RS67500B1 - Monoklonsko antitelo protiv interleukina-31 - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] OBLAST PRONALASKA

[0005] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovana anti-IL31 antitela u obliku veterinarskih kompoziicja korisnih za tretiranje pruritusnog stanja kod pasa.

[0007] OSNOVA PRONALASKA

[0009] Atopijski dermatitis je definisan od strane American College of Veterinary Dermatology radne jedinice kao "genetički predisponirana infalamatorna i pruritusna bolest kože sa karakterističnim kliničkim osobinama" (Olivry, et al. Veterinary Imunology and Imunopathology 2001; 81: 143-146). Radna jedinica je takođe prepoznala da je bolest kod pasa povezana sa alergen-specifičnim IgE (Olivry, et al. 2001 supra; Marsella & Olivry Clinics in Dermatology 2003; 21: 122-133). Težak pruritus, zajedno sa sekundarnom alopecijom i eritemom su najuočljiviji i najviše zabrinjavajući simptomi za vlasnike kućnih ljubimaca.

[0010] Prevalenca atopijskog dermatitisa nije precizno poznata usled slabih i nekonzistentnih epidemioloških podataka, ali se procenjuje da je 10% od ukupne populacije pasa (Marsella & Olivry 2003 supra; Scott, et al. Canadian Veterinary Journal 2002; 43: 601-603; Hillier Veterinary Imunology and Imunopathology 2001; 81: 147-151). Globalno, oko 4.5 miliona pasa je pogođeno sa hroničnim i doživotnim stanjem. Izgleda da se incidenca povećava. Sumnja se na sklonosti u odnosu na rasu i pol, ali mogu veoma varirati u zavisnosti od geografskog regiona (Hillier, 2001 supra; Picco, et al. Vet Dermatol.2008; 19: 150-155).

[0011] [0004] Potencijalni faktori uključeni u alergijski dermatitis su brojni i slabo shvaćeni. Komponente u hrani mogu biti okidač za atopijski dermatitis (Picco, 2008 supra), kao i sredinski alergeni kao što su buve, grinje, ambrozija, biljni ekstrakti, itd. Genetički faktori takođe igraju važnu ulogu. Iako nema potvrđene sklonosti u odnosu na rasu, smatra se da neki vid nasleđivanja povećava predispoziciju za atopijski dermatitis (Sousa & Marsella Veterinary Imunology and Imunopathology 2001; 81: 153-157; Schwartzman, et al. Clin. Exp. Imunol.1971; 9: 549-569.

[0012] Interleukin-31 (IL-31) je citokin koji je kloniran 2004. Uglavnom se proizvodi od strane aktiviranih T helper (Th)2 ćelija (Dillon et al. Nat Imunol 2004; 5:752-60), ali se takođe proizvodi u mast ćelijama i makrofagama. IL-31 se vezuje za koreceptor sastavljen od IL-31 receptora A (IL-31RA) i onkostatin M receptora (OSMR) (Dillon et al. 2004 supra and Bilsborough et al. J Allergy Clin Imunol. 2006 117(2):418-25). Aktivacija receptora rezultuje u fosforilaciji STAT preko JAK receptora (ili više njih). Ekspresija ko-receptora je pokazana kod makrofaga, keratinocita i u dorzalnoj spinalnoj gangliji. Nedavno, pronađeno je da je IL-31 uključen u dermatitis, pruritusne lezije kože, alergiju i hipersenzitivnost vazdušnih puteva. Videti Sl. 1.

[0013] Stimulacija T ćelija sa anti-CD3 i anti-CD28 antitelima momentalno ushodno reguliše ekspresiju iRNA za IL-31 (Dillon et al. 2004 supra). Analiza sa mikronizom je pokazala da IL-31 indukuje određene hemotaksične gene, kao što su CXCL1, CLL17 (timus i aktivacijom regulisani hemokin [TARC]), CCL19 (inflamatorni protein makrofaga [MIP]3β), CCL22 (monocit-izvedeni hemokin [MDC], CCL23 (MIP3), i CCL4 (MIPβ) (Dillon et al.2004 supra).

[0014] Transgeni miševi koji prekomerno eksprimiraju IL-31 pokazuju inflamaciju kože, pruritis, težak dermatitis, i alopeciju (Dillon et al. 2004 supra). Potkožna injekcija IL-31 u miševe okida infiltraciju inflamatornih ćelija, neutrofila, eozinofila, limfocita, i makrofaga, i rezultuje u zadebljanju epiderma i dermalnoj akantozi. Kod NC/Nga miševa, sa atopijskim dermatitisom (AD) usled prirodnih uzroka, IL-31 je prekomerno eksprimiran u lezijama kože i u korelaciji je sa pruritusom (Takaoka et al. Eur J. Pharmacol. 2005; 516, 180-181; Takaoka et al. Exp. Dermatol. 2006; 15, 161-167). Takođe, u mišjim modelima, pokazano je da IL-31 indukuje rapidni početak pruritusa (Raap et al.

[0015] Allergy Clin Imunol. 2008;122(2):421-3)

[0016] Mizuno et al. (Veterinary Immunology and Immunopathology, vol. 131 , no. 1‑2, pages 140‑143) opisuje kloniranje psećeg interleukina‑31 .Objavljeno je da anti-IL-31 antitelo ublažava češanje kod NC/Nga miševa (Grimstad et al, Exp. Dermatol.2009, 18:35-43). WO 2006/122079 i US 2009/0252732 opisuju opšte postupke za stvaranje anti-IL‑31 antitela. US 2010/0075996 opisuje jedinjenja koja se mogu koristiti kao JAK inhibitori i farmaceutske kompozicije koje sadrže ova jedinjenja. Olivry et al. (Veterinary Dermatology, 21 , 233‑248) reviews the treatment of canine atopic dermatitis. WO 03/060080 discloses caninized antibodies.

[0017] Dodatne studije su ukazale da je IL-31 povezan sa atopijskim dermatitisom indukovanom kožnom inflamacijom i pruritusom kod ljudi. Kod humanih AD pacijenata, ekspresija iRNK za IL-31 je značajno viša u lezijama kože nego u koži bez lezija, i ekspresija u koži bez lezija je veća od one kod normalne kože kod zdravih pacijenata (Sonkoly et al. J Allergy Clin Imunol 2006; 117:411-7). Sledeća studija je objavila da CD45RO+ (memorijske) za kožni antigen limfocita (CLA)-pozitivne T ćelije u koži AD pacijenata eksprimiraju IL-31 iRNK i protein (Bilsborough et al. 2006 supra). Takođe je objavljeno da prekomerna ekspresija IL-31 iRNK u koži pacijenata ili alergijski kontaktni dermatitis je u korelaciji sa IL-4 i IL-13 iRNK ekspresijom, ali ne sa ekspresijom iRNK interferona (IFN)-γ (Neis et al. J. Allergy Clin. Imunol.

[0018] 2006; 118, 930-937). Dodatno, pokazano je da su nivoi IL-31 u serumu povišeni kod humanih pacijenata sa hroničnom spontanom urtikarijom i još više kod pacijenata sa AD (Raap et al. Exp Dermatol. 2010;19(5):464-6). Takođe, korelacija težine AD sa nivoom IL-31 u serumu je uočena kod ljudi (Rapp et al. 2008 supra). Takođe je pokazano da je sekrecija IL-31 pojačana u mast ćelijama nakon IgE unakrsnog vezivanja i kao odgovor na stafilokokni superantigen kod atopijskih pojedinaca. Dodatno, pokazano je da IL-31 stimuliše proizvodnju nekoliko proinflamatornih medijatora uključujući IL-6, IL-8, CXCL1, CC17 i više metaloproteinaza u humanim miofibroblastima u debelom crevu (Yagi,et al. International Journal of Molecular Medicine 2007; 19(6): 941-946.

[0019] Hipersenzitivnost tipa I na sredinske alergene smatra se glavnim mehanizmom AD pasa, i nivoi Th2-posredovanih citokina, kao što je IL-4 su povećani u lezijama kože pasa sa AD (Nuttall, et al. Vet. Imunol. Imunopathol. 2002; 87, 379-384). Dodatno, infiltracija inflamatornih ćelija, limfocita i neutrofila, važan je mehanizam koji je u osnovi pogoršanja lezija na koži; prekomerna ekspresija hemotaksičnih gena kao što su CCL17/TARC, CCR4, i CCL28/mukozapovezani epitelni hemokin (MEC) doprinosi pogoršanju kožnih lezija kod pasa sa AD (videti, Maeda, et al. Vet. Imunol. Imunopathol. 2005; 103, 83-92; Maeda, et al. Vet. Imunol. Imunopathol.2002b; 90, 145-154; and Maeda, et al. J. Vet. Med. Sci.2008; 70, 51-55).

[0020] Skoriji dokazi su sugerisali da IL-31 može biti uključen u promociju alergijske inflamacije i odgovor epitela vazdušnih puteva kaarakterističan za alergijsku astmu (Chattopadhyay, et al. J Biol Chem 2007; 282:3014-26; and Wai, et al. Imunology, 2007; 122, 532-541).

[0021] [0013] Ove opservacije podržavaju hipotezu da IL-31 igra značajnu ulogu i u pruritusnim i alergijskim stanjima. Bilo bi poželjno obezbediti terapeutsko antitelo protiv IL-31 korisno za tretiranje pruritusnog stanja i/ili alergijskog stanja kod pasa ili mačaka.

[0023] REZIME PRONALASKA

[0025] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koje se specifično vezuje za pseći IL-31 koje sadrži region koji određuje komplementarnost (CDR)1 varijabilnog teškog (V<H>) lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-V<H>-CDR1), V<H>CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu TISYGGSYTYYPDNIKG(SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2) i V<H>CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu VRGYGYDTMDY(SEQ ID NO: 9; 34D03-V<H>-CDR3); i varijabilni laki (V<L>) lanac koji sadrži region koji određuje komplementarnost (CDR) 1 koji ima aminokiselinsku sekvencu KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-V<L>-CDR1), VL CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu RASNLEA(SEQ ID NO: 15; 34D03-V<L>-CDR2) i V<L>CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-V<L>-CDR3).

[0026] U nekim primerima izvođenja, antitelo je monoklonsko antitelo. U jednom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo je himerno. U sledećem primeu izvođenja, antitelo je kaninizovano.Antitelo smanjuje, inhibira, ili neutralizuje IL‑31 aktivnost kod psa. U poželjnim primerima izvođenja, antitelo smanjuje, inhibira, ili neutralizuje pruritusno stanje. Pruritusna stanja uključuju, na primer, atopijski dermatitis, ekcem, psorijazu, sklerodermu, i pruritus.

[0027] U nekim primerima izvođenja, antitelo može uključiti najmanje jedno od sledećeg:

[0029] a) varijabilni laki lanac koji sadrži

[0031]

[0033] b) varijabilni teški lanac koji sadrži

[0034]

[0037] i

[0038] c) varijante (a) i/ili (b) koje imaju jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija.

[0040] U jednom primeru izvođenja, antitelo je monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za region između aminokiselinskih ostataka 95 i 125 IL-31 aminokiselinske sekvence kanina od SEQ ID NO: 32. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za region između aminokiselinskih ostataka 102 i 122 IL-31 aminokiselinske sekvence kanina od SEQ ID NO: 32.

[0041] Predmetni pronalazak obezbeđuje veterinarsku kompoziciju koja uključuje terapeutski efiaksnu količinu najmanje jednog antitela opisanog prethodno.

[0042] U sledećeim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja proizvodi antitelo kao što je prethodno opisano .

[0043] U sledećeim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo ili njegov antigen vezujući deo kao što je definisano u patentnim zahtevima, koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira:

[0045] region koji određuje komplementarnost (CDR)1 varijabilnog teškog (V<H>) lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-VH-CDR1), V<H>CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-V<H>-CDR2) i V<H>CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu VRGYGYDTMDY(SEQ ID NO: 9; 34D03-V<H>-CDR3); i sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira

[0046] varijabilni laki (V<L>) lanac koji sadrži region koji određuje komplementarnost (CDR) 1 koji ima aminokiselinsku sekvencu KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-V<L>-CDR1), V<L>CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-V<L>-CDR2) i V<L>CDR3 koji ima aminokiselnsku sekvencu QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-V<L>-CDR3).

[0048] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje vektor uključujći nukleinske kiseline kao što je prethodno opisano.

[0049] U sledećim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela koji sadrži kultivisanje ćelije domaćina opisane prethodno pod uslovima koji rezultuju u proizvodnji antitela, i izolovanje antitela iz ćelije domaćina ili medijuma kulture ćelije domaćina. Pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigen-vezujući deo kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u tretiranju pruritusnog stanja pri čemu je promenjena terapeutski efektivna količina antitela. U nekim primerima izvođenja, pruritusno stanje je izabrano od atopijskog dermatitisa, ekcema, psorijaze, skleroderme, i pruritusa.

[0050] Ovde je opisan ali ne kao deo pronalaska, postupak za inhibiciju IL-31 aktivnosti kod psa ili mačke primenom antitela opisanog prethodno.

[0052] Opisano ovde ali ne kao deo pronalaska

[0054] je postupak za detekciju ili kvantifikaciju IL-31 u uzorku, pri čemu postupak uključuje inkubiranje kliničkog ili biološkog uzorka koji sadrži IL-31 u prisustvu antitela opisanog prethodno; i detekciju antitela koje je vezano sa IL-31 u uzorku. U jednom primeru izvođenja, antitelo je detektabilno obeleženo. U sledećem primeru izvođenja, antitelo je neobeleženo i korišćeno je u kombinaciji sa drugim antitelom koje je obeleženo.

[0056] Kratak opis crteža

[0058]

[0060] Slika 1 je šematski prikaz IL-31 puta.

[0061] Slika 2 je šematski prikaz opšte strukture mišjeg imunoglobulin G (IgG) molekula sa istaknutim mestom vezivanja antigena.

[0062] Slika 3 je šematski prikaz opšte strukture mišjeg:psećeg himernog IgG

[0063] Slika 4 je ilustracija koj apokazuje specijaciju ili "kaninizaciju" mišjeg IgG, mišji CDRs su graftovani na pseće okvirne regione identifikovane iz baza sekvenci

[0064] Slika 5 je ilustracija "heterohimernog" monoklonskog antitela uparenog sa himernim lakim lancem sa potpuno kaninizovanim teškim lancem.

[0065] Slika 6 ELISA titri od IL-31 imunizovanih miševa (CF-1 MU#1 - 4) u odnosu na stanje pre uzimanja krvi i pozitivne kontrolne miševa.

[0066] Slika 7 je ilustracija varijabilnih lanaca koja prikazuje prajmere za konstantne regione i degenerisane prajmere usmerene na mišje varijabilne regione.

[0067] Slika 8 je grafik pilot efikasnosti himernog 11E12 u placebo kontrolisanoj, sa pojedinačnom dozom, SC studiji (76A60).

[0068] Slika 9 je tabela koja prikazuje individualne pruritusne skorove od pasa uključenih u studiju 76A60.

[0069] Slika 10 su Western blotovi koji pokazuju vezivanje himernih (Blot #1), kaninizovanih (Blot#2), i heterohimernih (Blotovi #3 i 4) verzija 11E12 protiv psećeg IL-31. Heterohimera u Blotu #3 ima kaninizovani laki lanac uparen sa himernim teškim lancem. Heterohimera u Blotu #4 ima himerni laki lanac uparen sa kaninizovanim teškim lancem. Svaki nitrocelulozni blot sadrži – levu stazu, pre-obojene proteinske standarde (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) i desnu stazu, 800 ng psećeg IL-31.

[0070] Slika 11 je šematski pregled susptitucionog rada kaninizovanog 11E12 okvirnog regiona lakog lanca.

[0071] Slika 12 su Western blotovi koji pokazuju vezivanje kaninizovanih verzija 11E12 sa jednom povratnom mutacijom u mišje ostatke okvirnog regiona 2 lakog lanca. Svaki nitrocelulozni blot sadrži – levu stazu, pre-obojene proteinske standarde (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) i desnu stazu, 800 ng psećeg IL-31.

[0072] Slika 13 su Western blotovi sa punom dužinom i isečenim psećim IL-31 proteinima. Individualni nitrocelulozni blotovi su testirani sa A) anti-His B) 34D03 i C)11E12 antitelima. Staze 1-9 blotova odgovaraju sledećem: Staza 1-pre-obojeni proteinski standardi (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Staza 2- pseći IL-31 pune dužine; Staza 3- N-terminalno skraćenje - 20N; Staza 4- N-terminalno skraćenje -40N; Staza 5-N-terminalno skraćenje -60N; Staza 6-C-terminalno skraćenje -20C; Staza 7-C-terminalno skraćenje -40C; Staza 8-C-terminalno skraćenje -60C; i Staza 9- beta-galaktozidaza (lacZ). Napomena: IL-31 pune dužine i proteini sa C-terminalnim skraćenjima (-20, -40C, i -60C) nisu pokazali detektabilnu ekspresiju pod ovim uslovima.

[0073] Slika 14 su Western blotovi sa skraćenim psećim IL-31 proteinima. Individualni nitrocelulozni blotovi su testirani sa A) anti-His B) 11E12 i C) 34D03 antitelima. Staze 1-5 blotova odgovaraju sledećem: Staza 1-pre-obojeni proteinski standardi (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Staza 2-C-terminalno skračenje na položajima 20-122; Staza 3-C-terminalno skraćenje na položajima 20-100; Staza 4-C-terminalno skraćenje na položajima 20-80; i Staza 5-betagalaktozidaza (lacZ).

[0074] Slika 15 je deo Western blotova sa lizatima E. coli sojeva koji eksprimiraju pseći IL-31 sa supstituisanim alaninom za svaki mainokiselinski položaj (76-122). Individualni nitrocelulozni blotovi su testirani sa anti-His, 11E12 i, 34D03 antitelima, kao što je prikazano na Slici.

[0075] Slika 16 je deo sa Western blotovima sa dvostrukim i trostrukim mutacijama u psećem IL-31. -20N proteinski lizat je pušten kao pozitivna kontrola.

[0076] Slika 17 je grafik koji prikazuje pruritusni skor za pse kojima je potkožnom injekcijom ubruzgano kaninizovano 34D03 antitelo (1.0 mg/kg). Pruritusni skorovi su mereni svakog dana studije pre (osnovni odgovor) i nakon (2 h odgovor) provokacije sa 1.5 mg/kg psećeg IL-31. Slika 18 je 4-12 % Bis Tris SDS PAGE sa prečišćenim psećim i mačijim IL-31 proteinima. Panel A prikazuje coomassie bojenje proteina izveden pod redukujućim uslovima. Panel B prikazuje coomassie bojenje proteina izvedeno pod neredukujućim uslovima Panela. Paneli C i D su Western blotovi gelova identični sa A i B respektivno, testirani sa anti-His antitelom. Staza 1-pseći IL-31; Staza 2-mačiji IL-31; Staza 3- pre-obojeni proteinski standardi (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Staza 4-pseći IL-31; i Staza 5-mačiji IL-31.

[0077] Slika 19 is je grafik pSTAT sugnalizacije u psećim DH-82 monocitima indukovan sa psećim i mačijim IL-31 proizvednim u E. coli. Pseći IL-31 (CHO) je referentni protein korišćen za sve prethodne analize zasnovane na ćelijama, pseći pruritus model, i kao imunogen za inicijalnu identifikaciju antitela.

[0078] Slika 20 je poravnanje koja pokazuje konzervativnost sekvence između mačijeg i psećeg IL-31 u regionu proteina koji je uključen u vezivanje 11E12 i 34D03 antitela (obeleženo sa plus znakom).

[0079] Slika 21 su Western blotovi sa IL-31 proteinima. Individualni nitrocelulozni blotovi su testirani sa A) anti-His B) 11E12 i C) 34D03 antitelima. Napomena - Pseći IL-31 (CHO) ne sadrži 6-His tag.

[0080] Slika 22 je grafik koji prikazuje inhibiciju pSTAT siganlizacija indukovana psećim IL-31 u psećim DH82 monocitima koji poredi felinizovano i kaninizovano antitelo 34D03.

[0081] Slika 23 je Western blot mačijeg i psećeg IL-31 pod redukujućim uslovima testirani sa felinizovanim antitelom 34D03.

