RS66178B1

RS66178B1 - Interleukin-31 monoklonalno antitelo

Info

Publication number: RS66178B1
Application number: RS20241246A
Authority: RS
Inventors: Gary F Bammert; Steven A Dunham
Original assignee: Zoetis Services Llc
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2024-12-31
Also published as: EP3653645B1; FI3653645T3; US20190092854A1; US8790651B2; LT4459282T; SI3653645T1; RS60924B1; HRP20241528T1; US20140315251A1; HRP20201634T1; US10421807B2; ME02837B; HUE068353T2; EP4679089A2; PL3842456T3; MX2014000803A; LT2734549T; EP3219729B1; WO2013011407A1; CA2926379A1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL31 antitela za tretman stanja svraba kod pasa ili mačaka.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Atopični dermatitis je grupa autora definisala na američkom veterinarskom dermatološkom koledžu kao „genetski predodređena upalna i alergisjka kožna bolest sa karakterističnim kliničkim osobenostima.“ (Olivry, et al. Veterinary Immunology and Immunopathology 2001; 81: 143-146). Ova grupa autora je takođe prepoznala da je bolelst kod pasa povezana sa specifičnim alergenom IgE (Olivry, et al. 2001 supra; Marsella & Olivry Clinics in Dermatology 2003; 21: 122-133). Ozbiljni svrab, sa sekundarnom alopecijom i eritemom, je najčešće uočljiv i zabrinjavajući simptom za vlasnike kućnih ljubimaca.

[0003] Učestalost atopičnog dermatitisa nije detaljno poznata zbog nedovoljnih i nekoherentnih epidemoloških podataka, ali se procenjuje da je zastupljena kod 10% totalne pseće populacije. (Marsella & Olivry 2003 supra; Scott, et al. Canadian Veterinary Journal 2002; 43: 601-603; Hillier Veterinary Immunology and Immunopathology 2001; 81: 147-151).

Uopšteno, oko 4.5 miliona pasa ima ovo hronično stanje tokom celog života. Učestalost se izgleda povećava. Povezanost sa rasom i vrstom se predpostavlja, ali bi mogla mnogo da varira zavisno od geografska oblasti (Hillier, 2001 supra; Picco, et al. Vet Dermatol. 2008; 19: 150-155).

[0004] Ostali faktori koji su uključeni kod alergijskog dermatitisa su mnogobrojni i slabo poznati. Sastojci u hrani mogu da isprovociraju atopični dermatitis (Picco, 2008 supra), kao i sredinski alergeni kao što su buve, prašina, ambrozija, delovi biljaka. Genetski faktori takođe imaju važnu ulogu. Iako ne postoji potvrđena povezanost sa vrstom, predpostavlja se da neko nasleđivanje povećava predispoziciju za atopični dermatitis (Sousa & Marsella Veterinary Immunology and Immunopathology 2001; 81: 153-157; Schwartzman, et al. Clin. Exp. Immunol. 1971; 9: 549-569.

[0005] Interleukin-31 (IL-31) je citokin kloniran 2004. Pre svega nastaje aktiviranjem T pomagač(Th)2 ćelija (Dillon et al. Nat Immunol 2004; 5:752-60), ali se pravi i u mastocitima i u makrofagnim ćelijama. IL-31 povezuje koreceptor sastavljen od IL-31 receptora A (IL-31RA) i od onkostatin M receptora (OSMR) (Dillon et al.2004 supra and Bilsborough et al. J Allergy Clin Immunol. 2006 117(2):418-25). Aktivacija receptora rezultira fosforilacijom STAT kroz JAK receptor(e). Ekspresija koreceptora je pojavljuje u makrofagima, keratinocitima i u dorzalnom korenu ganglija. Skoro je nađeno da IL-31 ima ulogu u dermatitisu, kod lezija nastalih usled svraba, kod alergija i preosetljivosti respiratornih puteva. Vidi Sliku 1.

[0006] Stimulacija T ćelija sa anti-CD3 i anti-CD28 antitelima trenutno dodatno reguliše IL-31 mRNA ekspresiju (Dillon et al.2004 supra). Mikročip analiza je pokazala da IL-31 iondukuje neke hemotaktične gene, kao što je CXCL1, CLL17 (timus i aktivacijom regulisani hemokin [TARC]), CCL19 (makrofagni inflamatorni protein [MIP]3β), CCL22 (monocyte-derived chemokine [MDC], CCL23 (MIP3) i CCL4 (MIPβ) (Dillon et al.2004 supra).

[0007] Transgenetički miševi kod kojih je prekomerna ekspresija IL-31 pokazuju upalu kože, svrab, ozbiljni dermatitis i alopeciju (Dillon et al. 2004 supra). Potkožna injekcija IL-31 u miševe pokreće infiltraciju putem upalnih ćelija, neutrofila, eozinofila, limfocita i makrofaga i rezultira epidermalnim zadebljanjem i dermalnom akantozom. U NC/Nga miševima, sa atopičnim dermatitisom (AD) uzrokovan prirodnim uzrocima, IL-31 je prekomerno izražen u kožnim lezijama i koreliše sa svrabom (Takaoka et al. Eur J. Pharmacol. 2005; 516, 180-181; Takaoka et al. Exp. Dermatol. 2006; 15, 161-167). Takođe, kod glodara, je pokazano da IL-31 indukuje brz iznenadan svrab (Raap et al. J Allergy Clin Immunol.2008;122(2):421-3).

[0008] Mizuno et al. (Veterinary Immunology and Immunopathology, vol.131, b.1-2, pp 140-143) opisuje kloniranje interleukina-31 psa. Objavljeno je da anti-IL-31 antitelo ublažava češanje kod miševa (Grimstad et al, Exp. Dermatol. 2009, 18:35-43) (US7,939,068 B2). WO 2002/047262 opisuje ne-IL-31 antitela. WO 2006/122079, WO 2007/143231 i US 2009/0252732 opisuju opšte postupke za stvaranje anti-IL31 antitela. Debré et al (The Lancet, vol. 34, no.8877, pp 945-949) opisuje upotrebu Fc gama fragmenata za tretman dece sa aktnom imuno trombocitopenjskom purpurom. US7,939,068 se odnosi na antagonizaciju prenosa signala u ganglijskim ćelijama dorzalnog korena, i na IL-31 , i na IL-31 u mišjim i humanim tkivima. US 2006/0141579 opisuje citokin zcytor17 ligand polinukleotide.

[0009] Dalje studije su pokazale da IL-31 je povezan sa atopično dermatitično indukovanim kožnim upalama i svrabom kod ljudi. Kod ljudskih AD pacijenata, zastupljenost IL-31 mRNA je značajno viša u kožnim lezijama nego u koži bez lezija, a zastupljenost u koži bez lezija je veća nego u normalnoj koži zdravih pacijenata (Sonkoly et al. J Allergy Clin Immunol 2006; 117:411-7). Druga studija je pokazala da CD45RO+ (memory) kožni limfocit antigen (CLA)-pozitivan T ćelija u koži AD pacijenata pokazuje IL-31 mRNA i protein (Bilsborough et al.

2006 supra). Takođe je saopšteno da prekomerna zastupljenost Il-31 mRNA u koži pacijenata ili alergijski kontaktni dermatitis je u korelaciji sa izraženošću IL-4 i IL-13 mRNA ali ne i sa izraženošću inetrferon (IFN)-γ mRNA (Neis et al. J. Allergy Clin. Immunol. 2006; 118, 930-937). Nadalje, pokazano je da je nivo IL-31 seruma povišen kod ljudskih pacijenata sa hroničnom spontanom urtikarijom i čak mnogo viši kod pacijenata sa AD (Raap i al. Exp Dermatol. 2010;19(5):464-6). Takođe je pokazano da je Il-31 lučenje povećano u mastocitima prateći IgE ukrštanje i kao odgovor na Staphylococca superantigen kod atopičnih individua. Takođe je pokazano da IL-31 stimuliše produkciju nekih pro-inflamatornih medijatora uključujući IL-6, IL-8, CXCL1, CC17 i višestruke metaloproteinaze kod ljudskih miofibroblasta debelog creva (Yagi,et al. International Journal of Molecular Medicine 2007; 19(6): 941-946.

[0010] Tip I preosetljivosti na alergene iz okruženja se smatra glavnim mehanizmom pseće AD a nivoi TH2 posredovanih citokinina, kao što je IL-4 se povećavaju se u lezijama kože psa sa AD (Nuttall, et al. Vet. Immunol. Immunopathol. 2002; 87, 379-384). Pored toga, infiltracija putem inflamatornih ćelija, limfocita i neutrofila je važan mehanizam koji podrazumeva pogoršanje kožnih lezija; prekomernia ekspresija hemotaktičkih gena kao što su CCL17/TARC, CCR4, i CCL28/mukoza-povezani epitelni hemokin (MEC) doprinose pogoršanju kožnih lezija kod pasa sa AD (vidi, Maeda, i al. Vet. Immunol. Immunopathol. 2005; 103, 83-92; Maeda, i al. Vet. Immunol. Immunopathol.2002b; 90, 145-154; i Maeda, i al. J. Vet. Med. Sci.2008; 70, 51-55).

[0011] Skorašnji dokazi sugerišu da bi IL-31 mogao da bude uključen u podsticanje alergijske upale i odgovor epitela respiratornog puta karakterističnog za alergijsku astmu (Chattopadhyay, i al. J Biol Chem 2007; 282:3014-26; i Wai, i al. Immunology, 2007; 122, 532-541). Mizuno i al. (Vet.Imm. 2009, 131 (1-2): 140-143) su klonirali pseći IL-31 i ustanovili nizak nivo IL-31 u timusu, testisima, slezini i bubrezima, ali ne i u koži atopičnih pasa.

[0012] Ove opservacije podržavaju hipoteze da IL-31 igra značajnu ulogu i kod stanja svraba i kod alergijskog stanja. Poželjno bi bilo da se obezbedi terapeutsko antitelo protiv IL-31 korisno za tretman stanja svraba i/ili alergijskog stanja kod mačaka i pasa.

SAŽETAK PRONALASKA

[0013] Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-pseće IL-31 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koje se vezuje za IL-31 psa za upotrebu u tretiranju stanja svraba kod psa, pri čemu pomenuto antitelo redukuje, inhibiraja ili neutrališe IL-31 aktivnost kod psa i pri čemu antitelo inhibira pSTAT posredovanu signalizaciju IL-31 psa u ćelijskom testu. U nekim primerima izvođenja, antitelo je monoklonalno antitelo. U jednom primeru izvođenja, monoklonalno antitelo je hibridno. U sledećem primeru izvođenja antitelo je kaninizovano.

[0014] Antitelo redukuje, inhibira ili neutralizuje IL-31 aktivnost kod psa. Prema pronalsku antitelo redukuje, inhibira ili neutrališe stanje svraba. Stanja svraba podrazumevaju, na primer, atopični dermatitis, ekcem, psorijazu, sklerodermiju i svrab.

[0015] U jednom primeru izvođenja antitelo ili antigen- vezujući deo koji se vezuje za pseći IL-31 za upotrebu u tretmanu prema pronalasku uključuje bar jedno od sledećih:

promenljivi teški (VH) niz komplementarno determinišući region (CDR)1 koja ima sekvencu amino kiselina YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1), ili NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03VH-CDR1); promenljivi teški niz CDR2 koji ima sekvencu amino kiselina WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5 ; 19D07-VH-CDR2), ili TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6 ; 34D03-VH-CDR2); promenljivi teški niz CDR3 koji ima sekvencu amino kiselina ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VHCDR3), ARQNWWGLAY (SEQ ID NO: 8; 19D07-VH-CDR3), ili VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VHCDR3); i varijanta koja ima jednu ili više zaštitnih amino kiselinskih supstitucija u bar jednom od CDR1, CDR2, ili CDR3.

[0016] U sledećem primeru izvođenja, antitelo ili antigen- vezujući deo koji se vezuje za pseći IL-31 za upotrebu u tretmanu prema pronalasku uključuje bar jedno od sledećih: Promenljivi laki niz (VL) koji sadrži komplementarno determinišući region (CDR) 1 koja ima amino kiselinsku sekvencu RASESVDNYGISFMH (SEQ ID NO: 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA (SEQ ID NO: 11; 19D07-VLCDR1), ili KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1); promenljivi laki niz CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2), GASTRES (SEQ ID NO: 14; 19D07-VL-CDR2), ili RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2); promenljivi laki niz CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17;19D07-VL-CDR3), ili QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL-CDR3); i njihovu varijantu koja ima jednu ili više zaštitnih amino kiselinskih supstitucija u bar jednom od CDR1, CDR2, ili CDR3.

[0017] U još jednom ostvarenju, antitelo koje ima bar jedan promenljivi laki niz opisan iznad, može pored toga da uključuje bar jedan od sledećih promenljivih teških nizova CDR:

Promenljivi teški komplementarni niz koji određuje region (CDR)1 koja ima amino kiselinsku sekvencu YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1), ili NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-VHCDR1);

Promenljivi teški niz CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07VH-CDR2), ili TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); promenljivi teški niz CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VHCDR3), ARQNWWGLAY (SEQ ID NO: 8; 19D07-VH-CDR3), ili VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VHCDR3); i varijanta koja ima jednu ili više zaštitnih amino kiselinskih supstitucija u bar jednoj od CDR1, CDR2, ili CDR3.

[0018] U nekim primerima izvođenja, antitelo za upotrebu u tretmanu prema pronalasku može da obuhvata bar jedno od sledećih:

a) promenljivi laki niz koji obuhvata

b) promenljivi teški niz koji obuhvata

i

c) varijante koje imaju jednu ili više zaštićenih amino kiselinskih zamena.

[0019] U jednom ostvarenju, antitelo za upotrebu u tretmanu prema pronalasku je monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za oblast između amino kiselinskog ostatka 95 i 125 pseće IL-31 aminokiselinske sekvence od SEQ ID NO: 32. U nekim ostvarenjima, antitelo se specifično vezuje za oblast između amino kiselinskog ostatka 102 i 122 pseće IL-31 amino kiselinske sekvence od SEQ ID NO: 32.

[0020] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje veterinarski oblik za upotrebu u tretmanu stanja svraba kod psa koji sadrži terapeutski delotvorni iznos od bar jednog antitela opisanog iznad.

[0021] Opisano ovde, ali ne kao deo pronalaska je ćelija domaćin koja proizvodi jedno antitelo opisano iznad. Opisano ovde, ali ne kao deo pronalaska je izolovana nukleinska kiselina koja kodira jedno antitelo u skladu sa ovim pronalaskom, uključujući jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira bar jedno od sledećeg:

promenljivi teški niz (VH) komplementarno determinišući region (CDR)1 koji ima amino kiselinsku sekvencu YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11 E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1), ili NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03VH-CDR1); promrnljivi teški niz CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2), ili TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); promenljivi teški niz CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12VHCDR3), ARQNWWGLAY (SEQ ID NO: 8; 19D07-VH-CDR3), ili VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VHCDR3); i varijanta koja ima jednu ili više zaštitnih amino kiselinskih supstitucija u bar jednom od CDR1, CDR2, ili CDR3.

[0022] Izolovana nukleinska kiselina opisana iznad može nadalje da sadrži nukleinsko kiselinsku sekvencu koja kodira bar jedno od sledećeih:

Promenljivi laki niz (VL) koji sadrži komplementarno određujući (CDR) 1 koji ima amino kiselinsku sekvencu RASESVDNYGISFMH (SEQ ID NO: 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA (SEQ ID NO: 11; 19D07-VLCDR1), ili KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1); promenljivi laki niz CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2), GASTRES (SEQ ID NO: 14; 19D07-VL-CDR2), ili RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2); promenljivi laki niz CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17; 19D07-VL-CDR3), ili QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL-CDR3); i njihovu varijantu koja ima jednu ili više zaštićenih amino kiselinskih supstitucija u jednom od CDR1, CDR2, ili CDR3.

[0023] Opisano ovde, ali ne kao deo pronalaska je vektor koji sadrži bar jednu od nukleinskih kiselina opisanih iznad.

[0024] Opisano ovde, ali ne kao deo pronalaska je postupak za proizvodnju antitela koji obuhvata kultivisanje ćelija domaćina opisanih gore pod uslovima čiji je rezultat stvaranje antitela, i izolovanje antitela iz ćelije domaćina ili medijuma kulture ćelije domaćina.

[0025] Pronalazak obezbeđuje anti-pseće IL-31 ili njegov antigen-vezujući deo kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u tretiranju stanja svraba, obuhvatajući i administriranje terapijski delotvorne količine antitela opisanog iznad. U nekim ostvarenjima, stanja svraba su izabrana od atopičnog dermatitisa, ekcema, psorijaze, skleroderme i svraba.

[0026] Opisano ovde, ali ne kao deo pronalaska jpostupak inhibiranja IL-31 aktivnosti kod psa ili mačke, tako što im se daje jedno antitelo opisano iznad.

[0027] Opisano ovde, ali ne kao deo pronalaska je postupak za detekciju ili kvantifikaciju IL.31 u uzorku, pri čemu postupak obuhvata inkubaciju kliničkog ili biološkog uzorka koji sadrži Il-31 u prisustvu jednog antitela opisanog iznad; i detekciju antitela koje je povezano za IL-31 u uzorku. Antitelo može biti detektibilno označeno. Antitelo može biti neoznačeno i koristi se u kombinaciji sa drugim antitelom koje je označeno.

Kratki opis crteža

[0028]

Slika 1 je šematsko predstavljanje IL-31 puta.

Slika 2 je šematsko predstavljanje opšte strukture mišjeg imunoglobulina G (IgG) molekula ističući vezujuće mesto antigena.

Slika 3 Je šematsko predstavljanje opšte strukture mišje:pseće himernog IgG

Slika 4 je ilustracija koja predstavlja specijaciju ili „kaninizaciju“ mišjeg IgG, mišji CDRs je nakalemljen na pseći okvir identifikovan iz databaze sekvenci.

Slika 5 je ilustracija „heterohimere“ monoklonalnog antitela uparujući himerni laki niz sa potpuno kaninizovanim teškim lancem.

Slika 6 ELISA titar iz IL-31 imunizovanih miševa (CF-1 MU#1 - 4) u odnosu na negativnu i pozitivnu kontrolu miševa.

Slika 7 je ilustracija promenljivih nizova antitela koja pokazuje okidače prajmere za konstante oblasti i degenerativne prajmere upravljene prema mišjim promenljivim oblastima.

Slika 8 je grafikon probne efikasnosti himernog 11 E12 u placebo kontrolisanoj, pojedinačnoj dozi, SC studija (76A60).

Slika 9 je tabela koja pokazuje pojedinačni skor svraba za pse iz studije 76A60.

Slika 10 je Vestern blot koji pokazuje vezivanje himernih (Blot #1), kaninizovanih (Blot#2), i heterohimernih (Blots #3 i 4) verzija od 11 E12 za pseći IL-31. Heterohimera u Blot #3 ima kaninizovan laki niz uparen sa kaninizovanim teškim nizom. Heterohimera u Blot #4 ima himerni laki niz uparen sa kaninizovanim teškim nizom. Svaki nitrocelulozni blot sadrži- levu traku, prethodno markiranih proteinskih standarda (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) i desnu traku, 800 ng psećeg IL-31.

Slika 11 je šematski pregled kaninizovanih 11 E12 okvira rada na supstituciji lakog niza.

1

Slika 12 je Vestren blot koji pokazuje vezivanje kaninizovanih verzija 11E12 sa pojedinačnom reverznom mutacijom za mišji okvir 2 lakih lančanih ostataka. Svaki nitrocelulozni blot sadrži –levom trakom, prethodno markirane proteinske standarde (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) i desnu traku, 800 ng psećeg IL-31.

Slika 13 su Vestern blotovi u punoj dužini i sa okrnjenim psećim IL-31 proteinima. Pojedinačni nitrocelulozni blotovi su ispitivani sa A) anti-His B) 34D03 i C) 11E12 antitelima. Trake 1-9 blotova odgovaraju sledećem : Traka 1-prethodno markiranih proteinskih standarda (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Traka 2- pseća IL-31 potpune dužine; Traka 3- N-terminalno okrnjen- 20N; Traka 4- N-terminalno okrnjen-40N; Traka 5-N-terminalno okrnjen -60N; Traka 6-C-terminalno okrnjen -20C; Traka 7-C-terminalno okrnjen -40C; Traka 8-C-terminalno okrnjen-60C; i Traka 9- beta-galaktozidaza (lacZ). Napomena: IL-31 potpune dužine i proteini sa C-terminal okrnjenjem (-20, -40C, i -60C) pokazala je ne detektibilne vrednosti pod ovim uslovima.

Slika 14 prikazuje Vestern botove sa okrnjenim psećim IL-31 proteinima. Pojedinačni nitrocelulozni blotovi su ispitivani sa A) anti-His B) 11 E12 i C) 34D03 antitelima. Trake 1-5 blotova odgovaraju sledećem: Traka 1-prethodno markiranim proteinskim standardima (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Traka 2-C-terminalno okrnjenim na pozicijama 20-122; Traka 3-C-terminalno okrnjenim na pozicijama 20-100; Traka 4-C-terminalno okrnjenim na pozicijama 20-80; i Traka 5-beta-galaktozidaza (lacZ).

Slika 15 je sekcija Vestern botova sa lizatima E.coli sojeva koji pokazuju pseći IL-31 sa supstituisanim alaninom na svakoj amino kiselinskoj poziciji (76-122). Pojedinačni nitrocelulozni botovi su ispitivani sa anti-His, 11 E12 i, 34D03 antitelima, kao što je pokazano na slici.

Slika 16 je deo Vestern blotova sa duplim i trostrukim mutacijama u psećem IL-31. -20N proteinski lizat je korišćen kao pozitivna kontrola.

Slika 17 je grafik koji pokazuje skorove svraba kod pasa kojima je ubrizgan potkožno kaninizovano 34D03 antitelo (1.0 mg/kg). Skorovi svraba su mereni u svakoj studiji dan pre ( bazni odgovor) i nakon toga (odgovor nakon 2h) isprobavanjem sa 1.5 mg/kg psećeg IL-31.

Slika 18 је 4-12 % Bis Tris SDS PAGE ( natrijum dodecil sulfat poliakrilamid gelska elektroforeza) sa pročišćenim psećim i mačjim IL-31 proteinima. Panel A pokazuje Komasi bojenje proteina u neredukujućim uslovima. Panel B pokazuje Komasi bojenje proteina u neredukujućim uslovima. Paneli C i D su Vestern botovi gelova identični sa A i B redom, ispitivani sa anti-His antitelom. Traka- 1-psećeg IL-31; traka 2-mačjeg IL-31; Traka 3- preobojeni proteinski standardi (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Traka 4-psećeg IL-31; i Traka- 5-mačjeg IL-31.

Slika 19 je grafik pSTAT signalizirajućeg u psećim DH-82 monocitima indukovanih psećim i mačjim IL-31 napravljenim u E.coli. Pseći IL-31 (CHO) je referentni protein koji se koristi za sve prethodne probe na ćelijskoj osnovi, pseći model svraba i kao imunogen za inicijalno utvrđivanje antitela.

Slika 20 je ratsojanje koje pokazuje sekvencu konzervacije između mačjeg i psećeg IL-31 u oblasti proteina koji je umešan u povezivanje 11E12 i 34D03 antitela (praćeni plus znakom).

Slika 21 pokazuje Vestern blotove sa Il-31 proteinima. Pojedinačni nitrocelulozni blotovi su ispitivani sa A) anti-His B) 11 E12 i C) 34D03 antitelima. Napomena- pseći IL-31 (CHO) ne sadrži 6-His oznaku.

Slika 22 je grafik koji pokazuje inhibiciju psećeg IL-31 indukovanog pSTAT signalizirajućim u psećim DH82 monocitima poređenjem feliniziranog i kaninizovanog antitela 34D03.

Slika 23 pokazuje Vestern blot mačjeg i psećeg IL-31 pod redukujućim uslovima ispitivanim sa felinizovanim antitelima 34D03.

