RS66342B1 - Metode za snižavanja nivoa lipoproteina administracijom inhibitora proproteinske konvertaze suptilizin/keksin tipa 9 (pcsk9) - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast terapeutskih tretmana bolesti i poremećaja koji su povezani sa povišenim nivoima lipoproteina. Konkretno, ovaj pronalazak se odnosi na administraciju inhibitora PCSK9 za smanjenje nivoa serumskog Lp(a) kod pacijenta, pri čemu inhibitor PCSK9 je humano antitelo koje specifično inhibira PCSK9.

Stanje tehnike

[0002] Lipoprotein(a) (Lp(a))) je čestica slična lipoproteinu male gustiene koju formira apolitipoprotein(a) (Apo(a))) sa apopolipoprotein B100 (ApoB100). Apo(a) komponenta je kovalentno povezana disulfidnom vezom sa ApoB100 komponentom u sklopljenoj Lp(a) čestici. Povišeni serum Lp(a) je prikazan u nekoliko studija da je u korelaciji sa različitim aterosklerotičnim i trombotičnim poremećajima. (Videti, npr. Marcovina and Koschinsky (1998), Am. J. Cardiol.82:57U-66U; Ignatescu et al. (1998), Thromb. Haemost.80:231-232; Lippi and Guidi (2000), Q. J. Med.93:75-84; Bennet et al. (2008), Arch. Intern. Med.168:598-608; The Emerging Risk Factors Collaboration (2009), J. Am. Med. Assoc. 302:412-423; and Lamon-Fava et al. (2011), J. Lipid Res. 52:1181-1187). Stoga, terapeutsko smanjenje nivoa seruma Lp(a) je predloženo kao način za lečenje ili smanjenje rizika od kardiovaskularnih poremećaja. Postoji nekoliko dostupnih terapijskih opcija za snižavanje nivoa seruma Lp(a).Primeri tretmana koji su testirani i/ili predloženi za snižavanje seruma Lp(a) uključuju administraciju acetilsalicilne kiseline, L-karnitina, niacina ili anacetrapiba, ili LDL afereze. (videti, npr. Parhofer (2011), Curr. Pharm Des 17:871-876). Trenutno nema dostupnih tretmana, međutim, obezbeđuje adekvatnu i praktičnu terapiju za povišenu Lp(a).

[0003] Proproteinska konvertaza suptilizin/keksin tip 9 (PCSK9) je proteinska konvertaza koji pripada proteinazama K podfamilije porodice sekretorne suptilaze. Upotreba inhibitora PCSK9 (anti-PCSK9 antitela / antitela na PCSK9) za smanjenje ukupnog holesterola u serumu, LDL holesterola i serum triglicerida je opisana u US Patent Appl. Publ. No.2010/0166768. Nordestgaard et al. (2010) European Heart Journal 31 (23): 2844 opisuje vezu između povišenih nivoa Lp(a) i povećanog kardiovaskularnog rizika. Parhofer (2011) Current Pharmaceutical Design 17:871-876 ukazuje na to da efekat antitela na Lp(a) nije poznat. WO 2011/028938 opisuje upotrebu inhibitora PCSK9 za smanjenje LDL, apoB ili ukupnog holesterola. Ipak, do sada nije pokazano da inhibitor PCSK9 snižava nivo Lp(a) kod pacijenata. Stoga, u tehnici i dalje postoji potreba za terapijskim metodama snižavanja nivoa serumskog Lp(a). Kratak opis pronalaska

[0004] Predmetni pronalazak zadovoljava prethodno navedenu potrebu u tehnici za obezbeđivanjem farmaceutskih kompozicija za upotrebu u metodama za snižavanje nivoa seruma Lp(a) kod pojedinca. Metode obuhvataju izbor pacijenta koji pokazuje povišeni nivo serumskog Lp(a) iznad 30 mg/dl, i administriranje farmaceutske kompozicije koja se sastoji od inhibitora PCSK9 za pacijenta, pri čemu Inhibitor PCSK9 je humano antitelo koje specifično inhibira PCSK9. Pacijent takođe može da bude odabran na osnovu ispoljavanja dodatnih faktora rizika za takve bolesti i poremećaje u kojima bi smanjenje nivoa Lp(a) bilo korisno ili smanjilo rizik. Na primer, pacijenti sa hiperholesterolemijom (npr. hefH, nonFH, itd.) mogu da budu dobri kandidati za lečenje terapijskim metodama predmetnog pronalaska.

[0005] Primeri specifičnih anti-PCSK9antitela koja se mogu koristiti uključuju bilo koja antitela navedena u US Patent Appl. Publ. No.2010/0166768, i/ili je ovde dato.

[0006] inhibitor PCSK9 se može administrirati subjektu subkutano ili intravenozno. Osim toga, Inhibitor PCSK9 se može administrirati pacijentu koji je na terapijskom režimu statinima u vreme terapeutske intervencije.

[0007] Druge realizacije predmetnog pronalaska će biti vidljive iz pregleda detaljnog opisa koji sledi.

Detaljan opis pronalaska

[0008] Pre nego što bude opisan predmetni pronalazak, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određene metode i opisane eksperimentalne uslove, pošto takvi postupci i uslovi mogu da variraju. Takođe treba razumeti da je ovde korišćena terminologija samo u svrhu opisivanja određenih realizacija, i nije namera da bude ograničavajuća, budući da će obim ovog pronalaska biti ograničen samo priloženim zahtevima.

[0009] Osim ako nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni termini imaju isto značenje koje obično razume stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Kako se ovde koristi, termin "oko", kada se koristi u odnosu na određenu navedenu numeričku vrednost, znači da vrednost može da varira od navedene vrednosti za najviše 1%.Na primer, kao što se ovde koristi, izraz „oko 100“ obuhvata 99 i 101 i sve vrednosti između (npr.99,1, 99,2, 99,3, 99,4, itd.).

[0010] Iako se u primeni ovog izuma mogu koristiti metode i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, sada su opisani željeni metodi i materijali.

Povećani nivoi serumskog Lp(a)

[0011] Predmetni pronalazal obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje se koriste u metodama za smanjenje nivoa Lp(a) u serumu kod pacijenta. Metode obuhvataju izbor pacijenta koji pokazuje povišeni nivo Lp(a) u serumu iznad 30 mg/dl, i administriranje pacijentu farmaceutske kompozicije koja se sastoji od Inhibitora PCSK9, pri čemu Inhibitor PCSK9 je humano antitelo koje specifično inhibira PCSK9. Kao što se ovde koristi, izrazi „Lp(a)“ ili „lipoprotein(a)“ se odnose na čestice koje liče na lipoprotein male gustine koje formira apolitipoprotein(a) apo(a))) sa apolitipoproteinom B100 (apo B100).

[0012] Kao što je ovde opisano, „povišeni serum Lp(a)“ znači nivo Lp(a) seruma veći od oko 14 mg/dl. Za pacijenta se može smatrati da prikazuje povišeni serum Lp(a) ako je nivo Lp(a) u serumu izmeren kod pacijenta veći od 15 mg/dL, 20 mg/dL, 25 mg/dL, 30 mg/dL, 35 mg/dl, 40 mg/dL, 45 mg/dL, 50 mg/dL, 60 mg/dl, 70 mg/dl, 80 mg/dL, 90 mg/dL, 100 mg/dL, 120 mg/dl, 140 mg/dl, 160 mg/dl, 180 mg/dl, ili 200 mg/dl. Nivo Lp(a) u serumu se može meriti kod pacijenta nakon obroka. U nekim realizacijama, nivo Lp(a) se meri posle perioda posta (npr. posle posta 6 sati, 8 sati, 10 sati, 12 sati ili više). Primer metode za merenje nivoa Lp(a) u serumu kod pacijenta je po brzini imuno-nefelometrija, mada se bilo koji klinički prihvatljiv metod može koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska.

Populacija pacijenata

[0013] Ovde opisane metode su korisne za smanjenje nivoa Lp(a) u serumu kod ljudi koji pokazuju povišen nivo serumskog Lp(a).U nekim slučajevima pacijent je inače zdrav, osim kada se izlaže povišeni serum Lp(a).Na primer, pacijent ne sme da pokaže nikakav drugi faktor rizika od kardiovaskularnih, trombotičnih ili drugih bolesti ili poremećaja u vreme lečenja. U drugim slučajevima, međutim, pacijent se bira na osnovu dijagnoze ili rizika razvoja bolesti ili poremećaja koji je izazvan ili povezan sa povišenim Lp(a) u serumu.Na primer, za vreme ili pre administracije farmaceutskog sastava predmetnog pronalaska, pacijent može biti dijagnostikovan ili identifikovan da je pod rizikom od razvoja kardiovaskularnih bolesti ili poremećaja, kao što su, na primer, bolesti koronarnih arterija, akutni infarkt miokarda, asimptomatska karotidna ateroskleroza, moždani udar, okluzivna bolest perifernih arterija itd Kardiovaskularna bolest ili poremećaj, u nekim slučajevima, je hiperholesterolemija. Na primer, pacijent može biti izabran za lečenje ako je dijagnostikovan ili identifikovan da je pod rizikom od razvoja hiperholesterolemije kao što je, na primer, heterozigotna porodična hiperholesterolemija (heFH), homozigotna porodična hiperholesterolemija (hoFH), kao i incidencije hiperholesterolemije koje se razlikuju od porodične hiperholesterolemije (nonFH).

[0014] U drugim slučajevima, u vreme ili pre administracije farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, pacijent može da bude dijagnostikovan ili identifikovan da je pod rizikom od razvoja trombotične okluzivne bolesti ili poremećaja, kao što su, na primer, plućna embolija, centralna okluzija retinalne vene itd. U pdređenim realizacijama, pacijent se bira na osnovu dijagnoze da je oboleo ili je pod rizikom od razvoja kombinacije dve ili više prethodno navedenih bolesti ili poremećaja. Na primer, u trenutku ili pre administracije farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, pacijent može da bude dijagnostikovan ili identifikovan da je pod rizikom od razvoja bolesti koronarne arterije i plućne embolije. Druge dijagnostičke kombinacije (npr. ateroskleroza i centralna okluzija retinalne vene, heFH i moždani udar itd.) takođe su uključene u definiciju populacije pacijenta koje se mogu lečiti.

