JP6964610B2 - 微生物の保存 - Google Patents

Description

本発明は、微生物の保存の分野に関し、特に、マイクロカプセルのコアにおける非水性組成物中に生存微生物を含むマイクロカプセルを含む第1の区画と、第2の水性有機酸含有区画とを含む2区画系（2-compartment system）を提供する。本発明は、かかる系に基づいて、微生物を保存する方法、及び微生物を保存するためのかかる系の使用を更に提供する。

医学におけるプロバイオティクスとしての有益微生物の使用は、この20年ほどにわたって拡がっている。かかるプロバイオティクスの安定性を保証するためには、細菌を乾燥させて（例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥させて）、代謝的に不活性な状態を得る必要がある。したがって、細菌は、適切な保管条件（例えば、水分、温度等）下で数十年間生存することができる。水の導入によって、細菌粉末は再活性化されて、細菌は、それらの機能を発揮することができる。今日に至るまで、ほとんどのプロバイオティクス製剤は、胃腸への適用に使用されてきた。最も一般的な製剤は、水の非存在下で容易に保管することができ、かつ窒素又は二酸化炭素等の不活性ガス下で密封して、最大の安定性のために良好な相対湿度を設定することができるカプセル及び錠剤である。

他方で、局所（又は他の型の水性）製剤におけるプロバイオティクスの使用も同様に、大きな可能性があり得る。1つの選択肢は、軟膏又はオレオゲル（oleogels）等の無水物質中にこれらを配合することであり得るが、患者は一般的に、それらの製剤を受け入れない。より受け入れられる製剤は、ジェル／クリーム／泡状物質／ローションの形態の製剤である。しかしながら、かかる局所製剤は、ジェル、クリーム、泡状物質、ローション、軟膏等へと適切に配合するために、本質的に高度の水（high degree of water）を含有している。これらの製剤中のかかる高度の水の存在は、プロバイオティクスの、それらの代謝的に不活性な状態での保管に関する問題を課すことは明らかである。

かかる水性（例えば、局所）製剤で発生する第2の問題は、かかる製剤にて望まれていない微生物の増殖を抑えるのに、また安定なエマルジョンを形成するために、これらの製剤が、防腐剤、界面活性剤、乳化剤等の、微生物の生存に適合しない作用物質を一般的に含有することである。しかしながら、これらの作用物質は当然、有益微生物の製剤において深刻な問題も生ずる。

したがって、本発明の目的は、使用時に微生物に実質的に害を及ぼさない微生物の長期の保管を可能にする系を提供することであった。驚くべきことに、水不溶性かつ水不透過性シェル、及びマイクロカプセルのコアにおける非水性組成物中に含有される微生物を含むマイクロカプセルを含む第1の区画と、1つ以上の有機酸（7.0未満のpHを有し、かつ緩衝剤を実質的に含まない）を含む水性組成物を含有する（又は該水性組成物からなる）第2の区画とを含む2区画系が、上述の問題に対する解決法を提供することを見出した。特に、水を含まない区画に微生物が含有されていることで、保管中に水への曝露が妨げられるため、かかる系により微生物の長期の保管が可能になることが見出された。続いて、使用のために両方の区画の内容物を組み合わせる際に、驚くべきことに、保管用の防腐剤の目的を果たす有機酸は放出される微生物に即座には害を及ぼさず、該微生物は上記第2の組成物における水区画に起因して活性化されることとなることを見出した。このことは、微生物に対して非常に直接的な作用メカニズムを有する他の種類の防腐剤と対照的である。

さらに、本発明の製剤は、プロバイオティクスの局所塗布に特に適している一方で、本発明の概念はまた、水性環境中での微生物の保存／安定化という問題が発生する他の分野にも拡張することができる。したがって、本発明により規定するような2区画系において微生物を配合することによって、これらの問題は解決される。

2区画系において微生物を配合するという概念はすでに開示されているが、従来技術は、両方の区画の内容物を合わせた時点で、微生物の保護に対する解決法を提供しない。特に、微生物を活性化するのに要される水性区画は多くの場合、微生物にとって非常に厳しく（harsh）、大部分が、かかる微生物の長期の生存に適合しない防腐剤、界面活性剤等を含有する。対比して、防腐剤としての有機酸の選択に起因して、更なる防腐剤、界面活性剤、又は他の有害な構成成分を含む必要がないと同時に、かかる製剤の所要の安定性が保持されることを本発明者らは見出した。

非特許文献1は、細菌懸濁物が、グリセロール、マルトデキストリン、Tween等と一緒に酢酸セルロース中に固定化されるマイクロカプセル化プロセスについて記載している。噴霧乾燥中、細菌懸濁液は、加熱領域（100℃〜200℃）において単一ノズルを使用して噴霧される。これにより、懸濁液中の水は蒸発して、乾燥細菌粉末が得られる。得られた粉末は、水不溶性かつ水不透過性シェル、及びマイクロカプセルのコアにおける非水性組成物中に含有される微生物を含むマイクロカプセルではなく、上記微生物を含有するマトリクスに類似している。

特許文献1は、少なくとも1つの水様溶液を含む経口溶液及びアルギン酸塩、乳清タンパク質及びプロバイオティクスを含むゼリー様カプセルについて記載している。かかるゼリー様カプセルは、実際には1-位相性（fasic）ゲル粒子（即ち、プロバイオティクスを含むマトリクス）であり、上記カプセルの無水コアにおいてプロバイオティクスが維持される本明細書中に開示するような2区画系でない。

米国特許第2012263826号

Antunes et al., 2013(Food Science and Technology 54:125-131)

