RS66973B1 - Antisens kompozicije i postupci pravljenja i upotrebe istih - Google Patents

Description

Opis

POZADINA

[0001] Ulcerozni kolitis i Kronova (Crohnꞌs) bolest glavni su oblici hroničnih inflamatornih bolesti creva (IBD) kod ljudi. Intestinalna bolest creva je neadekvatan imunski odgovor koji se javlja kod genetski podložnih pojedinaca kao rezultat kompleksne interakcije između faktora okoline, mikrobnih faktora i crevnog imunskog sistema. Demonstrirano je da prekomerni imunski odgovor na mukozne antigene koji nisu adekvatno kontrolisani normalnim kontraregulatornim mehanizmima dovodi do hronične inflamacije creva.

[0002] Kronova bolest je hronična, recidivirajuća inflamatorna bolest gastrointestinalnog trakta, koju karakterišu segmentalna transmuralna inflamacija i granulomatozne promene. Tipične prezentacije uključuju diskontinuirano zahvatanje različitih delova gastrointestinalnog trakta i razvoj komplikacija, uključujući strikture, apscese ili fistule. Pošto je njen uzrok nepoznat, medicinsko zbrinjavanje Kronove bolesti je uglavnom empirijsko i dizajnirano je da smanji inflamaciju. Medicinska terapija uključuje kortikosteroide, antibiotike, imunosupresivne lekove, i anti-TNFα agense. Usled terapijskih neuspeha i ozbiljnih sporednih efekata postojećih terapija, potrebne su alternative.

[0003] Važnu ulogu u patogenezi IBD igra TGF-β1, multifunkcionalni citokin koji je sposoban da reguliše rast, diferencijaciju, i funkciju imunskih i neimunskih ćelija. Umanjena sposobnost pokretanja efikasnog kontraregulatornog TGF-β1 odgovora na inflamatorne stimuluse smatra se relevantnom u patogenezi bolesti kao što je IBD. TGF-β1 deluje kao potentan negativni regulator inflamacije mukoze i inhibicija njegove aktivnosti rezultuje razvojem kolitisa koji pokazuje imunomorfološke sličnosti sa Kronovom bolešću ili ulceroznim kolitisom.

[0004] U inflamiranom crevu pacijenata sa IBD postoji izražena prekomerna ekspresija Smad7 (protein koji služi kao supstrat za TGF-β1 receptore) i redukcija fosforilacije Smad 3, ključnog koraka u prenosu signala posredovanom sa TGF-β1. Stoga, kod IBD, visoki nivoi Smad7 mogu dovesti do defektne TGF-β1 signalizacije što rezultuje prekomernom ekspresijom gena proinflamatornih molekula, i TGF-β1 ne ispoljava svoju antiinflamatornu ulogu.

[0005] Antisens oligodezoksinukleotidni lekovi su kratki lanci DNK nukleotida koji inhibiraju translaciju proteina specifičnim vezivanjem za mali segment informacione RNK (iRNK) odgovorne za pokretanje proizvodnje proteina koji uzrokuju bolest. Sekvenca antisens leka je dizajnirana tako da bude komplementarna svojoj ciljnoj iRNK tako da, nakon hibridizacije, ćelija prepoznaje rezultujući dvolančani segment kao abnormalni i uništava ga, čime se sprečava translacija poruke u proteinski proizvod.

[0006] Međutim, antisens terapeutici se tipično primenjuju parenteralno što može dovesti do neželjenih reakcija usled sistemskih efekata. Takva primena takođe možda neće moći da se lokalizuje na mestu potrebnog lečenja. Prema tome, postoji potreba za topikalno-sličnom primenom antisens terapija za lečenje IBD i srodnih bolesti upotrebom formulacija na bazi tableta.

[0007] WO 2004/087920 se odnosi na antisens oligonukleotidne sekvence (ODN) prema Smad7 odgovarajuće modifikovane, i njihovu upotrebu u medicinskoj oblasti kao terapijskih bioloških agenasa, posebno u lečenju hronične inflamatorne bolesti creva, kao što su Kronova bolest i ulcerozni kolitis. WO 03/017940 se odnosi na farmaceutske formulacije sa modifikovanim oslobađanjem i postupke za poboljšanu mukoznu apsorpciju lekova. Formulacija sadrži inicijalnu(e) populaciju(e) čestica koje sadrže i lek i pojačivač penetracije koji se oslobađaju na prvoj lokaciji u gastrointestinalnom traktu, i naknadnu populaciju ili populacije čestica koje sadrže pojačivač(e) penetracije koje imaju odloženo oslobađanje usled polimerne obloge ili matriksa. Ovaj pojačivač penetracije se oslobađa na dodatnoj(im) lokaciji(ama) u crevu nizvodno od prve lokacije i poboljšava apsorpciju leka kada stigne do dodatne(ih) lokacije(a).

SAŽETAK

[0008] Ova objava je usmerena, barem delimično, na farmaceutske formulacije za oralnu primenu antisens oligonukleotida, kao što su antisens oligonukleotidi prema SMAD7.

[0009] U primeru izvođenja, obezbeđena je farmaceutska formulacija tablete za oralnu primenu antisens oligonukleotida koja sadrži unutargranularnu fazu, pri čemu unutargranularna faza uključuje antisens oligonukleotid koji je predstavljen pomoću SEQ ID NO 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv filer, i koja uključuje vangranularnu fazu koja sadrži dezintegrant. Razmatrani oligonukleotidi uključuju one koji su predstavljeni pomoću SEQ ID NO 1, pri čemu je najmanje jedna, ili u određenim primerima izvođenja, sve, internukleotidne veze O,O-povezani fosforotioati.

