Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS66445B1 - Multispecifični vezujući proteini za aktivaciju prirodnih ćelija ubica i njihova terapijska upotreba za lečenje raka - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS66445B1 - Multispecifični vezujući proteini za aktivaciju prirodnih ćelija ubica i njihova terapijska upotreba za lečenje raka - Google Patents

Multispecifični vezujući proteini za aktivaciju prirodnih ćelija ubica i njihova terapijska upotreba za lečenje raka

Info

Publication number
RS66445B1
RS66445B1 RS20250083A RSP20250083A RS66445B1 RS 66445 B1 RS66445 B1 RS 66445B1 RS 20250083 A RS20250083 A RS 20250083A RS P20250083 A RSP20250083 A RS P20250083A RS 66445 B1 RS66445 B1 RS 66445B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
cancer
trinket
cell
nkg2d
Prior art date
Application number
RS20250083A
Other languages
English (en)
Inventor
Gregory P Chang
Ann F Cheung
William Haney
Asya Grinberg
Original Assignee
Dragonfly Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dragonfly Therapeutics Inc filed Critical Dragonfly Therapeutics Inc
Publication of RS66445B1 publication Critical patent/RS66445B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNE REFERENCE NA SRODNE PRIJAVE
[0001] Ova prijave zahteva prednost i prioritet privremene patentne prijave US 62/456,535, podnete 8. februara 2017. godine.
LISTING SEKVENCI
[0002] Predmetna prijava sadrži listu sekvenci koja se podnosi elektronski u ASCII formatu. Navedena ASCII kopija, kreirana 6. februara 2018. godine, nazvana je DFY-001PC_SL.txt i veličine je 71.169 bajtova.
OBLAST PRONALASKA
[0003] Pronalazak se odnosi na multispecifične vezujuće proteine koji vezuju antigen povezan sa tumorom, NKG2D receptor i CD16. Pronalazak obezbeđuje multispecifični vezujući protein koji sadrži:
(a) prvo mesto za vezivanje antigena koje vezuje humani NKG2D;
(b) drugo mesto vezivanja antigena koje vezuje antigen povezan sa tumorom eksprimovan na ćeliji raka; i (c) Fc domen antitela ili njegov deo dovolјan da veže CD16,
pri čemu svako od prvog mesta vezivanja antigena i drugog mesta za vezivanje antigena obuhvata deo molekula imunoglobulina koji učestvuje u vezivanju NKG2D ili antigena povezanog sa tumorom, redom; i pri čemu je multispecifični vezujući protein konfigurisan da vezuje antigen povezan sa tumorom na ćeliji raka i vezuje NKG2D na prirodnoj ćeliji ubici (NK) da aktivira NK ćeliju i vezuje CD16 na NK ćeliu da bi aktivirao NK ćeliju.
STANJE TEHNIKE
[0004] Rak i dalјe predstavlјa značajan zdravstveni problem uprkos značajnim istraživačkim naporima i naučnim dostignućima prijavlјenim u literaturi za lečenje ove bolesti. Neki od najčešće dijagnostikovanih vrsta raka uklјučuju rak prostate, rak dojke i rak pluća. Rak prostate je najčešći oblik raka kod muškaraca. Rak dojke i dalјe je vodeći uzrok smrtnosti kod žena. Trenutne opcije lečenja ovih vrsta raka nisu efikasne za sve pacijente i/ili mogu imati značajne neželјene efekte. Druge vrste raka, takođe, ostaju izazovne za lečenje korišćenjem postojećih terapijskih opcija.
[0005] Imunoterapija protiv raka je poželјna, jer je veoma specifična i može olakšati uništavanje ćelija raka korišćenjem sopstvenog imunog sistema pacijenta. Fuzioni proteini kao što su bi-specifični T-ćelijski uklјučivači su imunoterapije raka opisane u literaturi da se vezuju za tumorske ćelije i T-ćelije kako bi olakšale uništavanje tumorskih ćelija. Antitela koja se vezuju za određene antigene povezane sa tumorom i za određene imune ćelije su opisana u literaturi. Videti, na primer WO 2016/134371 i WO 2015/095412.
US 2011/0044980 se odnosi na imunoglobuline sa dvostrukim varijabilnim domenom koji mogu da vežu dva ili više antigena.
Steigerwald J. et al PLOS ONE vol 9, no 10, od 7. oktobra 2014. godine, odnosi se na humana IgG1 antitela koja antagonizuju aktivirajući receptor NKG2D na prirodnim ćelijama ubicama.
Szun Szun Tay et al, „TriKEs and BiKEs join CARs on the cancer immunotherapy highway” Human Vaccines & Immunotherapies vol 12, no 11, od 20. juna 2016, odnosi se na trispecifično uključivanje ćelija ubica (TriKEs) koji su evoluirali od bipecifičnih uključivanja ćelija ubica (BiKEs) koji se sastoje od 2 fragmenta antitela, prvi koji prepoznaje tumorski antigen i drugi usmeren protiv CD 16 na NK ćelijama, dalјom integracijom IL-15.
Nicole C. Smits et al, Expert Opinion on Biological Therapy, vol 16, no 9, od 9. juna 2016, odnosi se na dizajniranje multivalentnih proteina zasnovanih na receptorima prirodnih ćelija ubica i njihovih liganda kao imunoterapije za rak.
[0006] Prirodne ćelije ubice (NK) su komponenta urođenog imunog sistema i čine približno 15% cirkulišućih limfocita. NK ćelije infiltriraju praktično sva tkiva i prvobitno ih je karakterisala njihova sposobnost da efikasno ubijaju ćelije tumora bez potrebe za prethodnom senzibilizacijom. Aktivirane NK ćelije ubijaju cilјne ćelije na način sličan citotoksičnim T ćelijama - tj. preko citolitičkih granula koje sadrže perforin i granzime kao i putem puteva receptora smrti. Aktivirane NK ćelije, takođe, luče inflamatorne citokine kao što su IFN-gama i hemokini koji pospešuju regrutovanje drugih leukocita u cilјno tkivo.
[0007] NK ćelije reaguju na signale preko različitih aktivirajućih i inhibitornih receptora na svojoj površini. Na primer, kada NK ćelije naiđu na zdrave sopstvene ćelije, njihova aktivnost se inhibira aktivacijom imunoglobulinskih receptora ćelija ubica (KIRs). Alternativno, kada NK ćelije naiđu na strane ćelije ili ćelije raka, one se aktiviraju preko svojih aktivirajućih receptora (npr. NKG2D, NCR, DNAM1). NK ćelije se, takođe, aktiviraju konstantnim regionom nekih imunoglobulina preko CD 16 receptora na svojoj površini. Ukupna osetlјivost NK ćelija na aktivaciju zavisi od zbira stimulativnih i inhibitornih signala.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0008] Pronalazak je izložen u priloženim patentnim zahtevima. Predmet, realizacije i aspekti koji izlaze van obima čija se zaštita traži, dati su samo za ilustraciju.
[0009] Predmetni pronalazak obezbeđuje multispecifični vezujući protein koji sadrži:
(a) prvo mesto za vezivanje antigena koje vezuje humani NKG2D;
(b) drugo mesto vezivanja antigena koje vezuje antigen povezan sa tumorom eksprimovan na ćeliji raka; i (c) Fc domen antitela ili njegov deo dovolјan da veže CD16,
pri čemu svako od prvog mesta vezivanja antigena i drugog mesta za vezivanje antigena obuhvata deo molekula imunoglobulina koji učestvuje u vezivanju NKG2D ili antigena povezanog sa tumorom, redom; i pri čemu je multispecifični vezujući protein konfigurisan da vezuje antigen povezan sa tumorom na ćeliji raka i vezuje NKG2D na prirodnoj ćeliji ubici (NK) da aktivira NK ćeliju i vezuje CD16 na NK ćeliu da bi aktivirao NK ćeliju.
[0010] Pronalazak obezbeđuje multispecifične vezujuće proteine koji se vezuju za antigen povezan sa tumorom na ćeliji raka i NKG2D receptor i CD16 receptor na prirodnim ćelijama ubicama kako bi aktivirali prirodne ćelije ubice, farmaceutske kompozicije koje sadrže takve multispecifične vezujuće proteine i terapeutske metode koje koriste takve multispecifične proteine i farmaceutske kompozicije, uklјučujući one za lečenje raka. Takvi proteini mogu da angažuju više od jedne vrste receptora za aktivaciju NK i mogu da blokiraju vezivanje prirodnih liganada za NKG2D. U određenim realizacijama, protein može da agonizuje NK ćelije kod lјudi, i kod drugih vrsta kao što su glodari i majmuna makaki rakojeda. Različiti aspekti i realizacije pronalaska su detalјnije opisani u daljem tekstu.
[0011] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein može da inkorporira prvo mesto za vezivanje antigena koje vezuje NKG2D; drugo mesto za vezivanje antigena koje vezuje antigen povezan sa tumorom; i Fc domen antitela, njegov deo dovolјan da veže CD 16, ili treće mesto za vezivanje antigena koje vezuje CD16.
[0012] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je trovalentan, što uklјučuje prvo i drugo mesto vezivanja antigena koje oba vezuju isti antigen povezan sa tumorom; treće mesto vezivanja antigena koje vezuje NKG2D; i Fc domen antitela, njegov deo dovolјan da veže CD16.
[0013] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je četvorovalentan, što uklјučuje prvo i drugo mesto vezivanja antigena koje oba vezuju isti antigen povezan sa tumorom; treće i četvrto mesto vezivanja antigena koje oba vezuju NKG2D; i Fc domen antitela, njegov deo dovolјan da veže CD 16.
[0014] Svako od ovih mesta za vezivanje antigena može da sadrži varijabilni domen teškog lanca antitela i varijabilni domen lakog lanca antitela (npr. raspoređeni kao u antitelu ili spojeni zajedno sa scFv), ili jedno ili više mesta za vezivanje antigena mogu biti jednodomensko antitelo, kao što je VHH antitelo poput antitela kamile ili VNARantitela poput onih koja se nalaze kod rušljoriba. U nekim slučajevima, antigen povezan sa tumorom može biti izabran iz grupe koju čine HER2, CD20, CD33, antigen sazrevanja B-ćelija (BCMA), EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 i PD1.
[0015] Drugi aspekt pronalaska obezbeđuje postupak lečenja raka kod pacijenta. Postupak obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno terapeutski efikasne količine multispecifičnog vezujućeg proteina opisanog ovde za lečenje raka. Primeri raka za lečenje korišćenjem multispecifičnih vezujućih proteina uklјučuju, na primer, karcinom koji eksprimuje HER2.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0016]
Sl. 1 je prikaz multispecifičnog vezujućeg proteina koji sadrži domen koji se vezuje za NKG2D (desni krak), domen vezivanja antigena povezan s tumorom (levi krak) i Fc domen ili njegov deo koji se vezuje za CD16.
Sl. 2 je prikaz multispecifičnog vezujućeg proteina koji sadrži domen koji se vezuje za NKG2D u scFv formatu (desna ruka), domen vezivanja antigena povezan s tumorom (levi krak) i Fc domen ili njegov deo koji se vezuje za CD16.
Sl. 3 je prikaz TriNKET-a u obliku Triomab-a, koji je trifunkcionalno, bispecifično antitelo koje održava oblik sličan IgG. Ova himera se sastoji od dva poluantitela, svako sa jednim lakim i jednim teškim lancem, koja potiču od dva roditelјska antitela. Triomab oblik može biti heterodimerni konstrukt koji sadrži 1⁄2 antitela pacova i 1⁄2 antitela miša.
Sl. 4 je prikaz TriNKET-a u obliku KiH zajedničkog lakog lanca (LC), koji uklјučuje tehnologiju knobs-into-holes (KIHs). KiH je heterodimer koji sadrži 2 Fab-a koji se vezuju za cilј 1 i 2, i Fc stabilizovan heterodimerizacionim mutacijama. TriNKET u KiH formatu može biti heterodimerni konstrukt sa 2 fab-a koji se vezuju za cilј 1 i cilј 2, koji sadrži 2 različita teška lanca i zajednički laki lanac koji se uparuje sa oba HC.
Sl. 5 je prikaz TriNKET-a u obliku imunoglobulina dvostruko varijabilnog domena (DVD-Ig™), koji kombinuje cilјne domene vezivanja dva monoklonalna antitela preko fleksibilnih linkera koji se javlјaju u prirodi, i daje tetravalentni molekul sličan IgG. DVD-Ig™ je homodimerni konstrukt gde je varijabilni domen koji cilјa antigen 2 fuzionisan sa N-krajem varijabilnog domena Fab ciljajućeg antigena 1. Konstrukt sadrži normalan Fc.
Sl. 6 je prikaz TriNKET-a u obliku ortogonalnog Fab interfejsa (Orto-Fab), koji je heterodimerni konstrukt koji sadrži 2 Fab-a, koji se vezuju za cilј 1 i cilј 2 fuzionisane sa Fc. LC-HC uparivanje je obezbeđeno ortogonalnim interfejsom. Heterodimerizacija je obezbeđena mutacijama u Fc.
Sl.7 je prikaz TrinKET-a u formatu 2 u 1 Ig.
Sl. 8 je prikaz TriNKET-a u ES obliku, koji je heterodimerni konstrukt koji sadrži 2 različita Fab-a koji se vezuju za cilј 1 i cilј 2 fuzionisane sa Fc. Heterodimerizacija je obezbeđena elektrostatičkim mutacijama upravlјanja u Fc. Sl. 9 je prikaz TriNKET-a u obliku razamene Fab kraka: antitela koja razmenjuju Fab krakove zamenom teškog lanca (HC) i pričvršćenog lakog lanca (LC) (polumolekula) sa parom teškog lakog lanca iz drugog molekula, što rezultira u bispecifičnim antitelima. Oblik razamene Fab kraka (cFae) je heterodimer koji sadrži 2 Fab-a koji se vezuju za cilј 1 i 2, i Fc stabilizovan heterodimerizacionim mutacijama.
Sl. 10 je prikaz TriNKET-a u obliku SEED tela, koje je heterodimer koji sadrži 2 Fab-a koji se vezuju za cilј 1 i 2, i Fc stabilizovan heterodimerizacionim mutacijama.
Sl. 11 je prikaz TriNKET-a u LuZ-Y obliku, u kome se leucinski zatvarač koristi da izazove heterodimerizaciju dva različita HC. LuZ-Y oblik je heterodimer koji sadrži 2 različita scFab-a koji se vezuju za cilј 1 i 2, fuzionisana sa Fc. Heterodimerizacija je obezbeđena preko motiva leucinskog zatvarača spojenih sa C-krajem Fc.
Sl.12 je prikaz TriNKET-a u obliku Cov-X-tela.
Sl. 13A-13B su prikazi TriNKET-a u oblicima κ λ-tela, koji su heterodimerni konstrukti sa 2 različita Fab-a fuzionisana sa Fc stabilizovanim heterodimerizacionim mutacijama: Fab1 cilјani antigen 1 sadrži kapa LC, dok drugi Fab cilјani antigen 2 sadrži lambda LC. Sl. 13A je ogledni prikaz jednog oblika κ λ-tela; Sl. 13B je ogledni prikaz drugog κ λ-tela.
Sl. 14 je grafikon koji pokazuje afinitet vezivanja domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi) za humani rekombinantni NKG2D u ELISA testu.
Sl. 15 je grafikon koji pokazuje afinitet vezivanja domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi) za rekombinantni NKG2D makaki rakojeda u ELISA testu.
Sl.16 je grafikon koji pokazuje afinitet vezivanja domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi) za mišji rekombinantni NKG2D u ELISA testu.
Sl. 17 je grafikon koji pokazuje vezivanje domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi) za EL4 ćelije koje eksprimuju humani NKG2D protočnom citometrijom pokazujući srednji intenzitet fluorescencije (MFI) u odnosu na pozadinu.
Sl. 18 je grafikon koji pokazuje vezivanje domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi) za EL4 ćelije koje eksprimuju mišji NKG2D pomoću protočne citometrije i pokazujući srednji intenzitet fluorescencije (MFI) u odnosu na pozadinu.
Sl. 19 je grafikon koji pokazuje afinitet specifičnog vezivanja domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi) za rekombinantni humani NKG2D-Fc takmičeći se sa prirodnim ligandom ULBP-6.
Sl. 20 je grafikon koji pokazuje afinitet specifičnog vezivanja domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi) za rekombinantni humani NKG2D-Fc takmičeći se sa prirodnim ligandom MICA.
Sl. 21 je grafikon koji pokazuje afinitet specifičnog vezivanja domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi) za rekombinantni mišji NKG2D-Fc takmičeći se sa prirodnim ligandom Rae-1 delta.
Sl. 22 je grafikon koji prikazuje aktivaciju humanog NKG2D domenima koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi) kvantifikacijom procenta TNF-alfa pozitivnih ćelija koje eksprimuju humane NKG2D-CD3 zeta fuzione proteine.
Sl. 23 je grafikon koji prikazuje aktivaciju mišjeg NKG2D domenima koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi) kvantifikacijom procenta TNF-alfa pozitivnih ćelija koje eksprimuju mišje NKG2D-CD3 zeta fuzione proteine.
Sl. 24 je grafikon koji prikazuje aktivaciju humanih NK ćelija pomoću domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi).
Sl. 25 je grafikon koji prikazuje aktivaciju humanih NK ćelija pomoću domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi).
Sl. 26 je grafikon koji prikazuje aktivaciju mišjih NK ćelija pomoću domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi).
Sl. 27 je grafikon koji prikazuje aktivaciju mišjih NK ćelija pomoću domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi).
Sl. 28 je grafikon koji pokazuje citotoksični efekat domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi) na tumorske ćelije.
Sl. 29 je grafikon koji prikazuje temperaturu toplјenja domena koji se vezuju za NKG2D (navedenih kao klonovi) merene diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom.
Sl.30 je grafikon koji pokazuje pojačanu aktivaciju humanih NK ćelija pomoću multispecifičnih vezujućih proteina.
Sl. 31 je grafikon koji pokazuje da su multispecifični vezujući proteini indukovali više nivoe citotoksičnosti prema cilјnim ćelijama tumora humanim NK ćelijama.
Sl. 32 je grafikon koji pokazuje da su multispecifični vezujući proteini indukovali više nivoe citotoksičnosti prema cilјnim ćelijama tumora od strane humanih NK ćelija.
Sl. 33 je grafikon koji pokazuje da su multispecifični vezujući proteini indukovali više nivoe citotoksičnosti prema cilјnim ćelijama tumora od strane humanih NK ćelija.
Sl. 34 je grafikon koji pokazuje da su multispecifični vezujući proteini indukovali više nivoe citotoksičnosti prema cilјnim ćelijama tumora od strane humanih NK ćelija.
Sl. 35 je grafikon koji pokazuje da su multispecifični vezujući proteini indukovali više nivoe citotoksičnosti prema cilјnim ćelijama tumora od strane humanih NK ćelija.
Sl. 36 je grafikon koji pokazuje da su multispecifični vezujući proteini indukovali više nivoe citotoksičnosti prema cilјnim ćelijama tumora od strane humanih NK ćelija.
Sl. 37 je profil vezivanja TriNKET-a koji cilјaju CD33 za NKG2D eksprimovan na EL4 ćelijama. Sl. 37 prikazuje vezivanje dva TriNKET-a kada se domen koji se vezuje za CD33 koristi kao drugi ciljajući krak.
Sl.38 je profil vezivanja TriNKET-a koji cilјaju HER2 za NKG2D eksprimovan na EL4 ćelijama. Sl.38 prikazuje ista dva domena koja se vezuju za NKG2D koja su sada uparena sa HER2 drugim ciljajućim krakom.
Sl.39 je profil vezivanja TriNKET-a koji cilјaju BCMA za NKG2D eksprimovan na EL4 ćelijama.
Sl. 40 je histogram TriNKET-a koji cilјaju CD20 koji se vezuju za NKG2D eksprimovan na EL4 ćelijama. Neobojene EL4 ćelije su korišćene kao negativna kontrola za signal fluorescencije. Bez mrlјa: ispunjeno; CD20-TriNKET-F04: puna linija; CD20-TriNKET-C26: isprekidana linija.
Sl.41 je profil vezivanja TriNKET-a koji cilјaju CD33 za CD33 eksprimovan na MV4-11 humanim AML ćelijama. Sl.42 je profil vezivanja TriNKET-a koji cilјaju HER2 za HER2 eksprimovan na humanim 786-O ćelijama karcinoma bubrežnih ćelija.
Sl. 43 je profil vezivanja TriNKET-a koji cilјaju BCMA za BCMA eksprimovan na MM.1S ćelijama humanog mijeloma.
Sl. 44 je histogram TriNKET-a koji cilјaju CD20 koji se vezuju za CD20 eksprimovan na ćelijama humanog limfoma Raji. Neobojene ćelije su korišćene kao negativna kontrola za signal fluorescencije. Bez mrlјa: ispunjeno; CD20-TriNKET-F04: puna linija; CD20-TriNKET-C26: isprekidana linija.
Sl. 45A-45C su stubičasti grafikoni sinergetske aktivacije NK ćelija korišćenjem CD16 i NKG2D. Sl.45A pokazuje nivoe CD107a; Sl. 45B pokazuje nivoe IFN γ; Sl. 45C pokazuje nivoe CD107a i IFN γ. Grafikoni pokazuju srednju vrednost (n = 2) ±SD. Podaci su reprezentativni za pet nezavisnih eksperimenata sa pet različitih zdravih donora.
Sl. 46 je stubičasti grafikon koji prikazuje aktivaciju NK ćelija korišćenjem TriNKET-a koji cilјaju NKG2D i CD16. Testirana antitela su bila izotipovi humanog IgG1. Grafikoni pokazuju srednju vrednost (n = 2) ±SD.
Sl. 47A - 47C su stubičasti grafikoni koji pokazuju da su TriNKET i trastuzumab bili u stanju da aktiviraju primarne humane NK ćelije u kokulturi sa HER2-pozitivnim humanim tumorskim ćelijama, što je naznačeno povećanjem degranulacije CD107a i proizvodnjom IFN γ citokina. U poređenju sa monoklonskim antitelom trastuzumabom, oba TriNKET-a su pokazala superiornu aktivaciju humanih NK ćelija kod različitih humanih HER2 ćelija raka. Sl. 47A pokazuje da se humane NK ćelije aktiviraju TriNKET-ima kada se uzgajaju sa SkBr-3 ćelijama. Sl. 47B pokazuje da se humane NK ćelije aktiviraju TriNKET-ima kada se uzgajaju sa Colo201 ćelijama. Sl. 47C pokazuje da se humane NK ćelije aktiviraju TriNKET-ima kada se uzgajaju sa ćelijama HCC1954.
Sl. 48A - 48B su linijski grafikoni koji prikazuju TriNKET posredovanu aktivaciju mirnih ili IL-2 aktiviranih humanih NK ćelija u kokulturi sa ćelijskom linijom humane AML MV4-11 koja eksprimuje CD33. Sl. 48A prikazuje TriNKET posredovanu aktivaciju humanih NK ćelija u mirovanju. Sl.48B prikazuje TriNKET posredovanu aktivaciju humanih NK ćelija aktiviranih IL-2 od istog donora.
Sl. 49A - 49B su grafikoni koji prikazuju TriNKET pobolјšanje citotoksične aktivnosti korišćenjem IL-2-aktiviranih i humanih NK ćelija u mirovanju. Sl. 49A prikazuje procentualno specifičnu lizu tumorskih ćelija SkBr-3 od strane humanih NK ćelija u mirovanju. Sl. Slika 49B prikazuje procentualno specifičnu lizu tumorskih ćelija SkBr-3 pomoću humanih NK ćelija aktiviranih IL-2.
Sl. 50A-50B su grafikoni koji pokazuju da TriNKET-ovi obezbeđuju veću prednost protiv raka sa srednjim i niskim HER2 u poređenju sa trastuzumabom. Sl. 50A prikazuje aktivirano ubijanje od strane humanih NK ćelija SkBr-3 tumorskih ćelija sa visokim nivoom HER2. Sl.50B prikazuje ubijanje od strane humanih NK ćelija 786-0 tumorskih ćelija sa niskim nivoom HER2. TriNKET-i obezbeđuju veću prednost u poređenju sa trastuzumabom protiv ćelija raka sa niskom ekspresijom HER2.
Sl. 51A - 51C su histogrami koji pokazuju ekspresiju FcRyI visokog afiniteta (CD64) na tri humane AML ćelijske linije, Molm-13 ćelijsku liniju (Sl.51A), Mv4-11 ćelijsku liniju (Sl.51B) i THP-1 ćelijsku liniju (Sl.51C).
Sl. 52A-52B su linijski grafikoni aktivacije humanih NK ćelija posredovane sa monoklonskim antitelom ili TriNKET-om u kokulturi sa Molm-13 (Sl.52B) ili THP-1 (Sl.52A) ćelijama.
Sl.53A - 53C su linijski grafikoni humanih NK testova citotoksičnosti korišćenjem tri humane AML ćelijske linije kao ciljeva. Sl. 53A pokazuje da su ćelije Mv4-11, koje eksprimuju CD64, ali na nižem nivou od THP-1, pokazale smanjenu efikasnost sa monoklonskim anti-CD33. Sl. 53B pokazuje da monoklonsko antitelo protiv CD33 pokazuje dobru efikasnost protiv Molm-13 ćelija, koje ne eksprimuju CD64. Sl.53C pokazuje da THP-1 ćelije nisu pokazale nikakav efekat samo sa monoklonskim anti-CD33. Identiteti linijskih grafikona zabeleženih na Sl.53C su, takođe, primenlјivi na linijske grafikone na Sl.53A-53B.
Sl.54A i 54B su stubičasti grafikoni koji pokazuju da su B ćelije zdravstvenog donora osetlјive na lizu posredovanu TriNKET-om.
Sl. 54C i 54D su stubičasti grafikoni koji pokazuju da su mijeloične ćelije otporne na lizu posredovanu TriNKET-om.
Sl. 55 su linijski grafikoni TriNKET-om posredovanog hPBMC ubijanja tumorskih ćelija SkBr-3 u dugotrajnim kokulturama.
Sl. 56 je dijagram toka dizajna studije efikasnosti RMA/S-HER2 supkutanog SC2.2.
Sl. 57 su linijski grafikoni koji pokazuju da SC2.2 nema efekta na supkutani rast tumora RMA/S-HER2.
Sl. 58A - 58B su grafikoni koji pokazuju in vitro vezivanje mcFAE-C26.99 TriNKET.60 μg/mL navedenih antitela sa četvorostrukim razblaženjima dodato je u 2×10<5>B16F10 tumorske ćelije (Sl.58A) ili ćelije EL4-mNKG2D (Sl.58B). Vezivanje je procenjeno korišćenjem kozjeg anti-mišjeg PE sekundarnog antitela, nakon čega je usledila analiza protočnom citometrijom.
Sl. 59 je grafikon koji pokazuje povećanu NK citotoksičnost posredovanu mcFAE-C26.99 TriNKET-om.
Sl. 60A - 60B pokazuju antitumorsku efikasnost mcFAE-C26.99 TriNKET-a u B16F10 s.c. modelima. Miševi su tretirani intraperitonealno sa (Sl. 60A) izotipskim kontrolnim mišjim IgG2a mab C1.18.4 i mišjim anti-Tyrp-1 monoklonskim antitelom ili (Sl. 60B) izotipskim kontrolnim mišjim IgG2a mab C1.18.4 i mcFAE-C26.99 TriNKET-om, ubrizganim u dozi od 150 μg (dani 6, 8, 10, 12, 14, 16 i 21). Rast tumora je procenjen tokom 28 dana. Grafikoni pokazuju krive rasta tumora pojedinačnih miševa.
Sl. 61A - 61B pokazuju antitumorsku efikasnost mcFAE-C26.99 TriNKET-a u B16F10 i.v. modelima. Sl. 61A predstavlјa opterećenje tumorom kada su antitela davana u dozi od 150 μg (4, 6, 8, 11, 13, 15. dana). Sl. 61B predstavlјa opterećenje tumorom kada su antitela davana u dozi od 150 μg (7, 9, 11, 13, 15. dana).18 dana nakon izazivanja tumora, miševi su eutanazirani i površinske metastaze u plućima su ocenjene.
Sl. 62 je stubičasti grafikon koji pokazuje da se humane NK ćelije aktiviraju TriNKET-ima kada se uzgajaju sa CD20+ Raji ćelijama.
Sl. 63 je stubičasti grafikon koji pokazuje da aktivaciju humanih NK u kulturi sa BCMA pozitivnim MM.1S ćelijama humanog mijeloma.
Sl. 64 je grafikon koji pokazuje da TriNKET pobolјšavaju lizu humanih NK ćelija KMS12-PE ćelija mijeloma.
Sl. 65 je grafikon koji pokazuje da TriNKET-i koji cilјaju BCMA sa različitim domenima koji se vezuju za NKG2D pobolјšavaju lizu od strane humanih NK ćelija KMS12-PE ćelija mijeloma.
Sl. 66 je linijski grafikon koji pokazuje da je tri-specifično vezivanje u jednom molekulu važno za maksimalnu aktivnost NK ćelija.
Sl. 67 je Oasc-Fab heterodimerni konstrukt koji uklјučuje Fab vezivanje za cilј 1 i vezivanje scFab za cilј 2 fuzionisan za Fc. Heterodimerizacija je obezbeđena mutacijama u Fc.
Sl. 68 je DuetMab, koji je heterodimerni konstrukt koji sadrži 2 različita Fab-a koji se vezuju za antigen 1 i 2 i Fc stabilizovan heterodimerizacionim mutacijama. Fab 1 i 2 sadrže diferencijalne S-S mostove koji obezbeđuju ispravno LC i HC uparivanje.
Sl. 69 je CrossmAb, koji je heterodimerni konstrukt sa 2 različita Fab-a koji se vezuju za cilј 1 i 2 fuzionisan za Fc stabilizovanim heterodimerizacijom. CL i CH1 domeni i Vh i VL domeni su zamenjeni, na primer, CH1 je fuzionisan u liniji sa VL, dok je CL fuzionisan u liniji sa VH.
Sl. 70 je Fit-Ig, koji je homodimerni konstrukt gde je Fab vezivanje za antigen 2 fuzionisano za N kraj HC Fab-a koji se vezuje za antigen 1. Konstrukt sadrži Fc divlјeg tipa.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0017] Pronalazak obezbeđuje multispecifične vezujuće proteine koji vezuju antigen povezan sa tumorom na ćeliji raka i NKG2D receptor i CD16 receptor na prirodnim ćelijama ubicama da bi aktivirali prirodne ćelije ubice, farmaceutske kompozicije koje sadrže takve multispecifične vezujuće proteine i terapeutske metode korišćenje takvih multispecifičnih proteina i farmaceutskih kompozicija, uklјučujući i one za lečenje raka. Različiti aspekti pronalaska su navedeni u daljem tekstu u odelјcima; međutim, aspekti pronalaska opisani u jednom posebnom odelјku ne smeju biti ograničeni ni na jedan poseban odelјak.