第1の態様において、本発明は、
水不溶性かつ水不透過性シェルを含み、マイクロカプセルのコアにおける非水性組成物中に微生物を更に含むマイクロカプセルを含む第1の区画と、
7.0未満のpHを有する水性組成物を含み、かつ1つ以上の有機酸を含む第2の区画であって、緩衝剤を実質的に含まない第2の区画と、
からなる2区画系を提供する。

本発明の特定の実施形態において、上記第2の水性組成物は、5.5未満、好ましくは5.0未満、より好ましくは4.5未満のpHを有する。

別の特定の実施形態において、上記1つ以上の有機酸は、安息香酸、ソルビン酸、クエン酸、酢酸、乳酸、シュウ酸、ギ酸、デヒドロ酢酸、フマル酸、アニス酸、グルコン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、リン酸及びプロピオン酸、並びにそれらの誘導体を含むリストから選択される。

また更なる実施形態において、上記微生物は、プロバイオティクス微生物であり、より好ましくはラクトバチルス・ペントーサス、ラクトバチルス・ラムノサス、及びラクトバチルス・プランタルムを含むリストから選択される。

特定の実施形態において、上記第1の区画は、水及び酸素に対して（実質的に）不透過性である。

別の特定の実施形態において、本発明のマイクロカプセルの上記水不溶性かつ水不透過性シェルは、アルギン酸塩、キサンタンガム、アラビアガム、ゲランガム、カラギーン、ゼラチン、セルロース若しくはそれらの誘導体；又は任意選択でキトサンと組み合わせた、寒天、タンパク質、ポリオール、ゼラチン、PVA（ポリビニルアルコール）、PLGA（乳酸−グリコール酸共重合体（Poly(lactic-co-glycolic acid)）、PLA（ポリ乳酸）及びそれらの誘導体、PCL、ポリイソヘキシルシアノアクリレート、アクリレート誘導体若しくはデンプンベースのポリマー；又はハードファット（hard fat）で構成される。

特定の実施形態において、本発明の2区画系は、上記マイクロカプセルを含むジェル、クリーム、泡状物質、ローション、又は軟膏の形態で存在する。

本発明の特定の実施形態において、非水性組成物は、植物油、鉱油、シリコン油又は親水性ポリマー、特にトリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、シリコーン又はハードファットを含むリストから選択される。

本発明の特定の実施形態において、上記1つ以上の有機酸は、防腐剤の目的を果たし、上記組成物は、更なる防腐剤を実質的に含まない。

更なる態様において、本発明は、生存微生物の保存方法であって、
2区画系を準備することと、
水不溶性かつ水不透過性シェル、及びマイクロカプセルのコアにおける非水性組成物中に含有される微生物を含むマイクロカプセルを含む第1の区画において、上記生存微生物を含ませることと、
7.0未満のpHを得るのに十分な量で、上記2区画系の第2の区画における水性組成物中に、1つ以上の有機酸を含ませることと、
を含み、上記第2の区画が緩衝剤を実質的に含まない、方法を提供する。

更なる態様において、本発明は、上記微生物に損傷を与えずに水性組成物を保存するための、生存微生物を包含する非水性組成物を含むマイクロカプセルと、7.0未満のpHを有する1つ以上の有機酸を含む水性組成物との組合せの使用を提供する。

これより図面を具体的に参照するが、示される項目は例示であり、本発明の種々の実施形態の説明的な論考のみを目的とすることが強調される。これらの図面は、本発明の原理及び概念的態様の最も有用かつ簡単な説明であると考えられるものを提供するために提示される。この点で、本発明の基礎的理解に必要とされるよりも詳細な本発明の構造細部を示そうとはしていない。この説明は、図面と共に本発明の幾つかの形態を実際に具体化し得る方法を当業者に明らかとするものである（makesapparent）。

シリコーン；A）CF 1406、B）CF 6570における微生物の安定性の図である。 油；A）ヒマワリ油、B）Miglyol812Nにおける微生物の安定性の図である。 極性媒質；A）PEG400、B）グリセリンにおける微生物の安定性の図である。 ハードファット；A）ウィテプゾールh15、B）ハイドロベース32/34における微生物の安定性の図である。

本明細書中で、上記で詳述するように、第1の態様において、本発明は、
水不溶性かつ水不透過性シェル、及びマイクロカプセルのコアにおける非水性組成物中に含有される微生物を含むマイクロカプセルを含む第1の区画と、
7.0未満のpHを有する水性組成物を含み、かつ1つ以上の有機酸を含む第2の区画であって、緩衝剤を実質的に含まない第2の区画と、
からなる2区画系を提供する。

より具体的には、本発明は、
水不溶性かつ水不透過性シェル、及び上記シェルのコアにおける非水性組成物中に含有される微生物を有するマイクロカプセルと、
7.0未満のpHを有し、かつ1つ以上の有機酸を含む水性組成物であって、緩衝剤を実質的に含まない水性組成物と、
からなる、本明細書中で規定するような2区画系を提供する。

更に具体的には、本発明は、
水不溶性かつ水不透過性シェル、及び上記シェルのコアにおける非水性組成物中に含有される微生物を有することができるマイクロカプセルと、
7.0未満のpHを有し、かつ1つ以上の有機酸を含む水性組成物であって、緩衝剤を実質的に含まない水性組成物と、
からなる、本明細書中で規定するような2区画系を提供する。

本発明において、「水不溶性」及び「水不透過性」マイクロカプセルという用語は、耐水性として理解されることを意味する。特に、耐水カプセルは、上記第2の水性区画中に懸濁された際に分解されないと記載することができる。それにもかかわらず、マイクロカプセルは、本明細書中で使用する場合、（通常は）塩濃度又は機械的な剪断応力等の或る特定のストレス条件下で、分解して、例えばそれらの不溶性を損ない、これによって、例えば本明細書中に記載するようなカプセルの放出メカニズムにより、それらの活性な内容物を放出し得る。

