RS65930B1 - Interleukin-2/interleukin-2 receptor alfa fuzioni proteini i postupci upotrebe - Google Patents

Description

Napomene:

Kompletan dokument, uključujući tabelu(-e) referenci i listu(-e) sekvenci može se preuzeti sa veb-stranice EPO

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovde stavljen na uvid predmet se uopšteno odnosi na interleukin2/interleukin-2 receptor alfa fuzione proteine i postupke i kompozicije za modulisanje imunskog odgovora u kojem se koriste takvi fuzioni proteini.

IZJAVA O FEDERALNOM FINANSIRANJU

[0002] Ovaj pronalazak realizovan je uz podršku vlade, broj odobrenja RO1 DK093866, dodeljen od strane Nacionalnog instituta za zdravlje (National Institute of Health, NIH), Nacionalnog instituta za dijabetes i bolesti digestivnog sistema i bubrega (National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, NIDDK). Vlada ima određena prava nad pronalaskom.

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0003] Interleukin-2 (IL-2) je biološko sredstvo koje se koristi u pokušajima pojačavanja imunskih odgovora kod pacijenata obolelih od kancera i HIV/AIDS. U novije vreme, niže doze IL-2 korišćene su za selektivno pojačavanje tolerancije kako bi se suprimirali neželjeni imunski odgovori koji su u vezi sa napadom na sopstvena tkiva, koji je sličan autoimunskom. Ono što je važno je da ove niske doze IL-2 nisu pokazale nikakve znake pojačavanja ili reaktivacije autoreaktivnih T ćelija. Uprkos tome, IL-2 kao terapijsko sredstvo ima važne nedostatke koji uključuju vrlo kratak poluživot in vivo, što ograničava njegova efikasnost, i toksičnost pri visokim dozama. Iz tih razloga za upotrebu su potrebni novi biološki lekovi na bazi IL-2, koji imaju poboljšanu farmakokinetiku i trajnost odgovora.

[0004] Razvijanje fuzionih proteina interleukina-2 sa oslabljenom aktivnošću, koji se mogu aktivirati proteazama opisano je u Puskas i sarad., Immunology. jun 2011; 133(2): 206-220 i WO 2011/123683. Fuzioni protein albuleukin je rekombinantni humani interleukin-2 genetički fuzionisan sa rekombinantnim humanim serumskim albuminom. Kaže se da je terapijska efikasnost albuleukina kod miševa poboljšana produžavanjem njegovog poluživota in vivo (Melder i sarad., Cancer Immunol Immunother. jun 2005;54(6):535-47).

Fuzijom citokina i njegovog vanćelijskog receptora može nastati moćni, dugodejstvujući agonist koji se sporo apsorbuje i eliminiše (Wilkinson i sarad., Nat Med. sept.2007;13(9):1108-13).

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0005] Predmetni pronalazak se u prvom aspektu odnosi na fuzioni protein koji sadrži: (a) prvi polipeptid koji sadrži interleukin-2 (IL-2); pri čemu prvi polipeptid ima najmanje 70% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO (SEK ID BR): 2 (b) drugi polipeptid fuzionisan u ramu sa prvim polipeptidom pomoću linkera, pri čemu je linker sekvenca navedena u SEQ ID NO: 13, i pri čemu drugi polipeptid sadrži vanćelijski domen interleukin-2 receptora alfa (IL-2Rα), pri čemu drugi polipeptid ima najmanje 70% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO: 7; koji ima biološku aktivnost vanćelijskog domena IL-2Rα; pri čemu fuzioni protein ima povišenu IL-2-aktivnost u poređenju sa nativnim IL-2; ili pri čemu fuzioni protein poseduje povišenu perzistentnu aktivnost IL-2-stimulacije limfocita koji nose IL-2R in vivo, u poređenju sa nativnim IL-2.

[0006] U drugom tehničkom rešenju, prvi polipeptid koji sadrži IL-2 ima najmanje 75%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO: 2.

[0007] U trećem tehničkom rešenju, drugi polipeptid koji sadrži vanćelijski domen IL-2Rα ima najmanje 75%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO: 7.

[0008] U četvrtom tehničkom rešenju, fuzioni protein pronalaska sadrži (a) aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 26, 27, 36, 37, 57, ili 59; ili (b) sekvencu koja ima najmanje 80%, 85%, 90%, ili 95% sekvencione identičnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO: 26, 27, 36, 57, ili 59.

[0009] U petom tehničkom rešenju, fuzioni protein sadrži: aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62; ili sekvencu koja ima najmanje 80%, 85%, 90%, ili 95% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO: 62.

[0010] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira fuzioni protein pronalaska.

[0011] U trećem aspektu, pronalazak se odnosi na ćeliju-domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira fuzioni protein pronalaska.

[0012] U četvrtom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak proizvodnje fuzionog proteina pronalaska, postupak uključuje eksprimiranje polinukleotida koji kodira fuzioni protein pronalaska u ćelijama-domaćinima stavljenim na uvid javnosti u ovom tekstu i preuzimanje tako proizvedenog fuzionog proteina.

[0013] U petom aspektu, pronalazak se odnosi na fuzioni protein pronalaska za upotrebu u smanjenju imunskog odgovora kod subjekta kojem je to potrebno.

[0014] U prvom tehničkom rešenju pomenutog petog aspekta, subjekt ima autoimunsko oboljenje; pri čemu je, opciono, autoimunsko oboljenje odabrano iz grupe koja se sastoji od dijabetesa tipa 1, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, celijačne bolesti, sistemskog eritemskog lupusa, juvenilnog idiopatskog artritisa, Crohn-ove bolesti, ulcerativnog kolitisa ili sistemske skleroze, bolesti kalema protiv domaćina, psorijaze, pečataste alopecije, i vaskulitisa indukovanog HCV-om.

[0015] U drugom tehničkom rešenju, terapijski efektivna količina fuzionog proteina sadrži 10<3>do 10<6>IU IL-2-aktivnosti po adultu ili 10<4>±100-struku IL-2 aktivnost po adultu.

[0016] U trećem tehničkom rešenju, subjekt je čovek.

[0017] U šestom aspektu, pronalazak se odnosi na fuzioni protein pronalaska za upotrebu u pojačavanju imunogenosti vakcine kod subjekta kojem je to potrebno ili prevladavanju suprimiranog imunskog odgovora na vakcinu kod subjekta kojem je to potrebno.

[0018] U prvom tehničkom rešenju pomenutog šestog aspekta, fuzioni protein i vakcinu treba administrirati istovremeno.

[0019] U drugom tehničkom rešenju, fuzioni protein i vakcinu treba administrirati sekvencijalno, bilo kojim redom.

[0020] U trećem tehničkom rešenju, pomenuta vakcina je vakcina protiv kancera.

[0021] U četvrtom tehničkom rešenju, terapijski efektivna količina fuzionog proteina uključuje najmanje 10<4>do 10<7>IU IL-2-aktivnosti po adultu ili najmanje 10<5>±10 IL-2 aktivnosti po adultu.

[0022] U jednom tehničkom rešenju, subjekt je čovek.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0023]

SL. 1 prikazuje shemu IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina, gde je L=liderski peptid, LK=linkerski region, G=glicin, H=histidin, i T= terminacioni kodon.

SL. 2A i SL.2B prikazuju dedukovane proteinske sekvence neograničavajućih primera IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina. SL. 2A prikazuje dedukovane proteinske sekvence neograničavajućih primera mišjih IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina. Sekvence mišjeg IL-2 i IL-2Rα prikazane su iznad, odnosno ispod fuzionih proteina. Sekvenca označena kao IL-2 navedena je u SEQ ID NO: 3; sekvenca označena kao IL-2-(G4S)4-IL-2Rα navedena je u SEQ ID NO: 54; sekvenca označena kao IL-2-(G4S)5-IL-2Rα navedena je u SEQ ID NO:55; sekvenca označena kao IL2-(G3S)4-IL-2Rα navedena je u SEQ ID NO:56; sekvenca označena kao IL-2-(G3S)3-IL-2Rα navedena je u SEQ ID NO: 57; i vanćelijski domen IL-2Rα naveden je u SEQ ID NO: 10. SL.

2B prikazuje dedukovane proteinske sekvence neograničavajućih primera humanih IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina. Sekvence humanih IL-2 i IL-2Rα prikazane su iznad, odnosno ispod fuzionih proteina. Sekvenca označena kao IL-2 navedena je u SEQ ID NO: 1; sekvenca označena kao IL-2-(G3S)2-IL-2Rα navedena je u SEQ ID NO: 58; sekvenca označena kao IL-2-(G3S)3-IL-2Rα navedena je u SEQ ID NO:59; sekvenca označena kao IL-2-(G3S)4-IL-2Rα navedena je u SEQ ID NO:60; sekvenca označena kao IL-2-(G4S)4-IL-2Rα navedena je u SEQ ID NO: 61; i vanćelijski domen IL-2Rα naveden je u SEQ ID NO: 7.

SL. 3 prikazuje bioaktivnost IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina. COS-7 ćelije su transfektovane cDNK za IL-2/IL-2Rα fuzione proteine, sa navedenim linkerima. Da bi se procenila aktivnost IL-2, supernatanti ovih ćelija uvedu se u kulturu T-blastičnih ćelija aktiviranih anti-CD3 antitelom. (A) Proliferativni odgovori T blasta posle razblaživanja navedenih fuzionih proteina. (B) Efekat anti-IL-2 na proliferaciju stimulisanu razblaženjem 1:2 supernatanta kulture koji sadrži navedene fuzione proteine.

SL. 4 prikazuje aktivnost prečišćenih IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina. Supernatanti transfektovanih CHO ćelija korišćeni su da bi se IL-2/(G3S)3/IL-2Rα i IL-2/(Gly4Ser)4/IL-Rα prečistili afinitetnom hromatografijom na bazi nikla, za 6x-His oznaku. (A) Merenje bioaktivnosti IL-2 preko proliferacije anti-CD3 T-blastičnih ćelija u prisustvu navedenog prečišćenog fuzionog proteina. (B) Efekat svakog od prečišćenih fuzionih proteina u inhibiciji vezivanja PC61 i 7D4 anti-IL-2Rα monoklonskih antitela, usmerenih ka ligand-nevezujućem mestu na T-blastičnim ćelijama aktiviranim anti-CD3 antitelom.

SL. 5 prikazuje da monoklonsko anti-IL-2Rα antitelo koje je usmereno ka IL-2-vezujućem mestu IL-2Rα ne može da se veže sa IL-2/IL-2Rα fuzionim proteinom. Prečišćeni fuzioni proteini sa varijabilnim linkerima, kako je navedeno, prvo su bili inkubirani sa 3C7 anti-IL-2Rα monoklonskim antitelom, usmerenim ka ligand-vezujućem mestu IL-2Rα ili 7D4 monoklonskim antitelom, usmerenim ka ligand-nevezujućem mestu IL-2Rα. Kapacitet 3C7 ili 7D4 za vezivanje za ćelijski površinski IL-2Rα procenjivan je korišćenjem IL-2Rαtransfektovanih EL4 ćelija.

SL. 6 prikazuje biohemijske osobine prečišćenog IL-2/IL-2Rα. (A) Prečišćeni IL-2/IL-2Rα podvrgne se SDS-PAGE pod redukujućim i neredukujućim uslovima; IL-2/IL-2Rα se vizuelizuje Western blot analizom uz markiranje antitelom na 6x-His oznaku fuzionog proteina. (B) Navedena količina prečišćenog IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2Ra podvrgne se SDS-PAGE pod redukujućim uslovima, što je praćeno bojenjem Coomassie plavim.

SL. 7 prikazuje efekat IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina na transdukciju signala zavisnu od IL-2, in vivo. C57BL/6 miševi primili su jednu injekciju i.p. IL-2/(G3S)3/IL-2Rα (4000 jedinica IL-2 aktivnosti) i odmah su procenjivani nivoi pSTAT5 u navedenim populacijama ćelija slezine. Nivoi pSTAT5 određivani su 0.5 h posle injekcije IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina. Za CD4<+>T ćelije, ćelije su ograđivane da bi se isključile Foxp3<+>Treg ćelije.

SL. 8 prikazuje efekat IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina na Treg ćelije in vivo. NOD miševima je 3 puta (dan 1, 3, 5) injektirana i.p. navedena količina IL-2-aktivnosti udruženo sa IL-2/(G3S)3/IL-2Rα. Efekat na Treg procenjivan je u slezini, limfnim čvorovima pankreasa (pancreatic lymph nodes, PLN) i pankreasu, 24 h posle poslednje injekcije. Evaluirani su udeo Treg u CD4<+>T ćelijama; srednji intenzitet fluorescencije (mean fluorescent intensity, MFI) za ekspresiju CD25 na Treg posle normalizacije u odnosu na ekspresiju CD25 na Treg kontrolnih miševa; proliferativni status Treg procenjen ekspresijom proliferativnog markera Ki67; i % Treg koji su eksprimirali Klrgl, marker IL-2-zavisne terminalno diferencirane subpopulacije. SL. 9 prikazuje upoređivanje IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina i rekombinantnog IL-2 u indukovanju promena Treg ćelija in vivo. C57BL/6 miševima su injektirani i.p.3 puta (dan 1, 3, 5) IL-2/(G3S)3/IL-2Rα (2000 jedinica), rekombinantni humani IL-2 (25000 jedinica) ili preformirani kompleksi anti-IL-2 (Jes-6.1; 5 µg) i mišjeg IL-2 (10000 jedinica) (IL2/IC). Efekat na Treg procenjivan je u slezini 24, 72 h i nedelju dana posle poslednje injekcije. Treg su procenjivani kako je opisano za SL.8.

SL. 10 prikazuje da ograničena primena niske doze IL-2 odlaže dijabetes kod NOD miševa. NOD miševi (8 miševa/grupi) primili su IL-2/IL-2Rα, solubilni IL-2Rα, ili PBS prema rasporedu u (A). Nivoi glukoze u urinu i krvi prate se dok miševi ne dostignu 40 nedelja starosti. Smatra se da su miševi dijabetični kada posle dva uzastopna očitavanja imaju nivo glukoze >250 mg/d1.