[0015] U drugim slučajevima, pacijent koji treba da bude tretiran se bira na osnovu jednog ili više faktora izabranih iz grupe koji se sastoje od starosti (npr. stariji od 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ili 80 godina), rasa, pol (muški ili ženski), navike vežbanja (npr. redovna vežba, nevežbač), druga već postojeća medicinska stanja (npr. dijabetes tipa II, visok krvni pritisak itd.), i trenutni status lekova (npr. trenutno uzimanje statina (npr. cerivastatin, atorvastatin, simvastatin, pitavastatin, rosuvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, itd.], beta blokatori, niacin, itd.) Prdmetni pronalazak takođe uključuje i farmaceutske kompozicije koje se koriste u metodama za smanjenje nivoa Lp(a) u serumu kod pacijenata koji su netolerantni, ne reaguju na konvencionalnu terapiju statinima. Potencijalni pacijenti mogu da budu izabrani izaberu/provereni na osnovu jednog ili više ovih faktora (npr. po upitniku, dijagnostičkoj proceni itd.) pre nego što budu tretirani.

Inhibitor PCSK9

[0016] kao što se ovde koristi, „Inhibitor PCSK9 “ je bilo koji agens koji se vezuje za ili interaguje sa ljudskim PCSK9 i inhibira normalnu biološku funkciju PCSK9 in vitro ili in vivo. Neograničavajući primeri kategorija inhibitora PCSK9 uključuju male molekule PCSK9 antagonista, PCSK9 antagoniste zasnovane na peptidu (npr. molekuli peptitela/peptibodi), i antitela ili antigen-vezujuće fragmente antitela koji specifično vezuju ljudska PCSK9.

[0017] Termin „humana proprotein konvertaza suptilizin/keksin tip 9“ ili „humana PCSK9“ ili „hPCSK9“, kao što se ovde koristi, odnosi se na PCSK9 koji ima sekvencu nukleinske kiseline prikazanu u SEQ ID no:754 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO NE:755, ili njegov biološki aktivan fragment.

[0018] Termin „antitelo“, kao što se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi na imunoglobulinske molekule koji se sastoje od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, kao i njihovi multimeri (npr. IgM). Svaki težak lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (skraćeno ovde kao HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (skraćeno ovde kao LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca obuhvata jedan domen (CL1). Regioni VHi VLmogu da budu dodatno podeljeni u oblasti hipervarijabilnosti, nazvani hipervarijabilne sekvence (hipervarijabilni regioni koji određuju komplementarnost (CDR), koji sadrže regione koji su više konzervirani, takozvane okvirne regione (FR). Svaki VHi VLse sastoji od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U različitim realizacijama pronalaska, FRS anti-PCSK9 antitela (ili antigen-vezujućeg dela) mogu biti identični ljudskim germinitvnim sekvencama, ili mogu biti prirodno ili veštački modifikovani. Konsenzus aminokiselinska sekvenca može se definisati analizom paralelnog ispitivanja dva ili više CDR.

[0019] Termin „antitelo“, kao što se ovde koristi, takođe uključuje antigen-vezujuće fragmente molekula celih antitela. Termini „ antigen vezujući deo“ ili „antigen-vezujući fragment“ antitela, kao što se ovde koristi, uključuju bilo koji prirodni, enzimatski dostupni, sintetički ili genetski modifikovani polipeptid ili glikoprotein koji specifično vezuje antigen za formiranje kompleksa. Fragmenti antitela koji vezuju antitela mogu se izvesti, npr. iz molekula celog antitela koristeći bilo koje odgovarajuće standardne tehnike kao što su proteolitička digestija ili rekombinantne tehnike genetskog inženjeringa koje uključuju manipulaciju i ekspresiju DNK kordirajućeg antitela varijabilne i po izboru konstantne domene. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, npr. komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uključujući, npr. biblioteke faga-antitela), ili se mogu sintetisati. DNK se može sekvencirati i modifikovati hemijskim putem ili korišćenjem tehnika molekularne biologije, na primer, da bi se jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena rasporedili u odgovarajuću konfiguraciju, ili da bi se uveli kodoni, stvorili cisteinski ostaci, modifikovalr, dodalr ili izbrisalr aminokiseline, itd.

[0020] Neograničavajući primeri antigen-vezujućih fragmenata uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2 fragmente; ((iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente, (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) fragmente dAb; i (vii) jedinice za minimalno prepoznavanje aminokiselinskih ostatka koje oponašaju hipervarijabilni region antitel (npr. Izolovan hipervarijabilni region (CDR) kao što je CDR3 peptid) ili ograničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi biotehnološki proizvedeni molekuli, kao što su domen – specifična antitela, antitela sa jednim domenom, antitela sa izbrisanim domenom, himerna antitela, CDR-graftovana antitela, dijatela, trijatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni ajkula takođe su obuhvaćeni izrazom "antigen-vezujući fragment ", kako se ovde koristi.

[0021] Antigen-vezujući fragment antitela obično obuhvata najmanje jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili aminokiseline i obično obuhvata najmanje jedan CDR koji je susedan ili u okviru sa jednom ili više sekvenci okvira. U antigen-vezujućim fragmentima koji imaju VHdomen povezan sa VLdomenom, VHi VLdomeni mogu biti smešteni jedni u odnosu na druge u bilo kom odgovarajućem rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimeran i da sadrži VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, antigen-vezujući fragment antitela može da sadrži monomerni VHili VLdomen.

[0022] U određenim realizacijama, antigen-vezujući fragment antitela može da sadrži najmanje jedan varijabilni domen kovalentno povezan sa najmanje jednim konstantnim domenom. Neograničavajući primeri konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koje se mogu naći u antigen-vezujućem fragmentu antitela predmetnog pronalaska uključuju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL.. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od gore navedenih konfiguracija datih kao primer, varijabilni i konstantni domeni mogu biti direktno povezani jedni sa drugima ili mogu biti povezani punim ili parcijalnim pregibnim ili linker regionom. Pregibni region može da se sastoji od najmanje 2 (npr.5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina koje rezultiraju fleksibilnom ili polufleksibilnom vezom između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom polipeptidnom molekulu. Štaviše, antigen-vezujući fragment antitela predmetnog pronalaska može da sadrži homodimer ili heterodimer (ili neki drugi multimer) bilo koje od varijabilnih i konstantnih domena gore navedenih konfiguracija u nekovalentnom povezivanju jedni sa drugima i/ili sa jednim ili više monomernim VHili VLdomenom (npr. sulfidnom vezom (disulfidnim vezama)).

[0023] Kao i sa molekulima antitela, antigen-vezujući fragmenti mogu da budu monospecifični ili multispecifični (npr. bispecifični). Multispecifični antigen-vezujući fragment antitela obično se sastoji od najmanje dva različita varijabilna domena, gde je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično veže za poseban antigen ili za drugačiji epitop na istom antigenu. Bilo koji multispecifični format antitea, uključujući primere formata bispecifičnih antitela navedenih u ovom tekstu, može se prilagoditi za upotrebu u kontekstu antigen-vezujućeg fragmenta antitela predmetnog pronalaska, koristeći rutinske tehnike dostupne u tehnici.

[0024] Konstantan region antitela je važan u sposobnosti antitela da popravi komplementarnu i posredujećelijski zavisnu citotoksičnost. Stoga se izotip antitela može da bude izabran na osnovu toga da li je poželjno da antitelo posreduje citotoksičnost.

[0025] termin „humano antitelo“, kao što se ovde koristi, ima za cilj da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci germinativih ćelija imunoglobulina čoveka. Humana antitela izuma mogu bez obzira na to da uključuju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani germintivnim imunoglobulinskim sekvencama čoveka (npr. mutacije koje su uvedene nasumičnom ili specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskim mutacijama u vivo), na primer u CDR, a posebno CDR3. Međutim, termin „humano antitelo“, kao što se ovde koristi, nije namenjen da uključi antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germitivnih ćelija druge vrste sisara, kao što je miš, nakalemljene na okvirne sekvence čoveka.

[0026] Termin „rekombinantno humano antitelo“, kao što se ovde koristi, ima za cilj da obuhvati sva antitela čoveka koja su pripremljena,eksprimovana, stvorena ili izolovana rekombinantnim alatima, kao što su antitela eksprimovana rekombinantnom ekspresijom vektora transfekotvana u matičnu ćeliju (opisanu dalje ispod), antitela izolovana iz životinja (npr. miša) koji je transgeni za gene imunoglobulina čoveka (npr. (1992) Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ili antitela pripremljena, eksprimovana, stvorena ili izolovana bilo kojim drugim načinima koji uključuju splajsovanje ljudskih imunoglobulinskih genskih sekvenci na druge DNK sekvence. Takva rekombinantna antitela čoveka imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci imunoglobulina čoveka. U određenim realizacijama, međutim, takva rekombinantna ljudska antitela su podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinjski transgeni za ljudske Ig sekvence, u vivo somatskoj mutagenezi) i tako aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako su izvedene iz i povezane sa geminativnim ćelijama čoveka, VHi VLsekvencama, koje ne postoje prirodno u repertoaru humanog antitela in vivo.

[0027] Humana antitela mogu da postoje u dva obila koja su povezane sa heterogenošću pregiba. U jednom obliku, molekul imunoglobulina se sastoji od stabilna četiri lančana konstrukta od približno 150-160 kDa u kojima se dimeri drže zajedno međulančanom disulfidnom vezom teškog lanca. U drugom obliku, dimeri nisu povezani putem međulančanih disulfidnih veza, a molekul od oko 75-80 kDa se formira iz kovalentno kuplovnaog lakog i teškog lanca (polu-antitela). Ove oblike je bilo izuzetno teško razdvojiti, čak i posle afinitetnog prečišćavanja.

