RS67707B1 - Antitela koja neutralizuju ljudski respiratorni sincicijalni virus - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] OBLAST PRONALASKA

[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na ljudska monoklonska antitela koja imaju visoke titre anti- neutralizacije RSV, kao i na upotrebu ovih antitela kao pasivnog imunoterapijskog sredstva kod odojčadi i starijih osoba.

[0007] POZADINA PRONALASKA

[0009] Paramiksovirusi su virusi sa omotačem i negativnim lancem RNK koji su značajni ljudski i životinjski patogeni. Ljudski respiratorni sincicijalni virus (hRSV, RSV) pripada porodici Paramyxoviridae, potporodici Pneumovirinae. Identifikovana su dva podtipa, tip A i tip B, koji su glavni uzrok teških, a ponekad čak i fatalnih respiratornih infekcija kod dece mlađe od 6 meseci. Odrasli sa osnovnim bolestima, kao što su HOBP, astma, rak, imunokompromitovani status, uključujući HIV ili posttransplantacioni period, takođe su u riziku od razvoja teške RSV infekcije. 15% godišnjih hospitalizacija kod odraslih starijih od 50 godina zbog akutne respiratorne infekcije uzrokovano je RSV-om. U Sjedinjenim Državama, RSV uzrokuje više od 100.000 hospitalizacija godišnje, a procenjuje se da uzrokuje oko 160.000 smrtnih slučajeva širom sveta svake godine. Trenutno ne postoji vakcina za RSV, a ispitivanje sa formalinom inaktiviranim virusom povezano je sa povećanom težinom bolesti kod odojčadi nakon infekcije RSV-om. Drugi članovi porodice virusa, uključujući humani metapneumovirus (hMPV) i humani parainfluenca virus (hPIV), takođe su odgovorni za akutne respiratorne bolesti slične hRSV.

[0011] Genom hRSV je jednolančani molekul RNK negativnog smisla veličine približno 15 kb koji kodira 11 proteina. Dva od ovih proteina su glavni površinski glikoproteini viriona. To su (i) protein vezivanja (G), koji posreduje u vezivanju virusa za ćelije, i (ii) protein fuzije (F), koji promoviše i fuziju virusne i ćelijske membrane u početnim fazama infektivnog ciklusa i fuziju membrane inficiranih ćelija sa membranama susednih ćelija da bi se formirala karakteristična sincitija. Protein vezivanja G vezuje receptore ćelijske površine i interaguje sa F. Ova interakcija pokreće konformacionu promenu u F da bi se izazvala fuzija membrane, čime se oslobađa virusni ribonukleoproteinski kompleks u citoplazmu ćelije domaćina.

[0012] Pokazano je da monoklonska antitela protiv F proteina ili G proteina imaju neutrališući efekat in vitro i profilaktički efekat in vivo. Videti, npr., Beeler and Coelingh 1989, J. Virol.

[0013] 63:2941-50; Garcia-Barreno et al., 1989, J. Virol.63:925-32; Taylor et al., 1984, Immunology 52: 137-142; Walsh et al., 1984, Infection and Immunity 43:756-758; i US patente br.5,842,307 i 6,818,216. Neutralizujući epitopi na F glikoproteinu su prvobitno mapirani identifikacijom aminokiselina koje su izmenjene u varijantama „izbegavanja“ antitela i procenom vezivanja antitela za peptide RSV izvedene iz F. Ove studije su pokazale da su neutrališuća antitela često usmerena na dva različita linearna epitopa. Videti Graham et al., 2015, Curr Opin Immunol 35:30-38 za pregled antigenih mesta za prefuzione i postfuzione F oblike. Antigeno mesto II (takođe nazvano mesto A) uključuje ostatke 255 do 275 i cilj je palivizumba (SYNAGIS®, AstraZeneca). Predviđeno je da je ovaj epitop konformaciono zavisan, a struktura potentnijeg derivata palivizumba u kompleksu sa ovim epitopom otkrila je da linearni epitop usvaja konformaciju heliks-petlja-heliks. Antigeno mesto IV (takođe nazvano mesto C) uključuje ostatke 422 do 438 i cilj je antitela MAb19 i 101F. Ovaj epitop je C-terminalan u odnosu na region bogat cisteinom i deo je domena II, koji u homolognim F glikoproteinima paramiksovirusa ostaje strukturno nepromenjen između prefuzijskih i postfuzijskih konformacija. 5C4, AM22 i D25 opisuju epitop označen kao mesto 0 koji je prisutan samo na prefuzijskom F proteinu i bio je 50 puta jači od palivizumba. Videti McLellan et al., 2013, Science 340:1113-1117; Međunarodna patentna prijava br. WO 2008/147196 i američki patent br. 8,568,726. Druga hRSV antitela su opisana u međunarodnim patentnim prijavama br. WO94/06448 i WO92/04381 i US patentu br.8,221,759.

[0015] WO 2006/050280 otkriva antitela, antigene i njihovu upotrebu protiv respiratornog sincicijalnog virusa. WO 97/11177 otkriva neutrališuća monoklonska antitela protiv respiratornog sincicijalnog virusa.

[0017] RSV Vakcina za aktivnu imunizaciju, ako je dostupna, ne bi mogla da s ekoristi za lečenje novorođenčadi sa nezrelim imunim sistemom ili pacijenata koji su imunosupresovani. Kod pacijenata kod kojih je potrebna profilaktička pasivna imunoterapija, kao rezultat hroničnijeg oblika bolesti, trenutna terapija se sprovodi periodičnom intravenskom inokulacijom ljudskog IgG pripremljenog iz sakupljene plazme. Ova vrsta terapije, zbog niskih titara neutrališućih anti-RSV antitela, uključuje veliku količinu globulina (npr.0,75 g po kg) i shodno tome zahteva intravenoznu primenu, u klinici ili bolnici, tokom dužeg perioda (2 do 4 sata), mesečno tokom meseci visokog rizika (jesen, zima i rano proleće).

[0018] KRATAK OPIS PRONALSKA

[0020] Tehničke informacije navedene u nastavku u nekim aspektima mogu da prevaziđu obim trenutno zahtevanog pronalaska, koji je definisan priloženim setom zahteva. Dodatne tehničke informacije su date da bi se pronalazak postavio u širi tehnički kontekst i da bi se ilustrovali mogući povezani tehnički razvoji. Pozivi ovde na metode lečenja terapijom ili hirurškim zahvatom treba tumačiti kao pozivi na jedinjenja, farmaceutske kompozicije, kombinacije i/ili lekove za upotrebu u tim metodama.

[0022] Pronalazak obezbeđuje antitela protiv F-proteina RSV/ anti-RSV F-protein antitela njihove fragmente koji vezuju antigen koji sadrže strukturne i funkcionalne karakteristike navedene u nastavku.

[0024] Pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za lhudski REV F protein, pri čemu antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, hipervarijabilni region CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 i hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6.

[0026] U daljem aspektu, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili fragment koji vezuje antigen ovog pronalaska.

[0028] U daljem aspektu, obezbeđen je ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu pronalaska.

[0030] U daljem aspektu, obezbeđena je kompozicija koji sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen prronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0032] U daljem aspektu, obezbeđen je imunogena kompozicija sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen pronalaska i antigen izabran od RSV F proteina i RSV G proteina i njihovih fragmenata.

[0034] [0014] U daljem aspektu, obezbeđen je metod za detekciju prisustva ljudskog RSV prefuzionog F proteina ili njegovog fragmenta u uzorku, koji obuhvata kontaktiranje uzorka sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen pronalaska i detekciju prisustva kompleksa između antitela ili fragmenta koji vezuje antigen i peptida; pri čemu detekcija kompleksa ukazuje na prisustvo RSV prefuzionog F proteina.

[0036] U daljem aspektu, obezbeđeno je antitelo ili fragment koji vezuje antigen pronalaska ili kompozicija pronalaska za upotrebu u sprečavanju ili lečenju RSV infekcije.

[0038] U daljem aspektu, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži antitelo, fragment koji vezuje antigen, nukleinsku kiselinu ili ekspresioni vektor pronalaska.

[0040] U daljem aspektu, obezbeđeno je antitelo ili fragment koji vezuje antigen pronalaska ili kompozicija pronalaska za upotrebu u terapiji.

[0042] U daljem aspektu, obezbeđena je kombinacija koja sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen pronalaska i dodatni profilaktički ili terapeutski agens za upotrebu u sprečavanju ili lečenju infekcije RSV kod ljudi.

[0044] U daljem aspektu, obezbeđeno je antitelo ili fragment koji vezuje antigen pronalaska ili kompozicija pronalaska za upotrebu u sprečavanju ili lečenju RSV bolesti.

[0046] U daljem aspektu, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži antitelo, fragment koji vezuje antigen, nukleinsku kiselinu ili ekspresioni vektor pronalaska.

[0048] U daljem aspektu, obezbeđen je metod proizvodnje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, koji obuhvata: a) kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži antitelo, fragment koji vezuje antigen, nukleinsku kiselinu ili ekspresioni vektor pronalaska pod uslovima povoljnim za ekspresiju antitela ili fragmenta koji vezuje antigen; i b) opciono, izdvajanje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen iz ćelije domaćina i/ili podloge za kultivaciju.

[0050] [0022] Pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za ljudski RSV F-protein, koji obuhvata: hipervarijabilni region CDR3teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U određenim realizacijama, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opciono ima najmanje jednu od sledećih karakteristika: (i) vezuje se za ljudski RSV prefuzioni F protein sa Kd vrednošću od oko 1 x 10<-9>M do oko 1 x 10<-12>M, kao što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET); ili (ii) vezuje se za postfuzioni F protein ljudskog RSV sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁶ M do oko 1 x 10⁻⁹ M, što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U određenim realizacijama, teški lanac obuhvata, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23.

[0052] Pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za ljudski RSV F-protein, koji obuhvata: hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U određenim ostvarenjima, laki lanac ili varijabilni region lakog lanca ne obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8. U određenim ostvarenjima, laki lanac nije povezan sa teškim lancem koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U određenim ostvarenjima, laki lanac je povezan sa teškim lancem koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7. U jednom ostvarenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opciono ima najmanje jednu od sledećih karakteristika: (i) vezuje se za ljudski RSV prefuzioni F protein sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹² M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET); ili (ii) vezuje se za postfuzioni F protein ljudskog RSV sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹¹ M, što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U određenim realizacijama, laki lanac obuhvata, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25.