SL. 11 pokazuje da visoka doza IL-2/IL-2Rα pojačava razvijanje memorije CD8<+>T-ćelija. C57BL/6 miševi primili su kongene klasa I-ograničene ovalbumin (OVA)-specifične OT-I T-ćelijski receptor-transgene T ćelije. Ovi miševi su imunizovani i jedanput tretirani IL-2/(G3S)3/IL-2Rα fuzionim proteinom, IL2/IC koji sadrži 15000 jedinica IL-2, ili rekombinantnim IL-2 (25000 jedinica). U navedena vremena, procenjivan je relativni udeo OT-I T ćelija u celokupnom kompartmentu CD8<+>T ćelija u perifernoj krvi.

SL. 12 pokazuje tip perzistentnih OT-I memorijskih ćelija podržanih visokom dozom IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina: (A) Strategija ograđivanja za identifikovanje efektorskih memorijskih (effector-memory, EM) i centralnih memorijskih (central memory, CM) ćelija. (B) Distribucija OT-1 memorijskih ćelija 28. i 202. dana posle imunizacije, kod miševa koji su takođe primili IL-2/IL-2Rα (12000 jedinica).

SL. 13 prikazuje karakterizaciju humanih IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina koji sadrže glicin/serin linkere varijabilne dužine, kako je prikazano. (A) IL-2-bioaktivnost prečišćenog humanog IL-2//IL-2Rα uz korišćenje CTLL biotesta. (B) Western blot analiza humanih IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina posle SDS-PAGE pod redukujućim uslovima.

SL. 14 prikazuje monoklonska anti-IL-2Ra antitela vezana za humani IL-2/IL-2Rα fuzioni protein. Prečišćeni fuzioni proteini sa navedenim linkerima najpre su inkubirani sa BC96 anti-IL-2Rα monoklonskim antitelom, usmerenim ka ligand-vezujućem regionu humanog IL-2R-ili MA257 monoklonskim antitelom, usmerenim ka ligand-nevezujućem regionu humanog IL-2Rα. Kapacitet BC96 ili M-A257 da se zatim vežu za ćelijski površinski IL-2Rα procenjivan je uz korišćenje IL-2Rα-transfektovanih CHO ćelija.

SL. 15 prikazuje interakciju IL-2 sa IL-2-vezujućim mestom IL-2Rα u kontekstu humanih IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina. IL-2-bioaktivnost navedenih fuzionih proteina sa varijabilnim glicin/serin linkerima procenjivana je uz korišćenje CTLL ćelija. Mut označava fuzione proteine u kojima IL-2Rα sadži mutacije Arg<35>→ Thr, Arg<36>→ Ser. Western blot analiza potvrdila je slične količine svih fuzionih proteina (nije prikazano).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0024] Predmetni pronalasci će sada biti potpunije opisani u nastavku, uz pozivanje na priložene crteže u kojima su prikazane neka, ali ne sva tehnička rešenja pronalaska.

[0025] Zaista, ovi pronalasci mogu imati mnogo različitih formi tehničkih rešenja i ne treba ih tumačiti kao ograničene na tehnička rešenja navedena u ovom tekstu; umesto toga, ova tehnička rešenja obezbeđena su da bi ova objava zadovoljila važeće zakonske zahteve. Slični brojevi odnose se na slične elemente, u celom tekstu.

[0026] Mnoge modifikacije i druga tehnička rešenja pronalazaka navedenih u ovom tekstu, pašće na pamet stručnjaku u oblasti na koju se ovi pronalasci odnose, koji će imati koristi od učenja prikazanih u prethodno navedenim opisima i pridruženim crtežima. Prema tome, treba razumeti da se pronalasci ne ograničavaju na specifična tehnička rešenja koja su stavljena na uvid javnosti i da modifikacije i druga tehnička rešenja treba da budu uključeni u obim ovog pronalaska koji je definisan u priloženim patentnim zahtevima. Iako se ovde koriste specifični izrazi, oni se koriste samo u generičkom i opisnom smislu, a ne u svrhu ograničavanja.

I Pregled

[0027] Sadašnja tehnologija počiva na upotrebi rekombinantnog interleukina-2 (IL-2) koji ima loše farmakološke osobine, naročito kratak poluživot koji ograničava njegovu korisnost. U ovom tekstu stavljeni su na uvid javnosti interleukin-2/interleukin-2 receptor alfa (IL-2/IL-2Rα) fuzioni proteini koji imaju prirođene osobine koje ih razlikuju od rekombinantnog IL-2 i drugih IL-2 fuzionih proteina. Prvo, veličina IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina produžiće njihov poluživot in vivo. Drugo, slaba interakcija između IL-2 i IL-2Rα (jedna podjedinica IL-2R) u kontekstu IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina obezbeđuje drugi mehanizam za produženje raspoloživosti IL-2. Bez ograničavanja na specifičan mehanizam delovanja, do produžene raspoloživosti IL-2 aktivnosti može doći preko kompetitivnih interakcija IL-2 komponente sa IL-2Rα iz IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina i sa ćelijama koje eksprimiraju IL-2R.

II. Interleukin-2/interleukin-2 receptor alfa fuzioni proteini i polinukleotidi koji ih kodiraju

[0028] U ovom tekstu stavljeni na uvid javnosti su fuzioni proteini koji sadrže prvi polipeptid koji sadrži interleukin-2 (IL-2) ili njegovu funkcionalnu varijantu ili fragment fuzionisan u ramu sa drugim polipeptidom koji sadrži ili se sastoji od vanćelijskog domena interleukin-2 receptora alfa (IL-2Rα) polipeptida ili njegove funkcionalne varijante ili fragmenta. Prema pronalasku, fuzioni protein sadrži prvi polipeptid koji sadrži IL-2 i ima najmanje 70% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO:2; i drugi polipeptid, fuzionisan u ramu sa prvim polipeptidom pomoću linkera, pri čemu je linker sekvenca navedena u SEQ ID NO: 13, i pri čemu drugi polipeptid sadrži vanćelijski domen interleukin-2 receptora alfa (IL-2Rα), pri čemu drugi polipeptid ima najmanje 70% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO: 7; koji ima biološku aktivnost vanćelijskog domena IL-2Rα.

[0029] Kako se koristi u ovom tekstu, "fuzioni protein" odnosi se na genetičku povezanost u ramu najmanje dva heterologna polipeptida. Posle transkripcije/translacije nastaje jedan protein. Na ovaj način, više proteina ili njihovih fragmenata može se inkorporisati u jedan polipeptid. "Operabilno vezan" označava funkcionalnu vezu dva ili više elemenata. Na primer, operabilna veza između dva polipeptida spaja oba polipeptida zajedno u ramu da bi proizveli fuzioni protein u vidu jednog polipeptida. U posebnom aspektu, fuzioni protein sadrži još i treći polipeptid koji, kao što se detaljnije razmatra u nastavku, može sadržati linkersku sekvencu.

[0030] IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini ili njihove aktivne varijante ili fragmenti objavljeni u ovom tekstu mogu imati jednu ili više od sledećih osobina/aktivnosti: (1) povišavanje aktivnosti regulatornih T ćelija (Treg) i/ili povišavanje imunske tolerancije u terapijama na bazi niske doze IL-2; (2) povišavanje imunskog odgovora i memorije u terapijama sa višim dozama; (3) porast raspoloživosti IL-2 u poređenju sa rekombinantnim IL-2; i/ili (4) povišavanje perzistentne IL-2-stimulacije limfocita koji nose IL-2R in vivo. Takva aktivnost i postupci testiranja stavljeni su na uvid javnosti u dodatnim detaljima na drugim mestima u ovom tekstu.

Videti, na primer, Primer 1 dat u ovom tekstu. Prema pronalasku, fuzioni protein ima povišenu IL-2 aktivnost, ili povišenu perzistentnu IL-2-stimulaciju limfocita koji nose IL-2R in vivo, u poređenju sa nativnim IL-2.

[0031] U jednom neograničavajućem tehničkom rešenju, povišena aktivnost Treg, koja je rezultat IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina ili njihovih aktivnih varijanti ili fragmenata stavljenih na uvid javnosti u ovom tekstu može se testirati na različite načine uključujući, na primer, (1) povišenu zastupljenost i broj Treg u kompartmentu CD4<+>T ćelija; (2) pozitivnu regulaciju IL-2-zavisnog CD25; (3) povišenu proliferaciju, procenjenu preko ekspresije markera proliferacije Ki67; i (4) povišenu frakciju podgrupe IL-2-zavisnih terminalno diferenciranih KIrgl<+>Treg. Takvi efekti na Treg mogu se zapaziti, na primer, u slezini i zapaljenom pankreasu.

[0032] U jednom neograničavajućem tehničkom rešenju, IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini ili njihove aktivne varijante ili fragmenti stavljeni na uvid javnosti u ovom tekstu povišavaju tolerogene i imunosupresivne Treg i imunitet povišavanjem odgovora T efektorskih/memorijskih ćelija i, u dodatnim tehničkim rešenjima, pokazuju poboljšanu farmakokinetiku obezbeđivanjem takvih odgovora pri (1) nižim efektivnim nivoima IL-2 aktivnosti u poređenju sa nativnim ili rekombinantnim IL-2; (2) pokazuju perzistentnije biološke odgovore nego nativni ili rekombinantni IL-2; i/ili (3) zadržavaju hijerarhiju sa Treg koji reaguju na niže nivoe doza od T efektorskih/memorijskih ćelija.

[0033] U specifičnim tehničkim rešenjima, fuzioni proteini stavljeni na uvid javnosti u ovom tekstu imaju poboljšanu aktivnost u odnosu na nativni ili rekombinantni IL-2. Na primer, efekat IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina može povisiti tolerogene Treg pri oko 2 puta, 5 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, 100 puta 150 puta, 200 puta ili nižem nivou IL-2 aktivnosti u poređenju sa nativnim ili rekombinantnim IL-2. U drugim tehničkim rešenjima, IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini stavljeni na uvid javnosti u ovom tekstu efektivniji su nego nativni ili rekombinantni IL-2 u indukovanju perzistentne augmentacije Treg i srodnih osobina.

[0034] Različiti fragmenti i varijante IL-2 i IL-2Rα iz različitih organizama mogu se upotrebiti za generisanje IL-2/vanćelijski domen IL-2Rα fuzionih proteina stavljenih na uvid javnosti u ovom tekstu. Takve komponente detaljnije se razmatraju na drugim mestima u ovom tekstu. Primeri neograničavajućih neobrađenih IL-2/vanćelijski domen IL-2Rα fuzionih proteina navedeni su u SEQ ID NO: 27, 36, 57, i 59 dok su neograničavajući primeri zrelih formi IL-2/vanćelijski domen IL-Rα fuzionih proteina navedeni u SEQ ID NO: 26, 37, i 62. Neograničavajući primeri polinukleotida koji kodiraju takve fuzione proteine navedeni su u SEQ ID NO: 33, 34, 42, i 63. Izraz "sekretorna signalna sekvenca" označava polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid ("sekretorni peptid") koji, kao komponenta većeg polipeptida, usmerava veći polipeptid kroz sekretorni put ćelije u kojoj je sintetisan. Tokom prolaska kroz sekretorni put, veći polipeptid se obično seče da bi se uklonio sekretorni peptid. Kako se koristi u ovom tekstu, "zrela" forma fuzionog proteina ili polipeptida uključuje obrađenu formu polipeptida kojem je uklonjen sekretorni peptid. Kako se koristi u ovom tekstu, "neobrađena" forma fuzionog proteina zadržava sekvencu sekretornog peptida. Objavljeni su i biološki aktivni fragmenti i varijante zrele i neobrađene forme IL-2/vanćelijski domen IL-Rα fuzionih proteina, i polinukleotidi koji kodiraju iste. Takva funkcionalna varijanta polipeptida može sadržati najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sekvencione identičnosti sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 26, 27, 36, 37, 57, 59, ili 62.

[0035] Na uvid javnosti su stavljene još i aktivne varijante i fragmenti polinukleotida koji kodiraju IL-2/vanćelijski domen IL-Rα fuzione proteine. Takav polinukleotid može sadržati polinukleotid koji kodira polipeptide navedene u SEQ ID NO: 26, 27, 36, 37, 57, 59, ili 62 i nastaviti da kodira funkcionalne IL-2/vanćelijski domen IL-Ra fuzione proteine.

[0036] Poznato je i to da se komponente IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina, kako je objavljeno u ovom tekstu, mogu sresti bilo kojim redom. U jednom tehničkom rešenju, IL-2 polipeptid je na N-terminusu i vanćelijski domen IL-2Rα je na C-terminusu fuzionih proteina stavljenih na uvid javnosti u ovom tekstu.

i. Interleukin-2

[0037] Fuzioni protein pronalaska sadrži prvi polipeptid koji sadrži interleukin-2 (IL-2); pri čemu prvi polipeptid ima najmanje 70% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO: 2. Kako se koristi u ovom tekstu, "interleukin-2" ili "IL-2" označava bilo koji nativni ili rekombinantni IL-2 iz bilo kojeg vertebratskog izvora, uključujući sisare kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), i domestifikovane životinje ili životinje za poljoprivredu, ukoliko nije drugačije naznačeno. Izraz obuhvata neobrađeni IL-2, kao i bilo koju formu IL-2 koja je rezultat obrade u ćeliji (tj. zrela forma IL-2). Izraz takođe obuhvata prirodne varijante i fragmente IL-2, npr. splajsne varijante i alelske varijante, i neprirodne varijante. Aminokiselinska sekvenca primera zrele forme humanog IL-2 (sa signalnom sekvencom od 20 amino-kiselina) prikazana je u SEQ ID NO: 2. Neobrađeni humani IL-2 dodatno sadrži N-terminalni signalni peptid od 20 amino-kiselina (SEQ ID NO: 1), koji je odsutan u zrelom IL-2 molekulu. Aminokiselinska sekvenca primera zrele forme mišjeg IL-2 (sa signalnom sekvencom od 20 amino-kiselina) prikazana je u SEQ ID NO: 4. Neobrađeni mišji IL-2 dodatno sadrži N-terminalni signalni peptid od 20 amino-kiselina (SEQ ID NO: 3), koji je odsutan u zrelom IL-2 molekulu. Videti i

1

SL. 2A i SL. 2B. Pod "nativnim IL-2", nazvan i "divlji tip IL-2", misli se na prirodni ili rekombinantni IL-2.