本発明において、「水性組成物」という用語は、水を含む製剤であることを意味する。特に、上記製剤は、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の水等の相当量の水を含む。したがって、「非水性組成物」という用語は、10%以下、好ましくは5%以下、更に好ましくは2%以下等の相当量の水を含有しない製剤であることを意味し、製剤が水を全く含有しないこと、即ち0%が最も好ましい。

本発明において、微生物という用語は、生きている「生存」微生物を指し、この用語は、それらの断片、培養上清、又は死滅形態であることを意味しない。上記生存微生物は、それらの保存を高めるために、凍結乾燥されることが好ましい。

本発明において、「有機酸」という用語は、酸の特性を有する有機化合物であることを意味する。明らかに、本発明において、任意の適切な有機酸は、それが防腐剤として作用し得る限りは使用され得る。

これらの有機酸が、微生物に対してゆっくりとした作用メカニズムを有し、微生物が、これらの有機酸と接触しても、即座には（プロバイオティクス）微生物に害を及ぼさないことを見出した。皮膚等の環境へのより長期の曝露後に、有機酸は、それらの活性を失い、またそれによって、より長期間にわたって、（プロバイオティクス）微生物に害を及ぼさない。本発明は、防腐剤として有機酸を使用して実施されることが好ましい（これらが、環境への曝露後に、それらの活性を失うことが見出されたため）のに対して、本発明はまた、別の防腐剤が例えば活性になるのに少なくとも24時間を要するように、ゆっくりとした作用メカニズムを有する限りは、別の防腐剤を使用することによって実施されてもよい。

有機酸の使用に関して、製剤は、緩衝剤を実質的に含まないことが好ましい。緩衝剤の存在は、長期間、低いpHで組成物を維持し、それによって、有機酸の防腐剤作用を阻害するのにより長く時間がかかり、したがって、微生物が有機酸と接触した時点で、微生物に害を及ぼす危険性が高まる。ほとんどの構成成分が、小さな緩衝液効果を有する一方で、組成物の構成成分が、有機酸の不活性化に要される時間を実質的に低減又は増加しないように、組成物の構成成分を選択することが望ましい。

特に適切な有機酸は、安息香酸、ソルビン酸、クエン酸、酢酸、乳酸、アニス酸、シュウ酸、ギ酸、デヒドロ酢酸、フマル酸、グルコン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、リン酸及びプロピオン酸、並びにそれらの誘導体を含むリストから選択されるものである。より具体的には、上記有機酸は、安息香酸、ソルビン酸、クエン酸、酢酸、乳酸、シュウ酸、ギ酸、デヒドロ酢酸、フマル酸、グルコン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、リン酸及びプロピオン酸、並びにそれらの誘導体を含むリストから選択され、例えばソルビン酸である。

本発明の特定の実施形態において、本発明による第2の水性組成物のpHは、5.5未満、好ましくは5.0未満、より好ましくは4.5未満、4.0未満又は3.5未満である。上記製剤のpHは、本発明に非常に関係がある。概して、pHがより低くなると、その防腐剤効果はより高くなり、それによって、本発明の製剤の長期間の安定性に寄与する。所望のpHは、同時配合される有機酸によって得られ、したがって、それらは、製剤中で防腐剤の目的を持つ。これらの有機酸の存在に起因して、更なる防腐剤を含む更なる必要性はなく、したがって、本発明の製剤は、有機酸以外の他の防腐剤を実質的に含まないことが好ましいことを本発明者らは見出した。さらに、組成物は当然、局所製剤において使用されることが非常に多いフェノキシエタノール、ブロニドックス（bronidox）、イソチアゾリノン、及びラウレス硫酸ナトリウム等の微生物にとって有害である他の構成成分を実質的に含まない。

好ましい実施形態において、本発明の生存微生物は、生存プロバイオティクス微生物である。

本発明において、「プロバイオティクス」という用語は、ヒト又は獣医学の分野で使用される場合に健康上の利益を提供する微生物を含むことを意味する。本発明の製剤は、ラクトバチルス属菌（Lactobacilli）、より詳細にはラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、及び／又はラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）等であるが、これらに限定されない任意の既知のプロバイオティクス微生物の製剤において非常に適している。明らかに、本発明の製剤は、使用目的に応じて、プロバイオティクス微生物の唯一の種、又はそれらの組合せを含んでもよい。

第1の区画において微生物の安定性を高めるために、上記第1の区画は、水及び酸素に対して（実質的に）不透過性であることが好ましい。

本発明において、「マイクロカプセル化された」又は「マイクロカプセル」という用語は、マイクロカプセル化プロセスによって得られる製品を指すことが意図されている。これは、マイクロサイズの（マイクロメートルの範囲の）粒子又は液滴がコーティングに取り囲まれて、多くの有用な特性を有する小さなカプセルを付与するプロセスである。本発明において、マイクロカプセルは、プロバイオティクス微生物を取り込むのに使用される。比較的簡素な形態で、マイクロカプセルは、その周囲に一様な壁を有する小さな球体である。マイクロカプセルの内側の材料は、コア、内部相、又は充填物（fill）と称される一方で、壁は、シェル、コーティング、又は膜と称される。

マイクロカプセルの製造に関して幾つかの方法が存在するという事実、及び本発明が、かかる方法のいずれかに限定されないという事実を、当業者は、十分に認識している。本発明に適したマイクロカプセル化の方法として、パンコーティング、エアサスペンションコーティング、遠心押出（centrifugal extrusion）、振動性ノズル、噴霧乾燥、向イオン性ゲル化（ionotropic gelation）、コアセルベーション相分離、界面重縮合、界面架橋、in-situ重合、マトリクス重合が挙げられるが、これらに限定されない。

