RS65506B1 - Heterociklična jedinjenja za inhibiciju aktivnosti tyk2 - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na heterociklična jedinjenja korisna u modulaciji TYK2 za izazivanje inhibicije transdukcije signala. Jedinjenja obezbeđuju poboljšana farmakokinetička svojstva kod životinja.

Osnovne informacije o pronalasku

Tirozin kinaza 2 (TYK2) je nereceptorska tirozinska proteinska kinaza koja pripada porodici Janus kinaza (JAK) i pokazalo se da je kritična u regulisanju kaskade transdukcije signala nizvodno od receptora za IL-12, IL-23 i tip I interferona.

Tandemski kinazni domeni su karakteristični za JAK. JH1 je kanonski domen proteinskih tirozin-kinaza, dok je JH2 klasifikovan kao pseudokinazni domen. Struktura porodice JAK je prikazana na SL.1.

Nedavni biohemijski i strukturni podaci sugerišu da pseudokinazni domen TYK2 ima nizak nivo katalitičke aktivnosti i negativno reguliše aktivnost kinaznog domena.

Kada citokinski receptori vežu citokine, pokreće se fosforilacija TYK2 i drugih članova porodice JAK1 i/ili JAK2 koji su vezani za međućelijske regione, što dovodi do aktivacije transdukcije signala i faktora transkripcijske aktivacije (STAT) dimerizacijom. Dimerisani STAT-ovi zatim migriraju unutar nukleusa i regulišu ekspresiju i transkripciju srodnih gena kako bi se završila transdukcija signala od ćelijske membrane do jezgra. Stoga, JAK transduciraju citokinom posredovane signale kroz JAK-STAT put i igraju važnu ulogu u mnogim ćelijskim funkcijama, citokinom uslovljenoj regulaciji proliferacije ćelija, diferencijaciji, apoptozi, imunološkom odgovoru, itd. Miševi sa nedostatkom TYK2 su otporni na eksperimentalne modele kolitisa, psorijaze i multiple skleroze, što pokazuje važnost TYK2 posredovane signalizacije za autoimunost i njome povezane poremećaje.

Kod ljudi, osobe koje eksprimuju neaktivnu varijantu TYK2 su zaštićene od multiple skleroze i moguće drugih autoimunih poremećaja. Studije asocijacija čitavih genoma pokazale su da su druge varijante TYK2 povezane sa autoimunim poremećajima kao što su Kronova bolest, psorijaza, sistemski eritemski lupus i reumatoidni artritis, što dalje pokazuje značaj TYK2 za autoimunost.

TYK2 nokaut miševi imaju normalan broj crvenih krvnih zrnaca i sposobni su da prežive. Nedostatak ekspresije TYK2 se manifestuje u oslabljenoj signalizaciji različitih proinflamatornih citokina i teškom disbalansu diferencijacije T pomoćnih ćelija. Dokazi iz studija povezanih sa genetikom podržavaju TYK2 kao zajednički podložni gen za autoimunu bolest. TYK2 regulisani putevi su terapijom antitelima potvrđeni za lečenje bolesti. Na primer, ustekinumab koji cilja na IL-12/IL-23 za lečenje psorijaze, i anifrolumab koji cilja na receptor interferona tipa I za lečenje sistemskog eritemskog lupusa (SLE) pokazali su značajnu efikasnost u kliničkim ispitivanjima.

TYK2 je povezan sa nekim vrstama raka korelacijom između abnormalnog preživljavanja ćelija akutne limfocitne leukemije (T-ALL) i aktivacije TYK2. Kao onkogen T-ALL, 88% T-ALL ćelijskih linija i 63% T-ALL ćelija dobijenih od pacijenata je zavisilo od TYK2 putem nokaut genskih eksperimenata (Sanda et. al, Cancer Disc.2013, 3, 564-77). TYK2 selektivni inhibitor NDI-031301 indukovao je apoptozu da inhibira rast humanih T-ALL ćelijskih linija i pokazao je dobru bezbednost i efikasnost na mišjem modelu sa KOPT-K1 T-ALL tumorskim ćelijama (Akahane et. al, British J. Haematol. 2017, 177, 271-82), što pokazuje izglede za selektivne inhibitore TYK2 za lečenje T-ALL. Stoga je TYK2 jedna od obećavajućih meta za lečenje upalnih bolesti, autoimunih bolesti i raka (Alicea-Velazkuez et. al, Curr. Drug Targets 2011, 12, 546-55).

TYK2 i drugi članovi porodice JAK strukturno imaju kinazni domen JH1 (JAK homologija 1) i susedni pseudokinazni domen JH2 (JAK homologija 2). JH2 može da veže ATP, ali nema katalitičku funkciju i umesto toga negativno reguliše kinaznu aktivnost JH1 (Staerk et. al, J. Biol. Chem.2015, 280, 41893-99). Zbog velike sličnosti sekvenci kinaznog domena JH1 među porodicom JAK (JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2), izazovno je razviti selektivni inhibitor usmeren na JH1 TYK2 bez inhibicije JH1 JAK1, JAK2 ili JAK3. Većina inhibitora JAK koji se vezuju za kinazni domen JAK, uključujući tofacitinib, ruksolitinib, baricitinib, upadacitinib, itd., nisu veoma selektivni među članovima porodice JAK i pokazuju klinički neželjene efekte zavisno od doze, kao što je anemija. Razvoj visoko selektivnih TYK2 inhibitora ostaje privlačan među farmaceutskim kompanijama. Na osnovu strukturnih razlika između mjesta za vezivanje ATP-a u TYK2 JH1 i JH2, kompanija Bristol-Myers Squibb razvila je visoko selektivno JH2 vezivo BMS-986165, koje inhibira samo fiziološke funkcije posredovane TYK2 bez vezivanja za kinazne domene (JH1) JAK. BMS-986165 je sada u fazi III kliničkih ispitivanja za autoimune bolesti (Wrobleski et. al, J. Med. Chem.2019, 62, 8973-95).

Struktura BMS-986165 je prikazana ispod (WO2014/074661):

Ostaje potreba da se razviju nova jedinjenja koja se selektivno vezuju za pseudokinazni domen (JH2) TYK2, sa minimalnim vezivanjem za kinazne domene porodice JAK, posebno JAK2.

Kratak opis crteža

SL. 1 prikazuje uobičajenu sekundarnu strukturu porodice JAK (JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2).

SL. 2 pokazuje in vivo efikasnost u životinjskom modelu IBD kolitisa indukovanog anti-CD40 antitelom. Relativne % promene telesne težine životinja lečenih sa vehikulumom, referentnim jedinjenjem i jedinjenjem 3 u tri različite doze prikazani su u odnosu na broj dana nakon lečenja.

Detaljan opis pronalaska

Sve reference na postupke lečenja u narednim paragrafima ovog opisa treba tumačiti kao referisanje na jedinjenja, farmaceutske sastave i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).

Pronalazači su otkrili selektivne TYK2 inhibitore koji ne ciljaju na katalitički aktivno mesto TYK2, već ciljaju na TYK2 pseudokinazni domen (JH2). Predmetni pronalazak je usmeren na jedinjenja 2, 3 ili 4, i njihove farmaceutski prihvatljive soli. Jedinjenja 2, 3 ili 4 su selektivna veziva za JH2 TYK2. Vezivanjem za pseudokinazni domen (JH2), jedinjenja 2, 3 ili 4 inhibiraju katalitičku aktivnost kinaze TYK2, inhibiraju proteinsku fosforilaciju i pokazuju značajne inhibitorne efekte na fiziološku funkciju TYK2. Jedinjenja 2, 3 ili 4 se ili slabo vezuju ili se ne vezuju za kinazni domen (JH1) TYK2. Jedinjenja 2, 3 ili 4 selektivno inhibiraju aktivnost kinaze TYK2 vezivanjem za JH2 i imaju nisku inhibitornu aktivnost prema kinaznoj aktivnosti drugih članova porodice JAK. Selektivnost jedinjenja 2, 3 ili 4 za inhibiciju TYK2 u odnosu na druge članove porodice JAK (JAK1, JAK2 i JAK3) minimizuje neželjene efekte kao što je anemija. Pokazano je da jedinjenja 2, 3 ili 4 imaju odlična in vivo farmakokinetička svojstva kod životinja.

„Farmaceutski prihvatljive soli“, kako se ovde koriste, su soli koje zadržavaju željenu biološku aktivnost matičnog jedinjenja i ne daju neželjene toksikološke efekte. Farmaceutski prihvatljivi oblici soli uključuju različite kristalne polimorfe kao i amorfne oblike različitih soli. Farmaceutski prihvatljive soli predmetnih baznih heterocikličnih jedinjenja mogu se formirati sa neorganskim kiselinama ili organskim kiselinama.

Jedinjenje 1 ima tri-deuterisani metil na triazolnom prstenu i trideuterisani metil amid.

Jedinjenje 2 ima tri-deuterisani metil na triazolnom prstenu.

Jedinjenje 3 ima tri-deuterisanu metoksi grupu na benzenskom prstenu.

Jedinjenje 4 ima tri-deuterisanu metoksi grupu na benzenskom prstenu i tri-deuterisani metil amid.

Jedinjenje 5 ima (S)-6-(2,2-difluorociklopropan-1-karboksamido) i trideuterisani metil amid.