[0028] Učestalost pojavljivanja drugog oblika u različitim intaktnim IgG izotipovima je posledica, ali nije ograničena na, strukturnih razlika povezanih sa izotipom pregibnog regiona antitela. Supstitucija jedne aminokiseline pregibnom regionu ljudskog IgG4 regiona može značajno da smanji izgled drugog oblika (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) do nivoa koji se obično posmatra pomoću ljudskog IgG1 pregibnog regiona. Predmetni pronalazak obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u pregibnom CH2 ili CH3 regionu koje mogu biti poželjne, na primer, u proizvodnji, da bi se poboljšao prinos željenog oblika antitela.

[0029] „Izolovano antitelo“, kao što se ovde koristi, znači antitelo koje je identifikovano i odvojeno i/ili regenerisano iz najmanje jedne komponente svog prirodnog okruženja. Na primer, antitelo koje je odvojeno ili uklonjeno iz najmanje jedne komponente organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kojoj antitelo prirodno postoji ili se prirodno proizvodi, je „izolovano antitelo“ za potrebe predmetnog pronalaska. Izolovano antitelo takođe uključuje antitelo u situ unutar rekombinantne ćelije. Izolovana antitela su antitela koja su bila izložena bar jednom koraku prečišćavanja ili izolovanja. Prema određenim realizacijama, izolovano antitelo može biti u znatnoj meri bez drugih ćelijskih materijala i/ili hemikalija.

[0030] Termin „specifično (se) vezuje“, znači da antitelo ili antigen-vezujući fragment tog dela formira kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan pod fiziološkim uslovima. Metode za određivanje da li se antitelo posebno vezuje za antigen su dobro poznate u tehnici i uključuju, na primer, ekvilibrijum dijalizu i površinsku plazmonsku rezonancu. Na primer, antitelo koje se „specifično vezuje“ PCSK970, kao što se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, uključuje antitela koja vezuju PCSK9, kako se koristi u kontekstu ovog pronalaska, uključuje antitela koja vezuju PCSK9 ili njegov deo sa KDmanjom od oko 1000 nM, manjom od oko 500 nM, manjom od oko 300 nM, manjom od oko 200 nM, manjom od oko 100 nM, manjom od oko 90 nM, manjom od oko 80 nM, manjom od oko 70 nM, manjom od oko 60 nM, manjom od oko 50 nM, manjom od oko 40 nM, manjom od oko 30 nM, manjom od oko 20 nM, manjom od oko 10 nM, manjom od oko 5 nM, manjom od oko 4 nM, manjom od oko 3 nM, manjom od oko 2 nM, manjom od oko 1 nM ili manjom od oko 0,5 nM, mereno u testu površinske plazmonske rezonance. Izolovano antitelo koje specifično vezuje humani PCSK9, međutim, ima unakrsnu reaktivnost na druge antigene, kao što su PCSK9 molekuli drugih (ne humanih) vrsta.

[0031] Anti-PCSK9 antitela mogu da sadrže jednu ili više aminokiselina supstitucija, insercija i/ili delecija u okvirnim i/ili CDR regionima teških i lakih lanca varijabilnih domena u poređenju sa odgovarajućiim sekvencama germinativnih ćelija iz kojih su antitela izvedena. Takve mutacije se mogu lako utvrditi poređenjem aminokiselina koje su ovde otkrivene sa sekvencamagerminativnih ćelija dostupnim iz, na primer, javnih baza podataka sekvenci antitela. Predmetni pronalazak uključuje antitela, kao i fragmente koji vežu antigene, koji su izvedeni iz bilo koje aminokiseline sekvence koje su ovde otkrivene, gde jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više okvirnih i/ili CDR regiona mutiraju do korespondirajućih ostataka geminativne sekvence iz koje je antitelo izvedeno, ili do odgovarajućih ostataka drugih sekvenci germinativnih ćelija čoveka, ili kod konzervativne aminokiseline supstitucije korespondirajućih germinativnih ostataka (takve promene sekvenci se ovde nazivaju kolektivno kao „germinativne mutacije“). Prosečan stručnjak u tehnici, počevši od ovde otkrivenih teških i lakih sekvenci varijabilnih regiona, može lako da proizvede brojna antitela i fragmente koji sadrže jednu ili više pojedinačnih mutacija germinativnih ćelija ili njihovih kombinacija. U određenim realizacijama, svi okvirni i/ili CDR ostaci unutar VHi/ili VLdomena mutiraju nazad do ostataka nađenih u originalnoj geminativnoj sekvenci iz koje je antitelo izvedeno. U drugim realizacijama, samo određeni ostaci mutiraju nazad do izvorne germinativne sekvence, npr. samo mutirani ostaci pronađeni u prvih 8 aminokiselina u FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina u FR4, ili samo mutirani ostaci pronađeni u CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim realizacijama, jedan ili više okvirnih i/ili CDR ostataka su mutirani u odgovarajuće ostatke različite germinativne sekvence (tj. klirinske sekvence koja se razlikuje od germinativnesekvence iz koje je antitelo izvorno izvedeno). Pored toga, antitela predmetnog pronalaska mogu da sadrže bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar okvirnog i/ili CDR regiona, npr., gde se određeni pojedinačni ostaci mutiraju do odgovarajućeg ostatka određene germinativne sekvence, dok se neki drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence zadržavaju ili mutiraju na odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijena, antitela i fragmenti koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija mogu da se lako testiraju na jedno ili više željenih svojstava kao što su poboljšana specifičnost vezivanja, poboljšano vezivanje afiniteta, poboljšana antagonistička ili agonistička biološka svojstva (kao u ovom slučaju), smanjena imunogenost, itd Upotreba antitela i antigen-vezujućih fragmenata dobijenih na ovaj opšti način obuhvaćeni su sadašnjim pronalaskom.

[0032] Predmetni pronalazak takođe uključuje farmaceutske kompozicije koje se sastoje od anti- PCSK9 antitela koja se sastoje od varijanti bilo koje od ovde otkrivenih HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci sa jednom ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, predmetni pronalazak uključuje upotrebu anti-PCSK9 antitela koja imaju HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr.10 ili manje, 8 ili manje, PCSK96 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih supstitucija aminokiselina u odnosu na bilo koju od aminokiselinskih sekvenci HCVR, LCVR i/ili CDR koje su ovde opisane.

[0033] Termin „površinska plazmondks rezonanca“, kao što se ovde koristi, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu interakcija u realnom vremenu detekcijom promena u koncentracijama proteina u biosenzorskoj matrici, na primer korišćenjem BIAcore<™>sistema (Biacore Life Sciences divizija kompanije GE Healthcare, Piscatway, NJ).

[0034] Termin "KD", kao što se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi naravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen.

[0035] Pojam "epitop" se odnosi na antigenu determinantu koja interaguje sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnom regionu antitela molekula poznatom kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Stoga, različita antitela mogu da se vežu za različite oblasti antigena i mogu da imaju različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop se formira prostorno na suprot aminokiselinama iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji nastaje od susednih aminokiselinskih ostataka u polipeptidnom lancu. U određenim okolnostima, epitop može da uključi ostatke saharida, fosforil grupe ili sulfonilnih grupe na antigenu.

Priprema humanih antitela

[0036] Metode za generisanje humanih antitela kod transgenih miševa su poznate u tehnici Bilo koja od ovih poznatih metoda može se koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska da bi se napravila humana antitela koja se posebno vezuju za PCSK9 čoveka.

[0037] Korišćenjem tehnologije VELOCIMMUNE<™>(videti, na primer, US 6.596.541, Regeneron Farmaceuticals) ili bilo koje druge poznate metode za generisanje monoklonskih antitela, prvobitno su izolovana himerna antitela visokog afiniteta za PCSK9 sa humanim varijabilnim regionom i mišjim konstantnim regionom. VELOCIMMUNE<™>tehnologija uključuje generaciju transgenog miša koji ima genom koji se sastoji od teških i lakih varijabilnih regiona čoveka koji su operativno povezani sa endogenim konstantnim regionom miša, tako da miš proizvodi antitelo koje se sastoji od humanog varijabilnog regiona i mišjeg konstantnog regiona kao odgovor na antigenu stimulaciju. DNK koja kodira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela je izolovana i operativno povezana sa DNK koja kodira konstantne regione humanog teškog i lakog lanca. DNK se zatim eksprimira u ćeliji koja je sposobna da eksprimira potpuno humano antitelo.

[0038] Generalno, VELOCIMMUNE<™>miš je izazvan antigenom od interesa, a limfne ćelije (kao što su B-ćelije) su regenrisane iz miševa koji eksprimiraju antitela. Limfne ćelije mogu biti spojene sa ćelijskom linijom mieloma za pripremu besmrtnih hibridoma ćelijskih vrednost, a takve hibridoma ćelijske linije se proveravaju i odabiru da identifikuju hibridome koje proizvode antitela specifična za antigen pd interesa. DNK koja kodira varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca može biti izolovana i povezana sa poželjnim izotipskim konstantnim regionima teškog lanca i lakog lanca. Takav protein antitela se može proizvesti u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK kodiranje antigen-specifičnih himernih antitela ili varijabilnih domena lakih i teških lanaca može biti izolovano direktno od antigen-specifičnih limfocita.

[0039] U početku, himerna antitela visokog afiniteta su izolovana, imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Antitela se karakterišu i biraju po poželjnim karakteristikama, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd., koristećii standardne procedure poznate posečnom stručnjaku u tehnici. Mišji konstantni regioni su zamenjeni željenim lonstantnim regionom čoveka kako bi se generisalo potpuno humano antitelo predmetnog pronalaska, na primer IgG1 ili IgG4 divlje vrste ili modifikovan. Iako izabran konstantan region može da se varira u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike antigen vezivanja visokog afiniteta i ciljne specifičnosti se nalaze u varijabilnom regionu.