[0054] Pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za F-protein ljudskog RSV-a koji obuhvata: (i) hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; i (iii) hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U određenim orealizacijama, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 9. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen opciono ima najmanje jednu od sledećih karakteristika: (i) vezuje se za prefuzioni F protein ljudskog RSV sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹² M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET); ili (ii) vezuje se za postfuzioni F protein ljudskog RSV-a sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹¹ M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U određenim realizacijama, teški lanac obuhvata, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23.

[0055] U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata: (i) hipervarijabilni region CDR1 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (ii) hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (iii) hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U određenim realizacijama, laki lanac ili varijabilni region lakog lanca ne obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8. U određenim izvođenjima, laki lanac nije povezan sa teškim lancem koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U određenim izvođenjima, laki lanac je povezan sa teškim lancem koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment antitela opciono ima najmanje jednu od sledećih karakteristika: (i) vezuje se za prefuzioni F protein ljudskog RSV sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹² M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET); ili (ii) vezuje se za postfuzioni F protein ljudskog RSV sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹¹ M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U određenim izvođenjima, laki lanac obuhvata, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25.

[0057] [0026] U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata: (i) hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (iii) hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (iv) hipervarijabilni region CDR1 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (v) hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (vi) hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U određenim izvođenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opciono ima najmanje jednu od sledećih karakteristika: (i) vezuje se za prefuzioni F protein ljudskog RSV-a sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹² M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET); ili (ii) vezuje se za postfuzioni F protein ljudskog RSV-a sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻¹⁹ M do oko 1 x 10⁻¹¹ M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U određenim izvođenjima, teški lanac obuhvata, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23, a laki lanac obuhvata, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25

[0059] U drugom izvođenju, pronalazak obezbeđuje antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za F-protein ljudskog RSV virusa, koji obuhvata: (i) hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (iii) hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (iv) hipervarijabilni region CDR1 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (v) hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 5; i (vi) hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 6; pri čemu antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sa varijabilnim regionom teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sa varijabilnim regionom lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 8. U određenim ostvarenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U ovim gore navedenim ostvarenjima, varijacije sekvence se javljaju u okvirnim regionima. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opciono ima najmanje jednu od sledećih karakteristika: (i) vezuje se za prefuzioni F protein ljudskog RSV-a sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹² M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET); ili (ii) vezuje se za postfuzioni F protein ljudskog RSV sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹¹ M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U određenim izvođenjima, teški lanac sadrži, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23, a laki lanac sadrži, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25.

[0061] [0028] Pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za ljudski/humani RSV, a koji sadrži: (i) hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (iii) hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 3; (iv) hipervarijabilni region CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (v) hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 5; i (vi) hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U određenim realizacijama, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselina u CDR teškog lanca (SEQ ID NO: 1-3) i/ili u CDR lakog lanca (SEQ ID NO: 4-6). VH sekvenca SEQ ID NO: 7 ima CDR-ove SEQ ID NO: 1-3; i VL sekvenca SEQ ID NO: 8 ima CDR-ove SEQ ID NO: 4-6. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opciono ima najmanje jednu od sledećih karakteristika: (i) vezuje se za prefuzioni F protein ljudskog RSV sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹² M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET); ili (ii) vezuje se za postfuzioni F protein ljudskog RSV-a sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹¹ M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U određenim izvođenjima, teški lanac obuhvata, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23, a laki lanac obuhvata, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25.

[0063] U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, koji obuhvata: varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 i/ili varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, gde se antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen vezuje za ljudski RSV F protein. U drugom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen obuhvata teški lanac koji obuhvata, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO 23 i laki lanac koji obuhvata, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25, gde se antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen vezuje za ljudski RSV F protein. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opciono ima najmanje jednu od sledećih karakteristika: (i) vezuje se za prefuzioni F protein ljudskog RSV-a sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹² M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET); ili (ii) vezuje se za postfuzioni F protein ljudskog RSV-a sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹¹ M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET).

[0065] [0030] U drugom izvođenju, pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za isti epitop ljudskog RSV F proteina kao antitelo koje sadrži teški lanac SEQ ID NO: 23 i laki lanac SEQ ID NO: 25, gde antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ima najmanje jednu od sledećih karakteristika: (i) vezuje se za ljudski RSV prefuzioni F protein sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹² M kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET); ili (ii) vezuje se za ljudski RSV postfuzioni F protein sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹¹ M kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U jednom izvođenju, antitelo sadrži najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa varijabilnim regionom teškog lanca i/ili varijabilnim regionom lakog lanca SEQ ID NO: 7 i 8, respektivno. U drugom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 aminokiselinskih supstitucija u varijabilnom regionu teškog lanca SEQ ID NO: 7 i/ili varijabilnom regionu lakog lanca SEQ ID NO: 8. U određenim izvođenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0067] Ovde je takođe otkriveno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji unakrsno blokira vezivanje (ili se takmiči sa) antitelom koje sadrži teški lanac SEQ ID NO: 23 i laki lanac SEQ ID NO: 25 za ljudski RSV, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ima najmanje jednu od sledećih karakteristika: (i) vezuje se za prefuzioni F protein ljudskog RSV-a sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹² M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET); ili (ii) vezuje se za postfuzioni F protein ljudskog RSV-a sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹¹ M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa varijabilnim regionom teškog lanca SEQ ID NO: 7 ili varijabilnim regionom lakog lanca SEQ ID NO: 8. U drugom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 supstitucija aminokiselina u varijabilnom regionu teškog lanca SEQ ID NO: 7 ili varijabilnom regionu lakog lanca SEQ ID NO: 8. U drugom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u CDR-ovima teškog lanca (SEQ ID NOs: 1-3) i/ili u CDR-ovima lakog lanca (SEQ ID NOs: 4-6). U određenim ostvarenjima, varijabilni region teškog lanca ili teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0068] U jednom ostvarenju, pronalazak se odnosi na izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za ljudski RSV F protein koji sadrži: teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 ili njegova varijanta koja sadrži do 30 aminokiselinskih supstitucija, i/ili laki lanac koji sadrži aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 8 koja sadrži do 12 aminokiselinskih supstitucija. U određenim ostvarenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0070] U određenim ostvarenjima, pronalazak se odnosi na izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za ljudski RSV F protein, pri čemu se antitelo vezuje za ljudski RSV F protein putem jedne ili više sledećih interakcija ili svih sledećih interakcija:

[0072] 1) CDR3 petlja lakog lanca, preko ostataka Phe 91 i Leu 92, interaguje sa bočnim lancem Arg 429 ljudskog RSV F proteina kroz formiranje dve vodonične veze između karbonilnih kiseonika Phe 91 i Leu 92 u CDR3 petlji i guanidino azota Arg 429 ljudskog RSV F proteina;

[0074] 2) CDR2 petlja lakog lanca, preko ostataka Asp 50 i Glu 55, formira vodonične veze sa Asn 426 i Lys 445 ljudskog RSV F proteina;

[0076] 3) CDR3 petlja teškog lanca, preko ostataka Tyr 104 i Tyr 110, formira površinu za van der Valsovu interakciju sa Ile 432 na ljudskom RSV F proteinu;

[0078] 4) CDR3 petlja teškog lanca, preko Asn 107, formira vodoničnu vezu sa Lys 433 ljudskog RSV F proteina; i

[0080] 5) laki lanac se pakuje uz Glu 161 i Ser 182 susednog monomera RSV prefuzionog trimera.

[0082] U određenim aspektima bilo koje od gore navedenih realizacija, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je izolovan.

[0084] U određenim aspektima bilo koje od gore navedenih realizacija, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je rekombinantno antitelo.

[0086] U određenim aspektima bilo koje od gore navedenih realizacija, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je antitelo pune dužine.

[0088] [0037] U određenim aspektima bilo koje od gore navedenih realizacija, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku može da sadrži varijabilni region teškog regiona koji se sastoji od: (a) bilo kog od gore opisanih varijabilnih teških lanaca i (b) vodećeg peptida (na primer, vodeći peptid SEQ ID NO: 10). U određenim aspektima bilo koje od gore navedenih realizacija, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku može da sadrži varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od: (a) bilo kog od gore opisanih varijabilnih lakih lanaca i (b) vodećeg / lider peptida (na primer, vodeći/lider peptid SEQ ID NO: 10).

[0090] U određenim aspektima bilo koje od gore navedenih realizacija, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku je antitelo koje sadrži bilo koji od gore opisanih varijabilnih teških lanaca i bilo koji konstantni domen teškog lanca čoveka. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku je IgG izotipa i sadrži konstantni domen humanog teškog lanca IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku sadrži konstantni domen humanog teškog lanca IgG1, gde konstantni domen IgG1 je afukozilovan.

[0092] U određenim aspektima bilo koje od gore navedenih realizacija, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku može da sadrži bilo koji od gore opisanih varijabilnih lakih lanaca i konstantni domen humanog lakog lanca. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku sadrži konstantni domen ljudskog kapa lakog lanca ili njegovu varijantu, gde varijanta sadrži do 20, 10, 5, 3, 2 ili 1 supstituciju modifikovanih aminokiselina. U drugom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku sadrži konstantni domen humanog lambda lakog lanca ili njegovu varijantu, pri čemu varijanta sadrži do 20, 10, 5, 3, 2 ili 1 supstituciju modifikovanih aminokiselina. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku sadrži konstantni domen humanog kapa lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14.

[0094] U jednom izvođenju, antitelo protiv hRSV F-proteina prema pronalasku sadrži punu tetramernu strukturu koja ima dva laka lanca i dva teška lanca, pri čemu svaki laki lanac sadrži: varijabilni region koji sadrži SEQ ID NO: 8 i konstantni domen humanog kapa lakog lanca (SEQ ID NO: 14); i svaki teški lanac sadrži: varijabilni region koji sadrži SEQ ID NO: 7 i konstantni domen humanog IgG1 (SEQ ID NO: 13).