[0083] KRATAK OPIS SEKVENCI

[0085]

[0086] SEQ ID NO: 1 je CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao 11E12-VH-CDR1; SEQ ID NO: 2 je CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao 19D07-VH-CDR1;

[0087] SEQ ID NO: 3 je CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao 34D03-VH-CDR1;

[0088] SEQ ID NO: 4 je CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao 11E12-VH-CDR2; SEQ ID NO: 5 je CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao 19D07-VH-CDR2;

[0089] SEQ ID NO: 6 je CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao 34D03-VH-CDR2;

[0090] SEQ ID NO: 7 je CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao 11E12-VH-CDR3; SEQ ID NO: 8 je CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao 19D07-VH-CDR3;

[0091] SEQ ID NO: 9 je CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao 34D03-VH-CDR3;

[0092] SEQ ID NO: 10 je CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao 11E12-VL-CDR1; SEQ ID NO: 11 je CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao 19D07-VL-CDR1;

[0093] SEQ ID NO: 12 je CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao 34D03-VL-CDR1;

[0094] SEQ ID NO: 13 je CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao 11E12-VL-CDR2; SEQ ID NO: 14 je CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao 19D07-VLCDR2;

[0095] SEQ ID NO: 15 je CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao 34D03-VL-CDR2;

[0096] SEQ ID NO: 16 je CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao 11E12-VL-CDR3; SEQ ID NO: 17 je CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao 19D07-VL-CDR3;

[0097] SEQ ID NO: 18 je CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao 34D03-VL-CDR3;

[0098] SEQ ID NO: 19 je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao MU-11E12-VL;

[0099] SEQ ID NO: 20 je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao CAN-11E12-VL-cUn-FW2;

[0100] SEQ ID NO: 21 je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao CAN-11E12-VL-cUn-13;

[0101] SEQ ID NO: 22 je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao MU-19D07-VL;

[0102] SEQ ID NO: 23 je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao CAN-19D07-VL-998-1;

[0103] SEQ ID NO: 24 je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao MU-34D03-VL;

[0104] SEQ ID NO: 25 je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao CAN-34D03-VL-998-1;

[0105] SEQ ID NO: 26 je sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao MU-11E12-VH;

[0106] SEQ ID NO: 27 je sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao CAN-11E12-VH-415-1;

[0107] SEQ ID NO: 28 je sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao MU-19D07-VH;

[0108] SEQ ID NO: 29 je sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao CAN-19D07-VH-400-1;

[0109] SEQ ID NO: 30 je sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao MU-34D03VH;

[0110] SEQ ID NO: 31 je sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao CAN-34D03-VH-568-1;

[0111] SEQ ID NO: 32 je aminokiselinska sekvenca koja odgovara GenBank Accession No. C7G0W1 i odgovara psećem IL-31 proteinu pune dužine;

[0112] SEQ ID NO: 33 je nukleotidna sekvenca koja odgovara GenBank Accession No. C7G0W1 i odgovara nukleotidnoj sekvenci koja kodira pseći IL-31 protein pune dužine;

[0113] SEQ ID NO: 34 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao MU- 11E12-VL;

[0114] SEQ ID NO: 35 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao MU- 11E12-VH;

[0115] SEQ ID NO: 36 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao MU- 19D07-VL;

[0116] SEQ ID NO: 37 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao MU- 19D07-VH;

[0117] SEQ ID NO: 38 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao MU- 34D03-VL;

[0118] SEQ ID NO: 39 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao MU- 34D03-VH;

[0119] SEQ ID NO: 40 je aminokiselinska sekvenca za pseći konstantni region teškog lanca ovde označena kao HC- 64 (GenBank accession no. AF354264);

[0120] SEQ ID NO: 41 je nukleotidna sekvenca koja kodira pseći konstantni region teškog lanca ovde označena kao HC-64 (GenBank accession no. AF354264);

[0121] SEQ ID NO: 42 je aminokiselinska sekvenca za pseći konstantni region teškog lanca ovde označena kao HC- 65 (GenBank accession no. AF354265);

[0122] SEQ ID NO: 43 je nukleotidna sekvenca koja kodira pseći konstantni region teškog lanca ovde označena kao HC-65 (GenBank accession no. AF354265);

[0123] SEQ ID NO: 44 je aminokiselinska sekvenca za pseći konstantni region lakog lanca ovde označena kao kapa (GenBank Accession No. XP_532962);

[0124] SEQ ID NO: 45 je nukleotidna sekvenca koja kodira pseći konstantni region lakog lanca referred to as kapa (GenBank Accession No. XP_532962);

[0125] SEQ ID NO: 46 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao CAN- 19D07-VL-998-1;

[0126] SEQ ID NO: 47 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao CAN- 19D07-VH-998-1;

[0127] SEQ ID NO: 48 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao CAN- 34D03-VL-998-1;

[0128] SEQ ID NO: 49 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao CAN- 34D03-VH-568-1;

[0129] SEQ ID NO: 50 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao CAN- 11E12-VL-cUn-FW2;

[0130] SEQ ID NO: 51 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao CAN- 11E12-VH-415-1;

[0131] SEQ ID NO: 52 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao CAN- 11E12-VL-cUn-13;

[0132] SEQ ID NO: 53 je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao CAN-11E12_VL_cUn_1;

[0133] SEQ ID NO: 54 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao CAN- 11E12-VL-cUn-1;

[0134] SEQ ID NO: 55 odgovara aminokiselinskoj sekvenci psećeg IL-31 konstruktu pune dužine korišćenom ovde za E.coli ekspresiju;

[0135] SEQ ID NO: 56 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-31 konstruktu pune dužine korišćenom ovde za E.coli ekspresiju;

[0136] SEQ ID NO: 57 je aminokiselinska sekvenca psećeg IL-31 -20N konstrukta za E.coli ekspresiju; SEQ ID NO: 58 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-31 -20N konstruktu za E.coli ekspresiju;

[0137] SEQ ID NO: 59 je aminokiselinska sekvenca psećeg IL-31 -40N konstrukta za E.coli ekspresiju; SEQ ID NO: 60 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-31 -40N konstruktu za E.coli ekspresiju;

[0138] SEQ ID NO: 61 je aminokiselinska sekvenca psećeg IL-31 -60N konstrukta za E.coli ekspresiju; SEQ ID NO: 62 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-31 -60N konstruktu za E.coli ekspresiju;

[0139] SEQ ID NO: 63 je aminokiselinska sekvenca psećeg IL-31 20-122 konstrukta za E.coli ekspresiju;

[0140] SEQ ID NO: 64 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-31 20-122 konstruktu za E.coli ekspresiju;

[0141] SEQ ID NO: 65 je aminokiselinska sekvenca psećeg IL-31 20-100 konstrukta za E.coli ekspresiju;

[0142] SEQ ID NO: 66 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-31 20-100 konstruktu za E.coli ekspresiju;

[0143] SEQ ID NO: 67 je aminokiselinska sekvenca psećeg IL-3120-80 konstrukta za E.coli ekspresiju; SEQ ID NO: 68 je nukleotidna sekvenca koja odgovara psećem IL-3120-80 konstruktu za E.coli ekspresiju;

[0144] SEQ ID NO: 69 je nukleotidna sekvenca koja odgovara mačijem IL-31 konstruktu pune dužine za E.coli ekspresiju;

[0145] SEQ ID NO: 70 je aminokiselinska sekvenca koja odgovara mačijem IL-31 konstruktu pune dužine za E.coli ekspresiju;

[0146] SEQ ID NO: 71 je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao FEL-34D03-VL-021-1;

[0147] SEQ ID NO: 72 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca ovde označena kao FEL- 34D03-VL-021-1;

[0148] SEQ ID NO: 73 je sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao FEL-34D03-VH-035-1;

[0149] SEQ ID NO: 74 je nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca ovde označena kao FEL- 34D03-VH-035-1;

[0150] SEQ ID NO: 75 je aminokiselinska sekvenca za mačiji konstantni region teškog lanca ovde označena kao HC-A Mačiji (GenBank accession no. AB016710.1);

[0151] SEQ ID NO: 76 je nukleotidna sekvenca koja kodira mačiji konstantni region teškog lanca ovde označena kao HC-A Mačiji (GenBank accession no. AB016710.1);

[0152] SEQ ID NO: 77 je aminokiselinska sekvenca za mačiji konstantni region lakog lanca ovde označena kao LC-Kapa Mačiji (GenBank accession no. AF198257.1);

[0153] SEQ ID NO: 78 je ukleotidna sekvenca koja kodira mačiji konstantni region lakog lanca ovde označena kao LCKapa Mačiji (GenBank accession no. AF198257.1);

[0154] DEFINICIJE

[0156] Pre detaljnog opisa pronalaska, biće definisano nekoliko termina korišćenih u kontekstu predmetnog pronalaska. Dodatno ovim terminima, drugi su definisani na drugim mestima u specifikaciji, po potrebi. Ukoliko nije izričito drugačije naznačeno ovde, termini iz tehnike korišćeni u ovoj specifikaciji imaće njihova podrazumevana značenja u tehnici.

[0157] Kako je korišćeno u specifikaciji i patentnim zahtevima, oblik jednine "a", "an" i "the" uključuju reference na množinu ukoliko kontekst jasno ne zahteva drugačije. Na primer, referenca na "antitelo" uključuje množinu takvih antitela.

[0158] Kao što je ovde korišćeno, namera je da termin "sadrži" znači da kompozicije i postupci uključuju navedene elemente, ali ne isključujući druge.

[0159] Epitop, kao što je ovde korišćeno, odnosi se na antigenu determinantu prepoznatu od strane CDRs antitela. Drugim rečima, epitop se odnosi na ovaj deo bilo kog molekula koji je sposoban da bude prepoznat od strane, i veznan sa, antitelom. Ukoliko nije naznačeno drugačije, termin "epitop" kao što je ovde korišćeno, odnosi se na region IL-31 na koji reaguje anti-IL-31 sredstvo.

[0160] "Antigen" je molekul ili deo molekula sposoban da bude vezan sa antitelom koje je dodatno sposobno da bude prepoznato od strane, i vezano sa, antitelom (odgovarajući vezujući region antitela može se označiti kao paratop). Generalno, epitopi se sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula, na primer, bočnih lanaca aminokiselina ili šećera, i imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike kao i specifične karakteristike naelektrisanja.

[0161] [0032] Termin "specifično" u kontekstu vezivanja antitela, odnosi se na visok aviditet i/ili visok afinitet vezivanja antitela za specifični antigen, tj., polipeptid, ili epitop. U mnogim primerima izvođenja, specifični antigen je antigen (ili fragment ili subfrakcija antigena) korišćena za imunizaciju životinje domaćina iz koga su ćelije koje proizvode antitelo izolovane. Specifično vezivanje antitela sa natigenom je jače od vezivanja istog antitela sa drugim antigenima. Antitela koja se specifično vezuju za polipeptid mogu biti sposobna da vezuju druge polipeptide sa slabim, ali ipak detektabilnim nivoom (npr., pokazano 10% ili manje vezivanja sa polipeptidom od interesa). Takvo slabo vezivanje, ili vezivanje osnovnog nivoa, lako se razlikuje od specifičnog vezivanja antitela sa predmetnim polipetidom, npr. upotrebom odgovarajućih kontrola. Generalno, specifična antitela se vezuju za antigen sa afinitetom vezivanja sa KD od 10<-7>M ili manje, npr., 10<-8>M ili manje (npr., 10<-9>M ili manje, 10<-10>ili manje, 10<-11>ili manje, 10<-12>ili manje, ili 10<-13>ili manje, itd.).

[0162] Kao što je ovde korišćeno, termin "antitelo" odnosi se na intaktni imunoglobulin koji ima dva laka i dva teška lanca. Stoga jedno izolovano antitelo ili fragment može biti poliklonsko antitelo, mnoklonsko antitelo, sintetičko antitelo, rekombinantno antitelo, himerno antitelo, heterohimerno antitelo, ili kaninizovano antitelo. Termin "antitelo" poželjno se odnosi na monoklonska antitela i njihove fragmente, i imunološko vezivanje njihovih ekvivalenata koji se mogu vezati za IL-31 protein i njegove fragmente. Termin antitelo je korišćen i da se odnosi na homogeno molekulsko, ili smešu kao što je serumski proizvod stvoren od više različitih molekulskih entiteta.

[0163] "Nativna antitela" i "nativni imunoglobulini" su obično heterotetramerni glikoproteini od oko 150,000 Daltona, saastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je vezan sa teškim lancem sa jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok broj disulfidnih veza varira između teških lanaca različitih izotipova imunoglobulina. Svaki teški i laki lanac takođe ima regularno raspoređene intralančane disulfidne mostove. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH) nakon čega slede brojni konstantni domeni. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantni domen na njegovom drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, i varijabilni domen lakog lanca je poravnat sa varijabilnim domenom teškog lanca. Smatra se da određeni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnog domena lakog i teškg lanca. SL. 2 je primer opšte strukture nativnog mišjeg imunoglobulina G (IgG) sa naglašenim antigen vezujućim mestom.

[0164] Termin "fragment antitela" odnosi se na manje od intaktne strukture antitela, uključujući, bez ograničenja, izolovani jedan lanac antitela, Fv konstrukt, Fab konstrukt, Fc konstrukt, sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca ili regiona koji određuje komplementarnost (CDR), itd.

[0165] [0036] Termin "varijabilni" region sadrži okvirne regione i CDRs (drugačije poznate kao hipervarijabilni) i odnosi se na činjenicu da određeni delovi varijabilnih domena se izrazito razlikuju u sekvenci između antitela i korišćeni su u vezivanju i specifičnosti svakog određenog antitela za njegov određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije jedanko raspoređena kroz varijabilne domene antitela. Koncentrisana je u tri segmenta nazvana hipervarijabilni regioni i u varijabilnim domenima lakog lanca i teškog lanca. Više konzervativni delovi varijabilnih domena se nazivaju okvirni region (FR). Svaki od varijabilnih domena nativnih teških i lakih lanaca sadrži više FRs, u velikom delu zauzimajući konfiguraciju β-nabrane ploče, spojenih sa tri hipervarijabilna regiona, koji stvaraju petlje koje povezuju, i u nekim slučajevima formiraju deo, strukture α-naborane ploče. Hipervarijabilni regioni u svakom lancu drže se blisko zajedno sa FRs i, sa hipervarijabilnim regionima iz drugog lanca, doprinose formiranju antigen-vezujućeg mesta antitela (videti Kabat, et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela sa antigenom, ali pokazuju različite efektorne funkcije, kao što je učešće antitela u antitelo-zavisnoj ćelijskoj toksičnosti.

[0166] Termin "hipervarijabilni region" kada se ovde koristi odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske ostatke iz "regiona koji određuje komplementarnost" ili "CDR" (Kabat, et al. (1991), prethodno) i/ili one ostatke iz "hipervarijabilne petlje" (Chothia and Lesk J. Mol. Biol.

[0167] 196:901-917 (1987). "Okvirni" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena različiti od ostataka hipervarijabilnog regiona kao što je ovde definisano.

[0168] Digestija papainom antitela proizvodi dva identična antigen-vezujuća fragmenta, nazvana "Fab" fragmenti, svaki sa jednim antigen-vezujućim mestom, i rezidualnim "Fc" fragmentom, čiji naziv odražava njegovu sposobnost da se lako kristalizuje. Pepsin tretman daje F(ab’)2 fragment koji ima dva antigen-kombinovana mesta i još uvek je sposoban da unakrsno veže antigen.

[0169] "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži potpuno mesto prepoznavanja i mesto vezivanja antigena. Ovaj region se sastoji od dimera varijabilnog domena jednog teškog i jednog lakog lanca u bliskoj, nekovalentnoj vezi. U ovoj konfiguraciji tri hipervarijabilna regiona svakog varijabilnog domena interaguju da bi definisali antigen-vezujuće mesto na površini VH-VL dimera. Kolektivno, šest hipervarijabilnih regiona daju antigen-vezujuću specifičnost antitelu. Međutim, čak samo jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri hipervarijabilna regiona specifična za antigen) ima sposobnost da prepozna i veže antigen, iako na nižem afinitetu od celog mesta vezivanja.

[0170] [0040] Fab fragment takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po dodavanju nekoliko ostataka na karboksil terminus CH1 domena teškog lanca uključujući jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. Fab’-SH je ovde oznaka za Fab’ u kome cisteinski ostatak (ostaci) konstantnih domena nose slobodnu tiol grupu. F(ab’)2 fragmenti antitela originalno su proizvedeni kao parovi Fab’ fragmenata koji imaju zglobne cisteine između njih. Druga hemijska kuplovanja fragmenata antitela su takođe poznata.

[0171] "Laki lanci" antitela (imunoglobulini) iz bilo koje vrste kičmenjaka mogu se dodeliti jednom od dva jasno različita tipa, nazvana kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena.

[0172] U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, imunoglobulini se mogu dodeliti u različite klase. Trenutno postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, i nekoliko ovih može biti dodatno podeljeno u potklase (izotipove), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, i IgA2 (kao što je definisano mišjim i humanim oznakama). Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se alfa, delta, epsilon, gama, i mu, respektivno. Strukture subjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate kod više vrsta. Prevalenca individualnih izotipova i funkcionalnih aktivnosti povezanih sa ovim konstantnim domenima su species-specifične i moraju biti eksperimentalno definisane.

[0173] "Monoklonsko antitelo" kao što je ovde definisano je antitelo proizvedeno od strane jednog klona ćelija (specifično, jednog klona hibridoma ćelija) i stoga jedan čisti homogeni tip antitela. Sva monoklonska antitela proizvedena iz istog klona su identična i imaju istu antigen specifičnost. Termin "monoklonsko" odnosi se na jedan klon ćelija, jednu ćeliju, i progeniju te ćelije.

[0174] [0044] Monoklonska antitela ovde specifično uključuju "himerna" antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste, dok je ostatk lanca (lanaca) idetičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste, kao i fragmenti takvih antitela, dok pokazuju željenu biološku aktivnost. Tipično, himerna antitela su antitela čiji geni lakog i teškog lanca su konstruisani, tipično genetskim inženjeringom, iz gena varijabilnog i konstantnog regiona antitela koji pripadaju različitim vrstama. Na primer, varijabilni segmenti gena iz mišjeg monoklonskog antitela mogu se spojiti sa psećim konstantnim segmentima. SL. 3 je šematski prikaz opšte strukture jednog primera izvođenja mišjeg:psećeg IgG. U ovom primeru izvođenja, antigen vezujuće mesto je izvedeno iz miša dok je Fc deo pseći.

[0175] "Kaninizovani" oblici ne-psećih (npr., mišjih) antitela su genetičkim inženjeringom dobijena antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-psećeg imunoglobulina. Kaninizovana antitela su pseće sekvence imunoglobulina (antitelo primalac) u kojim su ostaci hipervarijabinog regiona primaoca zamenjeni sa ostacima hipervarijabilnog regiona iz ne-pseće vrste (antitelo donor) kao što je miš koji imaju željenu specifičnost, afinitet, i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) sekvenci psećeg imunoglobulina su zamenjene sa odgovarajućim ne-psećim ostacima. Dodatno, kaninizovana antitela mogu uključivati ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaocu ili u antitelu donoru. Ove modifikacije su napravljene da bi se dodatno rafinisala performansa antitela. Generalno, kaninizovano antitelo će uključiti suštinski sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili suštinski svi hipervarijabilni regioni odgovaraju onima kod ne-pseće imunoglobulinske sekvence i all ili suštinski svi od FRs su oni od pseće imunoglobulinske sekvence. Kaninizovano antitelo izborno takođe će sadržati kompletan, ili najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj od pseće imunoglobulinske sekvence. SL. 4 je ilustracija jednog primera izvođenja koja pokazuje specijaciju ili kaninizaciju mišjeg IgG. U ovom primeru izvođenja, mišji CDRs su graftovani na pseće okvirne regione.

[0176] [0046] "Felinizovani" oblici ne-mačijih (npr., mišjih) antitela su genetičkim inženjeringom dobijena antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-mačijeg imunoglobulina. Felinizovana antitela su mačije imunoglobulinske sekvence (antitelo primalac) u kojem su ostaci hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjene sa ostacima hipervarijabilnog regiona iz nemačije vrste (antiela donor) kao što je miš koja imaju željenu specifičnost, afinitet, i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) sekvenci mačijeg imunoglobulina su zamenjene sa odgovarajućim nemečijim ostacima. Dodatno, felinizovana antitela mogu uključivati ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaocu ili u antitelu donoru. Ove modifikacije su napravljene da bi se dodatno rafinisala performansa antitela. Generalno, felinizovana antitela će uključiti suštinski sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili suštinski svi hipervarijabilni regioni odgovaraju onima od sekvence nemačijeg imunoglobulina i svi ili suštinski svi od FRs su oni od sekvence mačijeg imunoglobulina. Felinizovano antitelo izborno će takođe sadržati kompletni, ili najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), tipično onog od mačije imunoglobulinske sekvence.

[0177] Termin "heterohimerno" kao što je ovde definisano, odnosi se na antitelo u kojem je jedan od lanaca antitela (teški ili laki) kaninizovan dok je drugi himerni. SL. 5 prikazuje jedan primer izvođenja heterohimernog molekula. U ovom primeru izvođenja, kaninizovani varijabilni region teškog lanca (gde su svi CDRs mišji i svi FRs su pseći) je uparen sa himernim varijabilnim regionom lakog lanca (gde su svi CDRs mišji i svi FRs su mišji). U ovom primeru izvođenja, i varijabilni region teškog i varijabilni region lakog lanca su fuzionisani sa psećim konstantnim regionom.

[0178] [0048] "Varijanta" anti-IL-31 antitela, ovde se odnosi na molekul koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od "roditeljskog" aminokiselinske sekvence anti-IL-31 antitela u adiciji, deleciji, i/ili supstituciji jedne ili više aminokiselinskih ostataka u sekvenci roditeljskog antitela i zadržava najmanje jednu željenu aktivnost predmetnog anti-IL-31-antitela. Željene aktivnosti mogu uključiti sposobnost da se veže specifično za antigen, sposobnost da smanji, inhibira ili neutralizuje IL-31 aktivnost kod životinje, i sposobnost da inhibira IL-31-posredovanu pSTAT signalizaciju u analizi zasnovanoj na ćelijama. U jednom primeru izvođenja, varijanta sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u jednom ili više hipervarijabilnih i/ili okvirnih regiona roditeljskog antitela. Na primer, varijanta može sadržati najmanje jedan, npr. od oko jednog do oko deset, i poželjno od oko dva do oko pet, supstitucija u jednom ili više hipervarijabilnih i/ili okvirnih regiona roditeljskog antitela. Obično, varijanta će imati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 50% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencama varijabilnog domena teškog ili lakog lanca roditeljskog antitela, poželjnije najmanje 65%, poželjnije najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, i najpoželjnije najmanje 95% identičnosti sekvence. Identičnost ili homologij au odnosu na ovu sekvencu je ovde definisana kao procenat aminokiselinskih ostataka u kandidat sekvenci koji su identični sa ostacima roditeljskog antitela, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ukoliko je neophodno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence. Nijednu od N-terminalnih, C-terminalnih, ili internih ekstenzija, delecija, ili insercija u sekvencu antitela ne treba konstruisati kao da utiče na identičnost ili homologiju sekvence. Varijanta zadržava sposobnost da se veže za IL-31 i poželjno ima željene aktivnosti koje su superiorne u odnosu na one kod roditeljskog antitela. Na primer, varijanta može imati jači afinitet za vezivanje, poboljšanu sposobnost da smanji, inhibira ili neutralizuje IL-31 aktivnost kod životinje, i/ili poboljšanu sposobnost da inhibira IL-31-posredovanu pSTAT signalizaciju u analizi zasnovanoj na ćelijama.

[0179] "Varijanta" nukleinske kiseline, ovde se odnosi na molekul koji se razlikuje u sekvenci od "roditeljske" nukleinske kiseline. Divergencija polinukleotidne sekvence može biti rezultat mutacionih promena kao što su delecije, supstitucije, ili adicije jednog ili više nukleotida. Svaka od ovih promena može se desiti zasebno ili u kombinaciji, jednom ili više puta u datoj sekvenci.