Jedinjenje 6 ima (S)-6-(2,2-difluorociklopropan-1-karboksamido) bez ikakve deuterijumske supstitucije.

Jedinjenje 7 ima (R)-6-(2,2-difluorociklopropan-1-karboksamido) i trideuterisani metil amid.

Jedinjenje 8 ima (R)-6-(2,2-difluorociklopropan-1-karboksamido) bez ikakve deuterijumske supstitucije.

Jedinjenja 1-5 i 7 imaju nekoliko deuterijumskih supstitucija na metilu radi poboljšanja farmakokinetičkih (PK) osobina. Jedinjenja 5-8 imaju difluor na ciklopropanu. Jedinjenja iz predmetnog pronalaska imaju niske vezivne aktivnosti za JAKs kinazne domene i imaju visoku inhibitornu aktivnost protiv ćelijskih funkcija TYK2, kao što je inhibicija sekrecije γ-interferona i IL-23. Jedinjenja predmetnog pronalaska obezbeđuju dobru bioraspoloživost kada se daju oralno. Jedinjenja predmetnog pronalaska su bezbedna za upotrebu i efektivna su u lečenju upalnih bolesti creva (IBD), kao što je pokazano na modelu anti-CD40 kolitisa (IBD) kod miševa, koji nisu pokazali značajan gubitak telesne težine nakon lečenja sa jedinjenjima 2, i 3.

Farmaceutski sastavi (ne prema pronalasku)

Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske sastave koji sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i aktivno jedinjenje jedinjenja 1-8, ili farmaceutski prihvatljivu so istih. Aktivno jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u farmaceutskim sastavima generalno je u količini od oko 0,01-20%, ili 0,05-20%, ili 0,1-20%, ili 0,2-15%, ili 0,5-10%, ili 1-5% (w/w) za topikalnu formulaciju; oko 0,1-5% za injekcijsku formulaciju, 0,1-5% za flastersku formulaciju, oko 1-90% za tabletnu formulaciju i 1-100% za kapsulsku formulaciju.

U jednom otelotvorenju, aktivno jedinjenje je ugrađeno u bilo koji prihvatljiv nosač, uključujući kreme, gelove, losione ili druge vrste suspenzija koje mogu da stabilizuju aktivno jedinjenje i da ga isporuče na zahvaćeno područje topikalnim primenama. U drugom otelotvorenju, farmaceutski sastav može biti u doznom obliku kao što su tablete, kapsule, granule, fine granule, praškovi, sirupi, supozitoriji, injekcijski rastvori, flasteri, ili slično. gorenavedeni farmaceutski sastav se može pripremiti konvencionalnim postupcima.

Farmaceutski prihvatljive nosače, koji su neaktivni sastojci, mogu da izaberu stručnjaci u predmetnoj oblasti koristeći konvencionalne kriterijume. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, rastvore na nevodenoj bazi, suspenzije, emulzije, mikroemulzije, micelarne rastvore, gelove, i masti. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu takođe da sadrže sastojke koji uključuju, ali nisu ograničeni na, fiziološki rastvor i vodene rastvore elektrolita; jonske i nejonske osmotske agense kao što su natrijum hlorid, kalijum hlorid, glicerol i dekstroza; pH regulatore i pufere kao što su soli hidroksida, fosfata, citrata, acetata, borata; i trolamin; antioksidanse kao što su soli, kiseline i/ili baze bisulfita, sulfita, metabisulfita, tiosulfita, askorbinske kiseline, acetil cisteina, cisteina, glutationa, butilisanog hidroksianizola, butilisanog hidroksitoluena, tokoferola i askorbil palmitata; surfaktante kao što su lecitin, fosfolipidi, uključujući ali bez ograničavanja na fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin i fosfatidil inozitiol; poloksamere i poloksamine, polisorbate kao što su polisorbat 80, polisorbat 60 i polisorbat 20, polietre kao što su polietilen glikoli i polipropilen glikoli; polivinile kao što su polivinil alkohol i povidon; derivate celuloze kao što su metilceluloza, hidroksipropil celuloza, hidroksietil celuloza, karboksimetil celuloza i hidroksipropil metilceluloza i njihove soli; naftne derivate kao što su mineralno ulje i beli petrolatum; masti kao što su lanolin, ulje od kikirikija, palmino ulje, sojino ulje; mono-, di- i trigliceride; polimere akrilne kiseline kao što je karboksipolimetilen gel i hidrofobno modifikovani umreženi akrilatni kopolimer; polisaharide kao što su dekstrani i glikozaminoglikani kao što je natrijum hijaluronat. Takvi farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti sačuvani od bakterijske kontaminacije korišćenjem dobro poznatih konzervansa, koji uključuju, ali nisu ograničeni na, benzalkonijum hlorid, etilendiamintetrasirćetnu kiselinu i njene soli, benzetonijum hlorid, hlorheksidin, hlorobutanol, metilparaben, timerosal, i feniletil alkohol, ili mogu biti formulisani kao formulacija bez konzervansa za jednokratnu ili višekratnu upotrebu.

Na primer, tabletna formulacija ili kapsulska formulacija aktivnog jedinjenja može da sadrži druge ekscipijente koji nemaju bioaktivnost i nemaju reakciju sa aktivnim jedinjenjem. Ekscipijenti tablete ili kapsule mogu uključivati punila, veziva, maziva i sredstva za klizanje, dezintegratore, agense za vlaženje i modifikatore brzine oslobađanja. Veziva podstiču adheziju čestica formulacije i važna su za tabletnu formulaciju. Primeri ekscipijenata tablete ili kapsule uključuju, ali nisu ograničeni na, karboksimetilcelulozu, celulozu, etilcelulozu, hidroksipropilmetilcelulozu, metilcelulozu, karaja gumu, skrob, tragakant gumu, želatin, magnezijum stearat, titanijum dioksid, poli(akrilnu kiselinu), i polivinilpirolidon. Na primer, tabletna formulacija može da sadrži neaktivne sastojke kao što su koloidni silicijum dioksid, krospovidon, hipromeloza, magnezijum stearat, mikrokristalna celuloza, polietilen glikol, natrijum

skrob glikolat, i/ili titanijum dioksid. Kapsulska formulacija može da sadrži neaktivne sastojke kao što su želatin, magnezijum stearat, i/ili titanijum dioksid.

Na primer, flasterska formulacija aktivnog jedinjenja može da sadrži neke neaktivne sastojke kao što su 1,3-butilen glikol, dihidroksialuminijum aminoacetat, dinatrijum edetat, D-sorbitol, želatin, kaolin, metilparaben, polisorbat 80, povidon, propilen glikol, natrijum karboksimetilceluloza, natrijum poliakrilat, vinska kiselina, titanijum dioksid i prečišćena voda. Flasterska formulacija takođe može da sadrži pojačivač permeabilnosti kože kao što su estri laktata (npr. lauril laktat) ili dietilen glikol monoetil etar.

Topikalne formulacije uključujući aktivno jedinjenje mogu biti u obliku gela, kreme, losiona, tečnosti, emulzije, masti, spreja, rastvora i suspenzije. Neaktivni sastojci u topikalnim formulacijama, na primer, uključuju, ali nisu ograničeni na, dietilen glikol monoetil etar (emolijens/pojačivač permeacije), DMSO (pojačivač rastvorljivosti), silikonski elastomer (modifikator reologije/teksture), kaprilni/kaprinski triglicerid (emolijens), oktil salicilat,

1

(emolijens/UV filter), silikonska tečnost (emolijens/razređivač), skvalen (emolijens), suncokretovo ulje (emolijens) i silikonski dioksid (agens za zgušnjavanje).

Način upotrebe (ne prema pronalasku)

Pronalazač je pokazao da se predmetna jedinjenja specifično vezuju za TYK2 pseudokinazni domen (JH2) i značajno inhibiraju fiziološku funkciju TYK2 u NK92 ćelijama. Jedinjenja takođe pokazuju odlična farmakokinetička svojstva kod pacova.

Predmetni pronalazak je usmeren na postupak za prevenciju ili lečenje TYK2 posredovanih bolesti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, autoimune bolesti, upalne bolesti (uključujući upalu creva i upalu probavnog trakta), kancere, kožne bolesti, dijabetes, očne bolesti, neurodegenerativne bolesti, alergijske reakcije, astmu, druge opstruktivne bolesti disajnih puteva i odbacivanje transplantata, itd. Postupak je posebno koristan za lečenje upalnih bolesti creva, psorijaze i sistemskog eritemskog lupusa (SLE). Postupak sadrži davanje pacijentu kojem je potrebno efektivne količine jedinjenja predmetnog pronalaska, ili proleka istog, farmaceutski prihvatljive soli istog. „Efektivna količina“, kako se ovde koristi, je količina efektivna za lečenje bolesti poboljšanjem patološkog stanja ili smanjenjem simptoma bolesti.

Farmaceutski sastav predmetnog pronalaska može se primeniti lokalnom primenom i sistemskom primenom. Lokalna primena uključuje topikalnu primenu. Sistemska primena uključuje oralni (uključujući bukalni ili sublingvalni), parenteralni (kao što je intravenozni, intramuskularni, subkutani ili rektalni) i druge sistemske puteve primene. U sistemskoj primeni, aktivno jedinjenje prvo dospeva u plazmu, i zatim se distribuira u ciljna tkiva. Topikalna primena i oralna primena su poželjni putevi primene za predmetni pronalazak.