[0096] [0041] U određenim aspektima bilo koje od gore navedenih realizacija, antitelo protiv F-proteina hRSV (anti-hRSV F-protein antitelo) ili njegov fragment koji vezuje antigen prema ovom pronalasku može biti konjugovano sa najmanje jednim profilaktičkim ili terapeutskim sredstvom. U jednom izvođenju, terapeutsko sredstvo sadrži drugo antitelo ili njegov fragment, imunomodulator, hormon, citotoksično sredstvo, enzim, radionuklid, drugo antitelo konjugovano sa najmanje jednim imunomodulatorom, enzimom, radioaktivnom oznakom, hormonom, antisens oligonukleotidom ili citotoksičnim sredstvom, ili njihovu kombinaciju.

[0098] Pronalazak takođe obezbeđuje izolovane polipeptide koji sadrže aminokiselinske sekvence bilo koje od SEQ ID NO: 1-8, 23 ili 25, ili fragment bilo koje od navedenih sekvenci. U određenim izvođenjima, polipeptidi koji sadrže aminokiselinske sekvence teškog lanca ne sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9.

[0100] Pronalazak takođe obezbeđuje izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koje od antitela protiv F-proteina hRSV (anti-hRSV F-protein antitela) ili fragmenata koji vezuju antigen prema ovom pronalasku. U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od polipeptida SEQ ID NO: 1-8, 23 ili 25, gde navedeni polipeptidi mogu opciono da sadrže vodeću sekvencu. U određenim izvođenjima, polipeptidi koji sadrže aminokiselinske sekvence teškog lanca ne sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. Pronalazak takođe obezbeđuje vektore ekspresije koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koji od polipeptida SEQ ID NO: 1-8, 23 ili 25 (gde navedeni polipeptidi mogu opciono da sadrže vodeću sekvencu). U određenim izvođenjima, polipeptidi koji sadrže aminokiselinske sekvence teškog lanca ne sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. Ove izolovane nukleinske kiseline i vektori ekspresije koji ih sadrže mogu se koristiti za ekspresiju antitela pronalaska ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen u rekombinantnim ćelijama domaćina. Stoga, pronalazak takođe obezbeđuje ćelije domaćina koje sadrže izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od polipeptida SEQ ID NO: 1-8, 23 ili 25 (gde navedeni polipeptidi mogu opciono da sadrže vodeću sekvencu). U određenim izvođenjima, polipeptidi koji sadrže aminokiselinske sekvence teškog lanca ne sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U jednom izvođenju, ćelija domaćin je ćelija jajnika kineskog hrčka. U jednom izvođenju, ćelija domaćin je ćelija kvasca, na primer ćelija Pichia ili ćelija domaćin Pichia pastoris.

[0102] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema ovom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. U jednom izvođenju, farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač je L-histidin. U jednom aspektu ovog izvođenja, antitelo ili fragment koji vezuje antigen je formulisan u 10 mM L-histidinu, 7% (t/z) saharozi i 0,02% (t/z) polisorbatu-80, pH 6,0. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen je tipično prisutan u koncentraciji od oko 100 mg/mL u takvoj formulaciji.

[0103] U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema ovom pronalasku i koje sadrže dodatni profilaktički ili terapeutski agens. U jednom izvođenju, dodatni profilaktički ili terapeutski agens je izabran iz grupe koja se sastoji od: drugog anti-hRSV antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen. U jednom izvođenju, drugo anti-hRSV antitelo ili fragment koji vezuje antigen ovog pronalaska sadrži: (i) hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvenca SEQ ID NO: 2; (iii) hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (iv) hipervarijabilni region CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (v) hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (vi) hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencua SEQ ID NO: 6. U određenim izvođenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0105] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje posudu ili uređaj za injekciju koji sadrži bilo koje od anti-hRSV F-protein antitelo ili fragmenata koji vezuju antigen ovog pronalaska. Antitelo protiv hRSV F-proteina ili fragment koji vezuje antigen prema pronalasku sadrži: (i) hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinska sekvencu SEQ ID NO: 2; (iii) hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (iv) hipervarijabilni region CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (v) hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (vi) hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U određenim ostvarenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U određenim ostvarenjima, teški lanac sadrži, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23, a laki lanac sadrži, ili se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO 25.

[0107] [0047] Pronalazak takođe obezbeđuje metod proizvodnje anti-hRSV F-proteinskog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen prema pronalasku koji obuhvata: kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira teški lanac i/ili laki lanac antitela prema pronalasku (ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen) pod uslovima povoljnim za ekspresiju polinukleotida; i opciono, izolovanje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen iz ćelije domaćina i/ili podloge za kultivaciju. U jednom ostvarenju, polinukleotid koji kodira teški lanac i polinukleotid koji kodira laki lanac su u jednom vektoru. U drugom izvođenju, polinukleotid koji kodira teški lanac i polinukleotid koji kodira laki lanac nalaze se u različitim vektorima. U jednom izvođenju, polinukleotid koji kodira teški lanac i polinukleotid koji kodira laki lanac kodiraju antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži: (i) hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (iii) hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (iv) hipervarijabilni region CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (v) hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; i (vi) hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6. U određenim ostvarenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U određenim ostvarenjima, teški lanac sadrži, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23, a laki lanac sadrži, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25.

[0109] [0048] Pronalazak takođe obezbeđuje metod za prevenciju ili lečenje hRSV infekcije kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine antihRSV F-proteinskog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen prema pronalasku, opciono u kombinaciji sa dodatnim profilaktičkim ili terapeutskim sredstvom ili terapeutskim postupkom. U jednom izvođenju, subjekt koji se leči je ljudski subjekt. U jednom izvođenju, dodatno profilaktičko ili terapeutsko sredstvo je izabrano iz grupe koja se sastoji od: drugog anti-hRSV antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, nukleinske kiseline koja kodira anti-RSV F antitelo ili fragment koji vezuje antigen, ili konjugata antitela. Anti-hRSV F-proteinovo antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema pronalasku obuhvata: (i) hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (iii) hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (iv) hipervarijabilni region CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (v) hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (vi) hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U određenim ostvarenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U određenim ostvarenjima, teški lanac sadrži, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23, a laki lanac sadrži, ili se sastoji od aminokiselinske sekvencea SEQ ID NO: 25.

[0111] Pronalazak takođe obezbeđuje metod za prevenciju ili lečenje hRSV infekcije kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje subjektu efikasne količine anti-RSV F-protein antitela ili fragmenta koji vezuje antigen pronalaska, opciono u kombinaciji sa dodatnim profilaktičkim ili terapeutskim sredstvom ili terapeutskim postupkom. Antitelo protiv hRSV F-proteina ili fragment koji vezuje antigen prema pronalasku sadrži: (i) hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (iii) hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (iv) hipervarijabilni region CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (v) hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (vi) hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U određenim ostvarenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U određenim ostvarenjima, teški lanac sadrži, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23, a laki lanac sadrži, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO 25.

[0113] Pronalazak takođe obezbeđuje vakcinu, ili imunogenu kompoziciju, koja sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen pronalaska. Antitelo protiv hRSV F-proteina ili fragment koji vezuje antigen pronalaska sadrži: (i) hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (iii) hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (iv) hipervarijabilni region CDR1 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (v) hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (vi) hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U određenim ostvarenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U određenim ostvarenjima, teški lanac obuhvata, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23, a laki lanac obuhvata, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25.

[0115] U jednom izvođenju, vakcina ili imunogena kompozicija dalje sadrži antigen izabran od RSV F proteina i RSV G proteina i njihovih fragmenata.

[0116] Pronalazak takođe obezbeđuje metod za detekciju prisustva RSV u uzorku (detekcijom F proteina ili njegovog fragmenta) koji obuhvata kontaktiranje uzorka sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen prema pronalasku i detekciju prisustva kompleksa između antitela ili fragmenta i peptida; pri čemu detekcija kompleksa ukazuje na prisustvo RSV F proteina. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema pronalasku obuhvata: (i) hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (iii) hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinskua sekvencu SEQ ID NO: 3; (iv) hipervarijabilni region CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (v) hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (vi) hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U određenim ostvarenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. U određenim ostvarenjima, teški lanac sadrži, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23, a laki lanac sadrži, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25.

[0118] Ovaj opis takođe obezbeđuje metod povećanja anti-hRSV aktivnosti anti-hRSV F-protein antitela koji obuhvata: dobijanje roditeljskog anti-hRSV F-protein antitela i povećanje efektorske funkcije roditeljskog anti-hRSV F-protein antitela; pri čemu je aktivnost rezultujućeg anti-hRSV F-protein antitela povećana u poređenju sa roditeljskim anti-hRSV F-protein antitelom. Kako se ovde koristi, „roditeljsko anti-antitelo“ odnosi se na antitelo koje ima Fc region divljeg tipa i/ili glikozilaciju divljeg tipa (tj. obrazac glikozilacije koji je rezultat ekspresije polipeptida u nemodifikovanoj ćeliji domaćina sisara). Efektorska funkcija roditeljskog antitela može se povećati mutacijom njegovog Fc regiona ili promenom njegove glikozilacije, na primer, čineći antitelo afukozilovanim (kao što je detaljnije objašnjeno u nastavku). U jednom izvođenju, efektorska funkcija roditeljskog anti-hRSV F-protein antitela se povećava mutacijama u Fc regionu roditeljskog anti-hRSV F-protein antitela. U drugom izvođenju, efektorska funkcija roditeljskog anti-hRSV F-protein antitela se povećava uklanjanjem ostataka fukoze iz antitela ili ekspresijom antitela u ćeliji domaćinu koja je genetski modifikovana da bi se uklonila aktivnost enzima koji dodaje fukozu glikoproteinima.

[0120] KRATAK OPIS SLIKA

[0122]

[0123] Slike 1A-B prikazuju krive vezivanja (iz ELISA testa) ljudskih RSV antitela D25, palivizumba i RB1 za ljudske RSV-F pre (A) i post (B) fuzione proteine.

[0125] Slike 2A-B prikazuju krive neutralizacije za ljudska RSV antitela u RSV A Long soju (A) i RSV B Washington soju (B).