マイクロカプセル化の第1の目的は、本発明では、特に、カプセル化された微生物を周囲の有機酸の防腐剤作用から保護するように、また微生物が水性環境中で活性化されるのを抑えるために、コアをその周囲から隔離することである。明らかに、使用時に、マイクロカプセルの壁は、破裂されて、微生物を解放して、望み通りに作用させる必要がある。かかる破裂は、使用中、例えば皮膚又は他の局所領域への製剤の塗布時の低圧、摩擦又は剪断応力によって得られることが好ましい。

本発明のマイクロカプセルは、その最も簡素な形態では、上記マイクロカプセルのコアにおいて非水性組成物中に含有される微生物とともに、水不溶性かつ水不透過性シェルを含む。しかしながら、適切な場合には、マイクロカプセルは、例えば、内容物の保護を高めるための追加のコーティング層等の更なる層を含んでもよい。

本発明の特定の実施形態において、上記マイクロカプセルは、水不溶性かつ水不透過性シェルを含み、上記微生物は、上記マイクロカプセルのコアにおける非水性組成物中に含有される。水の存在は、凍結乾燥した細菌を再活性化するのに十分であり、したがって、水の非存在下で細菌を配合することが重要であり、それによって、長期間の保管が可能となる。上記水不溶性かつ水不透過性シェルは、限定されるものではないが、アルギン酸塩、キサンタンガム、アラビアガム、ゲランガム、カラギーン（carrageen）、ゼラチン、セルロース若しくはそれらの誘導体；又は寒天、タンパク質、ポリオール、ゼラチン、PVA（ポリビニルアルコール）、PLGA（乳酸−グリコール酸共重合体）、PLA（ポリ乳酸）及びそれらの誘導体、PCL、ポリイソヘキシルシアノアクリレート、アクリレート誘導体若しくはデンプンベースのポリマー、又は例えばウィテプゾール若しくはハイドロベース等のハードファット等の任意の適切な物質で構成され得る。

これらの構成成分は、それ自体を使用してもよく、またこれらの構成成分を、互いに組み合わせてもよく、又はポリマー若しくはキトサンに架橋させてもよい。かかる更なる架橋は、マイクロカプセルの耐久性を増強し得る。さらに、水及び空気に対してマイクロカプセルの内容物（即ち、微生物）を更に保護するために、カプセルは、任意選択で適切なコーティングでコーティングされてもよい。

本明細書中で先に示したように、微生物は、長期間の保管を保証するように、水の非存在下で保管されるべきである。したがって、本発明のマイクロカプセルのコアは、好ましくは、例えば植物油、鉱油、シリコン油又は親水性ポリマー、特にトリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、シリコーン又は例えばウィテプゾール若しくはハイドロベース等のハードファットであるが、これらに限定されない水を含まない媒質である。

防腐剤の存在は当然、製剤の長期間の保管に非常に重要であるが、プロバイオティクス等の微生物の製剤に対して重大な問題を課す。それらの問題に対する解決法として、（プロバイオティクス）微生物のマイクロカプセル化及び有機酸を含む製剤におけるかかるマイクロカプセルの供給は、微生物の活性を妨害することなく、製剤の長期間の保管を保証するのに十分であることを、本発明者らは見出した。さらに、製剤の使用及び微生物の放出時に、微生物は同時配合された有機酸によって妨害されない。これは、有機酸が例えば皮膚の緩衝能に起因して、使用された時点でそれらの活性を迅速に失うためである。したがって、本発明の有機酸は、防腐剤の目的を果たすよう意図され、製剤は、マイクロカプセルからの放出後に微生物の活性を妨害し得る更なる防腐剤を実質的に含まない。

したがって、本発明の特定の実施形態において、上記有機酸は、防腐剤の目的を果たし、製剤は、更なる防腐剤を実質的に含まない。

本発明の製剤は、かかる製剤が一般的に高度の水を含有するので、局所用途に特に適している。したがって、特定の実施形態において、本発明による水性製剤は、局所水性製剤である。

本発明において、「局所」という用語は、身体の指定部位での局部的な送達、特に身体上の又は身体における特定の場所への塗布であることを意味する。特に、「局所」という用語は、クリーム、泡状物質、ジェル、ローション若しくは軟膏、又は任意の他の型の水含有製剤等の水性、即ち非固体製剤による粘膜への塗布を包含する。明らかに、「局所」という用語は、カプセル、錠剤等の固体調製物の形態における送達を包含しないことが意図されている。

本発明の局所プロバイオティクス製剤は、上記マイクロカプセルを含む、ジェル、クリーム、泡状物質、ローション、又は軟膏等であるが、これらに限定されない任意の適切な形態で存在し得る。

本明細書中で、上記で詳述するように、本発明の見解は、微生物が2区画系において水構成成分と接触しないような、微生物の製剤が、有機酸の使用と組み合わせて、（プロバイオティクス）微生物を実質的に妨害せずに、製剤の長期間の保管を可能にするのに十分であるということである。

したがって、更なる態様において、本発明は、生存微生物の保存方法であって、
2区画系を準備することと、
水不溶性かつ水不透過性シェル、及びマイクロカプセルのコアにおける非水性組成物中に含有される微生物を含むマイクロカプセルを含む第1の区画において、上記生存微生物を含ませることと、
7.0未満のpHを得るのに十分な量で、上記2区画系の第2の区画における水性組成物中に、1つ以上の有機酸を含ませることと、
を含み、上記第2の区画が緩衝剤を実質的に含まない、方法を提供する。

