RS65324B1 - Obeleženi inhibitori membranskog antigena specifičnog za prostatu (psma), njihova upotreba kao agenasa za snimanje i farmaceutskih agenasa za lečenje karcinoma prostate - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se generalno odnosi na oblast radiofarmaceutika i njihovu upotrebu u nuklearnoj medicini kao markera, agenasa za snimanje i za lečenje različitih bolesnih stanja karcinoma prostate.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Karcinom prostate (PCa) je najbrojniji karcinom u SAD i među evropskom populacijom. Najmanje 1-2 miliona muškaraca na zapadnoj hemisferi pati od karcinoma prostate i procenjuje se da će bolest pogoditi svakog šestog muškarca između 55 i 85 godina. U SAD se svake godine dijagnostikuje više od 300.000 novih slučajeva karcinoma prostate. Smrtnost od ove bolesti je na drugom mestu posle karcinoma pluća. Trenutno anatomske metode, kao što su kompjuterizovana tomografija (CT), magnetna rezonanca (MR) i ultrazvuk, preovlađuju za kliničko snimanje karcinoma prostate. Procenjuje se da se dve milijarde dolara trenutno troši širom sveta na hirurške intervencije, zračenje, terapiju lekovima i minimalno invazivno lečenje. Međutim, trenutno ne postoji efikasna terapija za androgen-nezavisan recidivirajući, metastatski karcinom prostate.

[0003] Različiti eksperimentalni agensi za snimanje PCa niske molekularne težine se trenutno klinički istražuju, uključujući radioaktivno obeležene analoge holina [<18>F]fluorodihidrotestosteron ([<18>F]FDHT), anti-1-amino-3-[<18>F]fluorociklobutil-1-karboksilna kiselina (anti[<18>F]F-FACBC, [11C]acetat i 1-(2-deoksi-2-[<18>F]fluoro-L-arabinofuranozil)-5-metiluracil (-[<18>F]FMAU)(Scher, B.; et al. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2007, 34, 45-53; Rinnab, L.; et al. BJU Int 2007, 100, 786,793; Reske, S.N.; et al. J Nucl Med 2006, 47, 1249-1254; Zophel, K.; Kotzerke, J. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2004, 31, 756-759; Vees, H.; et al. BJU Int 2007, 99, 1415-1420; Larson, S. M.; et al. J Nucl Med 2004, 45, 366-373; Schuster, D.M.; et al. J Nucl Med 2007, 48, 56-63; Tehrani, O.S.; et al. J Nucl Med 2007, 48, 1436-1441). Svaki od njih funkcioniše drugačijim mehanizmom i ima određene prednosti, na primer, nisko izlučivanje [<11>C]holina u urinu, i nedostatke, kao što je kratak fizički polu-život radionuklida koji emituju pozitron.

[0004] Dobro je poznato da tumori mogu da eksprimiraju jedinstvene proteine povezane sa njihovim malignim fenotipom ili mogu prekomerno eksprimirati normalne konstituente proteine u većem broju od normalnih ćelija. Ekspresija različitih proteina na površini tumorskih ćelija nudi mogućnost da se dijagnostikuje i karakteriše bolest ispitivanjem fenotipskog identiteta i biohemijskog sastava i aktivnosti tumora. Radioaktivni molekuli koji se selektivno vezuju za specifične proteine na površini tumorske ćelije pružaju atraktivan put za snimanje i lečenje tumora u neinvazivnim uslovima. Nova obećavajuća serija agenasa za snimanje niske molekularne težine cilja na membranski antigen specifičan za prostatu (PSMA) (Mease R.C. et al. Clin Cancer Res.2008, 14, 3036-3043; Foss, C.A.; et al. Clin Cancer Res 2005, 11, 4022-4028; Pomper, M.G.; et al. Mol Imaging 2002, 1, 96-101; Zhou, J.; etral. Nat Rev Drug Discov 2005, 4, 1015-1026; WO 2013/022797).

[0005] PSMA je trans-membranski glikoprotein tipa II od 750 aminokiselina koji ima obilnu i ograničenu ekspresiju na površini PCa, posebno kod androgen-nezavisne, uznapredovale i metastatske bolesti (Schulke, N.; et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2003, 100, 12590-12595). Ovo poslednje je važno jer skoro svi PCa vremenom postaju nezavisni od androgena. PSMA ima kriterijume obećavajuće mete za terapiju, to jest, obilna i ograničena (na prostatu) ekspresija u svim stadijumima bolesti, prezentacija na površini ćelije, ali se ne izbacuje u cirkulaciju i povezanost sa enzimskom ili signalnom aktivnošću (Schulke, N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 12590-12595). PSMA gen se nalazi na kratkom kraku hromozoma 11 i funkcioniše i kao folat hidrolaza i kao neuropeptidaza. Ima funkciju neuropeptidaze koja je ekvivalentna glutamat karboksipeptidazi II (GCPII), koja se naziva "moždani PSMA", i može da moduliše glutamatergičnu transmisiju cepanjem N-acetilaspartilglutamata (NAAG) na N-acetilaspartat (NAA) i glutamat (Nan, F.; et al. J Med Chem 2000, 43, 772-774). Postoji do 10<6>PSMA molekula po ćeliji karcinoma, što dalje sugeriše da je idealna meta za snimanje i terapiju tehnikama zasnovanim na radionuklidima (Tasch, J.; et al. Crit Rev Immunol 2001, 21, 249-261).

[0006] Radio-imunokonjugat anti-PSMA monoklonskog antitela (mAb) 7E11, poznat kao PROSTASCINT<®>skeniranje, trenutno se koristi za dijagnostikovanje metastaza i recidiva karcinoma prostate. Međutim, ovaj agent ima tendenciju da proizvodi slike koje je teško interpretirati (Lange, P.H. PROSTASCINT scan for staging prostate cancer. Urology 2001, 57, 402-406; Haseman, M.K.; et al. Cancer Biother Radiopharm 2000, 15, 131-140;

Rosenthal, S.A.; et al. Tech Urol 2001, 7, 27-37). Nedavno su razvijena monoklonska antitela koja se vezuju za ekstracelularni domen PSMA i koja su radioaktivno obeležena i pokazalo se da se akumuliraju u modelima PSMA-pozitivnih tumora prostate kod životinja. Međutim, dijagnoza i otkrivanje tumora korišćenjem monoklonskih antitela je ograničena niskom permeabilnošću monoklonskog antitela u čvrstim tumorima.

[0007] Selektivno ciljanje ćelija karcinoma radiofarmaceuticima, bilo u svrhu snimanja ili u terapeutske svrhe, predstavlja izazov. Poznato je da su različiti radionuklidi korisni za radioimaging ili radioterapiju karcinoma, uključujući<111>In,<90>Y,<68>Ga,<177>Lu,<99m>Tc,<123>I and<131>I. Nedavno je pokazano da neka jedinjenja koja sadrže glutamat-urea-glutamat (GUG) ili glutamat-urea-lizin (GUL) element za prepoznavanje vezan za radionuklid-ligand konjugat pokazuju visok afinitet za PSMA.

[0008] Potrebni su novi agensi koji će omogućiti brzu vizualizaciju karcinoma prostate i specifično ciljanje kako bi se omogućila radioterapija.

[0009] Prema tome, cilj ovog pronalaska je razvoj liganda koji stupaju u interakciju sa PSMA i nose odgovarajuće radionuklide koji obezbeđuju obećavajuću i novu opciju ciljanja za otkrivanje, lečenje i upravljanje karcinomom prostate.

REZIME PRONALASKA

[0010] Rešenje navedenog objekta postignuto je obezbeđivanjem otelotvorenja karakterisan u patentnim zahtevima.

[0011] Obim pronalaska je definisan patentnim zahtevima. Sve pozivanja u opisu na postupke lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu)

[0012] Pronalazači su pronašli nova jedinjenja koja su korisni radiofarmaceutici i njihovu upotrebu u nuklearnoj medicini kao tragače, sredstva za snimanje i za lečenje različitih stanja bolesti karcinoma prostate.