[0180] "Roditeljsko" antitelo ovde je ono koje je kodirano od strane aminokiselinske sekvence korišćene za pripremu varijante. Poželjno, roditeljsko antitelo ima pseći okvirni region i, ukoliko je prisutan, ima pseći konstantni region(e) antitela. Na primer, roditeljsko antitelo može biti kaninizovano ili pseće antitelo. Kao sledeći primer, roditeljsko antitelo može biti felinizovano ili mačije antitelo. Kao sledeći primer, roditeljsko antitelo je mišje monoklonsko antitelo.

[0181] Termin "izolovano" označava da materijal (npr., antitelo ili nukleinska kiselina) je razdvojen i/ili rekuperovan iz komponente njegovog prirodnog okruženja. Kontaminantne komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi uticali na dijagnostičke ili terapeutske upotrebe materijala, i mogu uključivati enzime, hormone, i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. U odnosu na nukleinsku kiselinu, izolovana nukleinska kiselina može uključivati onu koja je izdvojena iz 5’ do 3’ sekvenci sa kojima je normalno povezana u hromozomu. U poželjnim primerima izvođenja, materijal će biti prečišćen do više od 95% po težini materijala, i najpoželjnije više od 99% po težini. Izolovani materijal uključuje in situ unutar rekombinantnih ćelija jer najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja materijala neće biti prisutna. Obično, međutim, izolovani materijal će biti pripremljen sa najmanje jednim korakom prečišćavanja.

[0182] Reč "obeleživač" kada je ovde korišćena odnosi se na detektabilno jedinjenje ili kompoziciju koja je konjugovana direktno ili indirektno sa antitelom ili nukleinskom kisleinom. Obeleživač može sam po sebi biti detektabilan (npr., radioizotopski obeleživači ili fluorescentni obeleživači) ili, u slučaju enzimskih obeleživača, mogu katalizovati hemijsku izmenu supstratnog jedinjenja ili kompozicije koja je detektabilna.

[0183] [0053] Termini "nukleinska kiselina", "polinukleotid", "molekul nukleinske kiseline" i slično mogu se ovde koristiti naizmenično i odnositi se na seriju nukleotidnih baza (takođe označenih kao "nukleotidi") u DNK i RNK. Nukleinska kiselina može sadržati dezoksiribonukleotide, ribonukleotide, i/ili njihove analoge. Termin "nukleinska kiselina" uključuje, na primer, jednolančane i dvolančane molekule. Nukleinska kiselina može biti, na primer, gen ili fragment gena, egzoni, introni, molekul DNK (npr., cDNK), RNK molekul (npr., iRNK), rekombinantne nukleinske kiseline, plazmide, i druge vektore, prajmere i probe. I 5’ do 3’ (sens) i 3’ do 5’ (antisens) polinukleotidi su uključeni.

[0184] "Subjekat" ili "pacijent" odnosi se na životinju kojoj je potreban tretman na koji se može delovati molekulima prema pronalasku. Životinje koje se mogu tretirati u skladu sa pronalaskom uključuju kanine.

[0185] "Terapeutski efikasna količina" (ili "efikasna količina") odnosi se na količinu aktivnog sastojka, npr., sredstva prema pronalasku, dovoljnom da izazove korisne ili željene rezultate kada je primenjen na subjekta ili pacijenta. Efikasna količina se može primeniti u jednoj ili više primena, aplikacija ili doza. Terapeutski efikasna količina kompozicije prema pronalasku može se lako odrediti od strane stručnjaka. U kontekstu ovog pronalaska, "terapeutski efikasna količina" je ona koja proizvodi obejktivno merljivu promenu u jednom ili više parametara povezanih sa tretmanom pruritusnog stanja uključujući kliničko poboljšanje u simptomima. Naravno, terapeutski efikasna količina će varirati u zavisnosti od određenog subjekta i stanja koje se tretira, težine i starosti subjekta, težine bolesnog stanja, određenog izabranog jedinjenja, doznog režima koji se prati, vremena primene, načina primene i slično, pri čemu se svi mogu lako odrditi od strane stručnjaka.

[0186] Kao što je ovde korišćeno, termin "terapeutski" obuhvata ceo spektar tretmana bolesti ili poremećaja. "Terapeutsko" sredstvo prema pronalasku može delovati na način koji je profilaktički ili preventivni, uključujući one koji uključuju procedure dizajnirane za targetiranje životinja koje se mogu identifikovati da su u riziku (farmakogenetika); ili na način koji ublažava ili leči; ili mogu delovati tako da usporavaju stopu ili stepen progresije najmanje jednog simptoma bolesti ili poremećaja koje se tretira.

[0187] [0057] "Tretman", "tretiranje", i slično odnose se i na terapeutski tretman i profilaktičke ili preventivne mere. Životinje kojima je potreban tretman uključuju one koje već imaju poremećaj kao i one kod kojih se poremećaj može sprečiti. Termin "tretman" ili "tretiranje" bolesti ili poremećaja uključuje prevenciju ili zaštitu protiv bolesti ili poremećaja (odnosno, dovodeći do toga da se ne razviju klinički simptomi); inhibiciju bolesti ili poremećaja (tj., arest ili supresiju razvoja kliničkih simptoma; i/ili olakšavanje bolesti ili poremećaja (tj., izazivanje regresije kliničkih simptoma). Kao što će se shvatiti, nije uvek moguće razlikovati "prevenciju" i "supresiju" bolesti ili poremećaja jer krajnji induktivni događaj ili događaji mogu biti nepoznati ili latentni. Shodno tome, termin "profilaksa" podrazumeva da čini tip "tretmana" koji obuhvata i "prevenciju" i "supresiju." Termin "tretman" stoga uključuje "profilaksu".

[0188] Termin "alergijsko stanje" je ovde definisan kao bolest ili poremećaj izazvan interakcijom između imunog sistema i susptance koja je strana telu. Strana supstanca se naziva "alergen". Uobičajeni alergeni uključuju aeroalergene, kao što su poleni, prašna, buđi, proteini grinja, injektirana pljuvačka od ujeda insekata, itd. Primeri alergijskih stanja uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: alergijski dermatitis, letnji ekcem, urtikariju, opstrukciju pluća, inflamatorna bolest vazdušnih puteva, rekurentna opstrukcija vazdušnih puteva, hiperresponsivnost vazdušnih puteva, hronična opstruktivna plućna bolest, i inflamtorni procesi koji su rezultat autoimuniteta, kao što je sindrom iritabilnog creva (IBS).

[0189] Termin "pruritusno stanje" je ovde definisan kao bolest ili poremećaj koji se karakteriše intenzivnom senzacijom svraba koji proizvodi potrebu da se trlja ili češe koža da bi se došlo do olakšanja. Primeri pruritusnih stanja uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće: atopijski dermatitis, ekcem, psorijazu, sklerodermu, i pruritus.

[0190] Kao što je ovde korišćeno, termini "ćelija", "ćelijska linija", i "kultura ćelija" mogu se koristiti naizmenično. Svi ovi termini takođe uključuju njihovu progeniju, koja je bilo koja i sve naredne generacije. Podrazumeva se da sva progenija ne mora biti identična usled namernih ili slučajnih mutacija. U kontekstu ekspresije heterologne sekvencee nukelinske kiseline, "ćelija domaćin" se odnosi na prokariotsku ili eukariotsku ćeliju (npr., bakterijske ćelije, ćelije kvasca, ćelije sisara, i ćelije insekata) bilo da se nalaze in vitro ili in vivo. Na primer, ćelije domaćini mogu se nalaziti u transgenoj životinji. Ćelija domaćin se može koristiti kao primaoc za vektore i može uključivati bilo koji organizam koji se može transformisati koji je sposoban da replicira vektor i/ili eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu kodiranu od strane vektora.

[0191] Namera je da "kompozicija" označava kombinaciju aktivnog sredstva i drugog jedinjena ili kompozicije koja može biti inertna (npr., obeleživač), ili aktivna, kao što je ađuvant.

[0192] [0062] Kao što je ovde definisano, farmaceutski prihvatljivi nosači pogodni za upotrebu u pronalasku su dobro poznati stručnjacima. Takvi nosači uključuju, bez ograničenja, vodu, fiziološki rastvor, puferovani fiziološki rastvor, fosfatni pufer, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili supsenzije. Drugi konvencionalno primenjeni razblaživači, ađuvanti i ekscipijenti, mogu se dodati u skladu sa konvencionalnim tehnikama. Takvi nosači mogu uključiti etanol, poliole, i njihove pogodne smeše, biljna ulja, i injektabilne organske estre. Puferi i sredstva za podešavanje pH mogu se takođe koristiti. Puferi uključuju, bez ograničenja, soli pripremljene od organske kiseline ili baze. Reprezentativni puferi uključuju, bez ograničenja, soli organskih kiselina, kao šđto su soli limunske kiseline, npr., citrati, askorbinska kiselina, glukonska kiselina, histidin-HCI, ugljena kiselina, vinska kiselina, ćilibarna kiselina, sirćetna kiselina, ili ftalna kiselina, Tris, trimetanmin hidrohlorid, ili fosfatni puferi. Parenteralni nosači mogu uključivati rastvor natrijum hlorida, Ringer-ovu dekstrozu, dekstrozu, trehalozu, saharozu, i natrijum hlorid, laktat Ringer ili neisparljiva ulja. Intravenski nosači mogu uključiti obnovu tečnosti i nutrijenata, obnovu elektrolita, kao što su oni zasnovani na Ringer-ovoj dekstrozi i slično. Konzervansi i drugi aditivi kao što su, na primer, antimikrobna sredstva, antioksidanti, helatirajućia sredstva (npr., EDTA), inertni gasovi i slično mogu se takođe obezbediti u farmaceutskim nosačima. Priprema ovih farmaceutski prihvatljivih kompozicija, od prethodno opisanih komponenata, sa odgovarajućom pH izotoničnošću, stabilnošću i drugim konvencionalnim karkateristikama nalazi se unutar tehnike. Videti, npr., tekstove kao što su Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott Williams & Wilkins, publ., 2000; and The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.sup.th edit., eds. R. C. Rowe et al, APhA Publications, 2003.

[0193] Termin "konzervativna aminokiselinska supstitucija" označava bilo koju aminokiselinsku supstituciju za dati aminokiselinski ostatak, gde supstituent ostatka je toliko hemijski sličan onome u datom ostatku da nema nikakvog značajanog smanjenja u funkciji polipeptida (npr., enzimskoj aktivnosti). Konzervativne aminokiselinske supstitucije su opšte poznate u tehinic i njihovi primeri su opisani, npr., u SAD patentima br. 6,790,639, 6,774,107, 6,194,167, ili 5,350,576. U poželjnom primeru izvođenja, konzervativna aminokiselinska supstitucija biće bilo koja ona koja se dešava unutra jedne od seledećih šest grupa

[0195] • 1. Mali alifatični, suštinski nepolarni ostaci: Ala, Gly, Pro, Ser, i Thr;

[0196] • 2. Veliki alifatični, nepolarni ostaci: Ile, Leu, i Val; Met;

[0197] • 3. Polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi: Asp i Glu;

[0198] • 4. Amidi polarnih, negativno naelektrisanih ostataka: Asn i Gln; His;

[0199] • 5. Polarni, pozitivno naelektrisani ostaci: Arg i Lys; His; i

[0200] • 6. Veliki aromatični ostaci: Trp i Tyr; Phe.

[0201] U poželjnom primeru izvođenja, konzervativna aminokiselinska supstitucija će biti bilo koja od sledećih, koji su navedene kao nativni parovi ostataka (konzervativne supstitucije): Ala (Ser); Arg (Lys); Asn (Gln; His); Asp (Glu); Gln (Asn); Glu (Asp); Gly (Pro); His (Asn; Gln); Ile (Leu; Val); Leu (Ile; Val); Lys (Arg; Gln; Glu); Met (Leu; Ile); Phe (Met; Leu; Tyr); Ser (Thr); Thr (Ser); Trp (Tyr); Tyr (Trp; Phe); i Val (Ile; Leu).

[0202] Kao što polipeptid može sadržati konzervativne aminoksielinske supstitucije, njegov polinukleotid može sadržati konzervativne supstitucije kodona. Supstitucija kodona je smatrana konzervativnom ukoliko, kada je eksprimirana, proizvodi konzervativnu aminokiselinsku supstituciju, kao što je prethodno opisano. Degenerisana supstitucija kodona, koja ne rezultuje u supstituciji aminokiselina, takođe je korisna u polinukleotidima prema predmetnom pronalasku. Stoga, npr., polinukleotid koji kodira izabrani polipeptid koristan u primeru izvođenja predmetnog pronalaska može biti mutiran da degeneriše supstituciju kodona da bi se aproksimirala učestalost korišćenja kodona prikazana ekspresijom ćelije domaćina koju treba njim transformisati, ili da bi se na drugi način poboljšala njegova ekspresija.

[0204] DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0206] Terminologija korišćena ovde je samo za svrhu opisivanja određenih primera izvođenja, i nije namera da se limitira obim predmetnog pronalaska, koji je definisan jedino patentnim zahtevima.

[0207] Ukoliko nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini korišćeni u vezi sa antitelima opisanim ovde imaće ista značenja koja su uobičajeno podrazumevana od strane stručnjaka. Dodatno, ukoliko nije drugačije zahtevano kontekstom, termini u jednini će uključivati množinu i termini u množini će uključivati jedninu. Generalno, nomenklature korišćene u vezi sa, i tehnike, kulture ćelija i tkiva, molekularne biologije, i hemije proteina i oligo- ili polinukleotida i hibridizacija opisana ovde su one dobro poznate i uobičajeno korišćene u tehnici.

[0208] [0067] Standardne tehnike su korišćene za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, i kulturu tkiva i transfekciju (npr., elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja su izvedene u skaldu sa specifikacijama proizvođača ili kao što su obično rađene u tehnici ili kao što je ovde opisano. Prethodne tehnike i procedure su generalno izvedene prema konvencionalnim postupcima dobro poznatim u tehnici i kao što su opisane u različitim generalnim i specifičnijim referencama koje su citirane i razmatrane u predmetnoj specifikaciji, Videti npr., Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001) and Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (New York: Greene Publishing Association/ Wiley Interscience), 1993. Nomenklature korišćene u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije opisane ovde su one dobro poznate i uobičajeno korišćene u tehnici. Standardne tehnike su korišćene za hemijsku sintezu, hemijske analize, farmaceutske pripreme, formulaciju, i dopremanje, i treman pacijenata.

[0209] Osim u operativnim primerima, ili gde je drugačije naznačeno, svi brojevi koji izražavaju količine sastojaka ili reakcione uslove korišćene ovde treba shvatiti kao modifikovane u svim slučajevima sa terminom "oko."

[0210] Predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantna monoklonska antitela kao što je deifnisano u patentnim zahtevima i njihove upotrebe u kliničkim i naučnim procedurama, uključujći dijagnostičke procedure.

[0211] Sa napretkom postupaka molkeularne biologije i rekombinantne tehnologije, moguće je proizvesti antitelo antitelu-slične molekule rekombinantnim sredstvima i time stvoriti genske sekvence koje kodiraju specifične aminokiselinske sekvence koje se nalaze u polipeptidnoj strukturi antitela. Takva antitela se mogu proizvesti ili kloniranjem genske sekvence koja kodira polipeptidne lance pomenutih antitela ili direktnom sintezom pomenutih polipeptidnih lanaca, sa sastavljanjem sintetisanih lanaca da se formiraju aktivne tetramerne (H2L2) strukture sa afinitetom za specifčne epitope i antigene determinante. Ovo je omogućilo laku proizvodnju antitela koja imaju sekvence karakteristične za neutralizujuća antitela iz različitih vrsta i izvora.

[0212] [0071] Nezavisno od izvora antitela, ili kako su rekombinantno konstruisana, ili kako su sintetisana, in vitro ili in vivo, korišćenjem transgenih životinja, velikih ćelijskih kultura laboratorijske ili komercijalne veličine, korišćenjem transgenih biljaka, ili direktnom hmijskom sintezm koja ne upotrebljava žive organizme na bilo kom stadijumu procesa, sva antitela imaju sličnu opštu 3 dimenzionalnu strukturu. Ova struktura je često data kao H2L2 i odnosi se na činjenicu da antitela obično sadrže dva laka (L) aminokiselinska lanca i 2 teška (H) aminokiselinska lanca. Oba lanca imaju regione koji su sposobni da interaguju sa strukturno komplementarnim antigenim targetom. Regioni koji interaguju sa targetom označavaju se kao "varijabilni" ili "V" regioni i karakterišu se razlikama aminokiselinske sekvence od antitela različite antigene specifičnosti. Varijabilni regioni ili H ili L lanaca sadrže aminokiselinske sekvence sposobne da se specifično vezuju za antigene targete.

[0213] Kao što je ovde korišćeno, termin "antigen vezujući region" odnosi se na deo molekula antitela koji sadrži aminokiselinske ostatake koji interaguju sa antigenom i daju antitelu njegovu specifičnost i afinitet za antigen. Antitelo vezujući region uključuje aminokiselinske ostatke "okvirnog regiona" neophodne da se održi ispravna konformacija antigen-vezujućih ostataka.

[0214] Unutar varijabilnih regiona H ili L lanaca koji obezbeđuju antigen vezujuće regione su manje sekvence koje dubliraju "hipervarijabilne" usled njihove ekstremene varijabilnosti između antitela različitih specifičnosti. Takvi hipervrijabilni regioni se takođe označavaju kao "regioni koji određuju komplementarnost" ili "CDR" regioni. Ovi CDR regioni daju osnovnu specifičnost antitela za određenu strukturu antigene determinante.

[0215] CDRs predstavljaju nesusedne nizove aminokiselina unutar varijabilnih regiona ali, nezavisno od vrste, nađeno je da položajne lokacije ovih sekvenci kritičnih aminokiselina unutar varijabilnih regiona teškog i lakog lanca imaju slične lokacije unutar aminokiselinskih sekvenci varijabilnih lanaca. Svi varijabilni regioni teških i lakih lanaca svih antitela imaju tri CDR regiona, svaki nesusedan sa drugima.

[0216] Kod svih sisarskih vrsta, peptidi antitela sadrže konstantne (tj., visoko konzervativne) i varijabilne regione, i, unutar poseldnje pomenutih, postoje CDRs i takozvani "okvirni regioni" sačinjeni od aminokiselinskih sekvenci unutar varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca ali izvan CDRs.

[0217] U odnosu na antigenu determinatu prepoznatu sa CDR regionima antitela, ovo je takođe označeno kao "epitop." Drugim rečima, epitop se odnosi na onaj deo bilo kog molekula koji je sposoban da bude prepoznat, i vezan sa, antitelom (odgovarajući antitelo vezujući region može se označiti kao paratop).

[0218] "Antigen" je molekul ili deo molekula koji je sposoban da se veže sa antitelom koje je dodatno sposobno da indukuje životinju da proizvodi antitelo koje je sposobno da se vezuje za epitop tog antigena. Antigen može imati jedan ili više od jednog epitopa. Specifična reakcija označena prethodno označava da će antigen reagovati, na visoko selektivan način, sa njegovim odgovarajućim antitelom i ne sa brojnim drugim antitelima koja se mogu izazvati drugim antigenima.

[0219] [0078] Termin "antitelo" uključuje i intaktne imunoglobulinske molekule kao i delove, fragmente, peptide i njihove derivate kao što su, na primer, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fse, CDR regioni, paratopi, ili bilo koji deo ili peptidna sekvenca antitela koja je sposobna da se vezuje za antigen ili epitop. Kaže se da je antitelo "sposobno da vezuje" molekul ukoliko je sposobno da specifično reaguje sa molekulom čime se vezuje molekul za antitelo.

[0220] Antitelo takođe uključuje himerna antitela, heterohimerna antitela, kaninizovana antitela, ili felinizovana antitela, kao i fragmente, delove, regione, peptide ili njihove derivate, obezbeđene bilo kojom poznatom tehnikom, kao što je, ali se ne ograničavati na, enzimsko isecanje, sintezu peptida, ili rekombinantne tehnike. Takva antitela prema predmetnom pronalasku su sposobna da se specifično vezuju sa IL-31 kanina. Fragmentima ili delovima antitela može nedostajati Fc fragment intaktnog antitela, mogu se brže izbaciti iz cirkulacije, i mogu imati manje nespecifičnog vezivanja u tkivu od intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela mogu se proizvesti od intaktnih antitela korišćenjem postupaka dobro poznatih u tehnici, na primer proteolitičkim isecanjem sa enzimima kao što je papain (da bi se proizveli Fab fragmenti) ili pepsin (da bi se proizveli F(ab’).2 fragmenti). Videti, npr., Wahl et al., 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983). Delovi antitela mogu se napraviti bilo kojim prethodnim postupkom, ili se mogu napraviti ekspresijom dela rekombianntnog molekula. Na primer, CDR region(i) rekombinantnog antitela mogu se izolovati i subklonirati u odgovarajući ekspresioni vektor. Videti, npr., U.S. Pat. No.6,680,053.

[0222] Nukleotidne i aminokiselinske sekvence klona 34D03

[0224] Predmetni pronalazak obezbeđuje nova izolovana antitela ili njihove antigen-vezujuće delove koji se specifično vezuju za pseći IL-31 koje sadrži region koji određuje komplementarnost (CDR)1 varijabilnog teškog (V<H>) lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-V<H>-CDR1), VH CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu TISYGGSYTYYPDNIKG(SEQ ID NO: 6; 34D03-V<H>-CDR2) i V<H>CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu VRGYGYDTMDY(SEQ ID NO: 9; 34D03-V<H>-CDR3); i varijabilni laki (V<L>) lanac koji sadrži region koji određuje komplementarnost (CDR) 1 koji ima aminokiselinsku sekvencu KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-V<L>-CDR1), V<L>CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu RASNLEA(SEQ ID NO: 15; 34D03-V<L>-CDR2) i V<L>CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-V<L>-CDR3).