KRATKI OPIS SEKVENCI

[0029]

SEQ ID NO: 1 je promenljivi teški niz CDR1 zaveden ovde kao 11 E12-VH-CDR1;

SEQ ID NO: 2 je promenljivi teški niz CDR1 zaveden ovde kao 19D07-VH-CDR1;

SEQ ID NO: 3 je promenljivi teški niz CDR1 zaveden ovde kao 34D03-VH-CDR1;

SEQ ID NO: 4 je promenljivi teški niz CDR2 zaveden ovde kao 11 E12-VH-CDR2;

SEQ ID NO: 5 je promenljivi teški niz CDR2 zaveden ovde kao 19D07-VH-CDR2;

SEQ ID NO: 6 je promenljiv teški niz CDR2 zaveden ovde kao 34D03-VH-CDR2;

SEQ ID NO: 7 je promenljivi teški niz CDR3 zaveden ovde kao 11 E12-VH-CDR3;

SEQ ID NO: 8 je promenljivi teški niz CDR3 zaveden ovde kao 19D07-VH-CDR3;

SEQ ID NO: 9 je promenljivi teški niz CDR3 zaveden ovde kao 34D03-VH-CDR3;

SEQ ID NO: 10 je promenljivi laki niz CDR1 zaveden ovde kao 11E12-VL-CDR1;

SEQ ID NO: 11 je promenljivi laki niz CDR1 zaveden ovde kao 19D07-VL-CDR1;

SEQ ID NO: 12 je promenljivi laki niz CDR1 zaveden ovde kao 34D03-VL-CDR1;

SEQ ID NO: 13 je promenljivi laki niz CDR2 zaveden ovde kao 11E12-VL-CDR2;

SEQ ID NO: 14 je promenljivi laki niz CDR2 zaveden ovde kao 19D07-VL-CDR2;

SEQ ID NO: 15 je promenljivi laki niz CDR2 zaveden ovde kao 34D03-VL-CDR2;

SEQ ID NO: 16 je promenljivi lai niz CDR3 zaveden ovde kao 11E12-VL-CDR3;

SEQ ID NO: 17 je promenljivi laki niz CDR3 zaveden ovde kao 19D07-VL-CDR3;

SEQ ID NO: 18 je promenljivi laki niz CDR3 zaveden ovde kao 34D03-VL-CDR3;

SEQ ID NO: 19 je promenljiva lako lančana sekvenca zavedena ovde kao MU-11 E12-VL;

SEQ ID NO: 20 je promenljiva lako lančana sekvenca zavedena ovde kao CAN-11E12-VL-cUn-FW2;

SEQ ID NO: 21 je promenljiva lako lančana sekvenca zavedena ovde kao CAN-11 E12-VL-cUn-13;

SEQ ID NO: 22 je promenljiva lako lančana sekvenca zavedena ovde kao MU-19D07-VL;

SEQ ID NO: 23 je promenljiva lako lančana sekvenca zavedena ovde kao CAN-19D07-VL-998-1;

SEQ ID NO: 24 je promenljiva lako lančana sekvenca zavedena ovde kao MU-34D03-VL;

SEQ ID NO: 25 je promenljiva lako lančana sekvenca zavedena ovde kao CAN-34D03-VL-998-1;

SEQ ID NO: 26 je promenljiva teško lančana sekvenca zavedena ovde kao MU-11E12-VH;

1

SEQ ID NO: 27 je promenljiva teško lančana sekvenca zavedena ovde kao CAN-11E12-VH-415-1;

SEQ ID NO: 28 je promenljiva teško lančana sekvenca zavedena ovde kao MU-19D07-VH;

SEQ ID NO: 29 je promenljiva teško lančana sekvenca zavedena ovde kao CAN-19D07-VH-400-1;

SEQ ID NO: 30 je teško lančana sekvenca zavedena ovde kao MU-34D03-VH;

SEQ ID NO: 31 je promenljiva teško lančana sekvenca zavedena ovde kao CAN-34D03-VH-568-1;

SEQ ID NO: 32 je amino kiselinska sekvenca u skladu sa Akcesijom GenBanke No. C7G0W1 i odgovara psećem IL-31 proteinu potpune dužine;

SEQ ID NO: 33 je nukleotidna sekvenca u skladu s GenBanke ulazom No. C7G0W1 i odgovara nukleotidnoj sekvenci kodirajućeg psećeg IL-31 proteina potpune dužine;

SEQ ID NO: 34 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu lako lančanu sekvencu zavedenu ovde kao MU-11 E12-VL;

SEQ ID NO: 35 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu teško lančanu sekvencu zavedenu ovde kao MU11 E12-VH;

SEQ ID NO: 36 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu lako lančanu sekvencu zavedenu ovde kao MU19D07-VL;

SEQ ID NO: 37 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu teško lančanu sekvencu zavedenu ovde kao MU19D07-VH;

SEQ ID NO: 38 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljovu lako lančanu sekvencu zavedenu ovde kao MU34D03-VL;

SEQ ID NO: 39 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu teško lančanu sekvencu zavedenu ovde kao MU34D03-VH;

SEQ ID NO: 40 je amino kiselinska sekvenca za pseću konstantnu teško lančanu oblast zavedenu ovde kao HC64 (GenBanke pristup no. AF354264);

SEQ ID NO: 41 je nukleotidna sekvenca koja kodira konstantnu teško lančanu oblast zavedenu ovde kao HC-64 ( GenBanke pristup no. AF354264);

SEQ ID NO: 42 je amino kiselinska sekvenca za pseću konstantnu teško lančanu oblast zavedenu ovde kao HC65 (GenBanke pristup no. AF354265);

SEQ ID NO: 43 je nukleotidna sekvenca koja kodira pseću konstantnu teško lančanu oblast zavedenu ovde kao HC-65 (GenBanke pristup no. AF354265);

SEQ ID NO: 44 je amino kiselinska sekvenca za pseći lako lančani konstantni region zaveden ovde kao kappa (GenBanke pristup No. XP_532962);

SEQ ID NO: 45 je nukleotidna sekvenca koja kodira pseću konstantno lako lančanu oblast zavedenu ovde kao grčko slovo kapa- k (GenBanke pristup No. XP_532962);

SEQ ID NO: 46 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu lako lančanu sekvencu zavedenu ovde kao CAN19D07-VL-998-1;

SEQ ID NO: 47 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu tešku lančanu sekvencu zavedenu ovde kao CAN19D07-VH-998-1;

SEQ ID NO: 48 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu lako lančanu sekvencu zavedenu ovde kao CAN34D03-VL-998-1;

SEQ ID NO: 49 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu tešku lančanu sekvencu zavedenu ovde kao CAN34D03-VH-568-1;

SEQ ID NO: 50 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu lako lančanu sekvencu zavedenu ovde kao CAN11E12-VL-cUn-FW2;

SEQ ID NO: 51 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu teško lančanu sekvencu zavedenu ovde kao CAN11E12-VH-415-1;

SEQ ID NO: 52 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu lako lančanu sekvencu zavedenu ovde kao CAN11 E12-VL-cUn-13;

SEQ ID NO: 53 je promenljiva lako lančana sekvenca zavedena ovde kao CAN-11E12_VL_cUn_1;

1

SEQ ID NO: 54 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu lako lančanu sekvencu zavedenu ovde kao CAN11E12-VL-cUn-1;

SEQ ID NO: 55 odgovara amino kiselinskoj sekvenci psećeg IL-31 konstrukta potpune dužine upotrebljnog ovde za ekspresiju E.coli;

SEQ ID NO: 56 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-31 konstruktu potpune dužine upotrebljenog ovde za ekspresiju E.coli;

SEQ ID NO: 57 je amino kiselinska sekvenca psećeg IL-31 -20N konstrukta za E.coli ekspresiju;

SEQ ID NO: 58 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-31 -20N konstruktu za ekspresiju E.coli;

SEQ ID NO: 59 je amino kiselinska sekvenca psećeg IL-31 -40N konstrukta za ekspresiju E.coli;

SEQ ID NO: 60 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-31 -40N konstruktu za ekspresiju E.coli;

SEQ ID NO: 61 je amino kiselinska sekvenca psećeg IL-31 -60N konstrukta za ekspresiju E.coli;

SEQ ID NO: 62 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-31 -60N konstruktu za ekspresiju E.coli;

SEQ ID NO: 63 je amino kiselinska sekvenca koja odgovara psećem IL-3120-122 konstruktu za ekspresiju E.coli;

SEQ ID NO: 64 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-31 20-122 konstruktu za ekspresiju Ešerije koli;

SEQ ID NO: 65 je amino kiselinska sekvenca koja odgovara psećem IL-3120-100 konstruktu za ekspresiju E.coli;

SEQ ID NO: 66 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-3120-100 konstruktu za ekspresiju E.coli;

1

SEQ ID NO: 67 je amino kiselinska sekvenca koja odgovara psećem IL-31 20-80 konstruktu za ekspresiju E.coli;

SEQ ID NO: 68 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-31 20-80 konstruktu za ekspresiju E.coli;

SEQ ID NO: 69 je amino kiselinska sekvenca koja odgovara mačjem IL-31 konstruktu potpune dužine za ekspresiju E.coli;

SEQ ID NO: 70 je nukleotidna sekvenca koja odgovara mačjem IL-31 konstruktu potpune dužine za ekspresiju Ešerije koli;

SEQ ID NO: 71 je promenljiva lako lančana sekvenca zavedena ovde kao FEL-34D03-VL-021-1;

SEQ ID NO: 72 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu lako lančanu sekvencu zavedenu ovde kao FEL34D03-VL-021-1;

SEQ ID NO: 73 je promenljiva teško lančana sekvenca zavedena ovde kao FEL-34D03-VH-035-1;

SEQ ID NO: 74 je nukleotidna sekvenca koja kodira promenljivu teško lančanu sekvencu zavedenu ovde kao FEL34D03-VH-035-1;

SEQ ID NO: 75 je amino kiselinska sekvenca za mačju konstantnu teško lančanu oblast zavedenu ovde kao HC-A Feline (GenBanke pristup no. AB016710.1);

SEQ ID NO: 76 je nukleotidna sekvenca koja kodira mačju konstantnu teško lančanu oblast zavedenu ovde kao HC-A Feline (GenBanke pristup no. AB016710.1);

SEQ ID NO: 77 je amino kiselinska sekvenca mačju konstantnu lako lančanu oblast zavedenu ovde kao LC-KapaFelin (GenBanke pristup no. AF198257.1);

SEQ ID NO: 78 je nukleotidna sekvenca koja kodira mačju konstantno lako lančanu oblast zavedenu ovde kao LCKappa Feline (GenBanke pristup no. AF198257.1);

1

DEFINICIJE

[0030] Pre nego što opišemo ovaj pronalazak detaljno, definisaćemo neke termine upotrebljene u kontekstu ovog pronalaska. Pored ovih termina, ostali su definisani na drugom mestu u specifikacijama ako je to potrebno. Sem ako to nije ovde drugačije definisano, termini iz struke upotrebljini u ovoj specifikaciji imaće njihovo prepoznatljivo značenje u struci.

[0031] Kako je upotrebljeno u specifikacijama i zahtevima, oblik jednine za "a", "an" i "the" obuhvata reference u množini osim ako konteskt jasno ne diktira drugačije. Na primer, upotreba "antitelo" obuhvata množinu, svako antitelo.

[0032] Kako je ovde upotrebljno, termin "obuhvatajući" znači da mešavine i metode uključuju naznaćene elemente, ali ne isključuje ostale.

[0033] Epitop, upotrebljen ovde, se odnosi na antigenetsku determinantu, koju prepoznaju CDR antitela. Drugim rečima, epitop se odnosi na onaj deo bilo kog molekula koga može da prepozna i pričvrsti neko antitelo. Sem ako nije drugačije navedeno, termin "epitop" kao što je ovde upotrebljen, se odnosi na oblast IL-31 na koju neki anti-IL-31 agent reaguje.

[0034] "Antigen" je molekul ili deo molekula sposoban da se vezuje za antitelo koje je dodatno sposobno da bude prepoznato, vezano, za antitelo (odgovarajuća vezujuća oblast antitela mogla bi da se navede kao paratop). Uopšteno, epitopi se sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupisanja molekula, na primer, bočni nizovi amino kiselina ili šećera i imaju specifične trodimenzionalne strukturalne karakteristike kao i specifične karakteristike naelektrisanja.

[0035] Termin "specifično" u kontekstu vezivanja antitela, odnosi se na visoku sklonost i/ili visok afinitet povezivanja nekog antitela za specifičan antigen tj. polipeptid, ili epitop. U mnogim ostvarenjima, specifični antigen je antigen (ili fragment ili delić nekog gena) upotrebljen da imunizuje životinju domaćina od koje je izolovano antitelo koje proizvodi ćelije. Vezivanje antitela za specifičan antigen je jače nego povezivanje istog antitela sa nekim drugim antigenima. Antitela koja su specifično povezana sa polipeptidima mogu da budu sposobni da povezuju druge polipeptide na slabom, jedva detektibilnom nivou ( (na primer, 10% ili manje pokazanog povezivanja za odgovarajući polipeptid). Tako slabo povezivanje, ili background povezivanje, je odmah prepoznatljivo u odnosu na specifično vezivanje antitela za odgovarajući polipeptid, na primer korišćenjem odgovarajućih kontrola. Uopšteno, specifična antitela se vezuju za antigen sa vezujućim afinitetom KD od 10-7 M ili manje, na primer, 10-8 M ili manje (na primer, 10-9 M ili manje, 10-10 ili manje, 10-11 ili manje, 10-12 ili manje, ili 10-13 ili manje, itd.).

1

[0036] Kako se ovde upotreblja, termin "antitelo" se odnosi na intaktni imunoglobulin koji ima dva laka i dva teška niza. Tako pojedinačno izolovano antitelo ili fragment mogu da budu poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, sintetizovano antitelo, rekombinantno antitelo, himerno antitelo, heterohimerno antitelo, kaninizovano antitelo, ili felinizovano antitelo. Termin "antitelo" prvenstveno se odnosi na monoklonalna antitela i njihove fragmente, i njihovi imunološki vezujući ekvivalenti koji se mogu vezati za IL-31 protein i njihovi fragmenti. Termin antitelo je upotrebljeno i za molekularnu homogenost, ili za smešu kao što je proizvod seruma napravljen od više različitih molekularnih entiteta.

[0037] "Prirodna antitela" i "prirodni imunoglobulini" su obično heterotetrametrični glikoproteini od oko 150,000 Daltona, sastavljeni od dva identična laka niza (L) i dva identična teška niza (H). Svaki laki niz je povezan sa teškim nizom jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok broj disulfidnih veza varira među teškim nizovima različitih imunoglobulinskih izotopa. Svaki teški i laki niz takođe ima pravilno raspoređene unutrašnje disulfidne mostove. Svaki teški niz ima na jednom kraju promenljivu oblast (VH) koja je praćena nekim brojem konstantnih oblasti. Svaki laki niz ima promenljivu oblast na jednom kraju (VL) i konstantnu oblast na svom drugom kraju; konstantna oblast lakog niza usklađena je sa prvom konstantnom oblašću teškog niza, i laki niz promenljive oblasti je usklađen sa promenljivom oblašću teškog niza. Smatra se da posebni amino kiselinski ostaci formiraju međuprostor između promenljivih oblasti lakih i teških nizova. SLIKA. 2 je primer opšte strukture prirodnog mišjeg imunoglobulina G (IgG) ) ističući vezujuće mesto antigena.

[0038] Termin "fragment antitela" se odnosi na manje od jedne netaknute strukture antitela, koja uključuje bez ogranićenja, pojedinačni izolovani niz antitela, jedan Fv konstrukt, jedan Fab konstrukt, jedan Fc konstrukt, varijablu lakog niza ili sekvencu komplementarnog determinišućeg regiona (CDR), i td.

[0039] Termin "promenljiva" oblast podrazumeva okvir i CDRs (poznate i kao hipervarijable) i odnose se na činjenicu da neki delovi promenljivog domena se razlikuju mnogo u sekvenci među antitelima i koriste se u povezivanju i specifičnosti svakog pojedinačnog antitela za poseban antigen. Međutim, varijabilnost nije podjednako raspoređena po promenljivim domenima antitela. Koncentrisana je u tri segmenta koja su nazvana hipervarijabilne oblasti i u lako lančanim i u teško lančanim varijabilnim domenima. Najviše očuvani delovi varijabilne oblasti se nazivaju okvir (the framework region (FR)). Promenljive oblasti prirodnih teških i lakih nizova podrazumevaju svaka višestruke FRs, u velikoj meri poprimajući β-sheer

1

zakrivljenu konfigiraciju, povezan sa tri hipervarijabilne oblasti, koje formiraju petlje i u nekim slučajevima formirajući α-sheet zakrivljene strukture. FRs drže hipervarijabilne oblasti čvrtso zajedno u svakom lancu u čvrstoj blizini i sa druge strane sa hipervarijabilnim oblastima drugog lanca, doprinoseći stvaranju antigen-povezujećeg mesta antitela (videti Kabat, i al., Sekvence proteina od imunološkog značaja, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), strane 647-669). Konstantne oblasti nisu uključene direktno u povezivanje jednog antitela sa antigenom, ali izvršavaju različite delotvorne funkcije, kao što je učestvovanje antitela u antitelo-zavisnoj ćelijskoj toksičnosti.

[0040] Termin "hiperpromenljiva oblast" kad je ovde upotrebljen odnosi se na amino kiselinske ostatke nekog antitela koje je odgovorno za antigensko vezivanje. Hiperpromenljiva oblast podrazumeva amino kiselinske ostatke sa „oblašću koja detereminiše komplementarnost“ ili "CDR" (Kabat, i al. (1991), iznad) i/ili one ostatke sa "hiperpromenljive petlje" (Chothia i Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987). "Okvir" ili "FR" ostataka su oni ostaci promenljivih domena koji su drugačiji od ostataka hiperpromenljive oblasti ovde definisanih.

[0041] Papain digestija antitela proizvodi dva identična fragmenta antigenskog povezivanja, nazvani "Fab" fragmenti, svaki sa pojedinačnim mestom antigen povezivanja, i rezidualni "Fc" fragment, čije ime odražava sposobnost da brzo kristalizuje. Pepsin tretman stvara jedan F(ab’)2 fragment koji ima dva mesta antigen povezivanja i još uvek je sposoban za unakrsno antigensko povezivanje.

[0042] "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto antigena za prepoznavanje i povezivanje. Oblast se sastoji od dimera jednog teškog niza i jednog lakog niza promenljivog domena u tesnoj, nekovalentnoj asocijaciji. U toj konfiguraciji tri hipervarijabilne oblasti iz svakog promenljivog domena interaktivno deluju kako bi definisali mesto antigenskog povezivanja na površini VH-VL dimera. Zajedno, šest hipervarijabilnih oblasti daju specifičnost antigenskog povezivanja datom antitelu. Međutim, čak i pojedinačna varijabilna oblast (ili polovina Fv koja podrazumeva samo tri hipervarijabilne specifične oblasti za neki antigen) je sposobna da prepozna i veže antigen, čak i sa manjim afinitetom nego što ima celo mesto povezivanja.

[0043] Fab fragment takođe sadrži konstantni domen lakog niza i prvi konstantni domen (CH1) teškog niza. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenta jer dodatno imaju nekoliko ostataka na karboksilnom kraju teškog niza CH1 domena koji uključuje jedan ili više cisteina sa prelamajuće oblasti antitela. Fab’-SH je ovde oznaka za Fab’ u kojem cistein ostatak/ci

2

konstantnih domena nose slobodnu tiolnu grupu. F(ab’)2 fragmenti antitela su originalno napravljeni kao parovi Fab’ fragmenata koji imaju prelomne cisteine ismeđu sebe. Poznata su i druga hemijska kuplovanja fragmenata antitela.

[0044] "Laki nizovi" antitela (imunoglobulini) od bilo koje vrste kićmenjaka mogu da se dodele jednom ili dva jasno različita tipa, zvana kapa (κ) ili lambda (λ), zasnovana na amino kiselinskim sekvencama njihovih konstantnih domena.

[0045] Zavisno od amino kiselinske sekvence konstatnog domena njihovih teških nizova, imunoglobulini mogu da se dodele različitim klasama. Sada ima 5 velikih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, i mnogi od njih mogli bi nadalje da budu podeljeni na podklase (izotopi), na primer, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2 (označeni mišjim i ljudskim oznakama). Teško lančani konstantni domeni koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina se zovu alfa, delta, epsilon, gama, i mi, redom. Podjedinične strukture i tridimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate u više vrsta. Pretežnost pojedinačnih izotipa i funkcionalnih aktivnosti povezanih sa tim konstantnim domenima su specifični za vrstu i moraju da budu eksperimentalno definisani.

[0046] "Monoklonalno antitelo" kao što je ovde definisano je antitelo koje je napravljeno od pojedinačnog klona ćelija (specifično, pojedinačni klon od hibridoma ćelija) i nadalje pojedinačnog čistog homogenog tipa antitela. Sva monoklonalna antitela napravljena od istog klona su identična i imaju istu antigensku specifičnost. Termin "monoklonalni" odnosi se na pojedinačni klon ćelija, pojedinačnu ćeliju i potomke te ćelije.

[0047] Monoklonalno antitelo ovde specifično uključuje himerična antitela (imunoglobulini) u kojima deo teškog i/ili lakog niza je identičan sa ili homolog sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja su nastala od specifičnih vrsta, dok je ostatak niza identičan sa ili homolog sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od drugih vrsta, kao i fragmenti svakog antitela, sve dok izvršavaju željenu biološku aktivnost. Tipično, himerna antitela su antitela čiji geni sa lakim i teškim nizovima su konstruisana tipično genetskim inžinjeringom, od antitela gena sa varijabilnom i konstantnom oblašću gena koji pripadaju različitim vrstama. Na primer, varijabilni segmenti gena od mišjeg monoklonalnog antitela mogu da se povežu sa psećim konstantnim segmentima. Slika 3 je šematska predstava opšte strukture jednog ostvarenja mišjeg:psećeg IgG. U ovom ostvarenju, mesto vezivanja antigena je nastalo od miša dok je deo FC pseći.

[0048] "Kaninizovane" forme od ne-kaninske vrste(na primer glodara) antitela su antitela dobijena genetskim inženjeringom koja sadrže minimalnu sekvencu koja potiče od nekaninskog imunoglobulina. Kaninizovana antitela su pseće sekvence imunoglobulina (antitelo recipijent) u kojima su ostaci hipervariabilne oblasti recipienta zamenjeni ostacima hipervariabilne oblasti ne-kaninske vrste (antitelo donor) kao što je miš koji ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim primerima, ostaci okvirnog regiona(FR) pseće imunoglobulin sekvence su zamenjeni sa odgovarajućim ostacima koji nisu od pseće vrste. Nadalje, kaninizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji nisu pronađeni u antitelima recipijenta ili u antitelima donatora. Ove modifikacije su napravljene da bi poboljšale delotvornost antitela. Uopšte, kaninizovano antitelo će uključiti stvarno bar jedan, tipočno dva, varijabilna domena u kojima sve ili skoro sve od hipervariabilnih oblasti odgovaraju onima napravljenim od sekvence imunoglobulina koja nije pseće vrste i sve ili skoro sve FRs su od sekvence psećeg imunoglobulina. Alternativno kaninizovano antitelo će takođe da sadrži celu ili deo imunoglobulinske konstantne oblasti (Fc), tipično od pseće imunoglobulin sekvence. SLIKA. 4 je ilustracija jednog ostvarenja koja pokazuje specijaciju ili kaninizaciju mišjeg IgG. U ovom ostvarenju mišji CDRs su nakalemljeni na pseći okvir (matricu).

[0049] "Felinizovani" oblici antitela koja nisu mačja (na primer glodara) su obično genetskim inžinjeringom napravljena antitela koja sadrže minimalnu sekvencu koja je dobijena od imunoglobulina koji nije mačji. Fenilizovana antitela su mačje imunoglobulinske sekvence (recipijent antitela) u kojima ostaci hipervarijabilne oblasti recipijenta su zamenjeni sa ostacima hipervarijabilne oblasti od neke vrste koja nije mačja (antitelo donator) kao što je miš koja ima željene specifičnosti, afinitet i kapacitet. U nekim primerima, ostaci okvira oblasti (FR) mačjih imunoglobulinskih sekvenci su zamenjeni odgovarajućim ostacima koji nisu mačji. Nadalje, fenilizirana antitela mogu da sadrže ostatke koji nisu nađeni u antitelima recipient a kao ni u antitelima donatora. Ove modifikacije su napravljene da bi nadalje poboljšali delotvornost antitela. Uopšteno, felinizirano antitelo će ukljućiti bar jednu, tipično dve varijabilne oblasti u kojima sve ili skoro sve od hipervarijabilnih oblasti odgovara onim oblastima sekvence imunoglobulina koji nije mačji i sve ili skoro sve FRs su od sekvence mačjeg imunoglobulina. Fenilizacija antitela opcionalno će takođe obuhvatati potpunu ili bar deo konstantne oblasti imunoglobulina (Fc), obično je to ona od sekvence majčeg imunoglobulina.

[0050] Termin "heterohimeričan" kao što je definisan ovde, se odnosi na neko antitelo u kojem jedan od nizova antitela (teški ili laki) je kaninizovan dok je drugi himeričan.

SLIKA 5 prikazuje jedno ostvarenje heterohimeričnog molekula. U ovom ostvarenju, kaninizovan promenljivi teški niz (gde su svi CDRs mišji i svi FRs pseći) je uparen sa himernim promenljivim lakim nizom (u kojem su svi CDRs i svi FRs mišji). U ovom ostvarenju, i promenljivi teški i promenljivi laki nizovi su futzionisani sa psećom konstantnom oblašću.

[0051] "Variant" anti-IL-31 antitelo,se odnosi ovde na molekul koji se razlikuje u amino kiselinskoj sekvenci od „roditelja“ anti-IL-31 amino kiselinske sekvence po sposobnosti za adiciju, deleciju i/ili supstituciju jednog ili više amino kiselinskih ostataka u sekvenci roditeljskog antitela i zadržava bar jednu željenu aktivnost roditeljskog anti-IL-31-antitela. Željene aktivnosti mogu da obuhvataju sposobnost specifičnog vezivanja antigena, sposobnost da redukuju, inhibiraju ili neutrališu IL-31 aktivnost kod životinja, i sposobnost da inhibiraju IL31-posredovan pSTAT signalizujući u testovima koji se zasnivaju na ćelijama. U jednom ostvarenju, varijant obuhvata jednu ili više amino kiselinskih supstitucija u jednoj ili više hiperpromenljivih i/ili okvirnih oblasti roditeljskog antitela. Na primer, varijant bi mogao da obuhvata bar jednu, na primer od oko jedne do oko deset, i poželjno od oko 2 do 5, supstitucija u jednoj ili više hiperpromenljivih i/ili okvirnih oblasti roditeljskog antitela. Obično, varijant će imati neku amino kiselinsku sekvencu koja ima bar 50% amino kiselinskih sekvencionih identitičnosti sa roditeljskim varijabilnim domenom sekvenci antitela sa teškim ili lakim nozom, poželjnije je bar 65%, još poželjnije bar 75%, još poželjnije bar 80%, još poželjnije bar 85%, još poželjnije bar 90%, i još poželjnije bar 95% sekvencionalne identičnosti. Identičnost ili homolognost tih sekvenci su definisani ovde kao procenat identičnosti amino kiselinskih ostataka u kandidatskoj sekvenci sa ostacima roditeljskog antitela, posle postavljanja sekvenci i uvođenja razmaka, ako je potrebno, da bi se dostigao maksimalni procenat sekvencionalne identičnosti. Nijedan od N-terminal, C-terminal, ili internih ekstenzija, delecija ili insertacija u sekvencu antitela, treba da bude konstruisan tako da ne ugrožava identičnost ili homolognost sekvenci. Varijant zadržava sposobnost da vezuje IL-31 i poželjno je da ima željene aktivnosti koje su superiorne u odnosu na one kod roditeljskog antitela. Na primer, variant bi mogao da ima jaći afinitet vezivanja, pojačanu sposobnost da redukuje, inhibira ili neutralizuje aktivnost IL-31 u nekoj životinji, i/ili pojačanu sposobnost da inhibira IL-31posredovano pSTAT signaliziranje u probama zasnovanim na ćelijama.

[0052] "Variant" nukleinska kiselina, odnosi se ovde na molekul koji se razlikuje u sekvenci od "roditeljske" nukleinske kiseline. Polinukleotid sekvence divergenca može da bude rezultat mutacionih promena kao što su delecija (vrsta strukturne aberacije kod koje dolazi do gubitka

2

dela hromozoma), supstituciona ili point mutacija, ili adicije jednog ili više nukleotida. Svaka od ovih promena može da se desi sama ili u kombinaciji, jednom ili više puta u datoj sekvenci.

[0053] "Roditeljsko" antitelo ovde je ono koje je kodirano amino kiselinskom sekvencom koja se koristi za pripremu varijanta. Prvenstveno, roditeljsko antitelo ima pseću oblast kao okvir i, ako je prisutan, ima pseće antitelo konstantne(ih) oblasti. Na primer, Roditeljsko antitelo može da bude kaninizovano ili pseće antitelo. Kao sledeći primer, roditeljsko antitelo može biti felinizovano ili antitelo mačke. Kao još jedan primer, roditeljsko antitelo je od glodara monoklonalno antitelo.

[0054] Termin "izolovan" znači da je materijal (na primer, antitelo ili nukleinska kiselina) odvojen i/ili dobijen od komponente u njenom prirodnom okruženju. Kontaminirajuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi mogli da smetaju dijagnostičke ili terapeutske primene tog materijala, i mogu da obuhvataju enzime, hormone i druge proteinske i ne-proteinske rastvore. Što se tiče nukleinskih kiselina, jedna izolovana nukleinska kiselina bi mogla da obuhvata jednu koja je odvojena od 5’ do 3’ sekvenci sa kojima je normalno povezana u hromozomu. U poželjnom ostvarenju, materijal će biti prečišćen do 95% težinskih delova materijala, a još poželjnije i više od 99% težinskih delova. Izolovani materijal uključuje materijal in situ u rekombinantnim ćelijama pošto bar jedna komponenta iz prirodnog okruženja materijala neće biti prisutna. Obično, međutim, izolovani materijal će biti pripremljen bar jednim pročišćavajućim korakom.