[0013] Novi agensi za snimanje sa strukturnim modifikacijama u regionu linkera imaju poboljšana svojstva ciljanja tumora i farmakokinetiku. Farmakofor predstavlja tri karboksilne grupe sposobne da stupe u interakciju sa odgovarajućim bočnim lancima PSMA i kiseonikom kao delom kompleksiranja cinka u aktivnom centru. Pored ovih obaveznih interakcija, pronalazači su bili u mogućnosti da optimizuju lipofilne interakcije u regionu linkera.

KRATAK OPIS SLIKA

[0014]

Slika 1: PET - Snimanje MB17

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnih golih miševa koji nose LNCaP tumorske ksenografte. Efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva [<68>Ga]MB17 procenjeni su dinamičkim mikroPET skeniranjem. Injektirano je približno 15 MBq po mišu je. Grafikon A prikazuje odgovarajuće vremenske krive aktivnosti bubrega i bešike, a grafikon B odgovarajuće veemenske krive akivnosti srca, mišića i tumora. Vrednosti su izražene kao srednje SUV (standardizovane vrednosti preuzimanja).

Slika 2: Distribucija u organima 1 h nakon injekcije

Distribucija u organima jedan sat nakon injekcije 0,06 nmol<68>Ga obeleženog PSMA inhibitora MB17. Blokiranje PSMA kombinovanim davanjem 2 mg/kg telesne težine 2-PMPA ukazuje na PSMA-specifično preuzianje u tumor i bubrege. Podaci su izraženi kao srednja vrednost % ID/g tkiva ± SD (n=3).

Slika 3: PET - Snimanje MB4

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnih golih miševa koji nose LNCaP tumorske ksenografte. Efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva [<68>Ga]MB4 procenjeni su dinamičkim mikroPET skeniranjem. Injektirano je približno 15 MBq po mišu je. Grafikon A prikazuje odgovarajuće vremenske krive aktivnosti bubrega i bešike, a grafikon B odgovarajuće vremenske krive aktivnosti srca, mišića i tumora. Vrednosti su izražene kao srednje SUV (standardizovane vrednosti preuzimanja)

Slika 4: Distribucija u organima izražena kao % ID/g tkiva ± SD (n=5) 24 h nakon injekcije 0,06 nmol<177>Lu-obeleženog MB17

Distribucija u organima sa<177>Lu pokazuje da je visoko početno preuzimanje bubrega skoro potpuno isprano (2,13 ± 1,36 % ID/g) nakon 24 sata, dok je preuzimanje tumora ostalo visoko, pa čak i povećano (10,58 ± 4,50 % ID/g). Ostali organi kao što su jetra (0,08 ± 0,03 % ID/g), pluća (0,11 ± 0,13 % ID/g) i slezina (0,13 ± 0,05 % ID/g) pokazali su veoma nisko preuzimanje. Povoljna farmakokinetika dovela je do ekstremno visokih odnosa tumora i pozadine (tumor/krv: 1058; tumor/mišić: 529) posle 24 časa

Slika 5: PET - Snimanje MB 2

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnog golog mužjaka miša koji nosi LNCaP tumorske ksenografte. Efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva [<68>Ga]MB2 procenjeni su dinamičkim mikroPET skeniranjem. Injektirano je približno 15 MBq po mišu je.

Slika 6: PET - Snimanje MB 3

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnog golog mužjaka miša koji nosi LNCaP tumorske ksenografte. Efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva [<68>Ga]MB 3 procenjeni su dinamičkim mikroPET skeniranjem. Injektirano je približno 15 MBq po mišu je.

Slika 7: PET - Snimanje MB10

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnog golog mužjaka miša koji nosi LNCaP tumorske ksenografte. Efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva [<68>Ga]MB10 procenjeni su dinamičkim mikroPET skeniranjem. Injektirano je približno 15 MBq po mišu je.

Slika 8: PET - Snimanje MB17.D

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnog golog mužjaka miša koji nosi LNCaP tumorske ksenografte. Efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva [<68>Ga]MB17.D procenjeni su dinamičkim mikroPET skeniranjem. Injektirano je približno 15 MBq po mišu je.

MB17D: stereoizomer MB17(L); sinteza se zasniva na Fmoc-3(2-naftil)-D-alaninu

Slika 9: PET - Snimanje MB22

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnog golog mužjaka miša koji nosi LNCaP tumorske ksenografte. Efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva [<68>Ga]MB22 procenjeni su dinamičkim mikroPET skeniranjem. Injektirano je približno 15 MBq po mišu je.

Slika 10: PET - Snimanje MB 24

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnog golog mužjaka miša koji nosi LNCaP tumorske ksenografte. Efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva [<68>Ga]MB 24 procenjeni su dinamičkim mikroPET skeniranjem. Injektirano je približno 15 MBq po mišu je.

Slika 11: PET - Snimanje MB25

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnog golog mužjaka miša koji nosi LNCaP tumorske ksenografte. Efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva [<68>Ga]MB25 procenjeni su dinamičkim mikroPET skeniranjem. Injektirano je približno 15 MBq po mišu je.

Slika 12: PET - Snimanje MB31

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnog golog mužjaka miša koji nosi LNCaP tumorske ksenografte. Efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva [<68>Ga]MB31 procenjeni su dinamičkim mikroPET skeniranjem. Injektirano je približno 15 MBq po mišu je.

Slika 13: PET - Snimanje MB33

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnog golog mužjaka miša koji nosi LNCaP tumorske ksenografte. Efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva [<68>Ga]MB33 procenjeni su dinamičkim mikroPET skeniranjem. Injektirano je približno 15 MBq po mišu je.

Slika 14: PET - Snimanje MB35

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnog golog mužjaka miša koji nosi LNCaP tumorske ksenografte. Efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva [<68>Ga]MB35 procenjeni su dinamičkim mikroPET skeniranjem. Injektirano je približno 15 MBq po mišu je.

Slika 15: PET snimak miša kome je injektiran<68>Ga-CHX-DTPA.

Na levoj strani kaudalni, u sredini dorzalni i desno lateralni prikaz.

Slike pokrivaju vremenske intervale 20-40 min (gore), 40-60 min (u sredini) i 120-140 min (dole).

Sl. 16: MB-17 u odnosu na MB-17.D

MikroPET koronalni snimci celog tela atimičnih golih miševa koji nose LNCaP tumorske ksenografte. Izvršeno je direktno poređenje efikasnost ciljanja tumora i farmakokinetička svojstva stereoizomera MB-17 i MB-17 D 2 sata nakon injektiranja.

Sl. 17: Ljudski PET/CT snimak<68>Ga-obeleženog MB17

(a) Prvo kliničko iskustvo sa<68>Ga-obeleženim MB17 PET/CT pokazuje detekciju malih metastaza u limfnim čvorovima 1 sat nakon injekcije, prvenstveno zbog visokog unosa radiotrasera. Crvene strelice ukazuju na reprezentativnu leziju sa SUVmax 36,5 i odnosom tumor-pozadina od 52,1 jedan sat nakon injekcije. MIP = projekcija maksimalnog intenziteta PET snimka 1 sat nakon ubrizgavanja.

(b) Značajna prednost<68>Ga-obeleženog MB17 PET/CT je osetljivo otkrivanje lezija čak i pri niskom nivou PSA.

Sl. 18: PET snimanje pacijenata sa višestrukim metastazama karcinoma prostate

(a) Prvo skeniranje pokazuje inicijalni PET snimak pacijenta sa višestrukim metastazama karcinoma prostate sa vrednosti PSA u krvi od 14. Dva meseca kasnije primenjeno je 3,3 GBq<177>Lu-obeleženog MB17 U ovom trenutku, količina PSA u krvi dostigla je vrednost od 38. Nakon prvog ciklusa, nivo PSA se smanjio na 8. Tri meseca nakon prvog ciklusa primenjeno je još 4 GBq<177>Lu-obeleženog MB17. Kontrolno PET skeniranje je obavljeno mesec dana nakon drugog ciklusa. Lečenje je pokazalo značajan uticaj na tumorske lezije i vrednost PSA i rezultirao je smanjenjem bola u kostima.

(b) Grafikon pokazuje značajan uticaj na vrednost PSA koja se smanjila nakon prve primene terapeutske doze<177>Lu-obeleženog MB17.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0015] Predmedtni pronalazak se odnosi radiofarmaceutike i njihovu upotrebu u nuklearnoj medicini kao markera, agenasa za snimanje i za lečenje različitih bolesnih stanja karcinoma prostate.