[0018] Da bi se olakšalo razumevanje predmetnog pronalaska, niz izraza i fraza su definisani u nastavku.
[0019] Izrazi „a” i „an” (u engleskoj verziji) kako se ovde koriste znače „jedan ili više” i uklјučuju množinu osim ako kontekst nije odgovarajući.
[0020] Kako se ovde koristi, izraz „mesto vezivanja antigena” odnosi se na deo molekula imunoglobulina koji učestvuje u vezivanju antigena. U humanim antitelima, mesto vezivanja antigena formiraju aminokiselinski ostaci N-terminalnog varijabilnog („V”) regiona teškog („H”) i lakog („L”) lanaca. Tri veoma divergentna dela unutar V regiona teških i lakih lanaca nazivaju se „hipervarijabilnim regionima” koji su smešteni između očuvanijih bočnih delova poznatih kao „okvirni regioni” ili „FR”. Stoga se izraz „FR” odnosi na sekvence amino-kiseline koje se prirodno nalaze između i pored hipervarijabilnih regiona u imunoglobulinima. U molekulu humanog antitela, tri hipervarijabilna regiona lakog lanca i tri hipervarijabilna regiona teškog lanca su raspoređeni jedan u odnosu na drugog u trodimenzionalnom prostoru da formiraju površinu koja se vezuje za antigen. Površina koja se vezuje za antigen je komplementarna trodimenzionalnoj površini vezanog antigena, a tri hipervarijabilna regiona svakog od teškog i lakog lanca nazivaju se „regionima koji određuju komplementarnost” ili „CDR-ovima”. Kod određenih životinja, kao što su kamile i rušljoribe, mesto vezivanja antigena formira se jednim lancem antitela koji obezbeđuje „antitelo sa jednim domenom”.
Mesta vezivanja antigena mogu da postoje u intaktnom antitelu, u fragmentu antitela koji se vezuje za antigen koji zadržava površinu koja se vezuje za antigen, ili u rekombinantnom polipeptidu kao što je scFv, korišćenjem peptidnog linkera za povezivanje varijabilnog domena teškog lanca sa varijabilnim domenom lakog lanca u jednom polipeptidu.
[0021] Izraz „antigen povezan sa tumorom” kako se ovde koristi označava bilo koji antigen uklјučujući, ali ne ograničavajući se na protein, glikoprotein, gangliozid, uglјene hidrate, lipide koji su povezani sa rakom. Takav antigen može biti eksprimovan na malignim
ćelijama ili u mikrookruženju tumora, kao što su krvni sudovi povezani sa tumorom, ekstracelularni matriks, mezenhimalna stroma ili imuni infiltrati.
[0022] Kako se ovde koriste, izrazi „subjekat” i „pacijent” odnose se na organizam koji se leči ovde opisanim postupcima i kompozicijama. Takvi organizmi poželјno uklјučuju, ali nisu ograničeni na, sisare (npr. miševi, majmuni, kopitari, goveda, svinje, psi, mačke i slično), a poželјnije uklјučuju lјude.
[0023] Kako se ovde koristi, izraz „efikasna količina” se odnosi na količinu jedinjenja (npr. jedinjenje predmetnog pronalaska) dovolјno za postizanje korisnih ili želјenih rezultata. Efikasna količina se može primeniti u jednom ili više admiristriranja, primena ili doza i nije predviđena da bude ograničena na određenu formulaciju ili put primene. Kako se ovde koristi, izraz „lečenje” uklјučuje bilo koji efekat, npr. smanjenje, smanjenje, modulisanje, pobolјšanje ili eliminisanje, što dovodi do pobolјšanja stanja, bolesti, poremećaja i slično, ili ublažavanja simptoma istih.
[0024] Kako se ovde koristi, izraz „farmaceutska kompozicija” se odnosi na kombinaciju aktivnog sredstva sa nosačem, inertnim ili aktivnim, čineći kompoziciju posebno pogodnom za dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu in vivo ili ex vivo.
[0025] Kako se ovde koristi, izraz „farmaceutski prihvatlјiv nosač” odnosi se na bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača, kao što je fiziološki rastvor puferovan fosfatom, voda, emulzije (npr. kao što su emulzije ulјe/voda ili voda/ulјe) i razne vrste sredstava za vlaženje. Kompozicije, takođe, mogu da uklјučuju stabilizatore i konzervanse. Za primere nosača, stabilizatora i pomoćnih sredstava, videti npr. Martin, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].
[0026] Kako se ovde koristi, izraz „farmaceutski prihvatlјiva so” odnosi se na bilo koju farmaceutski prihvatlјivu so (npr. kiselina ili baza) jedinjenja iz predmetnog pronalaska koje je, nakon davanja subjektu, sposobno da obezbedi jedinjenje predmetnog pronalaska ili njegov aktivni metabolit ili njegov ostatak. Kao što je poznato stručnjacima u tehnici, „soli” jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti izvedene iz neorganskih ili organskih kiselina i baza. Primeri kiselina uklјučuju, ali nisu ograničeni na, hlorovodoničnu, bromovodoničnu, sumpornu, azotnu, perhlornu, fumarnu, maleinsku, fosfornu, glikolnu, mlečnu, salicilnu, sukcinsku, toluen-p-sulfonsku, vinsku, sirćetnu, limunsku, metansulfonsku, etansulfonsku, mravlјu, benzojevu, malonsku, naftalen-2-sulfonsku, benzensulfonsku kiselinu i slično. Druge kiseline, kao što je oksalna, iako same po sebi nisu farmaceutski prihvatlјive, mogu se upotrebiti u pripremi soli korisnih kao intermedijeri u dobijanju jedinjenja pronalaska i njihovih farmaceutski prihvatlјivih kiselinskih adicijskih soli.
[0027] Primeri baza uklјučuju, ali nisu ograničeni na, hidrokside alkalnih metala (npr. natrijum), hidrokside zemnoalkalnih metala (npr. magnezijum), amonijak i jedinjenja formule NW4<+>, gde je W C1-4alkil, i slično.
[0028] Primeri soli uklјučuju, ali nisu ograničeni na: acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butirat, citrat, kamfor, kamforsulfonat, ciklopentanpropionat, diglukonat, dodecilsulfat, etansulfonat, fumarat, flukoheptanoat, glicerofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hidrohlorid, hidrobromid, hidrojodid, 2-hidroksietansulfonat, laktat, maleat, metansulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, oksalat, palmoat, pektinat, persulfat, fenilpropionat, pikrat, pivalat, propionat, sukcinat, tartarat, tiocijanat, tozilat, undekanoat i slično. Drugi primeri soli uklјučuju anjone jedinjenja predmetnog pronalaska spojene sa pogodnim katjonom kao što je Na<+>, NH4<+>, i NW4<+>(gde je W C1-4alkil grupa) i slično.
[0029] Za terapeutsku upotrebu, soli jedinjenja predmetnog pronalaska se smatraju farmaceutski prihvatlјivim. Međutim, soli kiselina i baza koje nisu farmaceutski prihvatlјive mogu, takođe, naći primenu, na primer, u pripremi ili prečišćavanju farmaceutski prihvatlјivog jedinjenja.
[0030] U celom opisu, gde su kompozicije opisane da imaju, uklјučuju ili sadrže specifične komponente, ili gde su procesi i postupci opisani kao da imaju, uklјučuju ili obuhvataju specifične korake, smatra se da, dodatno, postoje kompozicije predmetnog pronalaska koje se sastoje u suštini od, ili se sastoje od navedenih komponenti, i da postoje procesi i postupci prema predmetnom pronalasku koji se u suštini sastoje od, ili se sastoje od navedenih koraka prerade.
[0031] Uopšteno govoreći, kompozicije koje određuju procenat su po težini, osim ako nije drugačije naznačeno. Dalјe, ako promenlјivu ne prati definicija, onda se primenjuje prethodna definicija promenlјive.
I. PROTEINI
[0032] Pronalazak obezbeđuje multispecifične vezujuće proteine koji vezuju antigen povezan sa tumorom na ćeliji raka i NKG2D receptor i CD16 receptor na prirodnim ćelijama ubicama da bi aktivirali prirodnu ćeliju ubicu. Multispecifični vezujući proteini su korisni u ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama i terapeutskim postupcima. Vezivanje multispecifičnog vezujućeg proteina za NKG2D receptor i CD16 receptor na prirodnoj ćeliji ubici pojačava aktivnost prirodne ćelije ubice prema uništavanju ćelije raka. Vezivanje multispecifičnog vezujućeg proteina za antigen povezan sa tumorom na ćeliji raka dovodi ćeliju raka u blizinu prirodne ćelije ubice, što olakšava direktno i indirektno uništavanje ćelije raka od strane prirodne ćelije ubice. Dalјi opis primera multispecifičnih vezujućih proteina je dat u daljem tekstu.
[0033] Prva komponenta multispecifičnih vezujućih proteina vezuje se za ćelije koje eksprimuju NKG2D receptor, što može da uklјučuje, ali nije ograničeno na NK ćelije, γ δ T ćelije i CD8<+>α β T ćelije. Nakon vezivanja za NKG2D, multispecifični vezujući proteini mogu blokirati prirodne ligande, kao što su ULBP6 i MICA, od vezivanja za NKG2D.
[0034] Druga komponenta multispecifičnih vezujućih proteina vezuje se za jedan ili više antigena povezanih sa tumorom, koji mogu da uklјučuju, ali nisu ograničeni na HER2, CD20, CD33, BCMA, EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 i PD1.
[0035] Treća komponenta za multispecifične vezujuće proteine vezuje se za ćelije koje eksprimuju CD16, Fc receptor na površini leukocita, uklјučujući prirodne ćelije ubice, makrofage, neutrofile, eozinofile, mastocite i folikularne dendritske ćelije.
[0036] Multispecifični vezujući proteini mogu da imaju nekoliko formata kao što je prikazano u primerima ispod, ali nisu ograničeni na njih. Jedan format je heterodimerno, multispecifično antitelo koje uklјučuje prvi teški lanac imunoglobulina, drugi teški lanac imunoglobulina i laki lanac imunoglobulina. Prvi teški lanac imunoglobulina uklјučuje prvi Fc (zglob-CH2-CH3) domen, prvi varijabilni domen teškog lanca i opciono prvi domen teškog lanca CH1. Laki lanac imunoglobulina uklјučuje varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca; zajedno sa prvim teškim lancem imunoglobulina, laki lanac imunoglobulina formira mesto za vezivanje antigena koje vezuje NKG2D. Drugi teški lanac imunoglobulina sadrži drugi Fc (zglob-CH2-CH3) domen, drugi varijabilni domen teškog lanca i opciono drugi domen teškog lanca CH1 koji se može upariti sa lakim lancem imunoglobulina identičnim onom koji se uparuje sa prvim teškim lancem imunoglobulina, osim što se kada je laki lanac imunoglobulina uparen sa drugim teškim lancem imunoglobulina, nastalo mesto vezivanja antigena vezuje za tumorski antigen. Prvi Fc domen i drugi Fc domen zajedno mogu da se vežu za CD16 (Sl.1).
[0037] Drugi primerni format uklјučuje heterodimerno, multispecifično antitelo koje uklјučuje prvi teški lanac imunoglobulina, laki lanac imunoglobulina i drugi teški lanac imunoglobulina. Prvi teški lanac imunoglobulina uklјučuje prvi Fc (zglob-CH2-CH3) domen fuzionisan ili preko linkera ili pokretljive veze (zgloba) antitela sa jednim lancem Fv (scFv) koji vezuje NKG2D. Različiti linkeri se mogu koristiti za povezivanje scFv sa prvim Fc domenom ili unutar samog scFv. Pored toga, scFv može da inkorporira mutacije koje omogućavaju formiranje disulfidne veze za stabilizaciju ukupne strukture scFv. ScFv, takođe, može da inkorporira mutacije za modifikaciju izoelektrične tačke ukupnog prvog teškog lanca imunoglobulina i/ili da omogući lakše prečišćavanje nizvodno. Drugi teški lanac imunoglobulina uklјučuje drugi Fc (zglob-CH2-CH3) domen i drugi varijabilni domen teškog lanca i opciono drugi CH1 domen teškog lanca. Laki lanac imunoglobulina uklјučuje varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca. Drugi teški lanac imunoglobulina se uparuje sa lakim lancem imunoglobulina i vezuje se za tumorski antigen. Prvi Fc domen i drugi Fc domen zajedno mogu da se vežu za CD16 (Sl.2).
[0038] Alternativni format heterodimernih multispecifičnih proteina uklјučuje prvi teški lanac imunoglobulina, drugi teški lanac imunoglobulina, prvi laki lanac imunoglobulina i drugi laki lanac imunoglobulina. Prvi teški lanac imunoglobulina uklјučuje prvi Fc (zglob-CH2-CH3) domen, prvi varijabilni domen teškog lanca i opciono prvi domen teškog lanca CH1. Prvi laki lanac imunoglobulina uklјučuje varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca. Zajedno sa prvim teškim lancem imunoglobulina, prvi laki lanac imunoglobulina formira mesto vezivanja antigena koje vezuje tumorski antigen. Drugi teški lanac imunoglobulina sadrži drugi Fc (zglob-CH2-CH3) domen, drugi varijabilni domen teškog lanca i opciono drugi domen teškog lanca CH1. Drugi laki lanac imunoglobulina uklјučuje varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca. Zajedno sa drugim teškim lancem imunoglobulina, laki lanac imunoglobulina formira mesto vezivanja antigena koje se vezuje za isti tumorski antigen. Drugi teški lanac imunoglobulina može da se upari sa lakim lancem imunoglobulina, koji može biti identičan lakom lancu imunoglobulina koji se uparuje sa prvim teškim lancem imunoglobulina, osim što kada je laki lanac imunoglobulina uparen sa drugim teškim lancem imunoglobulina, dobijeno mesto vezivanja antigena je drugo mesto vezivanja antigena koje se vezuje za tumorski antigen. U određenim realizacijama, prvi Fc domen i drugi Fc domen zajedno mogu da se vežu za CD16 (Sl.1).
[0039] Jedan ili više dodatnih motiva vezivanja mogu biti fuzionisani za C-kraj CH3 domena konstantnog regiona, opciono preko sekvence linkera. U određenim realizacijama, mesto vezivanja antigena može biti jednolančani ili disulfid-stabilizovani varijabilni region (ScFv) ili može formirati tetravalentni ili trovalentni molekul.
[0040] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u obliku Triomaba, koji je trofunkcionalno, bispecifično antitelo koje održava oblik sličan IgG. Ova himera se sastoji od dva poluantitela, svako sa jednim lakim i jednim teškim lancem, koja potiču od dva roditelјska antitela.
[0041] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je oblik KiH zajedničkog lakog lanca (LC), koji uklјučuje tehnologiju kvržica u rupu (knobs-into-holes - KIHs). KIH uklјučuje inžinjering CH3 domena da stvore ili „kvržicu” ili „rupu” u svakom teškom lancu da bi se pospešila heterodimerizacija. Koncept iza Fc tehnologije „kvržica u rupu (KiH)” bio je da se uvede „kvržica” u jedan CH3 domen (CH3A) zamenom malog ostatka sa glomaznim (tj. T366WCH3Au EU numeraciji). Da bi se prilagodila „kvržica”, komplementarna površina „rupe” je stvorena na drugom CH3 domenu (CH3B) zamenom najbližih susednih ostataka kvržici sa manjim (tj. T366S/L368A/Y407VCH3B). Mutacija „rupe” je optimizovana skriningom strukturirano vođene biblioteke faga (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J Mol Biol (1997) 270(1):26-35). Rendgenske kristalne strukture KiH Fc varijanti (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, et al., Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J Mol Biol (2014) 426(9): 1947-57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs. Mol Immunol (2014) 58(1):132-8) su pokazale da je heterodimerizacija termodinamički favorizovana hidrofobnim interakcijama pokretanim steričnom komplementarnošću na interfejsu jezgra inter-CH3 domena, dok interfejsi kvržicakvržica i interfejsi rupa-rupa ne favorizuju homodimerizaciju zbog sterične smetnje i prekida povolјnih interakcija, redom.
[0042] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u obliku imunoglobulina sa dvostrukom varijabilnom domenom (DVD-Ig™), koji kombinuje cilјne domene vezivanja dva monoklonska antitela preko fleksibilnih linkera koji se javlјaju u prirodi, i daje tetravalentni molekul sličan IgG.
[0043] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u obliku Ortogonalnog Fab interfejsa (Orto-Fab). U orto-Fab IgG pristupu (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al. Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32(2): 191-8), regionalni dizajn zasnovan na strukturi uvodi komplementarne mutacije na LC i HCVH-CH1interfejs samo u jednom Fab-u, bez ikakvih promena u drugom Fab-u.
[0044] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u formatu 2 in1 Ig. U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u ES obliku, koji je heterodimerni konstrukt koji sadrži 2 različita Fab-a koja se vezuju za cilј 1 i cilј 2 fuzionisane za Fc. Heterodimerizacija je obezbeđena elektrostatičkim mutacijama upravlјanja u Fc. U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u obliku κ λ-tela, koji je heterodimerni konstrukt sa 2 različita Faba fuzionisana sa Fc stabilizovanim heterodimerizacionim mutacijama: Fab1 ciljajući antigen 1 sadrži kapa LC, dok drugi Fab ciljajući antigen 2 sadrži lambda LC. Sl. 13A je ogledni prikaz jednog oblika κ λ-tela; Sl. 13B je ogledni prikaz drugog κ λ-tela.
[0045] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u obliku razmene Fab krakova (antitela koja razmenjuju Fab krakove zamenom teškog lanca i pričvršćenog lakog lanca (polumolekula) sa parom teškog lakog lanca iz drugog molekula, što dovodi do bispecifičnih antitela). U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u obliku SEED tela (platforma domena sa razmenom lanaca (SEED) dizajnirana je da generiše asimetrične i bispecifične molekule slične antitelu, sposobnost koja proširuje terapeutske primene prirodnih antitela. Ova platforma dizajnirana za proteine zasniva se na razmeni strukturno povezanih sekvenci imunoglobulina unutar očuvanih CH3 domena. Dizajn SEED omogućava efikasno generisanje AG/GA heterodimera, dok ne favorizuje homodimerizaciju AG i GA SEED CH3 domena. (Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54)). U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u LuZ-Y obliku, u kome se leucinski zatvarač koristi da indukuje heterodimerizaciju dva različita HC. (Wranik, BJ. et al., J. Biol. Chem. (2012), 287:43331-9).
[0046] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u obliku Cov-X-tela (u bispecifičnim Cov-X-telima, dva različita peptida su spojena zajedno korišćenjem razgranatog azetidinonskog linkera i fuzionisana sa skelom antitela pod blagim uslovima na način specifičan za mesto. Dok su farmakofori odgovorni za funkcionalne aktivnosti, skela antitela daje dug poluživot i distribuciju sličnu Ig. Farmakofori mogu biti hemijski optimizovani ili zamenjeni drugim farmakoforima da bi se generisala optimizovana ili jedinstvena bispecifična antitela. (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52);22611-22616).
[0047] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u Oasc-Fab heterodimernom obliku koji uklјučuje Fab vezivanje za cilј 1 i vezivanje scFab za cilј 2 fuzionisane za Fc. Heterodimerizacija je obezbeđena mutacijama u Fc.
[0048] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u obliku DuetMab-a, koji je heterodimerni konstrukt koji sadrži 2 različita Fab-a koja se vezuju za antigen 1 i 2 i Fc stabilizovan heterodimerizacionim mutacijama. Fab 1 i 2 sadrže diferencijalne S-S mostove koji obezbeđuju ispravno LC i HC uparivanje.
[0049] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u CrossmAb obliku, koji je heterodimerni konstrukt sa 2 različita Fab-a vezana za cilј 1 i 2 fuzionisane za Fc stabilizovan heterodimerizacijom. CL i CH1 domeni i VH i VL domeni su zamenjeni, na primer, CH1 je spojen u liniji sa VL, dok je CL spojen u liniji sa VH.
[0050] U nekim realizacijama, multispecifični vezujući protein je u Fit-Ig obliku, koji je homodimerni konstrukt gde je Fab vezivanje za antigen 2 fuzionisano za N kraj HC Fab-a koji se vezuje za antigen 1. Konstrukt sadrži Fc divlјeg tipa.
[0051] Tabela 1 navodi peptidne sekvence varijabilnih domena teškog lanca i varijabilnih domena lakog lanca koji se, u kombinaciji, mogu vezati za NKG2D.
[0052] Alternativno, varijabilni domen teškog lanca definisan sa SEQ ID NO:69 može biti uparen sa varijabilnim domenom lakog lanca definisanim sa SEQ ID NO:70 da bi se formiralo mesto za vezivanje antigena koje se može vezati za NKG2D, kao što je prikazano u US 9,273,136.
SEQ ID NO:69
[0053] Alternativno, varijabilni domen teškog lanca definisan sa SEQ ID NO:71 može biti uparen sa varijabilnim domenom lakog lanca definisanim sa SEQ ID NO:72 da bi se formiralo mesto za vezivanje antigena koje se može vezati za NKG2D, kao što je prikazano u US 7,879,985.
SEQ ID NO:71
SEQ ID NO:72
[0054] U okviru Fc domena, CD16 vezivanje je posredovano regionom pokretne veze i CH2 domenom. Na primer, unutar humanog IgG1, interakcija sa CD16 je prvenstveno fokusirana na aminokiselinske ostatke Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 i ostatak uglјenih hidrata N-acetil-D-glukozamin u CH2 domenu (videti, Sondermann et al, Nature, 406(6793):267-273). Na osnovu poznatih domena, mutacije mogu da se izaberu da pobolјšaju ili smanje afinitet vezivanja za CD 16, kao što je korišćenje biblioteka sa prikazanim fagom ili cDNK biblioteka koje su prikazane na površini kvasca, ili se mogu dizajnirati na osnovu poznate trodimenzionalne strukture interakcija.
[0055] Sastavlјanje teških lanaca heterodimernih antitela može se postići ekspresijom dve različite sekvence teškog lanca antitela u istoj ćeliji, što može dovesti do sklapanja homodimera svakog teškog lanca antitela, kao i sastavlјanja heterodimera. Pospešivanje preferencijalnog sastavlјanja heterodimera može se postići ugrađivanjem različitih mutacija u CH3 domenu svakog konstantnog regiona teškog lanca antitela. Na primer, mutacije se mogu napraviti u CH3 domenu na osnovu humanog IgG1 i inkorporacijom različitih parova supstitucija amino-kiselina unutar prvog polipeptida i drugog polipeptida koji omogućavaju ova dva lanca da se selektivno heterodimerizuju jedan sa drugim. Pozicije supstitucija amino-kiselina koje su prikazane u daljem tekstu su sve numerisane prema EU indeksu kao u Kabatu.
[0056] U jednom scenariju, supstitucija amino-kiseline u prvom polipeptidu zamenjuje originalnu amino-kiselinu većom amino-kiselinom, izabranom iz arginina (R), fenilalanina (F), tirozina (Y) ili triptofana (W) i najmanje jedna supstitucija amino-kiseline u drugom polipeptidu zamenjuje originalnu amino-kiselinu(e) manjom(im) amino-kiselinom(ama), izabranom iz alanina (A), serina (S), treonina (T) ili valina (V), tako da se veća supstitucija amino-kiselina (izbočina) uklapa u površinu manjih supstitucija amino-kiselina (šuplјinu). Na primer, jedan polipeptid može da uklјuči supstituciju T366W, a drugi može da uklјuči tri supstitucije uklјučujući T366S, L368A i Y407V.
[0057] Varijabilni domen teškog lanca antitela prema pronalasku može opciono biti kupkovan na sekvencu aminokiselina koja je najmanje 90% identična konstantnom regionu antitela, kao što je IgG konstantni region uklјučujući zglobne, CH2 i CH3 domene sa ili bez CH1 domena. U nekim realizacijama, sekvenca amino-kiselina konstantnog regiona je najmanje 90% identična konstantnom regionu humanog antitela, kao što je konstantni region humanoh IgG1, konstantni region IgG2, konstantni region IgG3 ili konstantni region IgG4. U nekim drugim realizacijama, sekvenca amino-kiselina konstantnog regiona je najmanje 90% identična konstantnom regionu antitela drugog sisara, kao što je zec, pas, mačka, miš ili konj. Jedna ili više mutacija mogu biti ugrađene u konstantni region u poređenju sa konstantnim regionom humanog IgG1, na primer na Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 i/ili K439. Primeri supstitucija uklјučuju, na primer, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D i K439E.
[0058] U određenim realizacijama, mutacije koje se mogu inkorporirati u CH1 konstantnog regiona humanog IgG1 mogu biti na amino-kiselini V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171, i/ili V173. U određenim realizacijama, mutacije koje se mogu ugraditi u C κ konstantnog regiona humanog IgG1 mogu biti na amino-kiselini E123, F116, S176, V163, S174 i/ili T164.
[0059] Alternativno, supstitucije amino-kiselina se mogu izabrati iz sledećih skupova supstitucija prikazanih u Tabeli 2.
[0060] Alternativno, supstitucije amino-kiselina se mogu izabrati iz sledećih skupova supstitucija prikazanih u Tabeli 3.
[0061] Alternativno, supstitucije amino-kiselina se mogu izabrati iz sledećeg skupa supstitucija prikazanih u Tabeli 4.
[0062] Alternativno, najmanje jedna amino-kiselinska supstitucija u svakom polipeptidnom lancu može biti izabrana iz Tabele 5.
[0063] Alternativno, najmanje jedna supstitucija amino-kiselina može biti izabrana iz sledećeg skupa supstitucija u Tabeli 6, gde se pozicija(e) naznačena u koloni prvog polipeptida zamenjuje bilo kojom poznatom negativno naelektrisanom amino-kiselinom, a pozicija(e) naznačena u koloni drugog polipeptida je zamenjena bilo kojom poznatom pozitivno naelektrisanom amino-kiselinom.
[0064] Alternativno, najmanje jedna supstitucija amino-kiselina može da se izabere iz sledećeg skupa u Tabeli 7, gde se pozicija(e) naznačena u koloni prvog polipeptida zamenjuje bilo kojom poznatom pozitivno naelektrisanom aminokiselinom, a pozicija(e) naznačena u koloni drugog polipeptida je zamenjen bilo kojom poznatom negativno naelektrisanom amino-kiselinom.
[0065] Alternativno, supstitucije amino-kiselina mogu se izabrati iz sledećeg skupa u Tabeli 8.
[0066] Alternativno, ili kao dodatak, strukturna stabilnost heteromultimernog proteina može se povećati uvođenjem S354C na bilo koji od prvog ili drugog polipeptidnog lanca, i Y349C na suprotni polipeptidni lanac, koji formira veštački disulfidni most unutar interfejsa dva polipeptida.
[0067] Višespecifični proteini opisani gore mogu biti napravlјeni korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK koja je dobro poznata stručnjaku u tehnici. Na primer, prva sekvenca nukleinske kiseline koja kodira prvi teški lanac imunoglobulina može biti klonirana u prvi ekspresioni vektor; druga sekvenca nukleinske kiseline koja kodira drugi teški lanac imunoglobulina može biti klonirana u drugi ekspresioni vektor; treća sekvenca nukleinske kiseline koja kodira laki lanac imunoglobulina može biti klonirana u treći ekspresioni vektor; prvi, drugi i treći ekspresioni vektori mogu biti stabilno transfektovani zajedno u ćelije domaćina da bi se proizveli multimerni proteini.
[0068] Da bi se postigao najveći prinos multispecifičnog proteina, mogu se istražiti različiti odnosi prvog, drugog i trećeg ekspresionog vektora da bi se odredio optimalni odnos za transfekciju u ćelije domaćina. Posle transfekcije, pojedinačni klonovi se mogu izolovati za stvaranje banke ćelija korišćenjem postupaka poznatih u tehnici, kao što su ograničeno razblaživanje, ELISA, FACS, mikroskopija ili Clonepix.
[0069] Klonovi se mogu uzgajati u uslovima pogodnim za povećanje veličine bioreaktora i održavanje ekspresije multispecifičnog proteina. Multispecifični proteini se mogu izolovati i prečistiti korišćenjem postupaka poznatih u tehnici, uklјučujući centrifugiranje, dubinsku filtraciju, lizu ćelija, homogenizaciju, zamrzavanje-odmrzavanje, afinitetno prečišćavanje, gel filtraciju, jonsku hromatografiju, hromatografiju hidrofobnih interakcija i mešoviti režim hromatografija.
II. Karakteristike TriNKET-a
[0070] U određenim realizacijama, TriNKET-i opisani ovde, koji uklјučuju domen koji se vezuje za NKG2D i vezujući domen za antigen povezan sa tumorom, vezuju se za ćelije koje eksprimuju humani NKG2D. U određenim realizacijama, TriNKET-i, koji uklјučuju domen koji se vezuje za NKG2D i vezujući domen za antigen povezan sa tumorom, vezuju se za antigen povezan sa tumorom na nivou uporedivom sa onim monoklonskog antitela koje ima isti domen za vezivanje antigena povezan sa tumorom. Na primer, TriNKET-i koji uklјučuju domen koji se vezuje za NKG2D i domen koji se vezuje za HER2 iz Trastuzumaba mogu da se vežu za HER2 eksprimovan na ćelijama na nivou koji je uporediv sa onim kod Trastuzumaba.
[0071] Međutim, TriNKET-i opisani ovde su efikasniji u smanjenju rasta tumora i ubijanju ćelija raka.
Na primer, TriNKET predmetnog pronalaska koji cilјa na HER2 eksprimujuće ćelije tumora/raka je efikasniji od SC2.2 -jednolančanog bispecifičnog molekula izgrađenog od scFv dobijenog od trastuzumaba povezanog sa ULBP-6, ligandom za NKG2D. SC2.2 vezuje HER2+ ćelije raka i NKG2D+ NK ćelije istovremeno. Stoga je ispitana efikasnost SC2.2 u smanjenju broja HER2+ ćelija raka. In vitro testovi aktivacije i citotoksičnosti su pokazali da je SC2.2 efikasan u aktiviranju i ubijanju NK ćelija. Međutim, SC2.2 nije uspeo da pokaže efikasnost u RMA/S-HER2
modelu supkutanog tumora. Takođe je testirana efikasnost SC2.2 in vivo korišćenjem RMA/S-HER2 singenskog modela miša sa prekomernom ekspresijom. U ovom modelu miša, SC2.2 nije uspeo da pokaže kontrolu rasta tumora u poređenju sa kontrolom nosača. Dakle, iako je SC2.2 bio u stanju da aktivira i ubije NK ćelije i vezuje se za HER2+ ćelije raka, ova svojstva su bila nedovolјna da efikasno kontrolišu rast tumora HER2+.