Doziranje sastava može da varira u zavisnosti od razmera povrede i individualne reakcije svakog pacijenta. Za sistemsku primenu, koncentracije isporučenog aktivnog jedinjenja u plazmi mogu da variraju; ali su generalno 1×10<-10>-1×10<-4>mol/litar, i poželjno 1×10<-8>-1×10<-5>mol/litar.

U jednom otelotvorenju, sastav se nanosi topikalno na zahvaćeno područje i utrljava u njega. Sastav se primenjuje topikalno najmanje 1 ili 2 puta po danu, ili 3 do 4 puta po danu, u zavisnosti od medicinskog problema i da li je patologija bolesti hronična ili akutna. generalno, topikalni sastav sadrži oko 0,01-20%, ili 0,05-20%, ili 0,1-20%, ili 0,2-15%, 0,5-10, ili 1-5% (w/w) aktivnog jedinjenja. Aktivno jedinjenje prolazi kroz kožu i isporučuje se do mesta nelagodnosti.

U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav se subjektu daje oralno. Doziranje za oralnu primenu je generalno najmanje 0,1 mg/kg/dan i manje od 1000 mg/kg/dan. Na primer, doza za oralnu primenu je 0,5 mg do 1 g, poželjno 1 mg do 700 mg, ili 5 mg do 300 mg jedinjenja po danu.

Stručnjaci u predmetnoj oblasti će prepoznati da je širok spektar mehanizama isporuke takođe pogodan za predmetni pronalazak.

Predmetni pronalazak je koristan u lečenju sisara, kao što su ljudi, konji i psi. Predmetni pronalazak je posebno koristan u lečenju ljudi.

Sledeći primeri dalje ilustruju predmetni pronalazak. Ovi primeri su namenjeni samo da budu ilustrativni za predmetni pronalazak i ne treba da se tumače kao ograničavajući.

Primeri

Primeri 1-8 ilustruju sintezu ovih jedinjenja. Proizvod u svakom koraku reakcije se dobija tehnikama separacije poznatim u predmetnoj oblasti, uključujući, ali bez ograničavanja na, ekstrakciju, filtraciju, destilaciju, kristalizaciju i hromatografsku separaciju. Početni materijali i hemijski reagensi potrebni za sintezu mogu se konvencionalno sintetizovati prema literaturi (dostupna pretragom na SciFinderu) ili kupiti.

Struktura jedinjenja se određuje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) ili masenom spektrometrijom (MS). nMR je meren korišćenjem Bruker ASCEND-400 nMR spektrometra. Rastvarači su bili deuterisani dimetilsulfoksid (DMSO-d6), deuterisani hloroform (CDC13) ili deuterisani metanol (CD3OD).

Interni standard je bio tetrametilsilan (TMS). Hemijska promena je data u jedinici od 10<-6>(ppm).

MS je meren korišćenjem Agilent SQD (ESI) masenog spektrometra (proizvođač: Agilent, model: 6120).

HPLC je merena korišćenjem Agilent 1260 DAD hromatografije visokog pritiska (Poroshell120 EC-C18, 50 × 3,0 mm, 2,7 µm kolona) ili Waters Arc tečne hromatografije visokog pritiska (Sunfire C18, 150 × 4,6 mm, 5 µm kolona).

Tankoslojna hromatografija (TLC) je izvedena korišćenjem Qingdao Ocean gF254 ploče od silika gela. Specifikacija TLC za nadzor reakcija i odvajanje/prečišćavanje proizvodnje je 0,15~0,2 mm i 0,4~0,5 mm

debljine, respektivno.

Kromatografija na koloni je vođena generalno korišćenjem Qingdao Ocean silika gela 200-(300 mesh) kao nosača.

Poznati početni materijali koji se koriste u predmetnom pronalasku mogu se sintetisati prema postupcima poznatim u predmetnoj oblasti, ili se mogu kupiti od ABCR gmbH & Co. KG, Acros Organics, Sigma-Aldrich Chemical Company, Accela ChemBio Inc., Beijing Ouhe Chemicals, i drugih kompanija.

U dole navedenim primerima, osim ako nije drugačije naznačeno, sve reakcije su izvedene u argonskoj atmosferi ili u azotnoj atmosferi.

Reakcija hidrogenacije je obično provođena u reaktoru koji je evakuisan, napunjen vodonikom i upotrebljen tri puta uzastopno.

Mikrotalasna reakcija je izvedena korišćenjem CEM Discover-SP mikrotalasnog reaktora.

U dole navedenim primerima, osim ako nije drugačije naznačeno, reakciona temperatura je bila sobna temperatura od 20°C do 30°C.

Napredak reakcije je nadziran pomoću Agilent LCMS instrumenta (1260/6120). To se takođe može nadgledati pomoću TLC. Sistem rastvarača za TLC je bio A: sistem dihlormetana i metanola; B: sistem petrolej etra i etil acetata; C: sistem prikazan u primerima. Zapreminski odnos rastvarača je podešen prema polarnosti jedinjenja.

1

Sistem eluenta za hromatografiju na koloni i TLC korišćen u procesu prečišćavanja jedinjenja uključivao je A: sistem dihlormetana i metanola; B: sistem petrolej etra i etil acetata; C: sistem prikazan u primerima. Zapreminski odnos rastvarača je podešen prema polarnosti jedinjenja, i za podešavanje se može dodati mala količina trietilamina i kiselog ili baznog reagensa.

Prečišćavanje jedinjenja se takođe može izvršiti korišćenjem Watersovog automatizovanog sistema za pripremu orijentisanog na spektrometriju mase (pripremni HPLC sa detektorom mase SQD2). U zavisnosti od polarnosti jedinjenja, odgovarajući profil elucije acetonitril/voda (koji sadrži 0,1% trifluorosirćetne kiseline ili mravlje kiseline) ili acetonitril/voda (koji sadrži 0,05% amonijum hidroksida) je korišćen za ispiranje kolone visokog pritiska obrnute faze (XBridge-C18, 19 × 150 mm, 5 µm) pri brzini protoka od 20 mL/min.

Primer 1 (ne prema pronalasku).6-(ciklopropankarboksamido)-4-((2-metoksi-3-(1-(metil-d3)-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)-N-(metil-d3)piridazin-3-karboksamid (1)

Korak 1

Metil 2-metoxi-3-nitrobenzoat (1b)

Rastvoru metil 2-fluoro-3-nitrobenzoata 1a (10 g, 50 mmol) u metanolu (50 mL) na sobnoj temperaturi dodat je natrijum metoksid (12,6 g, 70 mmol). Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 4 sata, rastvor je razblažen vodom

(200 mL), i zatim ekstrahovan etil acetatom (3 × 60 mL). Organske faze su kombinovane, isprane zasićenim rastvorom soli (2 × 100 mL), osušene preko anhidratnog natrijum sulfata i filtrirane. Filtrat je koncentrovan do suvosti pod sniženim pritiskom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 1b (10 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 98%.

MS m/z (ESI): 212 [M+1]

Korak 2

2-Metoksi-3-nitrobenzamid (1c)

Rastvoru metil 2-metoksi-3-nitrobenzoata 1b (10 g, 47 mmol) u metanolu (40 mL) na sobnoj temperaturi dodat je amonijum hidroksid (20 mL). Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 48 sati, rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 1c (sirovo, 10 g, čvrsta supstanca). Sirovi proizvod je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

MS m/z (ESI): 197 [M+1]

1

Korak 3

3-(2-Metoksi-3-nitrofenil)-1H-1,2,4-triazol (1d)

Rastvor 2-metoksi-3-nitrobenzamida 1c (10 g, 51 mmol) u N,N-dimetilformamid dimetil acetalu (50 mL) je zagrejan na 95°C i mešan 2 sata. Posle hlađenja do sobne temperature, rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i talog je rastvoren u etanolu (30 mL) da bi se dobio rastvor A. Hidrazin hidrat (25 mL) je polako dodavan smeši sirćetne kiseline (35 mL) i etanola. (150 mL) na 0°C, nakon čega je usledilo dodavanje rastvora A. Posle postepenog zagrevanja do sobne temperature i mešanja tokom 12 sati, rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Talog je dispergovan u vodi (400 mL) i filtriran. Dobijena čvrsta supstanca je isprana vodom i osušena da bi se dobilo ciljno jedinjenje 1d (6 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 55%.

MS m/z (ESI): 221 [M+1]

Korak 4

3-(2-Metoksi-3-nitrofenil)-1-(metil-d3)-1H-1,2,4-triazol (1e)

Smeši 3-(2-metoksi-3-nitrofenil)-1-(metil-d3)-1H-1,2,4-triazola 1d (1,2 g, 5,3 mmol), kalijum karbonata (2,2 g, 16 mmol) i N,N-dimetilformamida (10 mL) je dodat deuterisani jodometan (1 g, 6,9 mmol). Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 12 sati, dobijeni rastvor je prečišćen pripremnim HPLC-om reverzne faze da bi se dobilo ciljno jedinjenje 1e (530 mg, čvrsta supstanca) sa prinosom od 42%.