[0010] Predmetna objava obezbeđuje tabletu koja uključuje objavljen antisens oligonukleotid, i sadrži enteričku oblogu. Takva tableta može, na primer, da uključuje filer, dezintegrant, i/ili lubrikant. Na primer, ovde je obezbeđen oralni dozni oblik, kao što je tableta, koji sadrži oko 35 mg do oko 500 mg antisens oligonukleotida, npr. 40 mg oligonukleotida koji je predstavljen pomoću SEQ ID NO 1 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0011] U primeru izvođenja, ovde je obezbeđena tableta za oralnu upotrebu koja sadrži: oko 0,5% do oko 10% po težini antisens oligonukleotida koji je predstavljen pomoću SEQ ID NO 1 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli; oko 30% do oko 50% po težini manitola; i oko 10% do oko 30% po težini mikrokristalne celuloze.

[0012] Na primer, objava obezbeđuje farmaceutski prihvatljivu tabletu za oralnu upotrebu koja sadrži unutargranularnu fazu i vangranularnu fazu, pri čemu na primer, unutargranularna faza sadrži oko 5% do oko 10%, po težini (na primer oko 8% po težini) antisens oligonukleotida koji je predstavljen pomoću SEQ ID NO 1 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, oko 40% po težini manitola, oko 8% po težini mikrokristalne celuloze, oko 5% po težini hidropropilmetil celuloze, i oko 2% po težini natrijum skrob glikolata, i na primer, vangranularna faza sadrži oko 17% po težini mikrokristalne celuloze, oko 2% po težini natrijum skrob glikolata, i oko 0,4% po težini magnezijum stearata, gde tableta može dodatno da sadrži enteričku oblogu.

[0013] Ovde su takođe obezbeđeni postupci za lečenje Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, i hronične inflamatorne bolesti creva koji sadrže primenu pacijentu kome je to potrebno tablete, oralne doze ili farmaceutske formulacije koja je ovde objavljena. Na primer, nakon oralne primene farmaceutske formulacije, tablete ili oralnog doznog oblika pacijentu, farmaceutska formulacija, tableta ili oralni dozni oblik mogu biti suštinski isporučeni u terminalni ileum i/ili desni kolon pacijenta.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0014]

SLIKA 1 prikazuje molekularnu strukturu antisens jedinjenja, koje je ovde opisano kao AS1.

SLIKA 2 je šematski prikaz procesa proizvodnje AS1.

SLIKA 3 je histogram koji prikazuje raspodelu veličina čestica za jačinu doze od 3,5 mg AS1.

SLIKA 4 je histogram koji prikazuje raspodelu veličina čestica za jačinu doze od 35 mg AS1.

SLIKA 5 je histogram koji prikazuje raspodelu veličina čestica za jačinu doze od 250 mg AS1.

SLIKA 6 je linijski grafikon koji prikazuje profile rastvaranja (kao procenat rastvorene tablete) za tri tablete sa različitim jačinama doze AS1 u tri različita medijuma (pH 1,0, pH 6,6, i pH 7,2).

SLIKA 7 prikazuje profil rastvaranja serije koja je ovde opisana.

DETALJAN OPIS

[0015] Predmetna objava je generalno usmerena na farmaceutske kompozicije koje uključuju antisens oligonukleotid, kao što je onaj koji je prikazan na SLICI 1. Razmatrane kompozicije uključuju oligonukleotide koji deluju prema Smad7, i mogu se primenjivati oralno. Objavljene kompozicije mogu, kada se primenjuju oralno, isporučiti efikasnu količinu antisens oligonukleotida u crevni sistem pacijenta, npr. isporučiti efikasnu količinu antisens oligonukleotida u terminalni ileum i/ili desni kolon pacijenta.

[0016] Razmatrani antisens oligonukleotidi uključuju one koji sadrže SEQ ID NO: 1 GTC* GCC CCT TCT CCC C*GC AGC, gde C* predstavlja 5-metil‑2ꞌ-dezoksicitidin. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedna od internukleotidnih veza razmatranog antisens oligonukleotida je O,O-povezani fosforotioat, na primer, svaka od 20 internukleotidnih veza SEQ ID NO: 1 može biti O,O-povezani fosforotioat. U nekim primerima izvođenja, razmatrane kompozicije koje su ovde objavljene mogu da uključuju farmaceutski prihvatljivu so antisens oligonukleotida SEQ ID NO: 1, koja opciono može da uključuje 1 do 20 O,O-povezanih fosforotioatnih internukleotidnih veza. Razmatrane soli oligonukleotida uključuju one koje su potpuno neutralisane. Oligonukleotidi mogu da uključuju nukleobaze, šećere, i kovalentne internukleozidne (kičmene) veze koje se javljaju u prirodi, kao i delove koji se ne javljaju u prirodi. Primer antisens oligonukleotida, koji se ovde označava kao AS1, pokazan je na SLICI 1.

[0017] U nekim primerima izvođenja, ovde su razmatrane kompozicije pogodne za oralnu isporuku antisens oligonukleotida, npr. tablete, koje uključuju enteričku oblogu, npr. gastrorezistentnu oblogu, tako da kompozicije mogu isporučiti antisens jedinjenje npr. u terminalni ileum i desni kolon pacijenta. Na primer, takva primena može rezultovati topikalnim efektom, suštinski topikalnom primenom antisens jedinjenja direktno na zahvaćeni deo creva pacijenta. Takva primena može, u nekim primerima izvođenja, suštinski izbeći neželjenu sistemsku apsorpciju antisens jedinjenja.