[0055] Reč "oznaka" kad je ovde korišćena se odnosi na detektibilno jedinjenje ili sastav koji se mogu konjugovati direktno ili indirektno sa antitelom ili nukleinskom kiselinom. Oznaka može biti uočljiva i/ili merljiva sama od sebe (na primer, radioizotopne oznake ili fluorescentne oznake) ili, u slučaju enzimske oznake, može da katalizuje hemijski promenu jedinjenja substrata ili kompozicije koja je uočljiva i/ili merljiva.

[0056] Termini "nukleinska kiselina", "polinukleotid", "molekul nukleinske kiseline" i slični mogli bi da budu upotrebljeni paralelno ovde i da se odnose na seriju nukleotidnih baza (takođe nazvanih "nukleotidi") u DNK i RNK. Nukleinska kiselina može da sadrži dezoksiribonukleotide, ribonukleotide, i/ili njiihove analoge. Termin "nukleinska kiselina" obuhvata, na primer, jednolančane ili dvolančane molekule. Nukleinska kiselina može da bude, na primer, gen ili fragment gena, eksoni, introni, DNK molekul (na primer, cDNA), RNK molekul (na primer, mRNA), rekombinantne nukleinske kiseline, plazmidi, i ostali vektori, prajmeri i probe. Oba 5’ do 3’ (sense) i 3’ do 5’ (antisense) polinukleotida su uključena.

[0057] "Subjekat" ili "Pacijent" se odnosi na psa kome je potreban tretman koji se može izvršiti medicinskom upotrebom predmetnog pronalaska.

[0058] "Terapeutski delotvorna količina" (ili "delotvorna količina") se odnosi na količinu jednog aktivnog sastojka, na primer jednog agensa u skladu sa pronalaskom, dovoljna da proizvede dobre ili željene rezultate kad je administrirana subjektu ili pacijentu. Delotvorna količina bi mogla da se administrira u jednom ili više davanja, aplikacija ili doziranja. Terapeutski delotvorna količina jednog jedinjena mogla bi da bude čvrsto determinisana jednim od uobičajenih veština u struci. U kontekstu ovog pronalaska, "terapeutski delotvorna količina" je ona koja stvara jednu objektivno merljivu promenu u jednom ili više parametara povezanih sa tretmanom stanja svraba ili alergijskog stanja uključujući kliničko poboljšanje u simptomima. Naravno, terapeutski delotvorna količina će varirati zavisno od posebnog subjekta ili stanja koje se tretiratežine i godina subjekta, ozbiljnosti bolesnog stanja, načina administriranja i tome sličnog, i svi mogu da se jasno determinišu jednom od uobičajenih veština u struci.

[0059] Kako je upotrebljen ovde, termin "terapeutski" obuhvata potpuni spektar tretmana bolesti i poremećaja. „Terapeutski“ agens bi mogao da deluje profilatički ili preventivni način, uključujući i one načine koji uključuju procedure označene da deluju na životinje koje se identifikuju da su pod rizikom (farmakogenetske); ili na takav način da poboljšaju ili leče, ili mogu da deluju tako da usporavaju rang ili opseg progresivnosti bar jednog simptoma bolesti ili poremećaja koji se tretiraju.

[0060] "Tretman", "tretiranje", i tome slično se odnose i na terapeutske tretmane i na profilaktičke ili preventivne mere. Životinje kojima je potreban tretman obuhvataju one koje već imaju poremećaje kao i one kod kojih na pojavu poremećaja treba preventivno delovati. Termin "tretman" ili "tretiranje" bolesti ili poremećaja obuhvataju prevenciju ili protekciju protiv boleti ili poremećaja (sprečavajući razvoj kliničkih simptoma); inhibiciju bolesti ili poremećaja (na primer, zaustavljanje razvoja kliničkih simptoma; i/ili smanivanja bolesti ili poremećaja (na primer, dovodeći do povlačenja kliničkih simptoma). Iako je poželjno nije uvek moguće napraviti razliku između "prevencije" i "zaustavljanje" bolesti ili poremećaja jer krajnji indukovani događaj ili događaji mogu biti nepoznati ili prikriveni. U skladu s tim, termin "profilaksa" će biti shvaćen kao stvaranje tipa "tretmana" koji obuhvata i "prevenciju" i "zaustavljanje." Termin "tretman" tako uključuje "profilaksu".

2

[0061] Termin "alergijsko stanje" je definisano ovde kao poremečaj ili bolest izazvani interakcijom imunog sistema i neke supstance koja je strana za telo. Ta strana supstanca se naziva "alergen". Uobičajeni alergeni su aeroalergeni, kao što je polen, prašina, plesan, sitni proteini, ubrizgana pljuvačka od ujeda insekta, itd. Primer alergijskog stanja uključuje , ali se na njih ne ograničava, sledeće: alergijski dermatitis, letnji ekcem, urtikariju, mučnine, upalne bolesti respiratornog puta, česte opstrukcije respiratornog puta, hiperosetljivost respiratotnog puta, hronične opstruktivne bolesti pluća, i upalni autoimuni procsi, kao što je sindom iritabilnog kolona (IBS).

[0062] Termin "stanje svraba" je definisano ovde kao bolest ili poremećaj koje karakteriše jedna intezivna senzacija svrbeža koja izaziva hitno trljanje ili češanje kože da bi se osetilo olakšanje. Primeri stanja svraba uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće: atopični dermatitis, ekcem, psoriazu, sklerodermu, i svrab.

[0063] Kako su ovde upotrebljeni, termini "ćelija", ćelijska linija" i "ćelijska kultura" mogli bi da se koriste kao sinonimi. Svi ovi termini takođe obuhvataju njihove srodne izraze, bilo koje i sve narednih generacija. Razumljivo je da svi progeni mogu da ne budu identični usled hotomičnih ili nenamernih mutacija. U kontekstu izražavanja heterologne sekvence nukleinske kiseline, "ćelija domaćin“ se odnosi na prokariotsku ili eukariotsku ćeliju (na primer, bakterijske ćelije, kvasci, ćelije sisavaca, i ćelije insekata) bilo da su lokalizovane in vitro ili in vivo. Na primer, ćelija domaćin mogla bi da bude smeštena u transgenoj životinji. Ćelija domaćin može da se koristi kao recipient za vektore i mogla bi da obuhvata bilo koji organizam koji se može preobraziti i koji je sposoban da replicira vektor i/ili izrazi heterolognu nukleinsku kiselinu kodiranu vektorom.

[0064] "Sastav" treba da znači kombinaciju aktivnog agensa i drugog jedinjenja ili sastava koji može biti inertan (na primer, oznaka), ili aktivan, kao što je ađuvant.

[0065] Kao što je ovde definisano, farmaceutski prihvatljivi prenosnici prigodni za upotrebu u pronalasku su dobro poznati u struci. Takvi prenosnici uključuju, bez ograničenja, vodu, slani rastvor, puferovani slani rastvor, fosfatni pufer (rastvor upotrebljen da stabilizuje pH tečnosti), alkoholne/ vodene rastvore, emulzije ili suspenzije. Drugi konvencionalno upotrebljeni razređivači, pomagači i alkoholni/vodeni rastvori, emulzije i suspenzije. Drugi konvecionalno upotrebljeni razređivači, poćna sredstva u ekcipienti mogu da budu dodati u skladu sa konvencionalnim tehnikama. Takvi prenosnici mogu da ukiljučuju etanol, poliole, i njihove odgovarajuće mešavine, biljna ulja, i organske estre koji se ubrizgavaju. Puferi i agensi za

2

podešavanje pH mogu takođe da se upotrebe. Puferi, uključuju bez ograničenja, soli pripremljene od organske kiseline ili baze. Reprezentativni puferi obuhvataju, bez ograničenja, soli organskih kiselina, kao što su soli limunske kiseline, na primer, citrati, askorbinska kiselina, glukonska kiselina, histidin-HCl, ugljena kiselina, tartarna kiselina, sukcinska kiselina, sirćetna kiselina, ili ftalna kiselina, Tris, trimetanmin hidrohlorid, ili fosfatni puferi. Parenteralni prenosioci mogu da sadrže natrijum hlorid, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu, trehalozu, saharoza, natrijum hlorid, Ringerov laktat ili stabilna ulja. Intravenozni prenosioci mogu da uključuju fluid i hranljive punioce, elektrolite, kao što su oni zasnovani na Ringerovoj dekstrozi i tome slično. Konzervansi i drugi dodaci kao, na primer, antimikrobik, antioksidansi, helatni agensi (na primer, EDTA), inertni gasovi i tome slično mogu da bude spremljeni u farmaceutskim prenosnicima. Pripreme ovih farmaceutski prihvatljivih mešavina, od iznad navedenih sastojaka, imaju prihvatljivu pH izotoničnost, stabilnost i druge konvencionalne karakteristike u skladu sa strukom. Videti, na primer, tekstove kao što je Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott Williams & Wilkins, publ., 2000; i The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.sup.th edit., eds. R. C. Rowe i al, APhA Publications, 2003.

[0066] Termin "konzervativna amino kiselinska supstitucija" označava bilo koju amino kiselinsku supstituciju za dati ostatak amino kiseline, gde je zamena ostatka je toliko hemijski slična datom ostatku da nema supstancionalnog smanjenja polipeptidnog funkcionalnog rezultata (na primer, enzimatska aktivnost). Zaštitne amino kiselinske supstitucije su opšte poznate u struci i primeri su opisani u njima, na primer u U.S. Pat. Nos.6,790,639, 6,774,107, 6,194,167, ili 5,350,576. U poželjnom ostvarenju, zaštitna amino kiselinska supstitucija će biti bilo koja, koja se pojavljuje u nekoj od sledećih šest grupa:

• 1. Mali alifatični, supstancionalno nepoalrni ostaci: Ala, Gly, Pro, Ser i Thr;

• 2. Veliki alifatični, nepolarni ostaci: Ile, Leu i Val; Met;

• 3. Polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi: Asp i Glu;

• 4. Polarni amidi, negativno naelektrisani ostaci: Asn i Gin; His;

• 5. Polarni, pozitivno naelektrisani ostaci: Arg i Lys; His; i

• 6. Veliki aromatićni ostaci: Trp i Tyr; Phe.

2

[0067] U poželjnom ostvarenju, zaštitna amino kiselinska supstitucija će biti bilo koja od sledećih, koje su navedene kao Prirodni ostaci (Zaštitne supstitucije) parovi: Ala (Ser); Arg (Lys); Asn (Gin; His); Asp (Glu); Gin (Asn); Glu (Asp); Gly (Pro); His (Asn; Gin); Ile (Leu; Val); Leu (Ile; Val); Lys (Arg; Gin; Glu); Met (Leu; Ile); Phe (Met; Leu; Tyr); Ser (Thr); Thr (Ser); Trp (Tyr); Tyr (Trp; Phe); and Val (Ile; Leu).

[0068] Kao što polipeptidi mogu da sadrže zaštićene amino kiselinsku zamenu(e), njihovi polinukleotidi mogu da sadrže zaštićenu kodon zamenu(e). Kodon supstitucija se smatra zaštitnom ako, kad je izražena, stvara zaštitnu amino kiselinsku supstituciju, kao što je opisano iznad. Degenerativna kodon supstitucija, čiji je rezultat amino kiselinska supstitucija, je takođe korisna u polinukleotidima. Tako, na primer, polinukleotid koji kodira odabrani polipeptid koristan u nekom ostvarenju ovog pronalaska mogao bi da mutira zbog degenerativne kodon supstitucije tako da se približi kodonskoj upotrebnoj učestalosti koju ostvaruju putem ekspresije ćelije domaćina kako bi se tu transformisali ili kako bi se poboljšala njihova ekspresija.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0069] Terminologija koja je ovde korišćena služi samo u svrhu opisivanja naročitih primera izvođenja, i njije namera da se ograničava obim predmetnog pronalaska, koji je isključivo definisan patentnim zahtevima.

[0070] Sem ako je drugačije definisano, naučni i tehnički termini upotrebljeni u vezi sa antitelima opisanim ovde će imati značenje koje je opšte razumljivo od strane onih koji imaju uobičajene veštine u struci. Nadalje, sem ako nije zahtevano drugačije kontekstom, pojedinačni termini će uključivati i množinu i pojmovi u množini mogu da se odnose na jedninu. Uopšteno, nomenklature upotrebljene u vezi sa, i njihove tehnike, ćelijom i ćelijskom i tkivnom kulturom, molekularnom biologijom i proteinskom i oligo ili polinukleotidnom hemijom i hibridizacijom opisanim ovde su one koje su opšte poznate u struci.

[0071] Standardne tehnike su korišćene za rekombinaciju DNK, oligonukleotidne sintheze,i kulture tkiva i transfekciju (na primer, elektroporacija, lipofekcija). Enimske reakcije i prečišćavajuće tehnike su izvedene u skladu sa specifikacijama proizvodnje ili koje su uobičajeno izvedene u struci ili ovde opisane. Prethodne tehnike i procedure su obično izvedene u skladu sa konvencionalnim metodama dobro poznatim u struci i opisane u u raznim opštim i još specifičnijim referencama koje su navedene i o njima je diskutovano u ovoj specifikaciji.

2

Videti na primer, Sambrook i al. MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001) i Ausubel i al. Current Protocols in Molecular Biology (New York: Greene Publishing Association/Wiley Interscience), 1993. Nomenklatura korišćena u vezi s tim, i laboratorijske procedure i tehnike, analitička hemija, sintetička organska hemija i medicinska i farmaceutska hemija opisane ovde su dobro poznate i u opštoj upotrebi u struci. Standardne tehnike su korišćene za hemijsku sintezu, hemijsku analizu, farmakološku pripremu, isporuku i tretman pacijenata

[0072] Sem u operativnim primerima ili ako je drugačije navedeno, svi brojčano navedene količine sastojaka ili uslova reakcije upotrebljeni ovde treba da se razumeju kao modifikovani u svim primerima terminom "otprilike."

[0073] Sa napretkom metoda molekularne biologija i rekombinantne tehnologije, moguće je proizvesti antitelo i molekule slične antitelima na rekombinantni način i time stvoriti sekvence gena koje kodiraju specifične aminokiselinske sekvence koje se nalaze u strukturi antitela. Takva antitela mogu da se naprave bilo kloniranjem sekvenci gena koji kodiraju polipeptidne nizove navedenih antitela ili direktnom sintezom pomenutih polipeptidnih nizova, sve zajedno sa sintetizovanim nizovima kako bi se formirale aktivne tetramerne strukture (H2L2) sa afinitetom za specifične epitope i antigenske determinante. Ovo je omogućilo lako pravljenje antitela koja imaju karakteristične sekvence za neutralizaciju antitela raznih vrsta i izvora.

[0074] Bez obzira na poreklo antitela, ili kako su ona rekombinacijom konstruisana, ili kako su sintetizovana, in vitro ili in vivo, korišćenjem transgenskih životinja, velikih ćelijskih laboratorijskih kultura ili komercijalne veličine, koristeći transgenske biljke ili direktnu hemijsku sintezu koristeći nežive organizme u bilo kom stadijumu procesam sva antitela imaju opštu sličnu trodimenzionalnu strukturu. Ova struktura je često data kao H2L2 i odnosi se na činjenicu da antitela obično obuhvataju dva laka (L) amino kiselinska niza i imaju 2 teška (H) amino kiselinska niza. Oba niza imaju oblasti sposobne da interaktivno deluju sa strukturalno komplementarnim ciljanim antigenom. Oblasti koje uzajamno reaguju sa metom se navode kao „varijabilna“ ili "V" oblasti i odlikuju se razlikama u amino kiselinskim sekvencama od antitela različite antigenske specifičnosti. Promenljive oblasti amino kiselinske sekvence bilo H ili L niza sadrže amino kiselinske sekvence sposobne da se specifično vezuju za antigenske mete.

[0075] Kao što je upotrebljeno ovde, termin "antigenska oblast vezivanja" se odnosi na onaj deo molekula antitela koji sadrži amino kiselinski ostatak koji reaguje sa nekim antigenom i prenosi na antitelo svoju specifičnost i afinitet za antigen. Oblast vezivanja antitela obuhvata

2

"okvir" amino kiselinskih ostataka potrebnih za održavanje odgovarajuće konformacije antigen-vezujućih ostataka.

[0076] Unutar varijabilnih oblasti H ili L nizova koje obezbeđuju oblasti antigenskog vezivanja postoje manje sekvence nazvane "hipervariabilne" zbog njihove ekstremne varijabilnosti među antitelima različite specifičnosti. Ovakve hipervarijabilne oblasti se takođe navode kao "oblasti koje determinišu komplementarnost " ili "CDR" oblast. Ove CDR oblasti važe za osnovnu specifičnost antitela za određenu antigensku determinantnu strukturu.

[0077] CDRs predstavljaju ne-kontinuirane trake amino kiselina unutar varijabilnih oblasti ali bez obzira na vrstu, na mesto ovih kritičnih amino kiselinskih sekvenci unutar varijabilne oblasti teškog i lakog niza nađeno je da imaju slične lokacije unutar amino kiselinskih sekvenci varijabilnih nizova. Svi teški i laki nizovi svih antitela imaju tri CDR oblasti i one nisu u dodiru jedne sa drugima.

[0078] Kod svih sisarskih vrsta, peptidna antitela sadrže konstantu (na primer visoko zaštićene) i promenljive oblasti, i unutar drugih, nalaze se CDRs i takozvane "okvirne oblasti" napravljene od amino kiselinskih sekvenci unutar promenljive oblasti teškog i lakog niza ali izvan CDRs.

[0079] Što se tiče antigenske determinante prepoznate od strane CDR oblasti antitela , ovo je takođe navedeno kao „epitop“. Drugim rečima, epitop se odnosi na onaj deo bilo kog molekula kojeg jedno antitelo može da prepozna i veže, jedno antitelo (odgovarajuća oblast vezivanja antitela bi mogla da se navede kao paratop).

[0080] "Antigen" je molekul ili deo molekula koje antitelo može da veže i koji su dodatno sposobni da izazovu kod životinja pravljenje antitela sposobnog da se veže za epitop tog antigena. Antigen bi mogao da ima jedan ili više epitopa. Navedena specifična reakcija označava da će antigen da reaguje na veoma selektivan način, sa svojim odgovarajućim antitelom a ne sa mnogobrojnim drugim antitelima čiji su uzročnici drugi antigeni.

[0081] Termin "antitelo" označava i čitave molekule imunoglobulina kao i delove, fragmente, peptide kao i njihove derivate kao što su, na primer, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fse, CDR oblasti, paratopi, ili bilo koji deo ili peptidna sekvenca antitela koja je sposobna da veže neki antigen ili epitop. Za antitelo se kaže da je „sposobno da vezuje“ molekul ako je sposobno da specifično reaguje sa molekulom i da ga tako veže za sebe.

[0082] Antitela obuhvataju himerna antitela, heterohimerna antitela, kaninizovana antitela, ili felinizovana antitela, kao i fragmente, delove, oblasti, peptide i njihove derivate, obezbeđene bilo kojom poznatom tehnikom, kao što su, ali se time neograničavaju: enzimsko cepanje, peptidna sinteza, ili rekombinujuće tehnike. Antitela za upotrebu u inventivnom tretmanu su sposobna za specifično vezivanje IL-31 kanina. Fragmenti ili delovi antitela mogu da nemaju Fc fragment koji postoji u celom antitelu, mogu brže da nestanu iz cirkulacije i mogu da imaju manje nespecifičnog tkiva za vezivanje u odnosu na celo antitelo. Primeri fragmenata antitela mogli bi da budu napravljeni od celih antitela metodama dobro poznatim u struci, na primer proteolitičkim cepanjem sa enzimom kao što je papain (do bi se dobili Fab fragmenti) ili pepsin (da bi se dobili F(ab’).2 fragmenti). Videti na primer, Wahl et al., 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983). Delovi antitela mogu da budu napravljeni bilo kojom gore navedenom metodom ili bi mogli da budu napravljeni ekspresijom dela rekombinujućeg molekula. Na primer, CDR oblast(i) rekombinirajućeg antitela mogu biti izolovane i subklonirane u odgovarajući ekspresioni vektor. Videti, npr., U.S. Pat. No. 6,680,053. Antitela i njihovi antigen-vezujući delovi u sledećem otkriću treba posmatrati u kontekstu njihove upotrebe u tretmanu stanja svraba kod pasa kao što je definisano u patentnim zahtevima

Klonovi 11E12, 34D03 i 19D07 Nukleotidne i amino kiselinske sekvence.

[0083] Predmetni pronalazak daje doprinos za nova monoklonalna antitela koja specifično vezuju pseći IL-31 i redukuju, inhibiraju ili neutralizuju IL-31 aktivnost kod psa i inhibiraju pSTAT signalizaciju IL-31-psa u ćelijskom testu za upotrebu u tremanu stanja svraba kod psa. U jednom ostvarenju, monoklonalno antitelo vezuje se za IL-31 kanina, sprečava vezivanje i aktivaciju njegovog ko-receptornog kompleksa koji obuhvata IL-31 receptor A (IL-31Ra)i Oncostatin-M-specifični receptor (OsmR ili IL-31Rb). Monoklonalna antitela ovog pronalaska su identifikovana ovde kao "11 E12", "34D03" i "19D07", što odgovara dodeljenom broju za njihov hibridni klon. Ovde, "11 E12", "34D03", ili "19D07" se takođe odnose na deo monoklonalnog antitela, parapota ili CDRs, koji se vezuje specifično sa IL-31 epitopom identifikovanog kao 11 E12, 34D03, ili 19D07 zbog njihove sposobnosti da vezuju 11 E12, 34D03, ili 19D07 antitela, respektivno. Neki rekombinanti, himerni, heterohimerni, kaninizirani i/ili felinizovani oblici 11 E12, 34D03 i 19D07 opisani ovde mogu da se označe istim imenom.

[0084] U jednom ostvarenju, antitelo ili njegov antigen vezujući deo koji se vezuje za pseći IL-31 za upotrebu u tretmanu prema pronalasku uključuje bar jedno od navedenog:

1

Promenljivi teški niz (VH) komplementarno definišući oblast (CDR)1 koji ima amino kiselinsku sekvencu YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1), ili NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03VH-CDR1); promenljivi teški niz CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2), ili TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); promenljivi teški niz CDR3 sa amino kiselinskom sekvencom ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VHCDR3), ARQNWVVGLAY (SEQ ID NO: 8; 19D07-VH-CDR3), ili VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VHCDR3); i varijantu koja ima tako jednu ili više zaštićenih amino kiselinskih supstitucija u bar jednoj od CDR1, CDR2, ili CDR3.

[0085] U drugom pokušaju, antitelo ili njegov antigen vezujući deo koji se vezuje za pseći IL-31 za upotrebu u tretmanu prema pronalasku uključuje bar jedno od navedenog:

Varijabilni laki niz (VL) koji obuhvata oblst koja determiniše komplementarnost (CDR) 1 sa amino kiselinskom sekvencom RASESVDNYGISFMH (SEQ ID NO: 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA (SEQ ID NO: 11; 19D07-VLCDR1), ili KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1); varijabilni laki niz CDR2 sa amino kiselinskom sekvencom RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2), GASTRES (SEQ ID NO: 14; 19D07-VL-CDR2), ili RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2); variabilni laki niz CDR3 sa amino kiselinskom sekvencom QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17; 19D07-VL-CDR3), ili QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL-CDR3); i njihovu varijantu koja ima jednu ili više zaštićenih amino kiselinskih supstitucija u bar jednom od CDR1, CDR2, ili CDR3.

[0086] U još jednom ostvarenju, antitelo za upotrebu u tretmanu prema pronalasku koje ima bar jedan varijabilni laki niz CDRs opisan iznad, može nadalje da obuhvata bar jedan od sledećih CDRs varijabilnih teških nizova:

variabilni teški niz komplementarno determinišućeg oblasti (CDR)1 sa amino kiselinskom sekvencom YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1), ili NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-VHCDR1); varijabilni teški niz CDR2 sa amino kiselinskom sekvencom WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11 E12VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2), ili TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); varijabilni teški niz CDR3 sa amino kiselinskom sekvencom ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VHCDR3),

2

ARQNWWGLAY (SEQ ID NO: 8; 19D07-VH-CDR3), ili VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VHCDR3); i njihovu varijantu koja ima jednu ili više zaštićenih amino kiselinskih supstitucija u bar jednom od CDR1, CDR2, ili CDR3.

[0087] U jednom ostvarenju, antitelo može da obuhvati bar jedno od sledećeg:

a) varijabilni laki niz koji obuhvata

b) varijabilni laki niz koji obuhvata

i

c) njihove varijante koje imaju jednu ili više zaštićenih amino kiselinskih supstitucija.

[0088] Opisana ovde, ali ne kao deo pronalaska je ćelija domaćin koja proizvodi antitelo opisano iznad.

[0089] Opisane ovde, ali ne kao deo pronalaska su nukleotidne sekvence koje kodiraju antitelo opisano iznad, kodiraju varijabilne oblasti lakih i teških nizovaa anti-IL-31 antitela ovog pronalaska. U okviru domena ovog pronalaska je i bilo koja nukleotidna sekvenca koja kodira amino kiselinsku sekvencu 11 E12, 34D03 ili 19D07 ili njene peptide.

[0090] Opisana ovde, ali ne kao deo pronalaska je izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo opisano iznad, uključujući nukleinsko kiselinsku sekvencu koja kodira bar jedno od sledećeg:

4

Varijabilni teški niz (VH) komplementarno determinišući oblast (CDR)1 sa amino kiselinskom sekvencom YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1), ili NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03VH-CDR1); varijabilni teški niz CDR2 sa amino kiselinskom sekvencom WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2), ili TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); varijabilni teški niz CDR3 sa amino kiselinskom sekvencom ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VHCDR3), ARQNWWGLAY (SEQ ID NO: 8; 19D07-VH-CDR3), ili VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VHCDR3); i njihovu varijantu koja ima jednu ili više zaštićenih amino kiselinskih supstitucija u bar jednom od CDR1, CDR2, ili CDR3.

[0091] Izolovana nukleinska kiselina opisana iznad može nadalje da obuhvata nukleinsko kiselinsku sekvencu koja kodira bar jedno od sledećeg:

Varijabilni laki (VL) niz koji sadrži komplementarno determinišući (CDR) 1 sa amino kiselinskom sekvencom RASESVDNYGISFMH (SEQ ID NO: 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA (SEQ ID NO: 11; 19D07-VLCDR1), ili KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1); varijabilni laki niz CDR2 sa amino kiselinskom sekvencom RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2), GAS-TRES (SEQ ID NO: 14; 19D07-VL-CDR2), ili RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2); varijabilni laki niz CDR3 sa amino kiselinskom sekvencom QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17; 19D07-VL-CDR3), ili QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL-CDR3); i njihovu varijantu koja ima jednu ili više zaštićenih amino kiselinskih supstitucija u bar jednom od CDR1, CDR2, ili CDR3.