MS m/z (ESI): 238 [M+1]

1

Korak 5

2-Metoksi-3-(1-(metil-d3)-1H-1,2,4-triazol-3-il)anilin (1f)

Rastvoru 3-(2-metoksi-3-nitrofenil)-1-(metil-d3)-1H-1,2,4-triazola 1e (530 mg, 1,61 mmol) u metanolu (10 mL) dodato je 10% paladijuma na ugljeniku (50 mg). Reakciona smeša je mešana u vodoničkoj atmosferi 12 sati i zatim filtrirana. Filtrat je koncentrovan do suvosti pod sniženim pritiskom da bi se dobio ciljni proizvod 1f (430 mg, čvrsta supstanca). Proizvod je upotrebljen u sledećoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.

MS m/z (ESI): 208 [M+1]

Korak 6

Litijum 4,6-dihloropiridazin-3-karboksilat (1h)

Smeši metil 4,6-dihloropiridazin-3-karboksilata 1 g (5 g, 24,15 mmol), diizopropiletilamina (9,4 g, 72,5 mmol), acetonitrila (13,5 mL) i vode (3,25 mL) dodat je litijum-bromid (6,3 g, 72,5 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 12 sati i filtrirana. Dobijena čvrsta supstanca je isprana acetonitrilom (8 mL) i osušena pod vakuumom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 1h (4,53 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 90%.

MS m/z (ESI): 193 [M+1]

1

Korak 7

Cink 6-hloro-4-((2-metoksi-3-(1-(metil-d3)-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)piridazin-3-karboksilat (1i)

Smeši litijum 4,6-dihloropiridazin-3-karboksilata 1h (380 mg, 1,9 mmol), 2-metoksi-3-(1-(metil-d3)-1H-1,2,4-triazol-3- il)anilina 1f (471 mg, 2,27 mmol), izopropanola (0,5 mL) i vode (5 mL) je dodat cink acetat (350 mg, 1,9 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je zagrejana na 65°C i mešana 12 sati. Posle hlađenja do sobne temperature, reakciona smeša je razblažena vodom (30 mL), mešana 30 minuta i filtrirana. Čvrsta supstanca je isprana vodom (2 × 30 mL) i tetrahidrofuranom (2 × 30 mL) i osušena pod vakuumom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 1i (490 mg, čvrsta supstanca) sa prinosom od 71%.

MS m/z (ESI): 364 [M+1]

Korak 8

Metil 6-(ciklopropankarboksamido)-4-((2-metoksi-3-(1-(metil-d3)-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)piridazin-3-karboksilat (1j)

Smeši cink 6-hloro-4-((2-metoksi-3-(1-(metil-d3)-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)piridazin-3- karboksilat 1i (490 mg, 1,15 mmol), ciklopropankarboksamid (300 mg, 3,45 mmol), (2R)-1-[(1R)-1-[bis(1,1-dimetiletil)fosfino]etil]-2-(dicikloheksilfosfino)ferocena (63 mg, 0,115 mmol), paladijum acetata (25 mg, 0,0575 mmol), toluen (9 mL) i acetonitrila (5 mL) dodati su kalijum karbonat (320 mg, 7,8 mmol) i 1,8-diazabicikloundek-7 -en (180 mg, 1,5 mmol) uzastopno. Dobijena smeša je mešana na 80°C tokom 72 sata pod azotom. Posle hlađenja do sobne temperature, rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i talog je prečišćen pripremnim HPLC-om sa reverznom fazom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 1j (560 mg, čvrsta supstanca) sa prinosom od 99%.

1

MS m/z (ESI): 413 [M+1]

Korak 9

6-(ciklopropankarboksamido)-4-((2-metoksi-3-(1-(metil-d3)-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)-N-(metil-d3)piridazin-3-karboksamid (1)

Smeša metil 6-(ciklopropankarboksamido)-4-((2-metoksi-3-(1-(metild3)-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)piridazin-3-karboksilata 1j (280 mg,

0,68 mmol), deuterisanog metilamin hidrohlorida (60 mg, 0,81 mmol), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida (181 mg, 0,95 mmol), 1-hidroksibenzotriazola (53 mg, 0,34 mmol), acetonitrila (3 mL), N-metilpirolidona i N-metilimidazola (41 mg, 0,5 mmol) je zagrejana do 65°C i mešana 1 sat. Posle hlađenja do sobne temperature, rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i talog je prečišćen pripremnim HPLC-om reverzne faze da bi se dobilo ciljno jedinjenje 1 (44 mg, čvrsta supstanca) sa prinosom od 15%.

MS m/z (ESI): 429 [M+1]

1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ11,32 (s, 1H), 10,97 (s, 1H), 9,13 (s, 1H), 8,56 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,65 (dd, J = 7,8, 1,5 Hz, 1H), 7,54-7,46 (m, 1H), 7,32-7,22 (m,

1H), 3,72 (s, 3H), 2,12-2,03 (m, 1H), 0,88-0,73 (m, 4H).

Primer 2.6-(ciklopropankarboksamido)-4-((2-metoksi-3-(1-(metil-d3)-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)-N metilpiridazin-3 -karboksamid (2)

Jedinjenje 2 je sintetizovano prema postupcima za primer 1 osim što je metilamin hidrohlorid (CH3NH2·HCl) korišćen u koraku 9 umesto deuterisanog metilamin hidrohlorida (CD3NH2·HCl).

1

MS m/z (ESI): 426 [M+1]

<1>H nMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,32 (s, 1H), 10,97 (s, 1H), 9,22-9,11 (m, 1H), ,56 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,66 (dd, J = 7,8, 1,5 Hz, 1H), 7,51 (dd, J = 8,0, 1,5 Hz, 1H), 7,31-7,22 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 2,86 (d, J = 4,8 Hz, 3H), 2,15-2,01 (m, 1H),

0,87-0,75 (m, 4H).

Primer 3.6-(ciklopropankarboksamido)-4-((2-(metoksi-d3)-3-(1-metil-1H-,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)-N-metilpiridazin-3-karboksamid (3)

2

Korak 1

N-metilformohidrazid

Rastvoru metilhidrazin sulfata 3a (40 g, 277 mmol) u metanolu (250 mL) na sobnoj temperaturi dodat je natrijum metoksid (100 g, 554 mmol). Dobijena smeša je mešana 24 sata i filtrirana. Filtratu je zatim dodat metil format (17 g, 277 mmol) i mešan je na sobnoj temperaturi 18 sati. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 5b (22 g, sirovo). Sirovi proizvod je direktno korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

MS m/z (ESI): 75 [M+1]

Korak 2

5-hloro-2-(metoksi-d3)benzonitril (3d)

Smeši 5-hloro-2-hidroksibenzonitrila 3c (4 g, 26 mmol), kalijum karbonata (7,3 g, 53 mmol) i N,N-dimetilformamida (30 mL) dodat je deuterisani metil jodid na sobnoj temperaturi (10 g, 78 mmol). Dobijena smeša je zagrejana do 70°C i mešana 12 sati. Posle hlađenja do sobne temperature, reakciona smeša je razblažena vodom (200 mL) i ekstrahovana etil acetatom (2 × 100 mL).

Kombinovane organske faze su isprane zasićenim rastvorom soli (2 × 100 mL), osušene preko anhidridnog natrijum sulfata, filtrirane i koncentrovane do suvosti pod sniženim pritiskom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 3d (4,3 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 97%.

MS m/z (ESI): 171 [M+1]

Korak 3

3-(5-hloro-2-(metoksi-d3)fenil)-1-metil-1H-1,2,4-triazol sulfat (3e)

Rastvoru kalijum tert-butoksida (11,3 g, 101 mmol) u tetrahidrofuranu (30 mL) na 0°C dodat je 5-hloro-2-(metoksi-d3)benzonitril 3d (4,3 g, 25,3 mmol) i rastvor N-metilformilhidrazida (4,1 g, 58 mmol) u tetrahidrofuranu (20 mL) uzastopno. Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 12 sati, smeši je dodata voda (50 mL), zagrejana je na 40°C i mešana 40 minuta. Posle hlađenja do sobne temperature, organska faza je odvojena, isprana zasićenim rastvorom soli

(40 mL), osušena preko anhidridnog natrijum sulfata, filtrirana i koncentrovana do suvosti. Talog je rastvoren u etil acetatu (40 mL). Dobijenom rastvoru je polako dodavana koncentrovana sumporna kiselina (5 g) na sobnoj temperaturi i mešan je 12 sati. Smeša je zatim filtrirana i osušena da bi se dobilo ciljno jedinjenje 3e (5,6 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 83%.

MS m/z (ESI): 227 [M+1]

Korak 4

3-(5-hloro-2-(metoksi-d3)-3-nitrofenil)-1-metil-1H-1,2,4-triazol (3f)

Rastvoru 3-(5-hloro-2-(metoksi-d3)fenil)-1-metil-1H-1,2,4-triazol sulfata 3e (5,6 g, 24,7 mmol) u sumpornoj kiselini (25 g) dodata je azotna kiselina (2 g) na 0°C. Dobijeni rastvor je postepeno zagrejan do sobne temperature, mešan 12 sati, i zatim ponovo ohlađen na 0°C. Voda (67 mL) i metanol (47 mL) su dodati u rastvor na 0°C, zatim zagrejani do sobne temperature i mešani 1 sat. Rastvor je zagrejan do 40°C i dodat mu je amonijum hidroksid (42 mL). Rastvor je ohlađen na 20°C, mešan 2 sata, i zatim filtriran. Čvrsta supstanca je isprana vodom (2 × 30 mL) i osušena pod vakuumom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 3f (3,37 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 50%.