[0127] Slike 3A-B prikazuju mapiranje epitopa RB1 skenirajućom mutagenezom alanina Fusion F proteina (A) i ostatke mapirane epitopom na Pre-Fusion F kristalnoj strukturi (B).

[0129] Slike 4A-D prikazuju efikasnost RB1 u poređenju sa D25 u plućima na modelu izazivanja RSV A kod Cotton pacova, u odnosu na koncentracije antitela (A) i RSV B, u odnosu na koncentracije antitela (B) ili virusnih čestica (PFU/g) prisutnih u tkivima, u odnosu na dozu antitela za RSV A izazivanja (C) i RSV B izazivanja (D).

[0131] Slike 5A-D prikazuju efikasnost RB1 u poređenju sa D25 u nosu na modelu izazivanja RSV A kod Cotton pacova, u odnosu na koncentracije antitela (A) i RSV B, u odnosu na koncentracije antitela (B) ili virusnih čestica (PFU/g) prisutnih u tkivima, u odnosu na dozu antitela za RSV A izazivanja (C) i RSV B v izazivanja (D).

[0133] Slika 6 prikazuje krivu vezivanja (iz ELISA testa) ljudskog RSV antitela RB1+YTE za F protein ljudskog RSV A.

[0135] Slika 7 prikazuje farmakokinetička svojstva kod rezusa RB1-YTE (RB1+YTE) u odnosu na Motavizumab koji ima YTE skup mutacija.

[0137] DETALJAN OPIS

[0139] Skraćenice

[0141] Kroz detaljan opis i primere pronalaska koristiće se sledeće skraćenice:

[0144]

[0145] ELISA Enzimski povezani imunosorbentni test

[0148]

[0150] Kabat Sistem poravnanja i numeracije imunoglobulina koji

[0151] inicalno osmislio Elvin A. Kabat ((1991) Sequences of

[0152] Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health

[0153] Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.

[0156]

[0158] V region Segment IgG lanaca koji je varijabilan u sekvenci između

[0159] različitih antitela. Prostire se do Kabat ostatka 109 u

[0160] lakom lancu i 113 u teškom lancu

[0162] Varijabilni region teškog lanca imunoglobulina

[0165]

Varijabilni region kapa lakog lanca imunoglobuli

[0167] Definicije

[0169] Radi lakšeg razumevanja pronalaska, određeni tehnički i naučni termini su posebno definisani u nastavku. Osim ako nisu posebno definisani na drugom mestu u ovom dokumentu, svi ostali tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju značenje koje obično razume stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada.

[0170] Kako se ovde koristi, uključujući priložene zahteve, jednina reči kao što su „jedan“, „jedan“ i „dati“, uključuje njihove odgovarajuće reference u množini, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0172] „Primena/administracija“ i „tretman“, kako se primenjuje na životinju, čoveka, eksperimentalni subjekt, ćeliju, tkivo, organ ili biološku tečnost, odnosi se na kontakt egzogenog farmaceutskog, terapeutskog, dijagnostičkog sredstva ili kompozicije sa životinjom, čovekom, subjektom, ćelijom, tkivom, organom ili biološkom tečnošću. Tretman ćelije obuhvata kontakt reagensa sa ćelijom, kao i kontakt reagensa sa tečnošću, gde je tečnost u kontaktu sa ćelijom. „Primena/administracija“ i „lečenje“ takođe označavaju in vitro i eks vivo tretmane, npr. ćelije, reagensom, dijagnostičkim sredstvom, jedinjenjem za vezivanje ili drugom ćelijom.

[0174] „RSV bolest“ označava bolest uzrokovanu infekcijom RSV, uključujući upalu pluća i bronhiolitis.

[0176] „Lečiti“ ili „lečenje/tretiranje“ znači primeniti terapeutsko sredstvo, kao što je kompozicija koja sadrži bilo koje od antitela ili fragmenata koji vezuju antigen ovog pronalaska, interno ili eksterno subjektu ili pacijentu koji ima jedan ili više simptoma bolesti, ili za koga se sumnja da ima bolest, za koju sredstvo ima terapeutsku aktivnost. Tipično, sredstvo se administrira u količini koja je efikasna za ublažavanje jednog ili više simptoma bolesti kod tretiranog subjekta ili populacije, bilo indukovanjem regresije ili inhibiranjem progresije takvog(ih) simptoma(a) u bilo kom klinički merljivom stepenu. Količina terapeutskog sredstva koja je efikasna za ublažavanje bilo kog određenog simptoma bolesti može varirati u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost i težina pacijenta, kao i sposobnost leka da izazove željeni odgovor kod subjekta. Da li je simptom bolesti ublažen može se proceniti bilo kojim kliničkim merenjem koje obično koriste lekari ili drugi stručni zdravstveni radnici za procenu težine ili statusa progresije tog simptoma. Lečenje antitelima protiv RSV može se kombinovati i sa drugim intervencijama (antitela, nukleinske kiseline, vakcine i jedinjenja malih molekula) za lečenje drugih respiratornih patogena.

[0178] [0061] „Sprečiti/sprečavanje“ ili „prevencija“ znači primeniti profilaktičko sredstvo, kao što je kompozicija koja sadrži bilo koje od antitela ili fragmenata koji vezuju antigen ovog pronalaska, interno ili eksterno subjektu ili pacijentu koji je u riziku od infekcije hRSV-om, za koje sredstvo ima profilaktičko dejstvo. Prevencija uključuje smanjenje verovatnoće ili težine naknadne RSV infekcije, ublažavanje simptoma povezanih sa infekcijom donjih disajnih puteva (LRI) nakon RSV infekcije i indukovanje imuniteta radi zaštite od RSV infekcije. Tipično, sredstvo se primenjuje u količini koja je efikasna da neutrališe RSV u plućima i/ili nosu kako bi se blokirala infekcija. Količina profilaktičkog sredstva koja je efikasna da ublaži bilo koji određeni simptom bolesti može da varira u zavisnosti od faktora kao što su starost i težina pacijenta, kao i sposobnost sredstva da izazove željeni odgovor kod subjekta. Da li je simptom bolesti ublažen može se proceniti bilo kojim kliničkim merenjem koje obično koriste lekari ili drugi stručni zdravstveni radnici za procenu težine ili statusa progresije tog simptoma ili će u određenim slučajevima ublažiti potrebu za hospitalizacijom.

[0180] hRSV F protein

[0182] Humani RSV F protein se sintetiše kao metastabilni trimerni prekursor (F0) koji se proteolitički cepa na kovalentno povezane F1 i F2 podjedinice. Atomske strukture F trimera u prefuzijskom obliku su određene za PIV5 i RSV članove porodice paramyxoviridae. Videti McLellan et al., 2011, J Virol. 85:7788-7796 (RSV) i Welch et al., 2012, Proc Natl Acad Sci 109:16672-16677 (PIV). Prefuzijski F ima kratak C-terminalni citoplazmatski rep, jedan transmembranski domen, helikalnu stabljiku i globularni domen glave. Atomske strukture NDV, hPIV3 i RSV F u postfuzijskom obliku otkrivaju da se dešava veliki događaj ponovnog savijanja/sklapanja koji pretvara prefuzijski F u postfuzijski F, pri čemu se deo globularnog domena glave preuređuje i formira snop od šest spirala. Ove strukture, zajedno sa podacima o inhibiciji peptida, sugerišu model za membransku fuziju posredovanu F gde se, nakon aktivacije, F1/F2 preuređuje da bi umetnuo hidrofobni fuzioni peptid sa N-terminusa F1 u membranu ciljne ćelije, formirajući intermedijer u obliku pre-ukosnice. Ova relativno produžena struktura vezuje virus za ćelijsku membranu i kolabira da bi formirala stabilan snop od šest spirala postfuzione strukture. Prelazak iz metastabilne prefuzije, u intermedijer u obliku pre-ukosnice , u postfuzionu konformaciju odvija se niz energetski gradijent, pri čemu postfuzijski oblik predstavlja najstabilnije stanje, a energija oslobođena tokom refoldinga F je povezana sa membranskom fuzijom.

[0184] Termin hRSV F protein obuhvata ljudski RSV F protein, kao i njegove fragmente, kao što je njegov zreli fragment kome nedostaje signalni peptid. U jednom izvođenju pronalaska, aminokiselinska sekvenca F proteina ljudskog RSV-a obuhvata aminokiselinska sekvenca otkrivena u Genbank pristupnom broju AAR14266 (hRSV B soj 9320).

[0186] Anti-hRSV antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen

[0187] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen koji vezuju F protein ljudskog RSV, poželjno iz oba sojeva RSV-a A i B, koji vezuju i F protein pre fuzije i F protein posle fuzije, i upotrebu takvih antitela ili fragmenata. U nekim izvođenima izolovana su anti-RSV F-protein antitela. Antitela opisana ovde vezuju se za epitop na mestu IV proteina F. U bilo kom od ovde opisanih izvođenja pronalaska, u određenim realizacijama, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 i/ili laki lanac ili varijabilni region lakog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8. U određenim realizacijama, teški lanac sadrži, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23, a laki lanac sadrži, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25.

[0189] U preferiranim ostvarenjima, antitela protiv F-proteina RSV su potpuno humana odnosno čovečja. Glavna prednost monoklonskih antitela ovog pronalaska proizilazi iz činjenice da uključuju humane CDR3 sekvence i, u nekim ostvarenjima, mogu biti potpuno ljudska monoklonska antitela. Stoga, in vivo upotreba potpuno ljudskih monoklonskih antitela ovog pronalaska za imunoprofilaksiju i imunoterapiju RSV bolesti značajno smanjuje problem imunog odgovora domaćina na pasivno primenjena antitela. Ovaj problem se često javlja kada se koriste monoklonska antitela ksenogenog ili himernog porekla iz prethodne tehnike. Drugi važan aspekt ove prednosti je potencijalna bezbednost ovih ljudskih monoklonskih antitela za primene genske terapije, u kojima se ne može prekinuti ekspresija ksenogenih ili himernih proteina koji sadrže sekvence koje ne potiču od čoveka.

