JP7743082B2

JP7743082B2 - Ｔｙｋ２活性を阻害する複素環式化合物

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Publication number: JP7743082B2
Application number: JP2022554545A
Authority: JP
Inventors: チェン、シャンヤン; パン、イーチョン
Original assignee: Beijing Innocare Pharma Tech Co Ltd
Current assignee: Beijing Innocare Pharma Tech Co Ltd
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2025-09-24
Anticipated expiration: 2041-03-09
Also published as: KR20220152303A; CN114650990B; WO2021180072A1; DK4038063T3; CN114650990A; SI4038063T1; LT4038063T; HRP20240643T1; PT4038063T; TWI900543B; PL4038063T3; BR112022017440A2; TW202144335A; FI4038063T3; HUE067219T2; JP2023524361A; EP4038063A4; AU2021234496B2; ES2981764T3; US11578058B2

Description

本発明は、ＴＹＫ２を調節してシグナル伝達を阻止するのに有用な複素環式化合物に関する。この化合物は動物で薬物動態を改善する。

チロシンキナーゼ２（ＴＹＫ２）は、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）ファミリーに属する非受容体チロシンプロテインキナーゼであり、ＩＬ-１２、ＩＬ-２３及びＩ型インターフェロン受容体の下流のシグナル伝達カスケードの調節に重要であることが示されている。

ＪＡＫの特徴はタンデムキナーゼドメインである。ＪＨ１はカノニカルなプロテインチロシンキナーゼドメインで、ＪＨ２はシュードキナーゼドメインに分類される。ＪＡＫファミリーの構造を図１に示す。

最近の生化学的及び構造的データは、ＴＹＫ２のシュードキナーゼドメインの触媒活性が低く、キナーゼドメインの活性を負に調節することを示唆している。

サイトカイン受容体にサイトカインが結合すると、細胞内領域に結合しているＴＹＫ２並びにそのファミリーメンバーであるＪＡＫ１及び／又はＪＡＫ２のリン酸化が生じ、二量体化してシグナル伝達及び転写活性化因子（ＳＴＡＴ）の活性化が生じる。次に、二量体化したＳＴＡＴは核内に移動し、関連遺伝子の発現と転写を調節し、細胞膜から核へのシグナル伝達を完了する。したがって、ＪＡＫはＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路によりサイトカインを介したシグナルを伝達し、細胞増殖、分化、アポトーシス、免疫応答など、多くの細胞機能、サイトカイン依存性調節に重要な役割を果たす。ＴＹＫ２欠損マウスは、大腸炎、乾癬、多発性硬化症の実験モデルに耐性があり、自己免疫疾患と関連疾患におけるＴＹＫ２を介したシグナル伝達の重要性を示す。

ヒトでは、ＴＹＫ２の不活性バリアントを発現する個体は、多発性硬化症や他の自己免疫疾患から保護されている可能性がある。ゲノムワイドの研究では、ＴＹＫ２の他のバリアントは、クローン病、乾癬、全身性エリテマトーデス、関節リウマチといった自己免疫疾患に関係していることが示され、自己免疫におけるＴＹＫ２の重要性が更に実証されている。

ＴＹＫ２ノックアウトマウスの赤血球数は正常で、生存できる。ＴＹＫ２発現の欠如は、さまざまな炎症誘発性サイトカインのシグナル伝達の弱体化とＴヘルパー細胞の分化の深刻な不均衡に現れる。遺伝関連の研究からの証拠は、共通の感受性自己免疫疾患遺伝子としてＴＹＫ２を支持する。ＴＹＫ２制御経路は、疾患治療の抗体療法で確認されている。例えば、乾癬治療のためにＩＬ-１２／ＩＬ-２３を標的とするウステキヌマブや、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）治療のためにＩ型インターフェロン受容体を標的とするアニフロルマブは、臨床試験で顕著な効果を示す。

ＴＹＫ２は、急性リンパ性白血病（Ｔ-ＡＬＬ）細胞の異常な生存とＴＹＫ２の活性化の相関関係により、一部のがんと関連している。Ｔ-ＡＬＬの癌遺伝子として、Ｔ-ＡＬＬ細胞株の８８％と患者由来のＴ-ＡＬＬ細胞の６３％が、遺伝子ノックアウト実験によりＴＹＫ２に依存していた（Sanda et. al, Cancer Disc. 2013, 3, 564-77）。ＴＹＫ２選択的阻害剤NDI-031301はアポトーシスを誘導し、ヒトＴ-ＡＬＬ細胞株の増殖を阻害し、ＫＯＰＴ-Ｋ１Ｔ-ＡＬＬ腫瘍細胞を用いたモデルマウスにおいて、良好な安全性と有効性を示し（Akahane et. al, British J. Haematol. 2017, 177, 271-82）、このことは、Ｔ-ＡＬＬを治療するためのＴＹＫ２の選択的阻害剤の可能性を示す。したがって、ＴＹＫ２は、炎症性疾患、自己免疫疾患及びがんを治療するためのホットなターゲットの１つである（Alicea-Velazquez et. al, Curr. Drug Targets 2011, 12, 546-55）。

ＴＹＫ２及びＪＡＫファミリーの他のメンバーは、構造的にキナーゼドメインＪＨ１（ＪＡＫ相同性１）に隣接するシュードキナーゼドメインＪＨ２（ＪＡＫ相同性２）を有する。ＪＨ２はＡＴＰに結合できるが、触媒機能を有さず、代わりにＪＨ１のキナーゼ活性を負に調節する（Staerk et. al, J. Biol. Chem. 2015, 280, 41893-99）。キナーゼドメインＪＨ１のＪＡＫファミリー（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３及びＴＹＫ２）間での高い配列類似性のため、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２又はＪＡＫ３のＪＨ１を阻害することなく、ＴＹＫ２のＪＨ１に対する選択的阻害剤の開発は困難である。トファシチニブ、ルキソリチニブ、バリシチニブ、ウパダシチニブなど、ＪＡＫのキナーゼドメインに結合するほとんどのＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫファミリー間の選択性が少なく、貧血など臨床的に用量依存的な副作用を示す。選択性の高いＴＹＫ２阻害剤の開発は、製薬会社の間で引き続き魅力的である。ＴＹＫ２のＪＨ１とＪＨ２のＡＴＰ結合ポケットの構造上の相違に基づいて、Bristol-Myers Squibb Companyは、ＪＡＫのキナーゼドメイン（ＪＨ１）に結合することなく、ＴＹＫ２が媒介する生理学的機能のみを阻害する、高度に選択的なＪＨ２結合剤BMS-986165を開発した。現在、BMS-986165は自己免疫疾患の第ＩＩＩ相臨床試験段階にある（Wrobleski et. al, J. Med. Chem. 2019, 62, 8973-95）。

BMS-986165の構造を以下に示す（国際公開第2014/074661号）：

ＴＹＫ２のシュードキナーゼドメイン（ＪＨ２）に選択的に結合し、ＪＡＫファミリー、特にＪＡＫ２のキナーゼドメインへの結合が最小限である新規化合物を開発する必要性が引き続き存在する。

図１は、ＪＡＫファミリー（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３及びＴＹＫ２）の一般的な二次構造を示す。図２は、抗ＣＤ４０抗体誘発ＩＢＤ大腸炎モデル動物によるin vivoでの有効性を示す。溶媒、参照化合物及び３つの異なる用量の化合物３で処置した動物の相対的な体重変化（％）を、処置後の日数に対してプロット。