[0040] Generalno, antitela koja se mogu koristiti u predmetnogm pronalasku poseduju visoke afinitete, kao što je gore opisano, kada se mere vezivanjem za antigen ili imobilizacijom u čvrstoj fazi ili u fazi rastvora. Mišji konstantni regioni su zamenjeni željenim konstantnim regionima čoveka kako bi se dobila potpuno humana antitela pronalaska . Iako izabran konstantni region može da se razlikuje u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike antigen vezivanja visokog afiniteta i ciljne specifičnosti se nalaze u varijabilnom regionu.

[0041] Specifični primeri humanih antitela ili antigen-vezujućih fragmenata antitela koji se specifično vezuju PCSK9 koji se mogu koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska uključuju bilo koji antitelo ili antigen-vezujući fragment koji se sastoji od tri teška lanca CDRs (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) koji se nalaze u varijabilnom regionu teškog lanca (HCVR) sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe SEQ ID NOs: 2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 402, 406, 410, 426, 430, 434, 450, 454, 458, 474, 478, 482, 498, 502, 506, 522, 526, 530, 546, 550, 554, 570, 574, 578, 594, 598, 602, 618, 622, 626, 642, 646, 650, 666, 670, 674, 690, 694, 698, 714, 718, 722, 738 i 742, ili njima značajno sličan koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence. Fragment antitela ili antigen-vezujući fragment može da obuhvata tri laka lanca CDR (LCVR1, LCVR2, LCVR3) koji se nalaze u varijabilnom regionu lakog lanca (LCVR) sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380, 384, 394, 404, 408, 418, 428, 432, 442, 452, 456, 466, 476, 480, 490, 500, 504, 514, 524, 528, 538, 548, 552, 562, 572, 576, 586, 596, 600, 610, 620, 624, 634, 644, 648, 658, 668, 672, 682, 692, 696, 706, 716, 720, 730, 740 and 744, ili njima značajno sličan niz koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence.

[0042] U određenim realizacijama ovog pronalaska, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži šest CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3) iz parova aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca (HCVR/LCVR) izabrani iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500, 502/504, 506/514, 522/524, 526/528, 530/538, 546/548, 550/552, 554/562, 570/572, 574/576, 578/586, 594/596, 598/600, 602/610, 618/620, 622/624, 626/634, 642/644, 646/648, 650/658, 666/668, 670/672, 674/682, 690/692, 694/696, 698/706, 714/716, 718/720, 722/730, 738/740 i 742/744.

[0043] U određenim realizacijama ovog pronalaska, anti-PCSK9 antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, koji se može koristiti u ovom pronalasku ima aminokiselinske sekvence HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 odabrane od SEQ ID NOs: 76/78/80/84/86/88 (mAb316P) and 220/222/224/228/230/232 (mAb300N) (vidi patentnu prijavu SAD. Publ. br.

2010/0166768).

[0044] U određenim realizacijama ovog pronalaska, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži parove sekvence amino kiselina HCVR/LCVR izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500, 502/504, 506/514, 522/524, 526/528, 530/538, 546/548, 550/552, 554/562, 570/572, 574/576, 578/586, 594/596, 598/600, 602/610, 618/620, 622/624, 626/634, 642/644, 646/648, 650/658, 666/668, 670/672, 674/682, 690/692, 694/696, 698/706, 714/716, 718/720, 722/730, 738/740 i 742/744.

Farmaceutske kompozicije i metode administracije

[0045] Farmaceutske kompozicije za upotrebu prema pronalasku su formulisane sa pogodnim nosačima, ekscipijentima i drugim agensima koji obezbeđuju, na primer, odgovarajući transfer, isporuku ili toleranciju. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može se naći u formularu poznatom svim farmaceutskim hemičarima: : Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.Ove formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, žele, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je LIPOFECTIN™), DNK konjugate, anhidrovane paste za apsorpciju, emulzije ulje-u-vodi i voda -u -ulju, carbowax emulzije (polietilen glikoli različitih molekulskih težina), polučvrste gelove i polučvrste smeše koje carbowax. Vidi takođe. Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0046] Poznati su različiti sistemi za isporuku i mogu se koristiti za administriranje / davanje farmaceutske kompozicije pronalaska, npr., inkapsulacija u lipozome, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da eksprimiraju mutantne viruse, endocitoza posredovana receptorom (videti, npr. Wu et al., 1987, J. Biol. Chem.262:4429-4432). Metode administriranja uključuju, ali nisu ograničene na, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenozne, potkožne, intranazalne, epiduralne i oralne načine. Kompozicija se može administrirati bilo kojim pogodnim načinom, na primer infuzijom ili bolus injekcijom, apsorpcijom putem epitelnih ili mukotalnih sluzokoža (npr. oralne sluzokože, rektalne i intestinalne sluzokože itd.) i može se adinistrirati zajedno sa drugim biološki aktivnim agentima.

[0047] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska se može distribuirati subkutano ili intravenozno sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, u pogledu subkutane isporuke, uređaj za isporuku poznat kao pen (olovka) direktno ima primenu u isporuci farmaceutske kompozicije ovog pronalaska. Takav uređaj za isporuku poznat kao pen (olovka) može biti za višekratnu ili jednokratnu upotrebu. Uređaj za isporuku poznat kao pen (olovka) za višekratnu upotrebu generalno koristi zamenljivi kertridž koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Kada se administrira celokupna farmaceutska kompozicija iz kertridža i kertridž se isprazani, prazan kertridž se može lako odbaciti i zameniti novim kertridžom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Uređaj za isporuku poznat kao pen (olovka) se tada može ponovo koristiti. U uređaju za isporuku koji je poznat kao pen (olovka) za jednokratnu upotrebu ne postoji zamenljivi kertridž. Umesto toga, uređaj za isporuku poznat kao pen (olovka) za jednokratnu upotrebu dolazi unapred napunjen farmaceutskom kompozicijom koja se nalazi u rezervoaru unutar uređaja. Kada se rezervoar isprazni od farmaceutske kompozicije, ceo uređaj se baca.

[0048] Brojni uređaji za isporuku poznati kao pen (olovka) i autoinjektori za višekratnu upotrebu imaju primenu u subkutanoj adminisstraciji farmaceutske kompozicije ovog pronalaska. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na AUTOPEN<™>(Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC<™>pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25<™>pen, HUMALOG<™>pen, HUMALIN 70/30<™>pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN<™>I, II and III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR<™>(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD<™>pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN<™>, OPTIPEN PRO<™>, OPTIPEN STARLET<™>, i OPTICLIK<™>(sanofi-aventis, Frankfurt, Germany), da navedemo samo neke. Primeri uređaja za isporuku poznati kao pen (olovka) za jednokratnu upotrebu koji imaju primenu u subkutanoj isporuci farmaceutske kompozicije ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na SOLOSTAR<™>pen (sanofi-aventis), the FLEXPEN<™>(Novo Nordisk), and the KWIKPEN<™>(Eli Lilly), the SURECLICK<™>Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), t PENLET<™>(Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), i HUMIRA<™>Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), da navedemo samo nekoliko.

[0049] U određenim realizacijama, farmaceutska kompozicija može da bude isporučena u kontrolisanom sistemu oslobađanja. U jednoj realizaciji, pumpa može da se koristi (pogledajte Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). U drugoj realizaciji, mogu da se upotrebe polimerni materijali; videti, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida U narednoj realizaciji, kontrolisani sistem otpuštanja može da se postavi u blizini cilja kompozicije, što zahteva samo deo sistemske doze (videti, npr Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Drugi kontrolisani sistemi za oslobađanje su razmatrani u odnosu na Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[0050] Preparati za injekcije mogu uključivati dozne oblike za intravenske, subkutane, intrakutane i intramuskularne injekcije, infuzije kap po kap, itd. Ovi preparati za injekcije se mogu pripremiti poznatim metodama. Na primer, preparati za injekcije se mogu pripremiti, npr., rastvaranjem, suspendovanjem ili emulgovanjem antitela ili njegove soli opisane gore u sterilnom vodenom medijumu ili uljnom medijumu koji se uobičajeno koristi za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, postoje, na primer, fiziološki rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druge pomoćne agense, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim sredstvom za rastvaranje kao što je alkohol (npr. etanol), polialkohol (npr. propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr. polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljni medijum koriste se npr. , susamovo ulje, sojino ulje, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa agensom za rastvaranje kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Ovako pripremljena injekcija se poželjno puni u odgovarajuću ampulu.

[0051] Pogodno, farmaceutske kompozicije za oralnu ili parenteralnu upotrebu koje su prethodno opisane pripremljene su u obliku doze u jediničnoj dozi koja odgovara dozi aktivnih sastojaka. Takvi oblici doze u jediničnoj dozi uključuju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd

Doza

[0052] Količina inhibitora PCSK9 (npr. anti-PCSK9 antitela) koja se administrira subjektu je, generalno, terapeutski efikasna količina. Kao što se ovde koristi, fraza "terapeutski efikasna količina" znači dozu inhibitora PCSK9 koja rezultuje smanjenjem količine seruma Lp(a) koja se može detektovati.Na primer, „terapeutski efikasna količina“ inhibitora uključuje, npr. količinu inhibitora PCSK9 koji uzrokuje smanjenje od najmanje 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ili više nivoa Lp(a) kada se administrira kod humanog pacijenta, npr., kao što je prikazano na primeru 2, ovde. Alternativno, životinjski modeli se mogu koristiti da utvrde da li određena količina inhibitora kandidata PCSK9 je terapeutski efikasna količina.