最後の態様において、本発明は、生（プロバイオティクス）微生物を包含するマイクロカプセル、及び7未満のpHを有する水性製剤における1つ以上の有機酸の組合せの使用、より具体的には、上記マイクロカプセルにおける上記微生物に損傷を与えずに水性組成物を保存するための該組合せの使用を提供する。

本発明の製剤は、特に、皮膚、又は膣等の粘膜への直接的な塗布を含む局所投与に非常に適している。

投与の様式に応じて半固体又は液体であり得る適切な投与形態に加えて、それらの調製物における使用に関する方法、並びに担体、希釈剤及び賦形剤も当業者に明らかであり、例えば、米国特許第6,372,778号、米国特許第6,369,086号、米国特許第6,369,087号及び米国特許第6,372,733号に、並びにRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版等の標準的なハンドブックで更に言及されている。

かかる調製物の幾つかの好ましいが、非限定的な例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアガム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ポリエチレングリコール、セルロース、（滅菌）水、メチルセルロース、食用油、植物油及び鉱油又はそれらの適切な混合物等のそれ自体がかかる製剤に適している担体、賦形剤及び希釈剤を用いて配合され得るエリキシル、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、軟膏、クリーム、ローションが挙げられる。

本発明の製剤は、任意選択で、例えば微生物の増殖を刺激するために、薬物及び／又はプレバイオティクス（prebiotics）等の他の構成成分を含有し得る。

製剤は、任意選択で、湿潤剤、乳化剤及び沈殿防止剤、分散剤等の医薬製剤において一般的に使用される他の物質を含有してもよい。しかしながら、かかる更なる物質は、組成物の保管中にも、それらの使用時にも、プロバイオティクス生物に実質的に害を及ぼさないことが、非常に重要である。

より具体的には、本発明の微生物及び1つ以上の薬学的に許容可能な水溶性のポリマーの固体分散体からなる粒子を含む医薬製剤に本組成物を配合することができる。

「固体分散体」という用語は、1つの構成成分が幾らか均一に他の構成成分（単数又は複数）中に分散している、少なくとも2つの構成成分を含む固体状態（液体又は気体状態に対して）の系と定義される。

微生物を微粒子形態に配合し、約1 μm〜5000 μmの有効平均粒径を維持するのに十分な量の表面改質剤をその表面上に吸着させることが更に好都合であり得る。適切な表面改質剤は好ましくは、既知の有機及び無機の医薬賦形剤から選択することができる。そのような賦形剤としては、種々のポリマー、低分子量オリゴマー、天然産物及び界面活性剤、例えば非イオン性及び陰イオン性の界面活性剤が挙げられる。

ここで、下記の合成的及び生物学的実施例を用いて、本発明を説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を何ら限定しない。

実施例1：第1の区画に関する非水性組成物の選択
この実施例の目標は、生存微生物の長期間の安定性及び生存能をもたらす、生存微生物を含ませるのに適した非水性組成物を選択することである。

材料及び方法
安定性の研究
3つの株を安定性の研究に使用した：
自己培養したL.ペントーサス（L. pentosus）（即ち、lac4又はLp）
自己培養したLGG（即ち、lac7又はLGG）
購入した凍結乾燥LGG

細菌を保存するための8個の異なる水不含懸濁媒質を室温（+/-20℃）で検査した。使用した懸濁媒質は、4つの型に細分することができ、それらに関して、各群において、下記の通りに、2つの亜型を比較した。
シリコーン：
化粧品流体1406（ジメチコノール及びジメチコン）−Chemsil社製
化粧品流体6570（ジシロキサン、トリシロキサン、シクロペンタシロキサン及びジメチコン）−Chemsil社製
油：
ヒマワリ油−Everyday社製
Migyol812N−Huels製
極性溶媒：
PEG400−Roth製
グリセリン−Fagron社製
ハードファット：
ウィテプゾールH15−VW chemicals社製
ハイドロベース32/34−Prod'hyg laboratoires社製

試料を、9個の予め規定した時点で採取した：
T0＝懸濁媒質中の懸濁前
T1＝懸濁の1日後
T2＝懸濁の1週後
T3＝懸濁の2週後
T4＝懸濁の1ヵ月後
T5＝懸濁の2ヵ月後
T6＝懸濁の6ヵ月後
T7＝懸濁の12ヵ月後
T8＝24ヵ月

使用する材料は全て、オートクレーブにかけることによって使用前に滅菌した。使用する構成成分、成分等は全て、可能であればオートクレーブにかけて、他の場合では、滅菌環境で濾過した。

T0 CFU決定
Lac 4及びLac 7は、完全に増殖するまで、液体MRS（de MAN, Rogosa & Sharpe）培地（37℃）中で培養した。培地を2780 Gで10分間遠心分離した。上清を廃棄して、細菌ペレットを更に使用した。

100mgを秤量して、生理食塩水（0.85% NaCl）で希釈して、総容量10 mlを得た。3つの株（lac4、lac7及びLGG）から、希釈系列を作製し（10倍段階希釈）、スプレッドプレーティング法に従って、プレート計数を行った（薬局方の方法2.6.12及び2.6.13に由来する）。測定は三重反復で繰り返した。結果は、cfu/グラム（粉末）として表す。

懸濁媒質中の細菌の懸濁
得られた細菌塊を用いて、均質な1/10希釈物（m/m%）を、種々の無水懸濁媒質を用いて作製した。上記懸濁液1グラムをファルコンチューブ中に秤量して、アルミニウム袋中で密封した（RH=20%）。試料はそれぞれ、更なる実験目的で細菌100 mgを含有していた。生存能実験のために、アルミニウム袋を、或る特定の時間間隔で開放した。