[0225] U jednom primeru izvođenja pronalaska, monoklonsko antitel prema pronalasku vezuje se za IL-31 kanina i sprečava njegovo vezivanje za, i aktivaciju, njegovog ko-receptorskog kompleksa koji sadrži IL-31 receptor A (IL-31Ra) i onkostatin-M-specifični receptor (OsmR ili IL-31 Rb). Monoklonska antitela prema predmetnom pronalalsku su ovde identifikovana kao "34D03", što se odnosi na broj dodeljen njegovom hibridoma klonu. Ovde, "34D03" takođe se odnosi na odeo monoklonskog antitela, paratop ili CDRs, koji se specifično vezuju sa IL-31 epitopom identifikovanim kao 34D03 usled njegove sposobnosti da se vezuje sa 34D03 antitelima, respektivno. Nekoliko rekombinantnih, himernih, heterohimernih, i/ili kaninizovanih oblika 34D03 opisanih ovde mogu se označiti istim nazivom.

[0226] U nekim primerima izvođenja, antitelo može uključivati najmanje jedno od sledećeg:

[0228] a) varijabilni laki lanac koji sadrži

[0230]

[0232] b) varijabilni teški lanac koji sadrži

[0234]

[0237] i

[0238] c) varijante (a) i/ili (b) koje imaju jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija.

[0239] U sledećim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja proizvodi antitelo opisano prethodno.

[0240] Predmetni pronalazak takođe uključuje, unutar svog obima, nukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilne regione lakog i teškog lanca anti-IL-31 antitela prema predmetnom pronalalsku. Takođe je unutar obima pronalaska uključena bilo koja nukleotidna sekvenca koja kodira aminoksielinsku sekvencu od 34D03.

[0241] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje vektor uključujući najmanje jednu od prothodno opisanih nukleinskih kiselina.

[0242] Kako je genetski kod degenerisan, više od jednog kodona se može koristiti za kodiranje određene aminokiseline. Korišćenjem genetskog koda, mogu se identifikovati jedna ili više različitih nukleotidnih sekvenci, od kojih je svaka sposobna da kodira aminokiselinu. Verovatnoća da će određeni oligonukleotid, zaista, činiti stvarnu XXX-kodirajuću sekvencu može se proceniti razmatranjem odnosa abnormalnog uparivanja baza i učestalosti sa kojom je određeni kodon zaista korišćen (da bi se kodirala određena aminokiselin) u eukariotskim ili prokariotskim ćelijama koje eksprimiraju anti-IL-31 antitelo ili deo. Takva "pravila korišćenja kodona" su opisana od strane Lathe, et al., 183 J. Molec. Biol. 1-12 (1985). Upotrebom "pravila korišćenja kodona" od Lathe, može se identifikovati jedna nukleotidna sekvenca, ili set nukleotidnih sekvenci, koji sadrži teorijski "najverovatniju" nukleotidnu sekvencu koja je sposobna da kodira anti-IL-31 sekvence.

[0243] Takođe je namera da kodirajući regioni antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu takođe biti obezbeđeni izmenom postojećih gena za antitelo korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije koje rezultuju u varijantama (agonistima) antitela opisanim ovde. Takve varijante uključuju, ali nisu ograničene na delecije, adicije i supstitucije u aminokiselinskoj sekvenci anti-IL-31 antitela.

[0244] [0088] Na primer, jedna klasa supstitucija je konzervativna aminokiselinska supstitucija. Takve supstitucije su one koje supstituišu datu aminokiselinu u peptidu anti-IL-31 antitela sa drugom aminokiselinom sličnih karakteristika. Tipične konzervativne supstitucije su međusobne zamene, između alifatičnih aminokiselina Ala, Val, Leu, i Ile; međusobna razmena hidroksil ostataka Ser i Thr, razmena kiselih ostataka Asp i Glu, supstitucija između aminokiselinskih ostataka Asn i Gln, razmena baznih ostataka Lys i Arg, zamene između aromatičnih ostataka Phe, Tyr, i slično. Instrukcije koje se odnose na to koje aminokiselinske promene su najvrovatnij efenotipski tihe nalaze se u Bowie et al., 247 Science 1306-10 (1990).

[0245] Varijanta ili agonist anti-IL-31 antitela ili peptida može biti potpuno funkcionalna ili joj može nedostajati funkcija u jednoj ili više aktivnosti. Potpuno funkcionalne varijante tipično sadrže samo konzervativne varijacije ili varijacije u nekritičnim ostacima ili u nekritičnim regionima. Funkcionalne varijante mogu takođe sadržati supstituciju sličnih aminokiselina koje ne daju promenu ili daju beznačajnu promenu u funkciji. Alternativno, takve supstitucije mogu pozitivno ili negativno uticati na funkciju do nekog stepena. Nefunkcionalne varijante tipično sadrže jednu ili više nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, insercija, inverzija, ili skraćivanja ili supstituciju, inserciju, inverziju, ili deleciju u kritičnom ostatku ili kritičnom regionu.

[0246] Aminokiseline koje su esencijalne za funkciju mogu se identifikovati postupcima poznatim u tehnici, kao što je mutageneza specifična za mesto ili alanine-skening mutageneza. Cunningham et al., 244 Science 1081-85 (1989). Poslednje pomenuta procedura uvodi jednu mutaciju alanina na svakom ostatku u molekulu. Rezultujući mutantni molekuli se zatim testiraju u odnosu na biološku aktivnost kao što je vezivanje epitopa ili in vitro ADCC aktivnost. Mesta koja su kritična za ligand-receptor vezivanje mogu se takođe odrediti strukturnom analizom kao što je kristalografija, nuklearna magnetna rezonanaca, ili fotoafinitetno obeležavanje. Smith et al., 224 J. Mol. Biol.899-904 (1992); de Vos et al., 255 Science 306-12 (1992).

[0247] Dodatno, polipeptidi često sadrže aminokiseline različite od dvadeset "prirodnih" aminokiselina. Dodatno, mnoge aminokiseline, uključujući termininalne aminokiseline, mogu se modifikovati prirodnim procesima, kao što je obrada i druge post-translacione modifikacije, ili tehnikama hemijske modifikacije dobro poznatim u tehnici. Poznate modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, acetilaciju, acilaciju, ADP-ribozilaciju, amidaciju, kovalentno vezivanje flavina, kovalentno vezivanje heme dela, kovalentno vezivanje nukleotida ili derivata nukleotida, kovalentno vezivanje lipida ili derivata lipida, lipid fosfotidilinozitola, unakrsno vezivanje, ciklizaciju, formiranje disulfidne veze, demetilaciju, formiranje kovalentnih unakrsnih veza, formiranje cistina, formiranje piroglutamata, formilaciju, gama karboksilaciju, glikozilaciju, formiranje GPI sidra, hidroksilaciju, jodinaciju, metilaciju, miristoilaciju, oksidaciju, proteolitičku obradu, fosforilaciju, prenilaciju, racemizaciju, selenoilaciju, sulfataciju, dodavanje aminokiselina proteinima posredovano transportnom RNK kao što je arginilacija, i ubikvitinacija.

[0248] Takve modifikacije su dobro poznate stručnjacima i opisane su detaljno u naučnoj literaturi. Nekoliko naročito uobičajenih modifikacija, glikozilacija, vezivanje lipida, sulfatacija, gama-karboksilacija ostataka glutaminske kiseline, hidroksilacija i ADP-ribozilacija, na primer, su opisane u najosnovnijim tekstovima, kao što su Proteins--Structure and Molecular Properties (2nd ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman & Co., NY, 1993). Mnogi detaljni pregledi su dostupni u vezi ove teme, kao što je od Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, ed., Academic Press, NY, 1983); Seifter et al.182 Meth. Enzymol.626-46 (1990); and Rattan et al.663 Ann. NY Acad. Sci.48-62 (1992).

[0249] Shodno tome, antitela prema predmetnom pronalasku takođe obuhvataju derivate ili analoge kod kojih supstituisani aminokiselinski ostatak nije onaj koji je kodiran genetskim kodom. Slično, dodavanja i supstitucije u aminokiselinskoj sekvenci kao i varijacije, i modifikacije upravo opisane mogu biti jednako primenjive na aminokiselinsku sekvencu IL-31 antigena i/ili njihovih epitopa ili peptida.

[0250] Kao što je prethodno pomenuto, geni koji kodiraju monoklonsko antitelo prema predmetnom pronalasku je specifično efikasno u prepoznavanju IL-31.

[0252] Derivati antitela

[0254] Unutar obima ovog pronalaska uključeni su derivati antitela. "Derivat" antitela sadrži dodatne hemijske delove koji normalno nisu deo proteina. Kovalentne modifikacije proteina su uključene unutar obima ovog pronalaska. Takve modifikacije mogu biti introdukovane u molekul reakcijom targetiranih aminokiselinskih ostataka antitela sa organskim derivatizujućim sredstvom koje je sposobno da reaguje sa izabranim bočnim lancima ili terminalnim ostacima. Na primer, derivatizacija sa bifunkcionalnim sredstvima, dobro poznata u tehnici, je korisna za unakrsno vezujuće antitelo ili fragment sa potpornim matriksom nerastvorljivim u vodi ili sa drugim makromolekularnim nosačima.

[0255] [0096] Derivati takođe uključuju radioaktivno obeležena monoklonska antitela koja su obeležena. Na primer, sa radioaktivnim jodom (<125>I,<131>I), ugljenikom (<14>C), sumporom (<35>S), indijumom (<111>In), tricijumom (<3>H) ili slično; konjugati monoklonskih antitela sa biotinom ili avidinom, sa enzimima, kao što je peroksidaza rena, alkalna fosfataza, beta-D-galaktozidaza, glukoza oksidaza, glukoamilaza, anhidraza karboksilne kiseline, acetilholin esteraza, lizozim, malat dehidrogenaza ili glukoza 6-fosfat dehidrogenaza; i takođe konjugati monoklonskih antitela sa bioluminescentnim sredstvima (kao što je luciferaza), hemoluminescentnim sredstvima (kao što su akridin estri) ili fluorescentnim sredstvima (kao što su fikobiliproteini).

[0256] Sledeće derivatizovano bifunkcionalno antitelo prema predmetnom pronalasku je bispecifično antitelo, stvoreno kombinovanjem delova dva različita antitela koja prepoznaju dve različite antigene grupe. Ovo se može postići unakrsnim vezivanjem ili rekombinantnim tehnikama. Dodatno, antitelu ili njegovom delu mogu se dodati delovi da bi se povećao in vivo polu-život (npr., produžavanjem vremena klirensa iz krvotoka. Takve tehnike uključuju, na primer, dodavanje PEG delova (takođe nazvano pegilacija), i dobro su poznate u tehnici. Videti SAD patentna prij. obj. br.20030031671.

[0258] Rekombinantna ekspresija antitela

[0260] U nekim primerima izvođenja, nukleinske kiseline koje kodiraju predmetno monoklonsko antitelo su introdukovane direktno u ćeliju domaćina, i ćelija je inkubirana pod uslovima dovoljnim da se indukuje ekspresija enkodiranog antitela. Nakon što su predmetne nukleinske kiseline introdukovane u ćeliju, ćelij aje tipično inkubirana, normalno na 37°C, nekada pod selekcijom, u periodu od oko 1-24 časa da bi se omogućila ekspresija antitela. U jednom primeru izvođenja, antitelo je izlučeno u supernatant medijuma u kojoj ćelije rastu.

[0261] Tradicionalno, monoklonska antitela su proizvedena kao nativni molekuli u mišjim hibridoma linijama. Dodatno toj tehnologiji, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantnu DNK ekspresiju monoklonskih antitela. Ovo omogućava proizvodnju kaninizovanih antitela, kao i spektar derivata antitela i fuzionih proteina u vrsti domaćinu po izboru.

[0262] [0100] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedno anti-IL-31 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema predmetnom pronalasku može se rekombinovati sa vektor DNK u skladu sa konvencionalnim tehnikama, ukljčujući tupe krajeve ili nazubljene krajeve za ligaciju, digestiju restriktinim enzimima da se obezbede odgovarajući krajevi, punjenje kohezivnih krajeva po potrebi, tretman alkalnom fosfatazom da bi se izbeglo neželjeno vezivanje, i ligacija sa odgovarajućim ligazma. Tehnike za takve manipulacije opisane, npr., od strane Maniatis et al., MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 and 1989), i Ausubel et al. 1993 supra, mogu se koristiti za konstruisanje sekvenci nukleinske kiseline koja kodira molekul monoklonskog antitela ili njegov antigen vezujući region.

[0263] Za molekul nukleinske kiseline, kao što je DNK, kaže se da je "sposoban za ekspresiju" polipeptida ukoliko sadrži nukleotidne sekvence koje sadrže transkripcionu i translacionu regulatornu informaciju i takve sekvence su " operativno vezane" sa nukleotidnim sekvencama koje kodiraju polipeptid. Operativna veza je veza u kojoj regulatorne DNK sekvence i DNK sekvence koje treba eksprimirati su povezane na takav način da dozvole ekspresiju gena kao anti-IL-31 peptida ili delova antitela u količinama koje se mogu rekuperovati. Precizna priroda regulatornih regiona potrebnih za gensku ekspresiju može varirati od organizma do organizma, kao što je dobro poznato u analognoj tehnici. Videti, npr., Sambrook et al., 2001 supra; Ausubel et al., 1993 supra.

[0264] Predmetni pronalazak shodno tome obuhvata ekspresiju anti-IL-31 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela kao što je definisano u patentnimm zahtevima, bilo u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama. Pogodni domaćini uključuju bakterijske ili eukariotske domaćine uključujući ćelije bakterija, kvasca, insekata, gljiva, ptica i sisara ili in vivo, ili in situ, ili ćelije domaćine poreklom od sisara, insekta, ptice ili kvasca. Sisarska ćelija ili tkivo može biti od poreklom od čoveka, primata, hrčka, zeca, glodara, krave, svinje, ovce, konja, koze, psa ili mačke, ali se može koristiti bilo koja druga sisarska ćelija.

[0265] U jednom primeru izvođenja, introdukovana nukleotidna sekvenca će biti inkorposrisana u plazmidni ili virusni vektor sposoban za autonomnu replikaciju u domaćinu primaocu. Bilo koji od širokog izbora vektora može se upotrebiti u ovu svrhu. Videti, npr., Ausubel et al., 1993 supra. Faktori od važnosti u izboru određenog plazmidnog ili virusnog vektora uključuju: lakoću sa kojom će ćelije primaoci koji sadrže vektor mogu biti prepoznate i izabrane iz onih primaoca koji ne sadrže vektor; broj kopija vektora koji se želi u određenom domaćinu; i da li je poželjno da postoji mogućnost da se vektor "prenosi" između ćelija domaćina različitih vrsta.

[0266] [0104] Primeri prokariotskih vektora poznatih u tehnici uključuju plazmide kao što su oni sposobni za replikaciju u E. coli (kao što su, na primer, pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, .pi.VX). Takvi plazmidi su, na primer, opisani od strane Maniatis et al., 1989 supra; Ausubel et al, 1993 supra. Bacillus plazmidi uključuju pC194, pC221, pT127, itd. Takvi plazmidi su opisani od strane Gryczan, u THE MOLEC. BIO. OF THE BACILLI 307-329 (Academic Press, NY, 1982). Pogodni Streptomyces plazmidi uključuju plJ101 (Kendall et al., 169 J. Bacteriol. 4177-83 (1987)), i Streptomyces bakteriofage kao što su .phi.C31 (Chater et al., in SIXTH INT’L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. 45-54 (Akademiai Kaido, Budapest, Hungary 1986). Pseudomonas plazmidi su pregledno dati u John et al., 8 Rev. Infect. Dis.693-704 (1986); Izaki, 33 Jpn. J. Bacteriol.729-42 (1978); i Ausubel et al., 1993 supra.

[0267] Alternativno, elementi genske ekspresije korisni za ekspresiju cDNK koji kodiraju anti-IL-31 antitela ili peptide uključuju, ali nisu ograničeni na (a) promotore virusne transkripcije i njihove nehanser elemente, kao što su SV40 rani promotor (Okayama et al., 3 Mol. Cell. Biol.

[0268] 280 (1983)), Rous sarkoma virus LTR (Gorman et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 6777 (1982)), i virus Moloney mišje leukemije LTR (Grosschedl et al., 41 Cell 885 (1985)); (b) splajs regioni i poliadenilaciona mesta kao što su ona izvedena iz SV40 kasnog regiona (Okayarea et al., 1983), i (c) poliadenilaciona mesta kao u SV40 (Okayama et al., 1983).

[0269] Imunoglobulinski cDNK geni se mogu eksprimirati kao što je opisano od strane Weidle et al., 51 Gene 21 (1987), korišćenjem ekspresionih elemenata SV40 rani promotor i njegov enhanser, enhanseri promotora mišjeg H lanca imunoglobulina, iRNK SV40 kasnog regiona splajsing, zečija S-globin međusekvenca, poliadenilaciona mesta imunoglobulina i zečijeg S-globina, i SV40 poliadenilacioni elementi.

[0270] Za imunoglobulinske gene koji se sastoje od dela cDNK, dela genomske DNK (Whittle et al., 1 Protein Engin. 499 (1987)), transkripcioni promotor može biti humani citomegalovirus, enhanseri promotora mogu biti citomegalovirus i mišji/humani imunoglobulin, i iRNK spjalsing i poliadenilacioni regioni mogu biti nativne hromozomske sekvence imunoglobulina.

[0271] U jednom primeru izvođenja, za ekspresiju cDNK gena u glodarskim ćelijama, transkripcioni promotor je virusna LTR sekvenca, enhanseri transkripcionog promotora su bilo koji ili oba enhasera mišjeg imunoglobulinskog teškog lancai virusni LTR enhanser, splajs region sadrži intron veći od 31 bp, i regioni poliadenilacije i terminacije transkripcije su izvedeni iz nativne hromozomske sekvence koja odgovara imunoglobulinskom lancu koji se sintetiše. U sledećim primerima izvođenja, cDNK sekvence koje kodiraju druge proteine su kombinovane sa prethodno navedenim ekspresionim elementima da bi se postigla ekspresija proteina u ćelijama sisara.

[0272] [0109] Svaki fuzionisani gen može se sastaviti u, ili ubaciti u, ekspresioni vektor. Ćelije primaoci koji su sposobni da eksprimiraju genski proizvod himernog imunoglobulinskog lanca su zatim ko-transfektovani sa genom za himerni H i himerni L lanac. Transfektovane ćelije primaoci su kultivisane pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju inkorporisanih gena i eksprimirani imunoglobulinski lanci ili intaktna antitela ili fragmenti su rekuperovani iz kulture.

[0273] U jednom primeru izvođenja, fuzionisani geni koji kodiraju himerne H i L lance, ili njihove delove su sastavljeni u zasebnim ekspresionim vektorima koji su zatim korišćeni da izvrše ko-transfekciju ćelije primaoca. Alternativno fuzionisani geni koji kodiraju himerne H i L lance mogu se sastaviti na istom ekspresionom vektoru.

[0274] Za transfekciju ekspresionih vektora i proizvodnju himernog antitela, ćelijska linija primaoc može biti ćelija mijeloma. Mijeloma ćelije mogu sintetisati, sastaviti i izlučiti imunoglobuline kodirane sa transfektovanim imunoglobulinskim genima i poseduju mehanizme za glikozilaciju imunoglobulina. Mijeloma ćelije mogu se uzgajati u kulturi ili u peritonealnoj šupljini miša, odakle se izlučeni imunoglobulin može dobiti iz ascitne tečnosti. Druge pogodne ćelije recipijenti uključuju limfoidne ćelije kao što su B limfociti humanog ili ne-humanog porekla, hibridoma ćelija humanog ili ne-humanog porekla, ili ćelije interspecijskih hetrohibridoma ćelija.

[0275] Ekspresija vektora koji nosi himerni, kaninizovani konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku može se introdukovati u odgovarajuću ćeliju domaćina bilo kojim od pogodnih načina, uključujući takve biohemijske načine kao što su transformacija, transfekcija, konjugacija, fuzija protoplasta, taloženje kalcijum fosfata, i primena sa polikatjonima kao što je dietilaminoetil (DEAE) dekstran, i takvih mehaničkih načina kao što je elektroporacija, direktna mikroinjekcija, i bombardovanje mikroprojektilom. Johnston et al., 240 Science 1538 (1988).

[0276] Kvasac može obezbediti značajne prednosti u odnosu na bakterije za proizvodnju imunoglobulinskih H i L lanaca. Kvasci izvode post-translacione modifikacije peptida uključujći glikozilaciju. Sada postoje brojne strategije rekombinantne DNK koje koriste jake promotorske sekvence i veliki broj kopija plazmida koji se mogu koristiti za proizvodnju željenih proteina u kvascu. Kvasac prepoznaje lider sekvence proizvoda kloniranog sisarskog gena i izlučuje peptide koje nose lider sekvence (tj., pre-peptide). Hitzman et al., 11th Int’I Conference on Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, France, 1982).

[0277] [0114] Sistemi genske ekspresije u kvascu mogu se rutinski proceniti u odnosu na nivoe proizvodnje, izlučivanja i stabilnosti anti-IL-31 peptida, antitela i sastavljenih mišjih i himernih, heterohimernih, kaninizovanih, ili felinizovanih antitela, fragmenata i njihvoh regiona. Mogu se koristiti bilo koji iz serije sistema za ekspresiju gena kvasca koji uključuju promotorske i terminacione elemente iz aktivno eksprimiranih gena koji kodriaju glikolitičke enzime proizvedene u velikim količinama kada su kvasci uzgajani u medijumu bogatom glukozom. Poznati glikolitički geni mogu takođe obezbediti veoma efikasne transkripcione kontrolne signale. Na primer, mogu se koristiti promotorski i terminatorski signali gena fosfoglicerat kinaze (PGK). Brojni pristupi se mogu uzeti za evaluaciju plazmida sa optimalnom ekspresijom za ekspresiju kloniranih imunoglobulinskih cDNK u kvascu. Videti Vol. II DNA Cloning, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK 1985).