[0191] Kako se ovde koristi, antitelo protiv F-proteina RSV ili njegov antigen-vezujući fragment odnosi se na antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za ljudski RSV F protein. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen i koji se „specifično vezuje za ljudski/humani RSV“ je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za prefuzijski ili postfuzijski ljudski RSV F protein sa Kd od oko 1 nM ili većim afinitetom (npr.

[0192] 1 nM-2 pM, 1 nM, 100 pM, 10 pM ili 2 pM), ali se ne vezuje za druge proteine kojima nedostaju RSV F proteinske sekvence. U jednom izvođenju, antitelo ovog pronalaska koje se specifično vezuje za humani RSV F protein je takođe unakrsno reaktivno sa goveđim RSV F proteinom. Kako se ovde koristi, „unakrsna reaktivnost“ se odnosi na sposobnost antitela da reaguje sa homolognim proteinom iz drugih vrsta. Da li se antitelo specifično vezuje za ljudski RSV F protein može se utvrditi korišćenjem bilo kog testa poznatog u struci. Primeri testova poznatih u struci za određivanje afiniteta vezivanja uključuju površinsku plazmonsku rezonancu (npr. BIACORE) ili sličnu tehniku (npr. KinExa ili OCTET).

[0193] Predmetni pronalazak obuhvata antitela protiv hRSV F-proteina i metode njihove upotrebe. Kako se ovde koristi, termin „antitelo“ odnosi se na bilo koji oblik antitela koji pokazuje željenu biološku aktivnost. Stoga se koristi u najširem smislu i posebno obuhvata, ali nije ograničen na, monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine koja sadrže dva laka lanca i dva teška lanca), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela), humanizovana antitela, potpuno ljudska antitela i himerna antitela.

[0195] Predmetni pronalazak obuhvata fragmente antitela protiv hRSV F-proteina koji vezuju antigen i metode njihove upotrebe. Kako se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, „fragment antitela“ ili „fragment koji vezuje antigen“ odnosi se na fragmente antitela koji vezuju antigen, tj. fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen koji je vezan antitelom pune dužine, npr. fragmente koji zadržavaju jedan ili više CDR regiona. Primeri fragmenata koji vezuju antigen uključuju, ali nisu ograničeni na Fab, Fab', F(ab')<2>i Fv fragmente; diatela; linearna antitela; molekuli antitela sa jednim lancem, npr. sc-Fv; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0197] Predmet ovog pronalaska su Fab fragmenti F-proteina protiv RSV-a i metode njihove upotrebe. „Fab fragment“ se sastoji od jednog lakog lanca i C<H>1 i varijabilnih regiona jednog teškog lanca. Teški lanac Fab molekula ne može da formira disulfidnu vezu sa drugim molekulom teškog lanca. „Fab fragment“ može biti proizvod cepanja antitela papainom.

[0199] Predmetni pronalazak obuhvata anti-RSV F-proteinska antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, a koji obuhvataju Fc region, i metode njihove upotrebe. „Fc“ region sadrži dva fragmenta teškog lanca koji obuhvataju C<H>1 i C<H>2 domene antitela. Dva fragmenta teškog lanca su zajedno povezana sa dve ili više disulfidnih veza i hidrofobnim interakcijama C<H>3 domena.

[0201] Predmetni pronalazak obuhvata Fab' fragmente anti-RSV F-proteina i metode njihove upotrebe. „Fab' fragment“ sadrži jedan laki lanac i deo ili fragment jednog teškog lanca koji sadrži VH domen i C<H>1 domen, a takođe i region između C<H>1 i C<H>2 domena, tako da se može formirati međulančana disulfidna veza između dva teška lanca dva Fab' fragmenta da bi se formirao molekul F(ab')<2>.

[0203] [0072] Predmetni pronalazak obuhvata F(ab')<2>fragmente anti-RSV F-proteina i metode njihove upotrebe. „ F(ab')<2>fragment“ sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koji sadrže deo konstantnog regiona između C<H1>i C<H2>domena, tako da se između dva teška lanca formira međulančana disulfidna veza. F(ab')<2>fragment je stoga sastavljen od dva Fab' fragmenta koji su povezani disulfidnom vezom između dva teška lanca. „ F(ab')<2>fragment“ može biti proizvod cepanja antitela pepsinom.

[0205] Predmetni pronalazak obuhvata Fv fragmente anti-RSV F-proteina i metode njihove upotrebe. „Fv region“ obuhvata varijabilne regione i teškog i lakog lanca, ali mu nedostaju konstantni regioni.

[0207] Predmetni pronalazak obuhvata scFv fragmente anti-RSV F-proteina i metode njihove upotrebe. Termin „jednolančani Fv“ ili „scFv“ antitelo odnosi se na fragmente antitela koji obuhvataju V<H>i V<L>domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između V<H>i V<L>domena koji omogućava scFv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled scFv, videti Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTITILOS, vol. 113, Rosenburg i Moore eds. Springer-Verlag, New York, str. 269-315. Videti takođe, publikaciju međunarodnu patentne prijave br. WO 88/01649 i U.S. Pat. Nos.4,946,778 i 5,260,203.

[0209] Predmet ovog pronalaska su antitela sa F-proteinskim domenom protiv RSV i metode njihove upotrebe. „Domensko antitelo“ je imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment koji sadrži samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više V<H>regiona su kovalentno spojena sa peptidnim linkerom da bi se stvorilo bivalentno domensko antitelo. Dva V<H>regiona dvovalentnog domena antitela mogu ciljati iste ili različite antigene.

[0211] Predmet ovog pronalaska su dvovalentna antitela protiv F-proteina RSV-a i metode njihove upotrebe. „Bivalentno antitelo“ sadrži dva mesta za vezivanje antigena. U nekim slučajevima, dva mesta za vezivanje imaju iste antigenske specifičnosti. Međutim, bivalentna antitela mogu biti bispecifična (videti niže).

[0213] [0077] Predmetni pronalazak obuhvata anti-RSV F-proteinska diatela i metode njihove upotrebe. Kako se ovde koristi, termin „diatela“ odnosi se na male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, pri čemu fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (V<H>) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (V<L>) u istom polipeptidnom lancu (V<H>-V<L>ili V<L>-V<H>). Korišćenjem linkera koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su primorani da se upare sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvore dva mesta za vezivanje antigena. Diatela su detaljnije opisana u, npr., EP 404,097; WO 93/11161; i Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Za pregled genetski modifikovanih varijanti antitela videti Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol.

[0214] 23:1126-1136.

[0216] Tipično, antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema ovom pronalasku, koji je na neki način modifikovan, zadržava najmanje 10% svoje aktivnosti vezivanja (u poređenju sa roditeljskim antitelom) kada se ta aktivnost izražava na molarnoj osnovi. Poželjno je da antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema ovom pronalasku zadržava najmanje 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 100% ili više afiniteta vezivanja za RSV F-protein kao roditeljsko antitelo. Takođe je namenjeno da antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema ovom pronalasku može da sadrži konzervativne ili nekonzervativne supstitucije aminokiselina (koje se nazivaju „konzervativne varijante“ ili „varijante sa očuvanom funkcijom“ antitela) koje značajno ne menjaju njegovu biološku aktivnost.

[0218] Predmet ovog pronalaska je izolovana anti-hRSV F-protein antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen i metode njihove upotrebe. „Izolovana“ antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigene su barem delimično slobodni od drugih bioloških molekula iz ćelija ili ćelijskih kultura u kojima se proizvode. Takvi biološki molekuli uključuju nukleinske kiseline, proteine, lipide, ugljene hidrate ili drugi materijal kao što su ćelijski ostaci i medijum za rast. Izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigene može dalje biti barem delimično slobodan od komponenti ekspresionog sistema kao što su biološki molekuli iz ćelije domaćina ili iz njenog medijuma za rast. Generalno, termin „izolovan“ nije namenjen da se odnosi na potpuno odsustvo takvih bioloških molekula ili na odsustvo vode, pufera ili soli ili na komponente farmaceutske formulacije koja uključuje antitela ili fragmente.

[0220] [0080] Predmet ovog pronalaska je monoklonska anti-hRSV F-proteinska antitela i njihove fragmente koji vezuju antigene, kao i kompozicije monoklonskih antitela koje sadrže više izolovanih monoklonskih antitela. Termin „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na populaciju suštinski homogenih antitela, tj. molekuli antitela koji čine populaciju su identični u aminokiselinskoj sekvenci, osim mogućih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Nasuprot tome, konvencionalni (poliklonski) preparati antitela obično uključuju mnoštvo različitih antitela koja imaju različite aminokiselinske sekvence u svojim varijabilnim domenima, posebno njihovim CDR-ovima koji su često specifični za različite epitope. Modifikator „monoklonski“ ukazuje na karakter antitela kao dobijenog iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojom posebnom metodom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom mogu se napraviti metodama rekombinantne DNK (videti, npr., US Pat. br.

[0221] 4,816,567).

[0223] Generalno, osnovna (ili „pune dužine“) strukturna jedinica antitela obuhvata tetramer. Svaki tetramer uključuje dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan „laki“ (oko 25 kDa) i jedan „teški“ lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region ili domen od oko 100 do 110 ili više aminokiselina prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo teškog lanca može definisati konstantni region ili domen prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju. Tipično, ljudski laki lanci se klasifikuju kao kapa i lambda laki lanci. Štaviše, ljudski teški lanci se tipično klasifikuju kao mu, delta, gama, alfa ili epsilon i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, respektivno. Unutar lakih i teških lanaca, varijabilni i konstantni regioni su spojeni „J“ regionom od oko 12 ili više aminokiselina, pri čemu teški lanac takođe uključuje „D“ region od oko 10 dodatnih aminokiselina. Videti generalno, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989). U kontekstu antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, termini domen i region mogu se koristiti naizmenično, gde je to prikladno.

[0225] Varijabilni regioni svakog para lakog/teškog lanca formiraju mesto vezivanja antitela. Dakle, generalno, intaktno antitelo ima dva mesta vezivanja. Osim kod bifunkcionalnih ili bispecifičnih antitela, dva mesta vezivanja su, generalno, ista.