[0092] Opisan ovde, ali ne kao deo pronalaska je vektor koji uključuje bar jednu nukleinsku kiselinu opisanu iznad.

[0093] Kako je genetski kod degenerisan, više od jednog kodona je moguće upotrebiti da se kodira određena amino kiselina. Koristeći genetski kod, jedna ili više nukleotidnih sekvenci mogu da se identifikuju i svaka od njih bi bila sposobna da kodira amino kiselinu. Verovatnoća da će pojedinačni oligonukleotid da konstituiše ovu XXX sekvencu može da se proceni posmatranjem frekvencije nenormalnog osnovnog uparivanja i učestalosti sa kojom jedan poseban kodon je u stvari korišćen ( da bi se kodirala posebna amino kiselina) u eukariotskim ili prokariotskim ćelijama koje izražavaju anti-IL-31 antitela ili delove. Takva "kodonska upotrebna pravila" su otkrili Lathe, i al., 183 J. Molec. Biol. 1-12 (1985). Koristeći Lateova "kodonska upotrebna pravila", jedna nukleotidna sekvenca, ili serija nukleotidnih sekvenci, sadrže teorijski "najverovatniju" nukleotidnu sekvencu sposobnu da kodira anti-IL-31 sekvence može da se identifikuje. Takođe se predviđa da antitelo koje kodira oblasti za korišćenje u ovom pronalasku može takođe da obezbedi menjanje postojećih antitela gena upotrebom standardnih molekularno bioloških tehnika čiji rezultat su varijante (agonisti) antitela i peptida opisanih ovde. Svaka varijanta obuhvata, ali se ne ograničava na delecije, adicije i supstitucije u amino kiselinskoj sekvenci anti-IL-31 antitela ili peptida.

[0094] Na primer, jednu klasu supstitucija čine konzervativno amino kiselinske supstitucije. Svaka supstitucija je takva da supstituiše datu amino kiselinu u anti-IL-31 peptidnom antitelu sa drugom amino kiselinom sličnih karakteristika. Obično zaštitne supstitucije su zamene, jedna za drugu, među alifatičnim kiselinama Ala, Val, Leu i Ile; unutrašnja promena hidroksilnih ostataka Ser i Thr, izmena kiselih ostataka Asp i Glu, supstitucija između amidnih ostataka Asn i Gin, izmena baznih ostataka Lys i Arg, zamena aromatičnih ostataka Phe, Tyr i njima sličnim. Uputstvo koje se odnosi na to koja amino kiselinska promena je verovatno fenotipski nema se nalazi u Bowie i al., 247 Science 1306-10 (1990).

[0095] Varijanta ili agonist anti-IL-31 antitela ili peptida može da bude potpuno funkcionalan ili može da mu nedostaje funkcionalnost u jednoj ili više aktivnosti. Potpuno funkcionalna varijanta obično sadrži samo konzervativne varijacije ili varijacije u nekritičnim ostacima ili nekritičnim oblastima. Funkcionalna varijanta može da sadrži i supstituciju sličnih amino kiselina što ima za rezultat odsustvo promene ili statistički beznačajnu promenu u funkciji. Alternativno, svaka supstitucija može pozitivno ili negativno da deluje na funkciju u nekom stepenu. Nefunkcionalne varijante,obično sadrže jednu ili više nezaštićenih supstitucija amino kiselina, delecije, umetanja, inverzije ili skraćivanje ili supstituciju, umetanje, inverziju, ili delecije u kritičnom ostatku ili kritičnoj oblasti.

[0096] Amino kiseline koje su suštinske za funkciju mogu da se identifikuju metodama poznatim u struci, kao što su upravljanje mestom mutageneze ili alanin-skeniranje mutageneze. Cunningham i al., 244 Science 1081-85 (1989). Skeniranje mutageneze uvodi pojedinačne alanin mutacije u svaki ostatak u u molekulu. Mutirani molekul koji je rezultat toga je onda testiran na biološku aktivnost kao što je epitopno vezivanje ili in vitro ADCC activnosti. Mesta koja su kritična za ligand-receptorska vezivanja mogu se odredi strukturalnom analizom kao što je kristalografija, nuklearna magnetna rezonanca ili označavanjem fotoafiniteta Smith i al., 224 J. Mol. Biol.899-904 (1992); de Vos i al., 255 Science 306-12 (1992).

[0097] Pored toga, polipeptidi često sadrže amino kiseline koje su drugačije od „dvadeset amino kiselina koje se normalno pojavljuju“. Nadalje mnoge amino kiseline uključujući i poslednju amino kiselinu mogu da budu modifikovane prirodnim procesima, kao što su procesiranje i druge postranslacione modifikacije ili hemijskim modifikacionim tehnikama dobro poznatim u struci. Poznate modifikacije obuhvataju, ali se na njima ne ograničavaju, acetilovanje, acilovanje ADP-ribosilaciju, amidovanje, kovalentno vezivanje flavina, kovalentno vezivanje hemoproteina, kovalentno vezivanje nukleotida ili derivata nukleotida, kovalentno vezivanje lipida ili derivata lipida, kovalentno vezivanje fosfotidilinositola, ukršteno spajanje, ciklizaciju, formiranje disulfidne veze, demetilaciju, formiranje kovalentnih ukrštanja, formiranje cistina, formiranje piroglutamata formilaciju, gama karboksilaciju, glikozilaciju, formiranje GPI sidra, hidroksilaciju, jodinacija, metilacija, miristoilacija, oksidacija, protolitično procesiranje, fosforilacija, fenilacija, racemizacija, selenoilacija, sulfacija, transferaza-RNK posredovane adicije amino kiselina na proteine kao što su arginilacija i ubikvitinacija.

[0098] Ove modifikacije su dobro poznate stručnjacima u struci i opisane su detaljno u naučnoj literaturi. Neke posebno poznate modifikacije, glikozilacija, lipidno vezivanje, sulfacija, gamakarboksilacija glutaminsko kiselinskih ostataka, hidroksilacija i ADP ribozilacija, na primer, su opisane u najbazičnijim tekstovima, kao što su Proteinska struktura i molekularne osobine (2nd ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman & Co., NY, 1993). Mnogi časopisi su dostupni o ovom predmetu kao što je od Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, ed., Academic Press, NY, 1983); Seifter i al.182 Meth. Enzymol. 626-46 (1990); i Rattan et al.663 Ann. NY Acad. Sci.48-62 (1992).

[0099] Slično, adicija i supstitucija u amino kiselinskoj sekvenci kao i varijacije, i modifikacije upravo opisane se mogu podjednako upotrebiti na amino kiselinsku sekvencu IL-31 antigena i/ili epitopa ili njihovih peptida. Kao što je pomenuto iznad, gensko kodiranje monoklonalnog antitela u skladu sa ovim pronalaskom je specijalno delotvorno u prepoznavanju IL-31.

Derivati antitela

[0100] U domen ovog pronalaska su uključena i derivirana antitela. "Derivat" jednog antitela sadrži dodatne hemijske entitete koji normalno nisu deo proteina. Kovalentne modifikacije proteina su uključene u domen ovog pronalaska. Ovakve modifikacoije bi mogle da uvode u molekul reakcijom ciljanih amino kiselinskih ostataka antitela sa organski deriviranim agensom koji je sposoban da reaguje sa odabranom bočnim nizovima terminalnih ostataka. Na primer, derivatizacija sa bifunkcionalnim agensima, dobro poznata u struci, je korisna za unakrsno vezivanje antitela ili fragmenta sa potpornom osnovom nerastvorljivom u vodi ili sa drugim makromolekularnim prenosiocima.

[0101] Derivati takođe obuhvataju radioktivno obeležena monoklonalna tela koja su obeležena. Na primer, sa radioaktivnim jodom (<125>I,<131>I), ugljenikom (<14>C), sumporom (<35>S), indijumom (<111>In), tricijumom (<3>H) ili sličnim; konjugati monoklonalnih antitela sa biotinom ili avidinom, sa enzimima, kao što su ren peroksidaza, alkalna fosfataza, beta-D-galaktozidaza, glukoza oksidaza, glukoamilaza, karboksilno kiselinski anhidraza, acetilholinesteraza, lizozim, maleat dehidrogenaza ili glukoza 6-fosfat dehidrogenaza; kao i konjugati monoklonalnih antitela sa bioluminiscentim agensima (kao što je luciferaza), hemoluminiscentnim agensima (kao što je akridin ester) ili fluorescentnim agensima (kao što je fikobiliproteini).

[0102] Drugo derivirano bifunkcionalno antitelo je bispecifično antitelo, generisano kombinacijom delova dva odvojena antitela koja prepoznaju dve različite antigenske grupe. Ovo bi moglo da bude izvedeno unakrsnim vezivanjem ili rekombinantnim tehnikama. Dodatno, polovine mogu da se dodaju antitelu ili njihovim delovima da se produži polu-život in vivo (na primer produživanje vremena raščišćavanja iz krvnog toka). Ove tehnike uključuju, na primer, dodavanje PEG udela (takođe nazvano pegilacija), i dobro su poznate u struci. Videti U.S. Patent. Appl. Pub. No.20030031671.

Rekombinantna ekspresija antitela

[0103] Nukleinske kiseline koje kodiraju monoklonalno antitelo subjekta su direktno uvedene u ćeliju domaćina i ćelija je inkubirana pod uslovima dovoljnim da indukuju ekspresiju kodiranog antitela. Pošto su subjektove nukleinske kiseline uvedene u ćeliju, ćelija je obično inkubirana, normalno na 37°C, ponekad pod selekcijom, u periodu oko 1-24 sata da bi se omogućila ekspresija antitela. Antitelo se luči u supernatant u kojem ćelija raste.

[0104] Tradicionalno, monoklonalna antitela su pravljena kao prirodni molekuli u hibridnim linijama glodara. Kao dodatak toj tehnici, ovaj opis daje doprinos ekspresiji rekombinirajuće DNK monoklonalnih antitela. Ovo omogućava pravljenje kaninizovanih antitela kao i spektar derivata antitela i proteina fuzije u vrstama domaćinima koje su odabrane.

[0105] Nukleinske kiselinske sekvence koje kodiraju najmanje jedno anti-IL-31 antitelo, deo ili polipeptid mogu da budu rekombinirane sa DNK vektorom u skladu sa konvencionalnim tehnikama, uključujući lepljivi kraj i/ili tupe krajeve za ligaciju, restrikciju enzimatskog varenja da bi se obezbedili odgovarajući krajevi, ispunivši kohezivne krajeve kako treba, alkalin fosfatazni tretman da se izbegne neželjeno povezivanje i ligacija sa odgovarajućim ligazama. Tehnike za za ovakve manipulacije su prikazane, na primer kod Maniatis i al., MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 and 1989), i Ausubel i al.1993 supra, mogu da se koriste za konstruisanje sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju molekule monoklonalnih antitela ili oblats njegovog antigena vezivanja.

[0106] Za molekul nukleinske kiseline kao što je DNK, se kaže da je "sposoban da izrazi" polipeptid ako sadrži nukleotidne sekvence koje sadrže kopirane i prevedene regulativne informacije i takve sekvence su „oprativno vezane“ za nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptide. Operativno vezivanje je vezivanje u kojem regulatorne DNK sekvence i DNK sekvenca koje treba da se izraze su povezane na takav način da omogućavaju genski izraz anti-IL-31 peptida ili delova antitela u obnovljivim količinama. Precizna priroda regulatornih oblasti potrebnih za gensku ekspresiju može da varira od organizma do organizma, kao što je već poznato u odgovarajućoj struci. Videti, na primer Sambrook i al., 2001 supra; Ausubel i al., 1993 supra.

[0107] Shodno tome, opisana je ekspresija anti-IL-31 antitela ili peptida u prokariotskim i u eukariotskim ćelijma. Poželjni domaćini uključuju bakterijske ili eukariotske domaćine koji obuhvataju ćelije bakterija, kvasca, insekata, gljiva, ptica ili sisara in vivo ili in situ ili ćelije domaćine sisara, insekata, ptica ili kvasca. Ćelija ili tkivo sisara može da bude od ljudi, primata, hrčka, zeca, glodara, krave, svinje, ovce, konje, koze, psa ili mačke, ali i ćelije drugih sisara mogu da se upotrebe.

[0108] Uvedena nukleotidna sekvenca može biti inkorporirana u plazmid ili virusni vektor koji su sposobni da se repliciraju samostalno u recipientu domaćina. Bilo koji od veoma različitih vektora može da bude upotrebljen u ovu svrhu. Videti, na primer, Ausubel i al., 1993 supra. Faktori važnosti u izboru posebnog plazmida ili viralnog vektora obuhvataju: lakoća sa kojom ćelije recipienti koje sadrže vektor mogu da budu prepoznate i izabrane od drugih ćelija recipienata koje ne sadrže vektor; broja kopija vektora koje su poželjne u određenom domaćinu; i da li je poželjno da se "prenese" vektor između ćelija domaćina različitih vrsta.

[0109] Primer prokariotskih vektora poznatih u struci uključuje plazmide kao što su oni sposobni za replikaciju u E.coli (kao što je, na primer, pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, .pi.VX). Takvi plazmidi su, na primer, objavljeni kod Such Maniatis i al., 1989 supra; Ausubel i al, 1993 supra. Bacilus plazmidi obuhvataju pC194, pC221, pT127, itd. Takvi plazmidi su navedeni kod Gryczan, u THE MOLEC. BIO. OF THE BACILLI 307-329 (Academic Press, NY, 1982). Poželjni streptomicetni plazmidi obuhvataju pIJ101 (Kendall i al., 169 J. Bacteriol.

4177-83 (1987)), i Streptomicetne bakteriofage kao što su .phi.C31 (Chater i al., in SIXTH INT’L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO.45-54 (Akademiai Kaido, Budapest, Hungary 1986). Pseudomonas plazmidi su prikazani kod John i al., 8 Rev. Infect. Dis.693-704 (1986); Izaki, 33 Jpn. J. Bacteriol.729-42 (1978); i Ausubel i al., 1993 supra.

[0110] Alternativno, elementi genske ekspresije korisni za ekspresiju cDNK koji kodira anti-IL-31 antitela ili peptida obuhvataju, ali se ne ograničavaju na viralnu transkripciju promotera i njihovih pojačavajućih elementa, kao što je SV40 rani promoter (Okayama i al., 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)), Rous sarkom virus LTR (Gorman et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 6777 (1982)), i Molonej glodari leukemija virus Ltenglish fraeeR (Grosschedl i al., 41 Cell 885 (1985)); (b) splejs oblasti i mesta poliadenilace kao što su ona dobijena od SV40 kasne oblasti (Okayarea i al., 1983), i (c) mesta poliadenilacija kao što je u SV40 (Okayama i al., 1983).

[0111] Imunoglobulin cDNK geni mogu da se izraze kao što su opisani kod Weidle i al., 51 Gene 21 (1987), koristeći elemente ekspresije SV40 ranih promotera i njihovih pojačivača, mišji imunoglobulin H niz promotera pojačivača, SV40 kasna oblast mRNK splajsovanja, zečji S-globin među sekvenca, imunoglobulin i zečji S-globin poliadenilacijska mesta, i SV40 poliadenilacijski elementi.

[0112] Za imunoglobulin gena koji obuhvataju deo cDNK, deo genomskih DNK (Whittle i al., 1 Protein Engin.499 (1987)), transcripcionalni promoter može da bude ljudski citomegalovirus, promoter pojačivač može da bude citomegalovirus i mišji/ljudski imunoglobulin, i splajsovani mRNK i poliadenilacione oblasti mogu da budu prirodni hromozomalne imunoglobulin sekvence.

[0113] Za ekspresiju cDNK gena u ćelijama glodara, transkripcionalni promoter može biti virusna LTR sekvenca, transkripcionalni promoter pojačivači mogu biti jedan ili oba, mišji imunoglobulin ski teški niz pojačivač i virusni LTR pojačivač, splajsovana oblast može sadržati intron veći od 31 bp, i poliadenilacione i transkripcione završne mogu biti izvedene od prirodnih hromozomalnih sekvenci koje odgovaraju sintetizovanom imunoglobulinskom nizu. cDNK sekvence koje kodiraju druge proteine mogu biti kombinovani sa iznad navedenim ekspresionim elementima da bi se ostvarila ekspresija proteina u ćelijama sisara.

[0114] Svaki fuzionisani gen može da bude sastavljen ili ubačen u jedan vektor ekspresije. Ćelije recipijenti sposobni za izražavanje himeričnog imunoglobulinskog niza produkta gena

4

se zatim transfektuju pojedinačno sa anti-IL-31 peptida ili himeričnog H ili himeričnog L nizakodirajući gen, ili se zajedno transfektuju sa himeričnim H i himeričkim L nizom gena. Transfektovane ćelije recipijenta su kultivisane u uslovima koji omogućavaju ekspresiju inkorporiranih gena i takvi imunoglobulinski nizovi ili cela antitela ili fragmenti se izdvajaju iz kulture.

[0115] Fuzionisani geni koji kodiraju anti-IL-31 peptid ili himerični H i L niz, ili njihove delove mogu biti skupljeni u razdvojene ekspresione vektore i oni su onda upotrebljeni da zajedno transfektuju recipientske ćelije. Alternativno fuzionisani geni koji kodiraju himerične H i L nizove mogu da budu skupljeni na istom vektoru ekspresije.

[0116] Za transfekciju vektorskih ekspresija i za produkciju himeričnih antitela, recipientska ćelija po poreklu bi mogla da bude ćelija mijeloma. Ćelije meiloma mogu da sintetizuju, okupe i sekretuju imunoglobuline koji su kodirani transfekcijom imuunoglobulin gena i poseduju mehanizam za glikoilizu imunoglobulina. Mieloma ćelije bi mogle da budu uzgajane u kulturi ili u šupljini trbušne maramice miševa, gde se izlučeni imunoglobulin može dobiti iz ascit tečnosti. Druge željene ćelije recipienti uključuju limfocitne ćelije kao što su B limfociti ljudski ili neljudski, hibridne ćelije ljudske ili neljudske, ili heterohibridne ćelije međuvrsta.

[0117] Ekspresioni vektor koji nosi himerični ili kaninizovano antitelo konstrukt ili anti-IL-31 polipeptid može da se ubaci u odgovarajuću ćeliju domaćina na neki od raznih poželjnih načina, uključujući biohemijske načine kao što su transformacija, transfekcija, konjukcija, protoplast fuzija, kalcijum fosfatna precipitacija, i aplikacija sa polikacijom kao što su dietilaminoetil (DEAE) dekstran, i takvo mehanićčko sredstvo kao elektroporacija, direktna mikro ubrizgavanja ili mikroprojektilno bombardovanje. Johnston i al., 240 Science 1538 (1988).

[0118] Kvasac može da obezbedi supstancijalne prednosti u odnosu na bakteriju za produkciju imunoglobulina H i L niza. Kvasac donosi posttranslacione peptidne modifikacije uključujući glikolizaciju. Broj rekombinirajućih DNK strategija sada postoji i koriste jake promoter sekvence i veliki broj plazmida koji mogu da se koriste za produkciju željenih proteina u kvascu. Kvasac prepoznaje lider sekvence kloniranih genetskih produkata sisara i luče peptide koji nose lider sekvence /na primer prepeptide) Hitzman i al., 11th Int’l Conference on Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, France, 1982).

[0119] Kvasni genski sistemi ekspresije mogu da budu rutinski proceneni za nivo produkcije, sekrecije i stabilnosti anti-IL-31 peptida, antitela i sakupljeni od glodara i himeričnog, heterohimeričnog, kaninizovanog ili felinizovanog antitela, njihovih fragmenata i njihovih oblasti. Bilo koja od serija kvasnih genskih sistema ekspresije koja inkorporira promoterske terminalne elemente od aktivno izraženog genskog kodiranja za glikolizne enzime proizvedene u velikom broju kad je kvasac uzgajan u sredini bogatoj glukozom, može da bude upotrebljena. Poznati glikolizni geni mogu takođe da obezbede veoma efikasnu transkripcionu kontroolu signala. Na primer, promoterni i terminalni signali gena fosfoglicerat kinaze (PGK) se mogu upotrebiti. Brojni pristupi bi mogli da budu preduzeti za evaluaciju optimalne ekspresije plazmida za ekspresiju kloniranog imunoglobulina cDNAs u kvascu. Videti Vol. II DNA Cloning, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK 1985).

[0120] Bakterijski izolat se takođe može koristi kao domaćin za produkciju molekula antitela ili peptida. Plazmid vektori koji sadrže replikantnu i kontrolnu sekvencu koje su poreklom iz kompatibilnih vrsta sa ćelijom domaćinom su upotrebljeni u vezi sa ovim bakterijskim domaćinima. Vektori nose replikaciono mesto, kao i specifične gene koji su sposobni da obezbede fenotipsku selekciju transformisnih ćelija. Brojni pristupi mogu da se preduzmu za evaluaciju ekspresije plazmida za produkciju murinskih, himeričnih, heterohimeričnih, kaninizovanih ili felinozovanih antitela, fragmenata i oblasti ili nizova antitela koji su kodirani kloniranim imunoglobulinom cDNK u bakteriji (videti Glover, 1985 supra;

Ausubel, 1993 supra; Sambrook, 2001 supra; Colligan i al., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, NY (1994-2001); Colligan i al., eds. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001).

[0121] Ćelije domaćini sisara mogu da se uzgajaju in vitro ili in vivo. Ćelije sisara obezbeđuju post-translacione modifikacije proteinskih molekula immunoglobulina uključujući uklanjanje vodećeg peptida, ukrštanje i sastavljanje H i L niza, glikozilaciju molekula antitela, i sekreciju funkcionalnih proteina antitela.

[0122] Ćelije sisara koje bi mogle da budu korisne kao domaćini za pravljenje antitelo proteina pored ćelija limfnih organa opisanih iznad, obuhvataju ćelije koje su po poreklu fibroblasti, kao što je Vero (ATCC CRL 81) ili CHO-K1 (ATCC CRL 61) ćelije.

[0123] Mnogi vektorski sistemi su dostupni za ekspresiju kloniranih anti-IL-31 peptida H i L nizova gena u ćelijama sisara (videti Glover, 1985 supra). Različiti pristupi mogu da se slede da bi se dobila kompletna H2L2 antitela. Moguće je da se zajedno izraze H i L nizovi u istim ćelijama da bi se dostigla međućelijska asocijacija i povezivanje H i L niza u kompletnim tetrameričkim H2L2 antitelima i/illi anti-IL-31 peptidima. Zajednička ekspresija može da se desi korišćenjem istog ili različitog plazmida u istom domaćinu. Geni H i L niza i/ili anti-IL-31 peptida mogu da budu postavljeni u istom plazmidu, a onda su transfektovani u ćelije, tako selektujući direktno za ćelije koje izrašavaju obe vrste niza. Alternativno, ćelije mogu da budu trasfektovane prvo sa plazmidom koji kodira jedan niz, na primer L niz, za kojim sledi transfekcija rezultirajuće ćelijske linije plazmidom s H nizom, koji sadrži drugi odabrani marker. Ćelijske linije koje stvaraju anti-IL-31 peptide i/ili H2L2 molekule bilo kojom putanjom mogu da budu transfektovane sa plazmidima koji kodiraju dodatne kopije peptida H, L, ili H plus L niza zajedno sa dodatno odabranim markerima da se stvore ćelijske linije sa ojačanim svojstvima, kao što je veća produktivnost sastavljenih H2L2 molekula antitela ili pojačana stabilnost transfektovanih ćelijskih linija.

[0124] Za dugotrajnu, visoko produktivnu proizvodnju rekombinantnih antitela, može se koristiti stabilna ekspresija. Na primer, ćelijske linije, koje stabilno izražavaju molekule antitela mogu da se prave inžinjeringom. Radije nego da se koristi vektorska ekspresija koja ima virusno poreklo repliciranja, ćelije domaćini mogu da budu transformirane sa kasetama imunoglobulin ekspresije i odabranim markerima. Nakon uvođenja strane DNK, ćelije napravljene inžinjeringom mogu da rastu za 1-2 dana i obogaćenoj sredini, i da onda budu prebačene u odabranu sredinu. Odabrani marker u rekombinujućem plazmidu pojačava otpornost na selekciju, i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u hromozomu i da rastu do fokusiranih oblika koji dalje mogu da budu klonirani i da se prošire u ćelijske linije. Ovakav inžinjering ćelijskih linija bi mogao da bude posebno koristan u otkrivanju i proceni jedinjenja/sastojaka koji deluju zajedno direktno i indirektno sa molekulom antitela.

[0125] Jednom kad je antitelo napravljeno, može da bude prečišćeno nekom od metoda od onih poznatih u struci za prečišćavanje molekula imunoglobulina, na primer hromatografijom (na primer, jonska razmena, afinitet, posebno afinitet za specifični antigen posle Proteina A, i hromatografija veličine kolona), centrifugiranje, diferencionalna rastvorljivost, ili, bilo kojom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Antitela se mogu izlučiti iz ćelija u medijum kulture i prikupljena iz medijuma kulture.

Farmaceutske primene

[0126] Predmetni pronalazak se odnosi na anti-pseći IL-31 antitela ili njegov antigen-vezujući deo koji se vezuje za pseći IL-31 i redukuje, inhibira ili neutralizuje IL-31 aktivnost kod psa i inhibira pSTAT signalizaciju posredovanu sa IL-31 u ćelijskom testu za upotrebu u tretmanu stanja svraba kod pasa. Još specifičnije, pronalazak dodatno obezbeđuje farmaceutsku

4

kompoziciju koja sadrži anti-pseće IL-31 antitelo ili njegov antigen-vezujuće deo kao što je definisano u patentnim zahetvima i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač za upotrebu u tretmanu prema pronalasku. Antitelo može da bude himerično, heterohimerično ili kaninizovano antitelo. Intaktni imunoglobulini ili njihovi vezujući fragmenti, kao što je Fab, su predviđeni. Antitela i farmaceutske kompozicije za upotrebu u tretmanu prema pronalasku su korisna za parenteralno davanje, na primer podkožno, intramuskularno ili intravenozno.

[0127] Anti-IL-31 antitela za upotrebu prema ovom pronalasku mogu da se administriraju bilo kao individualni terapijski agens ili u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima. Mogu da se administriraju sami, ali su uobičajeno administrirani sa farmaceutskim prenosiocima odabranim na osnovu odabranog puta administriranja i standardne farmaceutske prakse.

[0128] Administracija antitela navedenih ovde mogla bi da se ostvari bilo kojim željenim načinom, uključujući i parenteralno ubrizgavanje (kao što su intraperitonealno, podkožno, intramuskularno ubrizgavanje) oralno ili topična administracijom antitela (tipično nošeni u farmaceutskim formulacijama) na neku površinu respiratornog puta. Topikalna administracija na površinu respiratornog puta može da se ostvari intranazalnom administracijom (na primer, korišćenjem pipete, štapića, inhalatora). Topička administracija antitela na površinu respiratornog puta može da se ostvari inhalatornom administracijom, ko što je stvaranje čestica za udisanje neke farmaceutske formulacije (uključujući i čvrste i tečne četice) koje sadrže antitela kao aerosolnu suspenziju, tako da subjekat inhalira četice koje mogu da se udišu. Metode i aparati za administriranje čestica za udisanje farmaceutskih formulacija su dobro poznati i bilo koja konvencionalna tehnika može da bude upotrebljena. Oralna administracija može biti, na primer, u obliku tečnosti ili čvrtse formulacije za gutanje.