[0278] Mogu se takođe koristiti bakterijski sojevi kao domaćini za proizvodnju molekula antitela opisanih u ovom pronalasku. Plazmidni vektori koji sadrže replikonske i kontrolne sekvence koje su izvedene iz vrsta kompatibilnih sa ćelijom domaćinom su korišćene u vezi sa ovim bakterijskim domaćinima. Vektor nosi mesto replikacije, kao i specifične gene koji su sposobni da obezbede fenotipsku selekciju u transformisanim ćelijama. Mogu se koristiti brojni pristupi za procenu ekspresionih plazmida za proizvodnju mišjih, himernih, heterohimernih, kaninizovanih ili felinizovanih antitela, fragmenata i regiona ili lanaca antitela kodiranih od strane kloniranih imunoglobulinskih cDNK u bakterijama (videti Glover, 1985 supra; Ausubel, 1993 supra; Sambrook, 2001 supra; Colligan et al., eds. Current Protocols in Imunology, John Wiley & Sons, NY, NY (1994-2001); Colligan et al., eds. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001).

[0279] Sisarske ćelije domaćini mogu se uzgajati in vitro ili in vivo. Sisarske ćelije obezbeđuju post-translacione modifikacije proteinskim molekulima imunoglobulina uključujući uklanjanje lider peptida, savijanje i sastvaljanje H i L lanaca, glikozilaciju molekula antitela, i izlučivanje funkcionalnog proteina antitela.

[0280] Sisarske ćelije koje mogu biti korisne kao domaćini za proizvodnju proteina antitela, dodatno ćelijama limfoidnog porekla opisanim prethodno, uključuju ćelije poreklom od fibroblasta, kao što su Vero (ATCC CRL 81) ili CHO-K1 (ATCC CRL 61) ćelije.

[0281] Dostupni su mnogi vektorski sistemi za ekspresiju gena kloniranih anti-IL-31 H i L lanca u sisarskim ćelijama (videti Glover, 1985 supra). Mogu se pratiti različiti pristupi da bi se dobila potpuna H2L2 antitela. Moguće je ko-eksprimirati H i L lance u istim ćelijama da bi se postigla intracelularna asocijacija i vezivanje H i L lanaca u kompletna tetramerna H2L2 antitela i/ili anti-IL-31 peptide. Ko-ekspesija se može desiti morišćenjem ili istih ili različitih plazmida u istom domaćinu. Geni za oba H i L lanca i/ili anti-IL-31 peptide mogu se postaviti u isti plazmid, koji je zatim transficiran u ćelije, čime se vrši direktna selekcija ćelija koje eksprimiraju oba lanca.

[0282] Alternativno, ćelije se mogu prvo transficirati sa plazmidom koji kodira jedan lanac, na primer L lanac, nakon čega sledi transfekcija rezultujuće ćelijske linije sa plazmidom za H lanac koji sadrži drugi selektabilni marker. Ćelijske linije koje proizvode anti-IL-31 H<2>L<2>molekule preko bilo kojeg puta mogu se transficirati sa plazmidima koji kodiraju dodatne kopije H, L, ili H plus L lance zajedno sa dodatnim selektabilnim markerima da bi se stvorile ćelijske linije sa poboljšanim osobinama, kao što je veća proizvodnja sastavljenih molekula H<2>L<2>antitela ili poboljšana stabilnost transficiranih ćelijskih linija.

[0283] Za dugotrajnu, proizvodnju velikog prinosa rekombinantnih antitela, može se koristiti stabilna ekspresija. Na primer, ćelijske linije, koje stabilno eksprimiraju molekul antitela mogu biti konstruisane. Pre nego korišćenje ekspresionih vektora koji sadrže virusne oridžine replikacije, ćelije domaćini se mogu transformisati sa imunoglobulinskim ekspresionim kasetama i selektabilnim markerom. Nakon introdukcije strane DNK, konstruisanim ćelijama se može dozvoliti da rastu 1-2 dana u obogaćenom medijumu, i zatim su prebačene u selektivni medijum. Selektabilni marker u rekombinantnom plazmidu daje rezistenciju na selekciju i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u hromozom i rastu u fokuse koji se zauzvrat mogu klonirati i proširiti u ćelijske linije. Takve konstruisane ćelijske linije mogu biti naročito korisne za skrining i evaluaciju jedinjenja/komponenti koje interaguju direktno ili indirektno sa molekulom antitela.

[0284] Kada je proizvedeno antitelo prema pronalasku, može se prečistiti bilo kojim poznatim postupkom u tehnici za prečišćavanje imunoglobulinskog molekula, na primer, hromatografijom (npr., jono.izmenjivačkom, afinitetnom, naročito afinitetnom za specifični antigen nakon Protein A, i hromatografije na koloni), centrifugiranjem, diferencijanom rastvorljivošću, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. U mnogim primerima izvođenja, antitela su izlučena iz ćelije u medijum kulture i sakupljene iz medijuma kulture.

[0286] Farmaceutske primene

[0288] [0121] Anti-IL-31 antitela ili njihovi antigen-vezujući delovi prema predmetnom pronalasku se mogu koristiti na primer u tretmanu pruritusnih stanja kod pasa. Specifičnije, pronalazak dodatno obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač, kao aktivni sastojak, antitelo prema pronalasku. Antitelo može biti himerno, heterohimerno, ili kaninizovano antitelo prema predmetnom pronalasku. Intaktni imunoglobulini ili njihovi vezujući fragmenti, kao što je Fab, su takođe predviđeni. Antitelo i njihove farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku su korisni za parenteralnu primenu, npr., potkožno, intramuskularno ili intravrenski.

[0289] Anti-IL-31 antitela prema predmetnom pronalasku mogu se primeniti ili kao pojedinačna terapeutska sredstva ili u kombinaciji sa drugim terapetuskim sredstvima. Mogu se primeniti zasebno, ali se generalno primenjuju sa farmaceutskim nosačem izbarnim na osnovu izabranog puta primene i standardne farmaceutske prakse.

[0290] Primena antitela opisanih ovde može se izvesti bilo kojim pogodnim načinima, uključujući parenteralnu injekciju (kao što su intraperitonealna, potkožna, ili intramuskularna injekcija), oralno, ili topikalnom primenom antitela (tipično izvedena u farmaceutskoj formulaciji) na površinu vazdušnih puteva. Topikalna primena na površinu vazdušnih puteva može se izvesti intranazalnom primenom (npr., upotrebom kapaljke, štapića za bris, ili inhalatora). Topikalna primena antitela na površinu vazdušnih puteva može se takođe izvesti primenom inhalacijom, kao što je stvaranjem čestica farmaceutske formulacije koje se mogu udisati (uključujući i čvrste i tečne čestice) koje sadrže antitela kao aerosol suspenziju, i zatim dovodeći do toga sa subjekat inhalira čestice koje se mogu udisati. Postupci i apart za primenu čestica farmaceutskih formulacija koje se mogu udisati su dobro poznati, i može se upotrebiti bilo koja konvencionalna tehnika. Oralna primena može biti, na primer, u obliku tečnosti koja se može ingestirati ili čvrste formulacije.

[0291] [0124] U nekim željenim primerima izvođenja, antitela su primenjna parenteralnom injekcijom. Za parenteralnu primenu, anti-IL-31 antitela se mogu formulisati kao rastvor, suspenzija, emulzija ili liofilizovani prašak zajedno sa farmaceutski prihvatljivim vehikulumom. Na primer vehikulum može biti rastvor antitela ili njegov koktel rastvoren u prihvatljivom nosaču, kao što je vodeni nosač, takvi nosači su voda, fiziološki rastvor, Ringer-ov rastvor, rastvor dekstroze, trehaloze ili rastvor saharoze, ili 5% serum albumin, 0.4% fiziološki rastvor, 0.3% glicin i slično. Mogu se takođe korsititi lipozomi i nevodeni vehikulumi kao što su neisparljiva ulja. Ovi rastvori su sterilni i generalno bez čestica. Ove kompozicije mogu biti sterilisane konvencionalnim, dobro poznatim tehnikama sterilizacije. Kompozicije mogu sadržati farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance po potrebi da se aproksimiraju fiziološki uslovi kao što su pH podešavanje i puferujuća sredstva, sredstva za podešavanje toksičnosti i slično, na primer natrijum acetat, natrijum hlorid, kalijum hlorid, kalcijum hlorid, natrijum laktat, itd. Koncentracija antitela u ovim formulacijama može široko varirati, na primer od manje od oko 0.5%, obično ili najmanje oko 1% do 15% ili 20% po težini i biće primarno izabrana na osnovu zapremine tečnosti, viskozitetima, itd., u skladu sa određenim izabranim načinom primene. Vehilkulum ili liofilizovani prašak može sadržati aditive koji održavaju izotoničnost (npr., natrijum hlorid, manitol) i hemijsku stabilnost (npr., puferi i konzervansi). Formulacija je sterilizovana uobičajeno korišćenim tehnikama.

[0292] Stvarni postupci za pripremu parenteralno primenjivih kompozicija biće poznati ili jasni stručnjacima i takođe su opisani detaljnije u, na primer, REMINGTON’S PHARMA. SCI. (15th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980).

[0293] Antitela prema ovom pronalasku mogu se liofilizovati za skladištenje i rekonstituisati u pogodnom nosaču pre upotrebe. Pokazano je da je ova tehnika efikasna sa konvencionalnim imunoglobulinima. Može se koristiti bilo koja pogodna tehnika liofilizacije i rekonstitucije. Stručnjacima će biti jasno da liofilizacija i rekonstitucija može dovesti do različitih stepena gubitka aktivnosti antitela i da se korišćeni nivoi možda moraju podesti da bi se to kompenzovalo.

[0294] Kompozicije koje sadrže predmetna antitela ili njihpov koktel mogu se primeniti za prevenciju ponovnog pojavljivanja i/ili terapeutske tretmane za postojeću bolest. Pogodni farmaceutski nosači su opisani u najskorijem izdanju REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, standardnog referentnog teksta u ovoj oblasti tehnike.

[0295] Za terapeutske primene, kompozicije su primenjene na subjekta koji već pati od bolesti, u količini dovoljnoj da izleči ili najmanje delimično zaustavi ili olakša bolest i njene komplikacije. Adekvatna količina da se ovo postigne je definisana kao "terapeutski efikasna doza" ili "terapeutski efikasna količina". Količine efikasne za ovu upotrebu zavisiće od težine bolesti i opšteg stanja imunog sistema subjekta, ali će generalno biti u opsegu od oko 0.1 mg antitela po kg telesne težine do oko 10 mg antitela po kg telesne težine, poželjno oko 0.3 mg antitela po kg telesne težine do oko 5 mg antitela po kg telesne težine. U pogledu minimizacije stranih supstanci i manje verovatnoće odbacivanja "strane supstance" što je postignuto sa predmetnim antitelima prema ovom pronalasku sličnim psećim i mačijim, može biti moguće da se primeni značajan višak ovih antitela.

[0296] [0129] Primenjena doza će, naravno, varirati u zavisnosti od poznatih faktora kao što su farmakodinamske karakteristike određenog sredstva, i njenog načina i puta primene; starosti, zdravlja, i težine primaoca; prirode i stepena simptoma, vrste istovremenog tretmana, učestalosti tretmana, i željenog efekta.

[0297] Kao neograničavajući primer, tretman IL-31-povezanih patologija kod pasa može se obezbediti kao dvo nedeljno ili mesečno doziranje anti-IL-31 antitela prema predmetnom pronalasku u doznom opsegu koji je opisan prethodno.

[0298] Primeri antitela za upotrebu u terapiji kanina su antitela visokog afiniteta (ova takođe mogu biti viskog aviditeta), i fragmenti, regioni i njihovi derivati koji imaju potentnu in vivo anti-IL-31 aktivnot, prema predmetnom pronalasku.

[0299] Pojedinačna ili više primena kompozicija može se izvesti sa doznim nivoima i obrascem koji je izabran od strane veterinara koji izvodi lečenje. U bilo kom slučaju, farmaceutske formulacije treba da obezbede količinu antitela (ili više njih) prema ovom pronalsku da bi se efikasno tretirao subjekt.

[0301] Dijagnostičke primene

[0303] Ovde opisana ali nisu deo pronalaska su anti-IL-31 antitela i peptidi za upotrebu u dijagnostičkim postupcima za detekciju IL-31 kod životinja kućnih ljubimaca za koje se zna ili se sumnja da imaju pruritusno i/ili alergijsko stanje.

[0304] Anti-IL-31 antitela prema predmetnom pronalasku su korisna za imunoanalize koje otkrivaju ili kvantifikuju IL-31, ili anti-IL-31 antitela, u uzorku. Imunoanaliza za IL-31 tipično sadrži inkubiranje kliničkog ili biološkog uzorka u prisustvu detektabilno obeleženog anti-IL-31 antitela visokog afiniteta (ili visokog aviditeta) prema predmetnom pronalasku koje je sposobno da selektivno veže IL-31, i detekciju obeleženog antitela koje je vezano u uzorku. Procedure različitih kliničkih analiza su dobro poznate u tehnici. Videti, npr., IMUNOASSAYS FOR THE 80’S (Voller et al., eds., Univ. Park, 1981). Takvi uzorci uključuju biopsiju tkiva, krvi, seruma, i fekalnih uzoraka, ili tečnosti sakupljenih od životinjskih subjekata i podvrgavanje ELISA analizi kao što je opisano u nastavku.

[0305] Vezivanje antigena sa antitelom može se detektovati bez upotrebe čvrste podloge. Na primer, vezivanje antigena sa antitelom može se detektovati u tečnom formatu.

[0306] [0136] Anti-IL-31 antitelo može, na primer, biti fiksirano na nitrocelulozi, ili drugoj čvrstoj podlozi koja je sposobna da imobiliše ćelije, ćelijske čestice ili rastvorljive proteine. Podloga se zatim može isprati sa pogodnim puferima nakon čega sledi tretman sa detektabilno obeleženim IL-31-specifičnim antitelom. Podloga u čvrstoj faze se zatim može isprati sa puferom drugi put da bi se uklonilo nevezano antitelo. Količina vezanog obeleživača na čvrstoj podlozi se zatim može detektovati sa koracima poznatih postupaka.

[0307] "Podloga u čvrstoj fazi" ili "nosač" odnosi se na bilo koju podlogu koja je sposobna da veže antigen, ili antitelo. Dobro poznate podloge ili nosači, uključuju staklo, polistiren, polipropilen, polietilen, polivinilidenfluorid (PVDF), dekstran, najlon, amilaze, prirodne i modifikovane celuloze, poliakrilamide, agaroze, i magnetit. Priroda nosača može biti ili rastvorljiva do nekog stepena ili nerastvorljiva. Materijal podloge može imati bilo koju strukturnu konfiguraciju sve dok je kuplovani molekul sposoban da se vezuje za IL-31 ili anti-IL-31 antitelo. Stoga, konfiguracija podloge može biti sferična, kao u kuglici, ili cilindrična, kao unutrašnja površina epruvete, ili spoljašnja površina štapića. Alternativno, površina može biti ravana, kao što je ploča, Petri šolja, test traka, itd. Na primer, podloge mogu uključivati polistirenske kuglice. Stručnjacima će biti poznati mnogi drugi pogodni nosači za vezivanje antitela ili antigena, ili mogu proceniti iste rutinskim eksperimentisanjem.

[0308] Dobro poznati koraci postupka mogu odrediti aktivnost vezivanja datog lota anti-IL-31 antitela. Stručnjaci mogu odrediti operativne i optimalne uslove analize rutinskim eksperimentisanjem.

[0309] Detektabilno obeležavanje IL-31-specifičnog antitela može se postići vezivanjem sa enzimom za upotrebu u enzimskoj imunoanalizi (EIA), ili imunoenzimskoj serološkoj analizi (ELISA). Vezani enzim reaguje sa izloženim supstratom da bi se stvorio hemijski deo koji se može detektovati, na primer, spekrofotometrijskim, fluorometrijskim ili vizuelnim načinom. Enzimi koji se mogu koristiti da bi se detektabilno obeležila IL-31-specifična antitela prema predmetnom pronalasku uključuju, ali nisu ograničena na, malat dehidrogenazu, stafilokoknu nukleazu, delta-5-steroid izomerazu, alkoholnu dehidrogenazu kvasca, alfa-glicerofosfat dehidrogenazu, trioza fosfat izomerazu, peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, asparaginazu, glukoza oksidazu, beta-galaktozidazu, ribonukleazu, ureazu, katalazu, glukoza-6-fosfat ehidrogenazu, glukoamilazu i acetilholin esterazu.

[0310] [0140] Radioaktivnim obeležavanjem IL-31-specifičnih antitela, moguće je detektovati IL-31 preko upotrebe radioimunoanalize (RIA). Videti Work et al., LAB. TECHNIQUES & BIOCHEM. 1N MOLEC. Bio. (No. Holland Pub. Co., NY, 1978). Radioaktivni izotop se može detektovati takvim načinima kao što je uptreba gama brojača ili scincilacionog brojača ili autoradiografijom. Izotopi koji su naročito korisni za svrhe predmetnog pronalaska uključuju:<3>H,<125>I,<131>I,<35>S,<14>C, i<125>I.

[0311] Takođe je moguće obeležiti IL-31-specifična antitela sa fluorescentnim jedinjenjem. Kada je fluorescentno obeleženo antitelo izloženo svetlosti korektne talasne dužine, njegovo prisustvo se može detektovati usled fluorescencije. Među najuobičajenije korišćenim jedinjenjima za obeležavanje su fluorescein izotiocijanat, rodamin, fikoeritrin, fikoeritrin, alofikocijanin, o-ftaldehid i fluorescamin.

[0312] IL-31-specifična antitela mogu se takođe detektabilno obeležiti korišćenjem metala koji emituju fluorescenciju kao što su<125>Eu, ili drugih iz niza lantanoida. Ovi metali se mogu vezati za IL-31—sepcifično antitelo korišćenjem takvih metal helatirajućih grupa kao što je dietilentriaminpentasirćetna kiselina (DTPA) ili etilendiamin-tetrasirćetna kiselina (EDTA).

[0313] IL-31-specifična antitela se takođe mogu detektabilno obeležiti kuplovanjem sa hemiluminescentnim signalom. Prisustvo hemiluminescentno obeleženog antitela je zatim određeno detekcijom prisustva luminescencije koja se javlja tokom hemijske reakcije. Primeri korisnih hemiluminescentnih jedinjenja obeleživača su luminol, izoluminol, theromatic akrinijum estar, imidazol, akridinijum so i oksalat estar.

[0314] Slično tome, bioluminescentno jedinjenje se može koristiti za obeležavanje IL-31-specifičnog antitela, dela, fragmenta, ili derivata predmetnog pronalaska. Bioluminescencija je tip hemiluminescencije kod bioloških sistema u kojima katalitički protein povećava efikasnost hemiluminescentne reakcije. Prisustvo bioluminescentnog proteina je određeno detekcijom prisustva luminescencije. Važna bioluminescentna jedinjenja za svrhe obeležavanja su luciferin, luciferaza i ekvorin.

[0315] Detekcija IL-31-specifičnog antitela, dela, fragmenta, ili derivata može se postići scincilacionim brojačem, na primer, ukoliko je detektabilni obeleživač radioaktivni gama emiter, ili fluorometrom, na primer, ukoliko je obeleživač fluorescentni materijal. U slučaju enzimskog obeleživača, detekcija se može postići kolorimetrijskim postupcima koji koriste supstrat za enzim. Detekcija se takođe može postići vizuelnim poređenjem stepena enzimske reakcije supstrata u poređenju sa slično pripremljenim standardima.

[0316] IL-31 koji je detektovan prethodnim analizama može biti prisutan u biološkom uzorku.

[0317] Može se koristiti bilo koji uzorak koji sadrži IL-31. Na primer, uzorak je biološka tečnost kao što je, na primer, krv, serum, limfa, urin, feces, inflamatorni eksudat, cerebrospinalna tečnost, amnionska tečnost, ekstrakt ili homogenat tkiva, i slično.

[0318] In situ detekcija se može postići uklanjanjem histološkog uzorka iz životinjskog subjekta, i obezbeđivanjem kombinacije obeleženih antitela prema predmetnom pronalasku na takav uzorak. Antitelo (ili njegov deo) mogu se obezbediti primenom ili postavljanjem sloja obeleženog antitela (ili dela) na biološki uzorak. Korišćenjem takve procedure, moguće je odrediti ne samo prisustvo IL-31 već takođe i distribuciju IL-31 u ispitivanom tkivu. Stručnjaci će lako shvatiti da bilo koji od brojnih histoloških postupaka (kao što su procedure bojenja) mogu se modifikovati da bi se postigla takva in situ detekcija.

[0319] Antitelo, fragment ili derivat predmetnog pronalaska može se prilagoditi za upotrebu u imunometrijskoj analizi, takođe poznatoj kao analiza sa "dva mesta" ili "sendvič" analiza. U tipičnoj imunometrijskoj analizi, količina neobeleženog antitela (ili fragmenta antitela) je vezana za čvrstu podlogu koja je nerastvorljiva u testiranoj tečnosti i količina detektabilno obeleženog antitela je dodata da bi se omogućila detekcija i/ili kvantifikacija tercijarnog kompleksa formiranog između antitela u čvrstoj fazi, antigena, i obeleženog antitela.

[0320] Antitela se ogu koristiti da se kvantitativno ili kvalitativno detektuje IL-31 u uzorku ili da se detektuje prisustvo ćelija koje eksprimiraju IL-31. Ovo se može postići tehnikama imunofluorescencije korišćenjem fluorescentno obeleženog antitela (videti u nastavku) kuplovano sa fluorescentnom mikroskopijom, protočno citometrijskom, ili fluorometrijskom detekcijom. Za dijagnostičke svrhe, antitela mogu biti ili obeležena ili neobeležena. Neobeležena antitela se mogu korisiti u kombinaciji sa drugim obeleženim antitelima (druga antitela) koja reaguju sa antitelom, kao što su antitela specifična za pseće ili mačije imunoglobulinske konstantne regione. Alternativno, antitela se mogu direktno obeležavati. Mogu se koristiti brojni obeleživači, kao što su radionuklidi, fluori, enzimi, enzimski supstrati, enzimski kofaktori, inhibitori enzima, ligandi (naročito hapteni), itd. Brojni tipovi imunoanaliza, kao što su oni razmatrani prethodno dostupni su i dobro poznati stručnjacima.