[0018] Na primer, obezbeđena je tableta za oralnu primenu koja sadrži granule (npr. barem delimično je formirana od granula) koje uključuju objavljeno antisens jedinjenje, npr. AS1, i farmaceutski prihvatljive ekscipijense. Takva tableta može biti obložena enteričkom oblogom. Razmatrane tablete mogu da uključuju farmaceutski prihvatljive ekscipijense kao što su fileri, bajnderi, dezintegranti, i/ili lubrikanti, kao i agense za bojenje, agense za oslobađanje, agense za oblaganje, zaslađivače, arome kao što su zimzelen, pomorandža, ksilitol, sorbitol, fruktoza, i maltodekstrin, i agense za parfimisanje, konzervanse i/ili antioksidanse.

[0019] U nekim primerima izvođenja, razmatrane farmaceutske formulacije uključuju unutargranularnu fazu koja uključuje razmatrano antisens jedinjenje, npr. ono koje je prikazano u SEQ ID NO: 1, ili farmaceutski prihvatljivu so, npr. AS1, i farmaceutski prihvatljiv filer. Na primer, AS1 i filer mogu se pomešati zajedno, opciono sa drugim ekscipijensima, i formirati u granule. U nekim primerima izvođenja, unutargranularna faza može se formirati upotrebom vlažne granulacije, npr. tečnost (npr. voda) se dodaje pomešanom antisens jedinjenju i fileru, i zatim se kombinacija suši, melje i/ili prosejava kako bi se dobile granule. Onaj sa iskustvom u struci će razumeti da se drugi procesi mogu upotrebljavati za postizanje unutargranularne faze.

[0020] U nekim primerima izvođenja, razmatrane formulacije uključuju vangranularnu fazu, koja može da uključuje jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, i koja se može pomešati sa unutargranularnom fazom kako bi se formirala objavljena formulacija.

[0021] Objavljena formulacija može da uključuje unutargranularnu fazu koja uključuje filer. Primeri filera uključuju, ali nisu ograničeni na, celulozu, želatin, kalcijum fosfat, laktozu, saharozu, glukozu, manitol, sorbitol, mikrokristalnu celulozu, pektin, poliakrilate, dekstrozu, celulozu acetat, hidroksipropilmetil celulozu, delimično preželatinizirani skrob, kalcijum karbonat, i drugo uključujući njihove kombinacije.

[0022] U nekim primerima izvođenja, objavljena formulacija može da uključuje unutargranularnu fazu i/ili vangranularnu fazu koja uključuje bajnder, koji generalno može da služi da drži sastojke farmaceutske formulacije zajedno. Primeri bajndera prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: skrobovi, šećeri, celuloza ili modifikovana celuloza kao što je hidroksipropil celuloza, laktoza, preželatinizirani kukuruzni skrob, polivinil pirolidon, hidroksipropil celuloza, hidroksipropilmetil celuloza, nisko supstituisana hidroksipropil celuloza, natrijum karboksimetil celuloza, metil celuloza, etil celuloza, šećerni alkoholi, i drugo uključujući njihove kombinacije.

[0023] Razmatrane formulacije, npr. one koje uključuju unutargranularnu fazu i/ili vangranularnu fazu, mogu da uključuju dezintegrant kao što su, ali nisu ograničeni na, skrob, celulozu, umreženi polivinil pirolidon, natrijum skrob glikolat, natrijum karboksimetil celulozu, alginate, kukuruzni skrob, krosmelozu natrijum, umreženu karboksimetil celulozu, nisko supstituisanu hidroksipropil celulozu, akaciju, i drugo uključujući njihove kombinacije. Na primer, unutargranularna faza i/ili vangranularna faza mogu da uključuju dezintegrant.

[0024] U nekim primerima izvođenja, razmatrana formulacija uključuje unutargranularnu fazu koja sadrži objavljeno antisens jedinjenje i ekscipijense koji su odabrani od: manitola, mikrokristalne celuloze, hidroksipropilmetil celuloze, i natrijum skrob glikolata ili njihovih kombinacija, i vangranularnu fazu koja sadrži jedno ili više od: mikrokristalne celuloze, natrijum skrob glikolata, i magnezijum stearata ili njihovih smeša.

[0025] U nekim primerima izvođenja, razmatrana formulacija može da uključuje lubrikant, npr. vangranularna faza može da sadrži lubrikant. Lubrikanti uključuju, ali nisu ograničeni na, talk, silicijum dioksid, masti, stearin, magnezijum stearat, kalcijum fosfat, silicijum dioksid, kalcijum silikat, kalcijum fosfat, koloidni silicijum dioksid, metalne stearate, hidrogenizovano biljno ulje, kukuruzni skrob, natrijum benzoat, polietilen glikole, natrijum acetat, kalcijum stearat, natrijum lauril sulfat, natrijum hlorid, magnezijum lauril sulfat, talk, i stearinsku kiselinu.

[0026] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska formulacija sadrži enteričku oblogu. Generalno, enteričke obloge stvaraju barijeru za oralni lek koja kontroliše mesto na kom se lek apsorbuje duž digestivnog trakta. Enteričke obloge mogu da uključuju polimer koji se dezintegriše različitim stopama u zavisnosti od pH. Enteričke obloge mogu da uključuju, na primer, celuloza acetat ftalat, kopolimere metil akrilata i metakrilne kiseline, celuloza acetat sukcinat, hidroksipropilmetil celuloza ftalat, kopolimere metil metakrilata i metakrilne kiseline, kopolimere etil akrilata i metakrilne kiseline, kopolimer metakrilne kiseline tipa C, polivinil acetat ftalat, i celuloza acetat ftalat.

[0027] Primeri enteričkih obloga uključuju Opadry<®>AMB, Acryl-EZE<®>, Eudragit<®>kvalitete. U nekim primerima izvođenja, enterička obloga može da sadrži oko 5% do oko 10%, oko 5% do oko 20%, 8 do oko 15%, oko 8% do oko 18%, oko 10% do oko 12%, ili oko 12 do oko 16% težine razmatrane tablete. Na primer, enteričke obloge mogu da uključuju kopolimer etil akrilata i metakrilne kiseline.