[0129] U nekim poželjnim ostvarenjima, antitela se administriraju parenteralnim ubrizgavanjem. Za ovu administraciju, anti-IL-31 antitela ili peptidi mogu da budu u obliku rastvora, suspenzije, emulzije ili liofilizovanog praška zajedno sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim prenosnikom. Na primer prenosnik može da bude rastvor antitela ili njihov koktel rastvoren u prihvatljivom prenosniku, kao što je voda, slani rastvor, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze, trehaloze ili saharoze, ili 5% serum albumina, 0.4% slani rastvor, 0.3% glicin i tome slično. Lipozomi i nevodeni prenosnici kao što su stabilna ulja mogu takođe da se koriste. Ovi rastvori su sterilni i obično bez čvrtih čestica. Ovi sastavi (oblici) moogu da budu sterilisani konvencionalnim, dobro poznatim tehnikama za sterilizaciju. Formulacija može da sadrži farmaceutski prihvatljivu pomoćnu supstancu kao što se zahteva za približne fiziološke uslove kao što su ph podešivači i puferski agensi, agensi podešavanja toksičnosti i tome slično, na primer natrijum acetat, natrijum hlorid, kalijum hlorid, kalcijum hlorid, natrijum laktat, itd. Koncentracija antitela u ovim formulacijama može široko da varira, na primer od bar oko 0.5%, obično je od 1 % do 15% ili 20% po težini i biće odabrani pre svega na osnovu zapremine fluida, viskoznosti i td, u skladu sa posebnim načinom odabranog administriranja. Prenosnik ili liofilozovan prah može da sadrži dodatke koji održavaju izotoničnost (na primer natrijum hlorid, manitol) i hemijsku stabilnost (na primer, puferi i konzervansi). Formulacija je sterilisana uobičajenom tehnikom.

[0130] Ove metode za pripremu parenteralno administrirajućih sastava biće poznate ili jasne stručnjacima u struci i opisane su detaljnije u, na primer, REMINGTON’S PHARMA. SCI. (15th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980).

[0131] Antitela za upotrebu u tretmanu prema pronalasku mogu se liofilizovati za skladištenje i rekonstituisati u odgovarajućem prenosniku pre upotrebe. Ova tehnika se pokazala efektivna sa konvencionalnim imunoglobulinom. Bilo koja poželjna liofilizacija i rekonstituciona tehnika može da se upotrebi. Treba znati u struci da lipofilizacija i rekonstitucija mogu da dovedu do različitog stepena smanjenja aktivnosti antitela i da bi onda to trebalo kompenzovati.

[0132] Formulacije koje sadrže ova antitela ili njihov koktel mogu da se administriraju za prevenciju od ponovnog razboljevanja i/ili terapeutske tretmane za postojeće bolesti. Odgovarajući farmaceutski prenosioci su opisani u najnovijem REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, standardni referentni tekst u ovoj oblasti.

[0133] U terapeutskoj primeni, formulacije se daju subjektu koji već pati od neke bolesti, u količini dovoljnoj da izleči ili da bar delimično zaustavi ili ublaži bolest i njene komplikacije. Količina adekvatna da ovo ispuni je definisana kao „terapeutski efektivna doza“ ili terapeutski efektivna količina“. Efektivna količina za ovu upotrebu će zavisiti od ozbiljnosti bolesti i opšteg stanja subjektovog imuno sistema, ali je uobičajeno ranga oko 0.1 mg antitela po kg telesne težine do 10 mg antitela po kg telesne težine, poželjno oko 0.3 mg antitela po kg telesne težine do 5 mg antitela po kg telesne težine. U pogledu minimalizacije sposljašnjih supstanci i smanjene verovatnoće odbacivanja „strane supstance“ koji su postignuti ovim antitelima sličnim psećim za upotrebu u tretmanu prema pronalasku, moglo bi da bude moguće administriranje značajnog viška ovih antitela.

4

[0134] Administrirana doza će naravno da veoma zavisi od poznatih faktora kao što su farmakodinamični faktori posebnog agensa, i njhovog načina i putanje administriranja, godina, zdravlja, težine primaoca; proirode i izraženosti simptoma, vrste paralelnog tretmana, učestalosti tretmana i željenog efekta.

[0135] Kao neogravajući primer, tretman IL-31-vezanih patologija kod pasa može se obezbediti kao doza od dva davanja nedeljno ili jedanput mesečno anti-IL-31 antitela za uportebu u tretmanu prema ovom pronalasku u obimu doziranja opisanom iznad.

[0136] Primer antitela kanina za terapeutsku upotrebu čine antitela, i njihovi fragmenti, oblasti i derivati sa velikim afinitetom ((može biti i visoka aditivnost) koji imaju jaku in vivo anti-IL-31 aktivnost, u skladu sa ovim pronalaskom.

[0137] Pojedinačna ili višestruka administracija formulacija bi mogla da se ostvari sa dozama i obrascima koji su izabrani od strane veterinara. U svakom slučaju, farmaceutske formulacije bi mogle da obezbede kvantitet antitela ovog pronalaska koji je dovoljan da se efektivno tretira subjekat.

Dijagnostičke primene

[0138] Opisana ovde ali ne kao deo pronalaska su anti-IL-31 antitela i peptidi za upotrebu u dijagnostičkim metodama za utvrđivanje IL-31 kod domaćih ljubimaca za koje se zna ili se sumnja da imaju stanje svraba i/ili alergije.

[0139] Anti-IL-31 antitela i/ili peptidi su korisni za imunotestove koji detektuju ili kvantifikuju IL-31, ili anti-IL-31 antitela, u uzorku. Imunotest za IL-31 obično obuhvata inkubaciju kliničkog ili biološkog uzorka sa merljivo označenim visokim afinitetom (ili visokom aditivnošću) za anti-IL-31 antitelo ili polipeptid ovog pronalaska sposobnim da se selektivno vezuju za IL-31, i detekciju obeleženih peptida ili antitela koji su vezani u uzorku. Razne kliničke procedure testiranja su poznate u struci. Videti, na primer, IMMUNOASSAYS FOR THE 80’S (Voller i al., eds., Univ. Park, 1981). Takvi uzorci uključuju biopsiju tkiva, krv, serum, uzorak stolice, ili tečnosti uzete od životinjskih subjekata i zatim podvrgavanje ELISA analizi kako je ispod opisano.

[0140] Vezivanje antigena za antitelo može biti detektovano detektovano bez upotrebe čvrste osnove. Na primer vezivanje antigena za antitelo može da se detektuje u tečnom formatu.

4

[0141] Anti-IL-31 antitelo ili polipeptid mogu, na primer, da budu fiksirani za nitrocelulozu ili nekum drugu čvrstu supstancu, koja je sposobna da imobilizuje ćelije, čestice ćelija ili rastvorljive proteine. Osnova onda može da bude oprana sa poželjnim puferima a tome sledi tretman sa detektibilnim obeleženim IL-31-specifičnim peptidom ili antitelom. Čvrsta faza osnove onda može da bude oprana sa puferom po drugi put da se odstrane nevezani peptidi ili antitela. Količina vezanih oznaka na čvrstoj osnovi može onda da bude detektovana poznatim metodološkim koracima.

[0142] "Čvrsta faza osnove" ili "prenosnici" odnosi se na bilo koju osnovu sposobnu da veže peptide, antigene, ili antitela. Dobro poznate osnove ili prenosnici uključuju staklo, polistirene polipropilene, polietilene, polivinilidenfluoride (PVDF), dekstran, najlon, amilaze, prirodnu ili modifikovanu celulozu, poliakrilamide, agaroze, i magnetit. Priroda prenosioca može biti rastvorljiva do nekog obima ili nerastvorljivi. Materijal osnove može da ima virtuelno bilo kakvu strukturalnu konfiguraciju sve dok je povezani molekul sposoban da se vezuje za IL-31 ili neko anti-IL-31 antitelo. Tako, konfiguracija osnove može da bude sferična, kao u perli, ili cilindrična kao kod epruvete ili kao spoljašnja strana štapa. Alternativno, površina može da bude ravna, kao list, kao posuda za kulturu, kao test traka itd. Na primer, osnove mogu da sadrže polistirenske perle. Stručnjaci u struci će znati mnoge druge poželjne prenosnike za vezivanje antitela, peptida ili antigena ili mogu da konstatuju iste rutinskim eksperimentima.

[0143] Dobro poznati metodski koraci mogu da odrede aktivnost vezivanja date šarže anti-IL-31 peptida i/ili antitela. Stručnjaci mogu lako da odrede operativne i optimalne uslove ispitivanja rutinskim eksperimentima.

[0144] Detektibino označavanje IL-31-specifičnog peptida i/ili antitela može da se ostvari vezivanjem za neki enzim za upotrebu u jednom enzimskom imunotestu (EIA), ili za enzim vezan imunosorbentni test (ELISA). Vezani enzim reaguje sa izloženim supstartom da bi stvorili hemijsku sredinu koja može da bude detektovana , na primer, spectrofotometrijom, fluorometrijom vizuelno. Enzimi koji mogu da se koriste za detektibilno označavanje IL-31-specifičnih antitela ovog pronalaska obuhvataju, ali nisu ogranićeni na njih maleat dehidrogenasa, stafilokokal nukleaza, delta-5-steroid izomeraza, kvasna alkoholna dehidrogenaza, alfa-glicerofosfat dehidrogenaza, trioza fosfat izomeraza, ren peroksidaza, alkalna fosfataza, asparaginaza, glucozna oksidaza, beta-galaktozidaza, ribonukleaza, ureaza, katalaza, glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, glukoamilaza i acetilholinesteraza.

4

[0145] Radioaktivnim obeležavanjem IL-31-specifičnog antitela, moguće je detektovati IL-31 korišćenjem radioimunotesta (RIA). Videti Work i al., LAB. TECHNIQUES & BIOCHEM.1 N MOLEC. Bio. (No. Holland Pub. Co., NY, 1978). Radioaktivni izotop bi mogao da bude detektovan sredstvima kao što je gama brojać ili scintilator ili autoradiografijom. Izotopi koji su posebno korisni za svrhu ovog pronalaska obuhvataju: 3H, 125I, 131I, 35S, 14C, i 125I.

[0146] Takođe je moguće da se označe IL-31-specifiča antitela sa fluorescentim jedinjenjem. Kad je fluorescentno obeleženo antitelo izloženo svetlosti odgovarajuće talasne dužine, njegovo prisustvo može da bude detektovano zahvaljujući fluorescenciji. Među najčešće korišćenim fluorescentnim jedinjenjima za obeleživanje su fluorescein izotiocijanat, rodamine, fikoeritrin, fikocijanin, alofikocijanin, o-ftalaldehid i fluoreskamin.

[0147] IL-31-specifična antitela bi takođe mogla da budu označena upotrebom fluoescentnoemitujućih metala kao što je 125Eu, ili drugih iz lantanoidne serije. Ovi metali su mogu vezati za IL-31-specifična antitela koristeći metalne helatne grupe kao što je pentetinska kiselina (DTPA) ili etilen diamin tetra sirćetna kiselina (EDTA).

[0148] IL-31-specifična antitela takođe mogu da budu označena za detekciju vezivanjem za hemiluminiscentno jedinjenje. Prisustvo označenog antitela je onda određeno prisustvom luminiscencije koja se pojavljuje tokom hemijske reakcije. Primeri korisnih hemiluminescentnih jedinjenja za označavanje su luminol, izoluminol, teromatični akridinium ester, imidazol, akridinium so, i oksalat ester.

[0149] Takođe, bioluminiscentno jedinjenje bi moglo da se koristi za označavanje IL-31-specifičnih antitela, delova, fragmenata, polipeptida, ili derivata prema ovom pronalasku. Bioluminiscencija je tip hemiluminiscencije pronađene u biološkim sistemima, u kojima katalitički protein povećava efikasnost hemiluminiscentne reakcije. Prisustvo bioluminiscentnog proteina je određeno detekcijom prisustva luminescencije. Važna bioluminescentna jedinjenja za svrhu označavanja su luciferin, luciferaza i ekorin.

[0150] Detekcija IL-31-specifičnih antitela, delova, fragmenta, polipeptida, ili derivativa može da se obavi scintilatorom, na primer ako je detektibina oznaka radioktivni gama emiter ili fluorometrijom, na primer ako je oznaka fluorescentni material. U slučaju enzimskog obeležavanja, detekcija bi mogla da se ostvari kolorometrijskim metodama koje koriste supstrat za enzime. Detekcija bi mogla da se ostvari takođe vizuelnim poređenjem opsega enzimske reakcije supstrata u poređenju sa slično pripremljenim standardima.

4

[0151] IL-31 koji je detektovan testovima navedenim iznad mogao bi da bude prisutan u biološkom uzorku. Bilo koji uzorak koji sadrži IL-31 mogao bi da bude upotrebljen. Na primer, uzorak je biološki fluid kao što je krv, serum, limfa, urin, fekalije, inflamatorne izlučevine, cerebrospinalna tečnost, amniotska tečnost ekstrakt tkiva ili homogenat i tome slično. In situ detekcija bi mogla da se ostvari odstranjivanjem histološkog uzorka sa jednog životinjskog subjekta i obezbeđivnjem kombinacije označenih antitela ovog pronalaska za takav uzorak. Antitela i njihovi delovi mogli bi da budu obezbeđeni primenom ili pokrivanjem sa označenim antitelom (ili njegovim delom) na biloški uzorak. Tokom takve jedne procProsečni stručnjaci bi jasno primetili da bilo koja od širokog varijeteta histoloških metoda (kao što je procedura bojenja) bi mogla da se modifikuje kako bi se ostvarila takva in situ detekcija.

[0152] Antitela, fragment ili derivati mogu da budu prilagođeni za korišćenje u imunometričkom testu, takođe poznatom i kao „dvostrani“ ili „“sendvič“ test. U tipičnom imunometrijskom testu, količina neoznačenih antitela (ili fragmenata antitela) je vezana za čvrstu osnovu koja nije rastvorljiva u tečnosti koja se testira i količina otkrivenih označenih rastvorljivih antitela je dodata da omogući detekciju i/ili kvantifikaciju trojnog kompleksa formiranog između čvrste faze antitela, antigena i označenog antitela.

[0153] Antitela bi mogla da budu upotrebljena za kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju IL-31 u uzorku ili da detektuju prisustvo ćelija koje izražavaju IL-31. Ovo bi moglo da se izvede imunofluorescentnim tehnikama koje koriste fluorescentno označeno antitelo (pogledaj ispod) praćeno sa fluorescentnim mikroskopom, protočnom citometrijom ili fluorometričnom detekcijom. Za dijagnostičke svrhe, antitela mogla da budu i označen i neoznačena. Neoznačena antitela mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim označenim antitelima (druga antitela) koja reaguju sa antitelom, kao što su antitela specifična za konstantnu oblast imunoglobulina kanina ili felina. Alternativno, antitela bi mogla da budu direktno označena. Široka raznolikost oznaka bi mogla da bude upotrebljena kao što su radionuklotidi, fluori, enzimi, supstrati enzima, enzimi kofaktori, enzimski inhibitori, ligandi (posebno hapteni) itd. Mnogobrojni tipovi imunotestova, kao što su oni diskutovani prethodno su dostupni i dobro su poznati ljudima iz struke.

[0154] Dijagnostička metoda za detekciju IL-31 može biti imuno test lateralnog protoka. Poznat je i kao imunohromatografski test, Rapid ImmunoMigration (RIM™) ili brzi test. To je suštinski imunotest prilagođen da operiše duž jedne ose da bi sledio format trake. Brojne tehnološke varijante su razvijene u komercijalne proizvode, ali one sve deluju po istom osnovnom principu. Tipična test traka se sastoji od sledećih delova: (1) uzorak podloga –

4

absorbent podloga na koju se nanosi uzorak za testiranje; (2) konjugovana ili reagens podloga – ova sadrži specifična antitela za ciljani analit vezan za obojene čestice (obično koloidne čestice zlata ili lateks mikrosfere); (3) reakciona membrana – tipično hidrofobna nitroceluloza ili celulozno acetatna membrana na koju su anti-target analit antitela imobilizirani u liniji preko membrane kao zone hvatanja ili test linije (kontrolna zona može da bude takođe prisutna sadržeći antitela specifična za konjugovana antitela); i (4) fitilj ili rezervoar za otpad - apsorbent podloga namenjena da vuče uzorak kroz reaktivnu membranu kapilarnim dejstvom i da ih skuplja. Komponente trake su obično fiksirane za nepokretni materijal podloge i mogu da budu u jednostavnom formatu graduisane šipke ili u plastičnoj futroli sa delom za uzorak i prozorom koji pokazuje zonu hvatanja i zonu kontrole.

[0155] Postoje dva glavna tipa laterlnog protoka imunotesta koji se koriste u mikrobiologiji. Dupli antitelo sendvič test i kompetitivni test. U prvom testu uzorak se kreće od podloge uzorka kroz vezivnu podlogu gde bilo koji ciljani analit se vezuje za veznik. Uzorak zatim nastavlja kroz membranu sve dok ne dođe do zone hvatanja gde se ciljano/vezivni kompleks vezuje za imobilizirana antitela stvarajući vidljivu liniju na membrani. Ova kontrolna linija označava da je uzorak prošao kroz membranu kao i što je bilo nameravano. Dve jasne linije na membrani su pozitivan rezultat. Jedna linija u kontrolnoj zoni je negativan rezultat. Kompetitivni test se razlikuje od prethodnog testa jer veznička osnova sadrži antitela koja su već vezana za ciljani analit ili na neki njihov analog. Ako je ciljani analit prisutan u uzorku on zbog toga neće da bude vezana za veznik i ostaće neoznačen. Kako se uzorak pomera duž membrane i doseže do zone hvatanja višak neoznačenih analita će se vezati za imobilisana antitela i blokiraće hvatanje veznika, i tad se ne stvara vidljiva linija. Nevezani veznici će se onda vezati za antitela u kontrolnoj zoni stvarajući vidljivu kontrolnu liniju. Jedna kontrolna linija na membrani je pozitivan rezultat. Dve vidljive linije u zoni hvatanja i kontrolnoj zoni je negativan rezultat. Međutim, ako višak neoznačenih ciljanih analita nije prisutan, slaba linija mogla bi da nastane u zoni hvatanja označavajući neodređeni rezultat. Postojne brojne varijacije u tehnologiji lateralnog protoka. Zona hvatanja na membrani može da sadrži imobilisane antigene ili enzime – zavisno pre od ciljanog analita nego antitela. Takođe je moguće da se primeni više zona za hvatanje da bi se napravio multipleks test. Na primer, razvijeni su komercionalni trake testovi sposobni da detektuju i EHEC Shiga toksine ST1 i ST2 odvojeno u istom uzorku.

[0156] Važno je napomenuti da bi antitela mogla da budu od koristi u dijagnostici svraba i/ili alergija kod pasa i mačaka. Još specifičnije, antitelo bi moglo da identifikuju preteranu ekspresiju IL-31 kod kućnih ljubimaca. Tako, antitela mogu da obezbede važno

imunohistohemijsko sredstvo.

[0157] Antitela mogla bi da se koriste u testovima sa antitelima, visoko prikladni za merenje profila genske ekspresije.

Kompleti

[0158] Opisani ovde ali nisu deo pronalaska su kompleti za praktikovanje metode. Ovi kompleti mogu da sadrže sadrže najmanje jedno ili više antitela opisanih ovde, nukleinsku kiselinu koja kodira isti, ili ćeliju koja sadrži isti. Može se obezbediti antitelo, obično u liofilizovanom obliku u kontejneru. Antitela koja bi mogla da bude povezana sa oznakom ili toksinom, ili nepovezana su obično uključeno u komplete sa puferima, kao što su Tris, fosfat, karbonat itd. stabilizatorima, biocidima, inertnim proteinima, na primer, serum albumina, ili tome slično. Obično, ovi materijali će biti prisutni u manje od 5% težine, zasnovano na količini aktivnog antitela , i obično su prisutni u totalnoj količini od bar oko 0.001% težine, zasnovano opet na koncentraciji antitela. Često će biti potrebno da se uključi jedan inertni dodatak ili ekcipient da se razblaži aktivni sastojak, ekcipient može da bude prisutan oko 1% do 99% težine totalnog jedinjenja. Kada su sekundarna antitela sposobna za vezivanje sa prvim antitelima upotrebljena u testu, oni će obično biti prisutna u odvojenim bočicama. Sekundarna antitela su obično povezana sa oznakom i formulisana na anoalogni način sa formulacijom antitela opisanom iznad. Komplet će obično sadržati i set instrukcija za upotrebu.

[0159] Komplet može biti test traka (imunnotest lateralnog protoka komplet) koristan za detekciju IL-31 proteina kanina ili felina u uzorku. Ovakva test traka će obično sadržati podlogu uzorka na kojoj će uzorak za testiranje biti primenjen; veznik ili reagens podloga sadrži antitelo specifično za IL-31 kanina ili felina, gde je antitelo vezano za obojene čestice (obično koloidno zlato); reaktivna membrana na kojoj su anti-IL-31 antitela imobilisana u liniji preko membrane kao zona hvatanja ili test linija (kontrolna zona može takođe da bude prisutna, sadržavajući antitela specifična za konjugovana antitela); i apsorbent podloga namenjena da vuče uzorak kroz reaktivnu membranu kapilarnim dejstvom i da ih skuplja. Test strip komplet će takođe generalno sadržavati uputstva za korišćenje.

[0160] Pronalazak će sada biti nadalje opisan sa neograničavajućim primerima u nastavku.

1

PRIMERI

Primer 1 Identifikacija mišjih monoklonalnih antitela koje prepoznavanjem psećeg Interleukin 31 (IL-31)

[0161] Rekombinantni pseći IL-31 je kreiran u CHO ćelijama korišćenjem CHROMOS ACE (Artificialna hromozom exspresija) sistema (Chromos Molecular Systems, Inc., Burnaby, British Columbia) da se stvori sekretizovan pseći IL-31 protein koji ima sekvencu SEQ ID NO: 32. Ovaj protein kodira nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 33. Kondicionirani medijum od 400 ml ćelijske kulture (CHO ćelijska linija) je dobijen i dijalizovan prema 10 volumena QA pufera (20 mM Tris pH 8.0, 20 mM NaCl) za 4.5 sata. Dializovan medojum je filtriran na 0.2 um i presut sa 1 ml/min u SOURCE™ Q kolonu (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) prethodno ujednačenu sa QA puferom. Protein je eluiran korišćenjem multifaznog linearnog gradijenta. Većina IL-31 ostaje u protoku kroz (FT) frakciju, mala količina IL31 je eluirana ranije u gradijentu. Identitet proteina je prethodno potvrđen sa Western imunoblutingom, i MassSpectro (MS) analizama. Protein u FT frakciji je koncentrovan 4-5 puta i dijalizovan tokom noći prema Fosfat Bafiran Salinom (PBS) na 4°C. Stabilnost protein je proverena sledeći dializu u PBS. Nije priimećena precipiatacija, ni proteoliza posle nekoliko dana na 4°C. Eksperiment deglikozilacija sa korišćenjem N-glikozidaze F je rezultirao kondenzovanjem proteina na jednu jedinu traku 15 kDa na SDS-PAGE. Proteinska koncentracija je determinisana korišćenjem bicinkoničnog testa (BCA test) sa goveđim Serum Albumina (BSA) kao standardom (ThermoFisher Scientific, Inc., Rockford, IL). Proteinski rastvor je podeljen na alikvote, naglo ohlađen (tečnost N2) i skladišten na -80°C.

[0162] Mišja monoklonalna antitela su identifikovani korišćenjem standardne imunizacije ženke CF-1 miševa sa rekombinantnim psećim IL-31 napravljenim u CHO ćelijama. Titeri iz imunizovanih miševa su determinisani korišćenjem enzima veznih imunosorbentnim testom(ELISA). Pseći IL-31 (50 ng/well) je imobilisan na mikropločice polistirena i upotrebljen kao antigen za hvatanje. Serum iz imunizovanih miševa su razblaženi u fosfatu puferovanom sa slanim rastvorom 0.05% tween-20 (PBST). Prisustvo mišjih anti-canin IL-31 antitela je detektovano sa ren peroksidazom (HRP)-konjugovanim kozjim i anti-mišjim sekundarnim antitelima (Kirkegard & Perry Laboratories, Inc. (KPL, Inc.), Gaithersburg, MD). Zatim je dodat hromogenski supstrat (SureBlue Reserve TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate, KPL, Inc., Gaithersburg, MD) i posle 10 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi (RT) reakcija je zaustavljena sa dodavanjem 100 mL 0.1 N HCl. Apsorbcija svakog udubljenja je determinisana pri optičkoj gustini (OD) od 450 nm. Slika 6 sumira odgovore antitela pojedinačnih miševa koji su imunizovani sa psećim IL-31. Uzorci donatora splenocita

2

od miševa 3 i 4 su upotrebljeni za fuziju. Posle fuzije i pregleda za anti IL-31 vezivanja direktnim putem sa ELISA, 100 dobrih je odabrano za ekspanziju i sekundarni pregled IL-31 activnosti. Drugi pregled je potvrdio da 81 fuzija zadržava sposobnost da napravi anti IL-31 antitela. Skladište zaledjenih ćelija i supernatanta od tih 81 kandidata su sačuvani za dalju evaluaciju.

[0163] Da se identifikuju kandidati sa inhibitornim aktivnostima , svih 81 supernatanata je ocenjeno prema njihovoj sposobnosti da deluju na IL-31posredovano pSTAT signaliziranje u testu zasnovanom na ćelijama. Ovi testovi zasnovani na ćelijama mere pSTAT signalizaciju u psećim DH-82 monocitnim ćelijama koje su prethodno tretirane tokom 24 sata sa psećim gama interferonom (R&D Systems, Minneapolis, MN) od 10 ng/mL i ukidanjem seruma 2 sata pre IL-31 tretmana da bi se povećala IL-31 receptorska ekspresija. Posle tog prethodnog tretmana rekombinantni pseći IL-31 je dodat 1 mg/mL za 5 minuta i STAT fosforilacija je evaluirana korišćenjem Alpha Screen technology (Perkin Elmer, Waltham, MA). Pošto koncentracija i čistoća nisu poznati u antitelu hybridoma supernatanta, oni su kvalitativno mereni za njihovu sposobnost da inhibiraju STAT fosforilaciju nakon 1 sata zajedničke inkubacije sa 1 mg/ml IL-31 koristeći 1:2 ili 1:20 rastvarača supenatanta. Eksperiment je identifikovao 31 supernatant koji je inhibirao >50% STAT fosforilacije u odnosu na netretirana udubljenja tako potvrđujući purifikaciju i dalju karakterizaciju.