MS m/z (ESI): 272 [M+1]

Korak 5

2-(Metoksi-d3)-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)anilin (3g)

Rastvoru 3-(5-hloro-2-(metoksi-d3)-3-nitrofenil)-1-metil-1H-1,2,4-triazola 3f (3,37 g, 12,25 mmol) u metanolu (10 mL) dodat je 10% paladijum na ugljeniku (400 mg) i natrijum bikarbonat (1,6 g, 25 mmol). Dobijena smeša je mešana u vodoničnoj atmosferi 12 sati i zatim filtrirana. Filtrat je koncentrovan do suvosti pod sniženim pritiskom i talog je rastvoren u dihlorometanu (25 mL). Dobijena smeša je filtrirana, i filtrat je koncentrovan do suvosti pod sniženim pritiskom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 3g (2,35 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 92%.

MS m/z (ESI): 208 [M+1]

Korak 6

Cink 6-hloro-4-((2-(metoksi-d3)-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)piridazin-3-karboksilat (3h)

Smeši litijum 4,6-dihloropiridazin-3-karboksilata 1h (3 g, 15,1 mmol), 2-(metoksi-d3)-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)anilina 3g (2,35 g, 11,3 mmol), izopropanola (2,5 mL) i vode (18 mL) na sobnoj temperaturi je dodat cink acetat (2,5 g, 13,6 mmol). Smeša je zagrejana na 65°C i mešana 12 sati. Posle hlađenja do sobne temperature, smeša je razblažena vodom (20 mL), mešana 30 minuta i filtrirana. Čvrsta supstanca je isprana vodom (2 × 30 mL) i tetrahidrofuranom (2 × 30 mL) i osušena pod vakuumom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 3h (4,3 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 100%.

MS m/z (ESI): 364 [M+1]

2

Korak 7

Metil 6-(ciklopropankarboksamido)-4-((2-(metoksi-d3)-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)piridazin-3- karboksilat (3i)

Smeša cink 6-hloro-4-((2-(metoksi-d3)-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)piridazin-3-karboksilata 3h (4,3 g, 11 mmol), ciklopropankarboksamida (2,4 g, 27,56 mmol), (2R)-1-[(1R)-1-[bis(1,1-dimetiletil)fosfino]etil]-2-(dicikloheksilfosfino)ferocena (600 mg, 1,1 mmol), paladijum acetata (125 mg, 0,55 mmol), toluena (34 ml), acetonitrila (17 ml), kalijum karbonata (3,1 g, 22 mmol) i 1,8-diazabiciklound-7-ena (1,7 g, 11 mmol) je zagrejana do 80°C u azotnoj atmosferi i mešana 12 sati. Posle hlađenja do sobne temperature, smeši su dodati vodeni rastvor sirćetne kiseline (50%, 17 ml) i glacijalne sirćetne kiseline (40 ml) uzastopno. Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, dobijena homogena smeša je isprana petrolej etrom (2 × 20 ml). Dodata je voda (50 ml) i smeša je ostavljena na sobnoj temperaturi 4 sata i zatim filtrirana. Čvrsta supstanca je isprana vodenim rastvorom acetonitrila (50%, 20 ml) i acetonitrilom (20 ml) uzastopno, i zatim sušena pod vakuumom na 65°C tokom 30 minuta da bi se dobio ciljni proizvod 3i (3 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 66%.

MS m/z (ESI): 413 [M+1]

Korak 8

6-(ciklopropankarboksamido)-4-((2-(metoksi-d3)-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)-N-metilpiridazin-3-karboksamid

Smeša metil 6-(ciklopropankarboksamido)-4-((2-(metoksi-d3)-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)piridazina-3-karboksilata 3i (1,5 g, 3,38 mmol), metilamin hidrohlorida (280 mg, 4,0 mmol), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida (900 mg, 4,73 mmol), 1-hidroksibenzotriazola (230 mg, 1,7 mmol), acetonitrila (3 ml), N-metilpirolidona (3 ml) i N-metilimidazola (200 mg, 2,4 mmol) je zagrejana do 65°C i mešana 12 sati. Nakon što je reakcija završena, reakcija je ugašena vodom (1,5 ml) i acetonitrilom (4,5 ml). Dobijena smeša je stajala na 65°C 1 sat i na 0°C 3 sata, i zatim je filtrirana. Čvrsta supstanca je uzastopno isprana vodenim rastvorom acetonitrila (33%, 4,5 ml) i acetonitrilom (4,5 ml), i sušena pod vakuumom na 65°C tokom 8 sati da bi se dobio ciljni proizvod 3 (811 mg, čvrsta supstanca) sa prinosom od 56%.

MS m/z (ESI): 426 [M+1]

<1>H nMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,32 (s, 1H), 10,97 (s, 1H), 9,24-9,08 (m, 1H), 8,57 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,66 (dd, J = 7,8, 1,5 Hz, 1H), 7,52 (dd, J = 7,9, 1,5 Hz, 1H), 7,33-7,20 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 2,87 (d, J = 4,8 Hz, 3H), 2,14-2,01 (m, 1H),

0,91-0,73 (m, 4H).

Jedinjenje 3 se može pretvoriti u HCl so putem sledeće procedure:

Reakcionom balonu su dodati 3 (5,00 g, 11,752 mmol) i DMSO (27 ml). Dobijena smeša je zagrejana na 50~55°C uz mešanje dok se čvrsta supstanca potpuno nije rastvorila do homogenog rastvora. Smeši je zatim dodata koncentrovana hlorovodonična kiselina (36%-38%, 1,18 g), i zatim voda (3 ml) i kristalno seme (25 mg). Dobijena smeša je mešana na 50~55°C tokom 0,5 h, ohlađena na 35~40°C, dodat joj je izopropanol (60 ml) u kapima tokom 0,5-1,0 h, i mešana je na 35~40°C tokom 0,5 h. Smeša je polako hlađena na 20~25°C tokom 1 h, mešana preko noći, i zatim filtrirana. Filterski kolač je ispran izopropanolom (2 × 15 ml) i osušen pod sniženim pritiskom na 65°C preko noći da bi se dobila mono-HCl so 3 (4,5 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 83%.

MS m/z (ESI): 426 [M+1]

2

<1H>NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,72 (brs, 1H), 12,13 (s, 1H), 11,40 (s, 1H), 9,22 (q, J = 4,5 Hz, 1H), 8,87 (s, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,78 (dd, J = 7,9, 1,5 Hz, 1H), 7,61 (dd, J = 8,0, 1,4 Hz, 1H), 7,35 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 4,01 (s, 3H), 2,89 (d, J = 4,8 Hz,

3H), 2,14-2,00 (m, 1H), 1,00-0,84 (m, 4H).

Primer 4.6-(ciklopropankarboksamido)-4-((2-(metoksi-d3)-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)-N-(metil-d3)piridazin-3-karboksamid (4)

Jedinjenje 4 je sintetizovano prema postupcima za primer 3 osim što je deuterisani metilamin hidrohlorid (CD3NH2·HCl) korišćen u koraku 8 umesto metilamin hidrohlorida (CH3NH2·HCl).

MS m/z (ESI): 429 [M+1]

<1>H nMR (400 MHz, DMSO-d6) δ11,32 (s, 1H), 10,98 (s, 1H), 9,14 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,66 (dd, J= 7,8, 1,6 Hz, 1H), 7,52 (dd, J= 7,9, 1,5 Hz, 1H), 7,32-7,21 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 2,14-2,03 (m, 1H ), 0,89-0,75 (m, 4H).

Primer 5 (ne prema pronalasku). (S)-6-(2,2-difluorociklopropan-1-karboksamido)-4-((2-metoksi-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)-N-(metild3)piridazin-3-karboksamid (5)

2

Korak 1

(S)-N-(2,4-Dimetoksibenzil)-2,2-difluorociklopropan-1-karboksamid (5b)

Smeši (S)-2,2-difluorociklopropan-1-karboksilne kiseline 5a (1,5 g, 12,3 mmol), HATU (5,7 g, 15 mmol), diizopropiletilamina (4,8 g, 37 mmol) i N,N-dimetilformamida (15 ml) je dodat 2,4-dimetoksibenzilamin (4,0 g, 24,4 mmol). Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 3 sata, rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i talog je prečišćen pripremnim HPLC-om reverzne faze da bi se dobilo ciljno jedinjenje 5b (4,4 g, čvrsta supstanca).

MS m/z (ESI): 272 [M+1]

2

Korak 2

(S)-2,2-difluorociklopropan-1-karboksamid (5c)

Rastvor (S)-N-(2,4-dimetoksibenzil)-2,2-difluorociklopropan-1-karboksamida 5b u trifluorosirćetnoj kiselini (10 ml) je zagrevan do 70°C i mešan 1 sat. Posle hlađenja do sobne temperature, smeša je koncentrovana do suvosti, i talog je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (dihlorometan/metanol od 100/0 do 9/1) da bi se dobilo ciljno jedinjenje 5d (1,4 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 93% u dva koraka.