[0028] Na primer, obezbeđena je tableta koja sadrži ili se suštinski sastoji od oko 0,5% do oko 70%, npr. oko 0,5% do oko 10%, ili oko 1% do oko 20%, po težini antisens oligonukleotida ili njegove farmaceutski prihvatljive soli (npr. AS1). Takva tableta može da uključuje, na primer, oko 0,5% do oko 60% po težini manitola, npr. oko 30% do oko 50% po težini manitola, npr. oko 40% po težini manitola; i/ili oko 20% do oko 40% po težini mikrokristalne celuloze, ili oko 10% do oko 30% po težini mikrokristalne celuloze. Na primer, objavljena tableta može da sadrži unutargranularnu fazu koja uključuje oko 30% do oko 60%, npr. oko 45% do oko 65% po težini, ili alternativno, oko 5 do oko 10% po težini AS1, oko 30% do oko 50%, ili alternativno, oko 5% do oko 15% po težini manitola, oko 5% do oko 15% mikrokristalne celuloze, oko 0% do oko 4%, ili oko 1% do oko 7% hidroksipropilmetilceluloze, i oko 0% do oko 4%, npr. oko 2% do oko 4% natrijum skrob glikolata po težini.

[0029] Primeri formulacija uključuju dozne oblike koji uključuju ili se suštinski sastoje od oko 35 mg do oko 500 mg AS1, na primer, ovde su razmatrane tablete koje uključuju oko 35 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, ili 250 mg AS1.

[0030] U primeru izvođenja koji služi kao primer, obezbeđena je farmaceutski prihvatljiva tableta za oralnu primenu koja uključuje unutargranularnu fazu koja može da sadrži oko 50% po težini AS1 (ili njegove soli), oko 11,5% po težini manitola, oko 10% po težini mikrokristalne celuloze, oko 3% po težini hidropropilmetilceluloze, i oko 2,5% po težini natrijum skrob glikolata; i vangranularnu fazu koja može da sadrži oko 20% po težini mikrokristalne celuloze, oko 2,5% po težini natrijum skrob glikolata, i oko 0,5% po težini magnezijum stearata. Tableta takođe može da uključuje enteričku oblogu.

[0031] U primeru izvođenja koji služi kao primer, obezbeđena je farmaceutski prihvatljiva tableta za oralnu primenu koja uključuje ili se suštinski sastoji od: unutargranularne faze koja može da sadrži ili se suštinski sastoji od oko 5% do oko 10%, npr. oko 8% po težini AS1 (npr. pri čemu su internukleotidne veze svaka O,O-povezani fosforotioati, i/ili njegove soli, npr. natrijumova so), oko 40% po težini manitola, oko 8% po težini mikrokristalne celuloze, oko 5% po težini hidropropilmetilceluloze, i oko 2% po težini natrijum skrob glikolata; i vangranularne faze koja može da sadrži oko 17% po težini mikrokristalne celuloze, oko 2% po težini natrijum skrob glikolata, i oko 0,4% po težini magnezijum stearata.

[0032] Objavljene tablete mogu takođe da uključuju enteričku oblogu, npr. objavljena tableta može da uključuje oko 13%, oko 15%, 16%, 17% po težini enteričke obloge, npr. AcyrlEZE<®>.

[0033] Stopa kojom se obloga rastvara i aktivni sastojak oslobađa je njegova stopa rastvaranja. U primeru izvođenja, razmatrana tableta može imati profil rastvaranja, npr. kada se testira u USP/EP aparatu tipa 2 (lopatica) na 100 o/min i 37 °C u fosfatnom puferu sa pH od 7,2, od oko 50% do oko 100% oligonukleotida koji se oslobađa posle oko 120 minuta do oko 240 minuta, na primer posle 180 minuta. U sledećem primeru izvođenja, razmatrana tableta može imati profil rastvaranja, npr. kada se testira u USP/EP aparatu tipa 2 (lopatica) na 100 o/min i 37 °C u razblaženoj HCl sa pH od 1,0, gde se suštinski nijedan oligonukleotid ne oslobađa posle 120 minuta. Razmatrana tableta, u sledećem primeru izvođenja, može imati profil rastvaranja, npr. kada se testira u USP/EP aparatu tipa 2 (lopatica) na 100 o/min i 37 °C u fosfatnom puferu sa pH od 6,6, od oko 10% do oko 30%, ili ne više od oko 50%, oligonukleotida koji se oslobađa posle 30 minuta.

[0034] Objavljene formulacije, npr. tablete, u nekim primerima izvođenja, kada se oralno primenjuju pacijentu mogu rezultovati minimalnom koncentracijom oligonukleotida u plazmi pacijenta. U sledećem primeru izvođenja, objavljene formulacije, kada se oralno primenjuju pacijentu, topikalno se isporučuju u terminalni ileum i/ili desni kolon pacijenta, npr. u zahvaćeno ili bolesno mesto creva pacijenta.

[0035] Ovde su takođe obezbeđeni postupci lečenja Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, i/ili hronične inflamatorne bolesti creva kod pacijenta kome je to potrebno, primenom objavljene formulacije.

PRIMERI

[0036] Primeri koji slede ni na koji način nisu namenjeni da ograniče obim ovog pronalaska, već su obezbeđeni da ilustruju postupke iz predmetnog pronalaska. Mnogi drugi primeri izvođenja ovog pronalaska biće očigledni onom sa iskustvom u struci.