[0321] [0150] Dijagnostički postupak za detekciju IL-31 može biti imunoanaliza lateralnog protoka. Ovo je takođe poznato kao imunohromatografska analiza, Rapid ImunoMigration (RIM™) ili test sa trakom. Imunoanalize lateralnog protoka su suštinski imunoanalize adaptirane da se izvršavaju duž jedne ose da bi seprilagodile formatu test trake. Brojne varijacije tehnologije su razvijene u komercijalnim proizvodima, ali sve one rade u skaldu sa istim osnovnim principom. Tipična test traka se sastoji od sledećih komponenti: (1) jastučić za uzorak – apsorbentni jastučić na koji je primenjen test uzorak; (2) jastučić za konjugat ili reagens – koji sadrži antitela specifična za ciljne analite konjugovane sa obojenim česticama (obično čestice koloidnog zlata, ili lateks mikrosfere); (3) reakciona membrana – tipično hidrofobna nitrocelulozna ili celuloza acetat membrana ne kojoj su imobilisana anti-target analit antitela u liniji duž membrane kao zone hvatanja ili test linije (kontrolna zona može takođe biti prisutna, koja sadrži antitela specifična za konjugat antitela); i (4) fitilj ili rezervoar za otpad – dodatni absorbentni jastučić dizajniran da vuče uzorak duž reakcione membrane kapilarnim dejstvom i da ga sakuplja. Komponente trake su obično fiksirane za inertni materijal podloge i mogu biti prisutne u jednostavnom dipstick formatu ili unutar plastičnog kućišta sa otvorom za uzoraka i reakcionim prozorom reaction koji prikazuje zone hvatanja i kontrolne zone.

[0322] [0151] Postoje dva glavna tipa imunoanalize lateralnog protoka korišćena u mikrobiološkom testiranju: sendvič analize sa duplim antitelom i kompetitivne analize. U sendvič formatu sa duplim antitelom, uzorak migrira iz jastučića za uzorak kroz jastučić za konjugat gde će se bilo koji prisutni ciljni analit vezati za konjugat. Uzorak zatim nastavlja da se kreće duž membrane dok ne dođe do zone hvatanja gde će se kompleks target/konjugat vezati za imobilisana antitela što proizvodi vidljivu liniju na membrani. Uzorak se zatim kreće dalje duž trake dok ne stigne do kontrolne zone, gde će se višak konjugata vezati i proizvesti drugu vidljivu liniju na membrani. Ova kontrolna linija označava da se uzorak kretao duž membrane kao što je nameravano. Dve jasne linije na membrani su pozitivni rezultat. Jedna linija u kontrolnoj zoni je negativni rezultat. Kompetitivne analize se razlikuju od sendvič formata sa duplim antitelom po tome što jastučić sa konjugatom sadrži antitela koja su već vezana za target analit, ili za njegov analog. Ukoliko je target analit prisutan u uzorku neće se stoga vezati sa konjugatom i ostaće neobeležen. Kako uzorak migrira duž membrane i stiže do zone hvatanja vršak neobeleženog analita će se vezati za imobilisano antitelo i blokirati hvatanje konjugata, tako da se ne proizvodi vidljiva linija. Nevezani konjugat će se zatim vezati za antitela u kontrolnoj zoni proizvodeći vidljivu kontrolnu liniju. Jedna kontrolna linija na membrani je pozitivni rezultat. Dve vidljive linije u zoni hvatanja i kontrolnoj zoni su negativni rezultat. Međutim, ukoliko nijeprisutan višak neobeleženog target analita, slaba linija se može proizvesti u zoni hvatanja, ukazujući rezultat na osnovu koga se ne može ništa zaključiti. Postoje brojne varijacije tehnologije lateralnog protoka. Zona hvatanja na membrani može sadržati imobilisane antigene ili enzime – u zavisnosti od target analita – pre nego antitela. Takođe je moguće primeniti više zona hvatanja da bi se stvorio multipleks test. Na primer, razvijene su komercijalne test trake koje su sposobne da detektuju i EHEC Shiga toksine ST1 i ST2 zasebno u istom uzorku.

[0323] Važno je da antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti pomoć u dijagnozi pruritusa kod pasa. Specifičnije, antitelo prema predmetnom pronalasku može identifikovati prekomernu ekspresiju IL-31 kod kućnih ljubimaca. Stoga, antitelo prema predmetnom pronalasku može obezbediti važan imunohistohemijski alat.

[0324] Antitela prema predmetnom pronalasku mogu se koristiti na nizovima antitela, visoko pogodnim za merenje profila genske ekspresije.

[0326] Kompleti

[0328] Opisani ovde ali nisu deo pronalaska su takođe uključeni kompleti za izvođenje predmetnih postupaka. Kompleti najmanje uključuju jedno ili više antitela prema predmetnom pronalasku, nukleinsku kiselinu koja kodira ista, ili ćeliju koja sadrži ista. Može biti obezbeđeno antitelo prema predmetnom pronalasku, obično u liofilizovanom obliku, u spremniku. Antitela, koja se mogu konjugovati sa obeleživačem ili toksinom, ili nekonjugovana, su tipično uključena u komplete sa puferima, kao što su Tris, fosfat, karobnat, itd., stabilizatorima, biocidima, inertnim proteinima, npr., serum albuminom, ili slično. Generalno, ovi materijali će biti prisutni u manje od 5% tež. Na osnovu količine sktivnog antitela, i obično prisutni u ukupnoj količini od najmanje oko 0.001% tež. ponovo na osnovu koncentracije antitela. Često, biće potrebno uključiti inertni punioc ili ekscipijent da se razblaže aktivni sastojci, gde ekscipijent može biti prisutan od oko 1% do 99% tež. ukupne kompozicije. Gde je drugo antitelo sposobno za vezivanje sa primarnim antitelom upotrebljeno u analizi, obično će biti prisutno u zasebnoj vijalici. Drugo antitelo je tipično konjugovano sa obeleživačem i formulisano na analogni način sa formulacijama antitela opisanim prethodno. Komplet će generalno takođe uključivati set uputstava za upotrebu.

[0329] [0155] Komplet može biti komplet test trake (komplet za imunoanalizu lateralnim protokom) koristan za detekciju IL-31 proteina kanina u uzorku. Takva test traka će tipično uključivati jastučić za uzorak na koji je primenjen test uzorak; jastučić za konjugat ili reagens koji sadrži antitelo specifično za IL-31 kanina, pri čemu je antitelo konjugovano sa obojenim česticama (obično česticama koloidnog zlata); reakcionu membranu na kojoj su imobilisana anti-IL-31 antitela u liniji duž membrane kao zone hvatanja ili test linije (takođe može biti prisutna kontrolna zona, koja sadrži antitela specifična za konjugat antitela); i dodatni apsorpcioni jastučić dizajniran da vuče uzorak duž reakcione membrane kapilarnim dejstvom i sakupi ga. Komplet sa test trakom će generalno takođe uključiti uputstva za upotrebu.

[0330] Pronalazak će sada biti dodoatno opisan preko neograničavajućih primera u nastavku. dodatno opisivanju antitela prema predmetnom pronalasku, sledeći primeri opisuju antitela koja nisu prema pronalasku ali koja su korisna za razumevanje pronalaska.

[0332] PRIMERI

[0334] Primer 1 Identifikacija mišjih monoklonskih antitela koja prepoznaju pseći Interleukin 31 (IL-31)

[0336] [0157] Rekombinantni pseći IL-31 je stvoren u CHO ćelijama korišćenjem CHROMOS ACE (Artificial Chromosome Expression) system (Chromos Molecular Systems, Inc., Burnaby, British Columbia) da bi se stvorio izlučeni pseći IL-31 protein koji ima sekvencu iz SEQ ID NO: 32. Ovaj protein je kodiran sa nukleotisnom sekvencom iz SEQ ID NO: 33. Kondicionirani medijum iz 400 ml ćelijske kulture (CHO ćelijska linija) je dobijen i dijaliziran nasuprot 10 zapremina QA pufera (20 mM Tris pH 8.0, 20 mM NaCl) 4.5 časova. Dijalizirani medijum je 0.2 um filtriran i napunjen na 1 ml/min u SOURCE™ Q kolonu (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) pre-ekvilibrisanu sa with QA puferom. Protein j eeluiran korišćenjem linearnog gradijenta iz više koraka. Većina IL-31 ostala je u frakciji protoka (FT), mala količina IL- 31 eluirana je rano u gradijentu. Identitet proteina jeprethodno potvrđen sa Western imunoblotingom, i maseno spektroskopskom (MS) analizom tripsinskog digestata. Protein u FT frakciji je koncentrovan 4-5 puta i dijalizovan preko noći nasuprot fosfatno puferovanom slanom rastvoru (PBS) na 4°C. Stabilnost proteina je proverena nakon dijalize u PBS. Nije uočeno taloženje, i nije uočena proteoliza nakon nekoliko dana na 4°C. De-glikozilacioni eksperimenti korišćenjem N-glikozidaze F rezultovale su u kondenzovanju proteina naniže u jednu traku od -15 kDa na SDS-PAGE. Koncentracija proteina je određena korišćenjem bicinhoninske analize (BCA assay) sa goveđim serum albuminom (BSA) kao standardom (ThermoFisher Scientific, Inc., Rockford, IL). Rastvor proteina je podeljen u alikvote, brzo zamrznut (tečni N<2>) i uskladišten na -80°C.

[0337] Mišja monoklonska antitela su identifikovana korišćenjem standardnih imunizacija ženki CF-1 miševa sa rekombinantnim psećim IL-31 proizvrdenim u CHO ćelijama. Titri iz imunizovanih miševa su određeni korišćenjem enzimske imunoanalize (ELISA). Pseći IL-31 (50 ng/well) je imobilisan na polistirenskim mikropločama i korišćen kao antigen za hvatanje. Serum iz imunizovanih miševa je razblažen u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru sa 0.05% tween-20 (PBST). Prisustvo mišjih anti-psećih IL-31 antitela je detektovano sa peroksidaza rena (HRP)-konjugovanim kozjim anti-mišjim sekundarnim antitelom (Kirkegard & Perry Laboratories, Inc. (KPL, Inc.), Gaithersburg, MD). Nakon dodavanja hromogenog supstrata (SureBlue Reserve TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate, KPL, Inc., Gaithersburg, MD) i deset minuta inkubacije na sobnoj temepraturi (RT) eakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µL 0.1 N HCI. Apsorbanca svakog bunarčića je određena na optičkoj gustini (OD) od 450 nm. Slika 6 rezimira odgovor antitela pojedinačnih miševa imunizovanih sa psećim IL-31. Pul donor splenocita iz miševa 3 i 4 korišćen je za fuziju. Nakon fuzije i skrininga anti IL-31 vezivanja preko direktne ELISA, 100 bunarčića je izabrano za ekspanziju i sekundarni skrining anti IL-31 aktivnosti. Sekundarni skrining je potvrdio da je 81 fuzija zadržala sposobnost da proizvodi anti IL-31 antitela. Smrznuti stokovi ćelija i supernatanti iz ovih 81 kandidata sačuvani su za dalju procenu.

[0338] [0159] Da bi se identifikovali kandidati sa inhibitornom aktivnošću, svih 81 supernatanata su procenjeni u odnosu na njihovu sposobnost da utiču na IL-31- poredovanu pSTAT signalizaciju u anlaizi zasnovanoj na ćelijama. Ova analiza azasnovana na ćelijama meri pSTAT signalizaciju u psećim DH-82 ćelijama monocitima prethodno tretiranim 24 časa sa psećim gama interferonom (R&D Systems, Minneapolis, MN) na 10 ng/mL i serum izgladnjivano 2 časa pre IL-31 tretmana da se poveća ekspresija IL-31 receptora. Nakon ovog pre-treatmana, rekombinantni pseći IL-31 je dodat na 1 µg/mL 5 minuta i STAT fosforilacija je procenjena korišćenjem Alpha Screen technology (Perkin Elmer, Waltham, MA). Kako su koncentracije i čistoća antitela nepoznati u supernatantima hibridoma, ovi supernatanti su kvalitativno mereni u odnosu na njihovu sposobnost da inhibiraju STAT fosforilaciju nakon 1 časa ko-inkubacije sa 1 µg/ml IL-31 korišćenjem 1:2 ili 1:20 razblaženja supernatanata. Ovaj eksperiment je identifikovao 31 supernatant koji je inhibirao >50% STAT fosforilacije u odnosu na netretirane bunarčiće čime se opravdava prečišćavanje i dalja karakterizacija.

[0339] Nakon prečišćavanja i kvantifikacije svakog monoklonskog antitela (mAb), IC<50>vrednosti sva 31 antitela su procenjene u DH-82 ćelijskoj analizi. Na osnovu rezultujućih IC<50>vrednosti i kompetitivnih ELISA da se definišu klase antitela na osnovu epitopa, tri antitela opisana u Tabeli 1 su uzeta za dalju karakterizaciju, 11E12, 19D07, i 34D03.

[0342] TABELA 1

[0343] Antitelo HC izotip LC izotip

[0344] 11E12 G1/2b kapa

[0345] 19D07 2b kapa

[0346] 34D03 G1 kapa

[0348] Primer 2 DNK sekvence koje kodiraju Encoding 11E12, 19D07 i 34D03 antitela

[0350] Ribonukleinska kiselina (RNK) je izolovana iz hibridoma ćelija 11E12, 19D07, i 34D03 korišćenjem Rneasy -mini kit (Qiagen, Inc., Germantown, MD) kao što je opisano od strane proizvođača. Milion zamrznutih ćelija iz svakog ibridoma su sakupljene centrifugiranjem i RNK jeprečišćena iz ćelijskih lizata korišćenjem Rneasy spin kolone prema postupku opisanom u protokolu. RNK je eluiran iz svake kolone i korišćena neposredno za kvantifikaciju i cDNK pripremu. RNK je analizirana u odnosu na prinos i čistoću merenjem njene apsorbance na 260 nm i 280 nm korišćenjem GeneQuant pro spektrofotometra (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Nakon izolacije, preostala RNK je uskladištena na -80° C za dalju upotrebu.

[0351] Oligonukleotidni prajmeri dizajnirani za amplifikaciju mišjih varijabilnih domena imunoglobulina (Ig) korišćeni su u skladu sa uputstvima proizvođača (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ). cDNK je pripremljena iz ukupne RNK hibridoma reverznom transkripcijom (RT) korišćenjem thermoscript RT kit (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) prema uputstvima proizvođača. 200-400 ng RNK iz svakog hibridoma je dodatno pojedinačnoj reakcionoj epruveti koja sadrži 3’ prajmer Ig konstantnog regiona. 3’ prajmer Ig konstantnog regiona je postavljen proksimalno u odnosu na varijabilni Ig region i prepisaće prvi lanac cDNK koji predstavlja varijabilni region mišjeg antitela. Za svaku RNK hibridoma, pojedinačna RT reakcija je izvedena korišćenjem prajmera 3’ konstantnog teškog lanca i 3’ konstantnog kapa lakog lanca.

[0352] cDNK iz svakog hibridoma korišćene su kao templejt u lančanoj reakciji polimeraze (PCR) da bi se umnožili varijabilni IgG teški i kapa laki lanac cDNK u svrhu određivanja sekvence. Više reakcija je izvedeno za svaki PCR korišćenjem degenerisanog 5’ prajmera ili pulova prajmera dizajniranih za aniling kodirajućih regina signalne sekvence mišjeg Ig varijabilnog domena. Zasebne PCR reakcije su izvedene sa degenerisanim prajmerom ili pulovima prajmera za amplifikaciju mišjih varijabilnih regiona teškog i varijabilnih regiona lakog lanca (Slika 7). PCR je izvedena sa 1 µl cDNK reakcijom korišćenjem Expand High Fidelity DNA polymerase kit (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) prema protokolu proizvođača. Parametri termociklusa za PCR bili su kao što sledi; 94° C 2 min., 35 ciklusa (94° C 15 sek., 55° C 30 sek., 72 ° C 1 min.), 72 ° C 7 min. Fragmenti amplifikovani u PCR su razdvojeni gel elektroforezom na 1 % agaroznom gelu i prečišćeni korišćenjem Qiagen gel extraction kit (Qiagen, Inc., Germantown, MD). Forward prajmeri za varijabilni region teškog i lakog lanca uključuju EcoRI ili SalI (New England Biolabs (NEB), Inc., Ipswich, MA) mesta i reverzni varijabilni teški i laki lanac, Hindlll (NEB Inc., Ipswich, MA) da bi se olakšalo kloniranje u pUC19 plazmid. Prečišćeni PCR fragmenti i pUC19 plazmid su digestovani sa prethodnim restrikcionim endonukleazama na 37°C 1-2 č. Nakon digestije, PCR fragmenti su prečišćeni korišćenjem Qiaquick PCR cleanup kit (Qiagen, Inc., Germantown, MD). Digestovani plazmid je razdvojen gel elektroforezom na 1 % agaroznom gelu i prečišćen korišćenjem Qiagen gel extraction kit. Prečišćeni PCR fragmenti koji predstavljaju DNK varijabilnog IgG teškoh i kapa lakog lanca su vezani u pUC19 plazmid korišćenjem T4 DNK ligaze i ligacionog pufera (NEB, Inc., Ipswich, MA) na 4°C preko noći. 3 µl svake ligacione reakcije je korišćeno da se transformišu E. coli TOP10 ćelije (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).

[0353] [0164] Plazmidi su izolovani iz pozitivnih klonova koji predstavljaju varijabilne regione svakog hibridoma korišćenjem Qiagen mini prep kit (Qiagen 27106) prema protokolu proizvođača. M13 forward i reverse prajmeri su korišćeni za amplifikaciju DNK sekvence za svaki klonirani insert korišćenjem BigDye sequencing reaction (Applied Biosystems by Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) prema protokolu proizvođača. Reakcije sekvenciranja su prečišćene korišćenjem kompleta za prečišćavanje sa 96 bunarčića (Zymo Research, Irvine, CA) prema protokolu proizvođača. Uzorci su napunjeni na ABI-3730 kapilarni sekvencer i rezultujući tragovi sekvence su analizirani korišćenjem Sequencher (GeneCodes v. 4.2) u odnosu na prisustvo kompletnih otvorenih okvira čitanja. Mišje anti pseće IL-31 varijabilne sekvence određene za svako antitelo su kao što sledi, 11E12 varijabilni laki lanac (Seq ID NO:19 MU-11E12-VL, čija je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 34), 11E12 varijabilni teški lanac (Seq ID NO: 26 MU-11E12-VH, čija je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 35), 19D07 varijabilni laki lanac (Seq ID NO:22 MU-19D07-VL, čija je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 36), 19D07 varijabilni teški lanac (Seq ID NO: 28 MU-19D07-VH, čija je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 37), 34D03 varijabilni laki lanac (Seq ID NO:24 MU-34D03- VL, čija je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 38), i 34D03 varijabilni teški lanac (Seq ID NO:30 MU-34D03-VH, čija je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 39).

[0354] Da bi se potvrdila validnost cDNK sekvence izvedene iz svakog varijabilnog teškog i lakog lanca antitela, analiza N-terminalne sekvence je izvedena na prečišćenom mAb proteinu korišćenjem Edman degradacije na Applied Biosystems model 494 gas phase protein sequencer. Tabela 2 u nastavku opisuje potvrdu sekvenci varijabilnog lakog lanca light za antitela 11E12 i 34D03 varijabilne teške sekvence 34D03. N-terminalna aminokiselina varijabilnog teškog lanca antitela 11E12, izvedena translacijom iz cDNK sekvence, određena je kao glutamin. Glutamin, kao amino terminalni ostatak proteina, može spontano podleći ciklizaciji do piroglutaminske kiseline sprečavajući određivanje sekvence sa Edman degradacijom (Chelius et al., Anal Chem.

[0355] 2006 78(7):2370-6).

[0357] TABELA 2

[0358] Varijabilni laki lanac

[0359] Antitelo Translatirana cDNK sekvenca N-terminalna sekvenca 11E12 DIVLT DIVLT

[0360] 19D07 DIVMS Nije testirano

[0361] 34D03 DILLT DILLT

[0362] Varijabilni teški lanac

[0363] Antitelo Translatirana cDNK sekvenca N-terminalna sekvenca 11E12 QVQLQ Blokirano

[0364] 19D07 EVKLV Nije testirano

[0365] 34D03 EVQLV EVQLV

[0367] Primer 3 Konstrukcija 11E12, 19D07 i 34D03 himernih antitela

[0368] Kao što je prethodno opisano, antitela su sastavljena od homodimerskog uparivanja dva heterodimerna proteina. Svaki lanac proteina (jedan težak i jedan lak) heterodimera sastoji se od varijabilnog domena i konstantnog domena. Svaki varijabilni domen sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) koji doprinose vezivanju antigena. CDRs su razdvojeni u varijabilnom domenu sa okvirnim regionima koji obezbeđuju osnovu za ispravnu prostornu prezentaciju mesta vezivanja na antitelu. Zajedno, CDR i okvirni regioni doprinose sposobnosti antitela da vezuju svoj prepoznati antigen (Slika 2).

[0369] Kao što je prethodno dodatno opisano, himerno antitelo se sastoji od varijabilne sekvence (i CDR i okvirne) iz mišjeg antitela (kao što je određeno iz prethodne analize sekvence) graftovane na respektivne konstantne regione teških i lakih lanaca psećeg IgG molekula (Slika 3). Kako je varijabilni region odgovoran za vezivanje antigena, očekuje se da graftovanje potpuno mišjeg varijabilnog domena na pseći konstantni region ima malo ili da nema efekat na sposobnost antitela da vezuje IL-31 imunogen.