[0053] U slučaju antitela, terapeutski efikasna količina može biti od oko 0,05 mg do oko 600 mg, na primer, oko 0,05 mg, oko 0,1 mg, oko 1,0 mg, oko 1,5 mg, oko 2,0 mg, oko 10 mg, oko 20 mg, oko 30 mg, oko 40 mg, oko 50 mg, oko 60 mg, oko 70 mg, oko 80 mg, oko 90 mg, oko 100 mg, oko 110 mg, oko 120 mg, oko 130 mg, oko 140 mg, oko 150 mg, oko 160 mg, oko 170 mg, oko 180 mg, oko 190 mg, oko 200 mg, oko 210 mg, oko 220 mg, oko 230 mg, oko 240 mg, oko 250 mg, oko 260 mg, oko 270 mg, oko 280 mg, oko 290 mg, oko 300 mg, oko 310 mg, oko 320 mg, oko 330 mg, oko 340 mg, oko 350 mg, oko 360 mg, oko 370 mg, oko 380 mg, oko 390 mg, oko 400 mg, oko 410 mg, oko 420 mg, oko 430 mg, oko 440 mg, oko 450 mg, oko 460 mg, oko 470 mg, oko 480 mg, oko 490 mg, oko 500 mg, oko 510 mg, oko 520 mg, oko 530 mg, oko 540 mg, oko 550 mg, oko 560 mg oko 570 mg, oko 580 mg, oko 590 mg ili oko 600 mg anti- PCSK antitela

[0054] Količina PCSK9 antitela koja se nalazi u pojedinačnim dozama može se izraziti u smislu miligrama antitela po kilogramu telesne težine pacijenta (tj. mg/kg). Na primer, antitelo na PCSK9 može da se administrirati pacijentu u dozi od oko 0,0001 do oko 10 mg/kg telesne težine pacijenta.

Kombinovane terapije

[0055] Prema izvesnim realizacijama, farmaceutska kompozicija pronalaska može se koristiti u metodi koja obuhvata administriranje farmaceutske kompozicije anti-PCSK9 antitela antitela pacijentu koji je na terapeutskom režimu za lečenje hiperholesterolemije u vreme, ili neposredno pre administracije farmaceutske kompozicije pronalaska. Na primer, pacijent kome je ranije dijagnostikovana hiperholesterolemija je možda prepisan i uzima stabilan terapijski režim drugog leka pre i/ili istovremeno sa administriranjem farmaceutske kompozicije koja se sastoji od anti-PCSK9 antitela. Prethodni ili aktuelnii terapeutski režim može da obuhvata, npr. (1) agens koji indukuje ćelijsko iskorišćenje (depleciju) sinteze holesterola inhibicijom 3-hidroksi-3-metilglutaril (HMG)-koenzima A (CoA) reduktaze, kao što je statin (npr. cerivastatin, atorvastatin, simvastatin, pitavastatin, rosuvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin itd.); (2) agens koji inhibira resorpciju holesterola ili reapsorpciju žučne kiseline; (3) agens koji povećava katabolizam lipoproteina (kao što je niacin); i/ili (4) aktivatore faktora LXR transkripcije koji igraju ulogu u eliminaciji holesterola kao što je 22-hidroksiholesterol. U određenim realizacijama, pacijent, pre ili u skladu sa administriranjem anti-PCSK9 antitela je u fiksnoj kombinaciji terapijskih agenasa kao što su ezetimib plus simvastatin; statin sa žučnim smolama (npr. holestiramin, kolestipol, kolesevelam); niacin plus statin (npr. niacetin sa lovastatinom), ili drugim agensima za snjiženje nivoa hloseterola kao što suetil estri 3-omega masne kiseline (na primer, omakor).

Režimi administracije

[0056] Prema određenim realizacijama ovog pronalaska, višestruke doze inhibitora PCSK9 se mogu administrirati subjektu tokom definisanog vremenskog perioda. Metode prema ovom aspektu pronalaska obuhvataju sekvencijalnu administraciju subjektu višestrukih doza inhibitora PCSK9. Kako se ovde koristi, "sekvencijalna administracija " znači da se svaka doza inhibitora PCSK9 administrira subjektu u različitom vremenskom momentu, npr., u različite dane u razmaku u unapred određenom intervalu (npr. satima, danima, nedeljama ili mesecima). Ovaj pronalazak obuhvata farmaceutske kompozicije kao što je definisano u zahtevima za upotrebu u metodama koje se sastoje od uzastopne administracije pacijentu jedne početne doze inhibitora PCSK9, praćene jednom ili više sekundarnih doza inhibitora PCSK9, i opciono praćene jednom ili više tercijarnih doza inhibitora PCSK9.

[0057] Termini „početna doza“, „sekundarne doze“ i „tercijarne doze“, odnose se na vremensku sekvencu administracije inhibitora PCSK9. Stoga, „početna doza“ je doza koja se administrira na početku režima lečenja (takođe se naziva i „osnovna doza“); „sekundarne doze“ su doze koje se administriraju posle početne doze; a „tercijarne doze“ su doze koje se administriraju posle sekundarnih doza. Početna, sekundarne i tercijarne doze mogu da sadrže istu količinu Inhibitora PCSK9 a, ali se generalno razlikuju jedna od druge u pogledu učestalosti administriranja. U određenim realizacijama, međutim, količina inhibitora PCSK9 sadržana u početnim, sekundarnim i/ili tercijarnim dozama će se razlikovati jedna od druge (npr. korigovane na više ili manje po potrebi) tokom tretmana.

[0058] U jednom primeru realizacije predmetnog pronalaska, svaka sekundarna i/ili tercijarna doza se administrira od 1 do 30 (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili više) dana nakon neposredno prethodne doze. Fraza "neposredna prethodna doza", kako se ovde koristi, označava, u nizu višestrukih administracija, dozu inhibitora PCSK9 koja se daje pacijentu pre administracije sledeće doze u nizu bez interventnih doza..

[0059] Postupci prema ovom aspektu pronalaska mogu da obuhvataju administriranje pacijentu bilo koji broj sekundarnih i/ili tercijalnih doza inhibitora PCSK9. Na primer, u određenim realizacijama, pacijentu se daje samo jedna sekundarna doza. U drugim realizacijama, dve ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) sekundarnih doza se administrira pacijentu. Slično, u određenim realizacijama, pacijentu se administrira samo jedna tercijarna doza. U drugim realizacijama, dve ili više (npr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) tercijarnih doza se daju pacijentu.

[0060] U realizacijama koje uključuju višestruke sekundarne doze, svaka sekundarna doza može da se administrira sa istom učestanošću kao i druge sekundarne doze. Na primer, svaka sekundarna doza može da se administrira pacijentu od 1 do 29 dana neposredno nakon prethodne doze. Slično tome, u realizacijama koje uključuju višestruke tercijarne doze, svaka tercijarna doza može da se administrira na istoj frekvenciji kao i druge tercijarne doze. Na primer, svaka tercijarna doza može da se administrira pacijentu od 1 do 60 dana neposredno nakon prethodne doze. Alternativno, učestalost na kojoj se daju sekundarne i/ili tercijarne doze pacijentu može da se razlikuje u zavisnosti od režima lečenja. Učestalost administriranja takođe može da podesi lekat tokom tretmana od u zavisnosti od potreba pojedinačnog pacijenta nakon kliničkog pregleda.

PRIMERI

[0061] Navedeni su sledeći primeri kako bi prosečnom stručnjaku u oblasti tehnike pružilo potpuno otkrivanje i opis načina na koji se dobijaju i upotrebljavaju kompozicije za upotrebu u skladu sa pronalaskom, i nisu namenjeni da ograniče obim pronalaska. Uloženi su napori da se obezbedi tačnost u odnosu na upotrebljene brojeve (npr. količine, temperaturu, itd.), ali treba uzeti u obzir neke eksperimentalne greške i odstupanja. Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je atmosferni ili blizu atmosfernog.

Primer 1. Dobijanje ljudskih antitela na humani PCSK9

[0062] Humana anti-PCSK9 antitela su generisana kao što je opisano u američkom patentu. Publ.

2010/0166768. Primer Inhibitora PCSK9 koji se koristi u sledećem primeru je humano anti-PCSK9 antitelo označeno mAb316P. mAb316P ima sledeće karakteristike sekvence aminokiselina: varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži SEQ ID NO:90; varijabilni domen lakog lanca (LCVR) koji sadrži SEQ ID NO:92; region 1 (HCDR1) za određivanje komplementarnosti teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:76; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO:78; HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO:80; region 1 (LCDR1) za određivanje komplementarnosti lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:84; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO:86; i LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO:88

Primer 2: Klinička ispitivanja anti-PCSK9 monoklona antitela , kao mono- ili kao dopunska terapija u heterozigotnoj porodičnoj i neporodičnoj hiperholesterolemiji

Uvod

[0063] Ovaj primer opisuje rezultate iz dva klinička ispitivanja u kojima su pojedinačne doze anti-PCSK9 monoklonskog antitela mAb316P administrirane intravenozno (IV) ili subkutano (SC) zdravim dobrovoljcima, i kliničko ispitivanje višestrukih doza mAb316P kod subjekata sa porodičnom hiperholesterolemijom (FH) ili non-FH, primanje stabilnih doza atorvastatins ili jednostavnom intervencijom u prehrani.

Metode

A. Nacrt istraživanja

[0064] Sprovedena su tri klinička ispitivanja korišćenjem mAb316P administriranog ljudima (humanim pacijentima). Dve studije su bile placebo kontrolisane studije pojedinačne doze mAb316P administrirane IV ili SC, respektivno. Treće ispitivanje je bilo faza 1b, dvostruko slepo, randomizovano, placebo kontrolisano, uzlazna procena više doza mAb316P administriranog SC subjektima sa FH ili non-FH. Treće ispitivanje je sprovedeno u dva dela: Deo A i Deo B. U delu A trećeg ispitivanja, svaki subjekt je primio ukupno 3 administracije mAb316P (50 mg, 100 mg ili 150 mg) ili odgovarajući placebo. U delu B trećeg ispitivanja, svaki subjekt je primio 2 administracije ili mAb316P (200 mg) ili odgovarajući placebo. U oba dela ispitivanja sa višestrukim SC dozama, prva doza je administrirana u stacionarnoj jedinici gde su subjekti bili zatvoreni i posmatrani 48 sati nakon doze. Naredne doze su administrirane u ambulantnim uslovima sa najmanje 2 sata posmatranja nakon doziranja.