本発明者らは、ＴＹＫ２の触媒活性部位を標的とするのではなく、ＴＹＫ２シュードキナーゼドメイン（ＪＨ２）を標的とする選択的ＴＹＫ２阻害剤を発見した。本発明は、化合物１～８及びその薬学的に許容される塩又はそのプロドラッグに関する。化合物１～８は、ＴＹＫ２のＪＨ２に対する選択的結合剤である。シュードキナーゼドメイン（ＪＨ２）に結合することにより、化合物１～８はＴＹＫ２のキナーゼ触媒活性を阻害し、タンパク質のリン酸化を阻害し、ＴＹＫ２の生理学的機能に対して有意な阻害効果を示す。化合物１～８は、ＴＹＫ２のキナーゼドメイン（ＪＨ１）に弱く結合するか、又は結合しない。化合物１～８は、ＪＨ２に結合することによってＴＹＫ２のキナーゼ活性を選択的に阻害し、他のＪＡＫファミリーメンバーのキナーゼ活性に対して低い阻害活性を有する。他のＪＡＫファミリーメンバー（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２及びＪＡＫ３）よりもＴＹＫ２を阻害する化合物１～８の選択性により、貧血などの副作用が最小限に抑えられる。化合物１～８は、動物で優れたin vivo薬物動態を有することが示されている。

本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒性を与えない塩である。薬学的に許容される塩の形態には、さまざまな結晶多形、並びに異なる塩の非晶質形態が含まれる。本塩基性複素環式化合物の薬学的に許容される塩は、無機酸又は有機酸で形成できる。

本明細書で使用される「プロドラッグ」は、対象への投与時に、代謝又は化学プロセスによる変換を受けて、化合物１～８の化合物及び／又はその塩を生じる化合物を指す。in vivoで変換されて化合物１～８の生物活性剤を提供する化合物は、本発明の範囲内のプロドラッグである。さまざまな形態のプロドラッグが当技術分野で周知である。

化合物１は、トリアゾール環に結合するトリ重水素化メチル基を有し、トリ重水素化メチルアミド基を有する。

化合物２は、トリアゾール環に結合するトリ重水素化メチル基を有する。

化合物３は、ベンゼン環に結合するトリ重水素化メトキシ基を有する。

化合物４は、ベンゼン環に結合するトリ重水素化メトキシ基を有し、トリ重水素化メチルアミド基を有する。

化合物５は、(S)-6-(2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド)基を有し、トリ重水素化メチルアミド基を有する。

化合物６は、(S)-6-(2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド)基を有するが、重水素化置換基は有していない。

化合物７は、(R)-6-(2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド)基を有し、トリ重水素化メチルアミド基を有する。

化合物８は、(R)-6-(2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド)基を有するが、重水素化置換基は有していない。

化合物１～５及び７は、薬物動態（ＰＫ）特性を改善するために、メチル基にいくつかの重水素置換がある。化合物５～８は、シクロプロパン環にジフルオロを有する。本発明の化合物は、ＪＡＫのキナーゼドメインに対する結合活性が低く、γ-インターフェロン及びＩＬ-２３分泌の阻害など、ＴＹＫ２の細胞機能に対して高い阻害活性を有する。本発明の化合物は、経口投与した場合、バイオアベイラビリティが良好である。本発明の化合物は安全に使用でき、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療に有効であることが、抗ＣＤ４０大腸炎（ＩＢＤ）モデルマウスで示され、化合物２、３及び５による処置後、体重は有意に減少しなかった。

医薬組成物
本発明は、１つ以上の薬学的に許容される担体及び化合物１～８の活性化合物又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を提供する。一般に、医薬組成物中の活性化合物又はその薬学的に許容される塩は、局所用製剤では約０．０１～２０％、０．０５～２０％、０．１～２０％、０．２～１５％、０．５～１０％又は１～５％(w/w)で、注射剤では約０．１～５％、貼付剤では０．１～５％、錠剤では約１～９０％、カプセル剤では１～１００％である。

ある態様では、活性化合物は許容される担体に配合され、それには、活性化合物を安定化させ、局所に適用することにより患部に送達できる、クリーム、ジェル、ローション又は他の懸濁液が含まれる。別の態様では、医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、貼付剤などの剤形であることができる。上記医薬組成物は常法で調製できる。

不活性成分である薬学的に許容される担体は、当業者が従来の基準によって選択できる。薬学的に許容される担体には、非水系溶液、懸濁剤、乳剤、マイクロエマルジョン、ミセル溶液、ゲル及び軟膏が含まれるが、これらに限定されるものではない。薬学的に許容される担体は、生理食塩水及び電解質水溶液；塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン及びぶどう糖といったイオン性及び非イオン性浸透剤；水酸化物、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩といったｐＨ調整剤及び緩衝剤；トロラミン；重亜硫酸塩、亜硫酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ亜硫酸塩、アスコルビン酸、アセチルシステイン、システイン、グルタチオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、トコフェロール類、パルミチン酸アスコルビルの、塩、酸及び／又は塩基などの酸化防止剤；ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルイノシチオールを含むがこれらには限定されないレシチン、リン脂質といった界面活性剤；ポロキサマー類及びポロキサミン類、ポリソルベート８０、ポリソルベート６０及びポリソルベート２０といったポリソルベート類、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールといったポリエーテル類；ポリビニルアルコール及びポビドンといったポリビニル類；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース並びにそれらの塩といったセルロース誘導体；鉱物油及び白色ワセリンといった石油誘導体；ラノリン、ピーナッツ油、パーム油、大豆油といった脂肪；モノ-、ジ-及びトリグリセリド類；カルボキシポリメチレンゲル及び疎水変性架橋アクリレート共重合体といったアクリル酸のポリマー類；デキストランといった多糖類、並びにヒアルロン酸ナトリウムといったグリコサミノグリカン類、を含むがこれらに限定されない成分も含んでいてもよい。このような薬学的に許容される担体は、塩化ベンザルコニウム、エチレンジアミン四酢酸及びその塩、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、メチルパラベン、チメロサール並びにフェニルエチルアルコールが含まれるが、これらには限定されない周知の保存剤を使用して細菌汚染から保護してもよく、また、単回使用又は複数回使用のための非保存製剤として製剤化してもよい。

例えば、活性化合物の錠剤又はカプセル剤は、生物活性を有さず、活性化合物と反応しない賦形剤を含んでいてもよい。錠剤又はカプセル剤の賦形剤には、充填剤、結合剤、潤滑剤及び流動促進剤、崩壊剤、湿潤剤及び放出速度調整剤が含まれてもよい。結合剤は、製剤粒子の接着を促進し、錠剤において重要である。錠剤又はカプセル剤の賦形剤の例には、限定されるものではないが、カルボキシメチルセルロース、セルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カラヤゴム、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、二酸化チタン、ポリ（アクリル酸）及びポリビニルピロリドンが含まれる。例えば、錠剤は、コロイド状二酸化ケイ素、クロスポビドン、ヒプロメロース、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、ポリエチレングリコール、デンプングリコール酸ナトリウム及び／又は二酸化チタンなどの不活性成分を含んでいてもよい。カプセル剤は、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、及び／又は二酸化チタンなどの不活性成分を含んでいてもよい。

例えば、活性化合物の貼付剤は、1,3-ブチレングリコール、アミノ酢酸ジヒドロキシアルミニウム、エデト酸二ナトリウム、D-ソルビトール、ゼラチン、カオリン、メチルパラベン、ポリソルベート８０、ポビドン、プロピレングリコール、プロピルパラベン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、酒石酸、二酸化チタン及び精製水などの不活性成分を含んでいてもよい。貼付剤は、また、乳酸エステル（例．乳酸ラウリル）又はジエチレングリコールモノエチルエーテルなどの皮膚透過性増強剤を含んでいてもよい。

活性化合物を含む局所用製剤は、ゲル、クリーム、ローション、液剤（liquid）、乳剤、軟膏、スプレー、液剤（solution）及び懸濁液の形態であってもよい。局所用製剤の不活性成分としては、例えば、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（皮膚軟化剤／浸透促進剤）、ＤＭＳＯ（溶解促進剤）、シリコーンエラストマー（レオロジー／質感調整剤）、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（皮膚軟化剤）、オクチサレート（皮膚軟化剤／ＵＶフィルター）、シリコーンオイル（皮膚軟化剤／希釈剤）、スクアレン（皮膚軟化剤）、ヒマワリ油（皮膚軟化剤）及び二酸化ケイ素（増粘剤）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