[0016] Stoga se predmetno otkriće odnosi na jedinjenja koja su predstavljena opštom formulom (Ia) ili (lb):

sa:

1

[0017] Ako nije drugačije navedeno, u predmetnom pronalasku "alkil" ostatak (poželjno: C1do C10) može biti linearan ili razgranat, nesupstituisan ili supstituisan. Poželjni alkil ostaci su metil, etil, n-propil, izo-propil, n-butil, terc-butil, n-pentanil, n-heksanil. Isto važi i za odgovarajuća cikloalkil jedinjenja koja poželjno imaju 3 do 10 atoma ugljenika.

[0018] "Aril" se odnosi na aromatični monociklični ili policiklični sistem prstena koji ima 6 do 14 atoma ugljenika, poželjno 6 do 10 atoma ugljenika. Aril grupa može biti supstituisana, ako je prikladno, jednim ili više supstituenata u prstenu, kao što su alkil grupe. Poželjne aril grupe su fenil, benzil ili naftil.

[0019] Iako je poželjno da Z-grupa bude-CO2H, ona se može lako zameniti biosteričkim zamenama kao što su -SO2H, -SO3H, -SO4H, -PO2H, -PO3H, -PO4H2, videti npr. „The Practice of Medicinal Chemistry“ (Academic Press New York, 1996), strana 203.

[0020] U smislu pronalaska, svi ostaci se smatraju kombinovanim osim ako nije drugačije navedeno u definiciji ostataka. Sve njihove zamislive podgrupe se smatraju otkrivenim.

[0021] U poželjnom otelotvorenju, motiv koji se specifično vezuje za ćelijske membrane neoplastičnih ćelija je motiv koji se specifično vezuje za ćelijske membrane ćelija karcinoma, pri čemu je poželjno da pomenuti motiv sadrži membranski antigen specifičan za prostatu (PSMA), posebno pri čemu pomenuti PSMA sadrži motiv glutamat-urea-lizin prema sledećoj formuli u Šemi 1.

[0022] Prema tome, poželjni molekuli ovog pronalaska sastoje se od tri glavne komponente (šema 1): hidrofilni PSMA vezujući motiv (Glu-Urea-Lis; = Glu-NH-CO-NH-Lis), varijabilni linker i helator koji je poželjno DOTA.

Šema 1: struktura poželjnih jedinjenja u predmetnom pronalasku

[0023] Različiti poželjni linkeri su prikazani u nastavku, gde je R=Glu-urea-Lis i R'=DOTA (kao poželjan primer za helator), kao što je prikazano iznad.

Hemijska formula: C36H54N8O15

Molekularna težina: 838,88 g/mol

1

Hemijska formula: C44H61N9O16Molekularna težina: 972,03 g/mol

Hemijska formula: C52H68N10O17Molekularna težina: 1105,18 g/mol

Hemijska formula: C65H70N11O8Molekularna težina: 1238,33 g/mol

ili

MB 17 linker

Hemijska formula: C49H71N9O16Molekularna težina: 1042,16 g/mol

Hemijska formula: C36H60N8O15 Molekularna težina: 844,92 g/mol

1

[0024] Poželjna jedinjenja predmetnog pronalaska su, na primer

ili

1

�

�

�

[0025] Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja opšte formule (Ia) i/ili (Ib). Pronalazak se takođe odnosi na solvate jedinjenja, uključujući njihove soli i, ako je prikladno, njihove tautomere prema opštoj formuli (Ia) i/ili (Ib).

[0026] "Farmaceutski prihvatljiva so" je farmaceutski prihvatljiva, organska ili neorganska kisela ili bazna so jedinjenja pronalaska. Reprezentativne farmaceutski prihvatljive soli

2

uključuju, na primer, soli alkalnih metala, zemnoalkalne soli, soli amonijuma, soli rastvorljive i u vodi nerastvorljive, kao što su acetat, karbonat, hlorid, glukonat, glutamat, laktat, laurat, malat ili tartrat.

[0027] Neka jedinjenja Formule (Ia) i/ili (Ib) su obuhvaćena u obliku racemata, njihovih enantiomera i opciono u obliku njihovih dijastereomera i svih mogućih smeša istih.

[0028] Prema pronalasku svi hiralni C-atomi treba da imaju D- i/ili L-konfiguraciju; takođe će biti moguće kombinacije unutar jednog jedinjenja, tj. neki od hiralnih C-atoma mogu biti D-, a drugi mogu biti L-konfiguracije.

[0029] Dobijena jedinjenja mogu se opciono razdvojiti poznatim metodama (npr. Allinger, N.L. und Elliel E.L. in "Topics in Stereochemistry" Vol.6, Wiley Interscience, 1971) u njihovim enantiomerima i/ili dijasteromerima. Jedan od mogućih postupaka odvajanja enantiomera je upotreba hromatografije.

[0030] Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske preparate koji sadrže terapeutski efikasnu količinu aktivnih sastojaka (jedinjenje prema pronalasku formule (Ia) ili (lb) zajedno sa organskim ili neorganskim čvrstim ili tečnim, farmaceutski prihvatljivim nosačima koji su odgovarajući za predviđenu primenu i koji stupaju u interakciju sa aktivnim sastojcima bez nedostataka.

[0031] Izraz „farmaceutski prihvatljivo“ ovde se koristi da bi se odnosilo na ona jedinjenja, materijale, kompozicije i/ili oblike doza koje su, u okviru opsega razumne medicinske procene, pogodne za korišćenje u kontaktu sa tkivima pacijenta vez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih problema ili komplikacija, srazmerno razumnom odnosu korist/rizik.

[0032] "Pacijent" uključuje životinju, kao što je čovek, majmun, krava, konj, mačka ili pas. Životinja može biti sisar kao što je neprimat i primat (npr. majmun i čovek). U jednom otelotvorenju, pacijent je ljudsko biće.

[0033] Uopšteno, jedinjenje formule (Ia) ili (Ib) ili njegove farmaceutske kompozicije, mogu se davati oralno ili parenteralnim putem, obično injekcijom ili infuzijom.

[0034] „Parenteralni put davanja“ označava načine davanja koji nisu enteralni i lokalni, obično injekcijom, i uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealni, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidalnu, intraspinalnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0035] Doziranje jedinjenja prema pronalasku određuje lekar na osnovu specifičnih parametara pacijenta, kao što su starost, težina, pol, težina bolesti, itd. Poželjno doziranje je od 0,00001 mg/ kg do 100 mg/kg telesne težine, poželjno od 0,001 do 50 mg/kg telesne težine i najpoželjnije od 0,01 do 10 mg/kg telesne težine.

[0036] U skladu sa načinom davanja, lek je prikladno formulisan, npr. u obliku rastvora ili suspenzija, jednostavnih tableta ili dražeja, tvrdih ili mekih želatinskih kapsula, supozitorija, ovula, preparata za injekcije, koji se pripremaju prema uobičajenim galenskim metodama.

[0037] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti formulisana, gde je prikladno, zajedno sa drugim aktivnim supstancama i sa ekscipijentima i nosačima uobičajenim u farmaceutskim kompozicijama, npr. - u zavisnosti od preparata koji se proizvodi - talk, arapska guma, laktoza, skrob, magnezijum stearat, kakao puter, vodeni i nevodeni nosači, masna tela životinjskog ili biljnog porekla, derivati parafina, glikoli (posebno polietilen glikol), razni plastifikatori, disperzanti ili emulgatori, farmaceutski kompatibilni gasovi (npr. vazduh, kiseonik, ugljen-dioksid, itd.), konzervansi.

[0038] Za proizvodnju tečnih preparata mogu se koristiti aditivi, kao što su rastvor natrijum hlorida, etanol, sorbitol, glicerin, maslinovo ulje, bademovo ulje, propilen glikol ili etilen glikol.