B. Doza i povećanje doze

[0065] Studija pojedinačne doze IV je obuhvatila 5 uzastopnih kohorta (0,3, 1,0, 3,0, 6,0 ili 12,0 mg/kg mAb316P), a studija pojedinačne SC doze je uključivalo doze 4 uzastopne kohorte (50, 100, 150 i 250 mg od mAb316P). Na osnovu početnih rezultata iz ovih ispitivanja, treće ispitivanje je procenilo doze SC mAb316P od 50 mg, 100 mg, 150 mg ili placebo, koje su administriran dana 1, 29 i 43 u 7 grupa subjekata sa FH ili non-FH (deo A), i 200 mg ili placebo koje su administrirane 1 i 29 osmoj grupi subjekata sa FH ili nFH (deo B). Regimeni doziranja i sastavi grupe pacijenata tri ispitivanja sumarno su dati su u Tabeli 1.

Tabela 1

[0066] U ispitivanju višestruke doze SC, svaki nivo doze je počeo sa označenom grupom od 3 (FH, non-FH ili oba) subjekata, sa najmanje 1, ali ne više od 2, subjekata koji primaju mAb316P. Prijem dodatnih subjekata na datu dozu nastavljen je tek nakon što su prva 3 subjekta bezbedno završili svoje dnevne procene 3 dana posle lečenja. Upis na sledeći viši nivo doze otvoren je nakon što je 10 ispitanika završilo bezbednosne procene 15. dana. Upis, koji je jednom započet na svakom nivou doze, nastavio je nezavisno od odluke o povećanju doze i pregleda bezbednosti 15. dana.

C. Subjekti

[0067] Ispitanici u studiji sa jednom dozom bili su zdravi muškarci i žene (18-65 godina starosti, 50-95 kg telesne težine, indeksa telesne mase [BMI] = 18-30 kg/m<2>) sa serumom LDL-C > 100 mg/dL (2,59 mmol/L). Upotreba svih nestudijskih agenasa za izmenu lipida je zabranjena tokom ovih studija.

[0068] Ispitanici u studiji sa više doza imali su heterozigotnu FH ili non- FH (18-65 godina starosti, BMI=18,01-35,0 kg/ m<2>) i bili su na stabilnoj terapiji atorvastatinom (10 do 40 mg dnevno) sa LDL holesterolom >100 mg/dL (2,59 mmol/L) ili nr- FH i bili su na dijeti samo sa LDL holesterolom >130 mg/dL (3,36 mmol/L) (Tabela 1). Svi subjekti su pregledali i potpisali pristanak o informisanosti koji je prethodno odobrio institucioni odbor za pregled prije bilo kakvih procedura u vezi sa studijom. Subjekti u FH grupi ispunjavali su kriterijume Simona Bruma za definitivnu ili moguću (Simon Broome Register Group (1991), BMJ 303:893-896; Neil et al., (2000), BMJ 321:148), dok subjekti nr- FH nisu. Oni koji su uzimali atorvastatin bili su na stabilnoj dozi, 10 do 40 mg dnevno, najmanje 28 dana pre početne vrednosti, i ostali su na istoj dozi tokom studije. Pacijenti koji pripadaju grupi non-FH a koji su bili na dijeti nisu mogli da primaju terapiju za snižavanje lipida najmanje 28 dana pre početne vrednosti i ostali su bez takvog lečenja tokom studije. Potencijalno kvalifikovani pacijenti koji ne primaju atorvastatin mogli su da uđu u period od 4 nedelje tokom kojeg su prebačeni na dozu atorvastatina (10 do 40 mg dnevno) za koju je verovatno da će održavati LDL holesterol blizu njihovog nivoa pre studije i >100 mg/ dL (2,59 mmol/L). Svi ispitanici su imali trigliceride ≤300 mg/dL i krvni pritisak kontrolisan sa manje od 3 antihipertenzivna leka. Pacijenti sa istorijom cerebrovaskularne, kardiovaskularne ili periferne vaskularne aterosklerotične bolesti, dijabetesa ili poremećaja za koje se zna da izazivaju sekundarno povišenje LDL holesterola su isključeni, kao i oni sa transaminazama jetre (ALT ili AST) >1,2 puta iznad gornje granice normale (x ULN), >2+ proteinurija ili kreatin kinaza (CK) >3 x ULN, osim ako se jasno ne odnosi na vežbu, u kom slučaju je od njih zahtevano ponovljeno testiranje sa CK <3 x GGN.

D. Laboratorijska merenja i metode

[0069] U studiji sa više doza, serum lipid (ukupni-, HDL-, LDL-, non-HDL-, i VLDL holesterol) i apolitipoprotein (Apo) B, A1 i Lp(a), hs-CRP i bezbednosni laboratorijski testovi obavljeni su nakon 12 sati gladovanja preko noći (samo na vodi) na skriningu (dan -21 do -3), dan -2 (za one na atorvastatinu), dan -1, dani 1, 2, 3, 8, 15, 29, 43. , 57, 71, 85, 99, 120 i kraj studije (148. dan). Sva laboratorijska merenja je izvršila centralna laboratorija koja je zadržala sertifikat Deo III od strane CDC programa za standardizaciju lipida i akreditaciju od strane College of American Pathologists. Trigliceridi i holesterol su mereni enzimskim kolorimetrijskim testovima (tests (Olympus AU2700 or AU5400 Analyzer, Olympus, Center Valley, Pennsylvania, USA) sa kalibracijom koja se direktno prati prema CDC referentnim procedurama. Lipoproteini koji sadrže Apo B su staloženi dodatkom dekstran sulfata i HDL holesterol je meren u supernatantu (Warnick et al., (1978), J. Lipid Res. 19:65-76). LDL- i VLDL holesterol su mereni nakon preparativnog ultracentrifugiranja (beta-kvantifikacija). Apo A1, B, Lp(a) i hs-CRP su mereni brzinom imuno-nefelometrije ((Dade Behring BNII nephelometer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, Illinois, USA). Sve vrednosti lipida, apolipoproteina i hs-CRP nisu bile vidljve za istraživače, osoblje u studiji i pacijente nakon -2 dana za grupe koje su lečene atorvastatinom ili dana -1 za grupu samo na ishrani.

E. Statistički plan.

[0070] Efekti mAb316P na lipidne parametre u studijama sa jednom dozom su procenjeni analizom modela kovarijanse (ANCOVA). Metoda najmanjeg kvadrata za razlike između terapijskih grupa i placebo grupe, 95% intervala pouzdanosti, i p-vrednosti za poređenje između grupa pod tretmanom i placeba su dobijene u okviru ANCOVA. Za sve testove značajnost je podešena na 0,05.

[0071] U studiji sa više doza, svi subjekti koji su primali placebo i atorvastatin su objedinjeni u dve placebo grupe bilo subjekti sa FH ili onih non- FH.6 subjekata u placebo grupama koje su FH i non-FH (tretirane atorvastatinom), i 5 i 8 subjekata u svakoj od grupa FH i neFH koje su tretirane odgovarajućim dozama mAb316P pružile su najmanje 80% sjačine za otkrivanje razlike u tretmanu od 30% (SD =15%) u odnosu na placebo u srednjem procentu promene u odnosu na početnu vrednost LDL holesterola pri svakoj poseti studiji kada se uporedi svaka doza sa placebom sa Dvostrani test na nivou značajnosti od 5%. Nisu napravljena nikakva prilagođavanja za višestruka poređenja. Rezultati grupe 7 su sumirani odvojeno prema tretmanu i placebu i dve grupe su upoređene pojedinačno. ANCOVA sa krakom tretmana kao fiksnim efektom i relevantnom osnovnom vrednošću kao kovarijatom korišćena je za analizu kontinuiranih varijabli. Vrednosti koje nedostaju su pripisane metodom Last Observation Carried Forward (LOCF). Sve p-vrednosti, osim triglicerida i Lp(a), koje su izvedene iz analize kovarijaanse zasnovane, izvučene su iz ANCOVA modela.

[0072] Da bi se sumirali efekti lipida i lipoproteina, izabrani su rezultati od 57. dana studije kada su se mogli posmatrati efekti dva uzastopna perioda doziranja od 2 nedelje. Studija nije bila zasnovana na direktnom statističkom poređenju odgovora ispitanika sa FH na subjekte iz grupe non- FH.

Rezultati

A. Ispitivanje populacije

[0073] Ukupno 40 subjekata je nasumično uvršteno u studiji jedne doze IV, a 32 je nasumično uvršteno u studije jednoj doze SC. Za deo A u SC studiji sa više doza, paženo je ukupno 97 ispitanika, i 62 je nasumično (21 FH i 41 non-FH). Ukupno 10 subjekata je uključeno u deo B višedozne SC studije (4 FH i 6 non-FH). Osnovne karakteristike subjekata u studijama sa jednom dozom i deo A u studiji sa više doza prikazane su u tabeli 2A. Osnovne karakteristike subjekata u delu B u studiji sa više doza prikazane su u tabeli 2B.

Tabela 2A

Tabela 2B

B. Odgovor lipida i lipoproteina

[0074] Administriranje jedne IV ili SC doze od mAb316P zdravim volonterima proizvelo je slično srednje maksimalno smanjenje LDL holesterola od 55-60%. Stepen i trajanje smanjenja LDL holesterola bio je zavisan od doze, a smanjenje LDL holesterola se održavalo najmanje do 29. I 22 dana nakon administracije viših nivoa doze IV ili SC mAb316P, respektivno. Slično tome, u studiji sa više doza, srednji procenat smanjenja u odnosnu na osnovnu vrednost LDL holesterola bio je zavisan od doze i premašio je 50% dve nedelje nakon doziranja sa 150 mg atorvastatina FH i non-FH na i populaciji non-FH koji su bili samo na ishrani. Svi osim 1 ispitanika u svakoj populaciji koji su primili 150 mg u studiji sa višestrukim dozama iskusili su smanjenje od najmanje 40% u odnosu na osnovnu vrednost.

[0075] Osnovna vrednost lipida i apolitipoproteina i nivoi 57. dana za sve grupe tretmana u delu A u studiji sa višestrukim dozama prikazani su u tabelama 3A (subjekti tretirani atorvastatinom) i 3B (samo ishrana - bez atorvastatina).