[0038] Poznate su dodatne nukleinskokiselinske i aminokiselinske sekvence za IL-2. Videti, na primer, GenBank pristupni brojevi: Q7JFM2 (Aotus lemurinus (sivotrbi noćni majmun)); Q7JFM5 (Aotus nancymaae (noćni majmun Nensi Ma)); P05016 (Bos taurus (govedo)); Q29416 (Canis familiaris (pas) (Canis lupus familiaris)); P36835 (Capra hircus (koza)); i, P37997 (Equus caballus (konj)).

[0039] Biološki aktivni fragmenti i varijante IL-2 takođe su stavljeni na uvid javnosti u ovom tekstu. Takve aktivne varijante ili fragmenti IL-2 zadržaće IL-2 aktivnost. Izraz "biološka aktivnost IL-2" odnosi se na jednu ili više bioloških aktivnosti IL-2, uključujući, ali ne ograničavajući se na sposobnost stimulacije limfocita koji nose IL-2 receptor. Takva aktivnost može se meriti in vitro i in vivo. IL-2 je globalni regulator imunske aktivnosti i ovde viđeni efekti su zbir tih aktivnosti. Na primer, on reguliše aktivnost preživljavanja (Bc1-2), indukuje T-efektorsku aktivnost (IFN-gama, granzim B, i perforin), i promoviše T regulatornu aktivnost (FoxP3). Videti, na primer, Malek i sarad. (2010) Immunity 33(2):153-65.

[0040] Poznate su biološki aktivne varijante IL-2. Videti, na primer, američke objavljene prijave 20060269515 i 20060160187 i WO 99/60128.

[0041] Biološki aktivni fragmenti i varijante IL-2 mogu se upotrebiti u fuzionim proteinima stavljenim na uvid javnosti u ovom tekstu. Takvi funkcionalni fragmenti mogu sadržati najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sekvencione identičnosti sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 2.

[0042] U ovom tekstu objavljene su i aktivne varijante i fragmenti polinukleotida koji kodiraju IL-2 proteine. Takav funkcionalni polinukleotid može sadržati najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sekvencione identičnosti sa polinukleotidom koji kodira aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 2 i nastaviti da kodira funkcionalni IL-2 polipeptid.

ii. Interleukin-2 receptor alfa

[0043] Fuzioni protein pronalaska sadrži drugi polipeptid koji sadrži vanćelijski domen interleukin-2 receptora alfa (IL-2Rα), pri čemu drugi polipeptid ima najmanje 70% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO: 7; koji ima biološku aktivnost vanćelijskog domena IL-2Rα.

[0044] Izraz "CD25" ili "IL-2 receptor α" ili "IL-2Rα", kako se koristi u ovom tekstu, označava bilo koji nativni ili rekombinantni IL-2Rα iz bilo kojeg vertebratskog izvora, uključujući sisare kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr., miševi i pacovi) i domestifikovani sisari ili sisari za poljoprivredu, ako nije drugačije naznačeno. Izraz takođe obuhvata prirodne varijante IL2Rα, npr. splajsne varijante ili alelske varijante, ili neprirodne varijante. Humani IL-2 ispoljava svoje biološke efekte signaliziranjem preko svog receptorskog sistema, IL-2R. IL-2 i njegov receptor (IL-2R) potrebni su za proliferaciju T ćelija i druge fundamentalne funkcije koje su krucijalne za imunski odgovor. IL-2R se sastoji od 3 nekovalentno povezana transmembranska proteina tipa I, to su lanci alfa (p55), beta (p75), i gama (p65). Humani IL-2R alfa lanac sadrži vanćelijski domen od 219 amino-kiselina, transmembranski domen od 19 amino-kiselina, i unutarćelijski domen od 13 amino-kiselina. Sekretovani vanćelijski domen IL-2R alfa (IL-2R-a) može da se upotrebi u fuzionim proteinima opisanim u ovom tekstu.

[0045] Aminokiselinska sekvenca primera zrele forme humanog IL-2Rα prikazana je u SEQ ID NO: 6. Neobrađeni humani IL-2Rα prikazan je u SEQ ID NO: 5. Vanćelijski domen SEQ ID NO: 6 naveden je u SEQ ID NO: 7. Aminokiselinska sekvenca primera zrele forme mišjeg IL-2Rα prikazana je u SEQ ID NO: 9. Neobrađeni mišji IL-2Rα prikazan je u SEQ ID NO: 8. Vanćelijski domen SEQ ID NO: 9 naveden je u SEQ ID NO: 10. Pod "nativnim IL-2Rα", nazvanim i "divlji tip IL-2Rα", misli se na prirodni ili rekombinantni IL-2Rα. Sekvenca nativnog humanog IL-2Rα molekula prikazana je u SEQ ID NO: 5 i 6. Nukleinskokiselinska i aminokiselinska sekvenca IL-2Rα su poznate. Videti, na primer, GenBank pristupni br: NP_001030597.1 (P. troglodytes); NP_001028089.1 (M. mulatta); NM_001003211.1 (C. lupus); NP_776783.1 (B. taurus); NP_032393.3 (M. musculus); i NP_037295.1 (R. norvegicus).

[0046] Biološki aktivni fragmenti i varijante vanćelijskog domena IL-2Rα takođe su stavljeni na uvid javnosti u ovom tekstu. Takve aktivne varijante ili fragmenti vanćelijskog domena IL-2Rα zadržaće aktivnost vanćelijskog domena IL-2Rα. Izraz "biološka aktivnost vanćelijskog domena IL-2Rα" odnosi se na jednu ili više bioloških aktivnosti vanćelijskog domena IL-2Rα, uključujući, ali ne ograničavajući se na sposobnost pojačavanja unutarćelijske signalizacije u ćelijama koje odgovaraju preko receptora za IL-2. Neograničavajući primeri biološki aktivnih fragmenata i varijanti IL-2Rα objavljeni su, na primer, u Robb i sarad., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 85:5654-5658, 1988. Biološki aktivni fragmenti i varijante vanćelijskog domena IL-2Rα mogu se upotrebiti u fuzionim proteinima stavljenim na uvid javnosti u ovom tekstu. Takve funkcionalne varijante mogu sadržati najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sekvencione identičnosti sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 7

[0047] U jednom tehničkom rešenju, fuzioni proteini stavljeni na uvid javnosti u ovom tekstu mogu sadržati najmanje jednu mutaciju unutar vanćelijskog domena IL-2Rα. U specifičnom tehničkom rešenju, arginin na poziciji 35 IL-2Rα može biti mutiran u treonin i/ili arginin na poziciji 36 IL-2Rα može biti mutiran u serin. Takav fuzioni protein može imati povišenu IL-2 aktivnost u poređenju sa fuzionim proteinom koji ne sadrži ove mutacije u vanćelijskom domenu IL-2Rα i/ili u poređenju sa nativnim ili rekombinantnim IL-2. Aminokiselinske sekvence primera fuzionih proteina koji sadrže IL-2Rα sa mutacijama unutar vanćelijskog domena IL-2Rα navedene su u SEQ ID NO: 62 i 64. U jednom tehničkom rešenju, fuzioni protein prema pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 62; ili sekvencu koja ima najmanje 80%, 85%, 90%, ili 95% sa SEQ ID NO: 62.

[0048] U ovom tekstu objavljene su još i aktivne varijante i fragmenti polinukleotida koji kodiraju vanćelijski domen IL-2Rα. Takav funkcionalni polinukleotid može sadržati najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sekvencione identičnosti sa polinukleotidom koji kodira amino-sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 7 i nastaviti da kodira protein koji ima aktivnost vanćelijskog domena IL-2Rα.

iii. Dodatne komponente

[0049] IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini stavljeni na uvid javnosti u ovom tekstu mogu sadržati još i dodatne elemente. Takvi elementi mogu pomoći u ekspresiji fuzionog proteina, pomoći u sekreciji fuzionog proteina, poboljšati stabilnost fuzionog proteina, omogućiti efikasnije prečišćavanje proteina, i/ili modulisati aktivnost fuzionog proteina.

[0050] "Heterologan" kada se odnosi na polipeptid ili polinukleotid označava polipeptid ili polinukleotid koji potiče od drugog proteina ili polinukleotida. Dodatne komponente fuzionog proteina mogu poticati od istog organizma kao druge polipeptidne komponente fuzionog proteina, ili dodatne komponente mogu biti iz organizma različitog od onog iz kog su druge polipeptidne komponente fuzionog proteina.

[0051] U jednom tehničkom rešenju, IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini stavljeni na uvid javnosti u ovom tekstu sadrže linkersku sekvencu lociranu između IL-2 polipeptida i IL-2Rα polipeptida. Prema pronalasku, drugi polipeptid je pomoću linkera fuzionisan u ramu sa prvim polipeptidom, pri čemu linkerska sekvenca sadrži kombinaciju glicinskih i serinskih aminokiselinskih rezidua, tj., linkerska sekvenca je GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 13) (označena i kao (Gly3Ser)3).

[0052] Alternativni linkeri koji mogu da se koriste, ali nisu specifično zahtevani su linker bilo koje dužine koji sadrži najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50 ili 60 ili više amino-kiselina; linker koji sadrži glicinske aminokiselinske rezidue; i glicin/serin linkeri koji mogu sadržati bilo koju kombinaciju aminokiselinskih rezidua, uključujući peptid GGGS ili GGGGS ili ponovke istog, uključujući 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više ponovaka ovih datih peptida. Na primer, linkerske

1

sekvence mogu sadržati GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 11) (označena i kao (Gly3Ser)4); ili (Gly3Ser)5; (Gly3Ser)6; (Gly3Ser)7, itd. Linkerske sekvence mogu sadržati još i (Gly4Ser)3kako je navedeno u SEQ ID NO: 50; GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 40) (označena i kao (Gly4Ser)4); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41) (označena i kao (Gly4Ser)5); (Gly4Ser)2, (Gly4Ser)1, (Gly4Ser)6; (Gly4Ser)7; (Gly4Ser)8, itd. Pored toga, mogu se dodatno koristiti aktivne varijante i fragmenti bilo kojeg linkera.

[0053] Pored toga, poznato je da polinukleotid koji kodira IL-2/IL-2Rα fuzione proteine može sadržati dodatne elemente koji pomažu pri translaciji fuzionog proteina. Takve sekvence uključuju, na primer, Kozak-ove sekvence prikačene za 5' kraj polinukleotida koji kodira fuzioni protein. Kozak-ova konsenzusna sekvenca je sekvenca koja se sreće na eukariotskoj iRNK, koja igra ulogu u inicijaciji procesa translacije i ima konsenzus (gcc)gccRccAUGG (SEQ ID NO: 35); pri čemu (1) malo slovo označava najčešću bazu na poziciji na kojoj baza ipak može varirati; (2) velika slova označavaju visokokonzervirane baze, tj. 'AUGG' sekvenca je konstantna ili se retko ili nikada ne menja, osim IUPAC dvosmislenog koda 'R' koji označava da se na ovom mestu normalno nalazi purin (adenin ili guanin); i (3) sekvenca u zagradama ((gcc)) je nesigurnog značaja. U jednom tehničkom rešenju, Kozak-ova sekvenca sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 53.

[0054] U jednom neograničavajućem tehničkom rešenju, IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini objavljeni u ovom tekstu sadrže IL-2 lider-optimizovanu Kozak-ovu sekvencu, kako je navedeno u SEQ ID NO: 28 ili njenu funkcionalnu varijantu ili fragment. Funkcionalna varijanta ili fragment Kozak-ove sekvence zadržaće sposobnost povišenja translacije proteina u poređenju sa nivoom translacije sekvence kojoj nedostaje lider. Takav funkcionalni fragment može sadržati najmanje 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40 kontinuiranih nukleotida kozak-ove sekvence ili sekvence navedene u SEQ ID NO: 28 ili 53. Alternativno, funkcionalna varijanta može sadržati najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sekvencione identičnosti sa kozak-ovom sekvencom ili sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 28 ili 53.

[0055] U dodatnim tehničkim rešenjima, IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini stavljeni na uvid javnosti u ovom tekstu sadrže jednu ili više oznaka na C-terminusu koje pomažu pri prečišćavanju polipeptida. Takve oznake su poznate i uključuju, na primer, histidinsku oznaku. U specifičnim tehničkim rešenjima koristi se 6X His oznaka. Poznato je i to da između fuzionog proteina i His oznake može da se upotrebi dodatna linkerska sekvenca.

[0056] Neograničavajuće tehničko rešenje IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina navedeno je na SL.

1. Takav fuzioni protein sadrži liderski peptid, IL-2 ili njegovu funkcionalnu varijantu ili fragment, varijabilni linker, IL2Ra, glicinski linker, 6x his oznaku, i dva terminaciona kodona. iv. Varijante i fragmenti

a. Polinukleotidi

[0057] Fragmenti i varijante polinukleotida koji kodiraju IL-2/vanćelijski domen IL-2Rα fuzione proteine ili različite komponente sadržane u njima (tj., vanćelijski domen IL-2Rα, IL-2Rα polipeptide, linkerske sekvence i/ili Kozak-ove sekvence) mogu se upotrebiti u različitim postupcima i kompozicijama stavljenim na uvid javnosti u ovom tekstu. Pod "fragment" podrazumeva se deo polinukleotida, a time i protein kodiran njime ili deo polipeptida. Fragmenti polinukleotida mogu kodirati proteinske fragmente koji zadržavaju biološku aktivnost nativnog proteina i tako imaju IL-2 aktivnost, aktivnost vanćelijskog domena IL-2Rα, aktivnost IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina, ili ako kodiraju linkersku sekvencu, obezbeđuju željenu aktivnost IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina.