[0039] Kada se koriste rastvori za infuziju ili injekcije, poželjno je da su to vodeni rastvori ili suspenzije, koje je moguće proizvesti pre upotrebe, npr. iz liofilizovanih preparata koji sadrže aktivnu supstancu kao takvu ili zajedno sa nosačem, kao što su manitol, laktoza, glukoza, albumin i slično. Gotovi rastvori se sterilišu i po potrebi mešaju sa ekscipijentima, npr. sa konzervansima, stabilizatorima, emulgatorima, solubilizatorima, puferima i/ili solima za regulisanje osmotskog pritiska. Sterilizacija se može postići sterilnom filtracijom korišćenjem filtera koji imaju malu veličinu pora prema kojima se kompozicija može liofilizovati, gde je to prikladno. Takođe se mogu dodati male količine antibiotika da bi se obezbedilo održavanje steriliteta.

[0040] Fraze "efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" kako se ovde koriste označavaju količinu jedinjenja, materijala ili kompozicije koja sadrži jedinjenje pronalaska, ili drugi aktivni sastojak koji je efikasan za postizanje nekog željenog terapeutskog efekta u najmanje podpopulaciji ćelija u životinji sa razumnim odnosom koristi i rizika primenljivom na bilo koji medicinski tretman. Terapeutski efikasna količina u odnosu na jedinjenje pronalaska označava količinu terapijskog sredstva, samog ili u kombinaciji sa drugim terapijama, koja obezbeđuje terapeutsku korist u lečenju ili prevenciji bolesti. Upotrebljen u vezi sa jedinjenjem pronalaska, termin može da obuhvati količinu koja poboljšava ukupnu terapiju, smanjuje ili izbegava simptome ili uzroke bolesti, ili poboljšava terapeutsku efikasnost ili sinergije sa drugim terapeutskim agensom.

[0041] Kako se ovde koristi, termini "lečiti" ili "lečenje" imaju za cilj da takođe obuhvate dijagnozu, profilaksu, prevenciju, terapiju i izlečenje.

[0042] Izrazi "sprečiti", "sprečavanje" i "prevencija" odnose se na prevenciju pojave, ponovnog pojavljivanja ili širenja bolesti kod pacijenta kao rezultat davanja profilaktičkog ili terapeutskog sredstva.

[0043] U zavisnosti od toga da li se inventivna jedinjenja formule (Ia) i/ili (lb) koriste kao agensi za radio imidžing ili kao radiofarmaceutici, različiti radionuklidi su kompleksirani sa helatorom. Ilustrativni radionuklidi uključuju, na primer,<89>Zr,<44>Sc,<111>In,<90>Y,<66>Ga,<67>Ga,<68>Ga,<177>Lu,<99m>Tc,<61>Cu,<82>Cu,<84>Cu,<87>Cu,<149>Tb,<152>Tb,<155>Tb,<181>Tb,<153>Gd,<155>Gd,<157>Gd,<213>Bi,<225>Ac,<230>U,<223>Ra,<165>Er and Fe. Prema jednom aspektu predmetnog pronalaska radionuklid je<111>In,<90>Y,<68>Ga,<64>Cu,<153>Gd,<155>Gd,<213>Bi,<225>Ac, Fe, or<177>Lu.

2

[0044] Kao što je gore navedeno, kompleksi jedinjenja prema formuli (Ia) ili (lb) mogu sadržati jedan ili više radionuklida koji su pogodni za upotrebu kao agensi za radiološko snimanje ili kao terapeutici za lečenje ćelija koje se brzo razmnožavaju, na primer, PSMA koje eksprimiraju ćelije karcinoma prostate. Prema ovom pronalasku, oni se nazivaju "metalni kompleksi" ili "radiofarmaceutici".

[0045] Poželjne metode snimanja su pozitronska emisiona tomografija (PET) ili kompjuterizovana tomografija sa jednom fotonskom emisijom (SPECT).

[0046] Shodno tome, u jednom otelotvorenju, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja uključuje kompleks koji uključuje radionuklid i jedinjenje formule (Ia) ili formule (Ib), njegovu so, solvat, stereoizomer ili tautomer, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0047] Prema drugom aspektu, obezbeđena je farmaceutska kompozicija, koja je pogodna za snimanje in vivo i radioterapiju. Pogodne farmaceutske kompozicije mogu sadržati agens za radiološko snimanje ili radioterapeutsko sredstvo koje ima radionuklid bilo kao element, tj. radioaktivni jod, ili radioaktivni metalni helat kompleks jedinjenja formule (Ia) i/ili (Ib) u određenoj količini dovoljnoj za snimanje, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim radiološkim vehikulumom. Radiološki vehikulum treba da bude pogodan za injekciju ili aspiraciju, kao što je humani serumski albumin; vodeni puferski rastvori, npr., tris(hidrometil) aminometan (i njegove soli), fosfat, citrat, bikarbonat, itd; fiziološki rastvor sterilne vode; i uravnoteženi jonski rastvori koji sadrže hloridne i/ili dikarbonatne soli ili upozorenja za normalnu krvnu plazmu kao što su kalcijum, kalijum, natrijum i magnezijum.

[0048] Koncentracija agensa za snimanje ili terapeutskog sredstva u radiološkom vehikulumu treba da bude dovoljna da obezbedi zadovoljavajuće snimanje. Na primer, kada se koristi vodeni rastvor, doza je oko 1,0 do 100 milikirija. Međutim, stvarnu dozu koja se daje pacijentu u svrhu snimanja ili u terapijske svrhe određuje lekar koji pruža lečenje. Agens za snimanje ili terapeutsko sredstvo treba davati tako da ostane u pacijentu oko 1 sat do 10 dana, iako su prihvatljivi i duži i kraći vremenski periodi. Zbog toga se mogu pripremiti pogodne ampule koje sadrže 1 do 10 ml vodenog rastvora.

[0049] Snimanje slike se može izvesti na normalan način, na primer ubrizgavanjem dovoljne količine kompozicije za snimanje da bi se obezbedila adekvatna slika, a zatim skeniranjem pomoću odgovarajuće mašine za snimanje ili skeniranje, kao što je tomograf ili gama kamera. U određenim realizacijama, postupak snimanja regiona kod pacijenta uključuje sledeće korake: (i) davanje pacijentu dijagnostički efikasne količine jedinjenja u kompleksu sa radionuklidom; izlaganje regiona pacijenta uređaju za skeniranje; i (ii) dobijanje slike regiona pacijenta. U određenim realizacijama prikazani region je glava ili grudni koš. U drugim otelotvorenjima, jedinjenja i kompleksi Formule I(a) i/ili (Ib) ciljaju PSMA protein.

[0050] Prema tome, u nekim otelotvorenjima, obezbeđen je metod snimanja tkiva kao što je tkivo slezine, tkivo bubrega ili tumorsko tkivo koje eksprimira PSMA uključujući dovođenje u kontakt tkiva sa kompleksom sintetizovanim dovođenjem u kontakt sa radionuklidom i jedinjenjem formule (Ia) i/ili I(b).

[0051] Količina jedinjenja iz predmetnog pronalaska, ili formulacije koja sadrži kompleks metala i jedinjenja prema formuli (Ia) i/ili (Ib), ili njegove soli, solvata, stereoizomera ili tautomera koja se daje pacijentu zavisi od nekoliko fizioloških faktora koje lekar rutinski koristi, uključujući prirodu snimanja koje treba da se sprovede, tkivo koje će biti ciljano za snimanje ili terapiju i telesnu težinu i istoriju bolesti pacijenta koji će biti snimljen ili lečen korišćenjem radiofarmaceutika.

[0052] Shodno tome, u drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje metod za lečenje pacijenta davanjem pacijentu terapeutski efikasne količine jedinjenja formule (Ia) i/ili (Ib) kompleksiranog sa radionuklidom, ili farmaceutski prihvatljive soli ili solvata kompleksa za lečenje pacijenta koji pati od ćelijskog proliferativnog oboljenja ili poremećaja. Konkretno, ćelijsko proliferativno oboljenje ili poremećaj koji se leči ili snima korišćenjem jedinjenja, farmaceutske kompozicije ili radiofarmaceutika u skladu sa predmetnim pronalaskom je karcinom, na primer, karcinom prostate i/ili metastaze karcinoma prostate u npr. plućima, jetri, bubrezima, kostima, mozgu, kičmenoj moždini, bešici itd.

[0053] Sinteza jedinjenja ovog pronalaska je detaljno opisana u odeljku sa primerima.