[0072] U određenim realizacijama, TriNKET-i opisani ovde, koji uklјučuju domen koji se vezuje za NKG2D i vezujući domen za antigen povezan sa tumorom, aktiviraju primarne humane NK ćelije kada se kultivišu sa tumorskim ćelijama koje eksprimuju antigen. Aktivacija NK ćelija je obeležena povećanjem degranulacije CD107a i proizvodnje IFN γ citokina. Štaviše, u poređenju sa monoklonskim antitelom koje uklјučuje domen za vezivanje antigena povezan sa tumorom, TriNKET pokazuju superiornu aktivaciju humanih NK ćelija u prisustvu tumorskih ćelija koje eksprimuju antigen. Na primer, u poređenju sa monoklonskim antitelom trastuzumabom, TriNKET-i predmetnog pronalaska koji imaju domen koji se vezuje za HER2, imaju superiornu aktivaciju humanih NK ćelija u prisustvu ćelija raka koje eksprimuju HER2.
[0073] U određenim realizacijama, TriNKET-i opisani ovde, koji uklјučuju domen koji se vezuje za NKG2D i vezujući domen za antigen povezan sa tumorom, povećavaju aktivnost humanih NK ćelija u mirovanju i IL-2-aktiviranih u prisustvu tumorskih ćelija koje eksprimuju antigen. NK ćelije u mirovanju su pokazale manju proizvodnju IFN γ u pozadini i degranulaciju CD 107a nego IL-2-aktivirane NK ćelije. U određenim realizacijama, NK ćelije u mirovanju pokazuju veću promenu u proizvodnji IFN γ i degranulaciji CD107a u poređenju sa IL-2 aktiviranim NK ćelijama. U određenim realizacijama, IL-2-aktivirane NK ćelije pokazuju veći procenat ćelija koje postaju IFN γ+; CD107a+ nakon stimulacije sa TriNKET-ima.
[0074] U određenim realizacijama, TriNKET-i opisani ovde, koji uklјučuju domen koji se vezuje za NKG2D i vezujući domen za antigen povezan sa tumorom (neograničavajući primeri antigena povezanih sa tumorom, uklјučuju CD20, BCMA i HER2), povećavaju citotoksičnu aktivnost humanih NK ćelija u mirovanju i IL -2-aktiviranih u prisustvu tumorskih ćelija koje eksprimuju antigen. Štaviše, TriNKET-i (npr. A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET i F63-TriNKET), koji uklјučuju vezujući domen za antigen povezan sa tumorom (neograničavajući primeri antigena povezanih sa tumorom uklјučuju CD20, BCMA i HER2) snažnije direktne reakcije aktiviranih i NK ćelija u mirovanju protiv tumorskih ćelija, u poređenju sa monoklonskim antitelom koje uklјučuje isto mesto vezivanja antigena povezanog sa tumorom. U određenim realizacijama, TriNKET-i nude prednost u odnosu na tumorske ćelije koje eksprimuju srednje i niske tumorske antigene u poređenju sa monoklonskim antitelima koja uklјučuju isto mesto vezivanja tumorskog antigena. Stoga, terapija koja uklјučuje TriNKET može biti bolјa od terapije monoklonskim antitelima.
[0075] U određenim realizacijama, u poređenju sa monoklonalnim antitelima, TriNKET-i opisani ovde (npr. A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, i F63-TriNKET), koji uklјučuju vezujući domen za antigen povezan sa tumorom (neograničavajući primeri antigena povezanih sa tumorom uklјučuju CD20, BCMA i HER2) su korisni u lečenju raka sa visokom ekspresijom Fc receptora (FcR) ili raka koji se nalazi u tumorskom mikrookruženju sa visokim nivoima FcR. Monoklonska antitela ispolјavaju svoje efekte na rast tumora kroz više mehanizama uklјučujući ADCC, CDC, fagocitozu i blokadu signala, između ostalog. Među FcyR, CD16 ima najmanji afinitet za IgG Fc; FcyRI (CD64) je FcR visokog afiniteta, koji se vezuje oko 1000 puta jače za IgG Fc od CD 16. CD64 je normalno eksprimovan u mnogim hematopoetskim linijama, kao što je mijeloidna loza, i može se eksprimirati na tumorima koji potiču od ovih tipova ćelija, kao što je akutna mijeloidna leukemija (AML). Imunske ćelije koje se infiltriraju u tumor, kao što su MDSC i monociti, takođe eksprimuju CD64 i poznato je da infiltriraju mikrookruženje tumora. Ekspresija CD64 od strane tumora ili u mikrookruženju tumora može imati štetan efekat na terapiju monoklonskim antitelima. Ekspresija CD64 u mikrookruženju tumora otežava ovim antitelima da angažuju CD16 na površini NK ćelija, pošto antitela više vole da vezuju receptor visokog afiniteta. TriNKET-i, cilјanjem na dva aktivirajuća receptora na površini NK ćelija, mogu da prevaziđu štetan efekat ekspresije CD64 (bilo na tumoru ili tumorskom mikrookruženju) na terapiju monoklonskim antitelima. Bez obzira na ekspresiju CD64 na tumorskim ćelijama, TriNKET su u stanju da posreduju u odgovorima humanih NK ćelija protiv svih tumorskih ćelija, jer dvostruko cilјanje dva aktivirajuća receptora na NK ćelije obezbeđuje jače specifično vezivanje za NK ćelije.
[0076] U nekim realizacijama, TriNKET-i opisani ovde (npr. A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET i F63-TriNKET), koji uklјučuju vezujući domen za antigen povezan sa tumorom (neograničavajući primeri antigena povezanih sa tumorom uklјučuju CD20, BCMA i HER2) imaju bolјi bezbednosni profil kroz smanjene neželјene efekte na cilju van tumora. I prirodne ćelije ubice i CD8 T ćelije su sposobne da direktno lizuju tumorske ćelije, iako se razlikuju mehanizmi preko kojih NK ćelije i CD8 T ćelije prepoznaju svoje normalne ćelijske od tumorskih ćelija. Aktivnost NK ćelija je regulisana balansom signala aktivacionih (NCR, NKG2D, CD16, itd.) i inhibitornih (KIR, NKG2A, itd.) receptora. Ravnoteža ovih aktivirajućih i inhibitornih signala omogućava NK ćelijama da odrede sopstvene zdrave ćelije od stresnih, virusno inficiranih ili transformisanih sopstvenih ćelija. Ovaj ‘ugrađeni’ mehanizam samotolerancije će pomoći u zaštiti normalnog zdravog tkiva od odgovora NK ćelija. Da bi se proširio ovaj princip, samotolerancija NK ćelija će omogućiti TriNKET-ima da cilјaju antigene eksprimovane i na sebi i na tumoru bez neželјenih efekata van tumora, ili sa povećanim terapijskim okvirom. Za razliku od prirodnih ćelija ubica, T ćelije zahtevaju prepoznavanje specifičnog peptida predstavlјenog MHC molekulima za aktivaciju i efektorske funkcije. T ćelije su bile primarna meta imunoterapije, a razvijene su mnoge strategije za preusmeravanje odgovora T ćelija protiv tumora. Bispecifičnosti T ćelija, inhibitori kontrolnih tačaka i CAR-T ćelije su svi odobreni od strane FDA, ali često pate od toksičnosti koja ograničava dozu. Bispecifičnosti T ćelija i CAR-T ćelije rade na TCR-MHC sistemu za prepoznavanje korišćenjem domena vezivanja za cilјanje antigena na površini tumorskih ćelija i korišćenjem projektovanih signalnih domena za transdukciju aktivacionih signala u efektorske ćelije. Iako su efikasne u izazivanju antitumorskog imunološkog odgovora, ove terapije su često povezane sa sindromom oslobađanja citokina (CRS) i neželјenim efektima na cilju van tumora. TriNKET-i su jedinstveni u ovom kontekstu jer neće „nadjačati/premostiti” prirodne sisteme aktivacije i inhibicije NK ćelija. Umesto toga, TriNKET-i su dizajnirani da utiču na ravnotežu i obezbeđuju dodatne aktivacione signale NK ćelijama, istovremeno održavajući NK toleranciju prema sopstvenim zdravim ćelijama.
[0077] U nekim realizacijama, TriNKET-i opisani ovde uklјučuju domen koji se vezuje za NKG2D (npr. A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET i F63-TriNKET), koji uklјučuju vezujući domen za antigen povezan sa tumorom (neograničavajući primeri antigeni povezani sa tumorom uklјučujući CD20, BCMA i HER2) odlažu napredovanje tumora efikasnije od monoklonskih antitela koja uklјučuju isti domen koji se vezuje za tumorski antigen. U nekim realizacijama, TriNKET-i uklјučujući domen koji se vezuje za NKG2D i domen koji se vezuje za tumorski antigen su efikasniji protiv metastaza raka od monoklonskih antitela koja uklјučuju isti domen koji se vezuje za tumorski antigen.
[0078] Gornji opis opisuje više aspekata i realizacija pronalaska. Patentna prijava posebno razmatra sve kombinacije i permutacije aspekata i realizacija.
III. TERAPIJSKE PRIMENE
[0079] Pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje raka korišćenjem multispecifičnog vezujućeg proteina opisanog ovde (npr. A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET i F63-TriN-KET), koji uklјučuje vezujući domen za antigen povezan sa tumorom (neograničavajući primeri antigena povezanih sa tumorom uklјučuju CD20, BCMA i HER2) i/ili ovde opisanog farmaceutskog preparata. Postupci se mogu koristiti za lečenje različitih tipova raka, uklјučujući solidni tumor, limfom i leukemiju. Poželјno je da se tip raka koji se leči uskladi sa tipom ćelije raka za koju se vezuje multispecifični vezujući protein. Na primer, lečenje raka koji eksprimuje adhezioni molekula epitelnih ćelija (EpCAM), kao što je rak debelog creva koji eksprimuje EpCAM, poželјno je lečiti korišćenjem multispecifičnog vezujućeg proteina opisanog ovde koji se vezuje za multispecifični vezujući protein. Dodatni aspekti i realizacije terapijskih postupaka opisani su u daljem tekstu.
[0080] Shodno tome, jedan aspekt pronalaska obezbeđuje postupak lečenja raka kod pacijenta, pri čemu postupak obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno terapeutski efikasne količine multispecifičnog vezujućeg proteina opisanog ovde (npr. A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET i F63-TriNKET), koji uklјučuje vezujući domen za antigen povezan sa tumorom (neograničavajući primeri antigena povezanih sa tumorom uklјučuju CD20, BCMA i HER2) za lečenje raka. Primeri raka za lečenje uklјučuju solidni tumor, leukemiju i limfom.
[0081] Terapeutski postupak se može okarakterisati prema raku koji se leči. Na primer, u određenim rešenjima, rak je solidni tumor. U nekim drugim realizacijama, rak je rak mozga, rak mokraćne bešike, rak dojke, rak grlića materice, rak debelog creva, kolorektalni rak, rak endometrijuma, rak jednjaka, leukemija, rak pluća, rak jetre, melanom, rak jajnika, rak pankreasa, rak prostate, rak rektuma, rak bubrega, rak želuca, rak testisa ili rak materice. U još nekim rešenjima, rak je vaskularizovani tumor, karcinom skvamoznih ćelija, adenokarcinom, sitnoćelijski karcinom, melanom, gliom, neuroblastom, sarkom (npr. angiosarkom ili hondrosarkom), rak larinksa, rak parotida, rak žučnih kanala, rak štitaste žlezde, akralni lentiginozni melanom, aktinične keratoze, akutna limfocitna leukemija, akutna mijeloidna leukemija, adenoidni cistični karcinom, adenom, adenosarkom, adenoskvamozni karcinom, rak analnog kanala, analni rak, rak anorektuma, astrocitni tumor, karcinom Bartolinijeve žlezde, karcinom bazalnih ćelija, rak žuči, rak kostiju, rak kostne srži, rak bronhija, karcinom bronhijalne žlezde, karcinoid, holangiokarcinom, hondosarkom, papilom/karcinom horoidnog pleksusa, hronična limfocitna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, karcinom bistrih ćelija, rak vezivnog tkiva, cistadenom, rak digestivnog sistema, rak dvanaestopalačnog creva, rak endokrinog sistema, tumor endodermalnog sinusa, hiperplazija endometrijuma, stromalni sarkom endometrijuma, adenokarcinom endometrijuma, rak endotelnih ćelija, ependimalni rak, rak epitelnih ćelija, Juingov sarkom, rak oka i orbite, rak ženskih genitalnih organa, fokalna nodularna hiperplazija, rak žučne kese, rak antruma želuca, rak fundusa želuca, gastrinom, glioblastom, glukagonom, rak srca, hemangiblastomi, hemangioendoteliom, hemangiomi, adenom jetre, adenomatoza jetre, hepatobilijarni rak, hepatocelularni karcinom, Hočkinova bolest, rak ileuma, insulinom, intaepitelna neoplazija, interepitelna neoplazija skvamoznih ćelija, intrahepatični rak žučnog kanala, invazivni karcinom skvamoznih ćelija, rak jejunuma, rak zglobova, Kapošijev sarkom, rak karlice, krupnoćelijski karcinom, rak debelog creva, leiomiosarkom, lentigo maligi melanomi, limfom, rak muških genitalnih organa, maligni melanom, maligni mezotelni tumori, meduloblastom, meduloepiteliom, rak meningea, rak mezotela, metastatski karcinom, rak usta, mukoepidermoidni karcinom, multipli mijelom, rak mišića, rak nosnog trakta, rak nervnog sistema, neuroepitelni adenokarcinom nodularni melanom, neepitelni rak kože, ne-Hočkinov limfom, mikrocelularni karcinom pluća, oligodedrogliom, rak usne duplje, osteosarkom, papilarni serozni adenokarcinom, rak penisa, rak ždrela, tumori hipofize, plazmacitom, pseudosarkom, plućni blastom, rak rektuma, karcinom bubrežnih ćelija, rak respiratornog sistema, retinoblastom, rabdomiosarkom, sarkom, serozni karcinom, ra sinusa, rak kože, mikrocelularni karcinom, rak tankog creva, rak glatkih mišića, rak mekog tkiva, tumor koji luči somatostatin, rak kičme, karcinom skvamoznih ćelija, rak prugastih mišića, rak submezotela, melanom koji se površinski širi, leukemija T ćelija, rak jezika, nediferencirani karcinom, rak uretera, rak uretre, rak mokraćne bešike, rak urinarnog sistema, karcinom grlića materice, karcinom tela materice, melanom uvee, rak vagine, verukozni karcinom, VIPom, rak vulve, dobro diferencirani karcinom ili Vilmsov tumor.
[0082] U nekim drugim realizacijama, rak je ne-Hočkinov limfom, kao što je B-ćelijski limfom ili T-ćelijski limfom. U određenim realizacijama, ne-Hočkinov limfom je B-ćelijski limfom, kao što je difuzni B krupnoćelijski limfom, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom, folikularni limfom, mali limfocitni limfom, limfom ćelija omotača folikula (mantle ćelija), B-ćelijski limfom marginalne zone, B-ćelijski limfom ekstranodalne marginalne zone, limfom B-ćelija nodalne marginalne zone, B-ćelijski limfom marginalne zone slezine, Burkitov limfom, limfoplazmacitni limfom, leukemija vlasastih ćelija ili primarni limfom centralnog nervnog sistema (CNS). U nekim drugim realizacijama, ne-Hočkinov limfom je T-ćelijski limfom, kao što je prekursor T-limfoblastni limfom, periferni T-ćelijski limfom, kožni T-ćelijski limfom, angioimunoblastni T-ćelijski limfom, ekstranodalni limfom prirodnih ćelija ubica / T-ćelija, T-ćelijski limfom enteropatskog tipa, subkutanom pannikulitisu sličan T-ćelijski limfom, krupnoćelijski anaplastični limfom ili periferni T-ćelijski limfom.
[0083] Rak koji se leči može se okarakterisati na osnovu prisustva određenog antigena eksprimovanog na površini ćelije raka. U određenim realizacijama, ćelija raka eksprimuje jedno ili više od sledećeg: HER2, CD20, CD33, BCMA, EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 i PD1.
[0084] U određenim realizacijama, protein predmetnog pronalaska se koristi u postupku povećanja smrti tumorskih ćelija (sinonim za lizu, ubijanje, ablaciju, smanjenje preživlјavanja ili proliferaciju ćelija, i slično) direktno ili indirektno, ili proizvodnju leka za upotrebu u postupku povećanja smrti tumorskih ćelija (sinonim za lizu, ubijanje, ablaciju, smanjenje preživlјavanja ili proliferaciju ćelija, i slično) direktno ili indirektno, izlaganjem ćelije tumora ili raka i prirodnih ćelija ubica proteinu predmetnog pronalaska (npr. A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET i F63-TriNKET), koji uklјučuje vezujući domen za antigen povezan sa tumorom (neograničavajući primeri antigena povezanih sa tumorom uklјučuju CD20, BCMA i HER2). Tumorska ćelija koja reaguje na protein, kao što je gore opisano, eksprimuje antigen povezan sa tumorom za koji se vezuje drugo mesto vezivanja za antigen proteina. Na primer, u jednom primeru realizacije, C26-TriNKET-CD20 se koristi za cilјanje tumorske ćelije ili ćelije raka koja eksprimuje CD20 (bilo u mirovanju ili aktivirana); u drugom primernu realizacije, C26-TriNKET-BMCA se koristi za cilјanje tumora ili ćelije raka koja eksprimuje BMCA (bilo u mirovanju ili aktivirana).
[0085] U određenim realizacijama, protein predmetnog pronalaska se koristi u postupku lečenja raka kod subjekta kome je to potrebno, ili u proizvodnji leka za upotrebu u postupku lečenja raka kod subjekta kome je to potrebno, što uklјučuje davanje subjektu proteina ili formulacije koja uklјučuje protein predmetnog pronalaska (npr. A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET i F63-TriNKET), koji uklјučuju vezujući domen za antigen povezan sa tumorom (neograničavajući primeri antigena povezanih sa tumorom uklјučuju CD20, BCMA i HER2). Ćelija raka koja reaguje na protein, kao što je gore opisano, eksprimuje antigen povezan sa tumorom za koji se vezuje drugo mesto vezivanja za antigen proteina. Na primer, u jednom primeru realizacije, C26-TriNKET-CD20 se koristi za cilјanje ćelije raka koja ekspresuje CD20 (bilo u mirovanju ili aktivirana); u drugom primeru realizacije, C26-TriNKET-BMCA se koristi za cilјanje tumora ili ćelije raka koja eksprimuje BMCA (bilo u mirovanju ili aktivirana).
IV. KOMBINOVANA TERAPIJA
[0086] Drugi aspekt pronalaska obezbeđuje kombinovanu terapiju. Multispecifični vezujući proteini opisani ovde se koriste u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim sredstvima za lečenje raka.
[0087] Primeri terapeutskih sredstava koja se mogu koristiti kao deo kombinovane terapije u lečenju raka uklјučuju, na primer, zračenje, mitomicin, tretinoin, ribomustin, gemcitabin, vinkristin, etopozid, kladribin, mitobronitol, metotreksat, doksorubicin, karbokvon, pentokostatin, nitrakrin, zinostatin, cetroreliks, letrozol, raltitreksed, daunorubicin, fadrozol, fotemustin, timalfasin, sobuzoksan, nedaplatin, citarabin, bikalutamid, vinorelbin, vesnarinon, aminoglutetimid, amsakrin, proglumid, eliptinijum acetat, ketanserin, doksifluridin, etretinat, izotretinoin, streptozocin, nimustin, vindezin, flutamid, drogenil, butocin, karmofur, razoksan, sizofilan, karboplatin, mitolaktol, tegafur, ifosfamid, prednimustin, picibanil, levamisol, tenipozid, improsulfan, enocitabin, lizurid, oksimetolon, tamoksifen, progesteron, mepitiostan, epitiostanol, formestan, interferon-alfa, interferon-2 alfa, interferon-beta, interferon-gama, faktor stimulacije kolonija 1, faktor stimulacije kolonija 2, denileukin diftitoks, interleukin 2, faktor oslobađanja luteinizirajućeg hormona i varijacije gore pomenutih sredstava koje mogu pokazati diferencijalno vezivanje za svoj srodni receptor, i povećan ili smanjen poluživot u serumu.
[0088] Dodatna klasa sredstava koja se mogu koristiti kao deo kombinovane terapije u lečenju raka su inhibitori imunoloških kontrolnih tačaka. Primeri inhibitora imunološke kontrolne tačke uklјučuju sredstva koja inhibiraju jedan ili više od (i) antigena 4 povezanog sa citotoksičnim T-limfocitom (CTLA4), (ii) proteina programirane ćelijske smrti 1 (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG3, (v) B7-H3, (vi) B7-H4, i (vii) TIM3. CTLA4 inhibitor ipilimumab je odobrila Američka uprava za hranu i lekove (FDA) za lečenje melanoma.
[0089] Ipak, druga sredstva koja se mogu koristiti kao deo kombinovane terapije u lečenju raka su sredstva monoklonskih antitela koji cilјaju ciljeve bez kontrolne tačke (npr. herceptin) i ne-citotoksična sredstva (npr. inhibitori tirozin-kinaze). [0090] Još neke kategorije sredstava protiv raka uklјučuju, na primer: (i) inhibitor izabran iz inhibitora ALK, inhibitora ATR, antagonista A2A, inhibitora popravke baze ekscizije, inhibitora Bcr-Abl tirozin kinaze, inhibitora Brutonove tirozin kinaze, inhibitora CDC7, inhibitora CHK1, inhibitora kinaze zavisne od ciklina, inhibitora DNK-PK, inhibitora i DNK-PK i mTOR, inhibitora DNMT1, inhibitora DNMT1 plus 2-hloro-deoksiadenozin, inhibitora HDAC, inhibitora signalnog puta ježa, inhibitora IDO, inhibitora JAK, inhibitora mTOR, inhibitora MEK, inhibitora MELK, inhibitora MTH1, inhibitora PARP, inhibitora fosfoinozitid 3 kinaze, inhibitora i PARP1 i DHODH, inhibitora proteazoma, inhibitora topoizomeraze-II, inhibitora tirozin kinaze, inhibitora VFREG i inhibitora WEE1; (ii) agonista OX40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 ili ICOS; i (iii) citokina izabran iz IL-12, IL-15, GM-CSF i G-CSF.
[0091] Proteini pronalaska se, takođe, mogu koristiti kao dodatak hirurškom uklanjanju primarne lezije.
[0092] Količina multispecifičnog vezujućeg proteina i dodatnog terapeutskog sredstva i relativno vreme primene mogu biti odabrani da bi se postigao želјeni kombinovani terapeutski efekat. Na primer, kada se primenjuje kombinovana terapija pacijentu kome je potrebna takva terapija, terapeutska sredstva u kombinaciji, ili farmaceutska kompozicija ili kompozicije koje sadrže terapeutska sredstva, mogu se administrirati bilo kojim redosledom kao što je, na primer, uzastopno, istovremeno, zajedno, odjednom i sl. Dalјe, na primer, multispecifični vezujući protein se može davati tokom vremena kada dodatno terapeutsko sredstvo(a) ispolјava(ju) svoj profilaktički ili terapeutski efekat, ili obrnuto.
V. FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE
[0093] Predmetni pronalazak, takođe, obuhvata farmaceutske kompozicije koje sadrže terapeutski efikasnu količinu proteina koji je ovde opisan (npr. A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET i F63-TriNKET), koji uklјučuje vezivanje domena za antigen povezan sa tumorom (neograničavajući primeri antigena povezanih sa tumorom uklјučuju CD20, BCMA i HER2). Kompozicija se može formulisati za upotrebu u različitim sistemima za isporuku lekova. Jedan ili više fiziološki prihvatlјivih ekscipijenasa ili nosača, takođe, mogu biti uklјučeni u kompoziciju za odgovarajuću formulaciju. Pogodne formulacije za upotrebu u predmetnom pronalasku nalaze se u Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985. Za kratak pregled postupaka za isporuku lekova, videti, npr. Langera (Science 249:1527-1533, 1990).
[0094] Formulacija za intravensko davanje leka prema predmetnom pronalasku može se nalaziti u vrećici, olovci ili špricu. U određenim realizacijama, vrećica može biti povezana sa kanalom koji sadrži cev i/ili iglu. U određenim realizacijama, formulacija može biti liofilizovana formulacija ili tečna formulacija. U određenim realizacijama, formulacija može da se osuši zamrzavanjem (liofilizovana) i da se nalazi u oko 12-60 bočica. U određenim realizacijama, formulacija može biti sušena zamrzavanjem i 45 mg liofilizovane formulacije se može nalaziti u jednoj bočici. U određenim realizacijama, oko 40 mg - oko 100 mg zamrzavanjem sušene formulacije se može nalaziti u jednoj bočici. U određenim realizacijama, liofilizovana formulacija iz 12, 27 ili 45 bočica se kombinuje da bi se dobila terapeutska doza proteina u intravenoznoj formulaciji leka. U određenim realizacijama, formulacija može biti tečna formulacija i uskladištena kao oko 250 mg/bočici do oko 1000 mg/bočici. U određenim realizacijama, formulacija može biti tečna formulacija i uskladištena kao oko 600 mg/bočici. U određenim realizacijama, formulacija može biti tečna formulacija i uskladištena kao oko 250 mg/bočici.
[0095] Ovaj predmetni pronalazak može da postoji u tečnoj vodenoj farmaceutskoj formulaciji uklјučujući terapeutski efikasnu količinu proteina u puferovanom rastvoru koji formira formulaciju.
[0096] Ove kompozicije mogu biti sterilisane konvencionalnim tehnikama sterilizacije, ili mogu biti sterilno filtrirane. Dobijeni vodeni rastvori se mogu pakovati za upotrebu kao što jesu ili liofilizovani, pri čemu se liofilizovani preparat kombinuje sa sterilnim vodenim nosačem pre primene. pH preparata će obično biti između 3 i 11, poželјnije između 5 i 9 ili između 6 i 8, a najpoželјnije između 7 i 8, kao što je 7 do 7.5. Dobijene kompozicije u čvrstom obliku mogu biti upakovane u višestruke pojedinačne dozne jedinice, od kojih svaka sadrži fiksnu količinu gore pomenutog sredstva ili sredstava. Kompozicija u čvrstom obliku, takođe, može biti upakovana u kontejner za fleksibilnu količinu.
[0097] U određenim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje formulaciju sa produženim rokom trajanja koja uklјučuje protein iz predmetnog pronalaska, u kombinaciji sa manitolom, limunskom kiselinom monohidratom, natrijum citratom, dinatrijum fosfat dihidratom, natrijum dihidrogen fosfat dihidratom, natrijum hloridom, polisorbatom 80, vodom i natrijum hidroksidom.
[0098] U određenim realizacijama, vodena formulacija je pripremlјena uklјučujući protein prema predmetnom pronalasku u pH-puferisanom rastvoru. Pufer predmetnog pronalaska može imati pH u rasponu od oko 4 do oko 8, npr. od oko 4.5 do oko 6.0, ili od oko 4.8 do oko 5.5, ili može imati pH od oko 5.0 do oko 5.2. Rasponi srednjih vrednosti od gore navedenih pH vrednosti su, takođe, namenjeni da budu deo predmetnog pronalaska. Na primer, trebalo bi da budu uklјučeni rasponi vrednosti koji koriste kombinaciju bilo koje od gore navedenih vrednosti kao gornje i/ili donje granice. Primeri pufera koji će kontrolisati pH unutar ovog raspona uklјučuju acetat (npr. natrijum acetat), sukcinat (kao što je natrijum sukcinat), glukonat, histidin, citrat i druge pufere organske kiseline.
[0099] U određenim realizacijama, formulacija uklјučuje puferski sistem koji sadrži citrat i fosfat za održavanje pH vrednosti u rasponu od oko 4 do oko 8. U određenim realizacijama, pH raspon može biti od oko 4.5 do oko 6.0, ili od oko pH 4.8 do oko 5.5, ili u pH rasponu od oko 5.0 do oko 5.2. U određenim realizacijama, puferski sistem uklјučuje monohidrat limunske kiseline, natrijum citrat, dinatrijum fosfat dihidrat i/ili natrijum dihidrogen fosfat dihidrat. U određenim realizacijama, puferski sistem uklјučuje oko 1,3 mg/ml limunske kiseline (npr. 1.305 mg/ml), oko 0,3 mg/ml natrijum citrata (npr.0.305 mg/ml), oko 1,5 mg/ml dinatrijum fosfat dihidrata (npr. 1,53 mg/ml), oko 0,9 mg/ml natrijum dihidrogen fosfat dihidrata (npr. 0,86) i oko 6,2 mg/ml natrijum hlorida (npr. 6,165 mg/ml). U određenim realizacijama, puferski sistem uklјučuje 1-1,5 mg/ml limunske kiseline, 0,25 do 0,5 mg/ml natrijum citrata, 1,25 do 1,75 mg/ml dinatrijum fosfat dihidrata, 0,7 do 1,1 mg/ml natrijum dihidrogen fosfat dihidrata, i 6,0 do 6,4 mg/ml natrijum hlorida. U određenim realizacijama, pH formulacije se podešava natrijum hidroksidom.
[0100] Poliol, koji deluje kao tonifikator i može da stabilizuej antitelo, takođe, može da bude uklјučen u formulaciju. Poliol se dodaje formulaciji u količini koja može da varira u odnosu na želјenu izotoničnost formulacije. U određenim realizacijama, vodena formulacija može biti izotonična. Količina dodatog poliola, takođe, može da bude promenjena u odnosu na molekulsku masu poliola. Na primer, može se dodati manja količina monosaharida (npr. manitola), u poređenju sa disaharidom (kao što je trehaloza). U određenim realizacijama, poliol koji se može koristiti u formulaciji kao sredstvo za toničnost je manitol. U određenim realizacijama, koncentracija manitola može da bude od oko 5 do oko 20 mg/ml. U određenim realizacijama, koncentracija manitola može da bude oko 7,5 do 15 mg/ml. U određenim realizacijama, koncentracija manitola može da bude oko 10-14 mg/ml. U određenim realizacijama, koncentracija manitola može da bude oko 12 mg/ml. U određenim realizacijama, poliol sorbitol može da bude uklјučen u formulaciju.