[0164] Posle prečišćavanja i kvantifikovanja svakog monoklonog antitela (mAb), IC50 vrednosti svih 31 antitela su evaluirane u DH-82 ćelijskom testu. Zasnovano na rezultirajućim IC50 vrednostima i kompetitivnim ELISA testovima za definisanje klasa antitela zasnovanih na epitopskim korpama, tri antitela opisana u Tabeli 1 su ostavljena za dalju karakterizaciju 11 E12, 19D07, i 34D03.

TABELA 1

Primer 2 DNA Sekvence koje kodiraju 11E12, 19D07 i 34D03 antitela.

[0165] Ribonukleinska kiselina (RNK) je izolovana iz hibridoma ćelija 11 E12, 19D07, i 34D03 korišćenjem Rneasy -mini kompleta (Qiagen, Inc., Germantown, MD) kako je opisano od strane proizvođača. Milion zaleđenih ćelija iz svakog hibridoma su sakupljene centrifugiranjem i RNK su prečišćene od ćelijskih lizata korišćenjem Rneasy spiralne kolone u skladu sa metodom opisanom u protokolu. RNK je eluirana iz svake kolone i odmah upotrebljena za kvantifikaciju i cDNK pripremu. RNK je analizirana za kvasac i čistoću merenjem njegove apsorbcije na 260 nm i 280 nm upotrebom GeneQuant pro spektrofotometra (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Nakon izolovanja, preostala RNK je skladištena na-80° C za dalju upotrebu.

[0166] Oligonukleotidni prajmeri namenjeni za amplifikaciju mišjeg imunoglobulina (Ig) varijabilnih oblasti su upotrebljeni u skladu sa instrukcijama proizvođača (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ). cDNK je pripremljena od totalnih hybridoma RNA reverzibilnom transkripcijom (RT) koristeći termoskript RT komlpet (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) u skladu sa instrukcijama proizvođača. 200-400 ng RNK od svakog hibridom je dodato u pojedinačnu epruvetu tako da sadrži 3’ Ig prajmera konstantne oblasti. Konstantni 3’ Ig prajmer je postavljen približno pored varijabilne Ig oblasti i treba da transkribuje prvi element cDNK koji predstavlja varijablilnu oblast mišjeg antitela. Za svaki hibridom RNK, individualna RT reakcija je ostvarena korišćenjem 3’ konstantnog teškog niza i 3’ konstantnog kapa lako lančanog prajmera.

[0167] cDNK iz svakog hibridoma su korišćeni kao model u polimerizovanoj lančanoj reakciji (PCR) da poveća varijabilnost IgG teškoh i kapa lakog niza cDNK za determinaciju sekvenci. Mnogobrojne reakcije su izvedene za svaki PCR korišćenjem degenerisanog 5’ prajmera ili prajmer skladišta namenjenih da ojačaju signalnu sekvencu koja kodira oblast mišjeg Ig varijabilnog domena. Odvojene PCR reakcije su izvedene sa degenerisanim prajmerom ili prajmerom iz rezerve da se pojačaju mišje varijabilne oblasti teškog niza i varijabilne oblasti lakog niza (Figura 7). PCR je izveden sa 1 ml cDNK reakcijom koristeći Expand High Fidelity DNK polimerazni komplet (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) u skladu sa komerionalnim protokolom. Termociklirajući parametri za PCR bili su sledeći: ;94°C fza 2 min., 35 krugova (94°C 15 sec., 55°C 30 sec., 72°C 1 min.), 72°C 7 min. Pojačani fragmenti iz PCR su razdvojeni gel elektroforezom u 1 % agaroza gelu i prečišćeni korišćenjem Qiagen gela ekstarkcionog kompleta (Qiagen, Inc., Germantown, MD). Prethodni prajmeri za teško i lako lančane varijabilne oblasti inkorporiraju EcoRI ili SalI (New England Biolabs (NEB), Inc., Ipswich, MA) mesta i zamenjujuu teške i lako lančane varijable, HindIII (NEB Inc., Ipswich, MA) da bi olakšali kloniranje u pUC19 plazmidu. Prečišćeni PCR fragmenti i pUC19 plasmid

4

su digestovani sa gornjim restrikcijskim endonukleazama na 37°C za 1-2 sata. Posle digestije, PCR fragmenti su prečišćeni korišćenjem Qiaquick PCR pročišćavajućeg kita (Qiagen, Inc., Germantown, MD). Digestovani plazmidi su odvojeni gel elektroforezom na 1 % agarozi i prečišćeni korišćenjem Qiagen gel ekstrakcionog kompleta. Prečišćeni PCR fragmenti koji predstavljaju promenljivi IgG težak i kappa lak niz DNK su ligatovani u pUC19 plazmid korišćenjem T4 DNK ligaze i liaznog pufera (NEB, Inc., Ipswich, MA) na 4°C preko noći. 3 ml od svake ligacione reakcije je iskorišćeno da se transformišu E. coli TOP10 ćelije (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).

[0168] Plazmidi su izolovani od pozitivnih klonova koji predstavljaju vrijabilne oblasti svakog hibridoma koristeći Qiagen mini prep komplet (Qiagen 27106) u skladu sa komercijalnim protokolom. M13 forward i reverse prajmeri su korišćeni da se amplifikuje DNK sekvenca za svaki ubačeni klon koristeći BigDye sekvencionu reakciju (Applied Biosystems by Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) u skladu sa komercijalnim protokolom. Sekvencione reakcije su pročišćene upotrebom 96 dobrih p kompleta za prečišćavanje. (Zymo Research, Irvine, CA) u skladu sa komercionalnim protoikolom. Uzorci su stavljeni u ABI-3730 kapilarni sekvester i dobijeni sekvencioni tragovi su analizirani upotrebom Sequencher (GeneCodes v.

4.2) za prisustvo kompletno otvorenih okvira. Mišje anti-pseće IL-31 varijablilne sekvence određene za svako antitelo su kao što sledi : 11 E12 varijabilni laki niz (Seq ID NO:19 MU-11 E12-VL, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za svaki je SEQ ID NO: 34), 11 E12 varijabilni teški niz (Seq ID NO: 26 MU-11 E12-VH, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za svaki je SEQ ID NO: 35), 19D07 varijabilni laki niz (Seq ID NO:22 MU-19D07-VL, odgovarajuća nukleotidna srekvenca za svaki je SEQ ID NO: 36), 19D07 varijabilni teški niz (Seq ID NO: 28 MU-19D07-VH, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za svaki je SEQ ID NO: 37), 34D03 varijabilni laki niz (Seq ID NO:24 MU-34D03VL, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za svaki je SEQ ID NO: 38), i 34D03 varijabilni teški niz (Seq ID NO:30 MU-34D03-VH, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za svaki je SEQ ID NO: 39).

[0169] Da bi se potvrdila validnost cDNA sekvence derivirane od svakog antitela varijabilnog teških i lakih lanaca, N-terminal sekvenciona analiza je urađena na prečišćenom mAb proteinu upotrebom Edman degradaciju Primenjeni Biosistem model 494 gas faze proteinskog sekvencera. Tabela 2 ispod opisuje konfirmaciju vartijabilnih lako lančanih sekvenci za antitela 11 E12 i 34D03 i varijabilnu tešku sekvencu za 34D03. N-terminal amino kiseline za varijabilni teški lanac antitela 11 E12, deriviran translacijom cDNA sekvence, je određen kao glutamin. Glutamin, kao amino terminalni ostatak proteina, može spontano da se podvrgne ciklizaciji u piroglutaminsku kiselinu onemogućavajući sekvencionu determinaciju Edman degradacijom (Chelius i al., Anal Chem.2006 78(7):2370-6).

TABELA 2*

Primer 3 Konstrukcija 11E12, 19D07 i 34D03 Himeričnih antitela

[0170] Kao što je objašnjeno iznad, antitela se sastoje od homodimera uparenog od dva heterodimerična proteina. Svaki proteinski lanac (1 teški i 1 laki) heterodimera se sastoji od varijabilnog i konstantnog domena. Svaki varijabilni domen sadrži tri oblasti koje determinišu komplementarnost (CDRs) koje doprinose antigenskom vezivanju. CDRs su odvojene u varijabiln okvirnim oblastima koje obezbeđuju skelu za ličnu prostornu prezentaciju strana vezivanja na nekom antitelu. Zajedno, CDR i okvirne oblasti doprinose sposobnosti antitela da vezuju svoje srodne antigene (Slika 2).

[0171] Kako je dalje objašnjeno iznad, himerično antitelo se sastoji od varijabilne sekvence ( kako CDR tako i okvira) iz mišjeg antitela (kako je determinisano iz iznad navedene sekvencione analize ) kalemljenog u respektivno teško i lako konstantnoj oblasti psećeg IgG molekula (Slika 3). Kako je varijabilni domen odgovoran za antigensko vezivanje, za očekivanje je da će kalemljenje potpunog mišjeg domena u psećoj konstantnoj oblasti imati malo uticaja ili da ga uopšte neće imati na sposobnost antitela da vezuje IL-31 imunogen.

[0172] Da bi simultano potvrdili da je korektna sekvenca teško i lako lančane varijabilne oblasti identifikovana i da bi napravili rekombinantni, homogeni materijal, napravljeni su vektori ekspresije da prave himerična antitela u ekspresionom sistemu sisara. Prednji i zadnji prajmeri su namenjeni da amlifikuju mišju teško i lako lančanu varijabilnu oblast sekvence antitela dobijenih iz hibridoma 11 E12, 19D07, i 34D03. Jedina restrikcija endonukleaznog mesta, Kozak konsenzusna sekvenca i sekreciono lider sekvenca su inkorporirane u svaki prednji prajmer da se olakša ekspresija i sekrecija rekombinirajućeg antitela iz ćelijske linije sisara. Svaki zadnji prajmer je namenjen da amplifikuje svaki respektivni varijabilni teški i laki niz i uključuje jedinstveno restrikciono mesto da bi se olakšalo kloniranje. PCR je napravljen da se amplifikuje svaki teški i laki niz koji koristi klonirano hibridoma varijabilno lančano antitelo DNK kao model za svaku reakciju. Svaki PCR produkt je kloniran u ekspresioni plazmid sisara koji sadrži bilo pseći IgG teško (ovde zavedeno kao HC-64 ili HC-65) ili lako lančane (zavedeno ovde kao kapa) konstantne oblasti koje su zasnovane na sekvencama iz GenBanka prilaznih brojeva AF354264 ili AF354265 i XP_532962 respektivno. Amino kiselinske i nukleotidne sekvence HC-64 su predstavljene sa SEQ ID NOs: 40 i 41, respektivno. Amino kiselinske i nukleotidne sekvence HC-65 su predstavljene kao SEQ ID NOs: 42 i 43, respektivno. Amino kiselinske i nukleotidne sekvence kapa su predstavljene sa SEQ ID NOs: 44 i 45, respektivno. Plazmidi koji kodiraju svaki teški i laki niz, pod kontrolom CMV promotera, su zajedno prebačeni u HEK 293 ćelije upotrebom standardnih lipofektaminskih metoda. Narednih 6 dana ekspresije, himerični Abs su prečišćeni iz 30ml u prolazno transfektovane HEK293FS ćelijske supernatante korišćenjem MabSelect SuRe proteina A smole (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) u skladu sa standardnim metodama za proteinsko prečišćavanje. Eluirane frakcije su odvojene, koncentrovane na ∼500ul koristeći 10,000 nominal MW cutoff Nanosep Omega centrifugalni uređaj (Pall Corp., Port Washington, NY), dijalizovane tokom noći na 4° C u 1x PBS, pH7.2 i skladištene na 4° C za dalju upotrebu.

[0173] Ekspresije himeričnih psećih IgG su ocenjene upotrebom SDS poliakrilamidne elektroforeze (SDS PAGE) pod prirodnim i veštačkim uslovima. Monoklonalna antitela (mAbs) iz svake transfekcije su razdvojena u 4-12% Bis Tris gel upotrebom SDS MES running baferom u skladu sa komercijalnim protokolom (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Nakon elektroforeze, proteini su vizualizovani sa jednostavnom plavom Kumasi bojom (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) da se osigura da će se dogoditi pravilno uparivanje i da se obezbedi grubo ocenjivanje proteinske homogenosti. Da se evaluira da li će rekombinirajući mAbs zadržati sposobnost da vezuje pseći IL-31, mAbs su ocenjeni za njihove sposobnosti da vezuju pseći IL31 pomoću Western Blotovima. Proteinski standardni i rekombinirjući pseći IL-31 (800 ng) su raščlanjeni na SDS PAGE i preneti u nitroceluloznu membranu upotrebom Invitrogen iBlot uređaj (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Nakon transfera, membrane su oprane sa destilovanom dejonizovanom vodom i blokirane sa 5 % nemasnim mlekom u prahu(NFDM) u fosfatnom puferovanom slanom rastvoru koji sadrži 0.05% tween-20 (PBST) za 1 sat na sobnoj temperaturi (RT). Posle blokiranja, membrane su oprane u PBST i inkubirane sa bilo razblaženim supernatantom iz prolazne ekspresije i prečišćene sa himeričnim antitelima. Vezivanje himeričnih antitela je procenjeno sa koza anti-pseći IgG antitelo-peroksidaza konjugatom (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX ili Rockland, Immunochemicals, Inc., Gilbertsville, PA) u 1:5000 rastvoru u PBST za 1 sat u RT. Potvrda IL-31 vezivanja je određena prisustvom kolorimetrijske trake (jasne molekularne težine 15 kDa) koja odgovara glikozilantnom obliku psećeg IL-31 praćeno dodavanjem TMB supstrata u blot (KPL, Inc., Gaithersburg, MD).

[0174] Zatim su analizirani pomoću Vestern blota afinitet i funkcionalnost himeričnih mAbs koji pokazuju ekspresiju iz HEK 293 ćelija i koji se vezuju se za rekombinirajući pseći IL-31 imunogen. Da bi karakterisali afinitet sa kojim kandidat mAbs vezuje IL-31, površina plazmon rezonance (SPR) je evaluirana upotrebom Biacore sistema (Biocore Life Sciences (GE Healthcare), Uppsala, Sweden). Da bi se izbegla razlike afiniteta usled različitih pripremnih površina koje mogu da se jave kad se imobilišu antitela u površinama; strategije su upotrebljene kada je IL-31 direktno vezan za površinu. Imobilizacija je dobijena amin uparivanjem 5 mg/mL IL-31 upotrebom N-hidroksisukcinimid (NHS)/1-Etil-3-(3dimetilaminopropil)karbodiimid (EDC) hemije. Čipovi su natopljeni etanolaminom i procenjen je afinitet sa kojim se svaki kandidat mAbs vezuje za imobilisani IL-31. Sve krive su odgovarale 1:1 modelu. Afiniteti<E-11 su ispod najmanje granične kvantitativne vrednosti detekcije na instrumentu.

[0175] Svi kandidati mAbs su takođe procenjeni po sposobnosti da inhibiraju IL-31 koji signalizira u testu zasnovanom na ćelijama u dva nezavisan formata. U koinkubatorskom formatu, mAb:IL-31 compleksi su prethodno inkubirani na sat vremena da se obezbedi kompleksna formacija pre ćelijske adicije. pre-incubated for one hour to ensure complex formation prior to cell addition. Da se poveća potencijal za razlikovanje mAbs, drugi set eksperimenta je izveden i u njima nije bilo koinkubacije i mAbs su dodati direktno u ćelije 5 minuta pre dodavanja IL-31. U oba slučaja, IL-31 stimulacija se dogodia za 5 minuta. Kako je prikazano u Tabeli 3 konverzija mišjih monoklonalnih 11 E12, 19D07 i 34D03 u pseći himerični oblik , je imala malo uticaja na njihovu sposobnost da vezuju IL-31 ili inhibirju ćelijsko posredovano signaliziranje. Rezultati takođe potvrđuju korektne varijabilno teške i varijabilne lako lančane sekvence dobijene iz svakog mišjeg hibridoma.

TABELA 3

Primer 4 In vivo evaluacija himeričnih mAbs

[0176] Da bi se potvrdilo da inhibicija IL-31-posredovanog ćelijskog signaliziranja, dobijen u DH-82 testu, stoji u korelaciji sa inhibicijom IL-31-posredovanog svraba kod pasa, himerično 11 E12 monoklonalno antitelo opisano iznad u Tabeli 3 (himerični 11 E12-64) je procenjen u IL-31 modelu psećeg svraba. U ovom modelu, pseći IL-31, kad je dat intravenozno (IV) u dozi od 1 do 1.5 mg/kg, pravi a brz konzistenti skok u odgovoru svraba koji može da se kvantifikuje tokom dva sata posmatranja. Da bi se procenio odgovor svraba psi su postavljeni u pojedinačne kućice i merenja aktivnosti češanja su obavljen video nadzorom. Posle perioda aklimatizacije ≥ 1 sat, osnovni skor češanja je određen za svakog psa upotrebom relnog vremena video nadzora upotrebom kategorijalnog skor sistema. using real-time video surveillance using a categorical scoring system. Specijalno, posle konsekutivnih 1 minutnih intervala, "da/ne" odluke su napravljene zavisno od toga da li je ponašanje češanja pokazano kod svakog psa. Pokazivanje ponašnja vezana za svrab su akcije kao što su lizanje/grickanje šapa, boka o/ili analnih oblasti, grebanje bokova, vrata i/ili valjanje po podu, ,klaćenje glavom, vučenja guze po podu po kavezu su bile dovoljne da se odabere „da“ odgovor tokom označenog vremenskog intervala. Na kraju ovog perioda izbrojane „da“ odrednice skupljenie su zajedno da bi dali kumulativni indeks skor svraba (PSI). Skorovi svraba su određeni dva puta za svakog psa, tako da je prvo merenje uzeto kao osnovni skor i urađeno je 30 minuta neposredno pre početka test tretmanskog perioda. Posle popunjavanja svake satnice posmatranog perioda, psi su vraćeni na njihova normalna prebivališta.

[0177] Da bi se uradila procena da li pokožna (SC) administracija himeričnog 11 E12-64 može da inhibira IL-31-posredovani svrab, pilot studija (76A03) je izvedena i uključuje i tretirano i placebo grupu (N = 4 po grupi). U ovoj studiji osnovni odgovori su izvedeni sa svih 8 pasa i psi su randomizirani u grupe i podeljeni po kućicama po njihovom PSI. Važno je da je svaka grupa se satojala dva psa sa velikim brojem odgovora (PSI >55) i dva sa srednjim brojem odgovora (PSI = 30 do 55). Ovim psima je onda administriran hinerični 11 E12-64 7. dana i IL-31 stimulacije su izvedene 8.14. i 22. Rezultati studije su predstavljeni una Figuri 8. Ovi rezultati pokazuju da administriranje himeričnog 11 E12-64 daje smanjenje za više od 75% PSI skora za dane 8 i 14, u odnosu na prvi dan, za životinje tretirane himeričnim 11 E12-64. Ovo je u suprotnosti sa 37 - 51% povećanjem u PSI skoru za netretirane životinje. PSI skor se vratio na početnu vrednost dve nedelje posle mAb tretmana, sugerišući da je doza od 0.3 mg/kg efikasna između jedne i dve nedelje.

[0178] Pojedinačna stimulacija kad se napravi rezultat PSI svakodnevno varira zavisno od češanja psa. Da se dobije bolja kontrola ovih varijacija 30 minutni osnovni PSI je određen za svakog psa, svaki dan pre IL-31 stimulacije. Slika 9 pokazuje individulni skor svraba za pse uključene u ovoj studiji (76A60). Podaci na Slici 9 pokazuje da 8. I 14. dana osnovni PSi skor je bio približno 25% od post IL-31 stimulacije u grupi tretiranoj himeričnim 11 E12-64. Opservacija je u skladu sa kompletnom abrogation of IL-31 pobezan sa češanjima since the baseline observation time period (0.5 h) is 25% of the post IL-31 observation time period (2h). Uzeti zajedno, ovi in vivo podaci pokazuju da je evidentno da : 1) the himerični monoklonalni 11 E12 može da neutrališe sposobnost IL-31 da indukuje svrab kod pasa, 2) inhibicija IL-31 posredovanog signalisanja u testu zasnovanom na ćelijama korelira sa in vivo effikasnošću i 3) parametri neophodni z upotrebu ovih IL-31 modela za mAb evaluaciju su ustanovljeni za evaluaciju drugih kandidatski antitela.

Primer 5 kaninizujuća strategija

[0179] Generacija anti-drug leka antitela(ADAs) bi mogla da se poveže sa gubitkom efikasnosti bilo kog bioterapeutskog proteina koji uključuju monoklonalna antitela. Kompletna evaluacija literature je pokazala da speciation monoklonalnih antitela može da redukuje tendenciju mAbs da se koristi kao imunogenični iako primeri imunogeničkog potpuno ljudskog mAbs i neimunogeničnog himeričnog mAbs mogu da se nadju. Da se poveća smanjenje rizika od ADA formiranja za mišji anti IL-31 monoklonalno antitelo dostavljeno ovde, kaninizujuća stategijaje upotrebljena. Ova kaninizujuća strategija je zasnovana na identifikaciji one pseće germline klicine sekvence antitela koja najviše odgovara za kalemljeni CDRs (figura 4). Posle podrobne analize svih dostupnih psećih klivnih sekvenci i za teške i za lake lance, klicni kandidati su selektovani zavisno od njihove homolognosti sa mišjim mAbs, a CDRs za mišje mAbs su upotrebljeni da zamene prirodne pseće CDRs. Cilj je bio da se zadrži visoki afinitet i aktinost ćelija upotrebom potpuno pseće matrice da bi se smanjio potencijal of immunogenicity in vivo. Kaninizovani mAbs su izraženi i karakterisano prema njihovoj sposobnosti da vezuju IL-31 pomoću Bestern blotovanja.Ovi rezultati su su opisani ispod u primeru 8. Samo mAbs koji su zadržali sposobnost da vezuju IL-31 posle kaninizacije su ostavljeni za dalju karakterizaciju. Oni mAbs koji su izgubili sposobnost da vezujuIL-31 sus sistematično secirani da se utvrdi; 1) lanac odgovoran za gubitak funkcije 2) matrica odgovorna za gubitak funkcije i 3) amino kiselina ili kiseline odgovorne za gubitak funkcije.

Primer 6 Kaninizacija 11E12, 19D07, i 34D03 antitela

[0180] Napravljeni su sintetizovani nukleotidni konstrukti koji predstavljaju kaninizirane varijabilne teške i lake lance mAbs 11 E12, 19D07, i 34D03. Posle subcloning podkloniranja svakog varijabilnog lnca u plazmidima koji sadrže odgovarajuću pseću tešku ili kapa konstantnu oblast plazmidi su zajedno transfektovani za ekspresiju antitela u HEK 293

1

ćelijama. Kao rezime, oba, 19D07 i 34D03 mAbs zadržavaju IL-31 vezivanje posle kaninizacije. Kaninozavne anti-pseći IL-31 varijablilne sekvence za svako antitelo su sledeće: 19D07 varijabilni laki lanac (Seq ID NO: 23 CAN-19D07VL-998-1 odgovarajuća nukleotidna sekvenca za koju je SEQ ID NO: 46), 19D07 varijabilni teški lanac (Seq ID NO: 29 CAN-19D07-VH-400-1, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za koju je SEQ ID NO: 47), 34D03 varijabilni laki lanac (Seq ID NO: 25 CAN-34D03-VL-998-1, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za koju je SEQ ID NO: 48), and 34D03 varijabilni teški lanac (Seq ID NO: 31 CAN-34D03-VH-568-1, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za koju je SEQ ID No: 49).

[0181] Suprotno, germline klicne sekvence upotrebljene za 11 E12 kaninizaciju su imale neke nefunkcionalne mAbs. Na Slici 10, himerične, heterohimerične, i kaninozavane verzije mAb 11 E12 su izaražene i opisane pomoću Vestern blotovnja po njihovoj sposobnosti da vezuju pseći IL-31. Ovi rezultati pokazuju da kaninizovania 11 E12 antitela nisu vezivala pseći IL-31 (Blot #2). Takođe, heterohimerični i himerični teški lanci su povezni sa blagim smanjenjem vezivanja kaninizovanog IL-31 (Blot #3), dok su kaninizovani teški lanci povezani s blagim održvanjem aktivnosti vezivanja himeričnih IL-31 (Blot #4).Na osnovu rezultata dobijenih od heterohimera zaključeno je da je kaninizovani laki lanac odgovoran za gubitak aktivnosti.

[0182] U naporu da se obnovi vezivanje u kaninizovanim verzijama 11 E12 za pseći IL-31, kaninizovani laki niz je modifikovan tako što su zamenjene sekvence. Slika 11 daje pregled na poslu supstitucije okvira 11 E12 lakog niza. Tokom rada identifikovano je antitelo koje zamenjuje pseći okvir II (FWII) sa mišijim okvirom II i obnavlja vezivanje za pseći IL-31 (11 E12 promenljivi laki niz (Seq ID NO: 20 CAN-11 E12-VL-cUn-FW2, odgovarajuća nukleotidna sekvenca je SEQ ID NO: 50), 11 E12 promenljivi teški niz (Seq ID NO: 27 CAN-11 E12-VH-415-1, odgovarajući nukleotid je SEQ ID NO: 51)).

[0183] Dalje rafinisanje ovih pozadinskih mutacija identifikovalo je jedno antitelo sa jednom arginin z aleucin mutacijom (R50L) u okviru II može da obnovi IL-31 vezivanje preko Western blot analysis (11 E12 promenljivi laki niz (Seq ID NO:21 CAN-11 E12-VL-cUn-13, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za koju je SEQ ID NO: 52), 11 E12 promenljivi teški niz Seq ID NO: 27 CAN-11E12-VH-415-1)) (Slika 12). Jednom ’kaninizovane verzije’ svakog potencijalnog kandidata su identifikovane, mAbs prečišćene i dializovane u PBS radi dalje evaluacije. Tabela 4 sumira rezultate od merenja afiniteta i na ćelijama zasnovanim inhibišućih podataka. Ovi podaci pokazuju da kaninizovani derivati kako 11 E12 tako i 34D3 zadržavaju odličnu inhibitornu aktivnost u na ćelijama zasnovanim testovima i afinitet prema IL-31 kako

2

je mereno sa Biacore. Takože je vredno pomenuti da dok originalno kaninizovan 19D7 molekule zadržava odličan potencijal kao što je izmereno sa Biacore, sposobnost da se inhibiraju ćelije zasnovane na IL-31 signalizaciji signaling aje kompromitovana u odnosu na njegov mišji prethodnik. Malo do nimalo gubitka afiniteta je zabeleženo prilikom konverzije mAbs iz njegovog mišjeg izotipa u pasji derivat.