使用方法
本発明者は、本化合物がＴＹＫ２のシュードキナーゼドメイン（ＪＨ２）に特異的に結合し、ＮＫ９２細胞においてＴＹＫ２の生理学的機能を大幅に阻害することを実証した。これらの化合物は、ラットにおいても優れた薬物動態を示す。

本発明は、自己免疫疾患、炎症性疾患（腸の炎症を含む）、がん、皮膚疾患、糖尿病、眼疾患、神経変性疾患、アレルギー反応、喘息、他の閉塞性気道疾患及び移植拒絶反応などが含まれるがこれらには限定されないＴＹＫ２介在疾患を予防又は治療するための方法に関する。この方法は、炎症性腸疾患、乾癬及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療に特に有用である。この方法は、有効量の本発明の化合物又はそのプロドラッグ、その薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与することを含む。本明細書において「有効量」は、病的状態を改善するか、症状を軽減することによって疾患を治療するのに有効な量である。

本発明の医薬組成物は、局所投与及び全身投与により適用できる。局所投与には局部への投与が含まれる。全身投与には、経口（口腔内又は舌下を含む）、非経口（静脈内、筋肉内、皮下又は直腸など）及び他の全身投与経路が含まれる。全身投与では、活性化合物は最初に血漿に移行し、次に標的組織に分布する。局所投与及び経口投与は、本発明の好ましい投与経路である。

組成物の用量は、損傷の程度及び各患者の個々の応答に基づいて変化する。全身投与の場合、送達される活性化合物の血漿濃度はさまざまである；しかし、通常、１×１０^－１０～１×１０^－４ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１×１０^－８～１×１０^－５ｍｏｌ／Ｌである。

ある態様では、組成物を患部に局所的に塗布し、擦り込む。組成物は、医学的な出来事、及び疾患が慢性であるか急性であるかに応じて、少なくとも１日１回若しくは２回、又は１日３～４回、局所適用される。一般に、局所組成物は、約０．０１～２０％、０．０５～２０％、０．１～２０％、０．２～１５％、０．５～１０又は１～５％（w/w）の活性化合物を含む。活性化合物は皮膚を通過し、問題の部位に送達される。

ある態様では、医薬組成物は対象に経口投与される。経口投与の用量は、通常、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ／日であり、１０００ｍｇ／ｋｇ／日未満である。例えば、経口投与の投与量は、１日あたり化合物として０．５ｍｇ～１ｇ、好ましくは１ｍｇ～７００ｍｇ又は５ｍｇ～３００ｍｇである。

当業者は、多種多様な送達機構も本発明に適していることを認識する。

本発明は、ヒト、ウマ及びイヌといった哺乳動物を治療するのに有用である。本発明は、ヒトの治療に特に有用である。

以下の実施例は本発明を更に説明する。これらの実施例は、単に本発明を説明することを意図しており、限定するものと解釈されるべきではない。

実施例１～８に、本発明化合物の合成を説明する。反応の各段階の生成物は、抽出、ろ過、蒸留、結晶化及びクロマトグラフィー分離を含むがこれらには限定されない、当該技術分野において公知の分離技術によって得られる。合成に必要な出発物質と化学試薬は、文献（SciFinderで検索可能）に従って従来の方法で合成でき、又は購入できる。

化合物の構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）又は質量分析（ＭＳ）で決定する。ＮＭＲはBruker ASCEND-400 NMR分光計で測定した。溶媒は、重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ_６）、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ_３）又は重水素化メタノール（ＣＤ_３ＯＤ）を使用した。内部標準はテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を使用した。化学シフトの単位は１０^－６（ppm）である。

ＭＳはAgilent SQD(ESI)質量分析計（製造業者：Agilent, model: 6120）で測定した。

ＨＰＬＣは、Agilent 1260 DAD高圧液体クロマトグラフィー（Poroshell120 EC-C18、５０×３．０ｍｍ、２．７μｍカラム）又はWaters Arc高圧液体クロマトグラフィー（Sunfire C18、１５０×４．６ｍｍ、５μｍカラム）で測定した。

薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Qingdao Ocean GF254シリカゲルプレートを使用した。反応をモニタリングするためのＴＬＣ、生成物を分離・精製するためのＴＬＣは、それぞれ、厚さが０．１５～０．２ｍｍ、０．４～０．５ｍｍである。

カラムクロマトグラフィーの多くは、Qingdao Oceanシリカゲル２００～（３００メッシュ）を担体として使用して行った。

本発明で使用する公知の出発物質は、当該技術分野で公知の方法で合成でき、またはABCR GmbH & Co. KG、Acros Organics、Sigma-Aldrich Chemical Company、Accela ChemBio Inc.、Beijing Ouhe Chemicals及び他の企業から購入できる。

以下の実施例では、特に明記しない限り、反応は全てアルゴン雰囲気下または窒素雰囲気下で行った。

水素化反応は、通常、排気と水素の充填を３回繰り返す反応器内で行った。

マイクロ波反応は、CEM Discover-SPマイクロ波反応器を使用して行った。

以下の実施例では、反応温度は、特に明記しない限り２０℃～３０℃の室温である。

反応の進行はAgilent LCMS(1260/6120)でモニターした。また、ＴＬＣでもモニターした場合もある。ＴＬＣの溶媒は、Ａ：ジクロロメタン及びメタノール系；Ｂ：石油エーテル及び酢酸エチル系；Ｃ：実施例に示した系、を使用した。化合物の極性に応じて溶媒の体積比を調整した。

化合物の精製工程で使用するカラムクロマトグラフィー及びＴＬＣの溶離には、Ａ：ジクロロメタン及びメタノール系；Ｂ：石油エーテル及び酢酸エチル系；Ｃ：実施例に示した系、を使用した。化合物の極性に応じて溶媒の体積比を調整し、少量のトリエチルアミンと酸性又は塩基性試薬を加えて調整した。

化合物の精製には、Waters' mass spectrometry-oriented automated preparation system（prep-HPLC with a mass detector of SQD2）も使用した。化合物の極性に応じて、適切なアセトニトリル／水（０．１％トリフルオロ酢酸又はギ酸含有）又はアセトニトリル／水（０．０５％水酸化アンモニウム含有）溶出プロファイルを使用し、逆相高圧カラム（XBridge-C18、１９×１５０ｍｍ、５μｍ）により流量２０ｍＬ／分で行った。

実施例１ 6-(シクロプロパンカルボキサミド)-4-((2-メトキシ-3-(1-(メチル-d3)-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)-N-(メチル-d₃)ピリダジン-3-カルボキサミド(1)

工程１
2-メトキシ-3-ニトロ安息香酸メチル(1b)
2-フルオロ-3-ニトロ安息香酸メチル1a（10g、50mmol）のメタノール（50mL）溶液に、ナトリウムメトキシド（12.6g、70mmol）を室温で加えた。室温で４時間撹拌した後、溶液を水（200mL）で希釈し、次いで、酢酸エチル（3×60mL）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（2×100mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮乾固し、目的化合物１ｂ（10g、固体）を収率９８％で得た。

MS m/z (ESI): 212 [M+1]

工程２
2-メトキシ-3-ニトロベンズアミド(1c)
2-メトキシ-3-ニトロ安息香酸メチル1b（10g、47mmol）のメタノール（40mL）溶液に水酸化アンモニウム（20mL）を室温で加えた。室温で４８時間撹拌した後、減圧下で溶媒を除去し目的化合物1c（粗、10g、固体）を得た。粗生成物を更に精製することなく次の工程で使用した。

MS m/z (ESI): 197 [M+1]