[0058] Biološki aktivan deo vanćelijskog domen-2 polipeptid, IL-2/IL-2Rα fuzioni protein, Kozak-ova sekvenca, ili linkerska sekvenca mogu se pripremiti izolovanjem dela jednog od polinukleotida koji kodiraju deo vanćelijskog domena IL-2Rα ili IL-2 polipeptid i eksprimiranjem kodiranog dela polipeptida (npr., rekombinantnom ekspresijom in vitro), i procenjivanjem aktivnosti dela vanćelijskog domena IL-2Rα ili/i IL-2 polipeptida ili aktivnosti IL-2/IL-Rα fuzionih proteina.

[0059] "Varijantne" sekvence imaju visok stepen sekvencione sličnosti. Za polinukleotide, konzervativne varijante uključuju one sekvence koje, zbog degenerisanosti genetičkog koda, kodiraju aminokiselinsku sekvencu jednog od polipeptida vanćelijskog domena IL-2Rα, IL-2 polipeptida, IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina, ili linkerskih sekvenci. Varijante kao ove mogu se identifikovati korišćenjem dobro poznatih molekularno-bioloških tehnika kao što su, na primer, lančana reakcija polimeraze (polymerase chain reaction, PCR) i tehnike hibridizacije. Varijantni polinukleotidi uključuju i sintetski izvedene nukleotidne sekvence kao što su one nastale, na primer, korišćenjem usmerene mutageneze, ali koje i dalje kodiraju vanćelijski domen IL-2Rα, IL-2 polipeptid, IL-2/IL-2Rα fuzioni protein, Kozak-ovu sekvencu, ili linkersku sekvencu.

b. Polipeptidi

[0060] Pod "varijantnim" proteinom podrazumeva se protein izveden iz nativnog proteina delecijom (takozvano odsecanje) ili adicijom jedne ili više amino-kiselina na N-terminalnom i/ili C-terminalnom kraju nativnog proteina; delecijom ili adicijom jedne ili više amino-kiselina

1

na jednom ili više mesta u nativnom proteinu; ili supstitucijom jedne ili više amino-kiselina na jednom ili više mesta u nativnom proteinu. Varijantni proteini su biološki aktivni, to jest i dalje poseduju željenu biološku aktivnost, to jest, aktivnost IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina, IL-2 aktivnost ili aktivnost vanćelijskog domena IL-2Rα. Takve varijante mogu biti rezultat, na primer, genetičkog polimorfizma ili čovekove manipulacije. Biološki aktivne varijante IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina ili bilo koje od njegovih komponenti (tj., polipeptida vanćelijskog domena IL-2Rα, IL-2 polipeptida, ili linkerske sekvence) imaće najmanje oko 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom nativnog proteina, kako je određeno programima za poravnavanje sekvenci i parametrima opisanim na drugim mestima u ovom tekstu. Biološki aktivna varijanta proteina može se razlikovati od tog proteina po samo 1-15 aminokiselinskih rezidua, samo 1-10, na primer 6-10, samo 5, samo 4, 3, 2, ili čak 1 aminokiselinskoj rezidui.

[0061] Proteini mogu biti izmenjeni na različite načine uključujući aminokiselinske supstitucije, delecije, odsecanja, i insercije. Postupci za takve manipulacije opšte su poznati u struci. Na primer, varijante aminokiselinske sekvence vanćelijskog domena IL-2Rα, IL-2 polipeptida, IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina, ili linkerskih sekvenci mogu se pripremiti mutacijama u DNK. Postupci mutageneze i promene nukleotidne sekvence dobro su poznati u struci. Videti, na primer, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 82:488-492; Kunkel i sarad. (1987) Methods in Enzymol.154:367-382; američki patent sa brojem 4,873,192; Walker and Gaastra, ured. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Njujork) i tamo navedene reference. Smernice o odgovarajućim aminokiselinskim supstitucijama koje ne utiču na biološku aktivnost proteina od interesa mogu se naći u modelu Dayhoff i sarad. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). Mogu biti poželjne konzervativne supstitucije, na primer zamena jedne amino-kiseline drugom koja ima iste osobine.

[0062] Prema tome, polinukleotidi objavljeni u ovom tekstu mogu uključivati prirodne sekvence, "nativne" sekvence, kao i mutantne forme. Slično tome, proteini korišćeni u postupcima objavljenim u ovom tekstu obuhvataju prirodne proteine, kao i njihove varijacije i modifikovane forme. Takve varijante će i dalje imati sposobnost implementiranja događaja rekombinacije. Uopšteno, mutacije načinjene u polinukleotidu koji kodira varijantni polipeptid ne bi trebalo da postave sekvencu izvan rama čitanja, i/ili stvore komplementarne regione koji bi proizveli sekundarnu strukturu iRNK. Vidi, objavljena evropska prijava patenta sa brojem 75,444.

1

[0063] Varijantni polinukleotidi i proteini obuhvataju i sekvence i proteine izvedene procedurom mutageneze i rekombinacije kao što je mešanje DNK. Takvom procedurom, moguće je manipulisati jednu ili više različitih kodirajućih sekvenci vanćelijskog domena IL-2Rα ili IL-2 kako bi se stvorili novi polipeptidi vanćelijskog domena IL-2Rα ili IL-2, sa željenim osobinama. Na taj način stvaraju se biblioteke rekombinantnih polinukleotida od populacije polinukleotida srodnih sekvenci koji sadrže sekvencione regione sa suštinskom identičnošću sekvenci i koji se mogu homologno rekombinovati in vitro ili in vivo. Strategije za takvo mešanje DNK poznate su u struci, vidi, na primer, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri i sarad. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore i sarad. (1997) J. Mol. Biol.272:336-347; Zhang i sarad. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri i sarad. (1998) Nature 391:288-291; i američki patenti sa brojevima 5,605,793 i 5,837,458.

III. Polinukleotidi koji kodiraju IL-2/IL-2Rα fuzione proteine i postupci spravljanja [0064] Kompozicije opisane u ovom tekstu uključuju još i izolovane polinukleotide koji kodiraju različite fuzione proteine opisane ranije u ovom tekstu, i njihove varijante i fragmente. Objavljeni su i vektori i ekspresione kasete koji sadrže polinukleotide opisane u ovom tekstu. Ekspresione kasete će obično uključivati promotor operabilno povezan sa polinukleotidom i region terminacije transkripcije i translacije.

[0065] Korišćenje izraza "polinukleotid" nije namenjeno ograničavanju predmetnog pronalaska na polinukleotide koji sadrže DNK. Prosečno obučeni stručnjaci prepoznaće da polinukleotidi mogu sadržati ribonukleotide i kombinacije ribonukleotida i dezoksiribonukleotida. Takvi dezoksiribonukleotidi i ribonukleotidi uključuju prirodne molekule i sintetske analoge.

[0066] "Izolovani" ili "prečišćeni" polinukleotid ili protein, ili njegov biološki aktivan deo, suštinski ili bitno ne sadrži komponente koje su normalno udružene ili interaguju sa polinukleotidom ili proteinom kada se on nalazi u svom prirodnom okruženju. Prema tome, kada se proizvede rekombinantnim tehnikama, izolovani ili prečišćeni polinukleotid ili protein suštinski ne sadrži drugi ćelijski materijal, ili kultivacioni medijum ili, kada se sintetiše hemijski, suštinski ne sadrži hemijske prekursore ili druge hemikalije. Optimalno, "izolovani" polinukleotid ne sadrži sekvence (optimalno protein-kodirajuće sekvence) koje se prirodno nalaze na bokovima polinukleotida (tj., sekvence locirane na 5' i 3' kraju polinukleotida) u genomskoj DNK organizma iz kojeg je polinukleotid izveden. Na primer, u različitim tehničkim rešenjima, izolovani polinukleotid može sadržati manje od oko 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, ili 0.1 kb od nukleotidne sekvence koja se prirodno nalazi na bokovima polinukleotida u genomskoj DNK ćelije iz koje je polinukleotid izveden. Protein koji suštinski

1

ne sadrži ćelijski materijal uključuje preparate proteina sa manje od oko 30%, 20%, 10%, 5%, ili 1% (po suvoj masi) kontaminirajućeg proteina. Kada se protein pronalaska ili njegov biološki aktivan deo proizvede rekombinantno, optimalni kultivacioni medijum predstavlja manje od oko 30%, 20%, 10%, 5%, ili 1% (po suvoj masi) hemijskih prekursora ili hemikalija koje nisu protein od interesa.

[0067] Ovde se mogu upotrebiti konvencionalne tehnike molekularne biologije, mikrobiologije i rekombinantne DNK, koje su u okvirima struke. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti, npr., Sambrook i sarad., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" volumeni I-III [Ausubel, R. M., ured. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" volumeni I-III [J. E. Celis, ured. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" volumeni I-III [Coligan, J. E., ured. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ured.1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins ured. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, ured. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ured. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

[0068] U ovom tekstu stavljen je na uvid javnosti i vektor koji sadrži gore opisane polinukleotide operabilno povezane sa promotorom. Nukleotidna sekvenca je "operabilno povezana" sa sekvencom za kontrolu ekspresije (npr., promotor) kada sekvenca za kontrolu ekspresije kontroliše i reguliše transkripciju i translaciju te sekvence. Izraz "operabilno povezan", kada se odnosi na nukleotidnu sekvencu, uključuje prisustvo odgovarajućeg startsignala (npr., ATG) ispred nukleotidne sekvence koja treba da se eksprimira i održavanje ispravnog rama čitanja kako bi se omogućila ekspresija sekvence koja je pod kontrolom sekvence za kontrolu ekspresije i proizvodnja željenog proizvoda kodiranog sekvencom. Ako gen koji se insertuje u rekombinantni molekul nukleinske kiseline ne sadrži odgovarajući startsignal, takav start-signal može da se insertuje ispred gena. "Vektor" je replikon, kao što je plazmid, fag ili kozmid, za koji može da se veže drugi segment nukleinske kiseline tako da se izvrši replikacija vezanog segmenta. Promotor može biti, ili je identičan promotoru bakterije, kvasca, insekta ili sisara. Pored toga, vektor može biti plazmid, kozmid, veštački hromozom kvasca (yeast artificial chromosome, YAC), bakteriofag ili DNK virusa eukariota.

[0069] Mogu se upotrebiti i brojne druge vektorske osovine koje su u struci poznate kao korisne za ekspresiju proteina. Takvi vektori uključuju, ali se ne ograničavaju na: adenovirus, simijan virus 40 (SV40), citomegalovirus (CMV), virus mišjeg tumora dojke (mouse mammary tumor virus, MMTV), Moloney-jev virus mišje leukemije, sisteme za dostavu DNK, tj. lipozome i sisteme za dostavu ekspresionog plazmida. Pored toga, jedna klasa vektora obuhvata DNK

1

elemente izvedene iz virusa kao što su goveđi papiloma virus, polioma virus, bakulovirus, retrovirusi ili Semliki Forest virus. Takvi se vektori mogu nabaviti komercijalno ili asamblirati od opisanih sekvenci postupcima koji su dobro poznati u struci.

[0070] U ovom tekstu objavljen je sistem vektor-domaćin za proizvodnju polipeptida, koji sadrži vektor pogodne ćelije-domaćina. Pogodne ćelije-domaćini uključuju, ali se ne ograničavaju na prokariotske ili eukariotske ćelije, npr. bakterijske ćelije (uključujući grampozitivne ćelije), ćelije kvasca, ćelije gljiva, ćelije insekata, i ćelije životinja. Brojne ćelije sisara mogu se upotrebiti kao domaćini, uključujući, ali ne ograničavajući se na mišje fibroblaste NIH 3T3, CHO ćelije, HeLa ćelije, Ltk<->ćelije, itd. Korisne mogu biti i druge ćelije životinja, na primer R1.1, B-W i L-M ćelije, ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (npr., COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, i BMT10), ćelije insekata (npr., Sf9), kao i čovečje i biljne ćelije u kulturi tkiva.

[0071] Veliki broj različitih kombinacija domaćin/ekspresioni vektor može se koristiti za ekspresiju polinukleotidnih sekvenci prikazanih u ovom tekstu. Korisni ekspresioni vektori, na primer, mogu se sastojati od segmenata hromozomskih, nehromozomskih i sintetskih DNK sekvenci. Pogodni vektori uključuju derivate SV40 i poznate bakterijske plazmide, npr., E. coli plazmide col El, pCR1, pBR322, pMB9 i njihove derivate, plazmide kao što je RP4; fagne DNK, npr., brojni derivati faga λ, npr., NM989, i druge fagne DNK, npr., M13 i filamentozna jednolančana fagna DNK; plazmide kvasca kao što su 2µ plazmid ili njegovi derivati; vektore korisne u eukariotskim ćelijama kao što su vektori korisni u ćelijama insekata ili ćelijama sisara; vektore izvedene kombinacijom DNK plazmida i faga, kao što su plazmidi modifikovani za korišćenje fagne DNK ili druge sekvence za kontrolu ekspresije; i slično.

[0072] Bilo koja od velikog broja različitih sekvenci za kontrolu ekspresije (sekvence koje kontrolišu ekspresiju nukleotidne sekvence sa kojom su operabilno povezane) može se koristiti u ovim vektorima kako bi se eksprimirale ovde obezbeđene polinukleotidne sekvence. Takve korisne sekvence za kontrolu ekspresije uključuju, na primer, rane ili kasne promotore SV40, CMV, vakcinije, polioma ili adenovirusa, lac sistem, trp sistem, TAC sistem, TRC sistem, LTR sistem, glavni operatorski i promotorski region faga λ, kontrolne regione fd proteina omotača, promotor za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, promotor kisele fosfataze (npr. PhoS), promotor α-faktora sparivanja kvasca i druge sekvence za koje je poznato da kontrolišu ekspresiju gena prokariotskih ili eukariotskih ćelija ili njihovih virusa, i njihove različite kombinacije.