[0101] Formulaciji se, takođe, može dodati detergent ili surfaktant. Primeri detergenata uklјučuju nejonske detergente kao što su polisorbati (npr. polisorbati 20, 80 itd.) ili poloksameri (npr. poloksamer 188). Količina detergenta je takva da smanjuje agregaciju formulisanog antitela i/ili minimizira formiranje čestica u formulaciji i/ili smanjuje adsorpciju. U određenim realizacijama, formulacija može da sadrži surfaktant koji je polisorbat. U određenim realizacijama, formulacija može da sadrži detergent polisorbat 80 ili Tween 80. Tween 80 je izraz koji se koristi da opiše polioksietilen (20) sorbitanmonooleat (videti Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th ed., 1996). U određenim realizacijama, formulacija može da sadrži između oko 0,1 mg/mL i oko 10 mg/mL polisorbata 80, ili između oko 0,5 mg/mL i oko 5 mg/mL. U određenim realizacijama, oko 0,1% polisorbata 80 se može dodati u formulaciju.
[0102] U realizacijama, proteinski proizvod predmetnog pronalaska je formulisan kao tečna formulacija. Tečna formulacija može da bude predstavlјena u koncentraciji od 10 mg/mL u USP / Ph Eur tip I 50R bočici zatvorenoj gumenim čepom i zapečaćenoj aluminijumskim zatvaračem. Čep može da bude napravlјen od elastomera u skladu sa USP i Ph Eur. U određenim realizacijama, bočice se mogu napuniti sa 61,2 mL rastvora proteinskog proizvoda da bi se omogućila ekstrahovana zapremina od 60 mL. U određenim realizacijama, tečna formulacija može da se razblaži sa 0,9% rastvorom soli.
[0103] U određenim realizacijama, tečna formulacija prema pronalasku može da bude pripremlјena kao rastvor koncentracije 10 mg/mL u kombinaciji sa šećerom na nivoima stabilizacije. U određenim realizacijama, tečna formulacija se može pripremiti u vodenom nosaču. U određenim realizacijama, stabilizator se može dodati u količini ne većoj od one koja može dovesti do nepoželјnog ili nepogodnog viskoziteta za intravensko administriranje. U određenim realizacijama, šećer može da bude disaharid, npr. saharoza. U određenim realizacijama, tečna formulacija može, takođe, da sadrži jedan ili više od puferskih sredstava, surfaktanta i konzervansa.
[0104] U određenim realizacijama, pH tečne formulacije se može podesiti dodavanjem farmaceutski prihvatlјive kiseline i/ili baze. U određenim realizacijama, farmaceutski prihvatlјiva kiselina može da bude hlorovodonična kiselina. U određenim realizacijama, baza može da bude natrijum hidroksid.
[0105] Pored agregacije, deamidacija je uobičajena varijanta proizvoda peptida i proteina koji se mogu javiti tokom fermentacije, sakupljanja/pročišćavanja ćelija, prečišćavanja, skladištenja lekovite supstance / proizvoda leka i tokom analize uzorka. Deamidacija je gubitak NH3iz proteina koji formira sukcinimidni intermedijer koji može da se podvrgne hidrolizi. Sukcinimidni intermedijer dovodi do smanjenja mase roditelјskog peptida za 17 daltona. Naknadna hidroliza rezultira povećanjem mase od 18 daltona. Izolacija sukcinimidnog intermedijera je teška zbog nestabilnosti u vodenim uslovima. Kao takva, deamidacija se obično može detektovati kao povećanje mase od 1 daltona. Deamidacija asparagina dovodi do ili asparaginske ili izoasparaginske kiseline. Parametri koji utiču na brzinu deamidacije uklјučuju pH, temperaturu, dielektričnu konstantu rastvarača, jonsku snagu, primarnu sekvencu, lokalnu polipeptidnu konformaciju i tercijarnu strukturu. Aminokiselinski ostaci pored Asn u peptidnom lancu utiču na stope deamidacije. Gli i Ser koji prate Asn u proteinskim sekvencama rezultiraju većom osetlјivošću na deamidaciju.
[0106] U određenim realizacijama, tečna formulacija predmetnog pronalaska može se čuvati u uslovima pH i vlažnosti da bi se sprečila deaminacija proteinskog proizvoda.
[0107] Vodeni nosač od interesa ovde je onaj koji je farmaceutski prihvatlјiv (bezbedan i netoksičan za primenu kod lјudi) i koristan je za pripremu tečne formulacije. Prikazani nosači uklјučuju sterilnu vodu za injekcije (SWFI), bakteriostatsku vodu za injekcije (BWFI), pH puferovani rastvor (npr. fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom), sterilni fiziološki rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze.
[0108] Konzervans se ovde može opciono dodati formulacijama da bi se smanjilo delovanje bakterija. Dodavanje konzervansa može, na primer, da olakša proizvodnju formulacije za višestruku upotrebu (više doza).
[0109] Intravenske (IV) formulacije mogu biti poželјan način administriranja u određenim slučajevima, kao što je kada je pacijent u bolnici nakon transplantacije i prima sve lekove putem IV. U određenim realizacijama, tečna formulacija se razblaži sa 0,9% rastvorom natrijum hlorida pre administriranja. U određenim realizacijama, razblaženi lek za injekcije je izotoničan i pogodan za davanje intravenskom infuzijom.
[0110] U određenim realizacijama, so ili komponente pufera se mogu dodati u količini od 10 mM - 200 mM. Soli i/ili puferi su farmaceutski prihvatlјivi i izvedeni su iz različitih poznatih kiselina (neorganskih i organskih) sa metalima ili aminima koji „formiraju bazu”. U određenim realizacijama, pufer može da bude fosfatni pufer. U određenim realizacijama, pufer može da bude glicinatni, karbonatni, citratni pufer, u kom slučaju, natrijum, kalijum ili amonijum joni mogu poslužiti kao protivjoni.
[0111] Konzervans se ovde može opciono dodati formulacijama da bi se smanjilo delovanje bakterija. Dodavanje konzervansa može, na primer, da olakša proizvodnju formulacije za višestruku upotrebu (više doza).
[0112] Vodeni nosač od interesa ovde je onaj koji je farmaceutski prihvatlјiv (bezbedan i netoksičan za primenu kod lјudi) i koristan je za pripremu tečne formulacije. Prikazani nosači uklјučuju sterilnu vodu za injekcije (SWFI), bakteriostatsku vodu za injekcije (BWFI), pH puferovani rastvor (npr. fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom), sterilni fiziološki rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze.
[0113] Ovaj predmetni pronalazak može da postoji u liofilizovanoj formulaciji koja uklјučuje proteine i lioprotektant. Lioprotektant može da bude šećer, npr. disaharid. U određenim realizacijama, likoprotektant može da bude saharoza ili maltoza. Liofilizovana formulacija može da, takođe, uklјučuje jedan ili više od puferskih sredstava, surfaktanta, sredstva za povećanje zapremine i/ili konzervansa.
[0114] Količina saharoze ili maltoze korisna za stabilizaciju liofilizovanog leka može da bude u težinskom odnosu od najmanje 1:2 proteina prema saharozi ili maltozi. U određenim realizacijama, težinski odnos proteina prema saharozi ili maltozi može da bude od 1:2 do 1:5.
[0115] U određenim realizacijama, pH formulacije, pre liofilizacije, može da se podesi dodavanjem farmaceutski prihvatlјive kiseline i/ili baze. U određenim realizacijama, farmaceutski prihvatlјiva kiselina može da bude hlorovodonična kiselina. U određenim realizacijama, farmaceutski prihvatlјiva baza može da bude natrijum hidroksid.
[0116] Pre liofilizacije, pH rastvora koji sadrži protein prema predmetnom pronalasku može se podesiti između 6 i 8. U određenim realizacijama, pH raspon za liofilizovani lek može da bude od 7 do 8.
[0117] U određenim realizacijama, so ili komponente pufera se mogu dodati u količini od 10 mM - 200 mM. Soli i/ili puferi su farmaceutski prihvatlјivi i izvedeni su iz različitih poznatih kiselina (neorganskih i organskih) sa metalima ili aminima koji „formiraju bazu”. U određenim realizacijama, pufer može da bude fosfatni pufer. U određenim realizacijama, pufer može da bude glicinatni, karbonatni, citratni pufer, u kom slučaju, natrijum, kalijum ili amonijum joni mogu poslužiti kao protivjoni.
[0118] U određenim realizacijama, može se dodati „sredstvo za povećanje zapremine”. „Sredstvo za povećanje zapremine” je jedinjenje koje dodaje masu liofilizovanoj smeši i doprinosi fizičkoj strukturi liofilizovanog kolača (npr. olakšava proizvodnju u suštini ujednačenog liofilizovanog kolača koji održava strukturu otvorenih pora). Prikazana sredstva za povećanje zapremine uklјučuju manitol, glicin, polietilen glikol i sorbitol. Liofilizovane formulacije predmetnog pronalaska mogu da sadrže takva sredstva za povećanje zapremine.
[0119] Konzervans se ovde može opciono dodati formulacijama da bi se smanjilo delovanje bakterija. Dodavanje konzervansa može, na primer, da olakša proizvodnju formulacije za višestruku upotrebu (više doza).
[0120] U određenim realizacijama, liofilizovani proizvod leka može da bude konstituisan sa vodenim nosačem. Vodeni nosač od interesa je onaj koji je farmaceutski prihvatlјiv (npr. bezbedan i netoksičan za primenu kod lјudi) i koristan je za pripremu tečne formulacije, posle liofilizacije. Prikazani razblaživači uklјučuju sterilnu vodu za injekcije (SWFI), bakteriostatsku vodu za injekcije (BWFI), pH puferovani rastvor (npr. fiziološki rastvor puferovan fosfatom), sterilni fiziološki rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze.
[0121] U određenim realizacijama, liofilizovani proizvod leka predmetnog pronalaska se rekonstituiše ili sa sterilnom vodom za injekcije, USP (SWFI) ili 0,9% natrijum hloridom za injekcije, USP. Tokom rekonstitucije, liofilizovani prah se rastvara u rastvor.
[0122] U određenim realizacijama, liofilizovani proteinski proizvod predmetnog pronalaska je konstituisan u oko 4,5 mL vode za injekcije i razblažen sa 0,9% rastvorom soli (rastvor natrijum hlorida).
[0123] Stvarni nivoi doze aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska mogu da variraju tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje želјenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način primene, a da nije toksična za pacijenta.
[0124] Specifična doza može da bude uniformna doza za svakog pacijenta, na primer, 50-5000 mg proteina. Alternativno, pacijentova doza može da bude prilagođena približnoj telesnoj težini ili površini pacijenta. Drugi faktori u određivanju odgovarajuće doze mogu uklјučiti bolest ili stanje koje treba lečiti ili sprečiti, ozbilјnost bolesti, način administriranja i starost, pol i zdravstveno stanje pacijenta. Dalјe usavršavanje proračuna neophodnih za određivanje odgovarajuće doze za lečenje rutinski se vrši od strane stručnjaka, posebno u svetlu informacija o dozama i testova koji su ovde stavljeni na uvid. Doziranje može da se, takođe, odredi korišćenjem poznatih testova za određivanje doza koje se koriste zajedno sa odgovarajućim podacima o dozi i odgovoru. Pojedinalna doza za pacijenta može se prilagoditi kako se prati napredak bolesti. Nivoi cilјanog konstrukta ili kompleksa u krvi kod pacijenta mogu se izmeriti da bi se videlo da li je potrebno prilagoditi dozu da bi se postigla ili održala efektivna koncentracija. Farmakogenomika se može koristiti za određivanje koji cilјni konstrukti i/ili kompleksi i njihove doze će najverovatnije biti efikasni za datu osobu (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001).
[0125] Generalno, doze zasnovane na telesnoj težini su od oko 0,01 μg do oko 100 mg po kg telesne težine, kao što je oko 0,01 μg do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 0,01 μg do oko 50 mg/kg telesne težine, oko 0,01 μg do oko 10 mg/kg telesne težine, oko 0,01 μg do oko 1 mg/kg telesne težine, oko 0,01 μg do oko 100 μg/kg telesne težine, oko 0,01 μg do oko 50 μg/kg telesne težine, oko 0,01 μg do oko 10 μg/kg telesne težine, oko 0,01 μg do oko 1 μg/kg telesne težine, oko 0,01 μg do oko 0,1 μg/kg telesne težine, oko 0,1 μg do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 0,1 μg do oko 50 mg/kg telesne težine, oko 0,1 μg do oko 10 mg/kg telesne težine, oko 0,1 μg do oko 1 mg/kg telesne težine, oko 0,1 μg do oko 100 μg/kg telesne težine, oko 0,1 μg do oko 10 μg/kg telesne težine, oko 0,1 μg do oko 1 μg/kg telesne težine, oko 1 μg do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 1 μg do oko 50 mg/kg telesne težine, oko 1 μg do oko 10 mg/kg tela težina, oko 1 μg do oko 1 mg/kg telesne težine, oko 1 μg do oko 100 μg/kg telesne težine, oko 1 μg do oko 50 μg/kg telesne težine, oko 1 μg do oko 10 μg/kg telesne težine, oko 10 μg do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 10 μg do oko 50 mg/kg telesne težine, oko 10 μg do oko 10 mg/kg telesne težine, oko 10 μg do oko 1 mg/kg telesne težine, oko 10 μg do oko 100 μg/kg telesne težine, oko 10 μg do oko 50 μg/kg telesne težine, oko 50 μg do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 50 μg do oko 50 mg/kg telesne težine, oko 50 μg do oko 10 mg/kg telesne težine, oko 50 μg do oko 1 mg/kg telesne težine, oko 50 μg do oko 100 μg/kg telesne težine, oko 100 μg do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 100 μg do oko 50 mg/kg telesne težine, oko 100 μg do oko 10 mg/kg telesne težine, oko 100 μg do oko 1 mg/kg telesne težine, oko 1 mg do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 1 mg do oko 50 mg/kg telesne težine, oko 1 mg do oko 10 mg/kg telesne težine, oko 10 mg do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 10 mg do oko 50 mg/kg telesne težine, oko 50 mg do oko 100 mg/kg telesne težine.
[0126] Doze se mogu davati jednom ili više puta dnevno, nedelјno, mesečno ili godišnje, ili čak jednom u 2 do 20 godina. Prosečni stručnjaci u tehnici mogu lako proceniti stope ponavlјanja za doziranje na osnovu izmerenih vremena zadržavanja i koncentracija cilјanog konstrukta ili kompleksa u telesnim tečnostima ili tkivima. Administriranje predmetnog pronalaska može da bude intravensko, intraarterijsko, intraperitonealno, intramuskularno, supkutano, intrapleuralno, intratekalno, intrakavitarno, perfuzijom kroz kateter ili direktnom intralezijskom injekcijom. Može se administrirati jednom ili više puta dnevno, jednom ili više puta nedelјno, jednom ili više puta mesečno i jednom ili više puta godišnje.
[0127] Gornji opis opisuje više aspekata i realizacija pronalaska. Patentna prijava posebno razmatra sve kombinacije i permutacije aspekata i realizacija.
PRIMERI
[0128] Pronalazak koji je sada uopšteno opisan, biće lakše shvaćen uz upućivanje na sledeće primere, koji su uklјučeni samo u svrhu ilustracije određenih aspekata i realizacija predmetnog pronalaska, i nije im namera da ograniče pronalazak.
Primer 1 - Domeni koji se vezuju za NKG2D se vezuje za NKG2D
Domen koji se vezuje za NKG2Di se vezuje za prečišćeni rekombinantni NKG2D
[0129] Sekvence nukleinskih kiselina NKG2D ektodomena čoveka, miša ili makaki rakojeda fuzionisane su sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju humane IgG1 Fc domene i uvedene u ćelije sisara da bi bile eksprimovane. Nakon prečišćavanja, NKG2D-Fc fuzioni proteini su adsorbovani u ležišta mikroploča. Nakon blokiranja ležišta goveđim serumskim albuminom da bi se sprečilo nespecifično vezivanje, domeni koji se vezuju za NKG2D su titrirani i dodati u ležišta prethodno adsorbovana sa NKG2D-Fc fuzionim proteinima. Primarno vezivanje antitela je detektovano korišćenjem sekundarnog antitela koje je konjugovano sa peroksidazom rena i specifično prepoznaje humani kapa laki lanac da bi se izbegla unakrsna reaktivnost Fc. 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin (TMB), supstrat za peroksidazu rena, dodat je u ležišta da bi se vizuelizovao signal vezivanja, čija je apsorbancija merena na 450 nM i korigovana na 540 nM. Klon domena koji se vezuje za NKG2D, izotipska kontrola ili pozitivna kontrola (izabrana iz SEQ ID NO: 45-48, ili anti-mišjih NKG2D klonova MI-6 i CKS-5 dostupnih na eBioscience) su dodati u svako ležište.
[0130] Izotipska kontrola je pokazala minimalno vezivanje za rekombinantne NKG2D-Fc proteine, dok se pozitivna kontrola najjače vezala za rekombinantne antigene. Domeni koji se vezuju za NKG2D proizvedeni od strane svih klonova pokazali su vezivanje preko humanih (Sl.14), mišjih (Sl.16) i makaki rakojeda (Sl.15) rekombinantnih NKG2D-Fc proteina, iako sa različitim afinitetima od klona do klona. Generalno, svaki anti-NKG2D klon je vezan za humani (Sl.
14) i makaki rakojeda (Sl. 15) rekombinantni NKG2D-Fc sa sličnim afinitetom, ali sa manjim afinitetom za mišji (Sl.16) rekombinantni NKG2D-Fc.
Domeni koji se vezuju za NKG2D se vezuju za ćelije koje eksprimuju NKG2D
[0131] Ćelijske linije mišjeg limfoma EL4 su dizajnirane da eksprimuju himerne receptore antigena humanog ili mišjeg NKG2D - CD3 zeta signalnog domena. Klon koji se vezuje za NKG2D, izotipska kontrola ili pozitivna kontrola korišćeni su u koncentraciji od 100 nM za bojenje ekstracelularnog NKG2D eksprimovanog na EL4 ćelijama. Vezivanje antitela detektovano je korišćenjem sekundarnih anti-humanih IgG antitela konjugovanih sa fluoroforom. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom, a preklapanje pozadine (FOB) je izračunato korišćenjem srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) ćelija koje eksprimuju NKG2D u poređenju sa roditelјskim EL4 ćelijama.
[0132] Domeni koji se vezuju za NKG2D proizvedeni su od strane svih klonova vezanih za EL4 ćelije koje eksprimuju humani i mišji NKG2D. Pozitivna kontrolna antitela (izabrana iz SEQ ID NO: 45-48, ili anti-mišjih NKG2D klonova MI-6 i CX-5 dostupnih na eBioscience) dala su najbolјi FOB vezujući signal. Afinitet vezivanja za NKG2D za svaki klon bio je sličan između ćelija koje eksprimuju humane (Sl.17) i mišje (Sl.18) NKG2D (Slike 17-18, redom).
Primer 2 - Domeni koji se vezuju za NKG2D blokiraju vezivanje prirodnog liganda za NKG2D
Konkurencija sa ULBP-6
[0133] Rekombinantni humani NKG2D-Fc proteini su adsorbovani u ležišta mikroploče, a ležišta su blokirana albuminom goveđeg seruma koji smanjuje nespecifično vezivanje. Zasićujuća koncentracija ULBP-6-His-biotina je dodata u ležišta, nakon čega je usledilo dodavanje klonova domena koji se vezuje za NKG2D. Posle 2-časovne inkubacije, ležišta su isprana i ULBP-6-His-biotin koji je ostao vezan za NKG2D-Fc obloženog ležišta je detektovan streptavidinom konjugovanim sa peroksidazom rena i TMB supstratom. Apsorbancija je izmerena na 450 nM i korigovana na 540 nM. Nakon oduzimanja pozadine, specifično vezivanje domena koji se vezuju za NKG2D za NKG2D-Fc proteine izračunato je iz procenta ULBP-6-His-biotina koji je blokiran od vezivanja za NKG2D-Fc proteine u ležištama. Antitelo pozitivne kontrole (izabrano iz SEQ ID NO: 45-48) i različiti domeni koji se vezuju za NKG2D blokirali su vezivanje ULBP-6 za NKG2D, dok je izotipska kontrola pokazala malu konkurenciju sa ULBP-6 (Sl.19).
Konkurencija sa MICA
[0134] Rekombinantni humani MICA-Fc proteini su adsorbovani u ležišta mikroploče, a ležišta su blokirana albuminom goveđeg seruma da bi se smanjilo nespecifično vezivanje. NKG2D-Fc-biotin je dodat u ležišta, a zatim domeni koji se vezuju za NKG2D. Nakon inkubacije i ispiranja, NKG2D-Fc-biotin koji je ostao vezan za MICA-Fc obložena ležišta je detektovan korišćenjem streptavidina-HRP i TMB supstrata. Apsorbancija je izmerena na 450 nM i korigovana na 540 nM.
Nakon oduzimanja pozadine, specifično vezivanje domena koji se vezuju za NKG2D za NKG2D-Fc proteine izračunato je iz procenta NKG2D-Fc-biotina koji je blokiran od vezivanja za MICA-Fc obložena ležišta. Antitelo pozitivne kontrole (izabrano iz SEQ ID NO: 45-48) i različiti domeni koji se vezuju za NKG2D blokirali su vezivanje MICA za NKG2D, dok je izotipska kontrola pokazala malu konkurenciju sa MICA (Sl.20).
Konkurencija sa Rae-1 delta
[0135] Rekombinantni mišji Rae-1delta-Fc (kuplјen od R&D Sistems-a) je adsorbovan na ležišta mikroploče, a ležišta su blokirana albuminom goveđeg seruma da bi se smanjilo nespecifično vezivanje. Mišji NKG2D-Fc-biotin je dodat u ležišta, a zatim domeni koji se vezuju za NKG2D. Posle inkubacije i ispiranja, NKG2D-Fc-biotin koji je ostao vezan za Rae-1delta-Fc obložena ležišta je detektovan korišćenjem streptavidina-HRP i TMB supstrata. Apsorbancija je izmerena na 450 nM i korigovana na 540 nM. Nakon oduzimanja pozadine, specifično vezivanje domena koji se vezuju za NKG2D za NKG2D-Fc proteine izračunato je iz procenta NKG2D-Fc-biotina koji je blokiran od vezivanja za Rae-1delta-Fc obložena ležišta. Pozitivna kontrola (izabrana iz SEQ ID NO: 45-48, ili anti-mišjih NKG2D klonova MI-6 i CKS-5 dostupnih na eBioscience) i različiti klonovi domena koji se vezuju za NKG2D blokirali su Rae-1delta vezivanje za mišji NKG2D, dok je izotipsko kontrolno antitelo je pokazalo malu konkurenciju sa Rae-1delta (Sl.21).
Primer 3 - Klonovi domena koji se vezuju za NKG2D aktiviraju NKG2D
[0136] Sekvence nukleinske kiseline humanog i mišjeg NKG2D su fuzionisane sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju CD3 zeta signalni domen da bi se dobili konstrukti himernog antigen receptora (CAR). NKG2D-CAR konstrukti su zatim klonirani u retrovirusni vektor korišćenjem Gibsonovog uređajai transfektovani u expi293 ćelije za proizvodnju retrovirusa. EL4 ćelije su inficirane virusima koji sadrže NKG2D-CAR zajedno sa 8 mg/mL polibrena. 24 sata nakon infekcije, nivoi ekspresije NKG2D-CAR u EL4 ćelijama su analizirani protočnom citometrijom i odabrani su klonovi koji eksprimuju visoke nivoe NKG2D-CAR na površini ćelije.
[0137] Da bi se utvrdilo da li domeni koji se vezuju za NKG2D aktiviraju NKG2D, oni su adsorbovani u ležišta mikroploče, a ćelije NKG2D-CAR EL4 su kultivisane u ležištima obloženim fragmentima antitela tokom 4 sata u prisustvu brefeldina-A i monenzina. Intracelularna proizvodnja TNF-alfa, indikatora za aktivaciju NKG2D, ispitana je protočnom citometrijom. Procenat TNF-alfa pozitivnih ćelija je normalizovan na ćelije tretirane pozitivnom kontrolom. Svi domeni koji se vezuju za NKG2D aktivirali su i humane (Sl.22) i mišje (Sl.23) NKG2D.
Primer 4 - Domeni koji se vezuju za NKG2D aktiviraju NK ćelije
Primarne humane NK ćelije
[0138] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz trombocitno-leukocitnog međusloja humane periferne krvi korišćenjem centrifugiranja sa gradijentom gustine. NK ćelije (CD3<->CD56<+>) su izolovane upotrebom negativne selekcije sa magnetnim perlama iz PBMC, a čistoća izolovanih NK ćelija je obično bila >95%. Izolovane NK ćelije su zatim kultivisane u medijumu koji sadrži 100 ng/mL IL-2 tokom 24-48 sati pre nego što su prebačene u ležišta mikroploče na koje su adsorbovani domeni koji se vezuju za NKG2D i kultivisani u medijumu koji sadrži fluoroforom konjugovano anti-CD107a antitelo, brefeldin-A i monenzin. Posle kultivisanja, NK ćelije su analizirane protočnom citometrijom korišćenjem fluoroforom konjugovanih antitela protiv CD3, CD56 i IFN-gama. CD107a i IFN-gama bojenje je analizirano u CD3<->CD56<+>ćelijama za procenu aktivacije NK ćelija. Povećanje CD107a/IFN-gama dvostruko pozitivnih ćelija ukazuje na bolјu aktivaciju NK ćelija kroz angažovanje dva aktivirajuća receptora umesto jednog receptora. Domeni koji se vezuju za NKG2D i pozitivna kontrola (izabrana iz SEQ ID NO:45-48) pokazali su veći procenat NK ćelija koje postaju CD107a<+>i IFN-gama<+>nego izotipska kontrola (Sl. 24 i Sl. 25 predstavlјaju dva nezavisna eksperimenta, od kojih svaki koristi PBMC različitog donora za pripremu NK ćelija).
Primarne mišje NK ćelije
[0139] Slezine su dobijene od C57Bl/6 miševa i usitnjene kroz ćelijsku cedilјku od 70 μm da bi se dobila suspenzija jedne ćelije. Ćelije su peletirane i resuspendovane u ACK puferu za lizu (kuplјeno od Thermo Fisher Scientific #A1049201; 155 mM amonijum hlorida, 10 mM kalijum bikarbonata, 0,01 mM EDTA) da bi se uklonila crvena krvna zrnca. Preostale ćelije su kultivisane sa 100 ng/mL hIL-2 tokom 72 sata pre nego što su sakuplјene i pripremlјene za izolaciju NK ćelija. NK ćelije (CD3-NK1.1<+>) su zatim izolovane iz ćelija slezine pomoću tehnike negativnog iscrplјivanja sa magnetnim perlicama sa uobičajenih >90% čistoće. Prečišćene NK ćelije su kultivisane u medijumu koji sadrži 100 ng/mL mIL-15 tokom 48 sati pre nego što su prebačene u ležišta mikroploče na koje su adsorbovani domeni koji se vezuju za NKG2D i kultivisane u medijumu koji sadrži fluoroforom konjugovano anti-CD107a antitelo, brefeldin-A i monenzin. Nakon kultivisanja u ležištima obloženim domenom koji se vezuje za NKG2D, NK ćelije su analizirane protočnom citometrijom korišćenjem fluoroforom konjugovanih antitela protiv CD3, NK1.1 i IFN-gama. CD107a i IFN-gama bojenje je analizirano u CD3-NK1.1<+>ćelijama za procenu aktivacije NK ćelija. Povećanje CD107a/IFN-gama dvostruko pozitivnih ćelija ukazuje na bolјu aktivaciju NK ćelija kroz angažovanje dva aktivirajuća receptora umesto jednog receptora. Domeni koji se vezuju za NKG2D i pozitivna kontrola (izabrana iz anti-mišjih NKG2D klonova MI-6 i CKS-5 dostupnih na eBioscience) pokazali su veći procenat NK ćelija koje postaju CD107a<+>i IFN-gama<+>nego izotipska kontrola (Sl.26 i Sl. 27 predstavlјaju dva nezavisna eksperimenta, od kojih svaki koristi različitog miša za pripremu NK ćelija).
Primer 5 - Domeni koji se vezuju za NKG2D omogućavaju citotoksičnost cilјnih tumorskih ćelija
[0140] Ispitivanja primarne aktivacije humanih i mišjih NK ćelija pokazuju povećane markere citotoksičnosti na NK ćelijama nakon inkubacije sa domenima koji se vezuju za NKG2D. Da bi se rešilo da li se ovo prevodi u povećanu lizu tumorskih ćelija, korišćen je test zasnovan na ćelijama gde je svaki domen koji se vezuje za NKG2D razvijen u monospecifično antitelo. Fc region je korišćen kao jedan ciljajući krak, dok je Fab region (domen koji se vezuje za NKG2D) delovao kao drugi ciljajući krak za aktiviranje NK ćelija. THP-1 ćelije, koje su humanog porekla i eksprimuju visoke nivoe Fc receptora, korišćene su kao tumorski cilj i korišćen je Perkin Elmer DELFIA komplet za citotoksičnost. THP-1 ćelije su obeležene BATDA reagensom i resuspendovane na 10<5>/mL u medijumu za kulturu. Obeležene THP-1 ćelije su zatim kombinovane sa NKG2D antitelima i izolovanim mišjim NK ćelijama u ležištima mikrotitarske ploče na 37°C tokom 3 sata. Posle inkubacije, 20 μl supernatanta kulture je uklonjeno, pomešano sa 200 μl rastvora evropijuma i inkubirano uz mućkanje 15 minuta u mraku. Fluorescencija je merena tokom vremena pomoću čitača ploča PheraStar opremlјenog fluorescentnim modulom sa vremenskim razlučivanjem (ekscitacija 337nm, emisija 620nm) i specifična liza je izračunata prema uputstvima za taj komplet.
[0141] Pozitivna kontrola, ULBP-6 - prirodni ligand za NKG2D, pokazala je povećanu specifičnu lizu THP-1 cilјnih ćelija od strane mišjih NK ćelija. NKG2D antitela su, takođe, povećala specifičnu lizu THP-1 cilјnih ćelija, dok je izotipsko kontrolno antitelo pokazalo smanjenu specifičnu lizu. Isprekidana linija ukazuje na specifičnu lizu THP-1 ćelija od strane mišjih NK ćelija bez dodavanja antitela (Sl.28).