工程３
3-(2-メトキシ-3-ニトロフェニル)-1H-1,2,4-トリアゾール(1d)
2-メトキシ-3-ニトロベンズアミド1c（10g、51mmol）のN,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（50mL）溶液を９５℃に加熱し、２時間撹拌した。室温まで冷却後、減圧下で溶媒を除去し、残留物をエタノール（30mL）に溶解し、溶液Ａを得た。酢酸（35mL）とエタノール（150mL）の混合物にヒドラジン水和物（25mL）を０℃でゆっくりと加え、続いて溶液Ａを加えた。室温まで徐々に温め、１２時間撹拌した後、減圧下で溶媒を除去した。残留物を水（400mL）に分散させ、ろ過した。得られた固体を水洗し、乾燥して目的化合物1d（6g、固体）を収率５５％で得た。

MS m/z (ESI): 221 [M+1]

工程４
3-(2-メトキシ-3-ニトロフェニル)-1-(メチル-d3)-1H-1,2,4-トリアゾール(1e)
3-(2-メトキシ-3-ニトロフェニル)-1-(メチル-d3)-1H-1,2,4-トリアゾール1d（1.2g、5.3mmol）、炭酸カリウム（2.2g、16mmol）及びN,N-ジメチルホルムアミド（10mL）の混合物に、重水素化ヨードメタン（1g、6.9mmol）を加えた。室温で１２時間撹拌した後、得られた溶液を逆相分取ＨＰＬＣで精製し、目的化合物1e（530mg、固体）を収率４２％で得た。

MS m/z (ESI): 238 [M+1]

工程５
2-メトキシ-3-(1-(メチル-d3)-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)アニリン(1f)
3-(2-メトキシ-3-ニトロフェニル)-1-(メチル-d3)-1H-1,2,4-トリアゾール1e（530mg、1.61mmol）のメタノール（10mL）溶液に、10%パラジウムカーボン（50mg）を加えた。反応混合物を水素雰囲気下で１２時間撹拌し、次いでろ過した。ろ液を減圧下で濃縮乾固し、目的化合物1f（430mg、固体）を得た。生成物を更に精製することなく次の反応で使用した。

MS m/z (ESI): 208 [M+1]

工程６
4,6-ジクロロピリダジン-3-カルボン酸リチウム(1h)
4,6-ジクロロピリダジン-3-カルボン酸メチル1g（5g、24.15mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（9.4g、72.5mmol）、アセトニトリル（13.5mL）及び水（3.25mL）の混合物に、臭化リチウム（6.3g、72.5mmol）を加えた。得られた混合物を室温で１２時間撹拌し、ろ過した。得られた固体をアセトニトリル（8mL）で洗浄し、真空中で乾燥し、目的化合物1h（4.53g、固体）を収率９０％で得た。

MS m/z (ESI): 193 [M+1]

工程７
6-クロロ-4-((2-メトキシ-3-(1-(メチル-d3)-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)ピリダジン-3-カルボン酸亜鉛(1i)
4,6-ジクロロピリダジン-3-カルボン酸リチウム1h（380mg、1.9mmol）、2-メトキシ-3-(1-(メチル-d3)-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)アニリン1f（471mg、2.27mmol）、イソプロパノール（0.5mL）及び水（5mL）の混合物に、酢酸亜鉛（350mg、1.9mmol）を室温で加えた。混合物を６５℃に加熱し、１２時間撹拌した。室温まで冷却後、反応混合物を水（30mL）で希釈し、３０分間撹拌し、ろ過した。固体を水（2×30mL）及びテトラヒドロフラン（2×30mL）で洗浄し、真空中で乾燥し、目的化合物1i（490mg、固体）を収率71%で得た。

MS m/z (ESI): 364 [M+1]

工程８
6-(シクロプロパンカルボキサミド)-4-((2-メトキシ-3-(1-(メチル-d3)-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)ピリダジン-3-カルボン酸メチル(1j)
6-クロロ-4-((2-メトキシ-3-(1-(メチル-d3)-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)ピリダジン-3-カルボン酸亜鉛1i（490mg、1.15mmol）、シクロプロパンカルボキサミド（300mg、3.45mmol）、(2R)-1-[(1R)-1-[ビス(1,1-ジメチルエチル)ホスフィノ]エチル]-2-(ジシクロヘキシルホスフィノ)フェロセン（63mg、0.115mmol）、酢酸パラジウム（25mg、0.0575mmol）、トルエン（9mL）及びアセトニトリル（5mL）の混合物に、炭酸カリウム（320mg、7.8mmol）と1,8-ジアザビシクロウンデカ-7-エン（180mg、1.5mmol）を順次加えた。得られた混合物を窒素下、８０℃で７２時間撹拌した。室温まで冷却後、減圧下で溶媒を除去し、残留物を逆相分取ＨＰＬＣで精製し、目的化合物1j（560mg、固体）を収率９９％で得た。

MS m/z (ESI): 413 [M+1]

工程９
6-(シクロプロパンカルボキサミド)-4-((2-メトキシ-3-(1-(メチル-d₃)-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)-N-(メチル-d₃)ピリダジン-3-カルボキサミド(1)
6-(シクロプロパンカルボキサミド)-4-((2-メトキシ-3-(1-(メチル-d₃)-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)ピリダジン-3-カルボン酸メチル1j（280mg、0.68mmol）、重水素化メチルアミン塩酸塩（60mg、0.81mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（181mg、0.95mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（53mg、0.34mmol）、アセトニトリル（3mL）、N-メチルピロリドン及びN-メチルイミダゾール（41mg、0.5mmol）の混合物を６５°Ｃに加熱し、１時間撹拌した。室温まで冷却後、減圧下で溶媒を除去し、残留物を逆相分取ＨＰＬＣで精製し、目的化合物1（44mg、固体）を収率１５％で得た。

MS m/z (ESI): 429 [M+1]
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ11.32 (s, 1H), 10.97 (s, 1H), 9.13 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.65 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.54 - 7.46 (m, 1H), 7.32 - 7.22 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.12 - 2.03 (m, 1H), 0.88 - 0.73 (m, 4H).

実施例２ 6-(シクロプロパンカルボキサミド)-4-((2-メトキシ-3-(1-(メチル-d₃)-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)-N-メチルピリダジン-3-カルボキサミド(2）
化合物２は、工程９で重水素化メチルアミン塩酸塩（ＣＤ_３ＮＨ_２・ＨＣｌ）に代えてメチルアミン塩酸塩（ＣＨ_３ＮＨ_２・ＨＣｌ）を使用したことを除き、実施例１の方法で合成した。

MS m/z (ESI): 426 [M+1]
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.32 (s, 1H), 10.97 (s, 1H), 9.22 - 9.11 (m, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.66 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.31 - 7.22 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.86 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.15 - 2.01 (m, 1H), 0.87 - 0.75 (m, 4H).

実施例３ 6-(シクロプロパンカルボキサミド)-4-((2-(メトキシ-d₃)-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)-N-メチルピリダジン-3-カルボキサミド(3)

工程１
N-メチルホルモヒドラジド
硫酸メチルヒドラジン3a（40g、277mmol）のメタノール（250mL）溶液に、ナトリウムメトキシド（100g、554mmol）を室温で加えた。得られた混合物を２４時間撹拌し、ろ過した。次いで、ろ液にギ酸メチル（17g、277mmol）を加え、室温で１８時間撹拌した。減圧下で溶媒を除去し目的化合物5b（22g、粗）を得た。粗生成物を更に精製することなく次の工程で直接使用した。

MS m/z (ESI): 75 [M+1]

工程２
5-クロロ-2-(メトキシ-d3)ベンゾニトリル(3d)
5-クロロ-2-ヒドロキシベンゾニトリル3c（4g、26mmol）、炭酸カリウム（7.3g、53mmol）及びN,N-ジメチルホルムアミド（30mL）の混合物に、重水素化ヨウ化メチル（10g、78mmol）を室温で加えた。得られた混合物を７０℃に加熱し、１２時間撹拌した。室温まで冷却後、反応混合物を水（200mL）で希釈し、酢酸エチル（2×100mL）で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（2×100mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮乾固し、目的化合物3d（4.3g、固体）を収率９７％で得た。

MS m/z (ESI): 171 [M+1]