MS m/z (ESI): 122 [M+1]

Korak 3

3-(5-hloro-2-metoksifenil)-1-metil-1H-1,2,4-triazol (5d)

Rastvoru kalijum tert-butoksida (34 g, 290 mmol) u tetrahidrofuranu (200 ml) na 0°C dodati su 5-hloro-2-metoksi-benzonitril (20 g, 120 mmol) i metilformil hidrazid 3b (22 g , sirov) uzastopno. Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 72 sata, dodata je voda (500 ml) i smeša je ekstrahovana etil acetatom (3 × 300 ml). Organske faze su kombinovane, isprane zasićenim rastvorom soli (2 × 300 ml), osušene preko anhidridnog natrijum sulfata, filtrirane i koncentrovane do suva pod sniženim pritiskom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 5d (17,1 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 88%.

MS m/z (ESI): 224 [M+1]

2

Korak 4

3-(5-hloro-2-metoksi-3-nitrofenil)-1-metil-1H-1,2,4-triazol (5e)

Rastvoru 3-(5-hloro-2-metoksifenil)-1-metil-1H-1,2,4-triazola 5d (16,13 g, 72 mmol) u koncentrovanoj sumpornoj kiselini (72 g) dodat je koncentrovana azotna kiselina (8,5 g, 87 mmol) na 0°C. Posle mešanja tokom 2 sata, dobijeni rastvor je dodat u smešu vode (250 g) i metanola (150 g) na 0°C. Smeša je zatim podešena na pH > 7 sa amonijum hidroksidom i filtrirana. Čvrsta supstanca je isprana vodom (2 × 100 ml) i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (petrol etar/etil acetat od 100/0 do 3/7) da bi se dobio ciljni proizvod 5e (17,1 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 88%.

MS m/z (ESI): 269 [M+1]

Korak 5

2-metoksi-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)anilin (5f)

Rastvoru 3-(5-hloro-2-metoksifenil)-1-metil-1H-1,2,4-triazola 5e (17 g, 63 mmol) u metanolu dodat je 10% paladijum na ugljeniku (3 g) i natrijum bikarbonat (10,5 g, 126 mmol). Smeša je mešana u vodoničnoj atmosferi 5 sati i zatim filtrirana. Filtrat je koncentrovan do suvosti pod sniženim pritiskom i talog je prečišćen pripremnim HPLC-om reverzne faze da bi se dobilo ciljno jedinjenje 5f (8,8 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 68%.

MS m/z (ESI): 205 [M+1]

2

Korak 6

Cink 6-hloro-4-((2-metoksi-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)piridazin-3-karboksilat (5g)

Smeši litijum 4,6-dihloropiridazin-3-karboksilata 1h (4,53 g, 22,87 mmol), 2-metoksi-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)anilina 5f (5,6 g,

27,44 mmol), izopropanola (4,5 ml) i vode (34 ml) je dodat cink acetat (4,2 g, 22,87 mmol). Dobijena smeša je zagrejana na 65°C i mešana 12 sati. Posle hlađenja do sobne temperature, smeša je razblažena vodom (30 ml), ostavljena 30 minuta i zatim filtrirana. Čvrsta supstanca je isprana vodom (2 × 30 ml) i tetrahidrofuranom (2 × 30 ml) i osušena pod vakuumom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 5g (7,6 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 93%.

MS m/z (ESI): 361 [M+1]

Korak 7

Cink (S)-6-(2,2-difluorociklopropan-1-karboksamido)-4-((2-metoksi-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)piridazin-3-karboksilat (5h)

Smeša cink 6-hloro-4-((2-metoksi-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil) amino)piridazin-3-karboksilata 5g (1,6 g, 3,93 mmol), (S)-2,2-difluorociklopropan-1-karboksamida 5c (1,2 g, 9,8 mmol), (2R)-1-[(1R)-1-[bis(1,1-dimetiletil)fosfino]etil]-2-(dicikloheksilfosfino)ferocena (220 mg, 0,393 mmol), paladijum acetata (44 mg, 0,196 mmol), toluena (18 ml), acetonitrila (11 ml), kalijum karbonata (1,1 g, 7,8 mmol) i 1,8-diazabicikloundek-7-ena (600 mg, 3,93 mmol) je mešan na 80°C tokom 72 sata u azotnoj atmosferi. Posle hlađenja do sobne temperature, smeša je razblažena sirćetnom kiselinom (27 ml) i vodom (9 ml), i dobijeni rastvor je ispran petrol etrom (2 × 30 ml). Zatim je dodata voda (50 ml) i ostavljena 3 sata. Smeša je filtrirana i čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 5h (1,1 g, čvrsta supstanca) sa prinosom od 62%.

MS m/z (ESI): 446 [M+1]

Korak 8

(S)-6-(2,2-difluorociklopropan-1-karboksamido)-4-((2-metoksi-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)-N-(metil-d3)piridazin-3-karboksamid

Smeši cink (S)-6-(2,2-difluorociklopropan-1-karboksamido)-4-((2-metoksi-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)piridazin-3-karboksilata 5h (1,1 g,

2,46 mmol), deuterisanog metilamin hidrohlorida (210 mg, 2,95 mmol), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida (660 mg, 3,44 mmol), 1-hidroksibenzotriazola (190 mg, 1,23 mmol), acetonitrila (6 ml) i N-metilpirolidona (6 ml) je dodat N-metilimidazol (141 mg, 1,72 mmol). Reakciona smeša je zagrejana do 65°C i mešana 1 sat. Posle hlađenja do sobne temperature, smeša je koncentrovana do suvosti pod sniženim pritiskom i talog je prečišćen pripremnim HPLC-om sa reverznom fazom da bi se dobilo ciljno jedinjenje 5 (420 mg, čvrsta supstanca) sa prinosom od 37%.

MS m/z (ESI): 462 [M+1]

<1>H nMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,52 (s, 1H), 11,01 (s, 1H), 9,18 (s, 1H), 8,58 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,67 ( dd, J = 7,8, 1,6 Hz, 1H), 7,53 (dd, J = 7,9, 1,5 Hz, 1H), 7,33-7,23 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 3,13-2,97 (m, 1H), 2,10-1,95 (m, 2H).

1

Primer 6 (ne prema pronalasku). (S)-6-(2,2-difluorociklopropan-1-karboksamido)-4-((2-metoksi-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)-N-metilpiridazin-3-karboksamid (6)

Jedinjenje 6 je sintetizovano u skladu sa procedurama primera 5 osim što je deuterisani metilamin hidrohlorid (CD3NH2·HCl) u koraku 8 zamenjen metilamin hidrohloridom (CH3NH2·HCl).

MS m/z (ESI): 459 [M+1]

<1>H nMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,52 (s, 1H), 11,01 (s, 1H), 9,20 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 8,56 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,67 (dd, J = 7,8, 1,6 Hz, 1H), 7,52 (dd, J = 8,0, 1,5 Hz, 1H), 7,33-7,23 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,73 (s , 3H), 3,11-2,98 (m, 1H), 2,86 (d,

J = 4,8 Hz, 3H), 2,10-1,94 (m, 2H).

Primer 7 (ne prema pronalasku). (R)-6-(2,2-difluorociklopropan-1-karboksamido)-4-((2-metoksi-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)-N-(metild3)piridazin-3-karboksamid (7) Jedinjenje 7 je sintetizovano u skladu sa procedurama primera 5 osim što je (S)-2,2-difluorociklopropan-1-karboksilna kiselina (5a) u koraku 1 zamenjena sa (R)-2,2-difluorociklopropan-1-karboksilnom kiselinom.

MS m/z (ESI): 462 [M+1]

<1H>NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,52 (s, 1H), 11,01 (s, 1H), 9,18 (s, 1H), 8,56 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,67 (dd, J = 7,8, 1,6 Hz, 1H), 7,53 (dd, J = 7,9, 1,5 Hz, 1H), 7,28 (m, 1H), 3,95 (s, 2H), 3,73 (s, 3H), 3,11-2,99 (m, 1H), 2,10-1,95 (m, 2H).

2

Primer 8 (ne prema pronalasku). (R)-6-(2,2-difluorociklopropan-1-karboksamido)-4-((2-metoksi-3-(1-metil-1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)amino)-N-metilpiridazin-3-karboksamid (8) Jedinjenje 8 je sintetizovano u skladu sa procedurama iz primera 5 osim što je (i) (S)-2,2-difluorociklopropan-1-karboksilna kiselina (5a) u koraku 1 zamenjena sa (R)-2,2-difluorociklopropan-1-karboksilna kiselinom, i (ii) deuterisanim metilamin hidrohlorid (CD3NH2·HCl) u koraku 8 zamenjen metilamin hidrohloridom (CH3NH2·HCl).

MS m/z (ESI): 459 [M+1]

<1>H nMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,52 (s, 1H), 11,01 (s, 1H), 9,27-9,16 (m, 1H), 8,56 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,67 (dd, J = 7,8, 1,6 Hz, 1H), 7,52 (dd, J = 8,0, 1,5 Hz, 1H), 7,33-7,24 (m, 1H), 3,95 (s, 2H), 3,73 (s, 2H) , 3,11-2,99 (m, 1H), 2,86 (d, J =

4,8 Hz, 3H), 2,08-1,95 (m, 2H).