Primer 6 - NKG2D antitela pokazuju visoku termostabilnost
[0142] Temperature toplјenja domena koji se vezuju za NKG2D su analizirane korišćenjem diferencijalne skenirajuće fluorimetrije. Ekstrapolirane prividne temperature toplјenja su visoke u odnosu na uobičajena IgG1 antitela (Sl.29).
Primer 7 - Multispecifični vezujući proteini pokazuju pobolјšanu sposobnost da aktiviraju NK ćelije
[0143] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz trombocitno-leukocitnog međusloja humane periferne krvi korišćenjem centrifugiranja sa gradijentom gustine. NK ćelije (CD3<->CD56<+>) su izolovane upotrebom negativne selekcije sa magnetnim perlama iz PBMC, a čistoća izolovanih NK ćelija je uobičajeno bila >95%. Izolovane NK ćelije su zatim kultivisane u medijumu koji sadrži 100 ng/mL IL-2 tokom 24-48 sati pre nego što su prebačene u ležišta mikroploče na koje su adsorbovani multispecifični i bispecifični vezujući proteini i kultivisani u medijumu koji sadrži fluoroforom konjugovano anti-CD107a antitelo, brefeldin-A i monenzin. Posle kultivisanja, NK ćelije su analizirane protočnom citometrijom korišćenjem fluoroforom konjugovanih antitela protiv CD3, CD56 i IFN-gama. CD107a i IFN-gama bojenje je analizirano u CD3<->CD56<+>ćelijama za procenu aktivacije NK ćelija. Povećanje CD107a/IFN-gama dvostruko pozitivnih ćelija ukazuje na bolјu aktivaciju NK ćelija. AL2.2 je multispecifični vezujući protein koji sadrži domen koji se vezuje za HER2 (trastuzumab), domen koji se vezuje za NKG2D (ULBP-6) i humani IgG1 Fc domen. Napravlјen je putem kontrolisane reakcije razmene Fab-kraka (cFAE) počevši od trastuzumab homodimera i ULBP-6-Fc homodimera (videti Labrijn et al. Nature Protocols 9, 2450-2463). SC2.2 je jednolančani protein koji uklјučuje scFv izveden iz trastuzumaba i ULBP-6 (SEQ ID NO:73). SEQ ID NO: 73
[0144] Analiza CD107a i IFN-gama bojenja pokazala je da izotipska kontrola IgG ne pokazuje aktivaciju NK ćelija, dok veći procenat NK ćelija postaje CD107a<+>i IFN-gama<+>nakon stimulacije sa multispecifičnim vezujućim proteinom u poređenju sa bispecifičnim proteinom, pokazujući jaču aktivaciju NK ćelija kroz angažovanje dva aktivirajuća receptora (NKG2D i CD16) umesto samo jednog (NKG2D) (Sl. 30). Očekuje se da će se ovo povećanje aktivacije NK ćelija prevesti u snažnije ubijanje tumorskih ćelija.
Primer 8 - Multispecifični vezujući proteini pokazuju povećanu citotoksičnost prema cilјnim tumorskim ćelijama
Ispitivanje citotoksičnosti primarne humane NK ćelije
[0145] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz trombocitno-leukocitnog međusloja humane periferne krvi korišćenjem centrifugiranja sa gradijentom gustine. NK ćelije (CD3<->CD56<+>) su izolovane upotrebom negativne selekcije sa magnetnim perlama iz PBMC, a čistoća izolovanih NK ćelija je uobičajeno bila >95%. NK ćelije su zatim kultivisane preko noći u medijumu koji sadrži 100 ng/mL IL-2 pre upotrebe u testovima citotoksičnosti. Sledećeg dana, NK ćelije su resuspendovane na 5×10<5>/mL u svežoj podlozi za kulturu. SkBr-3 ćelije ćelija humanog raka dojke su obeležene BATDA reagensom prema Perkin Elmer DELFIA kompletu za citotoksičnost i resuspendovane na 5×1<04>/mL u medijumu za kulturu. Različita razblaženja multispecifičnih vezujućih proteina su napravlјena u medijumu za kulturu. NK ćelije, obeležene SkBr-3 ćelije i multispecifični vezujući proteini su zatim kombinovani u ležištima mikrotitarske ploče i inkubirani na 37°C tokom 3 sata. Posle inkubacije, 20 μl supernatanta kulture je uklonjeno, pomešano sa 200 μl rastvora evropijuma i inkubirano uz mućkanje 15 minuta u mraku. Fluorescencija je merena tokom vremena pomoću čitača ploča PheraStar opremlјenog fluorescentnim modulom sa vremenskim razlučivanjem (ekscitacija 337nm, emisija 620nm) i specifična liza je izračunata prema uputstvima za taj komplet. AL0.2 je multispecifični vezujući protein koji sadrži domen koji se vezuje za HER2 (trastuzumab), domen koji se vezuje za NKG2D (izabran iz SEQ ID NO: 1-44)) i humani IgG1 Fc domen. Napravlјen je putem kontrolisane reakcije razmene Fab-kraka (cFAE) počevši od trastuzumab homodimera i anti-NKG2D homodimera. AL0.2si je zasnovan na AL0.2 i sadrži dodatnu D265A mutaciju u Fc domenu koja poništava vezivanje CD16. Trastuzumab-si je zasnovan na trastuzumabu i sadrži dodatnu D265A mutaciju u Fc domenu koja poništava vezivanje CD16. AL2.2 je multispecifični vezujući protein koji sadrži domen koji se vezuje za HER2 (trastuzumab), domen koji se vezuje za NKG2D (ULBP-6) i humani IgG1 Fc domen. SC2.2 je jednolančani protein koji uklјučuje scFv izveden iz trastuzumaba i ULBP-6.
[0146] AL0.2 je pokazao pojačanu lizu SkBr-3 cilјnih ćelija od strane humanih NK ćelija u odnosu na trastuzumab na način zavisan od doze, sa p vrednošću od 0,0311 u EC50 (Sl.31). AL0.2si (Sl.32) i trastuzumab-si (Sl.33) su pokazali smanjenje i potencije i maksimalne specifične lize SkBr-3 ćelija u poređenju sa AL0.2, sa p-vrednošću od 0,0002 i 0,0001 u EC50, redom (Slike 32-33). Pored toga, AL0.2 je pokazao pojačanu lizu SkBr-3 ćelija u odnosu na AL2.2 na način zavisan od doze (Sl. 34). Izotipska kontrola IgG nije pokazala povećanje specifične lize ni u jednoj od testiranih koncentracija. Podaci su zajedno pokazali da multispecifični vezujući proteini koji angažuju 2 aktivirajuća receptora na NK ćelijama i jedan tumorski antigen, indukuju snažnije ubijanje tumorskih ćelija od strane humanih NK ćelija u poređenju sa bispecifičnim proteinima koji angažuju jedan aktivirajući receptor na NK ćelijama i jedan tumorski antigen.
Test citotoksičnosti primarnih mišjih NK ćelija
[0147] Slezine su dobijene od C57Bl/6 miševa i usitnjene kroz ćelijsku cedilјku od 70 μm da bi se dobila suspenzija jedne ćelije. Ćelije su peletirane i resuspendovane u ACK puferu za lizu (kuplјeno od Thermo Fisher Scientific #A1049201; 155 mM amonijum hlorida, 10 mM kalijum bikarbonata, 0,01 mM EDTA) da bi se uklonila crvena krvna zrnca. Preostale ćelije su kultivisane sa 100 ng/mL hIL-2 tokom 72 sata pre nego što su sakuplјene i pripremlјene za izolaciju NK ćelija. NK ćelije (CD3-NK1.1<+>) su zatim izolovane iz ćelija slezine pomoću tehnike negativnog iscrplјivanja sa magnetnim perlicama sa uobičajenih >90% čistoće. Prečišćene NK ćelije su kultivisane u medijumu koji sadrži 100 ng/mL mIL-15 tokom 48 sati pre resuspendovanja u medijumu za kulturu na 10<6>/mL za citotoksične testove. RMA-HER2-dTomato, ćelijska linija tumora miša dizajnirana da eksprimuje HER2 i dTomato, i njen kontrolni pandan, RMA ćelije koje eksprimuju zsGreen korišćene su kao mete. One su resuspendovane na 2×10<5>/mL u medijumu za kulturu i zasejane u ležišta mikroploče u odnosu 1:1. Razblaženja multispecifičnog proteina su napravlјena u medijumu za kulturu i dodata RMA ćelijama zajedno sa NK ćelijama. Posle inkubacije preko noći na 37°C sa 5% CO2, procenat RMA-HER2-dTomato i RMA-zsGreen ćelija je određen protočnom citometrijom korišćenjem fluorescentnog reportera da bi se identifikovala dva tipa ćelija. Specifična smrt cilјne ćelije = (1- ((% RMA-Ca2T-dTomato ćelija u tretiranoj grupi * % RMA-zsGreen ćelija u kontrolnoj grupi)/(% RMA-Ca2T-dTomato ćelija u kontrolnoj grupi * % RMA-zsGreen ćelija tretiranoj grupi))) * 100%.
[0148] AL2.2 je moćniji u preusmeravanju odgovora NK ćelija na tumorske ciljeve nego SC2.2 (Sl. 36) i Trastuzumab (Sl. 35). Kontrolni protein je pokazao mali uticaj na specifičnu cilјnu smrt. Ovi podaci pokazuju da multispecifični vezujući proteini koji angažuju 2 aktivirajuća receptora na NK ćelijama i jedan tumorski antigen, indukuju snažnije ubijanje tumorskih ćelija od strane mišjih NK ćelija u poređenju sa bispecifičnim proteinima koji angažuju jedan aktivirajući receptor na NK ćelijama i jedan tumorski antigen.
Primer 9 - Multispecifični vezujući proteini se vezuju za NKG2D
[0149] EL4 ćelijske linije mišjeg limfoma su konstruisane da eksprimuju humane NKG2D trispecifične vezujuće proteine (TriNKET) od kojih svaki sadrži domen koji se vezuje za NKG2D, domen za vezivanje antigena povezanog sa tumorom (kao što je domen koji vezuje CD33, HER2, CD20 ili BCMA) i Fc domen koji se vezuje za CD16 kao što je prikazano na Sl. 1, testirani su na njihov afinitet prema vanćelijskom NKG2D eksprimovanom na EL4 ćelijama. Vezivanje multispecifičnih vezujućih proteina za NKG2D detektovano je korišćenjem fluoroforom konjugovanih sekundarnih antihumanih IgG antitela. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom, a preklapanje pozadine (FOB) je izračunato korišćenjem srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) ćelija koje eksprimuju NKG2D u poređenju sa roditelјskim EL4 ćelijama.
[0150] Testirani TriNKET-i uklјučuju CD33-TriNKET-C26 (ADI-28226 i domen koji se vezuje za CD33), CD33-TriNKET-F04 (ADI-29404 i domen koji se vezuje za CD33), HER2-TriNKET-C26 (ADI-28226 i domen koji se vezuje za HER2), HER2-TriNKET-F04 (ADI-29404 i domen koji se vezuje za HER2), CD20-TriNKET-C26 (ADI-28226 i domen koji se vezuje za CD20), CD20-TriNKET-F04 (ADI-29404 i domen koji se vezuje za CD20), BCMA-TriNKET- C26 (ADI-28226 i domen koji se vezuje za BCMA), BCMA-TriNKET-F04 (ADI-29404 i domen koji se vezuje za BCMA), BCMA-TriNKET-F43 (ADI-29443 i domen koji se vezuje za BCMA) i BCMA-TriNKET-F47 (ADI-29447 i domen koji se vezuje za BCMA). Domen koji se vezuje za HER2 korišćen u testiranim molekulima bio je sastavlјen od varijabilnog domena teškog lanca i varijabilnog domena lakog lanca trastuzumaba. Domen koji se vezuje za CD33 domen je sastavlјen od varijabilnog domena teškog lanca i varijabilnog domena lakog lanca koji su navedeni u daljem tekstu.
SEQ ID NO:74:
Domen koji se vezuje za CD20 korišćen u testiranim molekulima bio je sastavlјen od varijabilnog domena teškog lanca i varijabilnog domena lakog lanca. Domen koji se vezuje za BCMA korišćen u testiranim molekulima bio je sastavlјen od varijabilnog domena teškog lanca i varijabilnog domena lakog lanca kao što je navedeno u daljem tekstu.
EM-801 varijabilni domen teškog lanca (SEQ ID NO:82):
EM-801 varijabilni domen lakog lanca (SEQ ID NO:83):
EM-901 varijabilni domen teškog lanca (SEQ ID NO:76)
EM-901 varijabilni domen lakog lanca (SEQ ID NO:77)
[0151] Podaci pokazuju da se TriNKET predmetnog pronalaska vezuje za NKG2D kada protein uklјučuje domen koji se vezuje za tumorski antigen kao što je CD33, HER2, CD20 i BCMA.
Primer 10 - Multispecifični vezujući proteini vezuju se za humane tumorske antigene
Trispecifično vezujući proteini se vezuju za CD33, HER2, CD20 i BCMA
[0152] Humana AML ćelijska linija MV4-11 koja eksprimuje CD33 korišćena je za ispitivanje vezivanja TriNKET-a za antigen povezan sa tumorom. TriNKET i roditelјsko monoklonsko antitelo na CD33 su inkubirani sa ćelijama, a vezivanje je detektovano korišćenjem fluoroforom konjugovanih sekundarnih anti-humanih IgG antitela. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom, a preklapanje pozadine (FOB) je izračunato korišćenjem srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) iz TriNKET-a i roditelјskog monoklonskog anti-CD33 antitela normalizovanog na sekundarne kontrole antitela. CD33-TriNKET-C26 i CD33-TriNKET-F04 pokazuju uporedive nivoe vezivanja za CD33 u poređenju sa roditelјskim anti-CD33 antitelom (Sl.41).
[0153] Ćelijske linije humanog raka koje eksprimuju HER2 korišćene su za ispitivanje vezivanja TriNKET-a za antigen povezan sa tumorom. Ćelijska linija karcinoma bubrežnih ćelija 786-O eksprimuje niske nivoe HER2. TriNKET-i i opciono roditelјsko anti-HER2 monoklonsko antitelo (Trastuzumab) su inkubirani sa ćelijama, a vezivanje je detektovano korišćenjem fluoroforom konjugovanih sekundarnih anti-humanih IgG antitela. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom, a preklapanje pozadine (FOB) je izračunato korišćenjem srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) iz TriNKET-a i Trastuzumaba normalizovanog na sekundarne kontrole antitela. HER2-TriNKET-C26 i HER2-TriNKET-F04 pokazuju uporedive nivoe vezivanja za HER2 ekprimovane na 786-O ćelijama u poređenju sa Trastuzumabom (Sl.42).
[0154] MM.1S ćelije humanog mijeloma koje eksprimuju BCMA korišćene su za ispitivanje vezivanja TriNKET-a za antigen povezan sa tumorom BCMA. TriNKET-i i opciono roditelјsko anti-BCMA monoklonsko antitelo (EM-801) su inkubirani sa ćelijama, a vezivanje je detektovano korišćenjem fluoroforom konjugovanih sekundarnih anti-humanih IgG antitela. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom, a preklapanje pozadine (FOB) je izračunato korišćenjem srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) iz TriNKET-a i EM-801 normalizovanog na sekundarne kontrole antitela. C26--TriNKET-BCMA, F04-TriNKET-BCMA, F43-TriNKET-BCMA i F47-TriNKET-BCMA pokazuju uporedive nivoe vezivanja za BCMA epksprimovane na MM.1S ćelijama u poređenju sa EM-801 (Sl.43).
[0155] Ćelije Raji humanog limfoma koje eksprimuju CD20 korišćene su za ispitivanje vezivanja TriNKET-a za antigen CD20 povezan sa tumorom. TriNKET-i su inkubirani sa ćelijama, a vezivanje je detektovano korišćenjem fluoroforom konjugovanih sekundarnih anti-humanih IgG antitela. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom i histogram je nacrtan. Kao što je prikazano na Sl.44, CD20-TriNKET-C26 i CD20-TriNKET-F04 se jednako dobro vezuju za CD20.
Primer 11 - Multispecifični vezujući proteini aktiviraju NK ćelije
[0156] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz trombocitno-leukocitnog međusloja humane periferne krvi korišćenjem centrifugiranja sa gradijentom gustine. NK ćelije (CD3<->CD56<+>) izolovane su upotrebom negativne selekcije sa magnetnim perlama iz PBMC, a čistoća izolovanih NK ćelija je uobičajeno bila >90%. Izolovane NK ćelije su kultivisane u medijumu koji sadrži 100 ng/mL IL-2 za aktivaciju ili su mirovale preko noći bez citokina. IL-2-aktivirane NK ćelije su korišćene u roku od 24-48 sati nakon aktivacije.
[0157] Humane ćelije raka koje eksprimuju tumorski antigen su sakuplјene i resuspendovane u medijumu za kulturu pri 2×10<6>/mL. Monoklonska antitela ili TriNKET-i koji cilјaju tumorski antigen su razblaženi u medijumu za kulturu. Aktivirane NK ćelije su sakuplјene, isprane i resuspendovane na 2×10<6>/mL u medijumu za kulturu. Ćelije raka su zatim pomešane sa monoklonskim antitelima/TriNKET-ima i aktiviranim NK ćelijama u prisustvu IL-2. Brefeldin-A i monenzin su, takođe, dodati mešanoj kulturi da bi se blokirao transport proteina iz ćelije za intracelularno bojenje citokina. U mešanu kulturu je dodat fluoroforom konjugovan anti-CD107a i kultura je inkubirana 4 sata pre nego što su uzorci pripremlјeni za FACS analizu korišćenjem fluoroforom konjugovanih antitela protiv CD3, CD56 i IFN-gama. CD107a i IFN-gama bojenje je analizirano u CD3<->CD56<+>ćelijama za procenu aktivacije NK ćelija. Povećanje CD107a/IFN-gama dvostruko pozitivnih ćelija ukazuje na bolјu aktivaciju NK ćelija kroz angažovanje dva aktivirajuća receptora umesto jednog receptora.
[0158] TriNKET-i posreduju u aktivaciji humanih NK ćelija koje su kultivisane sa HER2-eksprimujućim SkBr-3 ćelijama (Sl. 47A), Colo201 ćelijama (Sl. 47B) i HCC1954 ćelijama (Sl. 47C), redom, kao što je naznačeno povećanjem degranulacije CD 107a i proizvodnjom IFN-gama. SkBr-3 ćelije i ćelije HCC1954 imaju visoke nivoe površinske ekspresije HER2, a Colo201 ima srednju ekspresiju HER2. U poređenju sa monoklonskim antitelom trastuzumabom, TriNKET pokazuju superiornu aktivaciju humanih NK ćelija u prisustvu humanih ćelija raka. Samo NK ćelije, NK ćelije plus SkBr-3 ćelije se koriste kao negativne kontrole.
[0159] TriNKET-i (C26-TriNKET-HER2 i F04-TriNKET-HER2) posreduju u aktivaciji humanih NK ćelija koje su kultivisane zajedno sa CD33-eksprimujućim humanim AML Mv4-11 ćelijama pokazali su povećanje degranulacije CD107a i proizvodnje IFN-gama. U poređenju sa monoklonskim anti-CD33 antitelom, TriNKETs (C26-TriNKET-HER2 i F04-TriNKET-HER2) su pokazali superiornu aktivaciju humanih NK ćelija u prisustvu humanih ćelija raka koje eksprimuju HER2 (Slike 47A-47C).
Primarne humane NK ćelije aktiviraju TriNKET u kokulturi sa ciljevima koji eksprimuju ćelijske linije humanog raka
[0160] Kokultivisanje primarnih humanih NK ćelija sa CD20-pozitivnim humanim ćelijama raka rezultiralo je TriNKET posredovanom aktivacijom primarnih humanih NK ćelija (Sl.62). TriNKET-i koji cilјaju CD20 (npr. C26-TriNKET-CD20 i F04-TriNKET-CD20), posredovani aktivacijom humanih NK ćelija koje su kultivisane sa CD20-pozitivnim Raji ćelijama, na šta ukazuje povećanje degranulacije CD107a i proizvodnje IFN γ citokina (Sl. 62). U poređenju sa monoklonskim antitelom Rituksimabom, oba TriNKET-a (npr. C26-TriNKET-CD20 i F04-TriNKET-CD20) su pokazala superiornu aktivaciju humanih NK ćelija (Sl.62).
Rituksimab_vH
[0161] Kokultivisanje primarnih humanih NK ćelija sa BCMA-pozitivnim MM.1S ćelijama mijeloma rezultiralo je TriNKET posredovanom aktivacijom primarnih humanih NK ćelija. TriNKET-i koji cilјaju BCMA (npr. C26-TriNKET-BMCA i F04-TriNKET-BMC A) su posredovali aktivaciji humanih NK ćelija koje su kultivisane sa MM.1S ćelijama mijeloma, na šta ukazuje povećanje degranulacije CD107a i proizvodnje IFN γ citokina (Sl. 63). U poređenju sa izotipom TriNKET-a, TriNKET koji ciljaju BCMA (npr. A44-TriNKET-BMCA, A49-TriNKET-BMCA, C26-TriNKET-BMCA, F04-TriNKET-BMCA, F43-TriNKET-BMCA, F43-TriNKET-BMCA, F47-TriNKET-BMCA i F63-TriNKET-BMCA) su pokazali povećanu aktivnost NK ćelija (Sl.63).
Primer 12 - Trispecifično vezujući proteini omogućavaju citotoksičnost cilјnih ćelija raka
[0162] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz trombocitno-leukocitnog međusloja humane periferne krvi korišćenjem centrifugiranja sa gradijentom gustine. NK ćelije (CD3<->CD56<+>) izolovane su upotrebom negativne selekcije sa magnetnim perlama iz PBMC, a čistoća izolovanih NK ćelija je uobičajeno bila >90%. Izolovane NK ćelije su kultivisane u medijumu koji sadrži 100 ng/mL IL-2 za aktivaciju ili su mirovale preko noći bez citokina. NK ćelije IL-2-aktivirane ili u mirovanju su korišćene sledećeg dana u testovima citotoksičnosti.
[0163] Da bi se testirala sposobnost humanih NK ćelija da liziraju ćelije raka u prisustvu TriNKET-a, korišćen je cyto Tox 96 test neradioaktivne citotoksičnosti kompanije Promega (G1780) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, humane ćelije raka koje eksprimuju tumorski antigen su sakuplјene, isprane i resuspendovane u medijumu za kulturu pri 1-2×10<5>/mL. NK ćelije u mirovanju i/ili aktivirane su sakuplјene, isprane i resuspendovane na 10<5>-2.0×10<6>/mL u istom medijumu za kulturu kao i ćelije raka. U svakom ležištu ploče sa 96 ležišta, 50 μl suspenzije ćelija raka je pomešano sa 50 μl suspenzije NK ćelija sa ili bez TriNKET-a koji cilјaju tumorski antigen eksprimovan na ćelijama raka. Posle inkubacije na 37 °C sa 5% CO2tokom 3 sata i 15 minuta, 10x pufer za lizu je dodat u ležišta koja sadrže samo ćelije raka, i u ležišta koja sadrže samo medijum za maksimalnu lizu i negativne kontrole reagensa, redom. Ploča je zatim vraćena u inkubator na dodatnih 45 minuta da bi se postiglo ukupno 4 sata inkubacije. Ćelije su zatim peletirane, a supernatant kulture je prebačen u novu ploču sa 96 ležišta i pomešan sa podlogom za razvoj. Nova ploča je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi, a apsorbancija je očitana na 492 nm na SpectraMax i3x. Procenat specifične lize ćelija raka izračunat je na sledeći način: % Specifične lize = ((eksperimentalna liza - spontana liza samo iz NK ćelija -spontana liza samo iz ćelija raka) / (Maksimalna liza - negativna kontrola reagensa)) × 100%.
[0164] TriNKET-i posreduju u citotoksičnosti humanih NK ćelija protiv CD33-pozitivne Molm-13 humane AML ćelijske linije. Kao što je prikazano na Sl. 53B, humane NK ćelije u mirovanju su pomešane sa Molm-13 ćelijama raka, a TriNKET-i (npr. C26-TriNKET-CD33 i F04-TriNKET-CD33) su u stanju da pojačaju citotoksičnu aktivnost humanih NK ćelija u mirovanju na način koji zavisi od doze protiv ćelija raka. Isprekidana linija ukazuje na citotoksičnu aktivnost NK ćelija u mirovanju bez TriNKET-a. Aktivirane humane NK ćelije su pomešane sa Molm-13 ćelijama raka, a TriNKET povećavaju citotoksičnu aktivnost aktiviranih humanih NK ćelija još više, u poređenju sa anti-CD33 antitelom, na način zavisi od doze protiv ćelija raka (Sl.53B).
[0165] TriNKET povećavaju citotoksičnost NK ćelija prema cilјevima sa niskom površinskom ekspresijom u poređenju sa citotoksičnom aktivnošću trastuzumaba, anti-HER2 monoklonskog antitela. Humane NK ćelije u mirovanju su pomešane sa SkBr tumorskim ćelijama koje eksprimuju visok HER2 i ćelijama raka 786-O sa niskim ekspresijom HER2, i ispitana je sposobnost TriNKET-a da pobolјša citotoksičnuaktivnost humanih NK ćelija u mirovanju protiv ćelija raka koje eksprimuju HER2 sa visokim i niskim nivoom na način koji je zavistan od doze. Isprekidane linije na Sl. 50A i Sl.
50B ukazuju na citotoksičnu aktivnost NK ćelija u mirovanju protiv ćelija raka u odsustvu TriNKET-a. Kao što je prikazano na Sl. 50B, nakon mešanja aktiviranih humanih NK ćelija sa 786-O ćelijama koje eksprimuju niski HER2, i TriNKET-a (npr. CD26-TriNKET-HER2 i F04-TriNKET-HER2) posmatrana je citotoksična aktivnost aktiviranih humanih NK ćelija protiv ćelija raka.
[0166] Ispitana je TriNKET posredovana liza BCMA pozitivnih ćelija mijeloma. Sl. 64 prikazuje-TriNKET posredovanu lizu BCMA-pozitivnih KMS12-PE ćelija mijeloma od humanih NK efektorskih ćelija u mirovanju. Dva TriNKET-a (cFAE-A49.801 i cFAE-A49.901) koji koriste isti domen koji se vezuje za NKG2D (A49), ali različite BCMA cilјane domene su testirana na efikasnost in vitro. Oba TriNKET-a su pobolјšala lizu NK ćelija KMS12-PE ćelija u sličnoj meri, ali TriNKET-i koji koriste cilјani domen EM-901 dali su povećanu potentnost.
[0167] Slika 65 prikazuje citotoksičnu aktivnost nekoliko TriNKET-a koji koriste različite domene za vezivanje NKG2D (A40, A44, A49, C26 i F47), ali isti cilјni domen BCMA. Promena domena vezivanja NKG2D TriNKET-a koji cilja BCMA proizvela je varijacije u maksimalnom ubijanju, kao i potentnosti TriNKET-a. Svi TriNKET-i su pokazali povećano ubijanje KMS12-PE cilјnih ćelija u poređenju sa EM-901 monoklonskim antitelom (Sl.65).
Primer 13
[0168] Ispitivano je sinergetsko aktiviranje humanih NK ćelija umrežavanjem NKG2D i CD 16.
Test aktivacije primarnih humanih NK ćelija
[0169] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz trombocitno-leukocitnog međusloja perifernih slojeva humane krvi pomoću centrifugiranja u gradijentu gustine. NK ćelije su prečišćene od PBMC pomoću negativnih magnetnih perli (StemCell # 17955). NK ćelije su bile >90% CD3-CD56<+>kako je utvrđeno protočnom citometrijom. Ćelije su zatim ekspandovane 48 sati u medijumu koji sadrži 100 ng/mL hIL-2 (Peprotech #200-02) pre upotrebe u testovima aktivacije. Antitela su naneta na ploču sa ravnim dnom sa 96 ležišta u koncentraciji od 2 μg/ml (anti-CD16, Biolegend # 302013) i 5 μg/mL (anti-NKG2D, R&D #MAB139) u 100 μl sterilnog PBS-a preko noći na 4 °C nakon čega sledi temelјno pranje ležišta da bi se uklonio višak antitela. Za procenu degranulacije IL-2-aktivirane NK ćelije su resuspendovane na 5×10<5>ćelija/ml u medijumu kulture sa dodatkom 100 ng/mL hIL2 i 1 μg/mL APC-konjugovanog anti-CD107a mAb (Biolegend # 328619). 1×10<5>ćelije/ležište su zatim dodati na ploče obložene antitelom. Inhibitori transporta proteina Brefeldin A (BFA, Biolegend # 420601) i Monensin (Biolegend # 420701) su dodati u konačnom razblaženju od 1:1000 i 1:270, redom. Postavlјene ćelije su inkubirane 4 sata na 37 ° C u 5% CO2. Za intracelularno bojenje IFN- γ NK ćelije su obeležene anti-CD3 (Biolegend #300452) i anti-CD56 mAb (Biolegend # 318328), a zatim su fiksirane i permeabilizovane i obeležene anti-IFN- γ mAb (Biolegend # 506507). NK ćelije su analizirane na ekspresiju CD107a i IFN- γ protočnom citometrijom nakon gejtinga na živim CD56<+>CD3<->ćelijama.
[0170] Da bi se istražila relativna potentnost kombinacije receptora, izvršeno je umrežavanje NKG2D ili CD16 i koumrežavanje oba receptora stimulacijom vezanom za ploču. Kao što je prikazano na Sl. 45 (Slike 45A-45C), kombinovana stimulacija CD16 i NKG2D je rezultirala visoko povišenim nivoima CD107a (degranulacijom) (Sl.45A) i/ili proizvodnjom IFN- γ (Sl.45B). Isprekidane linije predstavlјaju aditivni efekat pojedinačnih stimulacija svakog receptora.
[0171] Nivoi CD107a i intracelularna IFN- γ proizvodnja IL-2-aktiviranih NK ćelija analizirani su nakon 4 sata stimulacije vezane za ploču sa anti-CD16, anti-NKG2D ili kombinacijom oba monoklonska antitela. Grafikoni pokazuju srednju vrednost (n = 2) ± SD. Sl. 45A pokazuje nivoe CD107a; Sl. 45B pokazuje nivoe IFN γ; Sl. 45C pokazuje nivoe proizvodnje CD107a i IFN- γ . Podaci prikazani na Slikama 45A-45C su reprezentativni za pet nezavisnih eksperimenata koji koriste pet različitih zdravih donora.