Tabela 3A

Tabela 3B

L

[0076] Odgovor LDL holesterola 57. dana bio je sličan kod svih ispitanika, bez obzira da li pripadaju grupi FH ili non-FH, da li su se lečili atorvastatinom ili bili samo na ishrani. Odgovarajuće promene su takođe uočene u ukupnom i non-HDL holesterolu i Apo B (tabele 3A i 3B). Takođe je primećena i Lp(a).T Dodatno, kod pacijenata koji uzimaju atorvastatin, primećene su povoljne promene u HDL holesterolu i apoA1.

[0077] Slična poboljšanja primećena su kod pacijenata tretriana sa mAb316P u delu B studije sa višestrukim dozama. To jest, subkutana administracija od 200 mg mAb316P indukuje brzo, značajno i održivo smanjenje LDL-C-a, ukupnog holesterola, non-HDL-C, apoB, i u odnosu apoB/Apoa. Pacijenti koji su primili 200 mg mAb316P SC takođe su pokazali trend ka višim nivoima HDL-C i ApoA1.

Diskusija

[0078] Ovaj primer opisuje anti-PCSK9 antitela na ljudima opisana ovde kao mAb316P, počevši od dve studije sa pojedinačnim rastućim dozama na zdravim dobrovoljcima i proširivši se na veliko ispitivanje višestrukih doza sa dokazom koncepta kod pacijenata sa FH i non-FH lečenim statinom ili koji su bili samo na dijeti. Ova ispitivanja potvrđuju potencijal da dovedu do brzog i značajnog smanjenja LDL holesterola sa inhibicijom PCSK9 u porodičnoj i neporodičnoj hiperholesterolemiji, bilo na statinima ili samo na dijeti. Ispitane populacije obuhvataju veliku većinu pacijenata sa hiperholesterolemijom.

[0079] Robustan i ponovljiv efekat mAb316P na LDL holesterol od pojedinačnog IV doziranja, preko jednog SC doziranja, do višestrukih SC doza, primećuje se u neočekivano kratkom vremenu nakon administracije, dostižući maksimum za približno 2 nedelje. Ova brzina je veća od one za sve druge terapeutske modalitete za hiperholesterolemiju, osim uklanjanja LDL holesterola putem afereze, i brža je nego kod statinea. Ovo veliko sniženje nivoa LDL holesterola može postići sa mAb316P kod pacijenata koji su već na relativno visokim dozama atorvastatina za koje je poznato da proizvode smanjenje LDL holesterola od 40% do 50% jasno razlikuje potencijal mAb316P od drugih ispitivanih terapija koje su dodate statinima, kao npr. ezetimib, sekvestranti žučne kiseline i inhibitori skvalen sintaze. Efikasnost mAb316P u snižavanju LDL holesterola, u kombinaciji sa očiglednom podnošljivošću i bezbednošću, naglašava iznenađujuće terapeutske prednosti mAb316P u odnosu na nekoliko drugih agenasa za snižavanje Apo B/LDL-C koji su u postupku razvoja, kao što su Apo B antisens, MTP inhibitori i analozi tiroidnih hormona. U stvari, postizanje niskog nivoa LDL holesterola od 50 mg po decilitru (1,29 mmol/L) ili manje bez ikakvog povećanja hepatičkih transaminaza je u značajnoj suprotnosti sa rezultatima dobijenim sa agensima koji inhibiraju formiranje VLDL i LDL kod mnogih subjekata u ovim studijama. Epidemiološke studije koje pokazuju da genetska nedovoljna ekspresija ili čak odsustvo PCSK9 i doživotno nizak nivo LDL holesterola izgleda da nisu povezani sa neočekivanim morbiditetom ili mortalitetom, pružaju nivo udobnosti u pogledu terapeutskog potencijala inhibicije PCSK9 lekovima.

[0080] Anti-PCSK9 antitela kao što je mAb316P takođe pružaju pacijentima koji nisu u stanju da tolerišu statine (sada se procenjuje da je to otprilike 5% do 10% svih pacijenata lečenih statinima) značajnu priliku za postizanje velikog (najmanje 50%) smanjenja LDL holesterola . Za mnoge od procenjenih 10 miliona pacijenata širom sveta sa FH, anti-PCSK9 antitela, uključujući mAb316P, nude stvarnu mogućnost da njihova upotreba zajedno sa statinima može konačno da postigne optimalnu kontrolu LDL holesterola i potencijalno dalje smanji njihov značajan rizik od rane i rekurentne kardiovaskularne bolesti. Trenutno otkrivene terapijske metodologije mogu takođe mnogim pacijentima ponuditi potencijal da prekinu LDL aferezu, invazivnu, dugotrajnu i skupu proceduru svake 2 nedelje koja obezbeđuje samo kratkoročno smanjenje LDL holesterola.

[0081] Dodatni neočekivani korisni efekti na druge lipide uočeni su u HDL holesterolu, Apo A1 i, što je najneo;ekivanije, Lp(a) koji su imali trend ili dostigli statistički značaj, uključujući i kod pacijenata lečenih atorvastatinom. Važno je da do sada nije klinički pokazano ni jedan terapeutski biološki agens (npr. anti-PCSK9 antitela) smanjuje Lp(a), za koji se smatralo da se ne uklanja preko LDL receptora. Dakle, sadašnji eksperimenti su prva demonstracija sposobnosti inhibitora PCSK9 da smanji nivoe Lp(a) u serumu kod pacijenata.

[0082] U pogledu bezbednosti, reakcija na mestu ubrizgavanja mAb316P je bilo minimalna. mAb316P je takođe generalno bezbedan i dobro se toleri[e bez trenda u neželjenim događajima povezanim sa lekovima i bez dokaza o hepato-ili mio-toksičnosti. Nekoliko povećanja CK koja su zapažena povezana su sa vežbanjem.

[0083] Ukratko, ovaj primer pokazuje da je mAb316P inhibicija PCSK9, pored efikasnog snižavanja LDL holesterola kod ljudi, iznenađujuće smanjuje i nivoe Lp(a).

Primer 3: Nasumična, dvostruka slepa, placebo kontrolisana, 12 nedeljna studija o bezbednosti i efikasnosti monoklona anti-PCSK9 antitela kod pacijenata sa heterozigotnom familijalnom hiperholesterolemijom

[0084] Kliničko ispitivanje je sprovedeno radi procene efikasnosti različitih potkožnih doza (SC) i režima doziranja mAb316P na serumu lipoprotein holesterola male gustine (LDL-C) i drugih lipida/apolitipoproteina (npr. ukupan holesterol, lipoproteini holesterola velike gustine, trigliceridi, apo B, Apo A1 i Lp[a]) kod pacijenata sa heterozigotnom porodičnom hiperholesterolemijom (heFH). Populacija pacijenata

[0085] Populacija pacijenata za ovu studiju uključivala je muškarce i žene, starosti 18-75 godina, koji su imali dijagnozu hefH, pokazali su nivoe LDL-C od 100 mg/dl ili više, i koji su bili na stabilnoj dnevnoj bazi statina (bilo sa ili bez ezetimiba) na početku studije. Pacijenti su bili isključeni ako su uzimali bilo kakva dodatna jedinjenja za snižavanje lipida kao što su fibrati, niacin, omega-3 masne kiseline, smole žučne kiseline, biljne stanole (npr. Benekol, ulje lanenog semena, psilijum) ili fermentisani crveni pirinač. Studija je obuhvatila 77 pacijenata.

Formulacija leka

[0086] Formulacija leka se sastojala od 150 mg/mL od mAb316P, 10 mm histidina, 0,2% polisorbata 20, 10% saharoze, i imala je pH vrednost 6,0.

Način administriranja

[0087] Formulacija leka (ili placebo) je administrirana pacijentima potkožnom injekcijom u abdomen. Svaki tretman je podrazumevao dve potkožne injekcije od po 1 ml.

Režimi administriranja

[0088] Pacijenti su podeljeni u pet grupa. Grupa 1 je uključivala 15 pacijenata koji su dobijali placebo jednom u dve nedelje; Grupa 2 uključivala je 16 pacijenata koji su primali 150 mg mAb316P jednom u dve nedelje; Grupa 3 uključivala je 15 pacijenata koji su primali 150 mg mAb316P jednom u četiri nedelje; Grupa 4 uključivala je 16 pacijenata koji su primali 200 mg mAb316P jednom u četiri nedelje; i Grupa 5 uključivala je 15 pacijenata koji su primali 300 mg mAb316P jednom u četiri nedelje. Trajanje studije je iznosilo 12 nedelja.

Ocenjivanje efikasnosti

[0089] Uzorci krvi prikupljeni su od pacijenata tokom ispitivanja, a tokom perioda praćenja od 8 nedelja. Uzorci su prikupljeni posle najmanje 12 sati (ujutru pre unosa bilo kakvog leka). Merenja sledećih parametara utvrđena su iz uzoraka krvi: (1) ukupni holesterol; (2) LDL-C; (3) HDL-C; (4) trigliceridi (TG); (5) Apo B; (6) Apo A1; i (7) Lp(a).Prosečne promene u ovim parametrima u odnosu na placebo na kraju studije (nedelja 12) date su sumarno u tabeli 4.

Tabela 4

Primer 4: Nasumična, dvostruka slepa, paralelnih grupa, placebo kontrolisana, 12. nedeljna studija o bezbednosti i efikasnosti monoklonalna anti- PCSK9 antitela kod pacijenata sa primarnom hiperholesterolemijom na stabilnoj terapiji Atorvastatinom

[0090] Kliničko ispitivanje je sprovedeno kako bi se procenila efikasnost pet doza i dva režima doza mAb316P tokom 12 nedelja kod pacijenata sa primarnom hiperholesterolemijom i LDL-C nivoima većim od 100 mg/dL na trentutnoj stabilnoj terapiji atorvastatinom. Efikasnost je procenjena na osnovu promena u serumu lipoproteina holesterola male gustine (LDL-C) i drugih lipida/apolipoproteina (npr., ukupnog holesterola, lipoproteina holesterola visoke gustine, triglicerida, apo B, Apo A1 i Lp[a]) tokom studija.