Pregled sinteze je ilustrovan u Šemi 2 u vezi sa DOTA konjugovanim-PSMA inhibitorima. Međutim, stručnjak u ovoj oblasti bi mogao da modifikuje reakcije, npr. korišćenjem drugog

2

helatora. Prema tome, ova šema neće biti shvaćena tako da ograničava jedinjenja iz ovog pronalaska samo na DOTA helator.

[0054] Sintetizovana jedinjenja su hemijski okarakterisana pomoću RP-HPLC (tečna hromatograija visokih performansi obrnute faze), MS (masena spektrometrija) i/ili NMR (nuklearna magnetna rezonanca).

[0055] Novi agensi za snimanje konjugovani sa helatorom sa strukturnim modifikacijama u regionu linkera imaju poboljšana svojstva ciljanja tumora i farmakokinetiku. Farmakofor predstavlja tri karboksilne grupe koje mogu da stupe u interakciju sa odgovarajućim bočnim lancima PSMA i kiseonikom kao delom kompleksiranja cinka u aktivnom centru. Pored ovih obaveznih interakcija, pronalazači su bili u mogućnosti da optimizuju lipofilne interakcije u regionu linkera.

[0056] Pretklinička evaluacija uključuje in vitro testove (afinitet, internalizacija) i in vivo eksperimente (µPET skrining i distribucija u organe).

2

[0057] Jedinjenja predmetnog pronalaska su bolja od poznatih referentnih jedinjenja u pogledu klirensa bubrega i obogaćivanja u tumoru. Na afinitet vezivanja PSMA inhibitora predmetnog pronalaska mogu uticati modifikacije linkera. Čini se da su dva ciklična motiva i najmanje jedan aromatični deo u regionu linkera supstance poželjniji i rezultirali su jedinjenjima visokog afiniteta MB4 i MB17. U tom pogledu, veoma obećavajuće jedinjenje je MB17.

[0058] Dakle, jedinjenja iz predmetnog pronalaska predstavljaju nove sonde za ciljanje PSMA sa optimalnim karakteristikama što je takođe potvrđeno distribucijom u organima i PET snimanjem malih životinja. Jedinjenja iz predmetnog pronalaska pokazuju visoko PSMA-specifično preuzimanje tumora. Pored toga, karakteriše ih rano obogaćivanje bešike i maksimalno preuzimanje bubrega. Što se tiče terapeutske upotrebe, ovo daje jasne kliničke prednosti za jedinjenja predmetnog pronalaska u poređenju sa drugim PSMA inhibitorima. Na PET dijagramima jedinjenja predmetnog pronalaska, naročito MB17, pokazuju brzi pozadinski klirens kao i značajno smanjenje obogaćivanja u bubregu nakon 2 sata, dok se ono dalje akumulira i zadržava u tumoru koji eksprimira PSMA. Takođe, prva lečenja in vivo pomoću MB 17 pokazala su obećavajuće podatke (c.f. Sl.17 i 18).

[0059] Sledeća otelotvorenja detaljnije objašnjavaju pronalazak.

Primeri

Primer 1: Sinteza DOTA-konjugovanih inhibitora

[0060] DOTA konjugovani-PSMA inhibitori se sintetišu sintezom peptida u čvrstoj fazi (c.f. Šema 2). U prvom koraku, izocijanat glutamil grupe je generisan in situ dodavanjem smeše od 3 mmol bis(terc-butil)-L-glutamat hidrohlorida i 3 ml N-etildiizopropilamina (DIPEA) u 200 ml suvog CH2Cl2u rastvor od 1 mmol trifosgena u 10 ml suvog CH2Cl2na 5°C tokom 3 h. Posle reakcije, dodato je 0,5 mmol ε-aliloksikarbonil zaštićenog lizina imobilisanog smolom (2-hloro-tritilresin) i reagovao je 16 h uz lagano mešanje. Smola je filtrirana i aliloksi-zaštitna grupa je uklonjena korišćenjem 50 mg tetrakis-(trifenil)paladijuma i 400 µl morfolina u 4 ml CH2Cl2tokom 2 h.

2

[0061] Sledeća sinteza peptidomimetičkog PSMA vezujućeg motiva izvedena je prema standardnom Fmoc protokolu. Sledeće spajanje veznog dela izvedeno je korišćenjem 2 mmol odgovarajuće Fmoc-zaštićene kiseline, 3,96 mmol HBTU i 2 mmol N-etil-diizopropilamina u konačnoj zapremini od 4 ml DMF. Posle aktivacije sa 3,95 eq HBTU i DIPEA tokom 2 h, 4 eq tris(t-bu)-DOTA (Chematech) u odnosu na punjenje smolom reagovalo je u konačnoj zapremini od 3 ml DMF. Proizvod je otcepljen od smole u smeši od 2 ml koja se sastoji od trifluorosirćetne kiseline, triizopropilsilana i vode (95:2,5:2,5).

[0062] Helator je takođe konjugovan korišćenjem HBTU aktiviranog DOTA-NHS estra (CheMatech) ili DOTA-TFP estra (Mier W., Hoffend J., Krämer S., Schuhmacher J., Hull W. E., Eisenhut M., Haberkorn U., Bioconjugate Chem. 2005, 16: 237-240).

[0063] Analiza sintetizovanih molekula je izvedena korišćenjem tečne hromatografije visokih performansi reverzne faze (RP-HPLC; Chromolith RP-18e, 100×4,6 mm; Merck, Darmštat, Nemačka) sa linearnim A-B gradijentom (0% B do 100% B za 6 min) pri brzini protoka od 4 ml/min (analiza) ili 6 ml/min (prečišćavanje). Rastvarač A se sastojao od 0,1% vodenog rastvora TFA, a rastvarač B je bio 0,1% TFA u CH3CN. HPLC sistem (L6200 A; Merck-Hitachi, Darmštat, Nemačka) je opremljen UV i gama detektorom (Bioscan; Vašington, SAD). UV apsorbanca je merena na 214 nm. Masena spektrometrija je izvedena sa MALDI-MS Daltonics Microflex sistemom (Bruker Daltonics, Bremen, Nemačka).

Primer 2: Radioaktivno obeležavanje

[0064] Tipično, 1,5 nmol sintetizovanog jedinjenja iz Primera 1 (rastvorenog u 0,1 M HEPES puferu pH 7,5) je dodato u zapremini od 100 µl u smešu od 10 µl 2,1 M HEPES rastvora i 40 µl [<68>Ga]Ga<3+>eluata (40 MBq). pH rastvora za obeležavanje je podešen na 4,5.

[0065] Radio-obeležavanje jedinjenja je rezultiralo radiohemijskim prinosom od >97% posle 15 minuta na 95 °C i određeno je pomoću RP-HPLC i TLC. Naknadno prečišćavanje je obavljeno korišćenjem Sep-Pak C18 kertridža.

Primer 3: Sinteza jedinjenja MB4 i MB17

2

[0066] Izocijanat glutamil dela je generisan in situ dodavanjem smeše od 3 mmol bis(tercbutil) L-glutamat hidrohlorida i 1,5 ml N-etildiizopropilamina (DIPEA) u 200 ml suvog rastvora CH2Cl2u rastvor 1 mmol trifosgena u 10 ml suvog CH2Cl2na 0 °C tokom 4 h. Posle mešanja reakcione smeše tokom 1 h na 25 °C, dodato je 0,5 mmol smolom imobilisanog (2-hloro-tritilresin) ε-aliloksikarbonil zaštićenog lizina u 4 ml DCM i reagovano je 16 h uz lagano mešanje. Smola je filtrirana i aliloksi zaštitna grupa je uklonjena korišćenjem 30 mg tetrakis(trifenil)paladijuma(0) i 400 µl morfolina u 4 ml CH2Cl2tokom 3 sata. Sledeće spajanje 3 puta 4-(Fmoc-aminometil)benzojeve kiseline (u slučaju MB4) ili Fmoc-3-(2-naftil)-L-alanina i trans-4-(Fmoc-aminometil)cikloheksankarboksilne kiseline (u slučaju MB17), respektivno, izvedeno je postepeno korišćenjem 2 mmol Fmoc-zaštićene kiseline, 1,96 mmol HBTU i 2 mmol N-etildiizopropilamina u konačnoj zapremini od 4 ml DMF. Nakon aktivacije sa 3,95 eq HBTU i DIPEA tokom 2 h, 4 eq tris(t-bu)-DOTA (Chematech) u odnosu na punjenje smolom reagovalo je 3 h u konačnoj zapremini od 3 ml DMF. Proizvod je otcepljen od smole u smeši od 2 ml koja se sastoji od trifluorosirćetne kiseline, triizopropilsilana i vode (95:2,5:2,5). Prečišćavanje je izvedeno korišćenjem RP-HPLC i prečišćeni proizvod je analiziran pomoću analitičke RP-HPLC i MALDI-MS.