Primer 1 - Tablete

[0037] Vlažne granule su pripremljene stavljanjem svake unutargranularne komponente u odgovarajući kontejner. Svi unutargranularni materijali su prosejani kroz sito od 710 µm i mešani u činiji za obradu hrane tokom oko 5 minuta. Tečnost za vodeno granulisanje je polako dodavana upotrebom šprica. Vlažna masa je propuštena kroz ručno sito od 2,00 mm i osušena u rerni na 40 °C tokom do 90 minuta. Posle sušenja, granule su prosejane kroz ručno sito od 1,00 mm. Avan i tučak su korišćeni za smanjenje veličine krupnih granula. Granule su mešane sa vangranularnim ekscipijensima osim magnezijum stearata upotrebom Turbula blendera tokom 10 minuta na 42 o/min. Magnezijum stearat je dodat u smešu i dodatno je mešano tokom 2 minuta na 42 o/min. Formulacije su komprimovane na Manesty F3 mašini za komprimovanje sa jednim udarcem. Dijagram toka celog proizvodnog procesa za AS1 tablete može se videti na SLICI 2.

[0038] Formulacija jačine doze od 250 mg na bazi manitola, napravljena u veličini serije od 50 g, imala je sadržaj vlage u suvoj smeši od 5,21% i sadržaj vlage u osušenim granulama od 6,42%. Formulaciji jačine doze od 250 mg na bazi manitola dodato je 5,0 g vode, vreme granulacije je bilo 4 minuta, i vreme sušenja 60 minuta.

[0039] Jačina doze od 35 mg na bazi manitola, napravljena u veličini serije od 100 g, imala je sadržaj vlage od 2,35% za osušene granule, dodato je 28 g vode, vreme granulacije je bilo 6 minuta, i vreme sušenja je bilo 65 minuta.

[0040] IPC rezultati komprimovanja za formulacije jačine doze od 250 mg na bazi manitola su sledeći: prosečna težina od 453,0 mg, tvrdoća od 18,0 Kp, debljina od 3,82 mm, lomljivost od 0,23%, i vreme dezintegracije od 17 minuta.

[0041] Tabela 1A uključuje kompozicije tableta za tri jačine doze: 3,5 mg, 35 mg, i 250 mg. Težina tableta je bila 500 mg za sve formulacije.

Tabela 1A:

Tabela 1B ukazuje na kompoziciju osnovnih serija ove tri jačine doze:

Primer 2 - Karakterizacija praha

[0042] Formulacije su procenjene na osnovu raspodele veličina čestica, gustine, Karovog (Carrꞌs) indeksa i ugla mirovanja. Analiza veličina čestica je ukazala da su čestice veće veličine (335 µm) za formulaciju jačine doze od 3,5 mg, dok su formulacije jačine doze od 35 mg i 250 mg pokazale uobičajenu raspodelu veličina čestica. SLIKA 3 prikazuje raspodelu veličina čestica za jačinu doze od 3,5 mg sa kompozicijom koja je naznačena u Tabeli 1. SLIKA 4 prikazuje raspodelu veličina čestica za jačinu doze od 35 mg sa kompozicijom koja je naznačena u Tabeli 1. Na kraju, SLIKA 5 prikazuje raspodelu veličina čestica za jačinu doze od 250 mg sa kompozicijom koja je naznačena u Tabeli 1. Tabela 2 predstavlja rezultate karakterizacije praha za tri jačine doze.

Tabela 2:

Primer 3 - Enterička obloga

[0043] Za Acryl-EZE<®>obloge pripremljen je 20% rastvor za oblaganje. Potrebne količine vode i Acryl-EZE<®>sipane su u odgovarajuće kontejnere. Tokom mešanja, Acryl-EZE<®>je polako dodat u vorteks. Disperzija je mešana tokom 45 minuta i propuštena kroz sito od 500 µm. Raspršivanje je nastavljeno dok se nije dobilo povećanje težine od 10% ili 16%.

Primer 4 - Tablete od 40 mg

[0044] Formula serije za tablete od 40 mg AS1 prikazana je u nastavku:

Primer 5 - Formulacija tablete od 200 mg

[0045] AS1 tableta jačine doze od 200 mg proizvedena je generalno prateći proceduru u Primeru 1, kao što je pokazano u Tabeli 4. Težina tablete za sve formulacije bila je 500 mg.

Tabela 4: Sastav formulacije pri jačini doze od 200 mg

Primer 6 - HPLC postupak rastvaranja

[0046] Ova analitička test procedura opisuje analizu rastvaranja AS1 enterički obloženih tableta pomoću HPLC. Rastvaranje se vrši prema Ph. Eur. proceduri za čvrste dozne oblike sa odloženim oslobađanjem, upotrebom Postupka A. Upotrebljen aparat je bio Ph. Eur. /USP aparat 2 (lopatica).

[0047] Uslovi rastvaranja za HPLC su sledeći: medijum se sastoji od pH 1,0 HCl (120 min), pH 6,6 (30 min), pH 7,2 (60 min); temperatura od 37 °C; stopa od 100 o/min; uzorak za reciklažu 7,5 ml, veličina uzorka 0,8 ml; vreme uzorkovanja 120 min u pH 1,0 HCl, 15, 30 min pH 6,6, 15, 30, 45, 60 min pH 7,2; i Disteck linijski filter od 45 µm.

[0048] Medijum je podešen u svakoj posudi tokom rastvaranja pri svakom stanju na sledeći način: inicijalna zapremina 750 ml pH 1,0 HCl; na 120 min, dodato je 200 ml 0,2 M Na3PO4i 30 ml 1,0 M pH 6,7 Na2HPO4, nakon čega je pH podešena na pH 6,60±0,05 sa 2,0 M NaOH; na 150 min, pH je podešena na pH 7,20±0,05 sa 2,0 M NaOH.