Populacija pacijenata

[0091] Populacija pacijenata za ovu studiju uključivala je muškarce i žene, starosti 18-75 godina, koji su dijagnostikovani primarnom hiperholesterolemijom, pokazali su LDL-C nivoe od 100 mg/dL ili više, i koji su bili na stabilnoj atorvastatinskoj terapiji od 10, 20 ili 40 mg najmanje šest nedelja pre početka studije. Pacijenti su bili isključeni ako su uzimali bilo kakva dodatna jedinjenja za snižavanje lipida kao što su fibriti, niacin, omega-3 masne kiseline, smole žučne kiseline, biljne stanole (npr. Benekol, ulje lanenog semena, psilijum) ili fermentisani crveni pirinač. Studija je obuhvatila 118 pacijenata.

Formulacija leka

[0092] Formulacija leka sadrži 150 mg/mL od mAb316P, 10 mm histidina, 0,2% polisorbata 20, 10% saharoze, i imala je pH vrednost 6,0.

Način administriranja

[0093] Formulacija leka (ili placebo) je data pacijentima potkožnom injekcijom u abdomen. Svaki tretman je podrazumevao dve potkožne injekcije od po 1 ml.

Režim administriranja

[0094] Pacijenti su podeljeni u šest grupa. Grupa 1 obuhvatala je 20 pacijenata koji su primali placebo jednom u dve nedelje; Grupa 2 uključivala je 19 pacijenata koji su primali 50 mg mAb316P jednom u dve nedelje; Grupa 3 uključivala je 20 pacijenata koji su primali 100 mg mAb316P jednom u dve nedelje; Grupa 4 uključivala je 18 pacijenata koji su primali 150 mg mAb316P jednom u dve nedelje; Grupa 5 uključivala je 20 pacijenata koji su primali 200 mg mAb316P jednom u četiri nedelje; a Grupa 6 uključivala je 21 pacijenta koji su primali 300 mg mAb316P jednom u četiri nedelje. Trajanje studije jeiznosilo 12 nedelja.

Ocenjivanje efikasnosti

[0095] Uzorci krvi su prikupljeni od pacijenata tokom studije i tokom perioda praćenja od 8 nedelja. Uzorci su sakupljeni nakon gladovanja od najmanje 12 sati (ujutru pre uzimanja bilo kakvog leka). Iz uzoraka krvi određena su merenja sledećih parametara: (1) Ukupni holesterol; (2) LDL-C; (3) HDL-C; (4) trigliceridi (TG); (5) Apo B; (6) Apo A1; i (7) Lp(a). Srednji procenat promene ovih parametara u poređenju sa placebom na kraju studije (12. nedelja) su sumirane u tabeli 5.

Tabela 5

Primer 5: Nasumična, dvostruka slepa, paralelnih grupa, placebo kontrolisana, studija fiksne doze o bezbednosti i efikasnosti monoklonalnog anti-PCSK9 antitela koadministriranog sa 80 mg Atorvastatina kod pacijenata sa primarnom hiperholesterolemijom

[0096] Kliničko ispitivanje je sprovedeno kako bi se procenila efikasnost mAb316P kada se koadministrira sa 80 mg atorvastatina tokom 8 nedelja kod pacijenata sa primarnom hiperholesterolemijom i LDL-C nivoima većim od 100 mg/dL. Efikasnost je procenjena na osnovu promena nivoa lipoproteina holesterola male gustine (LDL-C) i drugih lipida/apolipoproteina u serumu (npr. totalnog holesterola, lipoproteina holesterola velike gustine, triglicerida, apo B, APO A1 i LP[a]) tokom studija.

Populacija pacijenata

[0097] Populacija pacijenata za ovu studiju uključivala je muškarce i žene starosti 18-75 godina, kojima je dijagnostikovana primarna hiperholesterolemija, pokazali su LDL-C nivoe od 100 mg/dL ili više, i koji su bili na stabilnoj terapiji atorvastatinom od 10 mg najmanje šest nedelja pre početka studije. Pacijenti su bili isključeni ako su uzimali bilo kakva dodatna jedinjenja za snižavanje lipida kao što su fibriti, niacin, omega-3 masne kiseline, smole žučne kiseline, biljni stanoli (npr. Benekol, ulje lanenog semena, psilijum), ili fermentisani crveni pirinač. Studija je obuhvatila 88 pacijenata.

Formulacija leka

[0098] Formulacija leka sadrži 150 mg/mL od mAb316P, 10 mm histidina, 0,2% polisorbata 20, 10% saharoze, i imala je pH vrednost 6,0.

Način administriranja

[0099] Formulacija leka (ili placebo) je administriana pacijentima potkožnom injekcijom u abdomen. Svaki tretman je podrazumevao jednu potkožnu injekciju od 1 ml.

Režim administriranja

[0100] Pacijenti su podeljeni u tri grupe. Grupa 1 uključivala je 29 pacijenata koji su primali placebo jednom u dve nedelje plus 80 mg atorvastatina dnevno; Grupa 2 uključivala je 30 pacijenata koji su primali 150 mg mAb316P jednom u dve nedelje plus 80 mg atorvastatina dnevno; i Grupa 3 uključivala je 29 pacijenata koji su primali 150 mg mAb316P jednom u dve nedelje plus 10 mg atorvastatina dnevno. Trajanje studije je iznosilo 8 nedelja.

Procena efikasnosti

[0101] Uzorci krvi su sakupljeni od pacijenata tokom studije, i tokom perioda praćenja od 8 nedelja. Uzorci su sakupljeni nakon gladovanja od najmanje 12 sati (ujutru pre uzimanja bilo kakvog leka). Iz uzoraka krvi određena su merenja sledećih parametara: (1) Ukupni holesterol; (2) LDL-C; (3) HDL-C; (4) trigliceridi (TG); (5) Apo B; (6) Apo A1; (7) odnos Apo B/Apo A1; i (8) Lp(a). Procenti promena ovih parametara u poređenju sa placebom na kraju studije sumirani su u tabeli 6.

Tabela 6

[0102] Uzeti zajedno, rezultati ovih studija (primeri 3-5) potvrđuju sposobnost mAB316P da efikasno smanji nivo LDL holesterola i povoljno utiče na druge parametre lipida/apolitipoproteina kod pacijenata kada se primenjuju u različitim dozama i doznim režimima. Ovi klinički primeri takođe potvrđuju neočekivani nalaz da je mAB316P u stanju da značajno smanji nivo Lp(a) kod pacijenata pod različitim okolnostima.

[0103] Obim predmetnog pronalaska ne sme da bude ograničen posebnim realizacijama opisanim ovde. Svakako, različite modifikacije pronalaska, pored onih opisanih ovde, postaće vidljive i prosečnim stručnjacima u oblasti tehnike iz prethodno datog opisa i pratećih slika. Obim pronalaska definisan je zahtevima datim u daljem tekstu.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija koja se sastoji od inhibitora PCSK9 za upotrebu u smanjenju nivoa lipoprotein(a) (Lp(a))) kod pacijenta koji ispolajva nivo Lp(a) u sreumu iznad 30 mg/dl; pri čemu Inhibitor PCSK9 je humano antitelo koje specifično inhibira PCSK9.

2. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time, što pacijent ispoljava nivo Lp(a) u serumu veći od 100 mg/dL.

3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, naznačena time, što je kod pacijenta dijagnostikovano ili identifikovano da je pod rizikom od razvoja kardiovaskularnih bolesti ili poremećaja pre ili u vreme administracije kompozicije.

4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 3, naznačena time, što se kardiovaskularna bolest ili poremećaj biraju iz grupe koju čine koronarna arterijska bolest, akutni infarkt miokarda, asimptomatska karotidna aterosklerozae, moždani udar i periferna arterijska okluzivna bolest.

5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 3, naznačena time, što kardiovaskularna bolest ili poremećaj je hiperholesterolemija.

6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 5, naznačena time, što hiperholesterolemija je heterozigotna porodična hiperholesterolemija (hefH), ili hiperholesterolemija je neporodična hiperholesterolemija (nonFH).

7. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, naznačena time, što što je kod pacijenta dijagnostikovano ili identifikovano da je pod rizikom od razvoja trombotične okluzivne bolesti ili poremećaja pre ili u vreme administracije kompozicije, pri čemu je trombotična okluzivna bolest ili poremećaj izabrana iz grupe koju čine plućna embolija i okluzija centralne retinalne vene.

8. Farmaceutska kompozicija za upotrebu bilo kom od zahteva 1 do 7 naznačena time, što se farmaceutska kompozicija sastoji od 20 mg do 200 mg Inhibitora PCSK9 , opciono od 50 mg do 150 mg inhibitora PCSK9 a.

9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 8, naznačena time, što se farmaceutski sastav sastoji od 50 mg Inhibitora PCSK9, 100 mg Inhibitora PCSK9, ili 150 mg inhibitora PCSK9.

10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva od 1 do 9, naznačena time, što se antitelo ili antigen-vezujući fragment sastoji od teških i lakih CDR parova aminokiselinskih sekvenci CVR/LCVR odabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 90/92 i 218/226.

11. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 10, naznačena time, što:

(a) antitelo ili antigen-vezujući fragment se sastoji od teških i lakih CDR aminokiselinskih sekvenci koje imaju SEQ ID NOS: 220, 222, 224, 228, 230 i 232, opciono, gde antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži HCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:218 i LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:226; ili

(b) antitelo ili antigen-vezujući fragment se sastoji od teških i lakih CDR aminokiselinskih sekvenci koje imaju SEQ ID NOS:76, 78, 80, 84, 86 i 88, opciono, gde antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži HCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:90 i LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:92.

12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom zahtevu 1 do 11, naznačena time, što pacijent je na terapeutskom režimu statinima u vreme ili neposredno pre administracije kompozicije; opciono u kome terapuetski režim statinima ovuhvata statin koji je izabran iz grupe koja se sastoji od cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina i pravastatina, poželjno atorvastatina.

13. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom zahtevu 1 do 11, naznačena time, što u vreme administracije kompozicije pacijent nije na terapijskom režimu statinom.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Kneginje Ljubice 5, 11000 Beograd

37