[0370] [0168] Da bi se istovremeno potvrdilo da su identifikovane ispravne sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca i da bi se proizveo rekombinantni, homogeni materijal, stvoreni su ekspresioni vektori za proizvodnju himernih antitela u sisarskim ekspresionim sistemima. Forward i reverse prajmeri su dizajnirani za amplifikaciju mišje sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca antitela izvedene iz hibridoma 11E12, 19D07, i 34D03. Jedinstveno mesto restrikcione endonukleaze, Kozak konsenzus sekvenca i, sekreciona lider sekvenca su inkorporisane u svaki forward prajmer da bi se olakšala ekspresija i sekrecija rekombinanatnog antitela iz sisarske ćelijske linije. Svaki reverse prajmer je dizajniran da amplifikuje svaki respektivni varijabilni teški i laki lanac i uključivao je jedinstveno restrikciono mesto da bi se olakšalo kloniranje. PCR je izveden da bi se amplifikovao svaki teški i laki lanac korišćenjem klonirane DNK varijabilnog lanca hibridoma kao templejta za svaku reakciju. Svaki PCR proizvod je kloniran u sisarski ekspresioni plazmid koji sadrži ili konstantne regione psećeg IgG (ovde označen kao HC-64 ili HC-65) ili lakog lanca (ovde označen kao kapa) zasnovane na sekvencama iz GenBank accession numbers AF354264 ili AF354265 i XP_532962 respektivno. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence HC-64 su predstavljene sa SEQ ID NOs: 40 i 41, respektivno. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence HC-65 su predstavljene sa SEQ ID NOs: 42 i 43, respektivno. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence kapa su predstavljene sa SEQ ID NOs: 44 i 45, respektivno. Plazmidi koji kodiraju svaki teški i laki lanac, pod kontrolom CMV promotora, su ko-transficirani u HEK 293 ćelije korišćenjem standardnih lipofektamin postupaka. Nakon šest dana ekspresije, himerni mAbs su prečišćeni iz 30 ml supernatanata prolazno transficirane HEK293FS ćelije korišćenjem MabSelect SuRe protein A resin (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) prema standardnim postupcima za prečišćavanje proteina. Eluirane frakcije su pulovane, koncentrovane do ∼500 ul korišćenjem 10,000 nominalne MW cutoff Nanosep Omega centrifuge (Pall Corp., Port Washington, NY), dijalizirane preko noći na 4° C u 1x PBS, pH7.2 i uskladištene na 4° C za buduću upotrebu.

[0371] Ekspresija himernog psećeg IgG je procenjena korišćenjem SDS poliakrilamid elektroforeze (SDS PAGE) pod nativnim i denaturišućim uslovima. Monklonska antitela (mAbs) iz svake transfekcije su razdvojena na 4-12% Bis Tris gelu korišćenjem SDS MES tekućem puferu prema protokolu proizvođača (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Nakon elektroforeze, proteini su vizuelizovani sa Simply Blue Coomassie Stain (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) da bi se osiguralo da se odigralo ispravno uparivanje i obezbedila sirova procena homogenosti proteina. Da bi se procenilo da li su rekombinantni mAbs zadržali sposobnost da vezuju pseći IL-31, mAbs su procenjeni u odnosu na njihovu sposobnost da vezuju pseći IL- 31 preko Western blotova. Proteinski standardi i rekombinantni pseći IL-31 (800 ng) su razdvojeni na SDS PAGE preneti na nitroceluloznu membranu korišćenjem Invitrogen iBlot uređaja (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Nakon transfera, membrane su isprane sa destilovanom dejonizovanom vodom i blokirane sa 5 % nemasnog osušenog mleka (NFDM) u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru koji sadrži 0.05% tween-20 (PBST) 1 čas na sobnoj temperaturi (RT). Nakon blokiranja, membrane su isprane u PBST i inkubirane sa ili razblaženim supernatantom iz prolazne ekspresije ili prečišćenim himernim antitelima. Vezivanje himernih antitela jeprocenjeno korišćenjem kozjih anti-psećih IgG antitela-peroksidaza konjugovanog (Betil Laboratories Inc., Montgomery, TX ili Rockland, Imunochemicals, Inc., Gilbertsville, PA) na 1:5000 razblaženju u PBST 1 čas na RT. Potvrda IL-31 vezivanja je određena prisustvom kolorimetrijske trake (očigledna molekulska težina 15 kDa) koja odgovara glikozilovanom obliku psećeg IL-31 nakon dodavanja TMB supstrata svakom blotu (KPL, Inc., Gaithersburg, MD).

[0372] [0170] Himerna mAbs koja pokazuju ekspresiju iz HEK 293 ćelija i vezivanje za rekombinantni pseći IL-31 imunogen sa Western blotom su dodatno analizirana u odnosu na afinitet i funkcionalnost. Da bi se karakterizovano afinitet sa kojim kandidat mAbs vezuje IL-31, površinska plazmon rezonanaca (SPR) je procenjena korišćenjem Biacore system (Biocore Life Sciences (GE Healthcare), Uppsala, Sweden). Da bi se izbegle razlike u afinitetu povezane sa diferencijalnom pripremom površine koja se može desiti pri imobilizaciji antitela za površine; upotrebljena je strategija gde je IL-31 direktno konjugovan za površinu. Imobilizacija je dobijena kuplovanjem amina 5 mg/mL IL-31 korišćenjem hemije N-hidroksisukcinimida (NHS)/1-Etil-3-(3- dimetilaminopropil)karbodiimid (EDC). Čipovi su ugašeni sa etanolaminom i procenjen je afinitet sa kojim su se svi kandidat mAbs vezivali za imobilisani IL-31. Sve krive su fitovane na 1:1 model. Afiniteti <E-11 su ispod donje granice kvantifikacije detekcije za instrument.

[0373] Sva kandidat mAbs su takođe procenjivana u odnosu na njihovu sposobnost da inhibiraju IL-31 signalizaciju u analizi zasnovanoj na ćelijama u dva nezavisna formata. U ko-inkubacinom formatu, mAb:IL-31 kompleksi su pre-inkubirani jedan čas da bi se osiguralo formiranje kompleksa pre dodavanja ćelija. Da bi se povećao potencijal za diferencijaciju između mAbs, izveden je drugi set eksperimenata kojima nedostaje ko-inkubacija i mAbs su dodata direktno ćelijama u toku 5 minuta nakon čega je dodat IL-31. U oba slučaja, IL-31 stimulacija se odigrala u toku 5 minuta. Kao što je dato u Tabeli 3 u nastavku, konverzija mišjih monoklonskih 11E12, 19D07 i 34D03 u pseći himerni oblik, imala je mali uticaj na njihovu sposobnost da vezuju IL-31 ili inhibiraju ćelijski posredovanu signalizaciju. Rezultati takođe potvrđuju ispravne sekvence varijabilnog regiona teškog i varijabilnog regiona lakog lanca izvedene iz svakog mišjeg hibridoma.

[0374] Tabela 3

[0375]

itet

[0377] <1>Himerno 11E12-za teški lanac, MU-11E12-VH je uparen sa HC-64, i za laki lanac, MU-11E12VL je uparen sa kapa.

[0378] *Himerno 19D07-za težak lanac, MU-19D07-VH je uparen sa HC-64, i za laki lanac, MU19D07-VL 45 je uparen sa kapa.

[0379] Himerno 34D03-za teški lanac, MU-34D03-VH je uparen sa HC-64, i za laki lanac, MU-34D03VL je uparen sa kapa.

[0381] Primer 4 In vivo procena himernih mAbs

[0383] Da bi se potvrdilo da je inhibicija IL-31-posredovane ćelijske signalizacije, uočene u DH-82 analizi, u korelaciji sa inhibicijom IL-31-posredovanim pruritusom kod psa, himerno 11E12 monoklonsko antitelo opisano prethodno u Tabeli 3 (Himerno 11E12-64) je procenjeno kod modela IL-31 pruritusa psa. U ovom modelu, pseći IL-31, kada je dat intravenski (IV) u dozi od 1 do 1.5 mg/kg, proizvodi brzu pojavu konzistentnog pruritusnog odgovora koji se može kvantifikovati tokom perioda od dva časa posmatranja. Da bi se procenili pruritusni odgovori, psi su stavljeni u pojedinačne kaveze i merenja pruritusne aktivnosti su izvedena korišćenjem video nadzora. Nakon perioda aklimatizacije od ≥ 1 čas, osnovni pruritusni skorovi su određeni za svakog osa korišćenjem video nadzora u realnom vremesnu korišćenjem kategoričkog sistema za bodovanje. Specifično, ponašanje je prikazano od strane svsakog psa. Pokazivanje ponašanja kao što je lizanje/grizanja šapa, boka, i/ili analnih regiona, češanje bokova, vrata, i/ili podom, trešenje glave, i povlačenje zadnjice duž poda kaveza bilo je dovoljno da da "da" odgovor tokom određenog vremenskog intervala. Na kraju ovog perioda, broj da određivanja je sabran da bi se dobio kumulativni indeks pruritusnog skora (PSI). Pruritusni skor je određen dva puta za svaku životinju, s tim da je prvo merenje bilo 30 minuta osnovnog skora mereno neposredno pre početka perioda tretmana sa test artiklom. Nakon završetka svakog planiranog perioda posmatranja, psi su vraćeni na njihove normalne lokacije.

[0384] [0173] Da bi se procenilo da li potkožna (SC) primena himernog 11E12-64 može inhibirati IL-31-posredovani pruritus, izvedena je pilot studija (76A03) koja je uključivala i tretiranu i placebo grupu (N = 4/grupi). U ovoj studiji, osnovni odgovori su izvedeni sa svih 8 pasa i psi su randomizovani u grupe i smešteni na osnovu njihovog PSI. Važno je da se svaka grupa sastojala od dva psa sa visokim odgovorom (PSI >55) i dva psa sa umerenim odgovorom (PSI = 30 do 55). Ovim psima je zatim primenjeno himerno 11E12-64 na dan 7 i IL-31 provokacije su izvedene na dan 8, 14 i 22. Rezultati ove studije su predstavljene na Slici 8. Ovi rezultati pokazuju da je primena himernog 11E12-64 rezultovala u više od 75% smanjenja u srednjem PSI za dan 8 i 14, u odnosu na dan 1, za životinje tretirane himernim 11E12-64. Ovoj je u suprotnosti sa 37 - 51% povećanju u PSI skorovima za netretirane životinje. PSI se vratio na osonvnu vrednost dve nedelje nakon mAb tretmana, što sugeriše trajanje efikasnosti između jedne i dve nedelje za primenjenu dozu od 0.3 mg/kg.

[0385] Naročiti izazov kada se procenjuje PSI je varijacija od dana do dana povezana sa pruritusnim ponašanjem psa. Da bi se pomoglo u kontroli ove varijacije, 30 minutni osnovni PSI je određen za svakog psa, na svaki dan pre IL-31 provokacije. Slika 9 prikazuje individualne pruritusne skorove pasa iz studije (76A60). Podaci na Slici 9 ilustruju da osnovni PSI na dan 8 i dan 14 je bio približno 25% post IL-31 provokacije u grupi tretiranoj sa himernim 11E12-64. Ova opservacija je konzistentna sa kompletnim ukidanjem IL-31 povezanog pruritusa jer vremenski period osnovne opservacije (0.5 h) je 25% vremenskog perioda opservacije post IL-31 (2h). Uzeti zajedno, ovi in vivo podaci obezbeđuju veoma jake dokaze da; 1) himerno 11E12 mnoklonsko antitelo može neutralisati sposobnost IL-31 da indukuje pruritus kod pasa, 2) inhibicija IL-31 posredovane signalizacije u analizi zasnovanoj na ćelijama je u korelaciji sa in vivo efikasnošću i 3) parametri neophodni da se koristi ovaj IL-31 model za mAb evaluaciju su ustanovljeni za evaluaciju drugih kandidat antitela.

[0387] Primer 5 Strategija kaninizacije

[0389] [0175] Stvaranje anti-lek antitela (ADAs) može biti povezano sa gubitkom efikasnosti za bilo koji bioterapeutski protein uključujući monoklonska antitela. Obimna procena literature pokazala je da specjacija monoklonskih antitela može smanjiti sklonost mAbs da budu imunogena iako se mogu naći primeri imunogenih potpuno humanih mAbs i ne-imunogenih himernih mAbs. Da bi se pomoglo da se smanje rizici mitigate povezani sa ADA formiranjem za mišja anti IL-31 monoklonska antitela obezbeđena ovde, upotrebljena je strategija kaninizacije. Ova strategija kaninizacije je zasnovana na identifikovanju najpogodnije sekvence antitela pseće klicine linije za CDR graftovanje (Slika 4). Nakon ekstenzivne analize svih dostupnih psećih sekvenci klicine linije i za teški za laki lanac, kandidati klicine linije su izabrani na osnovu njihove homologije sa mišjim mAbs, i CDRs iz mišjih progenitorskih mAbs su korišćeni da zamene nativne pseće CDRs. Cilj je bio da se zadrži visok afinitet i aktivnost zasnovana na ćelijama korišćenjem potpunih psećih okvirnih regiona da bi se minimizovao potencijal za imunogenost in vivo. Kaninizovana mAbs su eksprimirana i karakterisana u odnosu na njihovu sposobnost da vezuju IL-31 preko Western blotinga. Ovi rezultati su opisani u nastavku u Primeru 8. Samo mAbs koji su zadržali sposobnost da vezuju IL-31 nakon kaninizacije su dodatno karakterisani. Oni mAbs koi su izgubili sposobnost da vežu IL-31 sistematski su disekovani da bi se identifikovao; 1) lanac odgovoran za gubitak funkcije, 2) okvirni region odgovoran za gubitak funkcije i 3) aminokiselina (aminokiseline) odgovorne za gubitak funkcije.

[0391] Primer 6 Kaninizacija 11E12, 19D07, i 34D03 antitela

[0393] Napravljeni su sintetički nukleotidni konstrukti koji predstavljaju kaninizovane varijabilen teške i lake lance od mAbs 11E12, 19D07, i 34D03. Nakon subkloniranja svakog varijabilnog lanca u plazmide koji sadrže respektivne pseći konstantne teški ili kapa konstantni region, plazmidi su ko-transficirani za ekspresiju antitela u HEK 293 ćelijama. Ukratko, i 19D07 i 34D03 mAbs zadržali su IL-31 vezivanje nakon kaninizacije. Kaninizovane anti-pseće IL-31 varijabilne sekvence određene za svako antitelo su kao što sledi, 19D07 varijabilni laki lanac (Seq ID NO: 23 CAN-19D07- VL-998-1, za koji je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 46), 19D07 varijabilni teški lanac (Seq ID NO: 29 CAN-19D07-VH-400-1, za koji je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 47), 34D03 varijabilni laki lanac (Seq ID NO: 25 CAN-34D03-VL-998-1, za koji je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 48), and 34D03 varijabilni teški lanac (Seq ID NO: 31 CAN-34D03-VH-568-1, za koji je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID No: 49).

[0394] Nasuprot tome, sekvence klicine linije korišćene za pokušaje kaninizacije 11E12 rezultovale su u ne-funkcionalnim mAbs. U odnosu na Sliku 10, himerne, heteroimerne, i kaninizovane verzije mAb 11E12 su eksprimirane i karakterisane u odnosu na njihovu sposobnost da vežu pseći IL-31 preko Western blotinga. Ovi rezultati su pokazali da kaninizovano 11E12 antitelo nije vezalo pseći IL-31 (Blot #2). Takođe, u odnosu na heterohimere, himerni teški lanac uparen sa kaninizovanim lakim izgubio je IL-31 vezivanje (Blot #3), dok je kaninizovani teški lanac uparen sa himernim lakim zadržao IL-31 vezivanje (Blot #4). Na osnovu rezultata dobijenih iz heterohimera, zaključeno je da je kaninizovani laki lanac odgovoran za gubitak aktivnosti.

[0395] [0178] U naporima da se ovrati vezivanje kaninizovanih verzija 11E12 psećem IL-31, kaninizovani laki lanac je modifikovan zamenom okvirnih sekvenci. Slika 11 obezbeđuje pregled postupka supstitucije okvirnog regiona lakog lanca 11 E12. Ovaj postupak je identifikovao antitelo koje zamenjuje pseći okvirni region II (FWII) sa mišjim okvirnim regionom II i obnavlja vezivanje sa psećim IL-31 (11E12 varijabilni laki lanac (Seq ID NO: 20 CAN-11E12-VL-cUn-FW2, za koji je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 50), 11E12 varijabilni teški lanac (Seq ID NO: 27 CAN-11E12- VH-415-1, za koji je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 51)).

[0396] Dodatno poboljšavanje ovih povratnih mutacija identifikovalo je da antitelo sa povratnom mutacijom jednog arginina u leucin (R50L) u okvirnom regionu II može povratiti IL-31 vezivanje preko Western blot analize (11E12 varijabilni laki lanac (Seq ID NO: 21 CAN-11E12-VL-cUn-13, za koji je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 52), 11E12 varijabilni teški lanac (Seq ID NO: 27 CAN-11E12-VH-415-1)) (Slika 12). Kada su ’kaninizovane’ verzije svakogpotencijalnog kandidata identifikovane mAbs su prečišćeni i dijalizovani u PBS za dodatnu procenu. Tabela 4 rezimira rezultate i merenja afiniteta i podatke za inhibiciju zasnovanu na ćelijama. Ovi podaci demonstriraju da kaninizovani derivati i 11E12 i 34D3 oba zadržavaju odličnu inhibitornu aktivnost u analizi zasnovanoj na ćeliji i afinitet za IL-31 kao što je meren sa Biacore. Takođe je vredno napomenuti opservaciju da originalni kaninizovani 19D7 molekul zadržava izuzetnu potenciju kao što je mereno sa Biacore, sposobnost da inhibira based ćelijsku IL-31 signalizaciju izgelda da je kompromitovana u odnosu na njegovog mišjeg progenitora. Mali do nikakvog gubitka afiniteta je nastao pri koverziji mAbs iz njihovog mišjeg izotipa u pseći derivat.

[0399] TABELA 4

[0401]

itet

[0402] Teški lanci: Svi kaninizovani i heterohimerni oblici 11E12 uključivali su VH sekvencu od CAN-11E12-VH-415-1 (SEQ ID NO: 27) i konstantni region označen HC-64 (SEQ ID NO: 40);

[0403] Kaninizovani 19D07 uključivao je VH sekvencu od CAN-19D07-VH-400-1 (SEQ ID NO: 29) i HC-64; Kaninizovani 34D03 uključivao je VH sekvencu od CAN-34D03-VH-568-1 (SEQ ID NO: 31) i HC-64.

[0404] Laki lanci: Kaninizovani 11E12 je uključivao VL sekvencu od CAN-11E12-VL-cUn-1 (SEQ ID NO: 53) i konstantni region označen kapa (SEQ ID NO: 44); Heterohimerni 11E12 uključivao je VL sekvencu od MU-11E12-VL (SEQ ID NO: 19) i kapa; Kaninizovani 11E12 FW2 uključivali su VL sekvencu od CAN-11E12-VL-cUn-FW2 (SEQ ID NO: 20) i kapa; Kaninizovani 11E12 13 uključivao je VL sekvencu od CAN-11E12-VL-cUn-13 (SEQ ID NO: 21) i kapa;

[0405] Kaninizovani 19D07 uključivao je VL sekvencu od CAN-19D07-VL-998-1 (SEQ ID NO: 23) i kapa; Kaninizovani 34D03 uključivao je VL sekvencu od CAN-34D03-VL-998-1 (SEQ ID NO: 25) i kapa.

[0407] Primer 7 Karakterizacija vezivanja psećeg IL-31 sa antitelima 11E12 i 34D03

[0409] [0180] Da bi se odredili aminokiselinski ostaci uključeni u vezivanje psećeg IL-31 sa antitelima 11E12 i 34D03, korišćena je strategija mutacije koja je uključivala 1) skraćivanje IL-31 proteina iz i N i C terminusa i 2) zamenu pojedinačnih aminokiselina sa alaninom (ala skeniranje) da bi se odredio uticaj na mAb vezivanje. PCR prajmeri su dizajnirani da bi se amplifikovao pseći IL-31 gen koji je kodon optimizovan za ekspresiju u E. coli domaćinu. Sekvenca ovog kodon optimizovanog psećeg IL-31 konstrukta pune dužine za ekspresiju u E.coli je predstavljena sa SEQ ID NO: 55, za koji je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 56. Prajmeri su dizajnirani da amplifikuju gen u punoj dužini i da stvore skraćenja od 20 aminokiselina proteina krećući se ka unutra od N i C terminusa. Za svrhu ovih N-terminalnih skraćenja, položaj 1 je odgovarao glicinskom ostatku neposredno posle N-terminalnog 6-His taga u kodon optimizovanom konstruktu. Proizvodi PCR amplifikacije su klonirani u pET101D (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) premaprotokolu proizvođača. pET101D plazmid omogućava fuziju rekombinantnog proteina sa N-terminalnim 6-His epitop tagom za potvrdu ekspresije. Plazmidi sa potvrđenom sekvencom su korišćeni za transformaciju BL21 Star TOP10 E.coli ćelija (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) i ekspresija rekombinantnog proteina je indukovana korišćenjem 1mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) pod standardnim uslovima kulture. Nakon indukcija, ćelije su peletirane i lizirane korišćenjem Bacterial Protein Extraction Reagents (skraćeno B-PER, ThermoFisher Scientific Inc., Rockford, IL). Sirovi lizati su podvrgnuti SDS-PAGE i Western bloting je izveden kao što je prethodno opisano. Svi Western bloting za mutacionu analizu su izvedeni korišćenjem mišjih verzija 11E12 i 34D03 usled dostupnosti neophodnih prečišćenih antitela i reagenasa. Svako antitelo je testirano u odnosu na njegou sposobnost da vezuju lizat sirovog proteina koji predstavlja IL-31 pune dužine i skraćenu varijantu. Kontrolni blotovi su takođe testirani sa anti-His mAb da bi se potvrdila ekspresija svakog proteina. Proteini sa N-terminalnim skraćenjem (-20N, -40N, i -60N) su svi pokazali robusnu ekspresiju u E. coli i bili su sposobni da se vezuju sa 11E12 i 34D03 (Slika 13). Aminokiselinske i nukleotidne sekvence koje odgovaraju -20N konstruktu su SEQ ID NOs: 57 i 58, respektivno. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence koje odgovaraju -40N konstruktu su SEQ ID NOs: 59 i 60, respektivno. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence koje odgovaraju -60N konstruktu su SEQ ID NOs: 61 i 62, respektivno. Međutim, IL-31 pune dužine i proteini sa C-terminalnim skraćenjima (-20C, -40C, i -60C) nisu uspeli da se eksprimiraju pod ovim uslovima.