[0227] Tipično, varijabilni domeni i teškog i lakog lanca obuhvataju tri hipervarijabilna regiona, takođe nazvana regioni koji određuju komplementarnost (CDR), koji se nalaze unutar relativno konzerviranih ookvira regiona (FR). CDR su obično poravnati okvirnim regionima, omogućavajući vezivanje za specifični epitop. Generalno, od N-terminala do C-terminala, varijabilni domeni i lakih i teških lanaca obuhvataju FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu je, generalno, u skladu sa Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat, 1978, Adv. Prot. Chem.32:1-75; Kabat, et al., 1977, J. Biol. Chem.252:6609-6616; Chothia et al., 1987, J Mol. Biol.196:901-917 or Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883.

[0229] [0084] Kako se ovde koristi, termin „hipervarijabilni region“ odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, a koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region obuhvata aminokiselinske ostatke iz „regiona koji određuje komplementarnost“ ili „CDR“ (tj. CDRL1, CDRL2 i CDRL3 u varijabilnom domenu lakog lanca i CDRH1, CDRH2 i CDRH3 u varijabilnom domenu teškog lanca). Videti Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (definisanje CDR regiona antitela pomoću sekvence); videti takođe Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196: 901-917 (definisanje CDR regiona antitela pomoću strukture). Kako se ovde koristi, termin „okvir/okvirni“ ili „FR“ ostaci odnose se na one ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona definisani ovde kao CDR ostaci.

[0231] „Izolovani molekul nukleinske kiseline“ ili „izolovani polinukleotid“ označava DNK ili RNK genomskog, mRNA, cDNA ili sintetičkog porekla ili neku njihovu kombinaciju koja nije povezana sa celim ili delom polinukleotida u kome Izolovani polinukleotid se nalazi u prirodi ili je povezan sa polinukleotidom sa kojim nije povezan u prirodi. Za potrebe ovog pronalaska, treba razumeti da „molekul nukleinske kiseline koji sadrži“ određenu nukleotidnu sekvencu ne obuhvata intaktne hromozome. Izolovani molekuli nukleinske kiseline koji „sadrže“ određene sekvence nukleinskih kiselina mogu uključivati, pored određene sekvence, kodirajuće sekvence za do deset ili čak do dvadeset ili više drugih proteina ili njihovih delova ili fragmenata, ili mogu uključivati operativno povezane regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju kodirajućeg regiona navedenih sekvenci nukleinskih kiselina, i/ili mogu uključivati vektorske sekvence.

[0233] Fraza „kontrolne sekvence“ odnosi se na DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćinu. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotor, opciono operatorsku sekvencu i mesto vezivanja ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotere, signale poliadenilacije i pojačivače.

[0235] [0087] Nukleinska kiselina ili polinukleotid je „operativno povezan“ kada se postavi u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za presekuencu ili sekretorni lider je operativno povezana sa DNK za polipeptid ako je ekspresovana kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da olakšava translaciju. Generalno, ali ne uvek, „operativno povezano“ znači da su DNK sekvence koje se povezuju susedne, a u slučaju sekretornog lidera, susedne i u fazi čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti susedni jedan drugom. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri se koriste u skladu sa uobičajenom praksom.

[0237] Kako se ovde koriste, izrazi „ćelija“, „ćelijska linija“ i „ćelijska kultura“ koriste se naizmenično i sve takve oznake uključuju potomstvo. Stoga, reči „transformanti“ i „transformisane ćelije“ uključuju primarnu ćeliju o kojoj se radi i kulture izvedene iz nje, bez obzira na broj transfera. Takođe se razume da neće svi potomci imati potpuno identičan sadržaj DNK, zbog namernih ili nenamernih mutacija. Uključeni su mutantni potomci koji imaju istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano u originalno transformisanoj ćeliji. Tamo gde su namenjene različite oznake, to će biti jasno iz konteksta.

[0239] Kako se ovde koristi, „ germinativna sekvenca“ odnosi se na sekvencu nepreuređenih DNK sekvenci imunoglobulina. Može se koristiti bilo koji pogodan izvor nepreuređenih sekvenci imunoglobulina. Ljudske sekvence germinativne linije mogu se dobiti, na primer, iz JOINSOLVER baza podataka germinativne linije na veb stranici National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the United States National Institutes of Health.. Mišje germinativne sekvence mogu se dobiti, na primer, kao što je opisano u Giudicelli et al., 2005, Nucleic Acids Res. 33:D256-D261.

[0241] Fizičke i funkcionalne osobine anti-RSV antitela F-proteina dati kao primer

[0243] Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-hRSV F-proteinska antitela i njihove antigenvezujuće fragmente koji imaju specifične strukturne i funkcionalne karakteristike, kao i metode upotrebe antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata u lečenju ili prevenciji bolesti/stanja povezanih sa RSV infekcijom.

[0245] „Anti-RSV antitelo F-proteina/anti-RSV F-protein antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen“ uključuje: bilo koje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji je ovde razmatran (npr. RB1) ili njegovu varijantu (npr. varijantu sekvence ili funkcionalnu varijantu); bilo koje antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži jedan ili više CDR-ova navedenih u Tabeli 7; bilo koje antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za isti epitop u ljudskom RSV F-proteinu kao i antitela o kojima se ovde razmatra (npr. RB1); i bilo koje antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji unakrsno blokira (delimično ili potpuno) ili je unakrsno blokiran (delimično ili potpuno) antitelom koje se ovde razmatra (npr. RB1) za vezivanje za RSV.

[0246] Unakrsno blokirajuća antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene mogu se identifikovati na osnovu njihove sposobnosti da se unakrsno takmiče sa antitelom ovog pronalaska u standardnim testovima vezivanja (npr. BIACore, ELISA, protočna citometrija). Na primer, mogu se koristiti standardni ELISA testovi u kojima se rekombinantni RSV F protein imobilizuje na ploči, jedno od antitela je fluorescentno obeleženo i procenjuje se sposobnost neobeleženih antitela da se takmiče sa vezivanjem obeleženog antitela. Dodatno ili alternativno, BIAcore analiza može se koristiti za procenu sposobnosti antitela da se unakrsno takmiče. Sposobnost test antitela da inhibira vezivanje drugog antitela (na primer, antitela D25) za RSV F-protein pokazuje da se test antitelo može takmičiti sa drugim antitelom (npr. D25) za vezivanje za RSV F protein i stoga se, u nekim slučajevima, može vezati za isti epitop na RSV F proteinu kao i antitelo D25 za preklapajući epitop.

[0248] Kao što je gore navedeno, takođe su otkrivena antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za isti epitop kao bilo koje od anti-RSV F-proteinskih antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen ovog pronalaska. Postoji nekoliko metoda dostupnih za mapiranje epitopa antitela na ciljnim antigenima, uključujući: H/D-Ex masenu spektroskopiju, rendgensku kristalografiju, pepskan analizu i mutagenezu usmerenu na mesto. Na primer, HDX (razmena vodonik-deuterijum) uparena sa proteolizom i masenom spektrometrijom može se koristiti za određivanje epitopa antitela na specifičnom antigenu Y. HDX-MS se oslanja na precizno merenje i poređenje stepena ugradnje deuterijuma od strane antigena kada se inkubira u D<2>O samostalno i u prisustvu njegovog antitela u različitim vremenskim intervalima. Deuterijum se razmenjuje vodonikom na amidnom skeletu proteina u izloženim delovima, dok će regioni antigena vezanog za antitelo biti zaštićeni i pokazaće manju ili nikakvu razmenu nakon analize proteolitičkih fragmenata pomoću LC-MS/MS.

[0250] Primeri imunoglobulinskih lanaca anti-RSV F-proteinskih antitela, kao i njihovih CDRs, uključuju, ali nisu ograničeni na one opisane u Tabeli 7 (SEQ ID NOs: 1-8, 23 i 25). Ovo otkriće obuhvata bilo koji polipeptid koji sadrži, sastoji se u suštini od ili se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 1-8, 23 i 25, i rekombinantne nukleotide koji kodiraju ovde polipeptide.

[0252] [0095] Obim ovog pronalaska obuhvata izolovana anti-hRSV F-protein antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji obuhvataju varijantu imunoglobulinskog lanca navedenog ovde, npr. bilo koju od SEQ ID NOs: 7, 8; pri čemu varijanta pokazuje jedno ili više sledećih svojstava: (i) vezuje se za prefuzioni F protein ljudskog RSV-a sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹² M, što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET); ili (ii) vezuje se za postfuzioni F protein ljudskog RSV-a sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹¹ M, što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U određenim ostvarenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0254] U određenim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigene koji se vezuju za ljudski hRSV F-protein i imaju V<L>domene i V<H>domene sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 8 (VL) i 7 (VH); gde varijanta pokazuje željeno vezivanje i svojstva, npr., (i) vezuje se za ljudski RSV prefuzioni F protein sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹² M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET); ili (ii) vezuje se za postfuzioni F protein ljudskog RSV-a sa Kd vrednošću od oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹¹ M, što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U određenim ostvarenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0256] „Konzervativno modifikovane varijante“ ili „konzervativna supstitucija“ odnosi se na supstitucije aminokiselina u proteinu drugim aminokiselinama koje imaju slične karakteristike (npr. naelektrisanje, veličina bočnog lanca, hidrofobnost/hidrofilnost, konformacija i krutost kičme, itd.), tako da se promene često mogu izvršiti bez promene biološke aktivnosti proteina. Stručnjaci u ovoj oblasti prepoznaju da, generalno, supstitucije pojedinačnih aminokiselina u neesencijalnim regionima polipeptida ne menjaju značajno biološku aktivnost (videti, npr., Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.

[0257] 224 (4th Ed.)). Pored toga, supstitucije strukturno ili funkcionalno sličnih aminokiselina manje je verovatno da će poremetiti biološku aktivnost. Primeri konzervativnih supstitucija navedeni su u Tabeli 1.

[0259] TABELA 1. Primeri konzervativnih supstitucija aminokiselina

[0260]

[0261]

[0264] Takođe su otkrivene funkcionalno konzervativne varijante antitela ovog pronalaska.