工程３
3-(5-クロロ-2-(メトキシ-d3)フェニル)-1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール硫酸塩(3e)
カリウムtert-ブトキシド（11.3g、101mmol）のテトラヒドロフラン（30mL）溶液に、5-クロロ-2-(メトキシ-d3)ベンゾニトリル3d（4.3g、25.3mmol）とN-メチルホルミルヒドラジン（4.1g、58mmol）のテトラヒドロフラン（20mL）溶液を順次０℃で加えた。室温で１２時間撹拌した後、混合物に水（50mL）を加え、４０℃に加熱し、４０分間撹拌した。室温まで冷却後、有機相を分離し、飽和食塩水（40mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮乾固した。残留物を酢酸エチル（40mL）に溶解した。得られた溶液に濃硫酸（5g）を室温でゆっくりと加え、１２時間撹拌した。次いで、混合物をろ過し、乾燥して目的化合物3e（5.6g、固体）を収率８３％で得た。

MS m/z (ESI): 227 [M+1]

工程４
3-(5-クロロ-2-(メトキシ-d₃)-3-ニトロフェニル)-1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール(3f)
3-(5-クロロ-2-(メトキシ-d3)フェニル)-1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール硫酸塩3e（5.6g、24.7mmol）の硫酸（25g）溶液に、硝酸（2g）を０℃で加えた。得られた溶液を室温まで徐々に温め、１２時間撹拌し、再度、０℃に冷却した。溶液に水（67mL）とメタノール（47mL）を０℃で加え、次いで、室温まで温め、１時間撹拌した。溶液を４０℃に加熱し、水酸化アンモニウム（42mL）を添加した。溶液を２０℃に冷却し、２時間撹拌し、ろ過した。固体を水（2×30mL）で洗浄し、真空中で乾燥し、目的化合物3f（3.37g、固体）を収率５０％で得た。

MS m/z (ESI): 272 [M+1]

工程５
2-(メトキシ-d₃)-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)アニリン(3g)
3-(5-クロロ-2-(メトキシ-d₃)-3-ニトロフェニル)-1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール3f（3.37g、12.25mmol）のメタノール（10mL）溶液に、１０％パラジウムカーボン（400mg）及び炭酸水素ナトリウム（1.6g、25mmol）を加えた。得られた混合物を水素雰囲気下で１２時間撹拌し、次いでろ過した。ろ液を減圧下で濃縮乾固し、残留物をジクロロメタン（25mL）に溶解した。得られた混合物をろ過し、ろ液を減圧下で濃縮乾固して目的化合物3g（2.35g、固体）を収率９２％で得た。

MS m/z (ESI): 208 [M+1]

工程６
6-クロロ-4-((2-(メトキシ-d₃)-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)ピリダジン-3-カルボン酸亜鉛(3h)
4,6-ジクロロピリダジン-3-カルボン酸リチウム1h（3g、15.1mmol）、2-(メトキシ-d₃)-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)アニリン3g（2.35g、11.3mmol）、イソプロパノール（2.5mL）及び水（18mL）の混合物に、酢酸亜鉛（2.5g、13.6mmol）を室温で加えた。混合物を６５℃に加熱し、１２時間撹拌した。室温まで冷却後、混合物を水（20mL）で希釈し、３０分間撹拌し、ろ過した。固体を水（2×30mL）及びテトラヒドロフラン（2×30mL）で洗浄し、真空中で乾燥し、目的化合物3h（4.3g、固体）を収率１００％で得た。

MS m/z (ESI): 364 [M+1]

工程７
6-(シクロプロパンカルボキサミド)-4-((2-(メトキシ-d₃)-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)ピリダジン-3-カルボン酸メチル(3i)
6-クロロ-4-((2-(メトキシ-d₃)-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)ピリダジン-3-カルボン酸亜鉛3h（4.3g、11mmol）、シクロプロパンカルボキサミド（2.4g、27.56mmol）、(2R)-1-[(1R)-1-[ビス(1,1-ジメチルエチル)ホスフィノ]エチル]-2-(ジシクロヘキシルホスフィノ)フェロセン（600mg、1.1mmol）、酢酸パラジウム（125mg、0.55mmol）、トルエン（34mL）、アセトニトリル（17mL）、炭酸カリウム（3.1g、22mmol）及び1,8-ジアザビシクロウンデカ-7-エン（1.7g、11mmol）の混合物を、窒素雰囲気下で８０℃に加熱し、１２時間撹拌した。室温まで冷却後、混合物に、酢酸水溶液（50%、17mL）と氷酢酸（40mL）を順次加えた。室温で１時間撹拌した後、得られた均一な混合物を、石油エーテル（2×20mL）で洗浄した。水（５０ｍＬ）を加え、混合物を室温で４時間エージングし、ろ過した。固体をアセトニトリル水溶液（50%、20mL）及びアセトニトリル（20mL）で順次洗浄し、次いで、真空、６５℃で３０分間乾燥し、目的化合物3i（3g、固体）を収率６６％で得た。

MS m/z (ESI): 413 [M+1]

工程８
6-(シクロプロパンカルボキサミド)-4-((2-(メトキシ-d₃)-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)-N-メチルピリダジン-3-カルボキサミド
6-(シクロプロパンカルボキサミド)-4-((2-(メトキシ-d₃)-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)ピリダジン-3-カルボン酸メチル3i（1.5g、3.38mmol）、メチルアミン塩酸塩（280mg、4.0mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（900mg、4.73mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（230mg、1.7mmol）、アセトニトリル（3mL）、N-メチルピロリドン（3mL）及びN-メチルイミダゾール（200mg、2.4mmol）の混合物を６５℃に加熱し、１２時間撹拌した。反応終了後、反応を水（1.5mL）及びアセトニトリル（4.5mL）でクエンチした。得られた混合物を６５℃で１時間、０℃で３時間エージングし、ろ過した。固体をアセトニトリル水溶液（33%、4.5mL）及びアセトニトリル（4.5mL）で順次洗浄し、真空、６５℃で８時間乾燥し、目的化合物3（811mg、固体）を収率５６％で得た。

MS m/z (ESI): 426 [M+1]
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.32 (s, 1H), 10.97 (s, 1H), 9.24 - 9.08 (m, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.66 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.33 - 7.20 (m, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.87 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.14 - 2.01 (m, 1H), 0.91 - 0.73 (m, 4H).

化合物３は、以下の手順で塩酸塩に変換できた：
反応フラスコに3（5.00g、11.752mmol）及びＤＭＳＯ（27mL）を加えた。得られた混合物を、固体が完全に均質な溶液になるまで撹拌しながら５０～５５℃に加熱した。次いで、混合物に濃塩酸（36%～38%、1.18g）を加え、続いて水（3mL）及び種晶（25mg）を加えた。得られた混合物を５０～５５℃で０．５時間撹拌し、３５～４０℃に冷却し、イソプロパノール（60mL）を０．５～１．０時間かけて滴下し、３５～４０℃で０．５時間撹拌した。混合物を１時間かけて２０～２５℃までゆっくりと冷却し、一晩撹拌し、ろ過した。過ケーキをイソプロパノール（2×15mL）で洗浄し、減圧下、６５℃で一晩乾燥し、3の一塩酸塩（4.5g、固体）を収率８３％で得た。

MS m/z (ESI): 426 [M+1]
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 13.72 (brs, 1H), 12.13 (s, 1H), 11.40 (s, 1H), 9.22 (q, J = 4.5 Hz, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.78 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.61 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.35 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.01 (s, 3H), 2.89 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.14 - 2.00 (m, 1H), 1.00 - 0.84 (m, 4H).