[0073] Razume se da neće svi vektori, sekvence za kontrolu ekspresije i domaćini funkcionisati jednako dobro za ekspresiju polinukleotidnih sekvenci obezbeđenih u ovom tekstu. Ni svi

1

domaćini neće funkcionisati jednako dobro sa istim ekspresionim sistemom. Međutim, stručnjak u oblasti moći će da odabere odgovarajuće vektore, sekvence za kontrolu ekspresije i domaćine bez nepotrebnog eksperimentisanja kako bi se postigla željena ekspresija bez odstupanja od obima ovog pronalaska. Na primer, pri odabiru vektora mora se uzeti u obzir domaćin jer vektor mora funkcionisati u njemu. U obzir će se uzeti i broj kopija vektora, mogućnost kontrolisanja tog broja kopija i ekspresija svih drugih proteina kodiranih vektorom, kao što su antibiotski markeri.

[0074] Pri odabiru sekvence za kontrolu ekspresije obično će se uzeti u obzir različiti faktori. Oni uključuju, na primer, relativnu snagu sistema, mogućnost njegovog kontrolisanja i njegovu kompatibilnost sa određenom nukleotidnom sekvencom ili genom koji treba da se eksprimira, posebno što se tiče potencijalnih sekundarnih struktura. Pogodni jednoćelijski domaćini biće odabrani uzimajući u obzir, npr., njihovu kompatibilnost sa odabranim vektorom, njihove sekrecione karakteristike, njihovu sposobnost da pravilno saviju proteine i njihove fermentacione potrebe, kao i toksičnost za domaćina proizvoda kodiranog nukleotidnim sekvencama koje treba da se eksprimiraju, i jednostavnost prečišćavanja proizvoda ekspresije.

[0075] Prilikom pripremanja ekspresione kasete, različiti polinukleotidi mogu se manipulisati tako da se obezbede polinukleotidne sekvence u pravilnoj orijentaciji i, kada je pogodno, u odgovarajućem ramu čitanja. U tu svrhu, za spajanje polinukleotida mogu se koristiti adapteri ili linkeri ili se mogu uključiti druge manipulacije da bi se obezbedila pogodna restrikciona mesta, uklonila suvišna DNK, uklonila restrikciona mesta ili slično. Na primer, između polipeptida mogu se dodati linkeri kao što su dva glicina. Mogu se dodati metioninske rezidue kodirane atg nukleotidnim sekvencama da bi se omogućila inicijacija transkripcije gena. U tu svrhu, mogu se uključiti in vitro mutageneza, reparacija prajmerom, restrikcija, hibridizacija, resupstitucije, npr. tranzicije i transverzije.

[0076] Obezbeđen je i postupak za proizvodnju polipeptida, koji uključuje eksprimiranje polinukleotida koji kodira ovde objavljeni fuzioni protein u ćeliji-domaćinu, pod pogodnim uslovima koji omogućavaju proizvodnju polipeptida i preuzimanje tako proizvedenog polipeptida; pri čemu je polipeptid fuzioni protein u skladu sa pronalaskom.

IV. IL-2/IL-2Rα fuzioni protein za upotrebu u postupcima

[0077] Objavljeni su različiti postupci za modulisanje imunskog odgovora. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "modulisanje" uključuje indukovanje, inhibiranje, potenciranje, porast, povišenje ili sniženje date aktivnosti ili odgovora.

[0078] Pod "subjektom" podrazumevaju se sisari, npr. primati, ljudi, životinje za poljoprivredu i domestifikovane životinje kao što su, bez ograničavanja, psi, mačke, goveda, konji, svinje,

2

ovce i slično. U jednom tehničkom rešenju, subjekt podvrgnut lečenju farmaceutskim formulacijama objavljenim u ovom tekstu je čovek.

[0079] "Terapijski efektivna količina" IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina odnosi se na količinu IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina dovoljnu da izazove željeni biološki odgovor. Kao što će prepoznati prosečno obučeni stručnjak u oblasti, apsolutna količina određenog IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina koja je efektivna može varirati u zavisnosti od faktora kao što su željena biološka krajnja tačka, IL-2/IL- 2Rα fuzioni proteini koje treba dostaviti, ciljna ćelija ili tkivo i slično. Prosečno obučeni stručnjak u oblasti razumeće i to da se efektivna količina može administrirati u jednoj dozi, ili se može dostići administriranjem više doza (tj., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10 ili više doza).

i. Fuzioni protein za upotrebu u postupku za povišavanje imunskog odgovora

[0080] Objavljeni su različiti postupci za povišavanje imunskog odgovora kod subjekta. Takvi postupci uključuju administriranje, kod subjekta kojem je potrebno povišavanje imunskog odgovora, terapijski efektivne količine IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina. Kao takva, u specifičnim tehničkim rešenjima, prolazna primena viših doza IL-2 koristi se za pojačavanje efektorskog i memorijskog imunskog odgovora.

[0081] Poznato je i to da različiti IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini mogu da se koriste u kombinaciji sa antigenom za pojačanje imunskog odgovora na antigen. Prema tome, IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini mogu da se koriste i kao adjuvans za vakcinu, posebno za pojačanje ćelijama posredovane imunske memorije.

[0082] Na primer, IL-2/IL-2Rα fuzion protein prema pronalasku može da se koristi za pojačanje preparata vakcine. Prema tome, različiti IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini korisni su za povećanje efikasnosti antikancerskih vakcina ili za vakcine koje su slabo imunogene. Pored toga, fuzioni protein pronalaska može da se koristi u postupku pojačavanja efikasnosti ili imunogenosti vakcine kod subjekta, ili prevazilaženja suprimiranog imunskog odgovora na vakcinu kod subjekta, koji uključuje (i) administriranje, kod subjekta, terapijski efektivne količine IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina i (ii) administriranje vakcine kod subjekta.

[0083] Pod "vakcinom" podrazumeva se kompozicija korisna za stimulisanje specifičnog imunskog odgovora (ili imunogenog odgovora) kod subjekta. U nekim tehničkim rešenjima, imunogeni odgovor je zaštitan ili obezbeđuje zaštitni imunitet. Na primer, u slučaju organizma koji izaziva bolest, vakcina omogućava subjektu da se bolje odupre infekciji ili progresiji bolesti koju izaziva organizam protiv kojeg je vakcina usmerena. Alternativno, u slučaju kancera, vakcina osnažuje subjektove prirodne odbrane protiv kancera koji su se već razvili. Ovi tipovi vakcina mogu takođe prevenirati dalji rast postojećih kancera, prevenirati recidiv lečenih kancera, i/ili eliminisati kancerske ćelije koje nisu ubijene prethodnim tretmanima.

[0084] Reprezentativne vakcine uključuju, ali se ne ograničavaju na vakcine protiv difterije, tetanusa, velikog kašlja, dečje paralize, malih boginja, zauški, rubele, hepatitisa B, Haemophilus influenzae tip b, varičele, meningitisa, virusa humana imunodeficijencije, tuberkuloze, Epstein Barr virusa, malarije, hepatitisa E, denge, rotavirusa, herpesa, humanog papilomavirusa, i kancera. Vakcine od interesa uključuju dve vakcine koje je licencirala Uprava za hranu i lekove SAD (U.S. Food and Drug Administration) za prevenciju virusnih infekcija koje mogu dovesti do kancera: vakcina protiv hepatitisa B, koja prevenira infekciju virusom hepatitisa B koji je infektivni agens udružen sa kancerom jetre (MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 46:107-09, 1997); i Gardasil<™>, koja prevenira infekciju koju izazivaju dva tipa humanog papilomavirusa koji zajedno prouzrokuju 70 procenata kancera cerviksa širom sveta (Speck and Tyring, Skin Therapy Lett. 11:1-3, 2006). Druge vakcine za lečenje od interesa uključuju terapijske vakcine za lečenje kancera, kancera cerviksa, ne-Hodgkin-ovog limfoma folikularnih B ćelija, kancera bubrega, melanoma kože, melanoma oka, kancera prostate, i multiplog mijeloma. Pod "pojačavanjem efikasnosti" ili "pojačavanjem imunogenosti", u vezi sa vakcinom, podrazumeva se poboljšanje ishoda, na primer, kako je mereno promenom specifične vrednosti kao što je porast ili smanjenje određenog parametra aktivnosti vakcine udružene sa zaštitnim imunitetom. U jednom tehničkom rešenju, pojačanje se odnosi na povišenje određenog parametra od najmanje 5%, 10%, 25%, 50%, 100% ili više od 100%. U drugom tehničkom rešenju, pojačanje se odnosi na sniženje određenog parametra od najmanje 5%, 10%, 25%, 50%, 100% ili više od 100%. U jednom primeru, pojačanje efikasnosti/imunogenosti vakcine odnosi se na porast sposobnosti vakcine da inhibira ili leči progresiju bolesti, na primer najmanje 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, ili više od 100% porasta efektivnosti tome namenjene vakcine. U još jednom primeru, pojačanje efikasnosti/imunogenosti vakcine odnosi se na porast sposobnosti vakcine da regrutuje subjektove prirodne odbrane protiv kancera koji se već razvio, na primer najmanje 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, ili više od 100% porasta efektivnosti tome namenjene vakcine.

[0085] Slično, pod "prevladavanjem suprimiranog imunskog odgovora", u vezi sa vakcinom, podrazumeva se poboljšanje ishoda, na primer, kako je mereno promenom specifične vrednosti, na primer povratkom na prethodno pozitivnu vrednost, određenog parametra aktivnosti vakcine udružene sa zaštitnim imunitetom. U jednom tehničkom rešenju, prevladavanje se odnosi na porast određenog parametra od najmanje 5%, 10%, 25%, 50%, 100% ili više od 100%. U jednom primeru, prevladavanje suprimiranog imunskog odgovora na vakcinu odnosi se na obnovljenu sposobnost vakcine da inhibira ili leči progresiju bolesti, na primer obnavljanje efektivnosti tome namenjene vakcine za najmanje 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, ili više od 100%. U još jednom primeru, prevladavanje suprimiranog imunskog odgovora na vakcinu odnosi se na obnovljenu sposobnost vakcine da regrutuje subjektove prirodne odbrane protiv kancera koji su se već razvili, na primer, obnavljanje efektivnosti tome namenjene vakcine za najmanje 25%, 50%, 100%, ili više od 100%. Pod "terapijski efektivnom količinom" podrazumeva se količina korisna za lečenje, prevenciju ili dijagnozu bolesti ili stanja. Kako se koristi u ovom tekstu, terapijski efektivna količina IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina je količina koja je, kada se administrira kod subjekta, dovoljna za postizanje željenog efekta kao što je modulisanje imunskog odgovora kod subjekta, bez izazivanja bitnog citotoksičnog efekta kod subjekta. Kao što je navedeno ranije u ovom tekstu, terapijski efektivna količina fuzionog proteina IL-2/IL-2Rα može se administrirati kod subjekta da bi se povisio imunski odgovor, pojačao imunski odgovor na antigen, pojačala efikasnost ili imunogenost vakcine kod subjekta, ili da bi se prevladao suprimirani imunski odgovor na vakcinu. Efektivna količina IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina korisna za modulisanje takvih funkcija zavisiće od subjekta koji se leči, ozbiljnosti tegobe i načina administriranja IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina. Primeri doza uključuju oko 10<4>do oko 10<7>IU IL-2 aktivnosti po adultu, oko 10<4>do 10<5>IU IL-2 aktivnosti po adultu, oko 10<5>do oko 10<6>IU IL-2 aktivnosti po adultu, oko 10<6>do oko 10<7>IU IL-2 aktivnosti po adultu. U drugim slučajevima, terapijski efektivna doza IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina je oko 10<5>IU IL-2 aktivnosti ± 100-struka, je oko 10<5>IU IL-2 aktivnosti ± 10-struka, oko 10<5>IU IL-2 aktivnosti ± 2-struka, oko 10<5>IU IL-2 aktivnosti ± 20-struka, oko 10<5>IU IL-2 aktivnosti ± 30-struka, oko 10<5>IU IL-2 aktivnosti ± 40-struka, oko 10<5>IU IL-2 aktivnosti ± 50-struka, oko 10<5>IU IL-2 aktivnosti ± 60-struka, oko 10<5>IU IL-2 aktivnosti ± 70-struka, oko 10<5>IU IL-2 aktivnosti ± 80-struka, ili oko 10<5>IU IL-2 aktivnosti ± 90-struka. U specifičnom neograničavajućem tehničkom rešenju, humani IL-2 fuzioni protein se administrira u toj dozi.

[0086] U jednom tehničkom rešenju, referentni standard za mišji IL-2 fuzioni protein je mišji IL-2, proizvođač eBiosciences (kataloški broj: 14-8021). Ukratko, bioaktivnost mišjeg IL-2, proizvođač eBioscience, je sledeća: ED50 ovog proteina, kako je izmereno CTLL-2 testom proliferacije ćelija, iznosi 175 pg/mL ili manje. Ovo odgovara specifičnoj aktivnosti od 5.7 x 10<6>jedinica/mg ili većoj.

[0087] U drugom tehničkom rešenju, referentni standard za humani IL-2 fuzioni protein je humani IL-2 lek aldesleukin (Proleukin). Prema tome, IL-2 fuzioni proteini objavljeni u ovom tekstu se direktno upoređuju sa fuzionim proteinom IL-2 leka koji se koristi u terapiji niskom dozom ili visokom dozom IL-2. Za određivanje IL-2 aktivnosti mišjeg i humanog IL-2 koristi

2

se isti test i njihova aktivnost u jedinicama/mg je slična. U vezi sa humanim IL-2 lekom, tj. aldesleukinom (Proleukin), standardna mera količine IL-2 je internacionalna jedinica (international unit, IU) koja tehnički nije fiksirana količina nego je količina koja proizvodi fiksirani efekat u specifičnom testu biološke aktivnosti, tj. CTLL testu proliferacije. U praksi, izrada IL-2 je standardizovana i postoji konverzija između mase leka i internacionalnih jedinica. To je 1.1 mg IL-2 = 18 miliona IU (skraćeno 18 MIU).