[0049] Hromatografski uslovi su sledeći: Dionex HPLC analitička kolona, DNAPac‑100, 4 x 250 mm; stopa protoka od 2,0 ml/min; temperatura kolone od 80 °C; detekcija UV na 260 nm; zapremina injektora od 100 µl; ispiranje igle vodom; mobilna faza A) 10% zapr./zapr. acetonitril u 100 mM Tris (pH 8,0) i B) 10% zapr./zapr. acetonitril u 100 mM Tris i 2M LiCl (pH 8,0); vreme rada HPLC od 15 min; i period eluiranja AS1 od približno 6 minuta. Gradijent je prikazan u Tabeli 6.

Tabela 6:

[0050] Priprema rastvora radnog standarda tableta od 35 mg: 12,5 mg AS1 referentnog standarda stavljeno je u volumetrijski flask od 50 ml i rastvoreno vodom kako bi se dobilo 50 ml rastvora. Vodom je razblaženo 7 ml rastvora kako bi se dobio rastvor od 50 ml, što je dalo krajnju koncentraciju AS1 od 0,035 mg/ml.

[0051] Priprema rastvora radnog standarda tableta od 250 mg: 12,5 mg AS1 stavljeno je u volumetrijski flask od 50 ml i rastvoreno vodom do zapremine od 50 ml, što je dalo krajnju koncentraciju AS1 od 0,25 mg/ml.

[0052] Tabela 5 prikazuje rezultate rastvaranja za serije od 35 mg, 250 mg, i 200 mg, sa povećanjem težine usled oblaganja sa Acryl-EZE<®>od 12%. SLIKA 6 je grafikon profila rastvaranja za tablete sa tri veličine doze AS1 formulacija u tri različita medijuma.

Tabela 5:

[0053] Tablete sa 16% Acryl-EZE® obloge se prave upotrebom tableta kao što je prethodno opisano u Seriji 1, i završno oblaganje se vrši sve dok povećanje težine tableta u mašini za oblaganje ne bude 16% od početne vrednosti. SLIKA 7 prikazuje profil rastvaranja.

Primer 7 - In vivo oralno doziranje AS1

[0054] Ciljevi studije bili su da se identifikuju potencijalni efekti AS1 na kardiovaskularni, respiratorni, i centralni nervni sistem svesnih, neograničenih, cinomolgus majmuna kada se primeni jedna doza oralno ili intravenski. Intravenska primena u ovoj studiji uključena je radi istraživanja potencijalnih efekata koji su povezani sa sistemskom izloženošću. Intravenska formulacija doze je primenjena kao prah u rasutom stanju, a za oralnu primenu kao enterički obložene tablete sadržane unutar želatinskih kapsula. Četiri eksperimentalno ne-naivna mužjaka cinomolgus majmuna, starosti od 3,6 do 3,8 godina, i težine od 3,4 do 3,9 kg, raspoređena su u jednu grupu.

Tabela 7:

[0055] Svi nivoi doza predstavljaju količinu AS1, korigovanu za čistoću. Kontrolne oralne doze bile su dve kapsule koje sadrže placebo tablete. Približan nivo doze, postignut primenom dve kapsule, od kojih svaka sadrži tabletu sa 26,1 mg AS1 po tableti (korigovano za čistoću), i zasnovan na telesnoj težini koja je bila u opsegu od 3,5 do 3,9 kg na Dan 4. Približan nivo doze, postignut primenom dve kapsule, od kojih svaka sadrži tabletu sa 169,9 mg AS1 po tableti (korigovano za čistoću), i zasnovan na telesnoj težini koja je bila u opsegu od 3,5 do 3,9 kg na Dan 4.

[0056] Uzorci krvi za toksikokinetičku analizu prikupljeni su pre studije i 1 i 6 sati nakon doze za oralne doze, i 5 minuta, 1 i 6 sati nakon doze za intravenske doze. Uzorci su obrađeni do plazme pod rashlađenim uslovima i plazma je čuvana na -70 °C do analize. Uzorci su analizirani upotrebom AS1 specifičnog hibridizacionog testa.

[0057] Na Dan 1, sve životinje su primile oralnu dozu kontrolne komponente, nakon čega su usledile doze AS1 na Dane 4 i 7 putem oralne gavaže. Za oralne doze, placebo i tablete koje sadrže AS1 bile su smeštene u želatinske kapsule odgovarajuće veličine kako bi se olakšala oralna primena. Na Dan 12, sve životinje su primile intravensku kontrolnu dozu (fosfatom puferisani fiziološki rastvor) pomoću sporog injektiranja, nakon čega su usledile intravenske doze AS1 na Dane 14 i 19.

[0058] Kardiovaskularni podaci i podaci o telesnoj temperaturi beleženi su putem telemetrije u čestim intervalima pre i tokom 24 sata nakon primene svake doze. Respiratorna funkcija je procenjena merenjem parametara gasova u krvi u arterijskim uzorcima prikupljenim pre doziranja i 1, 6, i 24 sata nakon svake doze, kao i određivanjem stope respiracije (vizuelno) u tim istim vremenskim tačkama. Neurološka funkcija je procenjena sprovođenjem sveobuhvatnog neurološkog pregleda svih životinja pre studije unutar približno 24 sata posle završetka perioda telemetrijskog beleženja nakon poslednje oralne doze testirane komponente i ponovo unutar približno 24 sata posle završetka perioda telemetrijskog beleženja nakon poslednje intravenske doze. Životinje su takođe posmatrane zbog kliničkih znakova (mortalitet/morbiditet, posmatranja opšteg ponašanja u kavezu, konzumacija hrane, i telesna težina).