実施例４ 6-(シクロプロパンカルボキサミド)-4-((2-(メトキシ-d₃)-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)-N-(メチル-d₃)ピリダジン-3-カルボキサミド(4)
化合物４は、工程８でメチルアミン塩酸塩（ＣＨ_３ＮＨ_２・ＨＣｌ）に代えて重水素化メチルアミン塩酸塩（ＣＤ_３ＮＨ_２・ＨＣｌ）を使用したことを除き、実施例３の方法で合成した。

MS m/z (ESI): 429 [M+1]
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ11.32 (s, 1H), 10.98 (s, 1H), 9.14 (s, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.66 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.32 - 7.21 (m, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.14 - 2.03 (m, 1H), 0.89 - 0.75 (m, 4H).

実施例５ (S)-6-(2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド)-4-((2-メトキシ-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)-N-(メチル-d₃)ピリダジン-3-カルボキサミド(5)

工程１
(S)-N-(2,4-ジメトキシベンジル)-2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド(5b)
(S)-2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボン酸5a（1.5g、12.3mmol）、ＨＡＴＵ（5.7g、15mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（4.8g、37mmol）及びN,N-ジメチルホルムアミド（15mL）の混合物に、2,4-ジメトキシベンジルアミン（4.0g、24.4mmol）を加えた。室温で３時間撹拌した後、減圧下で溶媒を除去し、残留物を逆相分取ＨＰＬＣで精製し、目的化合物5b（4.4g、固体）を得た。

MS m/z (ESI): 272 [M+1]

工程２
(S)-2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド(5c)
(S)-N-(2,4-ジメトキシベンジル)-2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド5bのトリフルオロ酢酸（10mL）溶液を70°Cに加熱し、1時間撹拌した。室温まで冷却後、混合物を濃縮乾固し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（100/0から9/1のジクロロメタン／メタノール）で精製し、目的化合物5d（1.4g、固体）を２工程の収率９３％で得た。

MS m/z (ESI): 122 [M+1]

工程３
3-(5-クロロ-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール(5d)
カリウムtert-ブトキシド（34g、290mmol）のテトラヒドロフラン（200mL）溶液に、０℃で5-クロロ-2-メトキシ-ベンゾニトリル（20g、120mmol）とメチルホルミルヒドラジド3b（22g、粗）を順次加えた。室温で７２時間撹拌した後、水（500mL）を加え、混合物を酢酸エチル（3×300mL）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（2×300mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮乾固して目的化合物5d（17.1g、固体）を収率８８％で得た。

MS m/z (ESI): 224 [M+1]

工程４
3-(5-クロロ-2-メトキシ-3-ニトロフェニル)-1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール(5e)
3-(5-クロロ-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール5d（16.13g、72mmol）の濃硫酸（72g）溶液に、濃硝酸（8.5g、87mmol）を０℃で加えた。２時間撹拌した後、得られた溶液に、水（250g）とメタノール（150g）の混合物を０℃で加えた。次いで、混合物を水酸化アンモニウムでｐＨ＞７に調整し、ろ過した。固体を水（2×100mL）で洗浄しシリカゲルカラムクロマトグラフィー（100/0から3/7の石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、目的化合物5e（17.1g、固体）を収率８８％で得た。

MS m/z (ESI): 269 [M+1]

工程５
2-メトキシ-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)アニリン(5f)
3-(5-クロロ-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール5e（17g、63mmol）のメタノール溶液に、10%パラジウムカーボン（3g）及び炭酸水素ナトリウム（10.5g、126mmol）を加えた。混合物を水素雰囲気下で５時間撹拌し、次いでろ過した。ろ液を減圧下で濃縮乾固し、残留物を逆相分取ＨＰＬＣで精製し、目的化合物5f（8.8g、固体）を収率６８％で得た。

MS m/z (ESI): 205 [M+1]

工程６
6-クロロ-4-((2-メトキシ-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)ピリダジン-3-カルボン酸亜鉛(5g)
4,6-ジクロロピリダジン-3-カルボン酸リチウム1h（4.53g、22.87mmol）、2-メトキシ-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)アニリン5f（5.6g、27.44mmol）、イソプロパノール（4.5mL）及び水（34mL）の混合物に、酢酸亜鉛（4.2g、22.87mmol）を加えた。得られた混合物を６５℃に加熱し、１２時間撹拌した。室温まで冷却後、混合物を水（30mL）で希釈し、３０分間エージングし、ろ過した。固体を水（2×30mL）及びテトラヒドロフラン（2×30mL）で洗浄し、真空中で乾燥し、目的化合物5g（7.6g、固体）を収率９３％で得た。

MS m/z (ESI): 361 [M+1]

工程７
(S)-6-(2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド)-4-((2-メトキシ-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)ピリダジン-3-カルボン酸亜鉛(5h)
6-クロロ-4-((2-メトキシ-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)ピリダジン-3-カルボン酸亜鉛5g（1.6g、3.93mmol）、(S)-2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド5c（1.2g、9.8mmol）、(2R)-1-[(1R)-1-[ビス(1,1-ジメチルエチル)ホスフィノ]エチル]-2-(ジシクロヘキシルホスフィノ)フェロセン（220mg、0.393mmol）、酢酸パラジウム（44mg、0.196mmol）、トルエン（18mL）アセトニトリル（11mL）、炭酸カリウム（1.1g、7.8mmol）及び1,8-ジアザビシクロウンデカ-7-エン（600mg、3.93mmol）の混合物を、窒素雰囲気下、８０℃で７２時間撹拌した。室温まで冷却後、混合物を酢酸（27mL）と水（9mL）で希釈し、得られた溶液を石油エーテル（2×30mL）で洗浄した。次いで水（50mL）を加え、３時間放置した。混合物をろ過し、固体を真空中で乾燥し、目的化合物5h（1.1g、固体）を収率６２％で得た。

MS m/z (ESI): 446 [M+1]

工程８
(S)-6-(2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド)-4-((2-メトキシ-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)-N-(メチル-d₃)ピリダジン-3-カルボキサミド
(S)-6-(2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド)-4-((2-メトキシ-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)ピリダジン-3-カルボン酸亜鉛5h（1.1g、2.46mmol）、重水素化メチルアミン塩酸塩（210mg、2.95mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（660mg、3.44mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（190mg、1.23mmol）、アセトニトリル（6mL）及びN-メチルピロリドン（6mL）の混合物に、N-メチルイミダゾール（141mg、1.72mmol）を加えた。反応混合物を６５℃に加熱し、１時間撹拌した。室温まで冷却後、混合物を減圧下で濃縮乾固し、残留物を逆相分取ＨＰＬＣで精製し、目的化合物5（420mg、固体）を収率３７％で得た。

MS m/z (ESI): 462 [M+1]
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.52 (s, 1H), 11.01 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.67 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.33 - 7.23 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.13 - 2.97 (m, 1H), 2.10 - 1.95 (m, 2H).

実施例６ (S)-6-(2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド)-4-((2-メトキシ-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)-N-メチルピリダジン-3-カルボキサミド(6)
化合物6は、工程８で重水素化メチルアミン塩酸塩（ＣＤ_３ＮＨ_２・ＨＣｌ）をメチルアミン塩酸塩（ＣＨ_３ＮＨ_２・ＨＣｌ）に置き換えたことを除き、実施例５の手順で合成した。

MS m/z (ESI): 459 [M+1]
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.52 (s, 1H), 11.01 (s, 1H), 9.20 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.67 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.33 - 7.23 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.11 - 2.98 (m, 1H), 2.86 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.10 - 1.94 (m, 2H).

実施例７ (R)-6-(2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド)-4-((2-メトキシ-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)-N-(メチル-d₃)ピリダジン-3-カルボキサミド(7)
化合物7は、工程１で(S)-2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボン酸(5a)を(R)-2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボン酸に置き換えたことを除き、実施例５の手順で合成した。

MS m/z (ESI): 462 [M+1]
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.52 (s, 1H), 11.01 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.67 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.28 (m, 1H), 3.95 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.11 - 2.99 (m, 1H), 2.10 - 1.95 (m, 2H).