Primer 9. Ispitivanje enzimske aktivnosti kinaznog domena JAK2

Efekat jedinjenja predmetnog pronalaska na enzimsku aktivnost rekombinantnog JAK2 kinaznog domena (JH1) se procenjuje detekcijom nivoa fosforilacije supstrata u reakciji kinaze korišćenjem HTRF kompleta za detekciju kinaze (Cisbio, kat. br.62TK0PEC) (Tabela 1).

Eksperimentalni postupak je generalno opisan u nastavku:

Reakcioni pufer koji sadrži sledeće komponente: enzimski pufer (1×), 5 mm mgCl2, 1 mm DTT i 0,01% Brij35 iz kompleta; protein humanog rekombinantnog JAK2 kinaznog domena (Carna Biosciences, Kat. br.08-045) razblažen do rastvora od 0,15 ng/µl sa reakcionim puferom; reakcioni rastvor supstrata koji sadrži 2,5 µm ATP i supstrat biotinilisane tirozin kinaze razblažen do 0,25 µm sa reakcionim puferom; detekcijski rastvor koji sadrži 0,1 ng/µl Eu<3+>obeleženog kaveznog antitela (Cisbio, Kat. br.61T66KLB) i 12,5 nM obeleženog streptavidinom XI,665 (Cisbio, Kat. br.610SAXLB) u reakcionom puferu.

Testno jedinjenje je rastvoreno do 1 mm u DMSO, čemu je usledilo serijsko 4-struko razblaživanje sa DMSO do minimalne koncentracije od 61 nM. Svaka koncentracija je dalje razblažena 40-struko sa reakcionim puferom.

Mikrotitracijskoj ploči sa 384 bunarića (Corning, Kat. br. 3674) dodato je 4 µl rastvora jedinjenja i 2 µl JAK2 kinaznog rastvora. Smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 15 minuta, i zatim joj je dodato 4 µl reakcionog rastvora supstrata. Posle dalje inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, reakcionoj smeši je dodata jednaka zapremina 10 µl rastvora za detekciju i ostavljena je na sobnoj temperaturi 30 minuta. Čitač ploča Envision (Perkin Elmer) se zatim koristi za merenje napretka reakcije na 620 nM i 665 nM. Odnos apsorbancija na 665 nM i 620 nM je u pozitivnoj korelaciji sa stepenom fosforilacije supstrata, stoga se detektuje aktivnost JAK2 kinaze. U ovom eksperimentu, grupa bez JAK2 proteinske kinaze je 100% inhibiciona grupa, i grupa sa JAK2 proteinskom kinazom, ali ne i testnim jedinjenjem, je grupa sa 0% inhibicije.

Procenat inhibicije kinazne aktivnosti JAK2 od strane testnog jedinjenja se izračunava korišćenjem sledeće formule:

Procenat inhibicije = 100 - 100* (odnosjedinjenja - odnos100% inhibicije)/(odnos0% inhibicije -odnos100% inhibicije)

Vrednost IC50 testnog jedinjenja se izračunava iz 8 tačaka koncentracije korišćenjem XLfit softvera (ID Business Solutions Ltd., UK) po sledećoj formuli:

Y = dno (vrh - dno)/(1+10^((logIC50 - X) x faktor nagiba))

4

Gde je Y procenat inhibicije, X je logaritam koncentracije testnog jedinjenja, dno je vrednost donjeg platoa krivulje u obliku slova S, vrh je vrednost gornjeg platoa krivulje u obliku slova S, i faktor nagiba je koeficijent nagiba krive.

Primer 10. Test enzimske aktivnosti TYK2 kinaznog domena

Efekat jedinjenja iz predmetnog pronalaska na enzimsku aktivnost rekombinantnog TYK2 kinaznog domena (JH1) se procenjuje detekcijom nivoa fosforilacije supstrata u reakciji kinaze korišćenjem HTRF kompleta za detekciju kinaze (Cisbio, Kat. br.62TK0PEC) (Tabela 1).

Eksperimentalni postupak je generalno opisan u nastavku:

Reakcioni pufer koji sadrži sledeće komponente: enzimski pufer (1×), 5 mm mgCl2, 1 mm DTT, 10 nM SEB (Cisbio, Kat. br.61SEBALB), 0,625 mm EGTA i 0,01% Brij35 iz kompleta; humani rekombinantni TYK2 kinazni (JH1) proteinski domen (Carna Biosciences, Kat. br.08-147) razblažen do rastvora od 0,25 ng/µl sa reakcionim puferom; reakcioni rastvor supstrata koji sadrži 11,25 µm ATP i supstrat biotinilisane tirozin kinaze razblažen do 0,5 µm sa reakcionim puferom; detekcijski rastvor koji sadrži 0,1 ng/µl Eu<3+>obeleženog kaveznog antitela (Cisbio, Kat. br.61T66KLB) i 25 nM obeleženog streptavidinom XI,665 (Cisbio, Kat. br.610SAXLB) u reakcionom puferu.

Testno jedinjenje je rastvoreno do 1 mm u DMSO, čemu je usledilo serijsko 4-struko razblaživanje sa DMSO do minimalne koncentracije od 61 nM. Svaka koncentracija je dalje razblažena 40-struko sa reakcionim puferom.

Mikrotitracijskoj ploči sa 384 bunarića (Corning, kat. br.3674) dodaje se 4 µl rastvora jedinjenja i 2 µl rastvora TYK2 kinaze. Smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 15 minuta, i zatim joj je dodato 4 µl reakcionog rastvora supstrata. Posle dalje inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta, reakcionoj smeši je dodata jednaka zapremina 10 µl rastvora za detekciju i ostavljena je na sobnoj temperaturi 30 minuta. Čitač ploča Envision (Perkin Elmer) se zatim koristi za merenje napretka reakcije na 620 nM i 665 nM. Odnos apsorbancija na 665 nM i 620 nM je u pozitivnoj korelaciji sa stepenom fosforilacije supstrata, stoga se detektuje aktivnost TYK2 kinaze. U ovom eksperimentu, grupa bez TYK2 proteinske kinaze je 100% inhibiciona grupa, i grupa sa TYK2 proteinskom kinazom, ali ne i testnim jedinjenjem, je grupa sa 0% inhibicije. Procenat inhibicije kinazne aktivnosti TYK2 od strane testnog jedinjenja se izračunava korišćenjem sledeće formule:

Procenat inhibicije = 100 - 100* (odnosjedinjenja - odnos100% inhibicije)/(odnos0% inhibicije -odnos100% inhibicije)

Vrednost IC50 testnog jedinjenja se izračunava iz 8 tačaka koncentracije korišćenjem XLfit softvera (ID Business Solutions Ltd., UK) po sledećoj formuli:

Y = dno (vrh - dno)/(1+10^((logIC50 - X) x faktor nagiba))

Gde je Y procenat inhibicije, X je logaritam koncentracije testnog jedinjenja, dno je vrednost donjeg platoa krivulje u obliku slova S, vrh je vrednost gornjeg platoa krivulje u obliku slova S, i faktor nagiba je koeficijent nagiba krive.

Primer 11. Test vezivanja domena TYK2 pseudokinaze

Vezivanje jedinjenja iz predmetnog pronalaska za TYK2 pseudokinazni domen (JH2) se određuje korišćenjem biohemijskog testa prenosa energije fluorescencije (TR-FRET) kroz konkurenciju sa komercijalnom fluoresceinom obeleženom sondom (Aleka-Fluor 647-konjugovani marker kinaze 178) (Tabela 1).

Eksperimentalni postupak je generalno opisan u nastavku:

Pufer za vezivanje sadrži 20 mm Hepes pH 7,5, 150 mm NaCl, 10 mm mgCl2, 0,015% Brij35, 2 mm DTT, 0,625 mm EGTA i 100 mm KF. JH2 domen TYK2 (aminokiseline 556-871 unutar proteina pune dužine) je eksprimovan i prečišćen pomoću platforme za prečišćavanje i identifikaciju proteina Univerziteta Tsinghua. Testno jedinjenje je rastvoreno do 0,1 mm u DMSO, čemu je usledilo serijsko 4-struko razblaživanje sa DMSO do minimalne koncentracije od 61 nM. Svaka koncentracija je dalje razblažena 40-struko sa reakcionim puferom.