[0067] Za pripremu MB-17D koji je stereoizomer MB17(L), sinteza je zasnovana na Fmoc-3(2-naftil)-D-alaninu. Ako nije drugačije navedeno, u sadašnjem opisu MB17 označava L-stereoizomer.

Primer 4: Spajanje sa različitim helatorima

[0068]

[0069] Helatori (DOTA, NOTA, NODAGA, DTPA, CHKS-DTPA, PCTA, Do3A) su spojeni na MB17 linker sintezom u čvrstoj fazi. Generalno, 13 µmol smole koja je bila spojena sa

2

PSMA motivom vezivanja je nabubrena pomoću DCM u špricu sa filterom. Nakon pranja smole 5 × sa DMF, inkubirana je 2 × 5 minuta sa 20% piperidina u DMF da bi se uklonila zaštita N-terminusa. Usledilo je još 5 × pranje sa DMF.

[0070] Između 1,5 i 4 ekvivalenta helatora (u zavisnosti od helatora), 0,98 × nchelatorHATU (ako je potrebno) i 10 ekvivalenata DIPEA rastvoreno je u 500 µl DMF, rastvor je uvučen u špric koji sadrži smolu i inkubirano preko noći. Zatim je smola isprana 5 × sa DMF, metanolom, DCM i dietil etrom i osušena u vakuumu.

[0071] Da bi se proverilo stanje reakcije, korišćena su test razdvajanja. Ovo je postignuto ispiranjem male količine smole sa DCM u vrh filtera i dodavanjem 100 µl rastvora za separaciju koji sadrži 95% TFA, 2,5% vode i 2,5% TIPS. Posle 30 minuta inkubacije, rastvor je pipetiran u ledeno hladan dietil etar i centrifugiran. Dietil etar je dekantovan, a preostali pelet je rastvoren u 35 µl ACN: H2O (1 : 1) i analiziran pomoću HPLC (0 - 100% ACN u vodi u roku od 5 min) i LC/MS.

[0072] Ako se dobije željeni proizvod, kompletan peptid je odvojen od smole. Osušena smola je inkubirana sa 500 µl rastvora za razdvajanje (95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% TIPS) tokom 2 sata. Dobijeni rastvor je pomešan sa ledeno hladnim dietil etrom i centrifugiran (4000 min<-1>, 5 min). Supernatant je odbačen, dodat je novi dietil etar i posuda je snažno protresena da bi se pelet resuspendovao. Ponovo, rastvor je centrifugiran (4000 min<-1>, 5 min) i dobijeni supernatant je odbačen. Pelet je zatim osušen u vakuumu i konačno resuspendovan u 1 ml ACN: H2O (1 : 1).

[0073] Prečišćavanje je postignuto preparativnom HPLC, vršne vrednosti su analizirane analitičkom HPLC (0 - 100% ACN u vodi u roku od 5 min) i LC/MS, a oni koji sadrže proizvod su spojeni i liofilizovani.

Primer 5: Radioaktivno obeležavanje

<177>Lu-obeležavanje

[0074]<177>Lu (otprilike 100 MBq) pomešano je sa 200 µl od 0,4 M natrijum acetatnog pufera koji sadrži Chelex (pH = 5).10 µl 1 mM rastvora jedinjenja u 10% DMSO u vodi, 2 µl zasićenog rastvora askorbinske kiseline i 40 µl rastvora koji sadrži<177>Lu su pomešani i zagrevani na 95 °C tokom 10 min. Obeležavanje je provereno pomoću radio-HPLC (0 -100% ACN u vodi u roku od 5 minuta, Monolitna kolona).

<68>Ga-obeležavanje

[0075] Za PET skeniranje CHKS-DTPA je obeležen sa<68>Ga.1 ml<68>Ga je eluiran iz<68>Ge/<68>Ga generatora sa 0,6 M HCl. Dodato je 298 µl NaOAc pufera i 1 µl 10 mM rastvora CHX-DTPA u DMSO i inkubirano 5 min. Nakon toga proizvod je prečišćen korišćenjem SOLA kertridža. Ispiranje je obavljeno 0,9% rastvorom NaCl i za eluiranje je korišćen etanol. Etanol je zatim uparen, a preostali proizvod je rastvoren u 100 µl 0,9% rastvora NaCl i 10 µl fosfatnog pufera.

Primer 6: Određivanje vrednosti IC50

[0076] Filter ploča MultiScreenHTS-DV je inkubirana na sobnoj temperaturi sa 100 µl PBS sa 1% BSA po bunarčiću 30 min. Nakon uklanjanja PBS/BSA rastvora, na svaki bunar je primenjeno 10<5>LNCaP ćelija u 50 µl Opti-MEM. Različite koncentracije jedinjenja (koje su dovele do koncentracija od 0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000 i 5000 nM u svakom bunarčiću) u 300 µl Opti-MEM pomešano je 3 µl su 150 nM rastvora<125>I-obeleženog MIP -1466 u Opti-MEM.50 µl dobijenog rastvora je dodato u svaki bunarčić, svaka koncentracija je pipetirana četvorostruko. Svaki bunarčić sada je sadržao radioaktivno obeleženi ligand u koncentraciji od 0,75 nM i kompetitivni, neobeleženi ligand u gore pomenutoj koncentraciji. Ploča je zatim inkubirana 45 minuta na sobnoj temperaturi na tresilici.

[0077]Posle inkubacije, ćelije su isprane 2 × sa 100 µl ledeno hladnog PBS i 1 × sa 200 µl ledeno hladnog PBS. Na kraju, filteri su sakupljeni i preostala radioaktivnost je izmerena gama brojačem. Svaka epruveta je merena 5 min.

[0078] Podaci mereni gama brojačem su procenjeni koristeći Graphpad Prism da bi se postigla koncentracija inhibicije 50 (IC50) u odnosu na radioaktivno obeležen MIP-1095.

1

Primer 7: µ PET - snimanje korišćenjem CHX-DTPA-MB17

[0079] Pre injektiranja u miša, rastvor koji sadrži prečišćeni<68>Ga-CHX-DTPA-vezani PSMA inhibitor je sterilno filtriran.100 µl ovog rastvora je uzeto u špric i zatim injektirano u LNCaP ksenograft BALB/c golog miša, intravenozno u repnu venu. PET skeniranje je snimano 140 minuta koristeći Siemens Inveon PET (slika 15)

Primer 8: Određivanje afiniteta kompetitivnog vezivanja

[0080] Da bi se uporedila serija novih jedinjenja, kompetitivni afinitet vezivanja i specifična internalizacija su analizirani korišćenjem ćelijske linije LNCaP koja eksprimira PSMA. Da bi se odredilo specifično ćelijsko preuzimanje, ćelije su blokirane sa 2-(fosfonometil)-pentandioinskom kiselinom (PMPA). Potencija inhibicije je takođe ispitana testom NAALADaze zasnovanim na enzima.

2

Ćelijska kultura

[0081] Za studije vezivanja i in vivo eksperimente LNCaP ćelije (metastatska lezija humanog adenokarcinoma prostate, ATCC CRL-1740) su kultivisane u RPMI medijumu sa dodatkom 10% fetalnog telećeg seruma i Glutamaxa (PAA, Austrija). Tokom ćelijske kulture, ćelije su uzgajane na 37°C u inkubatoru sa vlažnim vazduhom, ekvilibrisanim sa 5% CO2. Ćelije su sakupljene koristeći tripsin-etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (tripsin-EDTA; 0,25% tripsina, 0,02% EDTA, sve iz PAA, Austrija) i isprane sa PBS.