[0266] „Funkcionalno konzervativne varijante“, kako se ovde koristi, odnose se na antitela ili fragmente u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka promenjen bez promene željenog svojstva, kao što je afinitet i/ili specifičnost antigena. Takve varijante uključuju, ali nisu ograničene na, zamenu aminokiseline onom koja ima slična svojstva, kao što su konzervativne supstitucije aminokiselina iz Tabele 1. Takođe su obezbeđeni izolovani polipeptidi koji sadrže VL domene anti-hRSV F-proteinskih antitela pronalaska (npr. SEQ ID NO: 8), i izolovani polipeptidi koji sadrže VH domene (npr. SEQ ID NO: 7) anti-hRSV antitela pronalaska koji imaju do 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili više supstitucija aminokiselina, koje se mogu javiti isključivo u okvirnom regionu ili od kojih jedna ili više mogu biti lociran u jednom ili više CDR-ova. U određenim ostvarenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0268] U drugom ostvarenju, obezbeđeno je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za hRSV F-protein i ima V<L>domene i V<H>domene sa najmanje 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% ili 75% identiteta sekvence sa jednim ili više VL domena ili VH domena opisanih ovde, i pokazuje specifično vezivanje za hRSV F-protein. U drugom izvođenju, vezujuće antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ovog pronalaska sadrži VL i VH domene (sa i bez signalne sekvence) koji imaju do 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili više aminokiselinskih supstitucija, koje se mogu javiti isključivo u okvirnom regionu ili od kojih se jedna ili više mogu nalaziti u jednom ili više CDRs, i pokazuju specifično vezivanje za hRSV F-protein. U određenim izvođenjima, teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0270] Polinukleotidi i polipeptidi

[0271] Predmetni pronalazak dalje obuhvata polinukleotide koji kodiraju bilo koji od polipeptida ili imunoglobulinskih lanaca anti-hRSV F-proteinskih antitela i njihovih fragmenata koji vezuju antigen prema ovom pronalasku. U jednom izvođenju, izolovani polinukleotid kodira antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži najmanje jedan varijabilni domen lakog lanca (V<L>) zrelog imunoglobulina prema ovom pronalasku i/ili najmanje jedan varijabilni domen teškog lanca (V<H>) zrelog imunoglobulina prema ovom pronalasku. U nekim izvođenjima, izolovani polinukleotid kodira i laki lanac i teški lanac na jednom molekulu polinukleotida, a u drugim izvođenjima, laki i teški lanci su kodirani na odvojenim molekulima polinukleotida. U drugom izvođenju, polinukleotidi dalje kodiraju signalnu sekvencu. Na primer, ovaj pronalazak uključuje polinukleotide koji kodiraju aminokiseline opisane u SEQ ID NO: 1-8, 23 i 25, kao i polinukleotide koji se hibridizuju sa njima, a takođe i bilo koji polipeptid kodiran takvim hibridizujućim polinukleotidom. U jednom izvođenju, pronalazak obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja obuhvata, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od SEQ ID NO: 15 (varijabilni teški lanac) ili SEQ ID NO: 16 (varijabilni laki lanac). U određenim izvođenjima, optimizacija kodona može se koristiti za poboljšanje svojstva nukleinske kiseline, npr. ekspresije u određenom domaćinu. U jednom izvođenju, pronalazak obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja obuhvata, ili se sastoji od SEQ ID NO: 17 (kodon optimizovana varijabilna teška lanac) ili SEQ ID NO: 18 (kodon optimizovana varijabilna laka lanac). U određenim izvođenjima, može se koristiti liderska sekvenca. U jednom izvođenju, pronalazak obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja obuhvata, ili se sastoji od SEQ ID NO: 19 (lider sekvenca i teški lanac) ili SEQ ID NO: 20 (liderska sekvenca i laki lanac) povezanih sa teškim ili lakim lancem da bi se dobio SEQ ID NO: 21 ili SEQ ID NO: 22, respektivno.

[0273] [0102] Generalno, polinukleotidi hibridizuju pod uslovima niske, umerene ili visoke strogosti gajenja i kodiraju antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigene, a koji održavaju sposobnost vezivanja za hRSV F-protein. Prvi molekul polinukleotida „ koji se može hibridizirati /hibridizabilan“ sa drugim molekulom polinukleotida kada jednolančani oblik prvog molekula polinukleotida može da se spoji sa drugim molekulom polinukleotida pod odgovarajućim uslovima temperature i jonske jačine rastvora (videti Sambrook, et al., supra). Uslovi temperature i jonske jačine određuju „strogost“ uslova hibridizacije. Tipični uslovi hibridizacije niske strogosti uključuju 55°C, 5X SSC, 0,1% SDS i bez formamida; ili 30% formamida, 5X SSC, 0,5% SDS na 42°C. Tipični uslovi hibridizacije umerene strogosti su 40% formamid, sa 5X ili 6X SSC i 0,1% SDS na 42°C. Uslovi hibridizacije visoke stogosti su 50% formamid, 5X ili 6X SSC na 42°C ili, opciono, na višoj temperaturi (npr.57°C, 59°C, 60°C, 62°C, 63°C, 65°C ili 68°C). Generalno, SSC je 0,15M NaCl i 0,015M Na-citrat. Hibridizacija zahteva da dva polinukleotida sadrže komplementarne sekvence, međutim u zavisnosti od stogosti uslova hibridizacije, moguće je nepodudaranje baza. Odgovarajuća strogot uslova za hibridizaciju polinukleotida zavisi od dužine polinukleotida i stepena komplementacije, varijabli koje su dobro poznate u struci. Što je veći stepen sličnosti ili homologije između dve nukleotidne sekvence, veća je strogost uslova pod kojim se nukleinske kiseline mogu hibridizovati. Za hibride dužine veće od 100 nukleotida, izvedene su jednačine za izračunavanje temperature topljenja (videti Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). Za hibridizaciju sa kraćim polinukleotidima, npr. oligonukleotidima, položaj nepodudaranja postaje važniji, a dužina oligonukleotida određuje njegovu specifičnost (videti Sambrook, et al., supra, 11.7-11.8).

[0275] U jednom izvođenju, pronalazak obuhvata izolovani polinukleotid koji kodira varijabilni domen (V<H>) teškog lanca antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji obuhvata CDR-H1 (SEQ ID NO: 1), CDR-H2 (SEQ ID NO: 2) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 3).

[0277] U jednom izvođenju, pronalazak obuhvata izolovani polinukleotid koji kodira varijabilni domen (V<L>) lakog lanca antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji obuhvata CDR-L1 (SEQ ID NO: 4), CDR-L2 (SEQ ID NO: 5) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 6).

[0279] U jednom izvođenju, pronalazak obuhvata izolovani polinukleotid koji kodira varijabilni domen (V<H>) teškog lanca imunoglobulina SEQ ID NO: 7 ili teški lanac SEQ ID NO: 23.

[0281] U jednom izvođenju, pronalazak obuhvata izolovani polinukleotid koji kodira varijabilni domen (V<L>) teškog lanca imunoglobulina SEQ ID NO: 8 ili laki lanac SEQ ID NO: 25.

[0283] [0107] Ovaj predmetni pronalazak takođe obezbeđuje vektore, npr. vektore ekspresije, kao što su plazmidi, koji sadrže izolovane polinukleotide pronalaska, gde je polinukleotid operativno povezan sa kontrolnim sekvencama koje prepoznaje ćelija domaćina kada je ćelija domaćina transfektovana vektorom. Takođe su obezbeđene ćelije domaćina koje sadrže vektor ovog pronalaska i metode za proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen ili polipeptida opisanog ovde, koje obuhvataju kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži vektor ekspresije ili nukleinsku kiselinu koja kodira imunoglobulinske lance antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen u medijumu za kultivaciju, i izolovanje antigena ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen iz ćelije domaćina ili medijuma za kultivaciju.

[0285] U ovaj pronalazak su takođe uključeni polipeptidi, npr. imunoglobulinski polipeptidi, koji sadrže aminokiselinske sekvence koje su najmanje oko 75% identične, 80% identične, poželjnije najmanje oko 90% identične i najpoželjnije najmanje oko 95% identične (npr.95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) sa aminokiselinskim sekvencama antitela datih ovde kada se poređenje vrši pomoću BLAST algoritma, gde su parametri algoritma odabrani tako da daju najveće podudaranje između odgovarajućih sekvenci po celoj dužini odgovarajućih referentnih sekvenci (npr. očekivani prag: 10; veličina reči: 3; maksimalni broj podudaranja u opsegu upita: 0; BLOSUM 62 matrica; troškovi praznine: postojanje 11, proširenje 1; podešavanje matrice uslovnog kompozicionog rezultata).

[0287] Identitet sekvence se odnosi na stepen u kojem su aminokiseline dva polipeptida iste na ekvivalentnim pozicijama kada su dve sekvence optimalno poravnate.

[0289] Sledeće reference se odnose na BLAST algoritme koji se često koriste za analizu sekvenci: BLAST ALGORITHMS: Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109; Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol.266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci.10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol.5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp.353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; and Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp.1-14, Plenum, New York.

[0290] Afinitet vezivanja

[0292] Na primer, a ne kao ograničenje, antitela i fragmenti koji vezuju antigene opisani ovde mogu se vezati za prefuzioni F protein ili postfuzioni F protein ljudskog RSV sa KD vrednošću od najmanje oko 1 x 10⁻⁹ M (tj. K<D>vrednost od 1 x 10⁻⁹ M ili nižom) kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U jednom izvođenju, antitela i fragmenti koji vezuju antigene opisani ovde mogu se vezati za prefuzioni F protein ili postfuzioni F protein ljudskog RSV sa K<D>vrednošću od najmanje oko 1 x 10⁻⁹ M do oko 1 x 10⁻¹² M kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U jednom izvođenju, antitela i fragmenti koji vezuju antigene koji su ovde opisani mogu da se vežu za prefuzioni F protein ljudskog RSV ili postfuzioni F protein sa K<D>vrednošću od oko 1 x 10-9 M do oko 1 x 10-12 M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET). U jednom izvođenju, antitela i fragmenti koji vezuju antigene otkriveni ovde mogu se vezati za prefuzioni F protein ljudskog RSV ili postfuzioni F protein sa KD vrednošću od najmanje oko 100 pM (tj. K<D>vrednošću od oko 100 pM ili nižom), kako je određeno BIACORE-om ili sličnom tehnikom. U jednom izvođenju, antitela i fragmenti koji vezuju antigene koji su ovde opisani mogu se vezati za prefuzioni F protein ljudskog RSV ili postfuzioni F protein sa K<D>vrednošću od najmanje oko 10 pM (tj. K<D>vrednošću od oko 10 pm nižom), kako je određeno BIACORE-om ili sličnom tehnikom. U jednom izvođenju, antitela i fragmenti koji vezuju antigen ovog pronalaska mogu se vezati za prefuzioni F protein ljudskog RSV ili postfuzioni F protein sa K<D>od oko 1 pM do oko 100 pM, kako je određeno BIACORE-om ili sličnom tehnikom.