[0088] Pored toga, podrazumeva se da odgovarajuće doze funkcionalnog sredstva zavise od snage aktivnog sredstva u odnosu na aktivnost koju treba modulisati. Takve odgovarajuće doze mogu se odrediti pomoću testova opisanih u ovom tekstu. Pored toga, podrazumeva se da će specifični dozni nivo za bilo kojeg određenog životinjskog subjekta zavisiti od niza faktora uključujući aktivnost specifičnog upotrebljenog jedinjenja, starost, telesnu masu, opšte stanje zdravlja, pol i način ishrane subjekta, vreme administriranja, put administriranja, brzinu ekskrecije, i/ili bilo koju kombinaciju lekova.

[0089] Kada se administriranje vrši u svrhu lečenja, administriranje može biti u svrhu ili profilakse ili terapije. Kada se daje profilaktički, supstanca se daje pre bilo kakvog simptoma. Profilaktičko administriranje supstance služi za prevenciju ili ublažavanje bilo kojeg kasnijeg simptoma. Kada se daje terapijski, supstanca se daje pri pojavi simptoma (ili ubrzo posle toga). Terapijsko administriranje služi za ublažavanje bilo kojeg aktuelnog simptoma.

[0090] Obučeni stručnjak će razumeti da određeni faktori mogu uticati na dozu potrebnu za efikasno lečenje subjekta, uključujući, ali ne ograničavajući se na ozbiljnost bolesti ili poremećaja, prethodna lečenja, opšte stanje zdravlja i/ili starost subjekta i druge prisutne bolesti. Pored toga, lečenje subjekta terapijski efektivnom količinom IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina može uključivati jedan tretman ili, poželjno, može uključivati niz tretmana. Podrazumeva se i to da se efektivna doza IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina korišćenog za tretman može povisiti ili sniziti tokom određenog tretmana. Promene doziranja mogu rezultovati i postati očigledne iz rezultata dijagnostičkih testova, kako je opisano u ovom tekstu.

[0091] Terapijski efektivne količine IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina mogu se odrediti studijama na životinjama. Kada se koriste testovi na životinjama, administrira se doza koja će obezbediti ciljnu in vivo koncentraciju sličnu onoj za koju je pokazano da je efektivna u testovima na životinjama.

ii. Fuzioni protein za upotrebu u postupku smanjenja imunskog odgovora

[0092] Pronalazak uključuje još i fuzioni protein prema predmetnom pronalasku za upotrebu u smanjenju imunskog odgovora kod subjekta. Objavljeni su različiti postupci za smanjenje imunskog odgovora kod subjekta. Takvi postupci obuhvataju administriranje, kod subjekta kojem je potrebno smanjenje imunskog odgovora, terapijski efektivne količine IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina.

[0093] Postoji veliko interesovanje za korišćenje supresivne snage Treg za inhibiranje neželjenih imunskih odgovora. Podaci dobijeni na mišu i čoveku pokazuju da pojačavanje IL-2R signalizacije niskom dozom IL-2 selektivno podstiče Treg i pojačava imunske tolerogene mehanizme. IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini stavljeni na uvid javnosti u ovom tekstu predstavljaju novu i poboljšanu formu IL-2 koja snažnije pojačava Treg. Prema tome, IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini mogu se administrirati kod pacijenata sa autoimunskim bolestima, hroničnom bolešću kalema protiv domaćina, reakcijama odbacivanja transplanta i drugim stanjima u kojima je cilj suprimirati autoreaktivnost.

[0094] Na primer, terapijski efektivna količina IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina koja pokreće imunsku toleranciju može se upotrebiti, na primer, za lečenje subjekta koji ima autoimunski ili zapaljenski poremećaj, uključujući, ali ne ograničavajući se na odbacivanja kalema i alergije. Prema tome, u jednom tehničkom rešenju, obezbeđen je fuzioni protein prema pronalasku za upotrebu u postupku lečenja subjekta koji ima autoimunski ili zapaljenski poremećaj. Takav postupak uključuje administriranje, kod subjekta, terapijski efektivne količine IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina.

[0095] Neograničavajući primeri autoimunskih poremećaja koji se mogu lečiti ili prevenirati uključuju dijabetes tipa 1, multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, celijakiju, sistemski eritemski lupus, juvenilni idiopatski artritis, Crohn-ovu bolest, ulcerozni kolitis ili sistemsku sklerozu, bolest kalema protiv domaćina, HCV-indukovani vaskulitis, pečatastu alopeciju ili psorijazu.

[0096] Dodatne autoimunske bolesti uključuju one kod kojih već postoji naznaka da bi Treg mogli biti ometeni i da bi IL-2-zavisno podsticanje Treg moglo biti od koristi. U tom smislu, polimorfizmi jednog nukleotida (single nucleotide polymorphism, SNP) u IL-2, IL-2Rα ili IL-2R13 bili su u vezi sa genetičkim rizikom za dijabetes tipa 1, multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, celijakiju, sistemski eritemski lupus, juvenilni idiopatski artritis, Crohn-ovu bolest, ulcerozni kolitis i sistemsku sklerozu. Studije sugerišu da je genetički rizik u vezi sa poremećajem broja i/ili aktivnosti Treg. Pored toga, pokazalo se da terapija niskim dozama IL-2 koristi kod pacijenata sa hroničnim GvHD i HCV-indukovanim vaskulitisom Prema tome, kod takvih populacija pacijenata takođe se može administrirati terapijski efektivna količina IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina.

[0097] U drugim tehničkim rešenjima, IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini, kako je stavljeno na uvid javnosti, mogu se koristiti u kombinaciji sa terapijskim sredstvom da bi se redukovao imunski odgovor na sredstvo (tj. protein). Na primer, IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini, kako je stavljeno na

2

uvid javnosti, mogu se koristiti u kombinaciji sa terapijskim proteinom koji mora da se kod subjekta administrira hronično. Prema tome, u specifičnom tehničkom rešenju, postupak uključuje administriranje, kod subjekta, najmanje jednog dodatnog terapijskog sredstva u kombinaciji sa IL-2/IL-2Rα fuzionim proteinom. Takva terapijska sredstva uključuju, ali se ne ograničavaju na citokin, glukokortikoid, antraciklin (npr., doksorubicin ili epirubicin), fluorohinolon (npr., ciprofloksacin), antifolat (npr., metotreksat), antimetabolit (npr., fluorouracil), inhibitor topoizomeraze (npr., kamptotecin, irinotekan ili etopozid), alkilirajuće sredstvo (npr., ciklofosfamid, ifosfamid, mitolaktol, ili melfalan), antiandrogen (npr., flutamid), antiestrogen (npr., tamoksifen), jedinjenje platine (npr., cisplatin), alkaloid vinke (npr., vinorelbin, vinblastin ili vindezin), ili inhibitor mitoze (npr., paklitaksel ili docetaksel).

[0098] Pored toga, terapijski efektivna količina IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina, kako je stavljeno na uvid javnosti, može se administrirati i u kombinovanim terapijama za porast Treg i tolerancije. Takve kombinovane terapije mogu uključivati terapijski efektivnu količinu IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina u kombinaciji sa anti-TNFα ili drugim sredstvima kako bi se inhibirali zapaljenski odgovori. Terapijski efektivna količina IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina korisna za sniženje imunskog odgovora zavisiće od subjekta koji treba da se leči, ozbiljnosti tegobe, i načina administriranja IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina. Primeri doza uključuju oko 10<3>IU do oko 10<6>IU IL-2 aktivnosti po adultu ili oko 10<4>IU do oko 10<6>IU IL-2 aktivnosti po adultu. Primeri doza uključuju oko 10<3>do oko 10<6>IU IL-2 aktivnosti po adultu, oko 10<3>do oko 10<4>IU IL-2 aktivnosti po adultu, oko 10<4>do oko 10<6>IU IL-2 aktivnosti po adultu, oko 10<4>do 10<5>IU IL-2 aktivnosti po adultu, ili oko 10<5>do oko 10<6>IU IL-2 aktivnosti po adultu. U drugim slučajevima, terapijski efektivna doza IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina je oko 10<4>IU IL-2 aktivnosti ± 100-struka, je oko 10<4>IU IL-2 aktivnosti ± 10-struka, oko 10<4>IU IL-2 aktivnosti ± 2-struka, oko 10<4>IU IL-2 aktivnosti ± 20-struka, oko 10<4>IU IL-2 aktivnosti ± 30-struka, oko 10<4>IU IL-2 aktivnosti ± 40-struka, oko 10<4>IU IL-2 aktivnosti ± 50-struka, oko 10<4>IU IL-2 aktivnosti ± 60-struka, oko 10<4>IU IL-2 aktivnosti ± 70-struka, oko 10<4>IU IL-2 aktivnosti ± 80-struka, ili oko 10<4>IU IL-2 aktivnosti ± 90-struka. U specifičnom neograničavajućem tehničkom rešenju, humani IL-2 fuzioni protein administrira se u ovoj dozi.

[0099] U jednom tehničkom rešenju, referentni standard za mišji IL-2 fuzioni protein je mišji IL-2, proizvođač eBiosciences (kataloški broj: 14-8021). Ukratko, bioaktivnost mišjeg IL-2, proizvođač eBioscience, je sledeća: ED50 ovog proteina, kako je izmereno CTLL-2 testom proliferacije ćelija, iznosi 175 pg/mL ili manje. Ovo odgovara specifičnoj aktivnosti od 5.7 x 10<6>jedinica/mg ili većoj.

2

[0100] U drugom tehničkom rešenju, referentni standard za humani IL-2 fuzioni protein je humani IL-2 lek aldesleukin (Proleukin). Prema tome, IL-2 fuzioni proteini stavljeni na uvid javnosti u ovom tekstu se direktno upoređuju sa fuzionim proteinom IL-2 leka koji se koristi u terapiji niskom dozom ili visokom dozom IL-2. Za određivanje IL-2 aktivnost mišjeg i humanog IL-2 koristi isti test i njihova aktivnost u jedinicama/mg je slična. U vezi sa humanim IL-2 lekom, tj. aldesleukinom (Proleukin), standardna mera količine IL-2 je internacionalna jedinica (IU) koja tehnički nije fiksirana količina nego je količina koja proizvodi fiksirani efekat u specifičnom testu biološke aktivnosti, tj. CTLL testu proliferacije. U praksi, izrada IL-2 je standardizovana i postoji konverzija između mase leka i internacionalnih jedinica. To je 1.1 mg IL-2 = 18 miliona IU (skraćeno 18 MIU).

[0101] Pored toga, podrazumeva da odgovarajuće doze funkcionalnog sredstva zavise od snage aktivnog sredstva u odnosu na ekspresiju ili aktivnost koju treba modulisati. Takve odgovarajuće doze mogu se odrediti pomoću testova opisanih u ovom tekstu. Pored toga, podrazumeva se da će specifični dozni nivo za bilo kojeg određenog životinjskog subjekta zavisiti od niza faktora uključujući aktivnost specifičnog upotrebljenog jedinjenja, starost, telesnu masu, opšte stanje zdravlja, pol i način ishrane subjekta, vreme administriranja, put administriranja, stopu ekskrecije, i/ili bilo koju kombinaciju lekova.

[0102] Kada se administriranje vrši u svrhu lečenja, administriranje može biti u svrhu ili profilakse ili terapije. Kada se daje profilaktički, supstanca se daje pre bilo kakvog simptoma. Profilaktičko administriranje supstance služi za prevenciju ili ublažavanje bilo kojeg kasnijeg simptoma. Kada se daje terapijski, supstanca se daje pri pojavi simptoma (ili ubrzo posle toga). Terapijsko administriranje supstance služi za ublažavanje bilo kojeg aktuelnog simptoma.

[0103] Obučeni stručnjak će razumeti da određeni faktori mogu uticati na dozu potrebnu za efektivno lečenje subjekta, uključujući, ali ne ograničavajući se na ozbiljnost bolesti ili poremećaja, prethodna lečenja, opšte stanje zdravlja i/ili starost subjekta i druge prisutne bolesti. Pored toga, lečenje subjekta terapijski efektivnom količinom IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina može uključivati jedan tretman ili, poželjno, može uključivati niz tretmana. Podrazumeva se i to da se efektivna doza IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina korišćenog za tretman može povisiti ili sniziti tokom određenog tretmana. Promene doziranja mogu rezultovati i postati očigledne iz rezultata dijagnostičkih testova, kako je opisano u ovom tekstu.

[0104] Terapijski efektivne količine IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina mogu se odrediti studijama na životinjama. Kada se koriste testovi na životinjama, administrira se doza koja će obezbediti koncentraciju u ciljnom tkivu sličnu onoj za koju je pokazano da je efektivna u testovima na životinjama.

2

iii. Farmaceutska kompozicija

[0105] Različiti IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini objavljeni u ovom tekstu (označeni u ovom tekstu i kao "aktivna jedinjenja") mogu se inkoriporisati u farmaceutske kompozicije pogodne za administriranje. Takve kompozicije tipično sadrže fuzioni protein i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "farmaceutski prihvatljivi nosač" treba da uključi svaki i sve rastvarače, disperzione medijume, sredstva za oblaganje, antibakterijska i antigljivična sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije, i slično, kompatibilne sa farmaceutskim administriranjem. Upotreba takvih medijuma i sredstava uz farmaceutski aktivne supstance dobro je poznata u struci. Osim ako su neki uobičajeni medijum ili sredstvo inkompatibilni sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njihova upotreba u kompozicijama. U kompozicije se mogu inkorporisati i dodatna aktivna jedinjenja.