Vezivanje i internalizacija ćelija

[0082] Test kompetitivnog vezivanja ćelija i eksperimenti internalizacije su izvedeni kao što je prethodno opisano (Eder et al.2012). Ukratko, odgovarajuće ćelije (10<5>po bunarčiću) su inkubirane sa radioligandom (68Ga-obeleženim [Glu-urea-Lis(Ahx)]2-HBED-CC (Schafer et al., 2012) u prisustvu 12 različitih koncentracija analita (0-5000 nM, 100 µl po bunarčiću). Posle inkubacije, ispiranje je sprovedeno korišćenjem vakuumskog kolektora sa više sita (Millipore, Billerica, MA). Radioaktivnost vezana za ćelije je merena pomoću gama brojača (Packard Cobra II, GMI, Minesota, SAD).50% inhibitorna koncentracija (IC50) je izračunata prilagođavanjem podataka korišćenjem algoritma nelinearne regresije (GraphPad Software). Eksperimenti su izvedeni tri puta.

[0083] Da bi se odredilo specifično uzimanje ćelija i internalizacija, 10<5>ćelija je zasejano u ploče za ćelijsku kulturu obložene poli-L-lizinom sa 24 bunarčića 24 h pre inkubacije. Posle ispiranja, ćelije su inkubirane sa 25 nM radioaktivno obeleženih jedinjenja tokom 45 minuta na 37°C i na 4°C, respektivno. Specifično ćelijsko preuzimanje je određeno kompetitivnim blokiranjem sa 2-(fosfonometil)pentandioinskom kiselinom (500 µM konačna koncentracija, PMPA, Axxora, Loerach, Nemačka). Ćelijsko preuzimanje je prekinuto ispiranjem 4 puta sa 1 ml ledeno hladnog PBS. Ćelije su zatim inkubirane dva puta sa 0,5 ml glicin-HCl u PBS (50 mM, pH = 2,8) tokom 5 minuta da bi se uklonila površinski vezana frakcija. Ćelije su isprane sa 1 ml ledeno hladnog PBS i lizirane upotrebom 0,3 N NaOH (0,5 ml). Površinski vezane i internalizovane frakcije merene su gama brojačem. Preuzimanje ćelija je izračunato kao procenat prvobitno dodate radioaktivnosti vezane za 10<6>ćelija [%ID/10<6>ćelija].

Test Naaladaza (N-acetilirana-alfa-vezana-kisela dipeptidaza)

[0084] Rekombinantni humani PSMA (rhPSMA, R&D systems, Visbaden, Nemačka) je razblažen u puferu za ispitivanje (50 mM HEPES, 0,1 M NaCl, pH 7,5) do 0,4 µg/ml.

Supstrat Ac-Asp-Glu (Sigma, Taufkirhen, Nemačka, 40 µM konačna koncentracija) je pomešan sa natGa obeleženim analitom u koncentracijama u rasponu od 0,05 nM do 1000 nM u konačnoj zapremini od 125 µL pufera za ispitivanje. Smeše su kombinovane sa 125 µl rastvora rhPSMA (0,4 µg/ml) i inkubirane jedan sat na 37°C. Reakcija je zaustavljena zagrevanjem na 95°C tokom 5 minuta. U sve bočice je dodato 250 µl 15 mM rastvora ortoftaldialdehida (Sigma, Taufkirhen, Nemačka) i inkubirano 10 minuta na sobnoj temperaturi. Konačno, 200 µl reakcionih rastvora je stavljeno na F16 crnu Makisorp ploču (Nunc, Langenselbold, Nemačka) i očitano na talasnim dužinama ekscitacije i emisije od 330 nm i 450 nm, respektivno, koristeći čitač mikroploča (DTX-880, Beckman Coulter, Krefeld, Nemačka). Podaci su analizirani algoritmom regresije jednog mesta za ukupno vezivanje GraphPad (GraphPad Software, Kalifornija, SAD).

Biodistribucija

[0085] Mužjaci BALB/c nu/nu miševa od 7 do 8 nedelja (Charles River Laboratories) su supkutano inokulisani u desni trup sa 5×10<6>ćelija LNCaP (u 50% Matrigela; Becton Dickinson, Hajdelberg, Nemačka). Tumori su ostavljeni da rastu do veličine približno 1 cm3. Radioaktivno obeležena jedinjenja su ubrizgana u repnu venu (približno 1 MBq po mišu; 0,06 nmol). 1 h nakon injekcije životinje su žrtvovane. Organi od interesa su secirani, osušeni i izmereni. Radioaktivnost je izmerena korišćenjem gama brojača i izračunata kao % ID/g.

MikroPET

[0086] Za mikroPET studije, 10 - 25 MBq radioaktivno obeleženih jedinjenja u zapremini od 0,15 ml (~ 0,5 nmol) je injektirano preko lateralne repne vene u miševe koji nose LNCaP tumorske ksenografte. Anestezirane životinje (2% sevofluran, Abbott, Visbaden, Nemačka) stavljene su u ležeći položaj u Inveon PET skener za male životinje (Siemens, Knokville, Tenn, SAD) da bi se izvršila dinamička mikroPET skeniranja i 20 minuta statičkog skeniranja; c.f. Sl.1, 3, 5-14

4

Tabela A

[0087] Ovaj primer pokazuje da na afinitet vezivanja inhibitora PSMA mogu uticati modifikacije linkera. Čini se da su dva ciklična motiva i najmanje jedan aromatični deo u regionu linkera supstance poželjniji i rezultirali su jedinjenjima visokog afiniteta MB4 i MB17. Ove nove varijante pokazuju nizak nanomolarni afinitet prema ćelijskoj liniji LNCap i specifično su internalizovane na 37 °C do 48% ID/10<6>ćelija. Ranije studije su pokazale da su, pored afiniteta vezivanja, svojstva internalizacije PSMA-ciljanih sondi veoma važna i da su visoke stope internalizacije od suštinskog značaja za visoko in vivo preuzimanje i zadržavanje tumora. Dakle, MB17 predstavlja novu sondu za ciljanje PSMA sa optimalnim karakteristikama što je takođe potvrđeno distribucijom organa i PET snimanjem malih životinja. MB 17 pokazuje visoko PSMA-specifičmo preuzimanje tumora (slika 2). Pored toga, dinamičko PET snimanje MB17 (slika 2) pokazuje rano obogaćivanje bešike, a takođe i maksimalno upijanje bubrega (najviša tačka na vremensksoj krivoj aktivnosti) je već 15 minuta nakon injekcije radiotrasera i smanjuje se već posle 20 minuta. Što se tiče terapeutske upotrebe, ovo daje jasne kliničke prednosti za MB17 u poređenju sa drugim PSMA inhibitorima. Na PET dijagramima (Sl.1) naročito MB17, pokazuje brzi pozadinski klirens kao i značajno smanjenje obogaćivanja u bubregu nakon 2 sata, dok se on dalje akumulira i zadržava u tumoru koji eksprimira PSMA.

[0088] Pored toga, distribucija u organima sa<177>Lu (Sl.4) pokazuje da je visoko početno preuzimanje bubrega skoro potpuno isprano (2,13 ± 1,36 % ID/g) nakon 24 sata, dok je preuzimanje tumora ostalo visoko, pa čak i povećano (10,58 ± 4,50 % ID/g). Ostali organi kao što su jetra (0,08 ± 0,03 % ID/g), pluća (0,11 ± 0,13 % ID/g) i slezina (0,13 ± 0,05 % ID/g) pokazali su veoma nisko preuzimanje. Povoljna farmakokinetika dovela je do ekstremno visokih odnosa tumora i pozadine (tumor/krv: 1058; tumor/mišić: 529) posle 24 sata Tabela A jasno potvrđuje da hemijske modifikacije u regionu linkera molekula utiču na biološka svojstva, npr. afinitet i efikasnost internalizacije. MB17 i MB4 pokazuju najperspektivnija svojstva vezivanja na ćelijama.