実施例８ (R)-6-(2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボキサミド)-4-((2-メトキシ-3-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)アミノ)-N-メチルピリダジン-3-カルボキサミド(8)
化合物8は、(i) 工程１で(S)-2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボン酸(5a)を(R)-2,2-ジフルオロシクロプロパン-1-カルボン酸に置き換え、(ii) 工程８で重水素化メチルアミン塩酸塩（ＣＤ_３ＮＨ_２・ＨＣｌ）をメチルアミン塩酸塩（ＣＨ_３ＮＨ_２・ＨＣｌ）に置き換えたことを除き、実施例５の手順で合成した。

MS m/z (ESI): 459 [M+1]
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.52 (s, 1H), 11.01 (s, 1H), 9.27 - 9.16 (m, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.67 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.33 - 7.24 (m, 1H), 3.95 (s, 2H), 3.73 (s, 2H), 3.11 - 2.99 (m, 1H), 2.86 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.08 - 1.95 (m, 2H).

実施例９ＪＡＫ２キナーゼドメインの酵素活性アッセイ
組換えＪＡＫ２キナーゼドメイン（ＪＨ１）の酵素活性に対する本発明の化合物の効果を、ＨＴＲＦキナーゼアッセイ検出キット（Cisbio, Cat. No. 62TK0PEC）を使用して、キナーゼ反応における基質のリン酸化の量を検出することで評価する（表１）。

以下に実験方法を概説する：
以下の成分を含む反応バッファー：酵素緩衝液（１×）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ及び０．０１％のＢｒｉｊ３５（これらはキットに含まれる）；反応バッファーで０．１５ｎｇ／μＬに希釈したヒト組換えＪＡＫ２キナーゼドメインタンパク質（Carna Biosciences, Cat. No. 08-045）；２．５μＭのＡＴＰ及び反応バッファーで０．２５μＭに希釈したビオチン化チロシンキナーゼ基質を含む基質反応溶液；０．１ｎｇ／μＬのＥｕ^３＋標識ケージ抗体（Cisbio, Cat. No. 61T66KLB）及び１２．５ｎＭのストレプトアビジン標識ＸＬ６６５を含む検出溶液。

試験化合物をＤＭＳＯに溶解して１ｍＭとし、さらに、ＤＭＳＯで続けて４段階の希釈を行い最小濃度を６１ｎＭとする。各濃度の試料を反応バッファーで更に４０倍希釈する。

３８４ウェルのアッセイプレート（Corning, Cat. No. 3674）に、４μＬの化合物溶液と２μＬのＪＡＫ２キナーゼ溶液を加える。混合物を室温で１５分間インキュベートし、次いで４μＬの基質反応溶液を加える。さらに、室温で３０分間インキュベートした後、反応混合物に検出溶液１０μＬを加え、室温で３０分間放置する。Envisionプレートリーダー（Perkin Elmer）を使用して、反応の進行を６２０ｎｍ及び６６５ｎｍで測定する。６２０ｎｍ及び６６５ｎｍにおける吸光度の比は、基質のリン酸化の程度と正に相関するので、ＪＡＫ２キナーゼの活性が検出される。この実験では、ＪＡＫ２キナーゼタンパク質を含まない群が１００％阻害群であり、ＪＡＫ２キナーゼタンパク質を含み試験化合物を含まない群が０％阻害群である。試験化合物によるＪＡＫ２キナーゼ活性の阻害率は、以下の式で計算する：
阻害率＝１００－１００×（比_化合物－比_{１００％阻害}）／（比_０％阻害－比_{１００％阻害}）

試験化合物のＩＣ_５０は、XLfitソフトウェア（ID Business Solutions Ltd., UK）を使用して、８つの濃度から以下の式で計算する：
Ｙ＝Bottom＋（Top－Bottom）／（１＋１０＾（（ｌｏｇＩＣ_５０－Ｘ）×勾配係数））
（式中、Ｙは阻害率、Ｘは試験化合物の濃度の対数、BottomはＳ字曲線の下部プラトー値、TopはＳ字曲線の上部プラトー値、勾配係数は曲線の勾配係数である。）

実施例１０ＴＹＫ２キナーゼドメインの酵素活性アッセイ
組換えＴＹＫ２キナーゼドメイン（ＪＨ１）の酵素活性に対する本発明の化合物の効果を、ＨＴＲＦキナーゼアッセイ検出キット（Cisbio, Cat. No. 62TK0PEC）を使用して、キナーゼ反応における基質のリン酸化の量を検出することで評価する（表１）。

以下に実験方法を概説する：
以下の成分を含む反応バッファー：酵素緩衝液（１×）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｎＭのＳＥＢ（Cisbio, Cat. No. 61SEBALB）、０．６２５ｍＭのＥＧＴＡ及び０．０１％のＢｒｉｊ３５（これらはキットに含まれる）；反応バッファーで０．２５ｎｇ／μＬに希釈したヒト組換えＴＹＫ２キナーゼ（ＪＨ１）ドメインタンパク質（Carna Biosciences, Cat. No. 08-147）；１１．２５μＭのＡＴＰ及び反応バッファーで０．５μＭに希釈したビオチン化チロシンキナーゼ基質を含む基質反応溶液；０．１ｎｇ／μＬのＥｕ^３＋標識ケージ抗体（Cisbio, Cat. No. 61T66KLB）及び２５ｎＭのストレプトアビジン標識ＸＬ６６５を含む検出溶液。

試験化合物をＤＭＳＯに溶解して１ｍＭとし、さらに、ＤＭＳＯで続けて４段階の希釈を行い、最小濃度を６１ｎＭとする。各濃度の試料を反応バッファーで更に４０倍希釈する。

３８４ウェルのアッセイプレート（Corning, Cat. No. 3674）に、４μＬの化合物溶液と２μＬのＴＹＫ２キナーゼ溶液を加える。混合物を室温で１５分間インキュベートし、次いで４μＬの基質反応溶液を加える。さらに、室温で４０分間インキュベートした後、反応混合物に検出溶液１０μＬを加え、室温で３０分間放置する。Envisionプレートリーダー（Perkin Elmer）を使用して、反応の進行を６２０ｎｍ及び６６５ｎｍで測定する。６２０ｎｍ及び６６５ｎｍにおける吸光度の比は、基質のリン酸化の程度と正に相関するので、ＴＹＫ２キナーゼの活性が検出される。この実験では、ＴＹＫ２キナーゼタンパク質を含まない群が１００％阻害群であり、ＴＹＫ２キナーゼタンパク質を含み試験化合物を含まない群が０％阻害群である。試験化合物によるＴＹＫ２キナーゼ活性の阻害率は、以下の式で計算する：
阻害率＝１００－１００×（比_化合物－比_{１００％阻害}）／（比_０％阻害－比_{１００％阻害}）

実施例１１ＴＹＫ２シュードキナーゼドメインの結合アッセイ
本発明の化合物とＴＹＫ２シュードキナーゼドメイン（ＪＨ２）の結合は、市販のフルオレセイン標識プローブ（Alexa-Fluor 647-conjugated kinase tracer 178）との競合による時間分解蛍光エネルギー移動（TR-FRET）生化学アッセイを使用することによって決定する（表１）。

以下に実験方法を概説する：
結合バッファーは、２０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１５％のＢｒｉｊ３５、２ｍＭのＤＴＴ、０．６２５ｍＭのＥＧＴＡ及び１００ｍＭのＫＦを含む。ＴＹＫ２のＪＨ２ドメイン（全長タンパク質のアミノ酸５５６～８７１）は、Tsinghua大学のタンパク質精製・同定プラットフォームで発現及び精製される。試験化合物をＤＭＳＯに溶解して０．１ｍＭとし、さらに、ＤＭＳＯで続けて４段階の希釈を行い、最小濃度を６１ｎＭとする。各濃度の試料を反応バッファーで更に４０倍希釈する。