保管時間後の実験
安定性実験のために、密封した袋を、或る特定の時点で開放した。無水物質1グラムを含有するファルコンチューブは、乳化剤混合物（ポリソルベート80及びセスキオレイン酸ソルビタンからなる）1グラム、及び生理食塩水8グラムを添加することによって、更に処理した。これによりエマルジョンが形成され、このエマルジョンを通じて細菌が水と接触することができて、再活性化された。さらに、試料作製及びプレート計数を上述するように行い、薬局方の方法2.6.12：非滅菌産物の微生物的検査：微生物計数試験及び2.6.13：非滅菌産物の微生物学的検査：特定の微生物に関する試験に由来した。

結果及び考察
凍結乾燥した粉末の安定性は、「それ自体」の株の安定性と比較して、予想通りはるかに優れていた。ちょうど1ヵ月後、平均して3 logの低減が見られるのに対して、凍結乾燥した株に関しては検出可能な低減は見られない。これによって、経時的に生存微生物の安定な製剤を保証するのに、適正に凍結乾燥した（又は他の乾燥方法）粉末を用いて配合に着手することが重要であることが証明されている。したがって、凍結乾燥したLGG株の結果のみ、更に考察する。安定性の結果は、シリコン混合物（図1）、油（図2）及びハードファット（図3）に関して同等であった。親水性媒質（図3）のうち、PEG400のみが、FDIGGの安定性に負に影響を及ぼすグリセロールとは対照的に、懸濁媒質として適切であるように見える。

種々の無水媒質に関して、1年の安定の後に平均1 logの低減が見られる。これは、局所塗布されて、皮膚に対して有益な効果を発揮するのに十分な生存微生物を残している。これによって、無水媒質中に懸濁されて、光、水分及び防腐剤から保護される適正に凍結乾燥した粉末と一緒に作用させることで、安定なプロバイオティクスを有する相／区画を得ることが可能であることが証明される。この区画は、水相及び無水相の原位置での混合が存在する場合には2相系で、又は製剤中に懸濁されたカプセルとして存在することができる。

実施例2：第2の区画に関する水性組成物の選択
目標は、皮膚に塗布することができる生存微生物を用いて局所製剤を作製することであり、そこで微生物が有益な効果を発揮する。クリーム等の局所製剤は通常、油、水、防腐剤及び乳化剤を含有する。乳化剤及び防腐剤の存在は、この凍結乾燥した微生物の安定性に負の影響を及ぼし得る。或る特定の保存期間を保証する方法は、無水媒質中に、凍結乾燥したプロバイオティクスを懸濁させることである（実施例1も参照）。この無水懸濁液は、凍結乾燥した微生物に良好な安定性を与える。局所製剤における他の構成成分の負の影響を防止するために、上記無水懸濁液は、物理学的相分離により、又は上記無水懸濁液をカプセル化することによって、製剤の残部から最良に隔離される。続いて、カプセルを局所製剤中に懸濁させることができる。

相が隔離されている限りは、生存微生物を有する長持ちする局所製品を得ることができる。皮膚上への塗布の前に2相が混合されると、問題が生じ得る。凍結乾燥したプロバイオティクスは、製剤からの水の取込みによって活性化されるだけでなく、この乳化剤及び防腐剤に遭遇して、活性化された微生物を死滅させて、微生物が皮膚に対して有益な効果を発揮するのを妨害する。

この実験は、凍結乾燥したプロバイオティクスの生存に対する種々の製剤の短期間の効果（10分→1日）を決定するスクリーニングである。

1. 方法
1.1 実験A
この実験は、生存の凍結乾燥した微生物が、無水懸濁液中に安定に含有され、続いて種々の防腐剤及び乳化剤を含有する製剤と混合されるシミュレーションである。3つの標準的なTMF調製物を10%（m/m）の凍結乾燥したLGGとともにインキュベートする。TMF製剤は、広範囲に使用されて（ベルギー）、薬物の局所送達に関して安全でかつ安定な製剤とみなされる。製剤からの試料を、10分後及び24時間後に採取して、上記製剤の生存能、したがって短期間の抗菌効果を決定する。局所プロバイオティクスの塗布は通常、毎日行われる。その結果として、24時間後の試料は採取しなかった。スプレッドプレーティング法に従って、試料作製及びCFU決定（プレート計数）を行った（薬局方の方法2.6.12及び2.6.13に由来する）。測定は、三重反復で繰り返した。結果は、cfu/グラム（粉末）として表す。

検査したクリームの組成は下記の通りである：

1.2 実験B
実験Aのスクリーニングプラットフォームを拡張するために、種々の防腐剤及び乳化剤を含有する市販の製剤を用いて、実験Aを繰り返した。実験の実施は、2.1に記載するのと同じである。実験AからのクリームAを参照とした。他の医薬クリーム基剤（1〜5）をスクリーニングして、下記表に詳述するように、市販の化粧品製剤（6〜11）と比較した。

2. 結果
2.1 実験A

凍結乾燥したLGGの生存は、上記製剤において10分間懸濁させた後、ほんのわずかに影響を受けたようである。クリームAに関しては、24時間後に、減少はほとんど目立たない。クリームCに関しては、わずかな減少（±0.5 log）が見られ、クリームBに関しては、大きな減少（±3 log）が見られた。防腐剤としてのパラベン及びラウリル硫酸ナトリウム（既知の抗微生物特性を有する陰イオン性乳化剤）を含有するクリームBとは対照的に、クリームA及びクリームCはともに、防腐剤として有機酸であるソルビン酸を含有する。

全体で、有機酸は、ゆっくりとした作用メカニズムを有し（有効となるのに要される時間は、1日〜3日である（データは示していない））、したがって、凍結乾燥した微生物と組み合わせた局所製剤における使用のための安全な防腐剤とみなされ得ることを結論付けることができる。製剤Aは、局所製剤における凍結乾燥したプロバイオティクスの組合せに関する更なる試行にて提案される。