[0059] Uprkos veoma niskoj LLOQ za test (0,5 ng/ml), AS1 nije detektovan ni u jednom uzorku plazme nakon oralnih doza do skoro 100 mg/kg. Nasuprot tome, srednje vrednosti maksimalne koncentracije u plazmi nakon IV injekcija bile su 28.309 i 180.352 ng/ml za doze od 3 i 10 mg/kg, respektivno. Klirens AS1 iz plazme nakon IV doziranja pokazao je kinetiku sličnu onoj koja je prijavljena za strukturno srodne oligonukleotide (tj. približno 0,5 sati poluživot).

Primer 8 - In vivo studija od 28 dana oralno primenjenog AS1

[0060] Svrha ove studije bila je da se proceni potencijalna toksičnost i toksikokinetika AS1 kada se primenjuje jednom dnevno oralno miševima tokom 28 dana, nakon čega sledi period oporavka od 28 dana. Formulacija AS1 je pripremljena kao formulacija koja sadrži gastrorezistentnu oblogu u obliku malih obloženih perli. AS1 je nanet na inertne perle koje su zatim obložene sa Eudragit<®>S 100 kako bi se imitirale oralne formulacije pogodne za humanu upotrebu. Upotrebljene su tri grupe kojima su primenjeni različiti nivoi doze (30 mg/kg/danu (niska); 100 mg/kg/danu; 300 mg/kg/danu).

[0061] Nisu postojale razlike u nivoima u plazmi ili tkivu povezane sa polom. Uprkos veoma niskoj LLOQ za test, AS1 je detektovan u samo dva uzorka plazme životinja sa veoma niskom dozom (30 mg/kg/dan) prikupljenim na Dan 1, i ni u jednom uzorku prikupljenom na Dan 28. Pri višim nivoima doza od 100 i 300 mg/kg/dan, AS1 je bio kvantifikovan u većini uzoraka plazme, i nivoi su generalno bili dozno zavisni. Međutim, čak i pri najvećem nivou doze, nivoi u plazmi nisu prelazili 21 ng/ml ni kod jedne životinje (u uzorcima prikupljenim u različitim vremenima između 0,5 i 24 sata nakon doze). Koncentracije AS1 bile su veoma visoke u gastrointestinalnim (GI) tkivima, sa srednjim vrednostima maksimalne koncentracije pri najvećem nivou doze (nakon prve doze) od približno 536, 857, 825, 538, 137 i 127 µg/gramu tkiva za debelo crevo, tanko crevo, predželudac, deo želuca obložen glandularnom mukozom, jednjak i rektum, respektivno.

[0062] Ekstenzivni klirens iz tkiva GI trakta bio je evidentan 24 sata posle prve doze. Nije bilo očigledne akumulacije AS1 sa dnevnim doziranjem.

[0063] Maksimalne srednje vrednosti koncentracije u dva glavna organa sistemskog preuzimanja, bubrezima i jetri, nakon prve doze od 300 mg/kg bile su samo 4,0 i 2,3 µg/gramu, što je preko 100 puta niže od opsega koncentracija koje su izmerene u gastrointestinalnim tkivima.

[0064] Nakon najniže doze od 30 mg/kg, najviše srednje vrednosti koncentracije u bubrezima i jetri bile su samo 0,4 i 0,3 µg/gramu. Nije bilo dokaza za akumulaciju AS1 u unutrašnjim organima tokom perioda doziranja od 28 dana.

[0065] Sistemska izloženost AS1 kod miševa bila je veoma niska nakon oralne primene visokih doza (do 300 mg/kg/danu) AS1, koje su isporučene u gastrorezistentnoj formulaciji, i nije bilo akumulacije u gastrointestinalnim tkivima ili unutrašnjim tkivima kada su se primenjivale svakodnevno tokom 28 uzastopnih dana.

Primer 9 - Terapijski efekat AS1 na kolitis

[0066] Kako bi se ispitao terapijski efekat AS1 na tok crevne inflamacije u modelu TNBS-indukovanog kolitisa, miševi su tretirani sa jednom dozom AS1 ili Smad7 sens oligonukleotida jedan dan nakon intrarektalne primene TNBS. Pojedinačne doze od 125 ili 250 µg/mišu poboljšale su gubitak težine i primetno smanjile ozbiljnost histoloških manifestacija kolitisa.

[0067] AS1 (dat kao jedna doza od 125 µg jedan dan posle indukcije TNBS-kolitisa) značajno je smanjio produkciju monomerne p40 podjedinice u kolonu, komponente citokina IL-12 i IL-23, demonstrirajući inhibiciju produkcije ovih proinflamatornih citokina u kolonu.

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska formulacija tablete za oralnu primenu antisens oligonukleotida naznačena time što sadrži:

unutargranularnu fazu koja sadrži antisens oligonukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv filer;

vangranularnu fazu koja sadrži dezintegrant; i

enteričku oblogu koja sadrži kopolimer etilakrilata i metakrilne kiseline, pri čemu farmaceutska formulacija tablete, nakon oralne primene pacijentu, isporučuje antisens oligonukleotid suštinski u terminalni ileum i/ili desni kolon pacijenta.

2. Farmaceutska formulacija za oralnu primenu antisens oligonukleotida naznačena time što sadrži:

unutargranularnu fazu koja sadrži antisens oligonukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv filer;

vangranularnu fazu; i

enteričku oblogu koja sadrži kopolimer etilakrilata i metakrilne kiseline, pri čemu farmaceutska formulacija, nakon oralne primene pacijentu, isporučuje antisens oligonukleotid suštinski u terminalni ileum i/ili desni kolon.

3. Farmaceutska formulacija tablete prema patentnom zahtevu 1 ili farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što farmaceutska formulacija tablete ili farmaceutska formulacija rezultuju minimalnom koncentracijom antisens oligonukleotida u plazmi pacijenta.