[0172] Degranulacija CD107a i intracelularna IFN- γ proizvodnja IL-2-aktiviranih NK ćelija analizirane su nakon 4 sata stimulacije vezane za ploču sa trastuzumabom, anti-NKG2D ili TriNKET-om izvedenim iz vezujućih domena trastuzumaba i anti-NKG2D antitela (Sl. 46). U svim slučajevima, testirana antitela su bila izotip humanog IgG1. Grafikoni pokazuju srednju vrednost (n = 2) ± SD.
Primer 14
Procena vezivanja TriNKET-a za humani NKG2D eksprimovan u ćelijama
[0173] EL4 ćelije transdukovane sa humanim NKG2D korišćene su za testiranje vezivanja za humani NKG2D eksprimovan u ćelijama. TriNKET-i su razblaženi do 20 μg/mL, a zatim serijski razblaženi. Razblaženja mAb ili TriNKET su korišćena za bojenje ćelija, a vezivanje TriNKET ili mAb detektovano je korišćenjem fluoroforom konjugovanog sekundarnog anti-humanog IgG antitela. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom, vezujući MFI je normalizovan na sekundarne kontrole antitela da bi se dobila preklapanja u odnosu na pozadinske vrednosti.
Procena vezivanja TriNKET-a za ćelijski eksprimovane humane antigene raka
[0174] Ćelijske linije humanog karcinoma koje eksprimuju ili CD33 ili HER2 korišćene su za procenu vezivanja tumorskih antigena TriNKET-a izvedenih iz različitih klonova koji cilјaju NKG2D. Humana AML ćelijska linija MV4-11 je korišćena za procenu vezivanja TriNKET-a za CD33 eksprimovan u ćelijama. Ćelijska linija karcinoma bubrežnih ćelija 786-O eksprimuje niske nivoe HER2 i korišćena je za procenu vezivanja TriNKET-a za HER2 eksprimovan u ćelijama. TriNKET-i su razblaženi do 20 μg/mL, i inkubirani sa odgovarajućim ćelijama. Vezivanje TriNKET-a je detektovano korišćenjem fluoroforom konjugovanog sekundarnog anti-humanog IgG antitela. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom, vezivanje MFI za ćelijski eksprimovani CD33 i HER2 je normalizovan na sekundarne kontrole antitela da bi se dobile dobila preklapanja u odnosu na pozadinske vrednosti.
Određivanje kapaciteta vezivanja antitela kod humanih HER2-pozitivnih ćelijskih linija raka
[0175] Izmeren je kapacitet vezivanja antitela (ABC) HER2-pozitivnih humanih ćelijskih linija raka. Korišćen je Quantum Simply Cellular kit iz Bangs Lab-a (#815), a uputstva proizvođača su poštovana za pripremu perli označenih antitelom. Ukratko, svaka od četiri populacije perli je obojena zasićenom količinom anti-HER2 antitela, a ćelijske populacije su, takođe, obojene zasićenom količinom istog antitela. Podaci o uzorku su prikuplјeni za svaku populaciju perli, kao i za populacije ćelija. QuickCal radni list, isporučen sa kompletom, korišćen je za generisanje standardne krive i ekstrapolaciju ABC vrednosti za svaku ćelijsku liniju.
Aktivacija primarnih NK ćelija pomoću TriNKET-a
[0176] PBMCs su izolovane iz trombocitno-leukocitnog međusloja humane periferne krvi pomoću centrifugiranja sa gradijentom gustine. Izolovane PBMC su isprane i pripremlјene za izolaciju NK ćelija. NK ćelije su izolovane primenom tehnike negativne selekcije sa magnetnim perlama; čistoća izolovanih NK ćelija je uobičajeno bila >90% CD3-CD56+. Izolovane NK ćelije su kultivisane u medijumu koji sadrži 100 ng/mL IL-2 za aktivaciju ili su mirovale preko noći bez citokina. IL-2-aktivirane NK ćelije su korišćene 24-48 sati kasnije; NK ćelije u mirovanju su uvek korišćene dan nakon prečišćavanja.
[0177] Ćelijske linije humanog raka koje eksprimuju cilј raka od interesa su sakuplјene iz kulture, a ćelije su podešene na 2×10<6>/mL. Monoklonska antitela ili TriNKET-i koji cilјaju cilј raka od interesa su razblaženi u medijumu za kulturu. NK ćelije u mirovanju i/ili aktivirane su sakuplјene iz kulture, ćelije su isprane i resuspendovane na 2×10<6>/mL u medijumu za kulturu. IL-2 i anti-CD107a konjugovani fluoroforom su dodati NK ćelijama za aktivacionu kulturu. Brefeldin-A i monenzin su razblaženi u medijumu za kulturu da bi se blokirao transport proteina iz ćelije radi bojenja intracelularnih citokina. U ploču sa 96 ležišta dodato je 50 μl tumorskih ciljeva, mAbs/TriNKET, BFA/monenzin i NK ćelije za ukupnu zapreminu kulture od 200 μl. Ploča je kultivisana 4 sata pre nego što su uzorci pripremlјeni za FACS analizu.
[0178] Posle 4-časovne aktivacione kulture, ćelije su pripremlјene za analizu protočnom citometrijom korišćenjem fluoroforom konjugovanih antitela protiv CD3, CD56 i IFN γ. Bojenje CD107a i IFN γ je analizirano u CD3-CD56+ populacijama da bi se procenila aktivacija NK ćelija.
Ispitivanje citotoksičnosti primarne humane NK ćelije
[0179] PBMCs su izolovane iz trombocitno-leukocitnog međusloja humane periferne krvi pomoću centrifugiranja sa gradijentom gustine. Izolovane PBMC su isprane i pripremlјene za izolaciju NK ćelija. NK ćelije su izolovane primenom tehnike negativne selekcije sa magnetnim perlama, čistoća izolovanih NK ćelija je uobičajeno bila >90% CD3-CD56+. Izolovane NK ćelije su kultivisane u medijumu koji sadrži 100 ng/mL IL-2 ili su mirovale preko noći bez citokina. NK ćelije IL-2-aktivirane ili u mirovanju su korišćene sledećeg dana u testovima citotoksičnosti.
Cyto Tox 96 LHD test oslobađanja:
[0180] Sposobnost humanih NK ćelija da lizuju tumorske ćelije merena je sa ili bez dodavanja TriNKET-a korišćenjem cyto Tox 96 testa neradioaktivne citotoksičnosti kompanije Promega (G1780). Ćelijske linije humanog raka koje eksprimuju cilј raka od interesa su sakuplјene iz kulture, ćelije su isprane PBS-om i resuspendovane u medijumu za rast na 1-2×10<5>/mL za upotrebu kao cilјne ćelije. 50 μl suspenzije cilјnih ćelija je dodato u svako ležište. Monoklonska antitela ili TriNKET koji cilјaju antigen raka od interesa su razblaženi u medijumu za kulturu, 50 μl razblaženog mAb ili TriNKET-a je dodato u svako ležište. NK ćelije u mirovanju i/ili aktivirane su sakuplјene iz kulture, ćelije su isprane i resuspendovane na 10<5>-2.0×10<6>/mL u medijumu za kulturu u zavisnosti od želјenog E:T odnosa. 50 μl NK ćelija je dodato u svaki bunar ploče da bi se dobila ukupna zapremina kulture od 150 μl. Ploča je inkubirana na 37 °C sa 5% CO2tokom 3 sata i 15 minuta. Posle inkubacije, 10x pufer za lizu je dodat samo u ležišta sa cilјnim ćelijama, i u ležišta koji sadrže samo medijum, za maksimalnu kontrolu lize i zapremine. Ploča je zatim stavlјena nazad u inkubator na dodatnih 45 minuta, da bi se inkubirala ukupno 4 sata pre razvoja.
[0181] Posle inkubacije, ploča je uklonjena iz inkubatora i ćelije su peletirane centrifugiranjem na 200 g tokom 5 minuta.
50 μl supernatanta kulture je prebačeno u čistu mikroploču i 50 μl rastvora supstrata je dodato u svako ležište. Ploča je zaštićena od svetlosti i inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi. 50 μl stop rastvora je dodato u svako ležište, a apsorbancija je očitana na 492 nm na SpectraMax i3x. % specifične lize je izračunat na sledeći način: % Specifične lize = ((Eksperimentalno oslobađanje - Spontano oslobađanje iz efektora - Spontano oslobađanje iz cilјa) / (Maksimalno oslobađanje - Spontano oslobađanje)) * 100%.
DELFIA test citotoksičnosti:
[0182] Ćelijske linije humanog karcinoma koje eksprimuju cilј od interesa su sakuplјene iz kulture, ćelije su isprane PBS-om i ponovo suspendovane u medijumu za rast na 10<6>/mL za obeležavanje sa BATDA reagensom (Perkin Elmer AD0116). Praćena su uputstva proizvođača za obeležavanje cilјnih ćelija. Nakon obeležavanja ćelije su isprane 3x sa PBS-om i resuspendovane na 0,5-10×10<5>/mL u medijumu za kulturu. Da bi se pripremila pozadinska ležišta, alikvot obeleženih ćelija je stavlјen na stranu, a ćelije su izvučene iz medijuma.100 μl medijuma je pažlјivo dodato u ležišta u tri primerka da bi se izbeglo ometanje peletiranih ćelija.100 μl BATDA obeleženih ćelija je dodato u svako ležište ploče sa 96 ležišta. Ležišta su sačuvana za spontano oslobađanje iz cilјnih ćelija, a ležišta su pripremlјena za maksimalnu lizu cilјnih ćelija dodavanjem 1% Triton-X. Monoklonska antitela ili TriNKET protiv tumorskog cilja od interesa su razblažena u medijumu za kulturu i 50 μl razblaženog mAb ili TriNKET-a je dodato u svako ležište. NK ćelije u mirovanju i/ili aktivirane su sakuplјene iz kulture, ćelije su isprane i resuspendovane na 10<5>-2.0×10<6>/mL u medijumu za kulturu u zavisnosti od želјenog E:T odnosa. 50 μl NK ćelija je dodato u svako ležište ploče da bi se dobila ukupna zapremina kulture od 200 μl. Ploča je inkubirana na 37 °C sa 5% CO2tokom 2-3 sata pre razvijanja testa.
[0183] Posle kultivisanja tokom 2-3 sata, ploča je uklonjena iz inkubatora i ćelije su peletirane centrifugiranjem na 200 g tokom 5 minuta. 20 μl supernatanta kulture je prebačeno na čistu mikroploču koju je obezbedio proizvođač, u svako ležište je dodato 200 μl rastvora evropijuma sobne temperature. Ploča je zaštićena od svetlosti i inkubirana na šejkeru za ploče na 250 rpm tokom 15 minuta. Ploča je očitana pomoću instrumenata Victor 3 ili SpectraMax i3X. % specifične lize je izračunat na sledeći način: % Specifične lize = ((Eksperimentalno oslobađanje - Spontano oslobađanje) / (Maksimalno oslobađanje - Spontano oslobađanje)) * 100%.
Dugotrajni test humane PBMC citotoksičnosti:
[0184] SkBr-3 cilјne ćelije su obeležene sa BacMam 3.0 NucLight Green (#4622) da bi se omogućilo praćenje cilјnih ćelija. Za obeležavanje SkBr-3 cilјnih ćelija poštovan je protokol proizvođača. Annexin V Red (Essen Bioscience #4641) je razblažen i pripremlјen prema uputstvima proizvođača. Monoklonska antitela ili TriNKET su razblažena u medijumu za kulturu.50 μl mAbs ili TriNKET-a, Annexin V i NK ćelije u mirovanju dodato je u ležišta ploče sa 96 ležišta koja već sadrži obeležene SkBr-3 ćelije; Dodato je 50 ul kompletnog medijuma za kulturu za ukupno 200 μl zapremine kulture.
[0185] Kolekcija slika je postavlјena na IncuCyte S3. Slike za fazni, zeleni i crveni kanal prikuplјane su svakog sata, sa 2 slike po ležištu. Analiza slike je urađena korišćenjem softvera IncuCyte S3. Stvorene su maske za zeleni i crveni kanal za brojanje broja tumorskih ćelija, odnosno ćelija pozitivnih na annexin V. Za izračunavanje % annexin V pozitivnih Mv4-11 cilјnih ćelija korišćena je sledeća formula. % Annexin V pozitivnih SkBr-3 ćelija = ((broj objekata koji se preklapaju) / (broj zelenih objekata)) * 100%.
Poređenje TriNKET-a koji cilјa na HER+ ćelije raka sa SC2.2
[0186] TriNKET koji cilјa na HER2 efikasniji je od Trastuzumaba u smanjenju broja ćelija SkBr-3, a samo 60% ćelija iz vremena nula je ostalo nakon 60 sati. TriNKET predmetnog pronalaska koji cilјa ćelije tumora/karcinoma koje eksprimuju HER2 efikasniji je nego SC2.2 - jednolančani bispecifični molekul izgrađen od scFv dobijenog od trastuzumaba povezanog sa ULBP-6, liganda za NKG2D. SC2.2 vezuje HER2+ ćelije raka i NKG2D+ NK ćelije istovremeno. Stoga je ispitana efikasnost SC2.2 u smanjenju broja HER2+ ćelija raka. In vitro testovi aktivacije i citotoksičnosti su pokazali da je SC2.2 efikasan u aktiviranju i ubijanju NK ćelija. Međutim, SC2.2 nije uspeo da pokaže efikasnost u RMA/S-HER2 modelu supkutanog tumora. Takođe je testirana efikasnost SC2.2 in vivo korišćenjem RMA/S-HER2 singenskog modela miša sa prekomernom ekspresijom. U ovom modelu miša, SC2.2 nije uspeo da pokaže kontrolu rasta tumora u poređenju sa kontrolom nosača. Dakle, iako je SC2.2 bio u stanju da aktivira i ubije NK ćelije i vezuje se za HER2+ ćelije raka, ova svojstva su bila nedovolјna da efikasno kontrolišu rast tumora HER2+.
Procena poluživota SC2.2 u serumu kod C57B1/6 miševa
[0187] Da bi se odredio poluživot SC2.2 u serumu kod C57Bl/6 miševa, SC2.2 je obeležen fluorescentnom oznakom da bi se pratila njegova koncentracija in vivo. SC2.2 je označen sa IRDye 800CW (Licor #929-70020). Obeleženi protein je ubrizgan intravenozno u 3 miša C57Bl/6, krv je uzeta od svakog miša u naznačenim vremenskim tačkama. Nakon sakuplјanja, krv je centrifugirana na 1000 g tokom 15 minuta i serum je sakuplјen iz svakog uzorka i čuvan na 4°C dok se ne sakupe sve vremenske tačke.
[0188] Serum je snimlјen korišćenjem Odyssey CLx infracrvenog sistema za snimanje, fluorescentni signal sa 800 kanala je kvantifikovan korišćenjem softvera Image J. Intenzitet slike je normalizovan na prvu vremensku tačku, a podaci su prilagođeni dvofaznoj jednačini raspada. U ovom eksperimentalnom sistemu beta poluživot SC2.2 je izračunat na oko 7 sati.
In vivo testiranje SC2.2 protiv RMA/S-HER2 supkutanih tumora
[0189] In vivo studija je dizajnirana prema SI.56 za testiranje efikasnosti SC2.2 protiv supkutanih RMA/S-HER2 tumora.
10<6>RMA/S ćelije transdukovane sa humanim HER2 su ubrizgane supkutano u bok 20 C57Bl/6 miševa. Počevši od 2. dana nakon inokulacije tumora, SC2.2 je doziran dnevno putem IP injekcije. SC2.2 je doziran u visokim i niskim koncentracijama zajedno sa kontrolnim vehikulumom. Počevši od 4. dana nakon inokulacije tumora, tumori su mereni u ponedelјak, sredu i petak tokom trajanja studije. Zapremina tumora je izračunata korišćenjem sledeće formule: zapremina tumora = dužina × širina × visina
TriNKET-i se vezuju za ćelije koje eksprimuju humani NKG2D
[0190] Određena je sposobnost TriNKET-a da veže ćelije koje eksprimuju humani NKG2D. Sl. 37 i Sl. 38 pokazuju vezivanje dva TriNKET-a zavisna od doze koji sadrže različite domene za vezivanje NKG2D. Sl.37 prikazuje vezivanje dva TriNKET-a kada se domen koji se vezuje za CD33 koristi kao drugi ciljajući krak. Sl. 38 prikazuje ista dva domena koja se vezuju za NKG2D koja su sada uparena sa HER2 drugim ciljajućim krakom. Šest domena koji se vezuju za NKG2D zadržavaju isti profil vezivanja sa oba domena koja ciljaju tumor.
TriNKET se vezuju za ćelije koje eksprimuju humane antigene raka
[0191] Utvrđena je sposobnost TriNKET-a da veže ćelije koje eksprimuju humane antigene raka. Sl. 41 i Sl. 42 pokazuju vezivanje TriNKET-a za ćelijski eksprimovani CD33 (Sl. 41) i HER2 (Sl.42). Vezivanje TriNKET-a za ćelijski eksprimovani antigen bilo je konzistentno između domena koji se vezuju za NKG2D. TriNKET-i su vezani za uporedive nivoe kao roditelјska monoklonska antitela.
Kapacitet vezivanja antitela humanih HER2-pozitivnih ćelijskih linija raka
[0192] Tabela 9 prikazuje rezultate površinske kvantifikacije HER2. Identifikovano je da ćelije SkBr-3 i HCC1954 imaju visoke (+++) nivoe površinskog HER2. ZR-75-1 i Colo201 su pokazale srednje nivoe (++) površinskog HER2, a 786-O su pokazale najniži nivo HER2 (+).
T l :AB HER2- ziivnih li kih lini r k
Primarne humane NK ćelije aktiviraju TriNKET u kokulturi sa humanim linijama raka koje eksprimuju različite nivoe HER2
[0193] Slike 47A - 47C pokazuju da su TriNKET i trastuzumab bili u stanju da aktiviraju primarne humane NK ćelije u kokulturi sa HER2-pozitivnim humanim tumorskim ćelijama, što je naznačeno povećanjem degranulacije CD107a i proizvodnje IFN γ citokina. U poređenju sa monoklonskim antitelom trastuzumabom, oba TriNKET-a su pokazala superiornu aktivaciju humanih NK ćelija kod različitih humanih HER2 ćelija raka.
[0194] Sl. 47A pokazuje da se humane NK ćelije aktiviraju TriNKET-ima kada se uzgajaju sa SkBr-3 ćelijama. Sl.47B pokazuje da se humane NK ćelije aktiviraju TriNKET-ima kada se uzgajaju sa Colo201 ćelijama. Sl. 47C pokazuje da se humane NK ćelije aktiviraju TriNKET-ima kada se uzgajaju sa ćelijama HCC1954.
TriNKET povećavaju aktivnost humanih NK ćelija u mirovanju i IL-2-aktiviranih
[0195] Sl. 48A - 48B pokazuju TriNKET posredovanu aktivaciju humanih NK ćelija u mirovanju ili IL-2 aktiviranih u kokulturi sa humanom ćelijskom linijom AML MV4-11 koja ekspresuje CD33. Sl. 48A prikazuje TriNKET posredovanu aktivaciju humanih NK ćelija u mirovanju. Sl. 48B prikazuje TriNKET posredovanu aktivaciju humanih NK ćelija aktiviranih IL-2 od istog donora. NK ćelije u mirovanju su pokazale manju proizvodnju IFN γ u pozadini i degranulaciju CD107a nego IL-2-aktivirane NK ćelije. NK ćelije u mirovanju pokazale su veću promenu u proizvodnji IFN γ i degranulaciji CD107a u poređenju sa IL-2 aktiviranim NK ćelijama. IL-2-aktivirane NK ćelije su pokazale veći procenat ćelija koje postaju IFN γ+; CD107a+ nakon stimulacije sa TriNKET-ima.
TriNKET povećavaju citotoksičnost humanih NK ćelija u mirovanju i IL-2 aktiviranih
[0196] Sl. 49A - 49B pokazuju TriNKET pobolјšanje citotoksične aktivnosti korišćenjem humanih NK ćelija IL-2 aktiviranih i u mirovanju. Sl.49A prikazuje procentualno specifičnu lizu tumorskih ćelija SkBr-3 od strane humanih NK ćelija u mirovanju. Sl. 49B prikazuje procentualno specifičnu lizu tumorskih ćelija SkBr-3 pomoću humanih NK ćelija aktiviranih IL-2. Populacije NK ćelija aktivirane IL-2 i u mirovanju potekle su od istog donora. U poređenju sa trastuzumabom, TriNKET-i snažnije usmeravaju odgovore na SkBr-3 ćelije populacijama NK ćelija bilo aktiviranim ili u mirovanju.
TriNKET povećavaju citotoksičnost NK ćelija protiv cilјeva sa niskom površinskom ekspresijom
[0197] Sl. 50A-50B pokazuju da TriNKET-i obezbeđuju veću prednost protiv raka sa srednjim i niskim HER2 u poređenju sa trastuzumabom. Sl.50A prikazuje aktivirano ubijanje od strane humanih NK ćelija SkBr-3 tumorskih ćelija sa visokim nivoom HER2. Sl. 50B prikazuje ubijanje od strane humanih NK ćelija tumorskih ćelija 786-O sa niskim nivoom HER2. TriNKET-i obezbeđuju veću prednost u poređenju sa trastuzumabom protiv ćelija raka sa niskom ekspresijom HER2. TriNKET-i obezbeđuju najveću prednost u odnosu na ciljeve sa niskom površinskom ekspresijom.
Prednost TriNKET-a u lečenju raka sa visokom ekspresijom FcR, ili u tumorskim mikrookruženjima sa visokim nivoima FcR
[0198] Terapija monoklonskim antitelima je odobrena za lečenje mnogih tipova raka, uklјučujući i hematološke i solidne tumore. Dok je upotreba monoklonskih antitela u lečenju raka pobolјšala ishode pacijenata, još uvek postoje ograničenja. Mehanističke studije su pokazale da monoklonska antitela ispolјavaju svoje efekte na rast tumora kroz više mehanizama uklјučujući ADCC, CDC, fagocitozu i blokadu signala između ostalog. [0199] Najvažnije, smatra se da je ADCC glavni mehanizam kroz koji monoklonska antitela ostvaruju svoj efekat. ADCC se oslanja na angažovanje Fc antitela na FcyRIII niskog afiniteta (CD16) na površini prirodnih ćelija ubica, koje posreduju u direktnoj lizi tumorske ćelije. Među FcyR, CD16 ima najniži afinitet za IgG Fc, FcyRI (CD64) je FcR visokog afiniteta i vezuje se oko 1000 puta jače za IgG Fc nego CD16.
[0200] CD64 se normalno eksprimuje na mnogim hematopoetskim linijama kao što je mijeloidna linija, i može se eksprimovati na tumorima koji potiču od ovih tipova ćelija, kao što je akutna mijeloidna leukemija (AML). Imunske ćelije koje se infiltriraju u tumor, kao što su MDSC i monociti, takođe eksprimuju CD64 i poznato je da infiltriraju mikrookruženje tumora. Ekspresija CD64 u tumoru ili u mikrookruženju tumora može imati štetan efekat na terapiju monoklonskim antitelima. Ekspresija CD64 u mikrookruženju tumora otežava ovim antitelima da angažuju CD16 na površini NK ćelija, pošto antitela više vole da vezuju receptor visokog afiniteta. Kroz cilјanje na dva aktivirajuća receptora na površini NK ćelija, TriNKET-i mogu biti u stanju da prevaziđu štetan efekat ekspresije CD64 na terapiju monoklonskim antitelima.
Ekspresija FcRyI (CD64) na tri AML ćelijske linije
[0201] In vitro sistem kulture je razvijen da testira aktivnost TriNKET-a i monoklonskih antitela protiv tumora sa visokim i niskim nivoima površinske ekspresije CD64. Molm-13 i THP-1 su dve humane AML ćelijske linije koje imaju sličnu ekspresiju površinskog CD33, ali Molm-13 ćelije ne eksprimuju CD64, dok ćelije THP-1 eksprimuju CD64 na svojoj površini (Slike 51A - 51C). Korišćenjem monoklonskih antitela ili TriNKET-a usmerenih na cilјni CD33, testiran je efekat ekspresije CD64 od strane tumora na monoklonsko antitelo ili TriNKET terapiju. Sl. 51A - 51C pokazuju ekspresiju FcR γI (CD64) visokog afiniteta na tri humane AML ćelijske linije, Molm-13 ćelijsku liniju (Sl. 51A), Mv4-11 ćelijsku liniju (Sl. 51B) i THP-1 ćelijsku liniju (Sl. 51C). Molm-13 ćelije ne eksprimuju CD64, dok ćelije Mv4-11 imaju nizak nivo, a THP-1 visok nivo ćelijske površine CD64.
TriNKET-i imaju prednost u cilјanju tumorskih ćelija sa visokom površinskom ekspresijom FcR-a
[0202] Sl. 52A-52B pokazuju aktivaciju humanih NK ćelija posredovanu monoklonskim antitelom ili TriNKET-om u kokulturi sa Molm-13 (Sl. 52B) ili THP-1 (Sl. 52A) ćelijama. Monoklonsko antitelo protiv humanog CD33 pokazalo je dobru aktivaciju humanih NK ćelija, u sistemu kokulture Molm-13, što je dokazano povećanom degranulacijom CD107a i proizvodnjom IFN γ . Monoklonsko antitelo nema efekta u sistemu kokulture THP-1, gde su visoki nivoi CD64 prisutni na tumoru. Zanimlјivo je da su TriNKET-i bili efikasni i protiv Molm-13 (Sl. 52B) i THP-1 (Sl. 52A) ćelija, dok monoklonska antitela ne uspevaju da aktiviraju NK ćelije u kulturi sa FcR-Hi THP-1 ćelijama, što ukazuje na to da su TriNKET-i u stanju da prevazilaze vezivanje za CD64 na tumoru i efikasno cilјaju NK ćelije za aktivaciju. Dvostruko cilјanje dva aktivirajuća receptora na NK ćelijama obezbedilo je jače specifično vezivanje za NK ćelije. Monoklonska antitela, koja cilјaju samo CD16 na NK ćelijama, mogu biti vezana drugim FcR-ovima visokog afiniteta i sprečiti angažovanje CD16 na NK ćelijama.
[0203] Testovi citotoksičnosti humanih NK ćelija korišćenjem sistema kokulture Molm-13 i THP-1 obezbeđuju dodatne dokaze koji podržavaju efikasnost TriNKET-a u prisustvu visokog nivoa CD64. U ovim testovima citotoksičnosti je korišćena treća humana AML ćelijska linija, Mv4-11. Ćelije Mv4-11 (Sl. 51B) eksprimuju niske nivoe CD64 i spada između THP-1 (Sl.51C) i Molm-13 (Sl.51A) ćelija po nivima CD64 na svojoj površini.
TriNKET-i pokazuju efikasnost na AML ćelijskim linijama bez obzira na ekspresiju FcyRI
[0204] Slike 53A - 53C pokazuju testove humane NK citotoksičnosti koristeći tri humane AML ćelijske linije kao ciljeve. Monoklonsko antitelo protiv CD33 pokazuje dobru efikasnost protiv Molm-13 ćelija (Sl.53B), koje ne eksprimuju CD64. Mv4-11 ćelije (Sl. 53A), koje eksprimuju CD64, ali na nižem nivou od THP-1, pokazale su smanjenu efikasnost sa monoklonskim anti-CD33. THP-1 ćelije (Sl.53C) nisu pokazale nikakav efekat samo sa monoklonskim anti-CD33. Bez obzira na ekspresiju CD64 na tumorskim ćelijama, TriNKET-i su bili u stanju da posreduju u odgovorima humanih NK ćelija protiv svih tumorskih ćelija koje su ovde testirane.
[0205] Slike 53A - 53C pokazuju da su THP-1 ćelije zaštićene od terapije monoklonskim antitelima, zbog visokog nivoa ekspresije FcR visokog afiniteta na njihovoj površini. TriNKET-i su zaobišli ovu zaštitu cilјajući dva aktivirajuća receptora na površini NK ćelija. Podaci o citotoksičnosti direktno su korelirali sa onim što je viđeno u eksperimentima aktivacije kokulture. TriNKET-i su bili u stanju da zaobiđu zaštitu od terapije mAb-om uočenu kod THP-1 ćelija i indukuju lizu posredovanu NK ćelijama uprkos visokim nivoima FcR.
Ubijanje normalnih mijeloidnih i normalnih B ćelija u PBMC kulturama: TriNKET-i obezbeđuju bolјi bezbednosni profil kroz manje neželјenih efekata van tumora na cilju
[0206] Prirodne ćelije ubice i CD8 T ćelije su sposobne da direktno lizuju tumorske ćelije, iako se razlikuju mehanizmi preko kojih NK ćelije i CD8 T ćelije prepoznaju svoje normalne ćelije od tumorskih ćelija. Aktivnost NK ćelija je regulisana balansom signala aktivacionih (NCR, NKG2D, CD16, itd.) i inhibitornih (KIR, NKG2A, itd.) receptora. Ravnoteža ovih aktivirajućih i inhibitornih signala omogućava NK ćelijama da odrede zdrave sopstvene ćelije od stresnih, virusno inficiranih ili transformisanih sopstvenih ćelija. Ovaj ‘ugrađeni’ mehanizam samotolerancije će pomoći u zaštiti normalnog zdravog tkiva od odgovora NK ćelija. Da bi se proširio ovaj princip, samotolerancija NK ćelija će omogućiti TriNKET-ima da cilјaju antigene eksprimovane i na sebi i na tumoru bez neželјenih efekata van tumora, ili sa povećanim terapijskim okvirom.
[0207] Za razliku od prirodnih ćelija ubica, T ćelije zahtevaju prepoznavanje specifičnog peptida predstavlјenog MHC molekulima za aktivaciju i efektorske funkcije. T ćelije su bile primarni cilj imunoterapije, a razvijene su mnoge strategije za preusmeravanje odgovora T ćelija protiv tumora. Bispecifičnosti T ćelija, inhibitori kontrolnih tačaka i CAR-T ćelije su svi odobreni od strane FDA, ali često pate od toksičnosti koja ograničava dozu. Bispecifičnosti T ćelija i CAR-T ćelije rade na TCR-MHC sistemu za prepoznavanje korišćenjem domena vezivanja za cilјanje antigena na površini tumorskih ćelija i korišćenjem projektovanih signalnih domena za transdukciju aktivacionih signala u efektorske ćelije. Iako su efikasne u izazivanju antitumorskog imunološkog odgovora, ove terapije su često povezane sa sindromom oslobađanja citokina (CRS) i neželјenim efektima van tumora. TriNKET-i su jedinstveni u ovom kontekstu jer neće „nadjačati/premostiti” prirodne sisteme aktivacije i inhibicije NK ćelija. Umesto toga, TriNKET-i su dizajnirani da utiču na ravnotežu i obezbeđuju dodatne aktivacione signale NK ćelijama, istovremeno održavajući NK toleranciju prema sopstvenim zdravim ćelijama.