2.2 実験B

^*使用した方法は、4 logの低減の検出限界を有していた。CFUカウント0は、1.0E+0.7 CFU/グラム（粉末）未満が検出されたことを意味する。

最初の認識では、医薬クリーム基剤（1〜5）は、検査した化粧品製剤（6〜10）よりも短期間で抗菌性が低下しているようである。化粧品製剤は、極めて抗菌性であり（10分後に>4 logの低減）、それらの成分（乳化剤及び防腐剤）は、製剤の目的に適していないとみなされる。主に問題となる成分は、フェノキシエタノール、ブロニドックス、イソチアゾリノン及びラウレス硫酸ナトリウムとして同定されている。抗菌特性を有する他の成分は、同様に存在するが、あまり重要ではない。

最良の製剤（24時間後）は、この場合も、唯一の防腐剤としてソルビン酸を有する緩衝セトマクロゴールクリームである（24時間後に±0.15 logの低減）。2番目に良好な生存を伴う製剤は、防腐剤としてソルビン酸のみを含有するNourivan医薬基剤である。3番目に良好な製剤は、パラベンを含有するcarbomeergelであり、4番目に良好な製剤は、防腐剤としてソルビン酸及び安息香酸を含有するpentravanクリームである。Lanetteクリームは、防腐剤としてパラベン及びソルビン酸を含有する。

有機酸（及びパラベン）は、化粧品製剤において一般的に見られるものとは対照的に、ゆっくりと作用する防腐剤であり、皮膚への塗布後にプロバイオティクスに実質的に害を及ぼさないことは明らかである。有機酸防腐剤のみを含有する製剤1、製剤4及び製剤5は、10分後に最小限の低減を示す。パラベンもまた、防腐剤としての使用に適切であり得るが、パラベンは、既知のアレルギー因子であり、したがって、化粧品産業で使用されないことが好ましい。その結果として、有機酸防腐剤が、プロバイオティクスと同時配合するのに適した選択肢であると結論付けられる。

実施例3：安定性アッセイ
本発明者らのカプセルは、プロバイオティクス細菌を含有する内側コア周囲に均質な壁（シェル）を形成する。このシェルは、細菌を保護して、本発明者らのカプセルが懸濁された時点で、細菌が水性環境中に即座に放出されないようにする。

本発明者らは、以下の表から明らかであるように、冷蔵温度及び室温の両方で良好な安定性を提供し得る。

実施例4：防腐剤として有機酸を含有するクリームにおける生存能アッセイ
この実施例の目的は、種々の濃度のソルビン酸防腐剤の存在下で油／水クリーム中に懸濁させた場合のプロバイオティクスカプセルの有効性を決定することであった。第2の目標は、選択した防腐剤が、クリームを保護するのに適していることを証明することであった。このことは、欧州薬局方（5.1.3）に従って、種々の防腐剤濃度を有するクリーム（プロバイオティクスカプセルを有さない）に対する負荷試験（challenge test）を実施することによって証明された。

材料及び方法
使用する組成物
防腐剤／香料を有さない基礎クリームを、更なる検査に関する基礎として使用した。検査した防腐剤は、種々の濃度の25℃でpKa 4.76を有する有機酸であるソルビン酸（2,4-ヘキサンジエン酸）であった。検査した条件全てに関するクリームのpHは、HCl/NaOHを使用して4.5に調節した。

有機酸防腐剤濃度の負荷試験及び有効性
負荷試験を使用して、皮膚科学的製品用の抗微生物保存系の有効性を決定する。目標は、製品の安定性及び耐久性を高めることである。ソルビン酸は、濃度：0.5%−0.3%−0.1%−0%（対照）で検査した。

負荷した生物は、大腸菌（E. coli）（DSM 1576）、緑膿菌（Ps. Aeruginosa）（DSM 1128）、C.アルビカンス（C. albicans）（DSM 1386）、黄色ブドウ球菌（St. aureus）（DSM 799）、クロコウジカビ（As. Niger）（DSM 1988）であった。

負荷した生物の添加（製品100グラムにおける）は、10⁶ CFU/mlで行われた。試料採取は、6時間、24時間、7日〜14日及び28日後に行われる。負荷試験は、細菌に関しては、少なくとも3 logの低減が7日後に見られる場合に、また酵母／カビに関しては14日後に2 logの低減〜4週後に3 logの低減が見られる場合に成功である。示した結果は、試料採取の4週後のものである。

種々の防腐剤を有するクリーム基剤におけるプロバイオティクスカプセルの生存能
プロバイオティクスカプセルを、種々の防腐剤濃度を有するクリーム基剤中に15%（m/）で懸濁させる。invivoでプロバイオティクスの放出を再現するために、クエン酸緩衝液が、in vitroで使用された。クエン酸は、カプセルの膜を溶かし、それによって、カプセルの内側のプロバイオティクスを放出させる。CA緩衝液は、滅菌水971.54 g中にNa₂HP0₄ 31.2 g及びクエン酸1.25 gを溶解することによって作製された。最終的な溶液はpH7.4±0.2で等張であった。

試料クリームは、二重反復で（in duplo）試料採取して、その後、それをCA緩衝液中に溶解させる。更なる1/10希釈系列を作製して、直径4 mmの5個のガラスビーズを用いた「コパカバナ（copacabana）スプレッドプレーティング法」を使用して、0.1 mlをMRS寒天プレート上に拡げる。プレーティングは、二重反復で行い、結果（37℃で3日のインキュベーション後）は、CFU/グラム（クリーム）として算出する。保管は、4℃及び25℃で行う。試料採取は、1ヵ月−2ヵ月−3ヵ月後に行われる。示した結果は、低温保管中の3ヵ月後のカプセルの安定性である。