[0410] [0181] Uočeno je da je IL-31 protein pune dužine bio eksprimiran veoma slabo. Međutim, konstrukt sa uklonjenih prvih 20 aminokiselina (-20N) sa N-terminusa pokazao je robusnu ekspresiju. Sva antitela 11E12 i 34D03 su vezivala -20N protein. Stoga, dodatni rad je izveden korišćenjem ovog -20 N konstrukta. Konstrukti koji predstavljaju C-terminalno skraćenje na položajima 20-122 (MW 15.3 sa his tagom), 20-100 (MW 12.9 sa his tagom), i 20-80 (MW 10.4 sa his tagom), napravljeni su da bi se procenilo mAb vezivanje za ove površine na IL-31 proteinu. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence koje odgovaraju 20-122 konstruktu su SEQ ID NOs: 63 i 64, respektivno. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence koje odgovaraju 20-100 konstruktu su SEQ ID NOs: 65 i 66, respektivno. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence koje odgovaraju 20-80 konstruktu su SEQ ID NOs: 67 i 68, respektivno. Slika 14 prikazuje Western blotove lizata sirovog proteina ovih skraćenih proteina koji su testirani sa mAbs 11E12 (Blot B) i 34D03 (Blot C). Kao što je prikazano na ovoj Slici, mAbs 11E12 i 34D03 vezuju se za IL-31 skraćene proteine 20-122 i 20-100, ali nisu uspeli da se vežu za 20-80. Ovi rezultati su ukazali da aminokiseline između položaja 80 i 100 psećeg IL-31 konstrukta pune dužine sa SEQ ID NO: 55 (korišćenjem "SSHMA" kao N-terminusa) su bili uključeni u vezivanje ovih antitela. Ovaj region odgovara aminoksielinama br. Između aminokiselinskih ostataka 102 i 122 pseće sekvence IL-31 proteina pune dužine od SEQ ID NO: 32. Kontrolni blot korišćenjem anti-His mAb (Blot A) pokazao je da su svi skraćeni proteini eksprimirani. Dodatno, pET101D-lacZ protein je korišćen kao kontrola da bi se potvrdio nedostatak nespecifičnog vezivanja mAbs sa proteinima domaćina.

[0411] Da bi se dodatno identifikovale aminokiseline u psećem IL-31 uključene u vezivanje sa mAbs 11E12 i 34D03, alanin skening mutageneza je izvedena u skladu sa poznatim postupcima. Pojedinačni konstrukti su napravljeni (u -20N plazmidu) supstitucijom alanina na svakom položaju na psećem IL-31 od aminokiseline 76 do 122. Nakon potvrde sekvence, izvedena je ekspresija proteina i lizati sirovog proteina su podvrgnuti Western blot analizi. Slika 15 prikazuje rezime rezultata koji označavaju položaje na psećem IL-31 koje, kada su mutirane u alanin, utiču na vezivanje sa mAbs 11E12 i 34D03. Kao što je prikazano na ovoj Slici, položaji 77, 78, 81 i 85 IL-31 konstrukta pune dužine svi utiču na vezivanje 11E12 ili 34D03 antitela. Oni odgovaraju aminokiselinskim ostacima 99, 100, 103 i 107, respektivno, sekvence psećeg IL-31 proteina pune dužine od SEQ ID NO: 32.

[0412] Da bi se istražio uticaj više mutacija u regionu IL-31 važnih za vezivanje 11E12 i 34D03 antitela, konstruisani su ekspresioni plazmidi sa dvostrukim (D82A, I85A) i trostrukim (I81A, D82A, I85A) alanin supstitucijama. E. coli lizati koji eksprimiraju pseći IL-31 sa ovim dvostrukim i trostrukim mutacijama dodatno -20N kontroli su blotovani sa 11E12 i 34D03 antitelima (Slika 16). Jasno je da su ove tri aminokiseline na psećem IL-31 uključene u prepoznavanje 11E12 i 34D03 jer je potpuno ukidanje vezivanja uočeno kada su ova mesta izmenjena u alanin. Ove tri aminokiseline odgovaraju aminokiselinskim ostacima 103, 104 i 107 sekvence psećeg IL-31 proteina pune dužine od SEQ ID NO: 32.

[0413] [0184] Ukratko, analiza skraćivanjem psećeg IL-31 otkrila je da su aminokiselinski ostaci (naznačeni na Slici 15 između položaja 80 i 122) uključeni u vezivanje 11E12 i 34D03 antitela. Dodatno, fina mutaciona analiza korišćenjem alanin skeniranja otkrila je da svi ASP77, LYS78, ILE81, ASP82, i ILE85 IL-31 konstrukti pune dužine utiču na vezivanje 11E12 ili 34D03 ukazujući da ovaj region najverovatnije definiše epitop odgovoran za prepoznavanje od strane ovih antitela. Interesantno, pokazano je da je ovaj region humanog IL-31 proteina uključen u vezivanje sa GPL subjedinicom njegovog ko-receptora (Le Saux S et al. Biol Chem. 2010 Jan 29;285(5):3470-7. Epub 2009 Nov 17). Ove opservacije, zajedno sa sposobnošću mAbs 11E12 i 34D03 da neutrališu IL-31 posredovanu pSTAT aktivnost u monocitima, podržavaju preptostavku da se ovi mAbs vezuju za ostatke psećeg IL-31 koji su esencijalni za vezivanje ovog citokina za njegov receptor, čime se inhibira njegova sposobnost da indukuje signalizaciju.

[0415] Primer 8 Proizvodnja kaninizovanog 34D03 antitela iz glutamnin sintetaza (GS) plazmida

[0417] Geni koji kodiraju kaninizovana 34D03 mAb (teški i laki lanci, Tabela 4 prethodno) su klonirani u GS plazmide pEE 6.4 i pEE 12.4, respektivno (Lonza, Basel, Switzerland). Rezultujući plazmidi su digestirani prema protokolu proizvođača i ligatirani zajedno da bi formirali jedan sisarski ekspresioni plazmid. Svaki plazmid je korišćen za transfekciju HEK 293 ćelija i ekspresija je izvedena u 20L medijuma kulture. Protein je izolovan iz kondicioniranog HEK medijuma korišćenjem Protein A afinitetne hromatografije prema standardnim postupcima prečišćavanja proteina. Medijum je napunjen na hromatografsku smolu i eluiran sa promenom pH. Eluirani protein je pH podešen, dijalizovan, i sterilno filtriran pre upotrebe. Rezultujuće antitelo je bilo više od 99 procenata monomerno na osnovu analitičke ekskluzione hromatografije pri čemu nisu uočeni agregati velike molekulske težine. Ovo antitelo je nakon toga korišćeno za procenu u pruritus modelu psa da bi se procenila in vivo efikasnost.

[0419] Primer 9 Procena kaninizovanog 34D03 antitela u modelu pruritusa psa

[0421] [0186] Anti-pruritusna aktivnost kaninizovanog 34D03 (CAN 34D03-65 predstavljeno sa SEQ ID NO 31 (VH) uparen sa SEQ ID NO 25 (VL) na SEQ ID NO 42 (HC-65) i SEQ ID NO 44 (LC-Kapa)) procenjena je korišćenjem psećeg modela IL-31-indukovanog pruritusa. Sa ovim modelom, 1.5 mg/kg intravenske doze za provokaciju rekombinantnog psećeg IL-31 poznatog da indukuje prelazni period pruritusnog ponašanja kod bigl pasa (IL-31 provokacija, trajanje pruritus <24 časa) je ponovljeno dopremana životinjama pre i do 63 dana nakon jedne 1.0 mg/kg SC doze CAN 34D03-65. Na svakom periodu provokacije sa IL-31, korišćen je video nadzor u realnom vremenu da bi se dobila mera pruritusnog ponašanja 0.5 časova pre dopremanja citokina (pre-IL-31 osnovni period) nakon čega je sledilo slično 2 časovno merenje sa početkom 20 minuta nakon injekcije citokina (2h nakon perioda provokacije sa IL-31). Skorovi za pruritus su stvoreni u svakom vremenskom periodu pod procenom pravljenjem "da/ne" određivanja da li je pokazano pruritusno ponašanje tokom uzastopnih vremenskih intervala od 1 minuta (maksimalni pruritusni skor = 30 za svaki osnovni period; 120 za post-IL-31 provokacioni period). Slika 17 rezimira pruritusne skorove dobijene pre i posle CAN 34 D03-65 tretmana, koji je dat na dan 0 studije. Sedam dana pre mAb tretmana, srednja vrednost post-IL-31 provokacionog pruritusnog skora pasa bile je 68 ± 13 (S.E., n=4). Putem poređenja, na dane studije 7, 14, 21, srednja vrednost post-IL-31 provokacionog pruritusnog skora je snižena na 5 ± 2, 8 6 4, i 9 ± 5, respektivno. Ove promene u pruritusnom skoru između dana -7 i dana 7-21 predstavljaju ≥85% smanjenje u ukupnoj pruritusnoj reaktivnosti na IL-31.

[0422] Stepen inhibicije IL-31-indukovanog pruritusa može zaista biti bliži 100% tokom ovog vremenskog okvira ukoliko se u obzir uzme da su između dana 0 i 21, 0.5 h pre-IL-31 osnovni skorovi bili u proseku 1.6 ± 0.6—nivo koi bi se mogao ekstrapolirati do pruritusnog skora od 6-7 tokom perioda od 2h. Pruritusna reaktivnost tretiranih pasa na egzogeni IL-31 postepeno se vremenom oporavljala. Dod dana 63 post-CAN D03-65 tretmana, srednja vrednost 2h post-IL-31 provokacioni pruritusni skori je porastao na 57 ± 8 ili grubo do 84% pre-mAb IL-31 provokacionih odgovora uočenih na dan -7. Stoga, u modelu IL-31-indukovanog pruritusa, jedna bolus SC injekcija CAN 34D03-65 obezbedila je nedelje anti-pruritusne zaštite tretiranim psima.

[0424] Primer 10 Karakterizacija mačijeg IL-31

[0426] [0188] Sekvenca mačijeg IL-31 jen identifikovana sličnom pretragom mačijeg genoma sa psećim IL-31 korišćenjem NCBIs genome resursa (www.ncbi.nlm.nih.gov). Gen koji predstavlja mačiji IL-31 je sintetisan za optimalnu ekspresiju u E. coli. Ekspresioni konstrukti su stvoreni sa psećim i mačijim IL-31 genima pune dužine koji sadrže N-terminalni 6-His tag za detekciju i prečišćavanje. Mačiji konstrukt pune dužine korišćen za ekspresiju u E.coli je predstavljen sa nukleotidno sekvencom SEQ ID NO: 69 i sekvencom proteina SEQ ID NO: 70. Plazmidi sa potvrđenom sekvencom su korišćeni za transformaciju E. coli BL21 Star™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) i ekspresija je izvedena na 30 C 5 časova. Nakon lize ćelijskih peleta nađeno je da je imunoreaktivni protein veoma obogaćen sa nerastvorljivim lizatom. Ovi ćelijski peleti su solubilizovani u 6M urei i prečišćavanje rekombinantnih proteina je izvedeno pod denaturišućim uslovima korišćenjem nikl kobalt smole (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL). Pulovane eluirane frakcije, za koje je pokazano da su pozitivne u odnosu na prisustvo His taga, dijalizirane su koracima dijalize nasuprot 0.8 M urea PBS nakon čega sa PBS, i analizirane sa SDS PAGE (Slika 18). Kao što je ranije uočeno, prinos rekombinantnog psećeg IL-31 iz E. coli indukcije bio je nizak. Međutim, protein rekuperovan nakon prečišćavanja kreatao se u skladu sa očekivanom molekulskom masom preko SDS-PAGE.

[0427] Da bi se ispitala biološka aktivnost psećeg i mačijeg IL-31 proizvedenog iz E. coli, svaki protein je analiziran u odnosu na njegovu sposobnost da indukuje pSTAT signalizaciju u DH82 ćelijskoj analizi. Kako je rekombinantni IL-31 iz sisarskih ćelija (pseći IL- 31 (CHO)) je visoko glikozilovan, nije bilo jasno da li će neglikozilovani oblik zadržati biološku aktivnost. Slika 19 pokazuje da mačiji IL-31 ima zuporedivu bioaktivnost na referentni IL-31 proizveden u CHO ćelijama.

[0428] Alanin-skenirajuća mutageneza psećeg IL-31 definisala je region unutar proteina koji je neophodan za vvezivanje sa 11E12 i 34D03 antitelima. Pretpostavljeno je da, usled konzervativnosti sekvence u ovom regionu (Slika 20), ova mAbs će unakrsno reagovati sa mačijim IL-31.

[0429] Slika 21 prikazuje da mAbs 11E12 i 34D03 su sposobna da se vezuju za pseći IL-31 (E. coli) i takođe su sposobna da unakrsno reaguju sa mačijim IL-31 proteinom. Na osnovu ovih podataka, ciljana je specijacija 34D03 antitela na mačija (felinizacija).

[0431] Primer 11 Felinizacija na antitelu 34D03

[0433] Slično opisanoj strategiji kaninizacije, odgovarajuće sekvence antitela klicine linije su identifikovane iz svih dostupnih mačijih sekvenci za CDR grafting iz mAb 34D03. Varijabilni laki lanac (SEQ ID NO: 71 FEL-34D03-VL- 021-1, za koji je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 72) i varijabilni teški lanac (SEQ ID NO: 73 FEL-34D03-VH-035-1, za koji je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 74) izabrani su na osnovu najviše homologije sa njihovim respektivnim psećim okvirnim regionimau kaninizovanom 34D03. Rekombinantno felinizovano 34D03 je proizvedeno korišćenjem izabranih varijabilnih regiona spojenih sa njihovim respektivnim sekvencamaa konstatnog teškog IgG1 (SEQ ID NO: 75 HC-A mačiji, za koji je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 76 GenBank accession No. AB016710.1) i kapa konstantnog lakog (SEQ ID NO: 77 LC-Kapa mačiji, za koji je odgovarajuća nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 78 GenBank accession No. AF198257.1) lanca.

[0434] Antitelo je proizvedeno iz HEK ćelija i prečišćeno kao što je prethodno opisano. Slika 22 prikazuje sposobnost mačijeg 34D03 da neutralizuje pSTAT signalizaciju sa uporedivom IC<50>sa psećom verzijom.

[0435] Frelinizovano 34D03 je procenjeno u odnosu na njegovu sposobnost da vezuje i mačiji i pseći IL-31. Slika 23 prikazuje Western blotove sa felinizovanim 34D03 korišćenjem prečišćenog proteina i iz sisarskih i E. coli izvora. Vezivanje je uočeno i za pseće i za mačije proteine ukazujući na potpunu unakrsnu reaktivnost felinizovanog oblika 34D03 i potvrdu vazivanja sa mačijim proteinom. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugerišu da konzervativni epitop na mačijem IL-31 može biti pogodan target za inhibiciju ovog citokina kod mačaka.

[0437] Primer 12 Detekcija IL-31 citokina kod pasa sa atopijskim dermatitisom koji se prirodno javlja

[0439] U predmetnom primeru, nivo IL-31 proteina u serumu sakupljenom iz populacija pasa, uključujući one sa atopijskim dermatitisom, procenjen je korišćenjem tehnike kvantitativne imunoanalize.

[0440] Serum je sakupljen iz sledećih populacija pasa i zamrznut pre merenja serumskog IL-31.

[0442] 1) Dvadesetčetiri bigla hranjenih u tu svrhu (Marshall BioResources, North Rose, NY) pre iposle senzitizacije na alergen grinja (Dermatophagoides farina, Greer Labs). Sve životinje su bile približno 9 meseci stare. Oba pola su bile približno jednako predstavljena.

[0443] 2) Trideset pasa alergičnih na buve (Youngs Veterinary Research Services, Turlock, CA) pre infestacije buvama ili približno jednu nedelju nakon infestacije sa buvama odrasle mačke (Ctenocephalides felis). Većina pasa u ovoj koloniji bili su mešanci. Prosečna starost bila je oko 10.5 godina. Oba pola su bile približno jednako predstavljena.

[0444] 3) Osamdesetsedam pasa od vlasnika sa sub-kliničkom periodontalnom bolešću ali inače određeni da su dobrog zdravlja. Uzorci su sakupljeni u 18 US veterinarskih klinika. Životinje su bile reprezentativne za pseću populaciju u SAD u odnosu na pol i rasu i bili su između dve i pet godina starosti.

[0445] 4) Dvestotinedvadesetčetiri od vlasnika dijagnostifikovani sa hroničnim, ne-sezonskim atopijskim dermatitisom sa trajanjem od najmanje 1 godine (na osnovu modifikovanog Willemse-ovog kriterijuma, i Prelaud (Willemse T. J small Anim Pract 1986; 27:771-778 and Prelaud et al. Revue de Medecine Veterinaire 1998; 149: 1057-1064) sa minimum "umerenog svraba" kao što je procenjeno od strane vlasnika, i minimalnim skorom za kožne lezije od 25 na CADESI-02) kao što je procenjeno od strane veterinara. Uzorci su sakupljeni od 14 SAD veterinarskih praksi sa ekspertizom u veterinarskoj dermatologiji. Približno 75% pasa je bilo čistokrvno i ∼25% ukupne populacije bili su retriveri (Labrador (17.3%) i Zlatni (8.2%)). Tendencija je bila da su psi sredovečni (∼6 godna starosti). Oba pola su bile približno jednako predstavljena.

[0446] Sendvič imunoanaliza je korišćena za kvantifikaciju cIL-31 nivoa u psećem serumu. Uzorci seruma su razblaženi 1:2 u Rexxip puferu (Gyrolab, Warren, NJ) i pušteni na Bioaffy 1000 nL CDs (Gyrolab) koiršćenjem Gyrolab xP workstation. cIL-31 je uhvaćen sa biotinobeleženim anti-IL-31 monoklonskim antitelom prema predmetnom pronalasku i detktovan sa Alexaflour 647 obeleženim anti-IL-31 monoklonskim antitelom prema predmetnom pronalasku. Koncentracije uzorka cIL-31 su ekstrapolirane sa standardne krive sa 8 tačaka sa dinamičkim opsegom od 0.013-250 ng/mL korišćenjem modela sa fitovanjem na osnovu 5 parametara sa Gyrolab Evaluator softverom.

[0447] Nivoi cIL-31 bili su detektabilni u uzorcima seruma kod 57% pasa sa atopijskim dermatitisom koji se prirodno javlja (≥13 pg/mL) ali nisu bili detektabilni (< 13 pg/mL) u serumu iz namenski hranjenih biglova /- senzitizovanih na HDM, pasa mešanaca /- infestacija buvama, ili pasa od vlasnika sa periodontalnom bolešću koji su inačen smatrani dobrog zdravlja, nezavisno od rase. Kod pasa sa atopijskim dermatitisom koji se prirodno javlja, 53% analiziranih uzoraka je pokazalo IL-31 nivoe u serumu između 13-1000 pg/mL, i 4% je pokazalo nivoe preko 1000 pg/mL (Tabela 5).

[0449] Tabela 5: Nivoi IL-31 u serumu u različitim populacijama pasa

[0451]

[0452]

[0455] Rezultati predmetnog primera pokazuju da je IL-31 protein povišen u značajnom broju pasa sa psećim atopijskim dermatitisom. Bez vezivanja za bilo koju teoriju, veruje se da IL-31 put igra ulogu u patobiologiji pruritusnih alergijskih kožnih stanja kao što su, ali se ne ograničavajući na, pseći atopijski dermatitis i predstavlja novi put za terapijsku intervenciju sa IL-31 antagonistom, kao što je uključujući, ali se ne ograničavajući na, olacitnib i/ili anti-IL-31 antitelo koje se specifično vezuje za pseći IL-31.

Claims (14)

1. Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se specifično vezuje za IL-31 koji sadrži

region koji određuje komplementarnost (CDR)1 varijabilnog teškog (V<H>) lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-V<H>-CDR1), V<H>CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-V<H>-CDR2) i V<H>CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu VRGYGYDTMDY(SEQ ID NO: 9; 34D03-V<H>-CDR3); i

varijabilni laki (V<L>) lanac koji sadrži region koji određuje komplementarnost (CDR) 1 koji ima aminokiselinsku sekvencu KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-V<L>-CDR1), V<L>CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu RASNLEA(SEQ ID NO: 15; 34D03-V<L>-CDR2) i V<L>CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-V<L>-CDR3).

2. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući deo je monoklonsko antitelo.

3. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući deo je himerni.

4. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući deo je kaninizovan.

5. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući deo inhibira IL‑31-posredovanu pSTAT signalizaciju u ćelijski baziranom testu.

6. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5, pri čemu antitelo sadrži najmanje jednu grupu koja se sastoji od:

a) varijabilnog lakog lanca koji sadrži

b) varijabilnog teškog lanca koji sadrži

i

c) varijante (a) i/ili (b) koje imaju jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija.

7. Veterinarska kompozicija koja sadrži terapeutski efektivnu količinu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6.

8. Ćelija domaćin koja proizvodi antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahetva 1 do 6.

9. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, koja sadrži sekvencu nukleinske kiselina koja kodira:

region koji određuje komplementarnost (CDR)1 varijabilnog teškog (V<H>) lanca koji ima

aminokiselinsku sekvencu NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-V<H>-CDR1), V<H>CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu TISYGGSYTYYPDNIKG(SEQ ID NO: 6; 34D03-V<H>-CDR2) i V<H>CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu VRGYGYDTMDY(SEQ ID NO: 9; 34D03-V<H>-CDR3); i sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira

varijabilni laki (V<L>) lanac koji sadrži region koji određuje komplementarnost (CDR) 1 koji ima aminokiselinsku sekvencu KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-V<L>-CDR1), V<L>CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu RASNLEA(SEQ ID NO: 15; 34D03-V<L>-CDR2) i V<L>CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-V<L>-CDR3).

10. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 9.

11. Postupak za proizvodnju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela koji sadrži kultivaciju ćelije domaćina iz patentnog zahteva 8 pod uslovima koji rezultuju u proizvodnju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela, i izolovanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela iz ćelije domaćina ili medijuma kulture ćelije domaćina.

12. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 za upotrebu u tretiranju pruritusnog stanja kod psa.

13. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je pruritusno stanje izabrano iz grupe koja se sastoji od atopijskog dermatitisa, ekcema, psorijaze, skleroderme i pruritisa, poželjno pri čemu je pruritusno stanje atopijski dermatitis.

14. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema patentnom zahtevu 12 ili 13, pri čemu

(i) tretman je olakšavajući tretman pruritusnog stanja kod psa;

(ii) tretman uklanja pruritusno stanje kod psa; ili

(iii) tretman izaziva regresiju kliničkih simptoma.