[0106] Farmaceutska kompozicija, kako je objavljeno u ovom tekstu, formulisana je tako da bude kompatibilna sa putem administriranja kojem je namenjena. Primeri puteva administriranja uključuju parenteralni, npr., intravenski, intradermalni, supkutani, oralni (npr. inhalacija), transdermalni (površinski) i transmukozni. Pored toga, može biti poželjno da se terapijski efektivna količina farmaceutske kompozicije administrira lokalno na područje koje treba lečiti. To se može postići, na primer, lokalnom ili regionalnom infuzijom ili perfuzijom tokom operacije, površinskom primenom, injekcijom, kateterom, supozitorijom ili implantom (na primer, implanti izrađeni od poroznih, neporoznih ili želatinoznih materijala, uključujući membrane, npr. kao sijalastične membrane ili vlakna), i slično. U drugom tehničkom rešenju, terapijski efektivna količina farmaceutske kompozicije dostavlja se u vezikuli, na primer u lipozomima (videti, npr., Langer, Science 249:1527-33, 1990 i Treat i sarad., u Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (ured.), Liss, N.Y., str. 35365, 1989).

[0107] U još jednom tehničkom rešenju, terapijski efektivna količina farmaceutske kompozicije može se dostaviti u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. U jednom primeru, može se upotrebiti pumpa (videti, npr., Langer, Science 249:1527-33, 1990; Sefton, Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-40, 1987; Buchwald i sarad., Surgery 88:507-16, 1980; Saudek i sarad., N. Engi. J. Med. 321:574-79, 1989). U drugom primeru, mogu se koristiti i polimerni materijali (vidi, npr., Levy i sarad., Science 228:190-92, 1985; During i sarad., Ann. Neurol.25:351-56, 1989; Howard i sarad., J. Neurosurg. 71:105-12, 1989). Mogu se koristiti i drugi sistemi za kontrolisano oslobađanje, kao što su oni o kojima se govori u Langer (Science 249:1527-33, 1990).

2

[0108] Rastvori ili suspenzije upotrebljeni za parenteralnu, intradermalnu, ili supkutanu primenu mogu uključiti sledeće komponente: sterilne razblaživače kao što su voda za injekcije, fiziološki rastvor, fiksirana ulja, polietilen glikoli, glicerin, propilen glikol ili drugi veštački rastvarači; antibakterijska sredstva kao što su benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidante kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helirajuća sredstva kao što su etilendiamintetrasirćetna kiselina; pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati i sredstva za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti kiselinama ili bazama kao što su hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. Parenteralni preparati mogu se zatvoriti u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu, ili fiole sa više doza napravljene od stakla ili plastike.

[0109] Farmaceutske kompozicije pogodne za injektabilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (kada su rastvorljive u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za trenutno pripremanje sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Za intravensko administriranje, pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor ELϑ (BASF; Parsippany, NJ), ili fosfatom puferisani fiziološki rastvor (phosphate buffered saline, PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna i trebalo bi da bude tečna u meri dovoljnoj da može da se ubrizga. Mora biti stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora se zaštititi od kontaminirajućeg delovanja mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća tečljivost može se održati, na primer, upotrebom sredstva za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Prevencija delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antifungalnim sredstvima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom i sl. U mnogim slučajevima, biće poželjno u kompoziciju uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole kao manitol, sorbitol, natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se postići uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0110] Sterilni injektibilni rastvori mogu se pripremiti inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka navedenih ranije u ovom tekstu, po potrebi, posle čega sledi sterilizacija filtriranjem. Uopšteno, disperzije se pripremaju inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni prenosnik koji sadrži osnovni disperzioni medijum i druge potrebne sastojke od onih koji su nabrojani ranije u ovom tekstu. U slučaju sterilnih praškova za pripremuu sterilnih injektibilnih rastvora, poželjni postupci

2

pripreme su sušenje pod vakuumom i sušenje zamrzavanjem, čime se dobija prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0111] Za administriranje inhalacijom, jedinjenja se dostavaljaju u formi aerosolnog spreja iz kontejnera pod pritiskom ili dispenzera koji sadrži pogodni propelant, npr., gas kao što je ugljen-dioksid, ili nebulizera.

[0112] Sistemsko administriranje može biti i transmukoznim ili transdermalnim putem. Za transmukozno ili transdermalno administriranje, u formulaciji se koriste penetranti odgovarajući za barijeru koju treba proći. Takvi penetranti opšte su poznati u struci i uključuju, na primer, za transmukozno administriranje, deterdžente, žučne soli i derivate fusidinske kiseline. Transmukozno administriranje može se izvesti upotrebom nazalnih sprejova ili supozitorija. Za transdermalno administriranje, aktivna jedinjenja se formulišu u masti, meleme, gelove ili kremove, kako je opštepoznato u struci. Jedinjenja se mogu pripremiti i u formi supozitorija (npr. sa konvencionalnim bazama za supozitorije kao što su kakao buter i drugi gliceridi) ili retencionih enema za rektalnu dostavu.

[0113] Aktivna jedinjenja mogu se pripremiti sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brze eliminacije iz tela, na primer formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikroinkapsulirane dostavne sisteme. Mogu se koristiti biodegradabilni, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Postupci za pripremanje takvih formulacija biće jasni stručnjacima u oblasti. Materijali se takođe mogu nabaviti komercijalno od Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomske suspenzije (uključujući lipozome koji inficirane ćelije ciljaju monoklonskim antitelima na virusne antigene) takođe se mogu koristiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači. One se mogu pripremiti prema postupcima poznatim stručnjacima u oblasti, na primer, kao što je opisano u američkom patentu sa brojem 4,522,811.

[0114] Oralne ili parenteralne kompozicije posebno je pogodno formulisati u jediničnoj doznoj formi radi jednostavnosti administriranja i ujednačenosti doziranja. Jedinična dozna forma, kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinstvene doze za subjekta kojeg treba lečiti, pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapijski efekat, zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za jedinične dozne forme pronalaska diktirana je i direktno zavisi od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog efekta koji se želi postići, kao i ograničenja koja su svojstvena oblasti spravljanja takvog funkcionalnog jedinjenja za individualno lečenje.

[0115] Farmaceutske kompozicije se mogu nalaziti u kontejneru, pakovanju, ili dispenzeru zajedno sa uputstvima za administriranje.

iv. Kitovi

[0116] Kako se koristi u ovom tekstu, "kit" uključuje IL-2/IL-2Rα fuzioni protein za upotrebu u modulisanju imunskog odgovora, kako je opisano na drugim mestima u ovom tekstu. Izrazi "kit" i "sistem", kako se koriste u ovom tekstu, podrazumevaju najmanje jedan ili više IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina koji su, u specifičnim tehničkim rešenjima, u kombinaciji sa jednim ili više drugih tipova elemenata ili komponenti (npr., drugi tipovi biohemijskih reagenasa, kontejneri, pakovanje kao što je pakovanje namenjeno za komercijalnu prodaju, uputstva za upotrebu, i slično).

V. Sekvenciona identičnost

[0117] Kako je opisano ranije u ovom tekstu, stavljene na uvid javnosti su aktivne varijante i fragmenti IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina ili polinukleotida koji ih kodiraju, uključujući različite komponente IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina. Takve komponente uključuju IL-2, vanćelijski domen IL-2Rα, linkerske sekvence ili Kozak-ovu sekvencu. O aktivnosti koju zadržava aktivna varijanta ili fragment fuzionog proteina ili data komponenta fuzionog proteina govori se detaljnije na drugim mestima u ovom tekstu.

[0118] Takve varijante mogu imati najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sekvencione identičnosti sa datim referentnim polipeptidom ili polinukleotidom. Fragment može sadržati najmanje 10, 20, 30, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000 kontinuiranih nukleotida date referentne nukleotidne sekvence ili do pune dužine date nukleotidne referentne sekvence; ili fragment može sadržati najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 kontinuiranih amino-kiselina ili do pune dužine date referentne polipeptidne sekvence.

[0119] Kako se koristi u ovom tekstu, "sekvenciona identičnost" ili "identičnost" u kontekstu dveju polinukleotidnih ili polipeptidnih sekvenci ukazuje na rezidue u dvema sekvencama koje su iste kada se poravnaju za maksimalno poklapanje u specifičnom prozoru poređenja. Kada se procenat sekvencione identičnosti koristi u vezi sa proteinima, poznato je da se pozicije rezidua koje nisu identične često razlikuju po konzervativnim supstitucijama amino-kiselina, pri čemu su aminokiselinske rezidue supstituisane drugim aminokiselinskim reziduama sa sličnim hemijskim osobinama (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost) i prema tome ne menjaju funkcionalne osobine molekula. Kada se sekvence razlikuju po konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti sekvenci može se podesiti naviše kako bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Za sekvence koje se razlikuju po takvim konzervativnim supstitucijama

1

kaže se da imaju "sekvencionu sličnost" ili "sličnost". Načini izvođenja ovog podešavanja dobro su poznata stručnjacima u oblasti. Tipično, ovo uključuje ocenjivanje konzervativne supstitucije kao delimičnog, a ne potpunog nepodudaranja, čime se povišava procenat sekvencione identičnosti. Tako, na primer, kada identična amino-kiselina dobije ocenu 1, a nekonzervativna supstitucija ocenu nula, konzervativna supstitucija dobija ocenu između nula i 1. Ocenjivanje konzervativnih supstitucija izračunava se, npr., kako je implementirano u programu PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornija).

[0120] Kako se koristi u ovom tekstu, "procenat sekvencione identičnosti" označava vrednost određenu upoređivanjem dveju optimalno poravnatih sekvenci unutar prozora poređenja, pri čemu deo polinukleotidne sekvence u prozoru poređenja može sadržati adicije ili delecije (tj., procepe) u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži adicije ili delecije) za optimalno poravnavanje dveju sekvenci. Procenat se izračunava određivanjem broja pozicija na kojima se identična nukleinskokiselinska baza ili amino-kiselinska rezidua nalaze u obe sekvence da bi se dobio broj podudarnih pozicija, deljenjem broja podudarnih pozicija ukupnim brojem pozicija u prozoru poređenja, i množenjem rezultata sa 100 da se dobije procenat sekvencione identičnosti.

[0121] Ukoliko nije drugačije rečeno, vrednosti sekvencione identičnosti/sličnosti date u ovom tekstu označavaju vrednosti dobijene korišćenjem GAP Version 10, uz upotrebu sledećih parametara: % identičnosti i % sličnosti za nukleotidnu sekvencu uz korišćenje GAP težine 50 i dužinske težine 3, i nwsgapdna.cmp matrice skora; % identičnosti i % sličnosti za aminokiselinsku sekvencu uz korišćenje GAP težine 8 i dužinske težine 2, i BLOSUM62 matrice skora; ili bilo kojeg njemu ekvivalentnog programa. Pod "ekvivalentnim programom" podrazumeva se bilo koji program za poređenje sekvenci koji, za bilo koje dve sekvence o kojima je reč, generiše poravnavanje koje ima identična poklapanja nukleotida ili aminokiselinskih rezidua i identičan procenat sekvencione identičnosti kada se uporedi sa odgovarajućim poravnavanjem koje generiše GAP Version 10.

[0122] Kako se koristi u ovom tekstu, izrazi u jednini uključuju i izraze u množini, osim ako kontekst jasno ne ukazuje na drugačije. Slično tome, reč "ili" treba da uključi "i" osim ako kontekst jasno ne ukazuje na drugačije. Pored toga, podrazumeva se da su sve veličine baza ili veličine amino-kiselina, i sve vrednosti molekulske mase ili molarne mase date za nukleinske kiseline ili polipeptide približne i date su radi opisa.

[0123] Predmet ove objave dodatno je ilustrovan neograničavajućim primerima koji slede.