結果
負荷試験の結果
4週後の基剤クリーム（プロバイオティクスカプセルを除く）に関する負荷試験の結果

^*負荷試験は、3を上回るlogの低減が得られる場合に成功である。数字は、下記の通りに解釈されなくてはならない：初期細菌負荷と比較して、3＝1 log未満の低減、2＝1 log〜2 logの低減、1＝2 log〜3 logの低減、0＝3 logを上回る低減。

種々の濃度のソルビン酸を有するクリームにおけるプロバイオティクスカプセルの生存能
種々のソルビン酸防腐剤濃度の存在下での基礎クリームにおける3ヵ月後のプロバイオティクスカプセルの生存

結論
有機酸（ソルビン酸等）は、皮膚科学的製剤用の有用な防腐剤である。ソルビン酸は、0.1%程度と低い濃度で、良好な防腐剤効果を有する。ソルビン酸を添加しないと、予測した時間枠で、検査した微生物全てを死滅させることが不可能のようであったことから、負荷試験は失敗となった。その結果として、製剤における単独防腐剤としての有機酸の使用は、適切な濃度で存在する場合、細菌、酵母又はカビのいずれかによる損傷（spoilage）を防止する際に適切であるようである。

負荷試験に使用される同じ基礎クリーム中にプロバイオティクスカプセル（15%m/m）を懸濁させることにより、プロバイオティクスカプセルが種々の防腐剤濃度のいずれにも影響されないことが明らかになった。種々の防腐剤を含有するクリームの細菌CFU負荷量は、ブランクと比較して、32%以下（0.3 log未満の低減）の変化であった。これは、十分に偏差内であり、有意な差はみられない。

このことは、プロバイオティクスカプセルがこのクリーム製剤中のこの実験で検査した有機酸に対する良好な保護をもたらすと同時に、防腐剤は、クリーム中の外因性生物の増殖を防止することが可能であることを意味する。

Claims (14)

1. 水不溶性かつ水不透過性シェル、及びマイクロカプセルのコアにおける非水性組成物中に含有される生存微生物を含むマイクロカプセルを含む第1の区画と、
   7.0未満のpHを有する水性組成物を含み、かつ1つ以上の有機酸を含む第2の区画であって、更なる防腐剤を含まない第2の区画と、
   からなる2区画系。
2. 前記第2の区画の前記水性組成物は、5.5未満、若しくは5.0未満、若しくは4.5未満のpHを有する、請求項1に記載の2区画系。
3. 前記1つ以上の有機酸は、安息香酸、ソルビン酸、クエン酸、酢酸、乳酸、アニス酸、シュウ酸、ギ酸、デヒドロ酢酸、フマル酸、グルコン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、リン酸及びプロピオン酸、並びにそれらの誘導体を含むリストから選択される、請求項1又は2に記載の2区画系。
4. 前記生存微生物は、生存プロバイオティクス微生物である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の2区画系。
5. 前記生存微生物は、ラクトバチルス・ペントーサス、ラクトバチルス・ラムノサス、及びラクトバチルス・プランタルムを含むリストから選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の2区画系。
6. 前記生存微生物を含有する第1の区画は、水及び酸素に対して不透過性である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の2区画系。
7. 前記水不溶性かつ水不透過性シェルは、アルギン酸塩、キサンタンガム、アラビアガム、ゲランガム、カラギーン、ゼラチン、セルロース若しくはそれらの誘導体；又は任意選択でキトサンと組み合わせた、寒天、タンパク質、ポリオール、ゼラチン、PVA（ポリビニルアルコール）、PLGA（乳酸−グリコール酸共重合体）、PLA（ポリ乳酸）及びそれらの誘導体、PCL、ポリイソヘキシルシアノアクリレート、アクリレート誘導体若しくはデンプンベースのポリマー；又はハードファットで構成される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の2区画系。
8. 前記マイクロカプセルを含むジェル、クリーム、泡状物質、ローション、又は軟膏の形態で存在する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の2区画系。
9. 前記非水性組成物は、植物油、鉱油、シリコン油又は親水性ポリマーから選択される、又は、
   前記非水性組成物は、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、シリコーン又はハードファットを含むリストから選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の2区画系。
10. 前記有機酸は、防腐剤の目的を果たす、請求項1〜9のいずれか一項に記載の2区画系。
11. 生存微生物の保存方法であって、
    2区画系を準備することと、
    水不溶性かつ水不透過性シェル、及びマイクロカプセルのコアにおける非水性組成物中に含有される生存微生物を含むマイクロカプセルを含む第1の区画において、前記生存微生物を含ませることと、
    7.0未満のpHを得るのに十分な量で、前記2区画系の第2の区画における水性組成物中に、1つ以上の有機酸を含ませることと、
    を含み、前記第2の区画が更なる防腐剤を含まない、方法。
12. マイクロカプセル中の生存微生物に損傷を与えずに水性組成物を保存するための、水不溶性かつ水不透過性シェル、及び前記マイクロカプセルのコアにおいて生存微生物を包含する非水性組成物を含むマイクロカプセルと、7.0未満のpHを有する1つ以上の有機酸を含む水性組成物との組合せの使用。
13. 前記第2の区画は、更なる緩衝剤を含まない請求項1に記載の2区画系。
14. 水不溶性かつ水不透過性シェル、及びマイクロカプセルのコアにおける非水性組成物中に含有される生存微生物を含むマイクロカプセルを含む第1の区画と、
    7.0未満のpHを有する水性組成物を含み、かつ1つ以上の有機酸を含む第2の区画であって、更なる緩衝剤を含まない第2の区画と、
    からなる2区画系。

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