4. Farmaceutska formulacija tablete prema patentnom zahtevu 1 ili 3,

naznačeno time što kada se testira u USP/EP aparatu tipa 2 (lopatica) pri 100 o/min i 37 °C u fosfatnom puferu sa pH od 6,6, ne oslobađa se više od oko 50% količine antisens oligonukleotida iz farmaceutske formulacije tokom perioda od 30 minuta; i/ili

kada se testira u USP/EP aparatu tipa 2 (lopatica) pri 100 o/min i 37 °C u razblaženoj HCl sa pH od 1,0, suštinski se ne oslobađa nijedna količina antisens oligonukleotida iz farmaceutske formulacije tokom perioda od 120 minuta.

5. Farmaceutska formulacija tablete prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-4, naznačeno time što kada se testira u USP/EP aparatu tipa 2 (lopatica) pri 100 o/min i 37 °C u fosfatnom puferu sa pH od 6,6, ne oslobađa se više od oko 50% količine antisens oligonukleotida iz farmaceutske formulacije tokom perioda od 30 minuta.

6. Farmaceutska formulacija tablete prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-5, naznačeno time što kada se testira u USP/EP aparatu tipa 2 (lopatica) pri 100 o/min i 37 °C u razblaženoj HCl sa pH od 1,0, suštinski se ne oslobađa nijedna količina antisens oligonukleotida iz farmaceutske formulacije tokom perioda od 120 minuta.

7. Farmaceutska formulacija tablete prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-6, naznačeno time što kada se testira u USP/EP aparatu tipa 2 (lopatica) pri 100 o/min i 37 °C u fosfatnom puferu sa pH od 6,6, ne oslobađa se više od oko 50% količine antisens oligonukleotida iz farmaceutske formulacije tokom perioda od 30 minuta; i kada se testira u USP/EP aparatu tipa 2 (lopatica) pri 100 o/min i 37 °C u razblaženoj HCl sa pH od 1,0, suštinski se ne oslobađa nijedna količina antisens oligonukleotida iz farmaceutske formulacije tokom perioda od 120 minuta.

8. Farmaceutska formulacija tablete prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-7 ili farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 2, naznačene time što su internukleotidne veze SEQ ID NO: 1 O,O-povezani fosforotioati.

9. Farmaceutska formulacija tablete prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-8 ili farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 2 ili 8, naznačene time što unutargranularna faza dodatno sadrži dezintegrant i/ili vangranularna faza dodatno sadrži lubrikant.

10. Farmaceutska formulacija tablete prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-9 ili farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 2, 8, ili 9, naznačene time što je filer manitol, i dezintegrant je natrijum skrob glikolat.

11. Farmaceutska formulacija tablete prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-10 ili farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 2 ili 8-10 naznačene time što

unutargranularna faza dodatno sadrži komponentu koja je odabrana od mikrokristalne celuloze, natrijum skrob glikolata, hidroksipropil metil celuloze, i njihovih smeša; i/ili

vangranularna faza dodatno sadrži komponentu koja je odabrana od mikrokristalne celuloze i magnezijum stearata, i njihovih smeša.

12. Farmaceutska formulacija tablete prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-11, naznačena time što je enterička obloga oko 12% do oko 16% po težini farmaceutske formulacije tablete ili farmaceutske formulacije.

13. Farmaceutski prihvatljiva tableta za oralnu upotrebu naznačena time što sadrži:

oko 0,5% do oko 10% po težini antisens oligonukleotida koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i enteričku oblogu koja sadrži kopolimer etilakrilata i metakrilne kiseline;

oko 30% do oko 50% po težini manitola;

oko 10% do oko 30% po težini mikrokristalne celuloze,

pri čemu nakon primene, tableta isporučuje antisens oligonukleotid suštinski u terminalni ileum i/ili desni kolon.

14. Farmaceutska formulacija tablete za oralnu upotrebu naznačena time što sadrži oko 35 mg do oko 500 mg antisens oligonukleotida koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i enteričku oblogu koja sadrži kopolimer etilakrilata i metakrilne kiseline, pri čemu nakon primene, farmaceutska formulacija isporučuje antisens oligonukleotid suštinski u terminalni ileum i/ili desni kolon.

15. Farmaceutski prihvatljiva tableta za oralnu upotrebu naznačena time što sadrži:

unutargranularnu fazu koja sadrži:

oko 5 do oko 10% po težini antisens oligonukleotida koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so;

oko 40% po težini manitola,

oko 8% po težini mikrokristalne celuloze,

oko 5% po težini hidroksipropil metil celuloze, i

oko 2% po težini natrijum skrob glikolata;

vangranularnu fazu koja sadrži:

oko 17% po težini mikrokristalne celuloze,

oko 2% po težini natrijum skrob glikolata,

oko 0,4% po težini magnezijum stearata; i

enteričku oblogu preko tablete, koja sadrži oko 13% po težini AcyrlEZE<®>, pri čemu nakon primene, tableta isporučuje antisens oligonukleotid suštinski u terminalni ileum i/ili desni kolon.

16. Farmaceutski prihvatljiva tableta prema patentnom zahtevu 15, naznačena time što sadrži oko 40 mg antisens oligonukleotida.

17. Farmaceutska formulacija tablete prema bilo kom od patentnih zahteva 1, 3-12, i 14, farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 2 ili 8-11, ili farmaceutski prihvatljiva tableta prema bilo kom od patentnih zahteva 13 i 15-16, za upotrebu u lečenju Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa ili hronične inflamatorne bolesti creva, naznačeno time što je farmaceutska formulacija tablete, farmaceutska formulacija, ili farmaceutski prihvatljiva tableta za oralnu primenu.