[0208] PBMC su izolovane iz pune krvi centrifugiranjem u gradijentu gustine. Bilo koja kontaminirajuća crvena krvna zrnca su lizirana inkubacijom u ACK puferu za lizu. PBMC su isprane 3x u PBS-u i izbrojane su ukupne PBMC. PBMC su prilagođene na 106/mL u primarnoj podlozi za kulturu ćelija. 1 mL PBMC je zasejano u ležišta ploče sa 24 ležišta, naznačeni TriNKET-i ili mAbs su dodati PBMC kulturama u količini od 10 µg/mL. Ćelije su kultivisane preko noći na 37°C sa 5% CO2. Sledećeg dana (24 sata kasnije) PBMC su sakuplјene iz kulture i pripremlјene za FACS analizu. Procenat CD45+; CD19+ B ćelije i CD45+; CD33+; CD11b+ mijeloidnih ćelija je analiziran u različitim grupama za lečenje.
[0209] Sl. 54B i 54D pokazuju da su autologne mijeloidne ćelije zaštićene od odgovora NK ćelija posredovanih TriNKET-om. Sl. 54A i 54B pokazuju da su B ćelije od zdravog donora osetlјive na TriNKET posredovanu lizu, dok su mijeloidne ćelije otporne na TriNKET lizu. PBMC-ovi tretirani sa TriNKET-ima koji cilјaju na CD20 pokazali su smanjenu učestalost CD19+ B ćelija sa populacijom CD45+ limfocita (Sl. 54A), ali bez efekta u populaciji CD45+, CDD3-, CD56-limfocita (Sl. 54C). U ovim kulturama učestalost CD45+, CD19+ mijeloidnih ćelija (Sl. 54B), ili učestalost CD33+, CD 33+, CD11b+ mijeloidnih ćelija (Sl.54D) je bila nepromenjena.
TriNKET-i posreduju u hPBMC ubijanju SkBr-3 tumorskih ćelija u dugotrajnim kokulturama
Test citotoksičnosti primarne humane PBMC
[0210] Sl. 55 prikazuje dugotrajno ubijanje SkBr-3 ćelija u kulturi sa humanim PBMC. Kada se kultivišu same SkBr-3 ćelije proliferišu i skoro se udvostruče za 60 sati. Kada se humani PBMC dodaju SkBr-3 ćelijama u kulturi, brzina proliferacije je usporena, a kada se doda kontrolni izotip TriNKET koji cilјa na CD33, proliferacija je takođe usporena, ali u manjoj meri. Kada se kulture tretiraju sa Trastuzumab SkBr-3 više se ne razmnožavaju, a posle 60 sati ostaje samo 80% ćelija iz vremena nula. Pošto su SkBr-3 ćelije osetlјive na blokadu HER2 signala, efekat na rast ćelija SkBr-3 može da bude posredovan blokadom HER2 signala ili preko Fc efektorskih funkcija kao što je ADCC.
Primer 15
Anti-tumorska efikasnost mcFAE-C26.99 TriNKET-a in vitro
[0211] Da bi se verifikovale aktivnosti vezivanja mišjeg cFAE-C26.99 TriNKET-a, mereno je direktno vezivanje u poređenju sa njegovim monoklonskim antitelima testovima protočne citometrije protiv Tyrp-1-pozitivnih B 16F 10 ćelija melanoma (Sl.58A) i EL4 linije koja prekomerno eksprimuje mišje NKG2D (EL4-mNKG2D, Sl.58B).
[0212] Da bi se testiralo da li su mcFAE-C26.99 TriNKET-i zadržali sposobnost posredovanja u citotoksičnosti, mereno je ubijanje Tyrp-1-pozitivnih tumorskih ciljeva B16F10 pomoću IL-2-aktiviranih mišjih NK ćelija. Kao što je prikazano na Sl. 59, mišje NK ćelije su povećale svoju citotoksičnu aktivnost u prisustvu mcFAE-C26.99. Važno je da je anti-Tyrp-1 monoklonsko antitelo TA99 pokazalo samo marginalne efekte.
Povećana NK citotoksičnost posredovana mcFAE-C26.99 TriNKET-om
[0213] Oko 5×10<3>B 16F 10 ćelija melanoma po ležistu je zasejano dva dana pre testa. Na dan eksperimenta 5×10<4>IL-2 aktivirane mišje NK ćelije su dodate u prisustvu TA99 mab-a ili mcFAE-C26.99 TriNKET-a (mcFAE-C26.99 je heterodimer mC26 i TA99 sa mišjim IgG2c kao Fc. Gm mutacije se odnose na korišćene heterodimerizacione mutacije da bi se dobio heterodimer). Korišćeno je 20 μg/mL antitela sa četvorostrukim razblaženjima. Posle 4 sata kokulture, procenat citotoksičnosti je procenjen korišćenjem CytoTox96 kompleta za oslobađanje LDH. Isprekidana linija predstavlјa polaznu (osnovnu) citotoksičnost u odsustvu antitela.
mC26_hvL_mCL (podeblјan deo) (kurzivom podvučene amino-kiseline su heterodimerizacione mutacije koje se koriste za stvaranje heterodimera):
Primer 16
Antitumorska efikasnost mcFAE-C26.99 TriNKET-a in vivo
[0214] Da bi se testiralo da li mcFAE-C26.99 izaziva antitumorske funkcije in vivo, miševima C57BL/6 je supkutano ubrizgano 2×10<5>B16F10 tumorskih ćelija. Miševi su tretirani ili izotipskom kontrolom, monoklonskim TA99 antitelom ili sa mcFAE-C26.99 TriNKET-om. Tretman monoklonskim TA99 antitelom pokazao je sličnu progresiju tumora kao u kontrolnoj grupi tretiranoj izotipom. Međutim, administriranje mcFAE-C26.99 TriNKET-a je rezultiralo odloženom progresijom tumora u poređenju sa grupom tretiranom izotipom. Oko 2×10<5>ćelija melanoma B16F10 je ubrizgano supkutano u bok C57BL/6 miševa. Šestog dana nakon inokulacije, tumora miševi su randomizirani (n=10 po grupi). Miševi su tretirani intraperitonealno sa (Sl. 60A) izotipskim kontrolnim mišjim IgG2a mab C1.18.4 i mišjim anti-Tyrp-1 monoklonskim antitelom ili (Sl. 60B) izotipskim kontrolnim mišjim IgG2a mab C1.18.4 i mcFAE-C26.99 TriNKET-om, ubrizganim u dozi od 150 μg (dani 6, 8, 10, 12, 14, 16 i 21). Rast tumora je procenjen tokom 28 dana. Grafikoni pokazuju krive rasta tumora kod pojedinačnih miševa.
[0215] Pored potkožnog modela tumora B16F10, mcFAE-C26.99 TriNKET je takođe testiran na efikasnost tumora u okruženju diseminovanog tumora.1×10<5>B16F10 ćelije su intravenozno ubrizgane miševima. Tretman je započeo ili 4. ili 7. dana sa niskom (300 μg/injekcija) i visokom (600 μg/injekcija) dozom antitela. 18. dana nakon inokulacije tumora, izbrojane su plućne metastaze. Tretman započet 4. i 7. dana nakon inokulacije tumora rezultirao je smanjenim brojem plućnih metastaza kada su korišćeni TA99 monoklonsko antitelo ili mcFAE-C26.99 TriNKET u visokoj koncentraciji u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom izotipom. Pri niskim koncentracijama samo mcFAE-C26.99 TriNKET je smanjio opterećenje tumorom (Sl. 61A). Slični efekti su primećeni kada su antitela davana počevši od 7. dana nakon inokulacije tumora. Sve u svemu, mcFAE-C26.99 TriNKET terapija je rezultirala manjim brojem plućnih metastaza u poređenju sa monoklonskim TA99 antitelom u svim ispitivanim uslovima. Otprilike 1×10<5>ćelija melanoma B16F10 su ubrizgane intravenozno u repnu venu C57BL/6 miševa (n=8 po grupi). Miševi su ili ostavlјeni netretirani ili su tretirani intraperitonealno kontrolnim mab-om (izotip, klon C1.18.4), monoklonskim TA99 antitelom ili TA99 TriNKET-om (mcFAE-C26.99). Sl. 61A predstavlјa opterećenje tumorom kada su antitela primenjena u dozi od 150 μg (4, 6, 8, 11, 13, 15. dana). Sl. 61B predstavlјa opterećenje tumorom kada su antitela davana u dozi od 150 μg (7, 9, 11, 13, 15. dana). 18 dana nakon izazivanja tumora, miševi su eutanazirani i površinske metastaze u plućima su ocenjene (Sl.
61B).
Primer 17
Citotoksična aktivnost humanih NK ćelija u mirovanju posredovana TriNKET-ima, monoklonskim antitelima ili bispecifičnim antitelima protiv HER2-pozitivnih ćelija
[0216] PBMCs su izolovane iz trombocitno-leukocitnog međusloja humane periferne krvi pomoću centrifugiranja sa gradijentom gustine. Izolovane PBMC su isprane i pripremlјene za izolaciju NK ćelija. NK ćelije su izolovane primenom tehnike negativne selekcije sa magnetnim perlama; čistoća izolovanih NK ćelija bila je uobičajeno >90% CD3-CD56+. Izolovane NK ćelije su kultivisane u medijumu koji sadrži 100 ng/mL IL-2 ili su mirovale preko noći bez citokina. NK ćelije IL-2-aktivirane ili u mirovanju su korišćene sledećeg dana u testovima citotoksičnosti.
DELFIA test citotoksičnosti:
[0217] Ćelijske linije humanog raka koje eksprimuju cilј od interesa su sakuplјene iz kulture, ćelije su isprane sa HBS i ponovo suspendovane u medijumu za rast na 10<6>/mL za obeležavanje sa BATDA reagensom (Perkin Elmer AD0116). Praćena su uputstva proizvođača za obeležavanje cilјnih ćelija. Nakon obeležavanja, ćelije su isprane 3x sa HBS i resuspendovane na 0,5-10×10<5>/mL u medijumu za kulturu. Da bi se pripremila pozadinska ležišta, alikvot obeleženih ćelija je stavlјen na stranu, a ćelije su izvučene iz medijuma.100 μl medijuma je pažlјivo dodato u ležišta u tri primerka da bi se izbeglo ometanje peletiranih ćelija. 100 μl BATDA obeleženih ćelija je dodato u svako ležište ploče sa 96

Claims (17)

  1. ležišta. Ležišta su sačuvana za spontano oslobađanje iz cilјnih ćelija, a ležišta su pripremlјeni za maksimalnu lizu cilјnih ćelija dodavanjem 1% Triton-X. Monoklonska antitela ili TriNKET protiv tumorskog cilja od interesa su razblažena u medijumu za kulturu i 50 μl razblaženog mAb ili TriNKET-a je dodato u svako ležište. NK ćelije u mirovanju i/ili aktivirane su sakuplјene iz kulture, ćelije su isprane i resuspendovane na 10<5>-2.0×10<6>/mL u medijumu za kulturu u zavisnosti od želјenog E:T odnosa. 50 μl NK ćelija je dodato u svako ležište ploče da bi se dobila ukupna zapremina kulture od 200 μl. Ploča je inkubirana na 37°C sa 5% CO2tokom 2-3 sata pre razvijanja testa.
    [0218] Posle kultivisanja tokom 2-3 sata, ploča je uklonjena iz inkubatora i ćelije su peletirane centrifugiranjem na 200 g tokom 5 minuta. 20 μl supernatanta kulture je prebačeno u čistu mikroploču koju je obezbedio proizvođač i 200 μl rastvora evropijuma na sobnoj temperaturi je dodato u svako ležište. Ploča je zaštićena od svetlosti i inkubirana na šejkeru za ploče na 250 rpm tokom 15 minuta. Ploča je očitana pomoću instrumenata Victor 3 ili SpectraMax i3X. % specifične liza je izračunat na sledeći način: % Specifične lize = ((Eksperimentalno oslobađanje - Spontano oslobađanje) / (Maksimalno oslobađanje - Spontano oslobađanje)) * 100%.
    Kombinacija monoklonskog antitela i angaživača bispecifične NK ćelije ne rekapitulira aktivnost TriNKET-a:
    [0219] Slika 66 prikazuje citotoksičnu aktivnost humanih NK ćelija u mirovanu posredovanu TriNKET-ima, monoklonskim antitelima ili bispecifičnim antitelima protiv HER2-pozitivne Colo-201 ćelijske linije. TriNKET (ADI-29404 (F04)) koji cilјa na HER2 indukovao je maksimalnu lizu Colo-201 ćelija od strane humanih NK ćelija u mirovanju. D265A mutacija je uvedena u CH2 domen TriNKET-a da bi se poništilo FcR vezivanje. HER2-TriNKET (ADI-29404 (F04))-D265A ne uspeva da posreduje u lizi Colo-201 ćelija, što pokazuje važnost dvostrukog cilјanja CD 16 i NKG2D na NK ćelijama. Da bi se dodatno prikazao značaj dvostrukog cilјanja na NK ćelijama, korišćeno je monoklonsko antitelo Trastuzumab za cilјanje HER2 i posredovanje ADCC-a od strane NK ćelija, sam Trastuzumab je bio u stanju da poveća NK ćelijsku lizu Colo-201 ćelija, ali maksimalna liza postignuta samo Trastuzumabom je bila oko 4x niža u poređenju sa TriNKET-om. Da bi se razumela važnost cilјanja CD16 i NKG2D na isti molekul, aktivnost TriNKET-a (ADI-29404 (F04)) je upoređena sa aktivnošću bispecifičnog antitela koje cilјa na HER2 i NKG2D u kombinaciji sa Trastuzumabom. Kada se koristi u ekvimolarnim koncentracijama, kombinacija bispecifičnog i trastuzumaba nije bila u stanju da posreduje u maksimalnoj lizi Colo-201 ćelija od strane humanih NK ćelija u mirovanju. Neuspeh kombinacije Trastuzumab bispecifično pokazuje važnost držanja trispecifičnog vezivanja TriNKET-a u jednom molekulu.
    EKVIVALENTI
    [0220] Prethodne realizacije treba u svakom pogledu smatrati ilustrativnim, a ne ograničavajućim pronalazak koji je ovde opisan. Obim pronalaska je stoga naznačen priloženim patentnim zahtevima, a ne prethodnim opisom, i sve promene koje dolaze u okviru značenja i raspona ekvivalencije zahteva treba da budu obuhvaćene njima.
    Patentni zahtevi
    1. Multispecifični vezujući protein koji sadrži:
    (a) prvo mesto za vezivanje antigena koje vezuje humani NKG2D;
    (b) drugo mesto vezivanja antigena koje vezuje antigen povezan sa tumorom, eksprimovan na ćeliji raka; i (c) Fc domen antitela ili njegov deo dovolјan da veže CD16,
    pri čemu svako od prvog mesta vezivanja antigena i drugog mesta za vezivanje antigena obuhvata deo molekula imunoglobulina koji učestvuje u vezivanju NKG2D ili antigena povezanog sa tumorom, redom; i
    pri čemu je multispecifični vezujući protein konfigurisan da vezuje antigen povezan sa tumorom na ćeliji raka i vezuje NKG2D na prirodnoj ćeliji ubici (NK) da aktivira NK ćeliju i vezuje CD16 na NK ćeliu da bi aktivirao NK ćeliju.
  2. 2. Multispecifični vezujući protein prema zahtevu 1, pri čemu se prvo mesto vezivanja antigena vezuje za NKG2D kod lјudi i primata koji nisu lјudi.
  3. 3. Multispecifični vezujući protein prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca, opciono pri čemu su varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca prisutni na istom polipeptidu.
  4. 4. Multispecifični vezujući protein prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je prvo mesto vezivanja antigena antitelo sa jednim domenom.
  5. 5. Multispecifični vezujući protein prema zahtevu 4, pri čemu je antitelo sa jednim domenom VHH fragment ili VNARfragment.
  6. 6. Multispecifični vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu drugo mesto vezivanja antigena sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca.
  7. 7. Multispecifični vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu je drugo mesto vezivanja antigena antitelo sa jednim domenom.
  8. 8. Multispecifični vezujući protein prema zahtevu 7, pri čemu je drugo mesto vezivanja antigena VHH fragment ili VNARfragment.
  9. 9. Multispecifični vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-3 i 6-8, pri čemu prvo mesto vezivanja antigena sadrži sekvencu amino-kiselina varijabilnog domena teškog lanca najmanje 90% identičnu SEQ ID NO:1.
  10. 10. Multispecifični vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-3 i 6-8, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži:
    (a) sekvencu amino-kiselina varijabilnog domena teškog lanca najmanje 90% identičnu SEQ ID NO:41 i sekvencu amino-kiselina varijabilnog domena lakog lanca najmanje 90% identičnu SEQ ID NO:42;
    (b) sekvencu amino-kiselina varijabilnog domena teškog lanca najmanje 90% identičnu SEQ ID NO:43 i sekvencu amino-kiselina varijabilnog domena lakog lanca najmanje 90% identičnu SEQ ID NO:44;
    (c) sekvencu amino-kiselina varijabilnog domena teškog lanca najmanje 90% identičnu SEQ ID NO:69 i sekvencu amino-kiselina varijabilnog domena lakog lanca najmanje 90% identičnu SEQ ID NO:70; ili (d) sekvencu amino-kiselina varijabilnog domena teškog lanca najmanje 90% identičnu SEQ ID NO:71 i sekvencu amino-kiselina varijabilnog domena lakog lanca najmanje 90% identičnu SEQ ID NO:72.
  11. 11. Multispecifični vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-3 i 6-8, pri čemu prvo mesto vezivanja antigena blokira prirodni ligand od vezivanja NKG2D, opciono pri čemu je prirodni ligand ULBP6 ili MICA.
  12. 12. Multispecifični vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-11, pri čemu je antigen povezan sa tumorom izabran iz grupe koju čine CD20, EpCAM, CD2, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 i PD1.
  13. 13. Multispecifični vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-12, koji sadrži pokretno povezane i CH2 domene Fc domena antitela dovolјne da vežu CD16.
  14. 14. Multispecifični vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-12, pri čemu protein sadrži sekvencu amino-kiselina najmanje 90% identičnu amino-kiselinama 234-332 Fc domena humanog IgG1 antitela, numerisanu prema EU indeksu kao u Kabatu.
  15. 15. Formulacija koja sadrži multispecifični vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-14 i farmaceutski prihvatlјiv nosač.
  16. 16. Ćelija koja sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju multispecifični vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-14.
  17. 17. Multispecifični vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-14 ili formulacija prema zahtevu 15 za upotrebu u postupku lečenja raka, pri čemu se postupak sastoji od davanja proteina ili formulacije pacijentu kome je to potrebno, opciono pri čemu rak je izabran iz grupe koju čine akutna mijeloidna leukemija, akutna mijelomonocitna leukemija, B ćelijski limfom, rak mokraćne bešike, rak dojke, kolorektalni rak, difuzni B-ćelijski limfom, rak jednjaka, Juingov sarkom, folikularni limfom, rak želuca, gastrointestinalni rak, gastrointestinalni stromalni tumori, glioblastom, rak glave i vrata, melanom, mezoteliom, multipli mijelom, mijelodisplastični sindrom, karcinom bubrežnih ćelija, neuroblastom, krupnoćelijski karcinom pluća, neuroendokrini tumori, rak jajnika, i rak pankreasa, rak prostate, sarkomi, mikrocelularni karcinom pluća, limfom T ćelija, rak testisa, karcinom timusa, rak štitaste žlezde, urotelni rak, rak infiltriran supresorskim ćelijama dobijenim od mijeloida, rak sa depozicijom ekstracelularnog matriksa, rak sa visokim nivoom reaktivne strome i rak sa neoangiogenezom.
RS20250083A 2017-02-08 2018-02-08 Multispecifični vezujući proteini za aktivaciju prirodnih ćelija ubica i njihova terapijska upotreba za lečenje raka RS66445B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762456535P 2017-02-08 2017-02-08
EP18751476.5A EP3579848B1 (en) 2017-02-08 2018-02-08 Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
PCT/US2018/017470 WO2018148445A1 (en) 2017-02-08 2018-02-08 Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66445B1 true RS66445B1 (sr) 2025-02-28

Family

ID=63107062

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250083A RS66445B1 (sr) 2017-02-08 2018-02-08 Multispecifični vezujući proteini za aktivaciju prirodnih ćelija ubica i njihova terapijska upotreba za lečenje raka

Country Status (16)

Country Link
US (2) US11834506B2 (sr)
EP (2) EP4491234A3 (sr)
JP (3) JP2020506971A (sr)
KR (3) KR20240023449A (sr)
CN (1) CN110944651A (sr)
AU (1) AU2018219887B2 (sr)
CA (2) CA3053010A1 (sr)
DK (1) DK3579848T3 (sr)
ES (1) ES3005783T3 (sr)
FI (1) FI3579848T3 (sr)
IL (1) IL268554B2 (sr)
MX (1) MX2019009468A (sr)
PT (1) PT3579848T (sr)
RS (1) RS66445B1 (sr)
SG (1) SG11201907299XA (sr)
WO (1) WO2018148445A1 (sr)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018219887B2 (en) 2017-02-08 2024-08-15 Dragonfly Therapeutics, LLC Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
CN110461361A (zh) * 2017-02-10 2019-11-15 蜻蜓治疗公司 结合bcma、nkg2d和cd16的蛋白
CN110944661A (zh) * 2017-02-20 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 结合her2、nkg2d和cd16的蛋白质
BR112019017256A2 (pt) * 2017-02-20 2020-04-14 Dragonfly Therapeutics Inc proteínas de ligação gd2, nkg2d e cd16
SG11201907638QA (en) * 2017-02-20 2019-09-27 Dragonfly Therapeutics Inc Proteins binding cd33, nkg2d and cd16
CA3177692A1 (en) * 2017-02-27 2018-08-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multispecific binding proteins targeting caix, ano1, mesothelin, trop2, or claudin-18.2
US20200157226A1 (en) * 2017-05-23 2020-05-21 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
IL270803B1 (en) * 2017-05-23 2026-02-01 Dragonfly Therapeutics Inc NKG2D, CD16, and tumor-associated antigen binding protein
SG11202001930QA (en) * 2017-09-07 2020-04-29 Dragonfly Therapeutics Inc Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
BR112020015994A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Terapia de combinação do câncer que envolve proteínas de ligação multiespecíficas que ativam células natural killer
CA3237846A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor
WO2019164930A1 (en) 2018-02-20 2019-08-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins that bind cd33, nkg2d, and cd16, and methods of use
AU2019271263A1 (en) * 2018-05-16 2020-12-03 Dragonfly Therapeutics, Inc. Protein binding NKG2D, CD16 and a fibroblast activation protein
EA202091977A1 (ru) * 2018-05-28 2021-02-09 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Мультиспецифические связывающие белки, которые связывают cd33, nkg2d и cd16, и способы применения
EA202091888A1 (ru) * 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
KR102835308B1 (ko) 2018-08-08 2025-07-21 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 종양 관련 항원에 결합하는 단백질
JP2021534096A (ja) * 2018-08-08 2021-12-09 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６および腫瘍関連抗原に結合するタンパク質
EP3833392A4 (en) 2018-08-08 2022-05-18 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR BINDING CD33, NKG2D AND CD16 AND METHODS OF USE
EP3927722A4 (en) * 2019-02-18 2022-11-23 Courier Therapeutics, Inc. BISPECIFIC FUSION PROTEIN USING ORTHOPOXVIRUS MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) CLASS L-LIKE PROTEIN (OMCP) AND TUMOR-SPECIFIC BINDING PARTNER
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
JP7512394B2 (ja) 2020-05-06 2024-07-08 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６及びｃｌｅｃ１２ａに結合するタンパク質
BR112022023697A2 (pt) * 2020-05-21 2022-12-20 Merus Nv Métodos e meios para a produção de moléculas semelhantes a ig
TW202216174A (zh) 2020-06-30 2022-05-01 日商蓋亞生物製藥有限公司 使ｎｋ細胞與抗體之結合穩定化之方法及其利用
CN116261567A (zh) * 2020-07-03 2023-06-13 纽约市哥伦比亚大学理事会 多功能性正交蛋白嵌合体
US20230257467A1 (en) 2020-08-05 2023-08-17 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and egfr
US20240000937A1 (en) * 2020-09-22 2024-01-04 World Biotech Regenerative Medical Group Limited Methods and compositions of car-expressing natural killer cells with bispecific antigen-binding molecules as cancer therapeutic agents
WO2022148853A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
EP4301774A4 (en) 2021-03-03 2025-08-13 Dragonfly Therapeutics Inc METHODS OF TREATING CANCER USING MULTI-SPECIFIC BINDING PROTEINS THAT BIND TO NKG2D, CD16, AND A TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN
JP2024512135A (ja) * 2021-03-31 2024-03-18 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 免疫エフェクター細胞再指向のための材料及び方法
CA3234552A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Synthekine, Inc. Heterodimeric fc cytokines and uses thereof
WO2023107956A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and 5t4
CN116948029A (zh) * 2022-04-20 2023-10-27 南京融捷康生物科技有限公司 一种包含IgG类Fc区变体的抗体及其用途
CN115058393B (zh) * 2022-07-13 2024-05-24 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种包被刺激物、培养试剂盒和自然杀伤细胞的培养方法
EP4569002A2 (en) 2022-08-10 2025-06-18 Merck Sharp & Dohme LLC Proteins binding nkg2d, cd16, and ceacam5
IL319568A (en) 2022-09-15 2025-05-01 Avidicure Ip B V Multispecific antigen-binding proteins for NK cell stimulation and their uses
WO2025191136A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Avidicure Ip B.V. Muteins of 4-1bb ligand extracellular domain, fusion proteins comprising the same and uses thereof
WO2025191133A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Avidicure Ip B.V. Il-21 muteins, fusion proteins comprising the same and uses thereof
WO2025191139A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Avidicure Ip B.V. Conjugates of her2-specific antigen binding proteins and cytokines

Family Cites Families (276)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0366707A1 (en) 1987-05-06 1990-05-09 OOSTERWIJK, Egbert Monoclonal antibodies to renal cell carcinoma
EP0415929A1 (en) 1988-01-15 1991-03-13 Centocor, Inc. Heteroligating antibodies and therapeutic uses thereof
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
PT627940E (pt) 1992-03-05 2003-07-31 Univ Texas Utilizacao de imunoconjugados para o diagnostico e/ou terapia de tumores vascularizados
US6036955A (en) 1992-03-05 2000-03-14 The Scripps Research Institute Kits and methods for the specific coagulation of vasculature
US7381803B1 (en) 1992-03-27 2008-06-03 Pdl Biopharma, Inc. Humanized antibodies against CD3
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
US5622701A (en) 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0871673B1 (en) 1995-05-03 2006-04-05 Bioenhancementsments Ltd. Bispecific antibodies in which the binding capability is reversibly inhibited by a photocleavable moiety
DE19531346A1 (de) 1995-08-25 1997-02-27 Gsf Forschungszentrum Umwelt Arzneimittel zur Immuntherapie, enthaltend Antikörper, die spezifisch das MHCII-Antigen eines zu behandelnden Patienten erkennen
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US7112324B1 (en) 1998-04-21 2006-09-26 Micromet Ag CD 19×CD3 specific polypeptides and uses thereof
US6572856B1 (en) 1998-09-10 2003-06-03 The University Of Virginia Patent Foundation Methods for the prevention and treatment of cancer using anti-C3b(i) antibodies
DE69936927T2 (de) 1998-10-21 2008-05-15 Altor Bioscience Corp., Miramar Polyspezifische bindemoleküle und deren verwendung
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20040038339A1 (en) 2000-03-24 2004-02-26 Peter Kufer Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the nkg2d receptor complex
CA2409991A1 (en) 2000-05-24 2001-11-29 Imclone Systems Incorporated Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
US20040115198A1 (en) 2001-02-28 2004-06-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center Activation of lymphocyte populations expressing NKG2D using anti-NKG2D antibodies and ligand derivatives
US20020193569A1 (en) 2001-06-04 2002-12-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
DE10156482A1 (de) 2001-11-12 2003-05-28 Gundram Jung Bispezifisches Antikörper-Molekül
NZ542784A (en) 2002-08-19 2008-07-31 Astrazeneca Ab Antibodies directed to monocyte chemo-attractant protein-1 (MCP-1) and uses thereof
US7820166B2 (en) 2002-10-11 2010-10-26 Micromet Ag Potent T cell modulating molecules
DE10261223A1 (de) 2002-12-20 2004-07-08 MedInnova Gesellschaft für medizinische Innovationen aus akademischer Forschung mbH Steigerung der Immunantwort durch Substanzen, welche die Funktion von Natürlichen Killerzellen beeinflussen
US20060235201A1 (en) 2003-02-06 2006-10-19 Roman Kischel Enduring T cell response
US7666417B2 (en) 2003-04-22 2010-02-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for treating autoimmune diseases or conditions
JP2008501621A (ja) 2003-05-31 2008-01-24 マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト Ｂ細胞関連疾患を処置するための二重特異性抗ｃｄ３、抗ｃｄ１９抗体構築物を含む薬学的組成物
DK1629011T3 (da) 2003-05-31 2010-05-03 Micromet Ag Humane anti-humane-DC3-bindingsmolekyler
HRP20170342T1 (hr) 2003-07-24 2017-05-19 Innate Pharma S.A. Metode i sastavi za povećanje učinkovitosti terapijskih protutijela koristeći tvari koje potenciraju nk stanice
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
MXPA06004035A (es) 2003-10-16 2006-08-31 Micromet Ag Aglutinantes cd3 de-inmunizados multi-especificos.