３８４ウェルのアッセイプレート（Corning, Cat. No. 4512）に、５μＬの化合物溶液と５μＬのＴＹＫ２ＪＨ２ドメイン溶液（１６０ｎＭ）を加える。混合物を室温で３０分間インキュベートし、次いでフルオレセイン標識プローブ（ThermoFisher, Cat. No. PV5593）（20nM）とＧＳＴ-ユーロピウム（Ｅｕ）標識抗体（Cisbio, Cat. No. 61GSTKLA）（40ng/mL）の混合物１０μＬを加える。さらに、室温で３０分間インキュベーションした後、ＨＴＲＦシグナル（フルオレセイン受容体の発光波長６１５ｎｍとユウロピウム供与体の発光波長６６５ｎｍにおける蛍光強度の比）をEnvisionプレートリーダー（Perkin Elmer）で測定する。以下の式により、試験化合物を含まない陽性対照及びタンパク質を含まない陰性対照と比較することで、阻害率を計算する：
阻害率（％）＝１００－１００×（シグナル_化合物－シグナル_陰性対照）／（シグナル_陽性対照－シグナル_陰性対照）

ＪＡＫ２又はＴＹＫ２のキナーゼドメインに対する本発明の化合物の阻害活性は、弱いか、わずかである。表１は、化合物２、３、４、７及び８のキナーゼ活性を直接阻害するＩＣ_５０は１０μＭを超えるのに対し、参照化合物のＩＣ_５０は２．９μＭと低かったことをは示す。試験化合物及び参照化合物は全て、ＴＹＫ２ＪＨ２に対して強く結合した（ナノモル範囲のＩＣ_５０）。

実施例１２ＮＫ９２細胞でのＩＬ-１２誘導ＩＦＮ-γ分泌の阻害
ＮＫ９２細胞でＴＹＫ２が誘導するＩＦＮ-γ分泌に対する本発明の化合物の効果を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価する（表２）。

ＩＬ-１２受容体は、主に活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞（ＮＫ９２はＮＫ細胞株である）、ＤＣ細胞及びＢ細胞で発現している。ＩＬ-１２が結合すると、ＮＫ細胞及びＴリンパ球のＪＡＫ２／ＴＹＫ２シグナル伝達経路が活性化され、ＩＦＮ-γ分泌が誘導される。

以下に実験方法を概説する：
試験化合物をＤＭＳＯに溶解して２．５ｍＭとし、さらに、ＤＭＳＯで続けて４段階の希釈を行い、最小濃度を０．３１ｎＭとする。各濃度の試料を、ＦＢＳを含まないＭＥＭα培地（Gibco, Cat. No. 12561-056）で更に５０倍に希釈する
ＮＫ９２細胞（Nanjing Cobioer, Cat. No. CBP60980）を、１２．５％のＦＢＳ（Ausbian, Cat. No. VS500T）、１２．５％のウマ血清（Gibco, Cat. No. 16050-122）、０．０２ｍＭの葉酸（Sigma, Cat No. F8758）、０．２ｍＭのイノシトール（Sigma, Cat No. 17850）、０．５５ｍＭのβ-メルカプトエタノール（Gibco, Cat No. 21985-023）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ-２（R&D Systems, Cat No. 202-1L）及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（ThermoFisher, Cat No. 15140122）を含む完全ＭＥＭα培地で培養する。培養容器の表面の８０～９０％が覆われると、細胞を分散させ、９６ウェルプレート（ThermoFisher, Cat No. 167425）に１ウェルあたり１００，０００個の細胞（ＩＬ-２を含まない完全ＭＥＭα培地、８０μＬ）を播種する。次いで、９６ウェルプレートを３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートする。

一晩のインキュベーション後、試験化合物１０μＬと５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ-１２（R & D Systems, Cat. No. 219-1L）１０μＬを各ウェルに加え、穏やかに混合し、９６ウェルプレートを、さらに、３７℃／５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートする。室温、８００ｒｐｍでプレートを１０分間遠心分離し、各ウェルの上清５０μＬを、抗ＩＦＮ-γ抗体をコーティングした別の９６ウェルプレート（Sigma, Cat No. CLS3695）に移す。ヒトＩＦＮ-γ DuoSet ＥＬＩＳＡキット（R & D Systems, Cat No. DY285B）の指示に従い、ＩＦＮの分泌量を検出する。実験では、ＩＬ-１２及び試験化合物をＭＥＭα培地に置換した群を非刺激対照群（１００％阻害）とし、ＩＬ-１２及び０．２％ＤＭＳＯを有する群を刺激群（０％阻害）とした。試験化合物によるＮＫ-９２細胞でのＩＬ-１２誘導ＩＦＮ-γ分泌の阻害率は、以下の式で計算する：
阻害率＝１００－１００×（シグナル_化合物－シグナル_{非刺激対象}）／（シグナル_刺激対象－ジグナル_{非刺激対象}）

本発明の化合物は、ＮＫ９２細胞でＴＹＫ２が誘導するＩＦＮ-γの分泌に対して著しい阻害効果を有した。

実施例１３ in vivoでのラットＰＫの測定
本発明の化合物３と参照化合物BMS-986165の薬物動態を評価した。化合物３はベンゼン環にＯＣＤ_３を有するが、参照化合物はアミド部分にＣＤ_３を有する。メチル基は、通常、in vivoで不安定で、メチルアミドの場合はアミダーゼによる加水分解を受け、メトキシ基及びメチルトリアゾールの場合はＣＹＰによる酸化的脱メチル化を受ける。メチルをトリ重水素化メチルで置換すると、化合物のバイオアベイラビリティとin vivo曝露が改善され、同じ用量で化合物の有効性が向上する。

５％ N,N-ジメチルアセトアミド＋２０％ソルトール（solutol）＋７５％生理食塩水を含む溶液中の０．５ｍｇ／ｍＬの化合物３と参照化合物を、用量５ｍｇ／ｋｇで３匹のオスSprague Dawleyラットに経口投与した。投与の０．２５、０．５、１、２、４、８及び２４時間後に、血液を採取した。血漿中の化合物の濃度は、API-4500質量分析計によるＬＣ－ＭＳ／ＭＳで定量化した。分析の定量限界（ＬＯＱ）は１ｎｇ／ｍＬであった。薬物動態（ＰＫ）パラメーターは、WinNonlinによる非コンパートメント法で計算し、表３に示す。本発明の化合物３は参照化合物と比較して優れたin vivo曝露を有する結果が示された。

実施例１４抗ＣＤ４０抗体誘発大腸炎モデル動物によるin vivoでの有効性の評価
北京Vital River laboratoryから入手したメスのCB17-Scidマウス（８～１０週齢、１８～２０ｇ）を、無作為に５つの群（１群につきｎ＝８）に分けた。０日目に、１００μｇのＦＧＫ４．５抗ＣＤ４０ｍＡｂ（BioXCell, Cat. No. EB0016-2）を含むＰＢＳを単回、腹腔内に注入することで、マウスに大腸炎を誘発した。０日目から開始して７日目まで、処置群のマウスには、溶媒ＤＭＳＯ／ソルトール／ＰＥＧ-４００（１０：５：３０）に溶かした、０、１．５、５、１５ｍｇ／ｋｇの化合物３又は５ｍｇ／ｋｇのBMS-986165を、１日２回経口投与し、溶媒群のマウスには上記溶媒を経口投与した。毎日、マウスの体重を測定し、体重減少や軟便、下痢を含む大腸炎の徴候を監視した。８日目に全ての動物を安楽死させた。脾臓組織を採取し秤量した。１．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの化合物３の投与群並びに５ｍｇ／ｋｇの参照化合物投与群は、溶媒群と比較して、体重の減少（図２、表４）と脾臓の肥大（表４）を防ぎ、マウスを大腸炎から有意に保護した結果が示された。

この明細書は本発明の好ましい態様を説明したものであり、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく修正できることを理解されたい。

Claims

以下の化学構造式で示される化合物３又はその薬学的に許容される塩。
以下の化学構造式で示される化合物２又はその薬学的に許容される塩。
以下の化学構造式で示される化合物４又はその薬学的に許容される塩。