TABELA 4

Primer 7 Karakterizacija psećeg IL-31 vezivanja za 11E12 i 34D03

[0184] Da se determinišu ostaci amino kiselina involved sa vezivanjem psećeg IL-31 sa antitelima 11E12 i 34D03, strategija mutacije je korišćena koja involved 1) skraćivanje truncation IL-31 proteina od oba N i C terminusa i 2) zamena pojedinačnih amino kiselina sa alaninom replacement of individual amino acids with alanine (ala scan) da se utrdi uticaj na mAb vezivanje. PCR prajmeri su namenjeni da amplifikuju pseći IL-31 genkoji je bio kodonski optimalizovan za espresiju u Ešerija koli domaćinu. Sekvenca ovog kodonski optimalizovaong psećeg IL-31 konstrukta potpune dužine za ekspresiju Ešerije koli coli je predstavljena sa SEQ ID NO: 55, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za koju je SEQ ID NO: 56. Prajmeri su namnjeni da amlifikuju gene potpune dužine i da stvore 20 amino acidnih truncations skraćenih proteina koji se kreću unutra moving inward od N od C terminusa. Za potrebu N-terminal truncations skraćivanja , na poziciji 1 je bio glycine glicinski talog koji sledi odmah N-terminal 6-His tag označen u kodonski-optimimizovan konstrukt. PCR amplificirati produkti su bili klonirani u pET101 D (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) u skladu sa komercijalnim protokolom. Plazmid pET101 D dozvoljava spajanje rekombinirajućeg proteina sa Nterminal 6-His epitopskim tag označen za potvrdu ekspresije. Sekvenca potvrđuje da su plazmidi upotrebljeni da se transformiše BL21 Star TOP10 ćelije Ešerije koli (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) i i ekspresija rekombiniranog proteina was induced upotrebom 1 mM Izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) pod standard uslovima kulture. Nakon indukcije, ćelije su bile peletirane i lizirane pelleted and lysed korišćenjem Bakterisko proteinski ekstracioni reagensi (skraćeno B-PER, ThermoFisher Scientific Inc., Rockford, IL). Crude lizati su bili subjected to SDS-PAGE i Vestern blotovanje je izvršeno kao što je napred opisano. Sva Vestern blotovanja za mutacione analize su ostvarene korišćenjem mišjih verzija 11 E12 i 34D03 zbog neophodne raspoloživosti pročišćenih antitela i reagenasa. Testirana je sposobnost svakog antitela da veže sirovi proteinski lizatski blot koji predstavlja IL-31 cele dužine i truncated. Kontrolni blotovi su takođe ispitivani sa anti-His mAb da se potvrdi ekspresija svakog proteina. Proteini sa N-terminal truncation (-20N, -40N, and -60N) svi pokazuju robust

4

ekspresiju u Ešerija koli. coli i bili su sposobni za vezivanje sa11 E12 i 34D03 (Slika 13). Amino kiselinske i nukleotidne sekvence koje odgovaraju -20N konstruktu su SEQ ID NOs: 57 i 58, respektivno. Amino kiselinske i nukleotidne sekvence koje odgovaraju -40N konstruktu su SEQ ID NOs: 59 i 60, respektivno. Amino kiselinske i nukleotidne sekvence koje odgovaraju -60N konstruktu su SEQ ID NOs: 61 i 62, respektino. Međutim, IL-31 potpune dužine i proteini sa C-terminalnim skraćivanjem truncations (-20C, -40C, i -60C) nisu imali ekspresiju pod ovim uslovima.

[0185] Primećeno je da je protein IL-31 potpune dužine bio izražen veoma slabo. Međutim removed uklonjen konstrukt sa prvih 20 amino kiselina (-20N) iz N-terminusa pokazuje robust jaku ekspresiju. Antitela 11 E12 i 34D03 oba se vezuju -20N protein. Međutim, dalji rad je ostvaren korišćenjem tog -20 N konstrukta. Konstrukti koji predstavljaju C-terminal truncations skraćivanje na pozicijama 20-122 (MW 15.3 sa njegovim tag), 20-100 (MW 12.9 sa njegovim tag), i 20-80 (MW 10.4 sa njegovim tag), su napravljena da se oceni mAb vezivanje za ove oblasti na IL-31 proteinu. Amino kiselinske i nukleotidne sekvence koje odgovaraju 20-122 konstruktu su SEQ ID NOs: 63 i 64, respektivno. Amino kiselinske i nukleotidne sekvence koje odgovaraju 20-100 konstruktu su SEQ ID NOs: 65 and 66, respektivno. Amino kiselinske i nukleotidne sekvence koje odgovaraju 20-80 konstruktu su SEQ ID NOs: 67 i 68, respektivno. Slika 14 pokazuje Vestern blotove crude grubih proteinskih lizata ovih truncated skraćenih proteina koji su ispitivani sa mAbs 11E12 (Blot B) i 34D03 (Blot C). Kako je pokazano na ovoj slici, mAbs 11E12 i 34D03 se vezuju za IL-31 skraćene proteine truncated 20-122 i 20-100, ali nije uspeo da se veže za 20-80. Ovi rezultati pokazuju da amino kiseline između pozicija 80 i 100 psećeg IL-31 konstrukta potpune dužine SEQ ID NO: 55 (upotrebom "SSHMA" kao N-terminus) su involved sa vezivanjem ovih antiteta. Ova oblast odgovara amino kiselini Nos. Između amino acidnih taloga 102 i 122 psećeg IL-31 proteinske sekvence potpune dužine SEQ ID NO: 32. Kontrolni blot koji koristi anti-His mAb (Blot A) je pokazao da svi skraćeni proteini su bili izraženi. Dodatno, pET101D-lacZ protein je upotrebljen ko kontrola da se potvrdi nedostatk nespecifičnog vezivanja mAbs za proteine domaćine.

[0186] Da se dalje identifikuju amino kiseline u psećem IL-31 umešanom u vezivanje za mAbs 11 E12 i 34D03, mutagenetsko alaninskeniranje je izvršeno u skladu s poznatim metodama. Individualni konstrukti su napravljeni (u -20N plazmidu) supsticijom alanina za svaku poziciju na psećem IL-31 iz amino kiselina 76 do 122. Nakon konfirmacija sekvenci, ostvarena je proteinska ekspresija i sirovi proteinski lizati su korišćeni Vestern blot analizama. Slika 15 pokazuje rezime rezultata koji pokazuje pozicije na psećem IL-31 koje, kad mutiraju u alanin, menjaju doprinos vezivanje sa mAbs 11 E12 i 34D03. Kao što pokazuje ova slika, pozicije 77, 78, 81 85 IL-31 konstrukta potpune dužine doprinosa za vezivanje 11 E12 ili 34D03 antitela. One odgovaraju amino kiselinskim ostacima 99, 100, 103 i 107, respektivno, pseće IL-31 proteinske sekvence potpune dužine SEQ ID NO: 32.

[0187] Da se ispita uticaj višestruke mutacije u oblasti IL-31 važne za vezivanje za 11 E12 i 34D03 antitela, ekspresija plazmida je konstruisana sa duplom (D82A, I85A) ili troduplom (I81A, D82A, I85A) alanin supstitucijom. Ešerija koli lizati koji izražavaju pseći IL-31 sa ovim duplim i troduplim mutacijama dodatno sa kontrolnim -20N su blotovani sa 11 E12 i 34D03 antitelima (Slika 16). Jasno je da su ove tri amino kiseline na psećem IL-31 povezane sa prepoznavanjem 11 E12 i 34D03 tako što kompletno ukidanje vezivanja je uočeno kad su ova mesta promenjena u alanin. Ove tri amino kiseline odgovaraju amino kiselinskim ostacima 103, 104 i 107 pseće IL-31 proteinske sekvence potpune dužine SEQ ID NO: 32.

[0188] Ukratko analiza krajeva psećeg IL-31 otkriva amino kiselinske ostatke (zabeleženi na slici 15 između pozicija 80 i 122) koji su umešani u vezivanje 11 E12 i 34D03 antitela. Nadalje, fina mutaciona analiza koja koristi alaninsko skeniranje otkriva da ASP77, LYS78, ILE81, ASP82, i ILE85 potpune dužine IL-31 konstrukta koji svi utiču na vezivanje 11 E12 or 34D03 ukazujući da ova oblast najverovatnije definišu epitop odgovoran za prepoznavanje od strane tih antitela. Interesantno je da je pokazano da ova oblast ljudskog IL-31 proteina povezanih sa vezivanjem sa GPL podjedinicom njihovih koreceptora (Le Saux S i al. Biol Chem.2010 Jan 29;285(5):3470-7. Epub 2009 Nov 17). Ove opservacije, zajedno uporedo sa sposobnošću mAbs 11 E12 i 34D03 da neutrališu IL-31 posredovanu pSTAT aktivnost u monocitima, podržavaju hipoteze da su ovi mAbs vezani za ostatke na psećem IL-31 suštinski za vezivanje ovog citokina za njegov receptor, tako inhibirajući njegovu sposobnost da podstiče signlizaciju.

Primer 8 Produkcija kaninizovanog 34D03 antitela i glutaminskog sintetisanja (GS) plazmida

[0189] Geni koji kodiraju 34D03 mAb (teški i laki lanci, Tabela 4 iznad) su klonirani u GS plazmide pEE 6.4 i pEE 12.4, respektivno (Lonza, Basel, Switzerland). Dobijeni plazmidi su svareni /razloženi u skladu sa komercionalnim protokolom i ligated vezani zajedno d bi formirali pojedinačnu ekspresiju plazmida sisara. Svaki plazmid je upotrebljen da transfektuje HEK 293 ćelije i ekspresija je izvršena carried out u 20L kulture sredine. Protein je izolovan iz srednje kondicioniranog HEK upotrebom A proteinske hromatografije u skladu sa standardnom proteinskom metodom pročišćavanja. Medium sredina je bila was loaded opterećeni u hromatografsku smolu i eluirana u pH shift. Eluirani protein je bio pH prilagođen, dijalizovan, i sterilno filtriran pre upotrebe. Dobijeno antitelo je bilo bolje od 99 percent monomeric by analytical size exclusion chromatography with no high molecular weight aggregates observed. Ovo antitelo je subsequently posle toga upotrebljeno za evaluaciju u modelu psećeg svraba za evoluaciju efikasnosti in vivo.

Primer 9 Evaluacija kaninizovanog 34D03 antitela u psećem modelu svraba

[0190] Anti-svrab aktivnost kaninizovanog 34D03 (CAN 34D03-65 predstavljena saSEQ ID NO 31 (VH) uparenog sa SEQ ID NO 25 (VL) na SEQ ID NO 42 (HC-65) i SEQ ID NO 44 (LC-Kappa)) je procenjena upotrebom psećeg modela IL-31-indukovanog svraba. Sa ovim modelom, 1.5 mg/kg intravenozna stimulans doza rekombinirjućeg psećeg IL-31 poznatog da indukuje a transient prolazni period ponašanja vezanog za svrab kod bigl pasa (IL-31 stimulacija, trajanje svraba <24 sata) su ponovljeno davane pre i posle 63 pojedinačne 1.0 mg/kg SC doze CAN 34D03-65. U svakom IL-31 stimulus periodu, realno vreme video nadzora je korišćeno da se dobije mera ponašanja vezanog za svrab za 0.5 sati pre davanja citokina (pre-IL-31 osnovni period) sledilo je slično merenje 2 sata započeto 20 minuta posle ubrizgavanja citokina (2h post-IL-31 stimulativni period). Skor svraba je određen u svakom periodu evaluacije odlučivanjem „da/ne“ za ponašanje svraba tokom konsekutivnih intervala vremena od 1 minute (maksimalan skor svraba = 30 za svaki osnovni period; 120 za post-IL-31 stimulativni period). Slika 17 rezimira skorove svraba dobijene pre i posle CAN 34 D03-65 tretmana,koji je dat =. Dana studije. Sedam dana pre mAb tretmana, srednji post-IL-31 stimulativni skor svraba pasa je bio 68613 (S.E., n=4). Poređenjem, dana 7, 14, 21 ove studije, srednji post-IL-31 stimulativni skor svraba je bio manji od 5 6 2, 86 4, i 96 5, respektivno. Ove promene skora svraba između 7. dana i dana 7-21 pokazuju ≥85% smanjenje u celokupnoj in overall reaktivnosti svrba na IL-31. Stepen inhibicije IL-31-indukovanog svraba bi mogao ustvari da bude bliži 100% tokom tog vremensko okvira if one considers između 0. i 21. dana, 0.5h pre-IL-31 osnovni skorovi su prosečno 1.66 0.6-- nivo that would extrapolate što će dati vrednost skor svraba 6-7 over a 2h perioda. Reaktivnost svraba tretiranih pasa na exogenous IL-31 je postepeno povrati tokom vremena. Do 63 dana post-CAN D03-65 tretmana, mean srednji 2h post-IL-31 skor stimulacije svraba se povećao na had increased to 576 8 ili grubo 84% pre-mAb IL-31 stimulans odgovora uočenih 7. dana. Dakle, u modelu IL-31-indukovnog svraba, pojedinačno bolus SC ubizagvanje CAN 34D03-65 je obezbedilo nedelje zaštite od svraba kod tretiranih pasa.

Primer 10 Karakterizacija mačjeg IL-31

[0191] Sekvenca mačjeg IL-31 je identifikovan zahvaljujući sličnosti istraživanja mačjih genoma sa psećim IL-31 upotrebom NCBIs genomskih izvora (www.ncbi.nlm.nih.gov). Gen koji predstavlja mačji IL-31 je sintetizovan za optimalnu ekspresiju u Ešerija koli. Ekspresioni konstrukti su kreirani sa psećim i mačjim IL-31 genima potpune dužine koji sadrže N-terminal 6-His tag označen za detekciju i pročišćavanje. Mačji konstrukt potpune dužine upotrebljen u Ešerija koli je predstavljen sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 69 i proteinskom sekvencom SEQ ID NO: 70. Sekvenca koja potvrđuje plazmid je upotrebljena za transformaciju Ešerije koli. BL21 Star™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) i ekspresije su izvršene na 30 C tokom 5 sati. Nakon lysis of pellets povezivanja i peletacije ćelija nađeno je da imunoreaktivni protein visoko obogaćen u nerastvorljivom lysate lizatu. Ove pellets ćelije su bile rastvorene u 6M urea mokraće a pročišćenje proteina je izvršeno pod neprirodnim uslovimakorišćenjem nikel kobaltne smole(Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL). Potopljena eluirana frakcija se pokazuje pozitivna za prisustvo His tag označen,je bila dijalizovana step against 0.8 M mokraće PBS koju sledi PBS, i analizirana pomoću SDS PAGE (Slika 18). Kao što je prethodno uočeno, prinos rekombinirajućeg psećeg IL-31 iz E.coli koli indukcije je bio nizak. Međutim, protein je bio recovered post purification that migrated u skladu s očekivanom molekularnom masom prema SDS-PAGE.

[0192] Da bi se ispitala biološka aktivnsot psećeg i mačjeg IL-31 napravljenog iz Ešerija koli svaki kod svakog proteina je analizirana sposobnost da indukuje pSTAT signalizaciju u DH82 ćelijskom testu. Kako rekombinirjući IL-31 iz ćelija sisara (pseći IL31(CHO)) je visoko glikolizovan glycosylated, bilo je nejasno da li će neglikolizovana forma održati biološku aktivnost. Slika 19 pokazuje da mačji IL-31 ima sličnu has comparable bioaktivnost sa reference IL-31 napravljenog u CHO ćelijama.

[0193] Alanin-skrining mutageneza IL-31 kanina definisala je region unutar proteina koji je neophodan za vezivanje za 11E12 i 34D03 antitela. Pretpostavljeno je, usled konzervacije sekvence u ovom regionu (Slika 20), da bi ova mAbs unakrsno reagovala sa IL-31 felina.

[0194] Slika 21 pokazuje da mAbs 11E12 i 34D03 su sposobni za vezivanje sa psećim IL-31 (Ešerija koli ) i da su takođe sposobni za ukrštenu reaktivnost sa mačjim IL-31 proteinom. Zasnovana na ovim podacima, specijacija 34D03 antitela u mačji (felinizacija) je bila obavljena.

Primer 11 Felinizacija antitela 34D03

[0195] Slično opisnoj kaninizujućoj strategiji, odgovarajuća klicna antitelo sekvenca je identifikovana iz svih dostupnih mačjih dostupnih sekvenci za CDR kalemljenog iz mAb 34D03. Varijabilni laki lanac (SEQ ID NO: 71 FEL-34D03-VL021-1, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za koju je SEQ ID NO: 72) i arijabilni teški lanac (SEQ ID NO: 73 FEL-34D03-VH-035-1, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za koju je SEQ ID NO: 74) su odabrani zavisno od najviše homologije sa njihovim odgovarajućim psećim matricama u kaninizovanom 34D03. Rekombinirani felinizirani 34D03 je napravljen upotrebom odabranih varijabilnih oblasti povezane sa njihovim odgovrajućim konstantno teškim IgG1 (SEQ ID NO: 75 HC-A Mačja, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za koju je SEQ ID NO: 76 GenBanka akcesija No. AB016710.1) i kapa konstantnih lakih (SEQ ID NO: 77 LC-Kappa Feline, odgovarajuća nukleotidna sekvenca za koju je SEQ ID NO: 78 GenBank akcesija No. AF198257.1) lančana sekvenca. Antitela su napravljena iz HEK ćelija i pročišćena kao što je prethodno opisano. Slika 22 sposobnost mačjeg 34D03 da neutrališe pSTAT signalizaciju uporediv IC50 sa psećom verzijom.

[0196] Ocenjena je sposobnost feniliziranog 34D03 za vezivanje i mačjeg i psećeg IL-31. Slika 23 pokazuje Vestern blotove sa feliniziranim 34D03 upotrebom pročišćenog proteina iz sisarskih i Ešerija koli izvora. Conclusive Sva vezivanja su posmatrana i za pseće i za mačje proteine pokazujući potpunu unakrsnu reaktivnost feliniziranog oblika 34D03 i potvrdu verification vezivanja za mačji protein. Uzeti zajedno ovi rezultati sugerišu da konzervisani epitop na mačjem IL31 možda bude željeni cilj za inhibiciju ovog citokina kod mačaka.

Primer 12 Detekcija IL-31 citokina kod pasa sa prirodno ispoljenim atopičnim dermatitisom

[0197] U ovom primeru, upotrebom kvantitativne imunotestovne tehnike procenjen je nivo IL-31 proteina u serumu skupljenom od populacije pasa in serum collected from populations of dogs, uključujući one sa atopičnim dermatitisom.

In the present example, the level of IL-31 protein in serum collected from populations of dogs, including those with atopic dermatitis, was evaluated using a quantitative immunoassay technique.

[0198] Serum je skupljen iz sledećih populacija pasa u zaleđen pre IL-31 serum merenja.

1) 24 s namerom uzgajani purpose bred biglova (Marshall BioResources, North Rose, NY)pre i posle senzitizacije na alergen kućne prašine (Dermatophagoides farina, Greer Labs). Sve životinje su imale od prilike 9 meseci. Dva pola su bila zastupljena približno.

2) 30 pasa alergičnih na buve (Youngs Veterinary Research Services, Turlock, CA) pre zaraženosti buvama od prilike nedelju dana posle infestation zaraze sa odraslim mačjim buvama(Ctenocephalides felis). Najveći deo ovih pasa su bili mešanci. Proečna starost je bila oko 10.5 godina. Dva pola su bila zastupljena približno.3) 87 vlasničkih pasa sa sub-clinical periodontalnom bolešću, ali inače dobrog zdravlja. Uzorci su skupljeni u 18 američkih veterinarskih stanica.

Životinje su predstavnici američke populacije što se tiče vrste i uzgoja i bile su stare od 2 do 4 goidna 4) 124 vlasničkih pasa dijagnostikovanih sa hroničnim, nesezonskim atopičnim dermatitisom koji traje bar godinu dana (zasnovano na modifikovanim kriterijumima Vilemsa i Prelo (Willemse T. J small Anim Pract 1986; 27:771-778 i Prelaud i al. Revue de Medecine Veterinaire 1998; 149: 1057-1064) sa minimum "srednjeg češanja itching" po proceni vlasnika, i s minimalnim skorom povreda kože od 25 na CADESI-02 koji je dao veterinar. Uzorak je uzet iz 14 US veterinarskih praksi sa ekspertizom iz veterinarske dermatologije. Približno 75% pasa je bilo čistokrvnih purebred i ∼25% totalne populacije su bili retriveri (Labrador (17.3%) i Zlatni (8.2%)). Psi su bili srednjih godina (∼6 godina stari). Dva pola su bila zastupljena približno.

[0199] Korišćen je sendvič imunotest za kvantifikaciju cIL-31 nivoa u psećem serumu. Serum uzoraka je bio razblažen 1:2 u Rexxip baferu (Gyrolab, Warren, NJ) i run on Bioaffy 1000 nL CDs (Gyrolab) upotrebivši Gyrolab xP workstation. cIL-31 je uhvaćen biotin-labelizovanim anti-IL-31 monoklonalnim antitelom u skladu s ovim pronalaskom i detektovan sa Alexaflour 647 labelizovanim anti-IL-31 monoklonalnim antitelom u skldu sa ovim pronalaskom.Uzorci koncentracija cIL-31 su ekstrapolated iz 8-point standardne curve krivulje sa dinamičkim rangom od 0.013-250 ng/mL upotrebom 5-parmameter fit modela sa Gyrolab softverom evaluacije.

[0200] Nivoi cIL-31 su detektovani u serumu uzoraka 57% kod pasa sa prirodno nastalim atopičnim dermatitisom (≥13 pg/mL) ali nisu zabeleženi (< 13 pg/mL) u serumu iz s namerom uzgajane, rasne biglova purpose-bred /- senzitizovanih na HDM, mešanci mixed breed psi /-zaraženi buvama, ili vlasnički hpasa sa periodontalnom bolešću ali su s druge strane smatrani dobrog zdravlja, u odnosu na rasne. Kod pasa sa prirodno razvijenim atopičnim dermatitisom, 53% analiziranog uzorka pokazuje serum IL-31 nivoe između 13-1000 pg/mL, i 4% pokazuje nivoe iznad 1000 pg/mL (Tabela 5).

TABELA 5: Serum IL-31 nivoi različitih psećih populacija

[0201] Rezultati ovog primera pokazuju da IL-31 protein je povećan u značajnom broju kod pasa sa psećim atopičnim dermatitisom. Bez želje da se vežemo i za jednu teoriju veruje se da put igra ulogu u patologiji stanja alergijskog svraba, kao što su, bez ograničenja na njih, pseći atopični dermatitis predstavlja novi put za teraputske intervencije sa IL-31 antagonistom kao što je. Ali se na njega ne ograničava, olacitnib i/ili anti-IL-31 sntitelo koji se specifično vezuje za psećiano telo koje se specifično vezuje za IL-31.

1

LISTING SEKVENCI

<110> Pfizer Inc.

Bammert, Gary F.

Dunham, Steven A.

<120> INTERLEUKIN-31 MONOKLONSKO ANTITELO <130> PC71750

<150> 61/510,268

<151> 2011-07-21

<160> 78

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Tyr Tyr Asp Ile Asn

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ser Tyr Asp Met Ser

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Asn Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Thr Ile Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val Ile Arg Asp Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

Ala Arg Gln Asn Trp Val Val Gly Leu Ala Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15

Ala

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Gly Leu Met His

1 5 10 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16

Gln Gln Ser Asn Lys Asp Pro Leu Thr 1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 19

<211> 111

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 19

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Thr Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 20

<211> 111

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> sekvenca kaninizovanog varijabilnog lakog lanca mAb, od Mus musculus i Canis

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 111

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 21

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser 65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95

Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 22

<211> 113

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 22

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly 1 5 10 15

Asp Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Gln 35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110

Lys

<210> 23

<211> 113

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 23

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 24

<211> 111

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 24

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Gly Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Thr

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 25

<211> 111

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 25

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Gly Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 26

<211> 121

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Tyr Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val Ile Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 121

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> sekvenca kaninizovanog varijabilnog te kog lanca mAb, od Mus musculus i Canis

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Tyr Tyr 20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ala Gly Leu Asp Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ala Gly Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val Ile Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 28

<211> 118

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ile Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Asn Trp Val Val Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 29

<211> 118

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 29

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Asn Trp Val Val Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 118

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 118

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 31

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 159

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 32

Met Leu Ser His Thr Gly Pro Ser Arg Phe Ala Leu Phe Leu Leu Cys 1 5 10 15

Ser Met Glu Thr Leu Leu Ser Ser His Met Ala Pro Thr His Gln Leu 20 25 30

Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser 35 40 45

Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu 50 55 60

Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro

85 90 95

Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys

100 105 110

Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp 115 120 125

Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser 130 135 140

Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln

145 150 155

<210> 33

<211> 477

<212> DNK

<213> Canis familiaris

<400> 33

atgctctccc acacaggacc atccaggttt gccctgttcc tgctctgctc tatggaaacc 60 ttgctgtcct cccatatggc acccacccat cagctaccac caagtgatgt acgaaaaatc 120 atcttggaat tacagccctt gtcgagggga cttttggaag actatcagaa gaaagagaca 180 ggggtgccag aatccaaccg taccttgctg ctgtgtctca cctctgattc ccaaccacca 240 cgcctcaaca gctcagccat cttgccttat ttcagggcaa tcagaccatt atcagataag 300 aacattattg ataaaatcat agaacagctt gacaaactca aatttcaaca tgaaccagaa 360 acagaaattt ctgtgcctgc agatactttt gaatgtaaaa gcttcatctt gacgatttta 420 cagcagttct cggcgtgcct ggaaagtgtg tttaagtcac taaactctgg acctcag 477

<210> 34

<211> 333

<212> DNK

<213> Mus musculus

<400> 34

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gcactggtac 120 cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180 gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240 cctgtggaga ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaataa ggatccgctc 300 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333

<210> 35

<211> 363

<212> DNK

<213> Mus musculus

<400> 35

caggttcagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcaaa tactatgata taaactgggt gaggcagagg 120 cctgaacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gagatggtgg tactaagtac 180 aatgagacgt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcaggctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagagggggg 300 acttcggtga taagggatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360 tca 363

<210> 36

<211> 339

<212> DNK

<213> Mus musculus

<400> 36

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctgagtgtgt cagcaggaga taaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccatg gcagcctcct aaactgctga tctacggggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300 ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaa 339

<210> 37

<211> 354

<212> DNK

<213> Mus musculus

gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagc agctatgaca tgtcttgggt tcgccagatt 120 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attactagtg gtggtggtta cacctactct 180 gcagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccgtgt attattgtgc aagacaaaac 300 tgggtcgtgg ggttagctta ttggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354

<210> 38

<211> 333

<212> DNK

<213> Mus musculus

<400> 38

gacattttgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccatc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgtcagt tttgctggta ctggtttaat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagca acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaagct 180 ggggttccta ccaggtttag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caatatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat ttctgtcagc aaagcaggga atatccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333

<210> 39

<211> 353

<212> DNK

<213> Mus musculus

<400> 39

gaggtgcagt tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt ctctttcagt aactatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagttatg gtggtagtta cacctactat 180 ccagacaata taaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgt aagggggtat 300 ggttacgata ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc gag 353

<210> 40

<211> 331

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 40

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu His Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Val His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Pro Val Phe Asn Glu Cys Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val 100 105 110

Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro 115 120 125

Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 130 135 140

Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val 145 150 155 160

Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln 165 170 175

Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln 180 185 190

Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp 195 200 205

Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala

210 215 220

His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser

225 230 235 240

Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro

245 250 255

Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu

260 265 270

Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr 275 280 285

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

290 295 300

Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr 305 310 315 320

Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 41

<211> 993

<212> DNK

<213> Canis familiaris

<400> 41

gcctccacca cggcgccctc ggttttccca ctggccccca gctgcgggtc cacttccggc 60 tccacggtgg ccctggcctg cctggtgtca ggctacttcc ccgagcctgt aactgtgtcc 120 tggaactccg gctccttgac cagcggtgtg cacaccttcc cgtccgtcct gcagtcctca 180 gggcttcact ccctcagcag catggtgaca gtgccctcca gcaggtggcc cagcgagacc 240 ttcacctgca acgtggtcca cccagccagc aacactaaag tagacaagcc agtgttcaat 300 gaatgcagat gcactgatac acccccatgc ccagtccctg aacctctggg agggccttcg 360 gtcctcatct ttcccccgaa acccaaggac atcctcagga ttacccgaac acccgaggtc 420 acctgtgtgg tgttagatct gggccgtgag gaccctgagg tgcagatcag ctggttcgtg 480 gatggtaagg aggtgcacac agccaagacc cagtctcgtg agcagcagtt caacggcacc 540 taccgtgtgg tcagcgtcct ccccattgag caccaggact ggctcacagg gaaggagttc 600 aagtgcagag tcaaccacat agacctcccg tctcccatcg agaggaccat ctctaaggcc 660 agagggaggg cccataagcc cagtgtgtat gtcctgccgc catccccaaa ggagttgtca 720 tccagtgaca cagtcagcat cacctgcctg ataaaagact tctacccacc tgacattgat 780 gtggagtggc agagcaatgg acagcaggag cccgagagga agcaccgcat gaccccgccc 840 cagctggacg aggacgggtc ctacttcctg tacagcaagc tctctgtgga caagagccgc 900 tggcagcagg gagacccctt cacatgtgcg gtgatgcatg aaactctaca gaaccactac 960 acagatctat ccctctccca ttctccgggt aaa 993

<210> 42

<211> 335

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 42

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys

100 105 110

Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu 130 135 140

Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln 145 150 155 160

Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln 165 170 175

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190

Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys 195 200 205

Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 210 215 220

Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser 225 230 235 240

Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys 245 250 255

Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln 260 265 270

Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu 275 280 285

Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg 290 295 300

Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu 305 310 315 320

His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 335

<212> DNK

<213> Canis familiaris

<400> 43

gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60 agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtct ggatatttcc ctgagccagt gaccgtgagt 120 tggaacagcg gctctctgac ctccggggtg cacacatttc catctgtgct gcagtctagt 180 ggcctgtact ccctgtcaag catggtgact gtgccttcct ctaggtggcc atcagaaact 240 ttcacctgca acgtggccca tcccgccagc aagaccaaag tggacaagcc cgtgcctaaa 300 agggagaatg gaagggtgcc aagaccacct gattgcccta agtgtccagc tccagaaatg 360 ctgggaggac caagcgtgtt catctttcca cccaagccca aagacacact gctgattgct 420 agaactcccg aggtgacctg cgtggtggtg gacctggatc cagaggaccc cgaagtgcag 480 atctcctggt tcgtggatgg gaagcagatg cagacagcca aaactcagcc tcgggaggaa 540 cagtttaacg gaacctatag agtggtgtct gtgctgccaa ttggacacca ggactggctg 600 aagggcaaac agtttacatg caaggtgaac aacaaggccc tgcctagtcc aatcgagagg 660 actatttcaa aagctagggg acaggctcat cagccttccg tgtatgtgct gcctccatcc 720 cgggaggaac tgtctaagaa cacagtgagt ctgacttgtc tgatcaaaga tttctttccc 780 cctgacattg atgtggagtg gcagagcaat gggcagcagg agccagaatc caagtacaga 840 accacaccac cccagctgga cgaagatggc tcctatttcc tgtacagtaa gctgtcagtg 900 gacaaatcta ggtggcagcg cggggatacc tttatctgcg ccgtgatgca cgaggctctg 960 cacaatcatt acacacaaga aagtctgtca catagccccg gcaag 1005

<210> 44

<211> 106

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 44

Arg Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp

1 5 10 15

Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln 35 40 45

Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser

65 70 75 80

His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr

85 90 95

Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys

100 105

<210> 45

<211> 318

<212> DNK

<213> Canis familiaris

<400> 45

aggaacgacg cccagcctgc tgtgtatctg tttcagccct cccctgatca gctgcacact 60 ggctctgcta gtgtggtgtg tctgctgaac agcttctacc caaaggatat caatgtgaag 120 tggaaagtgg acggcgtgat ccaggatact gggattcagg agtccgtgac cgaacaggac 180 aaagattcaa catatagcct gagctccact ctgaccatgt ctagtaccga gtacctgagc 240 cacgaactgt attcctgcga gatcactcat aagtccctgc cctctaccct gatcaagagc 300 ttccagagat cagagtgt 318

<210> 46

<211> 339

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> nukleotidna sekvenca koja kodira kaninizovani varijabilni laki lanac mAb sekvence, od Mus musculus i Canis

<400> 46

gagatcgtga tgacccagag ccccgccagc ctgagcctga gccaggaaga gaaagtcacc 60 atcacatgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctggcc 120 tggtatcagc agaagcccgg ccaggccccc aagctgctga tctacggcgc cagcacccgc 180 gagagcggcg tgccaagcag attttccggc agcggctccg gcaccgactt cagcttcacc 240 atcagcagcc tggaacccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacga ctacagctac 300 ccctacacct tcggccaggg taccaagctg gagatcaag 339

<210> 47

<211> 354

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> nukleotidna sekvenca koja kodira kaninizovani varijabilni te ki lanac mAb sekvence, od Mus musculus i Canis

<400> 47

gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgac ctggtcaagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgtgtgg ccagcggctt caccttcagc agctacgaca tgagctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gactgcagtg ggtggccacc atcaccagcg gcggaggcta cacctacagc 180 gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acgcccggaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagacagaac 300 tgggtcgtgg gcctggccta ctggggccag ggaacactcg tgaccgtctc gagc 354

<210> 48

<211> 333

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 48

gagatcgtga tgacccagag ccccgccagc ctgagcctga gccaggaaga gaaagtcacc 60 atcacatgca aggccagcca gagcgtgtcc ttcgccggca caggcctgat gcactggtat 120 cagcagaagc ccggccaggc ccccaagctg ctgatctacc gggccagcaa cctggaagcc 180 ggcgtgccaa gcagattcag cggcagcggc tccggcaccg acttcagctt caccatcagc 240 agcctcgaac ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccagc agagcagaga gtacccctgg 300 accttcggcc agggtaccaa gctggagatc aag 333

<210> 49

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 49

gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgac ctggtcaagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgtgtgg ccagcggctt caccttcagc aactacggca tgagctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gactgcagtg ggtggccacc atcagctacg gcggcagcta cacctactac 180 cccgacaaca tcaagggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccatgt actactgcgt gcggggctac 300 ggctacgaca caatggacta ctggggccag ggcaccctcg tgaccgtctc gagc 354

<210> 50

<211> 333

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 50

gatatagtga tgacacaaac tcctctcagt ctttccgtat caccgggaga accggcttcc 60 atttcctgtc gggcctcaga gtctgtggac aactacggga tatccttcat gcactggtat 120 cagcagaaac ccggccagcc ccctaaactc cttatttaca gggccagtaa tctggaaagc 180 ggtgtgcccg atcgatttag cggttccggg agcggcacag atttcaccct gcgaatctct 240 agagttgaag cggatgatgc aggagtatat tactgccagc aatccaataa ggatcccctt 300 acattcggcg cgggtaccaa gctggagatc aag 333

<210> 51

<211> 363

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 51

gaggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaaga ccagcggcta caccttcaag tactacgaca tcaactgggt ccgacaggcc 120 cctggcgccg gactggattg gatgggctgg atcttccccg gcgacggcgg caccaagtac 180 aacgagacat tcaagggcag agtgaccctg accgccgaca ccagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag agccggcgat atcgctgtgt actactgcgc cagaggcggc 300 accagcgtga tccgggacgc tatggactac tggggccagg gcaccctcgt gaccgtctcg 360 agc 363

<210> 52

<211> 333

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 52

gacattgtta tgactcagac gcccctgagc ctgagcgtct cccccggcga gcccgctagt 60 attagttgcc gggcatccga gtcagtggac aattatggca tcagctttat gcattggttt 120 cagcagaaac caggtcagtc ccctcaactc ctgatttaca gagcttccaa tctggaatca 180 ggcgttcctg acagatttag cggatcaggc tccgggacag atttcaccct gcgcatcagt 240 cgcgtggaag ccgatgacgc aggcgtctat tattgtcaac agtccaacaa ggatcccctt 300 acattcggag ccggtaccaa gctggagatc aag 333

<210> 53

<211> 111

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 53

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45

Gln Arg Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 54

<211> 333

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 54

gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtgt cccctggcga gcctgccagc 60 atcagctgca gagccagcga gagcgtggac aactacggca tcagcttcat gcactggttc 120 cagcagaagc ccggccagag cccccagcgg ctgatctaca gagccagcaa cctggaaagc 180 ggcgtgcccg atcggtttag cggctctggc agcggcaccg acttcaccct gcggatctct 240 cgggtggaag ccgatgacgc cggagtgtac tactgccagc agagcaacaa ggaccccctg 300 acctttggcg ccggtaccaa gctggagatc aag 333

<210> 55

<211> 148

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> IL-31 protein kanina pune du ine kodiran sa kodon optimizovanom nukleotidnom sekvencom

<400> 55

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser His Met Ala

1 5 10 15

Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu Glu

20 25 30

Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Glu 35 40 45

Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser 50 55 60

Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe

65 70 75 80

Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile

85 90 95

Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile 100 105 110

Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile

115 120 125

Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn 130 135 140

Ser Gly Pro Gln

145

<210> 56

<211> 444

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> kodon-optimizovana nukleotidna sekvenca koja kodira IL-31 protein kanina pune du ine

<400> 56

atgagaggat cccatcacca tcaccaccac ggctcatctc atatggctcc tactcaccaa 60 ttaccaccct ccgatgtccg taaaattatt ctcgaattac aacctttatc ccgcggtctg 120 ctcgaagatt accaaaaaaa agaaacaggc gtcccagaaa gcaaccgtac attactcctt 180 tgccttacct ccgattccca accacctcgt cttaactcat cagccattct cccttatttc 240 cgtgccattc gccctctttc tgataaaaat attattgaca aaattattga acaactcgac 300 aaattaaaat tccaacacga acccgaaacc gaaatctccg tacctgccga tacctttgaa 360 tgcaaatcct ttatcctcac tattttacaa caattctccg catgtctcga atccgtcttc 420 aaatctctca attccggtcc acag 444

<210> 57

<211> 151

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> aminokiselinska sekvenca koja odgovara IL-31 proteinu kanina sa N-terminalnim skra?enjem (-20N)

<400> 57

Met Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln 1 5 10 15

Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys

20 25 30

Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu

35 40 45

Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp

50 55 60

Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu

65 70 75 80

Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile

85 90 95

Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys

100 105 110

Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln Lys Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu 115 120 125

Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr

130 135 140

Gly His His His His His His

145 150

<210> 58

<211> 456

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> nukleotidna sekvenca koja kodira IL-31 protein kanina sa N-terminalnim skra?enjem (-20N) <400> 58

atgctcgaat tacaaccttt atcccgcggt ctgctcgaag attaccaaaa aaaagaaaca 60

ggcgtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 120

cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 180

aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 240

accgaaatct ccgtacctgc cgataccttt gaatgcaaat cctttatcct cactatttta 300

caacaattct ccgcatgtct cgaatccgtc ttcaaatctc tcaattccgg tccacagaag 360

ggcgagctca attcgaagct tgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat 420

tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cattga 456

<210> 59

<211> 131

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> aminokiselinska sekvenca koja odgovara IL-31 proteinu kanina sa

N-terminalnim skra?enjem (-40N)

<400> 59

Met Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser Asp

1 5 10 15

Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg

20 25 30

Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu

Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser

50 55 60

Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu

65 70 75 80

Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser

85 90 95

Gly Pro Gln Lys Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile

100 105 110

Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His

115 120 125

His His His

130

<210> 60

<211> 393

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> nukleotidna sekvenca koja kodira IL-31 protein kanina sa N-terminalnim skra?enjem (-40N) <400> 60

atggtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 60

cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 120

aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 180

accgaaatct ccgtacctgc cgataccttt gaatgcaaat cctttatcct cactatttta 240

caacaattct ccgcatgtct cgaatccgtc ttcaaatctc tcaattccgg tccacagaag 300

ggcgagctca attcgaagct tgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtcwcgat 360

tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cat 393

<210> 61

<211> 111

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<223> aminokiselinska sekvenca koja odgovara IL-31 proteinu kanina sa

N-terminalnim skra?enjem (-60N)

<400> 61

Met Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro

1 5 10 15

Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys

20 25 30

Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp

35 40 45

Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser

50 55 60

Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln Lys

65 70 75 80

Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu

85 90 95

Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His

100 105 110

<210> 62

<211> 333

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> nukleotidna sekvenca koja kodira IL-31 protein kanina sa N-terminalnim skra?enjem (-60N) <400> 62

atgcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 60

aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 120

accgaaatct ccgtacctgc cgataccttt gaatgcaaat cctttatcct cactatttta 180

caacaattct ccgcatgtct cgaatccgtc ttcaaatctc tcaattccgg tccacagaag 240

ggcgagctca attcgaagct tgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat 300

tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cat 333

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> nukleotidna sekvenca koja kodira IL-31 protein kanina sa C-terminalnim skra?enjem na poziciji 20-122

<400> 63

Met Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln

1 5 10 15

Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys

20 25 30

Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu

35 40 45

Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp

50 55 60

Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu

65 70 75 80

Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile

85 90 95

Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Lys Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu

100 105 110

Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg

115 120 125

Thr Gly His His His His His His

130 135

<210> 64

<211> 411

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<400> 64

atgctcgaat tacaaccttt atcccgcggt ctgctcgaag attaccaaaa aaaagaaaca 60 ggcgtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 120 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 180 aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 240 accgaaatct ccgtacctgc cgataccttt gaatgcaaat cctttatcct cactatttta 300 caacaattct ccaagggcga gctcaattcg aagcttgaag gtaagcctat ccctaaccct 360 ctcctcggtc tcgattctac gcgtaccggt catcatcacc atcaccattg a 411

<210> 65

<211> 114

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> aminokiselinska sekvenca koja odgovara IL-31 proteinu kanina sa C-terminalnim skra?enjem na poziciji 20-100

<400> 65

Met Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln 1 5 10 15

Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys 20 25 30

Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu 35 40 45

Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp

50 55 60

Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu

65 70 75 80

Thr Glu Lys Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro

85 90 95

Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His

<210> 66

<211> 345

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> nukleotidna sekvenca koja kodira IL-31 protein kanina sa C-terminalnim skra?enjem na poziciji 20-100

<400> 66

atgctcgaat tacaaccttt atcccgcggt ctgctcgaag attaccaaaa aaaagaaaca 60 ggcgtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 120 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 180 aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 240 accgaaaagg gcgagctcaa ttcgaagctt gaaggtaagc ctatccctaa ccctctcctc 300 ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat caccatcacc attga 345

<210> 67

<211> 94

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> aminokiselinska sekvenca koja odgovara IL-31 proteinu kanina sa C-terminalnim skra?enjem na poziciji 20-80

<400> 67

Met Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln 1 5 10 15

Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys 20 25 30

Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu

35 40 45

Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Lys Gly

50 55 60

Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu

65 70 75 80

Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His

85 90

<210> 68

<211> 285

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> nukleotidna sekvenca koja kodira IL-31 protein kanina sa C-terminalnim skra?enjem na poziciji 20-80

<400> 68

atgctcgaat tacaaccttt atcccgcggt ctgctcgaag attaccaaaa aaaagaaaca 60 ggcgtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 120 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 180 aatattaagg gcgagctcaa ttcgaagctt gaaggtaagc ctatccctaa ccctctcctc 240 ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat caccatcacc attga 285

<210> 69

<211> 444

<212> DNK

<213> Felis catus

<400> 69

atgagaggat cccatcacca tcaccaccac ggctcatctc atatggcccc cgcacatcgc 60 ctgcagccga gtgacattcg taaaattatc ttggagctgc gcccgatgtc caagggctta 120 ctgcaggatt atctgaagaa agagatcggg ctgcctgaaa gcaaccatag tagcctgccg 180 tgtttatcgt ctgatagcca gttaccacac atcaatggct ctgcgatttt gccctacttt 240 cgcgccatcc gtccgctgtc cgataaaaat accatcgaca aaattatcga acaactggat 300 aaattgaagt ttcagcgcga gcctgaagcg aaagtttcga tgccagcmga taacttcgaa 360 cgcaaaaact ttattttagc ggtgttgcag cagttttctg cctgtctgga acacgtgctc 420 cagtcactca atagtgggcc acaa 444

<210> 70

<212> PRT

<213> Felis catus

<400> 70

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser His Met Ala

1 5 10 15

Pro Ala His Arg Leu Gln Pro Ser Asp Ile Arg Lys Ile Ile Leu Glu

20 25 30

Leu Arg Pro Met Ser Lys Gly Leu Leu Gln Asp Tyr Leu Lys Lys Glu

35 40 45

Ile Gly Leu Pro Glu Ser Asn His Ser Ser Leu Pro Cys Leu Ser Ser

50 55 60

Asp Ser Gln Leu Pro His Ile Asn Gly Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe

65 70 75 80

Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Thr Ile Asp Lys Ile Ile

85 90 95

Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln Arg Glu Pro Glu Ala Lys Val

100 105 110

Ser Met Pro Ala Asp Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe Ile Leu Ala Val

115 120 125

Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu His Val Leu Gln Ser Leu Asn

130 135 140

Ser Gly Pro Gln

145

<210> 71

<211> 111

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> sekvenca felinizovanog varijabilnog lakog lanca mAb, od Mus musculus i Felis catus

Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Gly Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 72

<211> 333

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> nukleotidna sekvenca koja kodira felinizovani varijabilni laki lanac mAb sekvence, od Mus musculus i Felis catus

<400> 72

gagattcaaa tgacccagag tcctagctca ctgagcgcat cacccgggga ccgcgtgacc 60 atcacgtgca aggcatctca gtccgtgtca ttcgctggaa ccggtctgat gcactggtat 120 cagcaaaaac cagggaaagt ccctaaactg ctgatctatc gcgcctccaa tcttgaggcc 180 ggggtgccat ctcggttctc tggtagcggc agcggaactg actttaccct gacaatctcc 240 tcactcgagc ctgaagacgc cgccacctac tactgtcaac agtccagaga atacccatgg 300 acctttggac agggtaccaa gctggagatc aaa 333

<210> 73

<211> 118

<212> PRT

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> sekvenca felinizovanog varijabilnog te kog lanca mAb, od Mus musculus i Felis catus

<400> 73

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 74

<211> 354

<212> DNK

<213> Ve ta?ki

<220>

<223> nukleotidna sekvenca koja kodira felinizovani varijabilni te ki lanac mAb sekvence, od Mus musculus i Felis catus

<400> 74

gacgtgcaac tggtcgaaag cggaggcgat cttgtgaagc caggtgggag tctccggctc 60

acatgcgtgg cctctggctt tacctacagc aactacggga tgagttgggt tcgccaggca 120 ccaggaaagg gcctgcaatg ggtggccact ataagctatg gtgggtccta tacctactac 180 cctgataata tcaaggggag attcactatt tcccgcgaca atgctaagaa tactctctac 240 ctccagatga atagcctgaa gactgaggat accgctacct actattgcgt gcgcggctac 300 ggctacgata ccatggacta ctggggacag ggaacccttg tcactgtctc gagc 354

<210> 75

<211> 335

<212> PRT

<213> Felis catus

<400> 75

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15

Thr Thr Ser Gly Ala Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Leu Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ala Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Leu Ser Asp Thr 65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Thr Val Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys 100 105 110

Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile

115 120 125

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu 130 135 140

Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln 145 150 155 160

Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser

165 170 175

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190

Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys 195 200 205

Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys

210 215 220

Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala

225 230 235 240

Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys 245 250 255

Ser Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln

260 265 270

Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser 275 280 285

Asp Gly Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His 290 295 300

Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu 305 310 315 320

His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys

325 330 335

<210> 76

<211> 1005

<212> DNK

<213> Felis catus

<400> 76

gcctccacca cggccccatc ggtgttccca ctggccccca gctgcgggac cacatctggc 60 gccaccgtgg ccctggcctg cctggtgtta ggctacttcc ctgagccggt gaccgtgtcc 120 tggaactccg gcgccctgac cagcggtgtg cacaccttcc cggccgtcct gcaggcctcg 180 gggctgtact ctctcagcag catggtgaca gtgccctcca gcaggtggct cagtgacacc 240 ttcacctgca acgtggccca cccgcccagc aacaccaagg tggacaagac cgtgcgcaaa 300 acagaccacc caccgggacc caaaccctgc gactgtccca aatgcccacc ccctgagatg 360 cttggaggac cgtccatctt catcttcccc ccaaaaccca aggacaccct ctcgatttcc 420 cggacgcccg aggtcacatg cttggtggtg gacttgggcc cagatgactc cgatgtccag 480 atcacatggt ttgtggataa cacccaggtg tacacagcca agacgagtcc gcgtgaggag 540 cagttcaaca gcacctaccg tgtggtcagt gtcctcccca tcctacacca ggactggctc 600 aaggggaagg agttcaagtg caaggtcaac agcaaatccc tcccctcccc catcgagagg 660 accatctcca aggccaaagg acagccccac gagccccagg tgtacgtcct gcctccagcc 720 caggaggagc tcagcaggaa caaagtcagt gtgacctgcc tgatcaaatc cttccacccg 780 cctgacattg ccgtcgagtg ggagatcacc ggacagccgg agccagagaa caactaccgg 840 acgaccccgc cccagctgga cagcgacggg acctacttcg tgtacagcaa gctctcggtg 900 gacaggtccc actggcagag gggaaacacc tacacctgct cggtgtcaca cgaagctctg 960 cacagccacc acacacagaa atccctcacc cagtctccgg gtaaa 1005

<210> 77

<211> 110

<212> PRT

<213> Felis catus

<400> 77

Arg Ser Asp Ala Gln Pro Ser Val Phe Leu Phe Gln Pro Ser Leu Asp

1 5 10 15

Glu Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Ile Val Cys Ile Leu Asn Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Glu Val Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Val Gln

35 40 45

Asn Lys Gly Ile Gln Glu Ser Thr Thr Glu Gln Asn Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Gln

Ser His Glu Lys Phe Ser Cys Glu Val Thr His Lys Ser Leu Ala Ser

85 90 95

Thr Leu Val Lys Ser Phe Asn Arg Ser Glu Cys Gln Arg Glu

100 105 110

<210> 78

<211> 330

<212> DNK

<213> Felis catus

<400> 78

cggagtgatg ctcagccatc tgtctttctc ttccaaccat ctctggacga gttacataca 60 ggaagtgcct ctatcgtgtg catattgaat gacttctacc ccaaagaggt caatgtcaag 120 tggaaagtgg atggcgtagt ccaaaacaaa ggcatccagg agagcaccac agagcagaac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacga tgtccagtac ggagtaccaa 240 agtcatgaaa agttctcctg cgaggtcact cacaagagcc tggcctccac cctcgtcaag 300 agcttcaaca ggagcgagtg tcagagagag 330

Claims

Patentni zahtevi

1. Anti-pseće IL-31 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za pseći IL-31 za upotrebu u tretmanu stanja svraba kod psa, naznačeno time da pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment smanjuje, inhibira, ili neutralizuje IL-31 aktivnost kod psa, i pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment inhibira pSTAT signalizaciju posredovanu psećim IL-31 u ćelijskom testu.

2. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da je antitelo monoklonsko antitelo.

3. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time da je antitelo himerno.

4. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time da je antitelo kaninizovano.

5. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koje sadrži najmanje jednog iz grupe koja se sastoji od:

regiona koji određuje komplementarnost (CDR)1 varijabilnog teškog (VH) lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDR1) ili NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-VH-CDR1);

CDR2 varijabilnog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12-VH-CDR2) ili TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2);

CDR3 varijabilnog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VH-CDR3) ili VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VH-CDR3); i

njihovu varijantu koja ima jednu do deset aminokiselinskih supstitucija u jednom ili više od CDR1, CDR2, i CDR3.

6. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, koje sadrži najmanje jedno iz grupe koja se sastoji od:

regiona koji određuje komplementarnost (CDR)1 varijabilnog lakog (VL) lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu RASESVDNYGISFMH (SEQ ID NO:10; 11E12-VL-CDR1) ili KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1);

CDR2 varijabilnog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2) ili RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2);

CDR3 varijabilnog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL-CDR3) ili QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL-CDR3); i njihovu varijantu koja ima jednu do deset aminokiselinskih supstitucija u jednom ili više od CDR1, CDR2, i CDR3.

7. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, koje sadrži najmanje jednu od sledećih kombinacija sekvenci regiona koji određuje komplementarnost (CDR):

a) 11E12: varijabilni teški (VH)-CDR1 prema SEQ ID NO: 1, VH-CDR2 prema SEQ ID NO: 4, VH-CDR3 prema SEQ ID NO: 7, varijabilni laki (VL)-CDR1 prema SEQ ID NO: 10, VL-CDR2 prema SEQ ID NO: 13, i VL CDR3 prema SEQ ID NO: 16; ili

b) 34D03: VH-CDR1 prema SEQ ID NO: 3, VH-CDR2 prema SEQ ID NO: 6, VH-CDR3 prema SEQ ID NO: 9, VL-CDR1 prema SEQ ID NO: 12, VL-CDR2 prema SEQ ID NO: 15, i VL-CDR3 of SEQ ID NO: 18.

8. Veterinarska kompozicija za upotrebu u tretiranju stanja svraba kod psa, naznačena time da veterinarska kompozicija sadrži terapeutski efektivnu količinu anti-psećeg IL-31 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji se vezuje za pseći IL-31 i smanjuje, inhibira, ili neutralizuje IL-31 aktivnost kod psa.

9. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačeno time da je stanje svraba izabrano iz grupe koja se sastoji od atopijskog dermatitisa, ekcema, psorijaze, skleroderme, i svraba.

10. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačeno time da je stanje atopijski dermatitis.

11. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačeno time da je stanje svraba karakterisano svrabom.

12. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 i 9 do 11 ili veterinarska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačeno time da tretman je tretman za ublažavanje stanja svraba kod psa.

13. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 i 9 do 11 ili veterinarska kompozicija prema patentnom zahtevu 8, naznačeno time da

(i) tretman olakšava stanje svraba kod psa; ili

(ii) tretman izaziva regresiju kliničkih simptoma.

11