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
US20110020273A1 (en) 2005-04-06 2011-01-27 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific Immunocytokine Dock-and-Lock (DNL) Complexes and Therapeutic Use Thereof
EP1716178B1 (en) 2004-02-16 2010-08-11 Micromet AG Less immunogenic binding molecules
AU2005263555B2 (en) 2004-07-16 2011-01-27 Amgen Research (Munich) Gmbh Expression-enhanced polypeptides
DK1771482T3 (da) 2004-07-22 2014-10-20 Genentech Inc HER2-antistofsammensætning
JP2008514685A (ja) 2004-10-01 2008-05-08 メディジーン リミテッド 治療剤に連結した、非天然型ジスルフィド鎖間結合を含有するｔ細胞レセプター
DOP2006000029A (es) 2005-02-07 2006-08-15 Genentech Inc Antibody variants and uses thereof. (variantes de un anticuerpo y usos de las mismas)
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
ES2971647T3 (es) 2005-04-15 2024-06-06 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y usos de los mismos
WO2007002905A1 (en) 2005-06-29 2007-01-04 University Of Miami Antibody-immune cell ligand fusion protein for cancer therapy
WO2007022520A2 (en) 2005-08-19 2007-02-22 Cerus Corporation Antibody-mediated enhancement of immune response
PE20071101A1 (es) 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
EP1940881B1 (en) 2005-10-11 2016-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
CN101300272B (zh) 2005-10-14 2013-09-18 依奈特制药公司 用于治疗增生性病症的组合物和方法
US20080299137A1 (en) 2005-10-28 2008-12-04 Novo Nordisk A/S Fusion Proteins That Bind Effector Lymphocytes And Target Cells
JP2009514537A (ja) 2005-11-03 2009-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 治療的抗ｈｅｒ２抗体融合ポリペプチド
WO2007055926A1 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Negative immunomodulation of immune responses by nkg2d-positive cd4+ cells
HRP20150175T1 (en) 2005-12-16 2015-03-27 Amgen Research (Munich) Gmbh Means and methods for the treatment of tumorous diseases
EP1820513A1 (en) 2006-02-15 2007-08-22 Trion Pharma Gmbh Destruction of tumor cells expressing low to medium levels of tumor associated target antigens by trifunctional bispecific antibodies
NZ573646A (en) 2006-06-12 2012-04-27 Wyeth Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
EP2450377A1 (en) 2006-09-07 2012-05-09 Crucell Holland B.V. Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus H5N1 and uses thereof
EP1900752A1 (en) 2006-09-15 2008-03-19 DOMPE' pha.r.ma s.p.a. Human anti-folate receptor alpha antibodies and antibody fragments for the radioimmunotherapy of ovarian carcinoma
EP2158318A2 (en) 2007-05-14 2010-03-03 Biogen Idec MA, Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
EP2014680A1 (en) 2007-07-10 2009-01-14 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Recombinant, single-chain, trivalent tri-specific or bi-specific antibody derivatives
JP2010534469A (ja) 2007-07-25 2010-11-11 アストラゼネカ アクチボラグ Ｋｄｒ指向性標的化結合物質およびその使用
JP2010536341A (ja) 2007-08-15 2010-12-02 アムニクス， インコーポレイテッド 生物学的に活性なポリペプチドの特性を改変するための組成物および方法
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
EP3124497B1 (en) 2007-09-14 2020-04-15 Adimab, LLC Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
AU2008337517B2 (en) 2007-12-14 2014-06-26 Novo Nordisk A/S Antibodies against human NKG2D and uses thereof
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
JP2011509687A (ja) 2008-01-22 2011-03-31 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｒｏｎ抗体およびその使用
TW201006485A (en) 2008-06-03 2010-02-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8067339B2 (en) 2008-07-09 2011-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Surface display of whole antibodies in eukaryotes
WO2010017103A2 (en) 2008-08-04 2010-02-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic Fully human anti-human nkg2d monoclonal antibodies
CA2737351A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Wyeth Llc Single chain antibody library design
CA2742969A1 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Fabrus Llc Anti-dll4 antibodies and uses thereof
US10865233B2 (en) 2008-12-18 2020-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. NKG2D-fc for immunotherapy
DK2786762T3 (da) 2008-12-19 2019-05-06 Macrogenics Inc Kovalente diabodies og anvendelser deraf
MX2011010166A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-3/anti-c-met.
WO2010132697A2 (en) 2009-05-13 2010-11-18 Genzyme Corporation Methods and compositions for treatment
WO2010144295A1 (en) 2009-06-09 2010-12-16 University Of Miami Aptamer-targeted costimulatory ligand aptamer
WO2011003780A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bi-specific digoxigenin binding antibodies
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
WO2011030851A1 (ja) 2009-09-11 2011-03-17 タカラバイオ株式会社 ナチュラルキラー細胞の製造方法
RS54655B2 (sr) 2009-10-27 2021-04-29 Amgen Res Munich Gmbh Dozni režim za primenu cd19xcd3 bispecifičnog antitela
WO2011057124A1 (en) 2009-11-06 2011-05-12 Transtarget, Inc. Polyclonal bispecific antibody compositions and method of use
EP2332994A1 (en) 2009-12-09 2011-06-15 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Trispecific therapeutics against acute myeloid leukaemia
US20120288507A1 (en) 2009-12-18 2012-11-15 Amgen Inc. Wise binding agents and epitopes
US8658765B2 (en) 2009-12-31 2014-02-25 Avidbiotics Corp. Non-natural MIC proteins
US8796420B2 (en) 2009-12-31 2014-08-05 Avidbiotics Corp. Non-natural MIC proteins
PH12012501751A1 (en) 2010-03-04 2012-11-12 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
EP2542256B1 (en) 2010-03-04 2019-05-22 MacroGenics, Inc. Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
HRP20241208T1 (hr) 2010-04-20 2024-11-22 Genmab A/S Heterodimerni proteini koji sadrže fc fragment protutijela i postupci za njihovu proizvodnju
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP3323830B1 (en) 2010-06-19 2023-08-23 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anti-gd2 antibodies
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
DE102010039018B4 (de) 2010-08-06 2013-02-28 Technische Universität Dresden Anti-La Antikörper und ihre Anwendung zum Immunotargeting
JP2013537416A (ja) 2010-08-13 2013-10-03 メディミューン リミテッド 変異型Ｆｃ領域を含むモノマーポリペプチド及び使用方法
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
TWI560199B (en) 2010-08-31 2016-12-01 Sanofi Sa Peptide or peptide complex binding to α2 integrin and methods and uses involving the same
WO2012032080A1 (en) 2010-09-07 2012-03-15 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H Stabilised human fc
CN103328511B (zh) 2010-09-10 2016-01-20 埃派斯进有限公司 抗-IL-1β抗体及其使用方法
UY33707A (es) * 2010-11-04 2012-05-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
US9518132B2 (en) 2010-11-09 2016-12-13 Altimab Therapeutics, Inc. Protein complexes for antigen binding and methods of use
UY33826A (es) 2010-12-22 2012-07-31 Abbott Lab Proteínas de unión con dominios trivariables y sus usos
MX352889B (es) 2011-02-25 2017-12-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo de fc especifico para fcyriib.
EP2686345B1 (en) 2011-03-16 2018-04-25 Amgen Inc. Fc variants
BR112013023918A2 (pt) 2011-03-25 2016-12-13 Glenmark Pharmaceuticals Sa imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento hetero-dimérico da mesma, método para produzir uma imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento hetero-dimérico da mesma, método para construir uma interface proteína-proteína de um domínio de uma proteína de múltiplos domínios e uso de um domínio doador de um primeiro e de um segundo membro de uma super-família de imunoglobulina de ocorrência natural
WO2012158818A2 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
BR112013029892A2 (pt) 2011-05-21 2016-12-20 Macrogenics Inc polipeptídeo, molécula de ligação a antígeno, diacorpo e uso de uma porção polipeptídica de uma proteína de ligação a soro desimunizada
EP2714738B1 (en) 2011-05-24 2018-10-10 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
US20140234342A1 (en) 2011-06-21 2014-08-21 Innate Pharma Nkp46-mediated nk cell tuning
TWI687439B (zh) * 2011-06-30 2020-03-11 中外製藥股份有限公司 異源二聚化多胜肽
DE102011118022B4 (de) 2011-06-30 2018-01-18 Gemoab Monoclonals Gmbh Antikörper gegen das Prostata-spezifische Stammzellenantigen und dessen Verwendung
WO2013013700A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Affimed Therapeutics Ag Multivalent antigen-binding fv molecule
WO2013036799A2 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving nkg2d inhibitors and cancer
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
KR102276528B1 (ko) 2011-09-30 2021-07-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존성 결합 분자 라이브러리
HUE033245T2 (hu) 2011-12-19 2017-11-28 Synimmune Gmbh Bispecifikus ellenanyag molekula
US10633451B2 (en) 2012-02-03 2020-04-28 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibody molecules with antigen-transfected T-cells and their use in medicine
WO2013120012A2 (en) 2012-02-08 2013-08-15 Igm Biosciences Inc. Cdim binding proteins and uses thereof
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
US9029510B2 (en) 2012-03-30 2015-05-12 Sorrento Therapeutics, Inc. Fully human antibodies that bind to VEGFR2 and methods of use thereof
US9248181B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Merus B.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
US9163090B2 (en) 2012-05-07 2015-10-20 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies specific for CLL-1
WO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
JP6628966B2 (ja) 2012-06-14 2020-01-15 中外製薬株式会社 改変されたＦｃ領域を含む抗原結合分子
CN105050618B (zh) 2012-06-21 2018-11-16 索伦托治疗有限公司 与c-Met结合的抗原结合蛋白
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
AU2013289883B2 (en) 2012-07-13 2018-11-01 Zymeworks Bc Inc. Bispecific asymmetric heterodimers comprising anti-CD3 constructs
IN2015DN01299A (sr) 2012-07-23 2015-07-03 Zymeworks Inc
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
CN104379169A (zh) 2012-08-14 2015-02-25 Ibc药品公司 用于治疗疾病的t-细胞重定向双特异性抗体
HUE042040T2 (hu) 2012-09-27 2019-06-28 Merus Nv Bispecifikus IGG antitestek mint T-sejt kapcsolók
US9562110B2 (en) 2012-11-21 2017-02-07 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Bispecific antibody
JP6385357B2 (ja) 2012-11-27 2018-09-05 アジュ ユニバーシティー インダストリー−アカデミック コーオペレイション ファウンデーションＡｊｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 抗体重鎖不変部位の異種二量体、高効率の形成を誘導するｃｈ３ドメイン変異体対、その作製方法および用途
KR20200024345A (ko) 2013-01-10 2020-03-06 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
KR102211837B1 (ko) 2013-01-14 2021-02-03 젠코어 인코포레이티드 신규한 이형이량체 단백질
WO2014116846A2 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
WO2014122143A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Engmab Ag Method for the selection of antibodies against bcma
US10047163B2 (en) 2013-02-08 2018-08-14 Abbvie Stemcentrx Llc Multispecific constructs
LT2961771T (lt) 2013-02-26 2020-03-10 Roche Glycart Ag Bispecifinės t ląstelę aktyvinančios antigeną surišančios molekulės, specifinės cd3 ir cea antigenams
SMT202100464T1 (it) 2013-03-14 2021-11-12 Macrogenics Inc Molecole bispecifiche che sono immunoreattive con cellule effettrici immunitarie che esprimono un recettore di attivazione
JP6594855B2 (ja) 2013-03-15 2019-10-23 ゼンコア インコーポレイテッド ヘテロ二量体タンパク質
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
RU2680267C2 (ru) 2013-03-15 2019-02-19 Мемориал Слоан Кеттеринг Кэнсер Сентер Высокоаффинные антитела к gd2
WO2014165818A2 (en) 2013-04-05 2014-10-09 T Cell Therapeutics, Inc. Compositions and methods for preventing and treating prostate cancer
HK1221908A1 (zh) 2013-04-29 2017-06-16 Adimab, Llc 多特异(polyspecificity)试剂，其制备方法和用途
EP3415534A1 (en) 2013-05-10 2018-12-19 Numab Therapeutics AG Bispecific constructs and their use in the treatment of various diseases
WO2014198748A1 (en) 2013-06-11 2014-12-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-her2 single domain antibodies, polypeptides comprising thereof and their use for treating cancer
US9908944B2 (en) 2013-07-15 2018-03-06 Novo Nordisk A/S Antibodies that bind urokinase plasminogen activator
BR112016000853A2 (pt) 2013-07-16 2017-12-12 Genentech Inc métodos para tratar ou retardar, reduzir ou inibir a recidiva ou a progressão do câncer e a progressão de uma doença imune-relacionada em um indivíduo, para aumentar, melhorar ou estimular uma resposta ou função imune em um indivíduo e kit
CN105722859B (zh) 2013-07-25 2021-05-07 西托姆克斯治疗公司 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
GB2518221A (en) 2013-09-16 2015-03-18 Sergej Michailovic Kiprijanov Tetravalent antigen-binding protein molecule
RU2671089C2 (ru) 2013-09-16 2018-10-29 Хельмхольтц Центрум Мюнхен - Дойчес Форшунгсцентрум Фюр Гезундхайт Унд Умвельт (Гмбх) Би- или полиспецифические полипептиды, связывающие поверхностные антигены иммунных эффекторных клеток и антигены hbv для лечения инфекций bv и ассоциированных с ними состояний
GB2519786A (en) 2013-10-30 2015-05-06 Sergej Michailovic Kiprijanov Multivalent antigen-binding protein molecules
EP3066130B1 (en) 2013-11-07 2019-05-15 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anti-wt1/hla bi-specific antibody
DE102013019352A1 (de) 2013-11-13 2015-09-17 Elke Pogge Von Strandmann Tri-spezifische rekombinante Antikörperderivate zur Behandlung von malignen Erkrankungen durch Aktivierung einer NK-Zell-basierten Immunantwort
SG11201604784XA (en) 2013-12-13 2016-07-28 Genentech Inc Anti-cd33 antibodies and immunoconjugates
WO2015095412A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Zhong Wang Bispecific antibody with two single-domain antigen-binding fragments
EP3083696B1 (en) 2013-12-20 2018-02-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Bispecific her2 antibodies and methods of use
CN105849124B (zh) 2013-12-20 2022-04-12 豪夫迈·罗氏有限公司 双重特异性抗体
KR20160122127A (ko) 2013-12-23 2016-10-21 자임워크스 인코포레이티드 C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 연장부를 포함하는 항체 및 이의 컨쥬게이트 및 이들의 사용방법
US10519251B2 (en) 2013-12-30 2019-12-31 Epimab Biotherapeutics, Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
RU2016132863A (ru) 2014-01-15 2018-02-20 Займворкс Инк. БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ CD3 и CD19 АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ КОНСТРУКЦИИ
DK3241561T3 (da) 2014-03-05 2025-06-30 Autolus Ltd Konjugeret antistof eller bispecifik t-celle-engager, som selektivt binder enten tcr-beta konstant region 1 (trbc1) eller trbc2
KR20160146747A (ko) 2014-03-31 2016-12-21 제넨테크, 인크. 항혈관신생제 및 ox40 결합 효능제를 포함하는 조합 요법
EP4050026A1 (en) 2014-04-01 2022-08-31 Adimab, LLC Method of obtaining or identifying one or more common light chains for use in preparing a multispecific antibody
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
PL3560954T3 (pl) 2014-04-03 2021-12-13 Igm Biosciences, Inc. Zmodyfikowany łańcuch J
SG11201608192SA (en) 2014-04-11 2016-10-28 Medimmune Llc Bispecific her2 antibodies
EP2930188A1 (en) 2014-04-13 2015-10-14 Affimed Therapeutics AG Trifunctional antigen-binding molecule
EP2942629A1 (en) 2014-05-08 2015-11-11 Universität Würzburg Predictive markers for successful cancer immunotherapy
EA035419B9 (ru) 2014-05-29 2020-08-07 Мэкроудженикс, Инк. Триспецифичные связывающие молекулы и способы их применения
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
WO2015197582A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Innate Pharma Monomeric multispecific antigen binding proteins
JP6822849B2 (ja) 2014-06-27 2021-01-27 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ． 多重特異的ＮＫｐ４６結合タンパク質
WO2015197598A2 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
WO2016001810A1 (en) 2014-07-01 2016-01-07 Pfizer Inc. Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
CN106999556B (zh) 2014-07-21 2021-07-30 武汉友芝友生物制药有限公司 细胞因子诱导的杀伤细胞的双特异性抗体介导的癌症治疗
US9777073B2 (en) 2014-07-21 2017-10-03 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Construction and application of bispecific antibody EpCAM×CD3
TWI719942B (zh) 2014-07-21 2021-03-01 瑞士商諾華公司 使用ｃｄ３３嵌合抗原受體治療癌症
AU2015301460B2 (en) 2014-08-14 2021-04-08 Novartis Ag Treatment of cancer using GFR alpha-4 chimeric antigen receptor
EP2985294A1 (en) 2014-08-14 2016-02-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Recombinant antibody molecule and its use for target cell restricted T cell activation
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
RU2017105425A (ru) 2014-08-28 2018-09-28 Академиш Зикенхёйс Лейден Х.О.Д.Н. Люмк Комбинации антитела против cd94/nkg2a и/или cd94/nkg2b и вакцины
EP2990416B1 (en) 2014-08-29 2018-06-20 GEMoaB Monoclonals GmbH Universal chimeric antigen receptor expressing immune cells for targeting of diverse multiple antigens and method of manufacturing the same and use of the same for treatment of cancer, infections and autoimmune disorders
EP3215531A1 (en) 2014-11-03 2017-09-13 Merck Patent GmbH Methods for generating bispecific shark variable antibody domains and use thereof
EP3227332B1 (en) 2014-12-03 2019-11-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
CA2963274C (en) 2014-12-05 2024-01-30 Avidbiotics Corp. Insertable variable fragments of antibodies and modified a1-a2 domains of nkg2d ligands
WO2016100533A2 (en) 2014-12-17 2016-06-23 Intrexon Corporation Intercalated single-chain variable fragments
MX384198B (es) 2014-12-19 2025-03-14 Chiome Bioscience Inc Proteina de fusion que comprende tres dominios de union a 5t4 y cd3.
CN107405399B (zh) 2015-01-02 2022-02-08 武田药品工业株式会社 针对血浆激肽释放酶和因子xii的双特异性抗体
CA2973720A1 (en) 2015-01-14 2016-07-21 Compass Therapeutics Llc Multispecific immunomodulatory antigen-binding constructs
WO2016122701A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Macrogenics, Inc. Anti-dr5 antibodies and molecules comprising dr5-binding domains thereof
WO2016134371A2 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Ohio State Innovation Foundation Bivalent antibody directed against nkg2d and tumor associated antigens
MA41613A (fr) 2015-02-23 2018-01-02 Abbvie Stemcentrx Llc Récepteurs antigéniques chimériques anti-dll3 et procédés d'utilisation desdits récepteurs
WO2016135041A1 (en) 2015-02-26 2016-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis
US11673957B2 (en) 2015-03-10 2023-06-13 Eureka Therapeutics, Inc. Anti-ROR2 antibodies
WO2016146702A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Trispecific binding molecules for treating hbv infection and associated conditions
WO2016161390A1 (en) 2015-04-03 2016-10-06 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
RS61907B1 (sr) 2015-04-06 2021-06-30 Subdomain Llc Polipeptidi koji sadrže de novo vezujući domen i njihova primena
SI3280441T1 (sl) 2015-04-07 2022-01-31 Alector Llc Protitelesa anti-sortilin in metoda njihove uporabe
TWI703159B (zh) 2015-04-13 2020-09-01 美商輝瑞股份有限公司 Bcma特異性治療性抗體及其用途
WO2016166139A1 (en) 2015-04-14 2016-10-20 Eberhard Karls Universität Tübingen Bispecific fusion proteins for enhancing immune responses of lymphocytes against tumor cells
WO2016187220A2 (en) 2015-05-18 2016-11-24 Five Prime Therapeutics, Inc. Anti-ror1 antibodies
EP3095792A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München T cell receptor with specificity for myeloperoxidase peptide and uses thereof
US20180147257A1 (en) 2015-05-22 2018-05-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Btn3a ectodomain proteins and methods of use
MA53355A (fr) 2015-05-29 2022-03-16 Agenus Inc Anticorps anti-ctla-4 et leurs procédés d'utilisation
DK3303396T5 (da) 2015-05-29 2024-10-07 Bristol Myers Squibb Co Antistoffer mod ox40 og anvendelser deraf
HK1252675A1 (zh) 2015-06-12 2019-05-31 Alector Llc 抗cd33抗体及其使用方法
AU2016274989A1 (en) 2015-06-12 2017-11-02 Immunomedics, Inc. Disease therapy with chimeric antigen receptor (car) constructs and t cells (car-t) or nk cells (car-nk) expressing car constructs
DK3313876T3 (da) 2015-06-23 2025-04-22 Innate Pharma Multispecifikke antigenbindende proteiner
AU2016284871B2 (en) 2015-06-23 2022-09-29 Innate Pharma Multispecific NK engager proteins
US10344081B2 (en) 2015-07-06 2019-07-09 Ucb Biopharma Sprl Tau-binding antibodies
WO2017011342A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Abbvie Inc. Igm-or-ige-modified binding proteins and uses thereof
EP3322735A4 (en) 2015-07-15 2019-03-13 Zymeworks Inc. ACTIVE CONJUGATED BIS-SPECIFIC ANTIGEN-BONDING CONSTRUCTS
WO2017011803A1 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Cellerant Therapeutics, Inc. Cysteine-substituted immunoglobulins
TWI793062B (zh) 2015-07-31 2023-02-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｄｌｌ３及ｃｄ３抗體構築體
EP3349792A1 (en) 2015-09-14 2018-07-25 Compass Therapeutics LLC Compositions and methods for treating cancer via antagonism of the cd155/tigit pathway and tgf-
US10526413B2 (en) 2015-10-02 2020-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specific for OX40
CA3003458A1 (en) 2015-10-29 2017-05-04 Alector Llc Anti-siglec-9 antibodies and methods of use thereof
KR20180083874A (ko) 2015-11-04 2018-07-23 사울 제이. 프라이스맨 Her2를 표적화하는 키메라 항원 수용체
US10815290B2 (en) 2015-11-10 2020-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center NKG2D decoys
US20180327499A1 (en) * 2015-11-13 2018-11-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti- nkg2d single domain antibodies and uses thereof
EP3397645B1 (en) 2015-12-28 2026-03-25 Innate Pharma Variable regions for nkp46 binding proteins
WO2017124002A1 (en) * 2016-01-13 2017-07-20 Compass Therapeutics Llc Multispecific immunomodulatory antigen-binding constructs
MA55746A (fr) 2016-01-21 2022-03-02 Novartis Ag Molécules multispécifiques ciblant cll-1
WO2017142928A1 (en) 2016-02-17 2017-08-24 Macrogenics, Inc. Ror1-binding molecules, and methods of use thereof
CN109310766A (zh) 2016-02-26 2019-02-05 伊蒙纽斯私人有限公司 多特异性分子
WO2017165464A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
EP3432924A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
CA3021634A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Zymeworks Inc. Multi-specific antigen-binding constructs targeting immunotherapeutics
GEP20227398B (en) 2016-04-15 2022-07-25 Macrogenics Inc Novel b7-h3 binding molecules, antibody drug conjugates thereof and usage thereof
GB201610044D0 (en) 2016-06-08 2016-07-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
JP7010854B2 (ja) 2016-06-14 2022-01-26 ゼンコア インコーポレイテッド 二重特異性チェックポイント阻害剤抗体
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
CN105906722B (zh) 2016-06-24 2020-02-07 安徽未名细胞治疗有限公司 一种Her2特异性嵌合抗原受体及其应用
AU2017319519A1 (en) 2016-09-01 2019-04-18 Immunomab, Inc. Bispecific antibodies
US20190225702A1 (en) 2016-10-14 2019-07-25 Harpoon Therapeutics, Inc. Innate immune cell trispecific binding proteins and methods of use
WO2018081648A2 (en) 2016-10-29 2018-05-03 Genentech, Inc. Anti-mic antibidies and methods of use
JP7291396B2 (ja) 2016-11-22 2023-06-15 ティーシーアール２ セラピューティクス インク． 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
JOP20190134A1 (ar) 2016-12-23 2019-06-02 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لنيوروبيلين وطرق استخدامها
WO2018148447A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Adimab, Llc Antibody heavy chain variable domains targeting the nkg2d receptor
AU2018219887B2 (en) * 2017-02-08 2024-08-15 Dragonfly Therapeutics, LLC Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
CA3053275A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding psma, nkg2d and cd16
CN110461361A (zh) 2017-02-10 2019-11-15 蜻蜓治疗公司 结合bcma、nkg2d和cd16的蛋白
WO2018152547A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Adimab, Llc Proteins binding cd123, nkg2d and cd16
SG11201907638QA (en) 2017-02-20 2019-09-27 Dragonfly Therapeutics Inc Proteins binding cd33, nkg2d and cd16
CN110944661A (zh) 2017-02-20 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 结合her2、nkg2d和cd16的蛋白质
BR112019017256A2 (pt) 2017-02-20 2020-04-14 Dragonfly Therapeutics Inc proteínas de ligação gd2, nkg2d e cd16
CA3177692A1 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multispecific binding proteins targeting caix, ano1, mesothelin, trop2, or claudin-18.2
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
IL270803B1 (en) 2017-05-23 2026-02-01 Dragonfly Therapeutics Inc NKG2D, CD16, and tumor-associated antigen binding protein
JP2020521448A (ja) 2017-05-23 2020-07-27 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、およびｒｏｒ１またはｒｏｒ２に結合するタンパク質
US20200157226A1 (en) 2017-05-23 2020-05-21 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
US20200165344A1 (en) 2017-07-31 2020-05-28 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and flt3
EP3668893A4 (en) 2017-08-16 2021-08-04 Dragonfly Therapeutics, Inc. PROTEINS BINDING TO NKG2D, CD16 AND EGFR, HLA-E, CCR4, OR PD-L1
US20200231679A1 (en) 2017-08-23 2020-07-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
SG11202001930QA (en) 2017-09-07 2020-04-29 Dragonfly Therapeutics Inc Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
EA202090718A1 (ru) 2017-09-14 2020-07-01 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Белки, связывающие nkg2d, cd16 и лектиноподобную молекулу-1 c-типа (cll-1)
BR112020015994A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Terapia de combinação do câncer que envolve proteínas de ligação multiespecíficas que ativam células natural killer
CA3237846A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor
WO2019164930A1 (en) 2018-02-20 2019-08-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins that bind cd33, nkg2d, and cd16, and methods of use
BR112020016944A2 (pt) 2018-02-20 2020-12-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Domínios variáveis de anticorpo que alvejam cd33 e uso dos mesmos
EP3773676A4 (en) 2018-04-03 2022-05-18 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and an antigen associated with tumors, mdscs and/or tams
EP3774921A4 (en) 2018-04-03 2022-01-05 Dragonfly Therapeutics, Inc. ANTIBODY VARIABLE DOMAINS AGAINST DLL3 AND USE OF IT
KR20210018275A (ko) 2018-05-07 2021-02-17 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 종양-연관 항원에 결합하는 단백질
AU2019271263A1 (en) 2018-05-16 2020-12-03 Dragonfly Therapeutics, Inc. Protein binding NKG2D, CD16 and a fibroblast activation protein
EA202091977A1 (ru) 2018-05-28 2021-02-09 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Мультиспецифические связывающие белки, которые связывают cd33, nkg2d и cd16, и способы применения
JP2021534096A (ja) 2018-08-08 2021-12-09 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６および腫瘍関連抗原に結合するタンパク質
EA202091888A1 (ru) 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
SG11202104136YA (en) 2018-10-23 2021-05-28 Dragonfly Therapeutics Inc Heterodimeric fc-fused proteins
EP3927722A4 (en) 2019-02-18 2022-11-23 Courier Therapeutics, Inc. BISPECIFIC FUSION PROTEIN USING ORTHOPOXVIRUS MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) CLASS L-LIKE PROTEIN (OMCP) AND TUMOR-SPECIFIC BINDING PARTNER
WO2020263830A1 (en) 2019-06-25 2020-12-30 Gilead Sciences, Inc. Flt3l-fc fusion proteins and methods of use
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
AU2020337999A1 (en) 2019-08-30 2022-03-24 Dragonfly Therapeutics, Inc. Pharmaceutical formulations and dosage regimens for multi-specific binding proteins that bind HER2, NKG2D, and CD16 for cancer treatment
JP7512394B2 (ja) 2020-05-06 2024-07-08 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６及びｃｌｅｃ１２ａに結合するタンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
US20240166753A1 (en) 2024-05-23
JP2020506971A (ja) 2020-03-05
JP2024099850A (ja) 2024-07-25
CA3221995A1 (en) 2018-08-16
EP4491234A3 (en) 2025-04-09
MX2019009468A (es) 2020-01-20
IL268554B1 (en) 2024-11-01
KR20190118172A (ko) 2019-10-17
RU2019128060A3 (sr) 2021-06-10
SG11201907299XA (en) 2019-09-27
CA3221995C (en) 2024-05-28
EP3579848A4 (en) 2021-03-03
FI3579848T3 (fi) 2025-01-22
IL268554B2 (en) 2025-03-01
BR112019016315A2 (pt) 2020-03-31
EP4491234A2 (en) 2025-01-15
RU2019128060A (ru) 2021-03-09
IL268554A (en) 2019-09-26
KR20240023449A (ko) 2024-02-21
EP3579848B1 (en) 2024-10-30
CN110944651A (zh) 2020-03-31
ES3005783T3 (en) 2025-03-17
DK3579848T3 (da) 2025-01-20
KR20250089564A (ko) 2025-06-18
US20190359716A1 (en) 2019-11-28
PT3579848T (pt) 2025-01-30
AU2018219887B2 (en) 2024-08-15
US11834506B2 (en) 2023-12-05
EP3579848A1 (en) 2019-12-18
AU2018219887A1 (en) 2019-08-22
JP2022101709A (ja) 2022-07-06
WO2018148445A1 (en) 2018-08-16
CA3053010A1 (en) 2018-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240166753A1 (en) Multi-specific binding proteins that bind nkg2d, cd16, and a tumor-associated antigen for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
US20240228625A1 (en) Proteins binding her2, nkg2d and cd16
US20230303702A1 (en) Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that bind nkg2d, cd16, and a tumor-associated antigen
US20200095327A1 (en) Antibody heavy chain variable domains targeting the nkg2d receptor
US20240018266A1 (en) Proteins binding cd123, nkg2d and cd16
KR20190123299A (ko) Caix, ano1, 메소텔린, trop2, cea, 또는 클라우딘-18.2를 표적화하는 다중특이적 결합 단백질
KR20240078657A (ko) Bcma, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
CA3053275A1 (en) Proteins binding psma, nkg2d and cd16
KR20190120783A (ko) Gd2, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
RU2809125C2 (ru) Полиспецифические связывающие белки для активации клеток-натуральных киллеров и их терапевтическое применение для лечения злокачественного новообразования
HK40019176A (en) Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
HK40019176B (en) Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
HK40019736B (en) Proteins binding her2, nkg2d and cd16
HK40019736A (en) Proteins binding her2, nkg2d and cd16