Primer 9: Klinički podaci u vezi sa MB17

[0089] PET/CT snimanje je izvedeno korišćenjem radiotrasera MB17 obeleženog sa Ga-68 (c.f Sl.17)

[0090]<68>Ge/<68>Ga-generator koji se koristi za radiofarmaceutsku proizvodnju kupljen je od kompanije IDB-Holland BV (Baarle-Nassau, Holandija). Kompleti kaseta za jednokratnu upotrebu i hemikalije, uključujući prekursor u skladu sa GMP standardom, koji se koriste za radiosintezu, dobijeni su od ABX naprednih biohemijskih jedinjenja (Radeberg, Nemačka). Ultimate 3000 HPLC sistem (Dionex) (acetonitril (A), voda 0,1 % TFA (B); gradijent: 0,5 min 95% B, 10,0 min 80% A, protok: 2 ml/min) opremljen sa Chromolith Performance RP-18e kolonom (100 × 4,6 mm, Merck) i Nal radiodetektorom (Raytest) korišćen je za određivanje radiohemijske čistoće. Rezidualni rastvarači su određeni korišćenjem gasnog hromatografa serije 6850 (Agilent Technologies). Testiranje endotoksina je obavljeno koristeći Endosafe<®>-PTS uređajem (Charles River).

[0091] 2 µg MB17 je rastvoreno u 1,5 M acetatnom puferu pH 4,5 (1 ml) i 1 M askorbinskoj kiselini (10 µl) i prebačeno u reakcioni sud.<68>Ge/<68>Ga-generator je eluiran sa 10 ml 0,6 M HCl i eluat je razblažen sa 9 ml ultra čiste vode.

Smeša je zatim prebačena u kertridž za izmenjivanje katjona (Macherey-Nagel PS-H+, veličina M) i eluirana sa 5 M rastvorom NaCl (1,2 ml) u prethodno zagrejanom reakcionom sudu (100°C). Reakciona smeša je zagrevana 10 minuta. Sirova reakciona smeša je zatim uklonjena iz reakcionog suda i prebačena u prethodno kondicionirani (10 ml EtOH/10 ml ultra čiste vode) C18 kertridž (Waters Sep-Pak light).9 ml ultra čiste vode je korišćeno za ispiranje reakcionog suda i propušteno preko C18 kertridža. Kertridž C18 je ispran sa još 5 ml ultra čiste vode. Konačni proizvod je eluiran iz C18 kertridža sa 2 ml EtOH/H2O (v:v 1:1), sterilno filtriran (Millipore Cathivex-GV, 0,22 µm) i razblažen sa 10 ml fiziološkog (PBS) rastvora puferovanog fosfatom pH 7.4 (prema Eur. Ph.8.0 (4005000)). Rastvor kompleksa<68>Ga-MB17 primenjen je na pacijente putem intravenskog bolusa.

Primer 10: Humana terapija sa<177>Lu-obeleženim MB17

[0092] Za terapiju, PSMA ligand MB17 je radioaktivno obeležen sa Lu-177.<177>LuCl3je dobijen od Perkin Elmera (4 GBq, NEZ307D, 0,04 M HCl).80 nmola MB17 je rastvoreno u 400 µL natrijum acetatnog pufera (0,4 M, pH 5) sa dodatkom 5 µL 20% askorbinske kiseline. Rastvor je prebačen u<177>LuCl3i inkubiran 10 minuta na 95°C. Na kraju je dodato 2 ml 0,9 % NaCl. Za kontrolu kvaliteta izvršena je ITLC i radio-HPLC.

[0093]<177>Lu-obeleženi MB17 dat je pacijentima putem intravenoznog bolusa (5 ml, polako u roku od 30 sekundi). Uz intravensku primenu data je infuzija 0,9% NaCl tokom 4,5 h počevši od 0,5 h pre injekcije. Pozivanje se daje na sl.18.

Claims (18)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule (la) ili (Ib)

   pri čemu n je 0 ili 1, m je 1, 2, 3 ili 4; Z je -CO2H, -SO2H, -SO3H, -SO4H, -PO2H, -PO3H ili -PO4H2, X je Naftil, Fenil, Bifenil, Indolil (=2,3-benzopirolil) ili Benzotiazolil Y je Aril, Alkilaril, Ciklopenil, Cikloheksil ili Cikloheptil, i Helator je 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-N,N',N",N‴-tetrasirćetna kiselina (DOTA), N,N"-bis[2-hidroksi-5-(karboksietil)benzil]etilendiamin-N,N"-dijasirćetna kiselina (HBED-CC), 1,4,7-triazaciklononan-1,4,7-trisirćetna kiselina (NOTA), 2-(4,7-bis(karboksimetil)-1,4,7-triazonan-1-il)pentandioična kiselina (NODAGA), 2-(4,7,10-tris(karboksimetil)-1,4,7,10-tetraazaciklododekan-1-il)pentandioična kiselina (DOTAGA), 1,4,7-triazaciklononan fosfinska kiselina (TRAP), 1,4,7-triazaciklononan-1-[metil(2-karboksietil)fosfinska kiselina]-4,7-bis[metil(2-hidroksimetil)fosfinska kiselina] (NOPO), 3,6,9,15-tetraazabiciklo[9.3.1.]pentadeka-1(15),11,13-trien-3,6,9-trisirćetna kiselina (PCTA), ili Dietilentriaminpentasirćetna kiselina (DTPA), 4 ili njene farmaceutski prihvatljive soli ili njeni solvati, ili solvati njene soli ili njeni tautomeri.
2. 2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 naznačeno time što jedinjenje predstavlja jedinjenje Formule (Ia) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat, ili solvat njegove soli ili njegov tautomer.
3. 3. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2 naznačeno time što je X naftil ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili njegov solvat, ili solvat njegove soli ili njegov tautomer.
4. 4. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2 naznačeno time što je Y cikloheksil ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili njegov solvat, ili solvat njegove soli ili njegov tautomer.
5. 5. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2 naznačeno time što je n 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili njegov solvat, ili solvat njegove soli ili njegov tautomer.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, naznačeno time što jedinjenje ima strukturu:

   ili njene farmaceutski prihvatljive soli ili njeni solvati, ili solvati njene soli ili njeni tautomeri.
7. 7. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 6, naznačeno time što jedinjenje ima strukturu:
8. 8. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7, naznačeno time što jedinjenje ima strukturu:
9. ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili njegovi solvati, ili solvati njegove soli ili njegovi tautomeri. 9. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8, naznačeno time što jedinjenje ima strukturu: 4
10. 10. Metalni kompleks koji sadrži: jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili njegov solvat, ili solvat njegove soli, ili njegov tautomer prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva; i radionuklid, pri čemu je radionuklid kompleksiran sa helatorom.
11. 11. Metalni kompleks prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što je radionuklid izabran između<89>Zr,<44>Sc,<111>In,<90>Y,<66>Ga,<67>Ga,<68>Ga,<177>Lu,<99m>Tc,<61>Cu,<62>Cu,<64>Cu,<67>Cu,<149>Tb,<152>Tb,<155>Tb,<161>Tb,<153>Gd,<155>Gd,<157>Gd,<213>Bi,<225>Ac,<230>U,<223>Ra,<165>Er ili Fe.
12. 12. Metalni kompleks prema patentnom zahtevu 11, naznačen time što je radionuklid izabran između<111>In,<90>Y,<68>Ga,<64>Cu,<153>Gd,<155>Gd,<213>Bi,<225>Ac, Fe, ili<177>Lu.
13. 13. Metalni kompleks prema patentnom zahtevu 12, naznačen time što je radionuklid<177>Lu.
14. 14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili njegov solvat, ili solvat njegove soli, ili njegov tautomer prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, ili metalni kompleks prema bilo kom od patentnih zahteva 10-13 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
15. 15. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili njegov solvat, ili solvat njegove soli, ili njegov tautomer prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, ili metalni kompleks prema bilo kom od patentnih zahteva 10-13, za upotrebu kao medikament.
16. 16. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili njegov solvat, ili solvat njegove soli, ili njegov tautomer prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, ili metalni kompleks prema bilo kom od patentnih zahteva 10-13, za upotrebu u postupku lečenja karcinoma prostate i/ili njegovih metastaza.
17. 17. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili njegov solvat, ili solvat njegove soli, ili njegov tautomer prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, ili metalni kompleks prema bilo kom od zahteva 10-13, za upotrebu u postupku snimanja pacijenta.
18. 18. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili njegov solvat, ili solvat njegove soli, ili njegov tautomer prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, ili metalni kompleks prema bilo kom od patentnih zahteva 10-13, za upotrebu u postupku dijagnostikovanja karcinoma prostate i/ili njegovih metastaza. 4