2

EKSPERIMENTI

[0124] IL-2 je biološki lek koji se koristi u pokušajima da se pojačaju imunski odgovori kod pacijenata obolelih od kancera i HIV/AID. U novije vreme, mnogo niže doze IL-2 korišćene su za selektivno pojačavanje tolerancije kako bi se suprimirali neželjeni imunski odgovori u vezi sa napadom na sopstvena tkiva, koji je sličan autoimunskom. Ono što je važno je da ove niske doze IL-2 nisu pokazale znake pojačavanja ili reaktivacije autoreaktivnih T ćelija. Uprkos tome, IL-2 kao terapijsko sredstvo ima važne nedostatke, uključujući vrlo kratak poluživot in vivo, što ograničava njegova efikasnost, kao i toksičnost pri visokim dozama. Iz tih razloga proizveden je novi biološki lek zasnovan na IL-2 u cilju poboljšanja njegove farmakokinetike i trajnosti odgovora, za upotrebu 1) u terapiji na bazi niskih doza IL-2 za podsticanje regulatornih T ćelija (Treg) i imunske tolerancije i 2) u adjuvantnoj terapiji višim dozama za jačanje imunskih odgovora i memorije. Da bi se postigli ovi ciljevi, razvijeni su IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini, pri čemu su ovi fuzioni proteini dizajnirani tako da povećaju dostupnost IL-2 povišenjem perzistentne IL-2-stimulacije limfocita koji nose IL-2R in vivo. Ti fuzioni proteini se sastoje od inženjerisanih proteina kako sledi (SL.1): 1) liderska sekvenca IL-2 koja sadrži optimizovanu Kozak-ovu sekvencu za efikasnu translaciju; 2) sekvenca IL-2 pune dužine; 3) glicin ili glicin/serin linkerska sekvenca varijabilne dužine; 4) kodirajuća sekvenca eksprimiranog vanćelijskog domena IL-2Rα; 5) glicinski spejser od dve amino-kiseline; 6) polihistidinski region od šest amino-kiselina za prečišćavanje; i 7) dva završna kodona. Proteinske sekvence predviđene na osnovu ovih mišjih i humanih cDNK prikazane su za IL-2/(GlySer)/IL-2Rα fuzione proteine na SL. 2A, odnosno SL. 2B. Ove cDNK su klonirane u pClneo ekspresioni vektor i korišćene za ekspresiju ovih fuzionih proteina u COS7 ćelijama. Analiza supernatanata kulture pokazala je da svaki mišji fuzioni protein pokazuje IL-2 bioaktivnost in vitro, sa optimalnom aktivnošću udruženom sa IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2Ra fuzionim proteinom (SL. 3A). Prema tome, uključivanje anti-IL-2 u ovaj biotest potpuno inhibira proliferaciju (SL.3B). Veće količine IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2Ra i IL-2/(Gly4Ser)4/IL-2Rα pripremljene su posle ekspresije u CHO ćelijama i prečišćene afinitetnom hromatografijom preko vezivanja 6x His oznake fuzionog proteina za imobilisani nikl. Mišji IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2Ra fuzioni protein pokazao je veću IL-2 bioaktivnost nego IL-2/(Gly4Ser)4/IL-2Rα (SL.4A) iako su oba fuziona proteina slično inhibirala vezivanje dva anti-IL-2Rα antitela (PC61 i 7D4) (SL. 4B) za ćelije koje eksprimiraju IL-2Rα, što potvrđuje veću IL-2 aktivnost udruženu sa prvim fuzionim proteinom. Inhibicija vezivanja PC61 i 7D4 ukazuje i na to da IL-2Rα deo fuzionog proteina zadržava dovoljnu tercijarnu strukturu da se veže za ova antitela. Međutim, ovi fuzioni proteini nisu inhibirali vezivanje monoklonskog antitela (3C7) usmerenog ka IL-2 vezujućem mestu IL-2Rα, na ćelijama koje eksprimiraju IL-2Rα. Ovaj rezultat implicira da je IL-2 unutar IL-2/IL-2Rα fuzionog proteina prostorno blizu vezujućeg mesta IL-2Rα (SL. 5). Western blot analiza ovih fuzionih proteina pokazala je da je IL-2/IL-2Rα imao 55-65 kDa, sa nešto bržom mobilnošću u neredukujućim uslovima, i da je približno 15 kDa veći od onoga što je zapaženo za solubilni IL-2Rα (SL.6A). U skladu sa tim, direktna analiza prečišćenog mišjeg IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2-Rα pomoću SDS-PAGE bila je konzistentna sa heterogenim monomernim proteinom od 55-65 kDa (SL.6B), što je očekivana veličina za IL-2 (15 kDa) i IL-2Rα (40-50 kDa) fuzioni molekul (SL.6), pri čemu IL-2Rα pokazuje heterogenost veličine zbog ekstenzivne varijabilne glikozilacije (Malek and Korty, J. Immunol. 136:4092-4098, 1986). Neposredna posledica IL-2-zavisne signalne transdukcije je fosforilacija STATS (pSTAT5) na tirozinu. Tretman miševa mišjim IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2Ra rezultovala je ekstenzivnom i selektivnom aktivacijom pSTAT5 u Treg, 30 min posle tretmana (SL. 7). Dozno-zavisne studije pokazale su da mišji IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2Ra utiče na brojne ključne aktivnosti Treg in vivo (SL.8). Ovi efekti na Treg uključuju: povećanu zastupljenost (SL.8A) i broj (nije pokazano) Treg u CD4<+>T ćelijskom kompartmentu; pozitivnu regulaciju IL-2-zavisnog CD25 (SL.8B); porast proliferacije procenjen ekspresijom proliferativnog markera Ki67 (SL.8C); i porast frakcije podgrupe IL-2-zavisnih terminalno diferenciranih Klrgl<+>Treg (SL. 8D). Ovi efekti su najupečatljiviji za Treg u slezini i zapaljenom pankreasu negojaznih dijabetičnih (NOD) miševa. Hiljadu jedinica IL-2 aktivnosti, kako je izmereno u standardnom CTLL IL-2 biotestu, udružene sa IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2Ra pokazalo je niže, ali lako merljive efekte na Treg (SL. 8). C57/BL6 miševi tretirani IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2Ra (2000 jedinica IL-2 aktivnosti) upoređivani su sa miševima koji su primali rekombinantni IL-2 (25000 jedinica) ili agonističke komplekse IL-2/anti-IL-2 (IL2/IC) (10000 jedinica IL-2 aktivnosti) (SL. 9). IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2Rα bio je mnogo efektivniji nego rekombinantni IL-2 i blago efektivniji nego IL2/IC u indukovanju perzistentnog pojačanja Treg i povezanih osobina (SL. 9). Ovi porasti tolerogenih Treg desili su se pri 5- i 12.5-struko nižim nivoima IL-2 aktivnosti u poređenju sa IL2/IC, odnosno rekombinantnim IL-2. Kada se razmatra IL-2-zavisna aktivacija pSTAT5 u Treg direktno ex vivo (SL. 9), ovi podaci sugerišu biološki poluživot od približno 72 sata za IL-2/IL-2Rα. Predijabetični NOD miševi podvrgnuti su kratkotrajnom tretmanu niskim količinama IL-2/IL-2Rα (SL. 10). Odlaganje pojave dijabetesa zapaženo je kod onih miševa koji su bili tretirani sa 800 U IL-2 aktivnosti udružene sa IL-2/IL-2Rα. U pogledu imunosti, primena jedne visoke doze IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2Ra (12000 U IL-2 aktivnosti) takođe bitno podstiče odgovore CD8<+>T ćelija, posebno dugoživećih memorijskih ćelija (SL.11). Rano posle imunizacije (dan 28), CD44<hi>CD62L1<lo>CD127<hi>efektorske-memorijske (effector-memory, EM) ćelije dominiraju memorijskim pulom; međutim, sa produženjem vremena dolazi do

4

porasta CD44<hi>CD62L<hi>CD127<hi>centralnih memorijskih (central memory, CM) ćelija, i CM ćelije dominiraju u memorijskom pulu 202 dana posle imunizacije (SL.12). Prema tome, IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2Ra funkcioniše na način analogan rekombinantnom IL-2 podstičući tolerogene i imunsupresivne Treg i imunost preko povišenja T efektorskih/memorijskih odgovora, ali ispoljava poboljšanu farmakokinetiku dostavom takvih odgovora: 1) pri nižim efektivnim nivoima IL-2 aktivnosti; 2) uz perzistentnije biološke odgovore; i 3) zadržavajući hijerarhiju sa Treg koji odgovaraju pri nižim dozama nego T efektorske/memorijske ćelije. Ovi podaci podržavaju stanovište da IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini, kada se administriraju u odgovarajućoj dozi i režimu, predstavljaju poboljšanu i novu klasu lekova za dostavu IL-2 aktivnosti za selektivno podsticanje imunske tolerancije ili imunske memorije.

[0125] Proizvedeni su i IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini koji sadrže humani IL-2 i humani IL-2Rα (SL. 1, SL.2B). Ove cDNK su eksprimirane u CHO ćelijama i sekretovani fuzioni proteini su prečišćeni nikl-afinitetnom hromatografijom na osnovu 6x-His oznake. Dužina glicin/serin linkera fuzionih proteina varirala je na način analogan onom koji je upotrebljen za mišji IL-2/IL-2Rα. Sva 4 rezultujuća humana IL-2/IL-2Rα fuziona proteina pokazala su IL-2 bioaktivnost u testu sa CTLL miša (SL.13A). Western blot analiza potvrdila je da humani IL-2/IL-2Rα takođe pokazuje heterogenu traku između 55-60 kDa (SL.13B), što je konzistentno sa visokoglikozilovanim molekulima očekivanim za IL-2 koji je vezan za IL-2Rα. IL-2/IL-2Rα fuzioni proteini sa (G3S)3 i posebno (G4S)4 linkerima mogu imati veću aktivnost jer se sreće manje fuzionog proteina iako se ekvivalentna količina IL-2 aktivnosti nanese na svaku liniju (SL. 13B). Kapacitet fuzionog proteina da inhibira vezivanje anti-IL-2Rα monoklonskih antitela, M-A257 i BC96, za ćelije koje nose humani IL-2Rα ukazuje da IL-2Rα fuzionog proteina zadržava zadovoljavajuću tercijarnu strukturu da bi vezao ova antitela (SL. 14). Međutim, ovi fuzioni proteini samo parcijalno inhibiraju vezivanje monoklonskog antitela (BC96) usmerenog ka IL-2-vezujućem mestu IL-2Rα, što implicira da je IL-2 u IL-2/IL-2Rα fuzionom proteinu prostorno u blizini vezujućeg mesta za IL-2Rα. Štaviše, procenili smo da specifična aktivnost mišjih i humanih IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina koji sadrže (G3S)3 linker iznosi 80, odnosno 2000 pM, za 1 jedinicu/ml IL-2 bioaktivnosti. Ove vrednosti su mnogo veće od aktivnosti rekombinantnog IL-2, koja iznosi 10 pM pri 1 jedinici/ml. Razlika u aktivnosti između humanog i mišjeg IL-2/IL-2Rα se bar delimično pripisuje relativnoj neefektivnosti humanog fuzionog proteina u podršci proliferacije mišjih CTLL ćelija u biotestu, u poređenju sa mišjim fuzionim proteinima ili mišjim i humanim rekombinantnim IL-2 (nije prikazano). Ove relativno niske specifične aktivnosti i rezultati blokiranja antitelima (SL.5 i SL.12) otvorili su mogućnost postojanja specifične intramolekularne interakcije između IL-2 i IL-2Rα u kontekstu fuzionog proteina, koja ograničava količinu IL-2 u fuzionom proteinu za stimulaciju ćelija koje nose IL-2R. Za direktno testiranje ove ideje, dve rezidue arginina unutar IL-2-vezujućeg mesta humanog IL-2Rα (vidi Robb i sarad., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85:5654-5658, 1988) mutirane su u treonin i serin. Detektovali smo mnogo veću bioaktivnost udruženu sa ovim mutantnim IL-2R fuzionim proteinima (SL.15); procenjuje se da specifična aktivnost mutiranih IL-2/IL-2Rα fuzionih proteina iznosi približno 5 pM za 1 jedinicu/ml IL-2 aktivnosti, što je vrednost veoma slična vrednosti za rekombinantni IL-2. Prema tome, ovi podaci ukazuju da je humani IL-2/IL-2Rα biološki aktivan i jedan specifičan mehanizam dejstva koji je odgovoran za produženu IL-2 aktivnost u ovim fuzionim proteinima je kroz kompetitivnu interakciju između IL-2 komponente sa IL-2 vezujućim regionom IL-2Rα fuzionog proteina i sa ćelijama koje eksprimiraju IL-2R.

Tabela 1. Kratak pregled sekvenci

4

4

4

4

4

4

4

1

[0126] Iako je prethodno navedeni pronalazak opisan u nekim detaljima putem ilustracija i primera u svrhu jasnog razumevanja, biće očigledno da se određene promene i modifikacije mogu praktikovati unutar obima ovog pronalaska koji je definisan u priloženim patentnim zahtevima.

2

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Fuzioni protein koji sadrži:

(a) prvi polipeptid koji sadrži interleukin-2 (IL-2); pri čemu prvi polipeptid ima najmanje 70% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO: 2; i

(b) drugi polipeptid, fuzionisan u ramu sa prvim polipeptidom pomoću linkera, pri čemu je linker sekvenca navedena u SEQ ID NO: 13, i pri čemu drugi polipeptid sadrži vanćelijski domen interleukin-2 receptora alfa (IL-2Rα), pri čemu drugi polipeptid ima najmanje 70% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO: 7; koji ima biološku aktivnost vanćelijskog domena IL-2Rα;

pri čemu fuzioni protein ima povišenu IL-2 aktivnost u poređenju sa nativnim IL-2; ili pri čemu fuzioni protein ima povišenu perzistentnu in vivo IL-2-stimulaciju limfocita koji nose IL-2R u poređenju sa nativnim IL-2.

2. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1, pri čemu prvi polipeptid koji sadrži IL-2 ima najmanje 75%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO: 2.

3. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu drugi polipeptid koji sadrži vanćelijski domen IL-2Rα ima najmanje 75%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO: 7.

4. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, koji sadrži

(a) aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 26, 27, 36, 37, 57, ili 59; ili (b) sekvencu koja ima najmanje 80%, 85%, 90%, ili 95% sekvencione identičnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO: 26, 27, 36, 57, ili 59.

5. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu fuzioni protein sadrži:

(a) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62; ili

(b) sekvencu koja ima najmanje 80%, 85%, 90%, ili 95% sekvencione identičnosti sa SEQ ID NO: 62.

6. Polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5.

7. Ćelija-domaćin koja sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je ćelijadomaćin opciono CHO ćelija ili COS ćelija.

8. Postupak proizvodnje fuzionog proteina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, pri čemu postupak uključuje eksprimiranje polinukleotida koji kodira fuzioni protein u ćeliji-domaćinu prema patentnom zahtevu 7 i dobijanje tako proizvedenog fuzionog proteina.

9. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 za upotrebu u snižavanju imunskog odgovora kod subjekta kojem je to potrebno.

10. Fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, pri čemu subjekt ima autoimunsku bolest; opciono pri čemu je autoimunska bolest odabrana iz grupe koja se sastoji od dijabetesa tipa 1, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, celijačne bolesti, sistemskog eritemskog lupusa, juvenilnog idiopatskog artritisa, Crohn-ove bolesti, ulcerativnog kolitisa ili sistemske skleroze, bolesti kalema protiv domaćina, psorijaze, pečataste alopecije, i HCV-indukovanog vaskulitisa.

11. Fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 9 ili patentnom zahtevu 10, pri čemu terapijski efektivna količina fuzionog proteina sadrži 10<3>do 10<6>IU IL-2 aktivnosti po adultu ili 10<4>±100-struku IL-2 aktivnost po adultu.

12. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 za upotrebu u pojačavanju imunogenosti vakcine kod subjekta kojem je to potrebno ili prevazilaženju suprimiranog imunskog odgovora na vakcinu kod subjekta kojem je to potrebno.

13. Fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu fuzioni protein i vakcina treba da se administriraju istovremeno.

14. Fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu fuzioni protein i vakcina treba da se administriraju sekvencijalno, bilo kojim redom.

15. Fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 13 ili patentnom zahtevu 14, pri čemu je pomenuta vakcina vakcina protiv kancera.

4

16. Fuzioni protein za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 12-15, pri čemu terapijski efektivna količina fuzionog proteina sadrži najmanje 10<4>do 10<7>IU IL-2 aktivnosti po adultu ili najmanje 10<5>±10 IL-2 aktivnosti po adultu.

17. Fuzioni protein za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 9-16, pri čemu je subjekt čovek.