Mikrotitracijskoj ploči sa 384 bunarića (Corning, Kat. br. 4512) dodato je 5 µl rastvora jedinjenja i 5 µl rastvora TYK2 JH2 domena (160 nM). Smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 30 minuta, i zatim joj je dodato 10 µl smeše fluoresceinom obeležene sonde (ThermoFisher, Kat. br. PV5593) (20 nM) i gST-Evropijumom (Eu) obeleženog antitela (Cisbio, Kat. br.61GSTKLA) (40 ng/ml). Nakon dalje inkubacije na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 minuta, HTRF signal (odnos intenziteta fluorescencije na emisijskoj talasnoj dužini od 615 nM i 665 nM za akceptor fluoresceina i donor evropijuma, respektivno) se meri na Envision čitaču ploča (Perkin Elmer). Procenat inhibicije se izračunava upoređivanjem sa pozitivnom kontrolom bez testnog jedinjenja i negativnom kontrolom bez proteina prema sledećoj formuli:

% inhibicije = 100 - 100* (signaljedinjenja - signalnegativne kontrole)/(signal pozitivne kontrole -signal negativne kontrole)

Vrednost IC50 testnog jedinjenja se izračunava iz 8 tačaka koncentracije korišćenjem XLfit softvera (ID Business Solutions Ltd., UK) po sledećoj formuli:

Y = dno (vrh - dno)/(1+10^((logIC50 - X) x faktor nagiba))

Gde je Y procenat inhibicije, X je logaritam koncentracije testnog jedinjenja, dno je vrednost donjeg platoa krivulje u obliku slova S, vrh je vrednost gornjeg platoa krivulje u obliku slova S, i faktor nagiba je koeficijent nagiba krive.

Tabela 1

Jedinjenja predmetnog pronalaska imaju slabu ili nisku inhibicionu aktivnost prema kinaznim domenima JAK2 ili TYK2. Tabela 1 pokazuje da su jedinjenja 2, 3 i 4 imala IC50 > 10 µm za direktnu inhibiciju kinazne aktivnosti, dok je referentno jedinjenje imalo niži IC50 od 2,9 µm. Sva testirana jedinjenja i referentna jedinjenja imala su snažno vezivanje za TYK2 JH2 (IC50 u nM rasponu)

Primer 12. Inhibicija IL-12 inducirane sekrecije IFN-γ u NK92 ćelijama

Efekat jedinjenja predmetnog pronalaska na TYK2 induciranu sekreciju IFN-γ u NK92 ćelijama je procenjen testom imunosorbenata povezanih sa enzimima (ELISA) (Tabela 2).

IL-12 receptor se uglavnom eksprimuje u aktiviranim T-ćelijama, NK ćelijama (NK92 je NK ćelijska linija), DC ćelijama, i B-ćelijama. Kada se vezuje za IL-12, aktivira put transdukcije JAK2/TYK2 signala unutar NK ćelija i T limfocita, čime indukuje sekreciju IFN-Y.

Eksperimentalni postupak je generalno opisan u nastavku:

Testno jedinjenje se rastvara do 2,5 mm u DMSO, čemu sledi serijsko 4-struko razblaživanje sa DMSO do minimalne koncentracije od 0,31 µm. Svaka koncentracija se dalje razblaži 50-struko sa MEMα medijumom bez FBS-a (Gibco, kat. br.12561-056).

NK92 ćelije (Nanjing Cobioer, Kat. br. CBP60980) se kultivišu u kompletnom MEMα, medijumu koji sadrži 12,5% FBS (Ausbian, Kat. br. VS500T), 12,5% konjski serum (Gibco, Kat. br.16050-122), 0,02 mm folne kiseline (Sigma, kat. br. F8758), 0,2 mm inozitola (Sigma, Kat. br.17850), 0,55 mm βmerkaptoetanola (Gibco, kat. br.21985-023), 200 U/ml IL-2 (R&D Sistems, kat. br.

202-1L) i 100 U/ml penicilina (ThermoFisher, Kat. br.15140122). Kada se pokrije 80-90% površine posude za kulturu, ćelije se raspršuju i postavljaju na mikrotitracijsku ploču sa 96 bunarića (ThermoFisher, Kat. br.167425) sa 100,000 ćelija po bunariću (80 µl kompletnog MEMα medijuma bez IL-2). Mikrotitarska ploča sa 96 jažica se zatim inkubira preko noći u CO2 inkubatoru na 37°C/5%.

Posle inkubacije preko noći, 10 µL testnog jedinjenja i 10 µL 50 ng/ml IL-12 (R & D Sistems, kat. br.219-1L) se dodaju u svaki bunar i lagano mešaju, i mikrotitracijska ploča sa 96 bunarića se inkubira u CO2 inkubatoru na 37°C/5% dodatna 24 sata. Mikrotitracijska ploča se centrifugira na 800 o/min tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi i 50 µl supernatanta iz svakog bunarića se prebacuje na drugu ploču sa 96 bunarića (Sigma, Kat. br. CLS3695) obloženu anti-IFN-γ antitelom. Količina sekrecije IFN-γ se detektuje prema uputstvima iz ELISA Humanog IFN-gama DuoSet kompleta (R & D Sistems, kat. br. DY285B). U eksperimentu, grupa sa IL-12 i testnim jedinjenjem koje je zamenjeno medijumom MEMα je nestimulisana kontrolna grupa (100% inhibicija), i grupa sa IL-12 i 0,2% DMSO je stimulisana grupa (0% inhibicije). Procenat inhibicije IL-12 indukovane sekrecije IFN-γ u ćelijama NK-92 od strane testnog jedinjenja se izračunava korišćenjem sledeće formule:

Procenat % inhibicije = 100 - 100* (signaljedinjenja - signalnestimulisane

kontrole)/(signalstimulisane kontrole - signalnestimulisane kontrole)

Vrednost IC50 testnog jedinjenja se izračunava iz 8 tačaka koncentracije korišćenjem XLfit softvera (ID Business Solutions Ltd., UK) po sledećoj formuli:

Y = dno (vrh - dno)/(1+10^((logIC50 - X) x faktor nagiba))

Gde je Y procenat inhibicije, X je logaritam koncentracije testnog jedinjenja, dno je vrednost donjeg platoa krivulje u obliku slova S, vrh je vrednost gornjeg platoa krivulje u obliku slova S, i faktor nagiba je koeficijent nagiba krive.

Tabela 2

Jedinjenja predmetnog pronalaska su imala značajan inhibitorni efekat na TYK2 indukovanu sekreciju IFN-γ u NK92 ćelijama.

4

Primer 13. In vivo određivanje PK kod pacova

Procenjena je farmakokinetika jedinjenja 3 predmetnog pronalaska i referentnog jedinjenja BMS-986165. Jedinjenje 3 ima OCD3 na benzenskom prstenu, dok referentno jedinjenje ima CD3 na amidnom delu. Metil grupa je tipično labilna in vivo, podložna hidrolizi amidazom u slučaju metilamida i oksidativnoj demetilaciji putem CYP u slučaju metoksi grupa i metiltriazola. Zamena metila sa tri-deuterisanim metilom poboljšava bioraspoloživost i in vivo izloženost jedinjenja i obezbeđuje bolju efektivnost jedinjenja pod istom dozom.

Jedinjenje 3 i referentno jedinjenje u rastvoru od 0,5 mg/ml koji sadrži 5% N,N-dimetilacetamida 20% solutola 75% fiziološkog rastvora oralno su davani trojici mužjaka Sprague Dawley pacova u dozi od 5 mg/kg. Uzorci krvi su sakupljeni 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 i 24 sata nakon primene. Koncentracije jedinjenja u plazmi su kvantifikovane pomoću LC-MS/MS pomoću API-4500 masenog spektrometra. granica kvantifikacije (LOQ) analize bila je 1 ng/ml.

Farmakokinetički (PK) parametri su izračunati nekompartmentalnim postupkom koristeći WinNonlin i prisutni su u tabeli 3. Rezultati pokazuju da je jedinjenje 3 predmetnog pronalaska imalo bolju izloženost in vivo od referentnog jedinjenja.

Tabela 3

Primer 14. In vivo procena efektivnosti u životinjskom modelu kolitisa indukovanog anti-CD40 antitelom

Ženke CB 17-Scid miševa (stare 8-10 nedelja, 18-20 g) iz laboratorije Beijing Vital River su nasumično podeljene u 5 grupa (n = 8 po grupi). Dana 0, kolitis je indukovan kod miševa, svaki sa jednom intraperitonealnom injekcijom od 100 µg FGK4.5 anti-CD40 mAb (BioXCell, Kat. br. EB0016-2) u PBS-u. Počevši od dana 0 do 7, miševima u grupama za lečenje je oralno davano 0, 1,5, 5, 15 mg/kg jedinjenja 3 ili 5 mg/kg BMS-986165 u nosaču DMSO/solutol/PEG-400 (10:5:30) dva puta po danu, dok je miševima u vehikulum grupi davan gore pomenuti vehikulum. Na dnevnoj bazi, miševima je merena težina i nadzirani su na znakove kolitisa, uključujući gubitak telesne težine i prateću nekompaktnu stolicu i dijareju. Dana 8, sve životinje su eutanazirane. Tkiva slezine su sakupljena i izmerena im je težina. Rezultati pokazuju da jedinjenje 3 u dozama od 1,5 mg/kg, 5 mg/kg i 15 mg/kg i referentno jedinjenje u dozi od 5 mg/kg značajno štite miševe od kolitisa sprečavajući gubitak telesne težine (SL.2, tabela 4) i povećanje slezine (tabela 4) u poređenju sa miševima u vehikulum grupi.

Tabela 4

_____________________

Claims (1)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje jedinjenja 2, 3 ili 4, ili farmaceutski prihvatljiva so istog.

   Jedinjenje 4 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, koje je jedinjenje 3, ili farmaceutski prihvatljiva so istog. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, koje je jedinjenje 2, ili farmaceutski prihvatljiva so istog. 4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, koje je jedinjenje 4, ili farmaceutski prihvatljiva so istog. 4