[0294] Metodi za dobijanje antitela i njihovih fragmenata koji vezuju antigen

[0296] Ovaj pronalazak obuhvata metode za pravljenje anti-hRSV antitela F-proteina ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen ovog pronalaska, koje obuhvataju kultivisanje ćelijske linije koja eksprimuje antitelo ili fragment pod uslovima povoljnim za takvu ekspresiju i, opciono, izolovanje antitela ili fragmenta iz ćelija i/ili podloge za rast (npr. podloga za ćelijsku kulturu).

[0298] [0113] Antitela protiv hRSV F-proteina opisana ovde mogu se takođe proizvesti rekombinantno (npr. u ekspresionom sistemu E. coli/T7, ekspresionom sistemu ćelija sisara ili ekspresionom sistemu nižih eukariota). U ovom izvođenju, nukleinske kiseline koje kodiraju molekule imunoglobulina antitela ovog pronalaska (npr. V<H>ili V<L>) mogu biti umetnute u plazmid zasnovan na pET-u i ekspresovane u E. coli/T7 sistemu. Na primer, ovaj pronalazak uključuje metode za ekspresiju antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen ili njegovog lanca imunoglobulina u ćeliji domaćina (npr. bakterijskoj ćeliji domaćina kao što je E. coli kao što je BL21 ili BL21DE3) koje obuhvataju ekspresiju T7 RNK polimeraze u ćeliji koja takođe uključuje polinukleotid koji kodira lanac imunoglobulina koji je operativno povezan sa T7 promotorom. Na primer, u jednom izvođenju ovog pronalaska, bakterijska ćelija domaćin, kao što je E. coli, uključuje polinukleotid koji kodira gen T7 RNK polimeraze operativno povezan sa lac promotorom i ekspresija polimeraze i lanca je indukovana inkubacijom ćelije domaćina sa IPTG (izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozid).

[0300] Postoji nekoliko metoda za proizvodnju rekombinantnih antitela koje su poznate u struci. Jedan primer metode za rekombinantnu proizvodnju antitela je opisan u US patentu br.

[0301] 4,816,567.

[0303] Transformacija se može izvršiti bilo kojom poznatom metodom za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina. Metode za uvođenje heterolognih polinukleotida u ćelije sisara su dobro poznate u struci i uključuju transfekciju posredovanu dekstranom, taloženje kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, enkapsulaciju polinukleotida u lipozome, biolističku injekciju i direktnu mikroinjekciju DNK u jezgra. Pored toga, molekuli nukleinskih kiselina mogu se uvesti u ćelije sisara pomoću virusnih vektora. Metode transformacije ćelija su dobro poznate u struci. Videti, na primer, US patente br.4,399,216; 4,912,040; 4,740,461 i 4,959,455.

[0305] Tako, ovaj pronalazak obuhvata rekombinantne metode za pravljenje anti-hRSV antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen ovog pronalaska, ili njegovog imunoglobulinskog lanca, koje obuhvataju uvođenje polinukleotida koji kodira jedan ili više imunoglobulinskih lanaca antitela ili fragmenta (npr. teški i/ili laki imunoglobulinski lanac); kultivisanje ćelije domaćina (npr. CHO ili Pichia ili Pichia pastoris) pod uslovima povoljnim za takvu ekspresiju i, opciono, izolovanje antitela ili fragmenta ili lanca iz ćelije domaćina i/ili medijuma u kojem se ćelija domaćin gaji.

[0307] Antitela protiv hRSV F-proteina takođe se mogu sintetizovati bilo kojom od metoda navedenih u US patentu br.6,331,415.

[0309] [0118] Eukariotske i prokariotske ćelije domaćina, uključujući ćelije sisara kao domaćine za ekspresiju antitela ili fragmenata ili imunoglobulinskih lanaca opisanih ovde, dobro su poznate u struci i uključuju mnoge immortalizovane ćelijske linije dostupne iz Američke kolekcije tipova kultura (ATCC). To uključuje, između ostalog, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), NSO, SP2 ćelije, HeLa ćelije, ćelije bubrega mladunčeta hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr. Hep G2), A549 ćelije, 3T3 ćelije, HEK-293 ćelije i niz drugih ćelijskih linija. Ćelije domaćina sisara uključuju ćelije ljudi, miševa, pacova, pasa, majmuna, svinja, koza, goveda, konja i hrčka. Ćelijske linije koje imaju posebnu prednost biraju se određivanjem koje ćelijske linije imaju visoke nivoe ekspresije. Druge ćelijske linije koje se mogu koristiti su ćelijske linije insekata, kao što su Sf9 ćelije, ćelije vodozemaca, bakterijske ćelije, biljne ćelije i gljivične ćelije. Ćelije gljivica uključuju ćelije kvasca i filamentoznih gljiva uključujući, na primer, , Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens and Neurospora crassa. Pichia sp., any Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, bilo koji Kluyveromyces sp., Candida albicans, any Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, bilo koji Fusarium sp., Yarrowia lipolytica i Neurospora crassa. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju teški lanac ili njegov deo ili fragment koji vezuje antigen, laki lanac i/ili njegov fragment koji vezuje antigen unesu u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode kultivisanjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda dovoljnog da omogući ekspresiju antitela ili fragmenta ili lanca u ćelijama domaćina ili sekreciju u podlogu za kultivaciju u kojoj se ćelije domaćina gaje.

[0311] [0119] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene i imunoglobulinski lanci mogu se izdvojiti iz podloge za kultivaciju korišćenjem standardnih metoda prečišćavanja proteina. Dalje, ekspresija antitela i njihovih fragmenata koji vezuju antigene i imunoglobulinskih lanaca pronalaska (ili drugih njihovih delova) iz proizvodnih ćelijskih linija može se poboljšati korišćenjem brojnih poznatih tehnika. Na primer, sistem ekspresije gena glutamin sintetaze (GS sistem) je uobičajeni pristup za poboljšanje ekspresije pod određenim uslovima. GS sistem se u celini ili delimično razmatra u vezi sa evropskim patentima br.0 216 846, 0 256 055 i 0 323 997 i evropskom patentnom prijavom br. 89303964.4. Tako, u jednom izvođenju pronalaska, ćelije domaćini sisara (npr. CHO) nemaju gen glutamin sintetaze i gaje se u odsustvu glutamina u podlozi gde, međutim, polinukleotid koji kodira imunoglobulinski lanac sadrži gen glutamin sintetaze koji nadoknađuje nedostatak gena u ćeliji domaćinu.

[0313] Predmetni pronalazak obuhvata metode za prečišćavanje anti-hRSV antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen prema ovom pronalasku, koje obuhvataju unošenje uzorka koji sadrži antitelo ili fragment u medijum za prečišćavanje (npr. medijum za katjonsku izmenu, medijum za anjonsku izmenu, hidrofobni medijum za izmenu, medijum za afinitetno prečišćavanje (npr. protein-A, protein-G, protein-A/G, protein-L)) i ili sakupljanje prečišćenog antitela ili fragmenta iz protočne frakcije navedenog uzorka koja se ne vezuje za medijum; ili odbacivanje protočne frakcije i eluiranje vezanog antitela ili fragmenta iz medijuma i sakupljanje eluata. U jednom izvođenju pronalaska, medijum se nalazi u koloni na koju se nanosi uzorak. U jednom izvođenju pronalaska, metod prečišćavanja se sprovodi nakon rekombinantne ekspresije antitela ili fragmenta u ćeliji domaćina, npr., gde se ćelija domaćin prvo lizira i, opciono, lizat se prečišćava od nerastvorljivih materijala pre prečišćavanja na medijumu.

[0315] Generalno, glikoproteini proizvedeni u određenoj ćelijskoj liniji ili transgenoj životinji imaće obrazac glikozilacije koji je karakterističan za glikoproteine proizvedene u ćelijskoj liniji ili transgenoj životinji. Stoga, određeni obrazac glikozilacije antitela zavisiće od određene ćelijske linije ili transgene životinje koja se koristi za proizvodnju antitela. Međutim, sva antitela kodirana molekulima nukleinskih kiselina datim ovde, ili koja sadrže aminokiselinske sekvence date ovde, obuhvataju ovaj pronalazak, nezavisno od obrasca glikozilacije koji antitela mogu imati. Slično, u određenim ostvarenjima, antitela sa obrascem glikozilacije koji sadrže samo nefukozilisane N-glikane mogu biti povoljna, jer je pokazano da ova antitela obično pokazuju snažniju efikasnost od svojih fukozilisanih pandana in vitro i in vivo (videti na primer, Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); američki patenti br.

[0316] 6,946,292 i 7,214,775). Ova antitela sa nefukozilovanim N-glikanima vrlo verovatno nisu imunogena jer su njihove ugljenohidratne strukture normalna komponenta populacije koja postoji u ljudskom serumskom IgG.

[0318] [0122] Predmet ovog pronalaska je bispecifična i bifunkcionalna antitela i fragmente koji vezuju antigene i imaju specifičnost vezivanja za hRSV F protein i drugi antigen, kao što je, na primer, hRSV G protein, i metode njihove upotrebe. Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teških/lakih lanaca i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela mogu se proizvesti različitim metodama, uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje Fab' fragmenata. Videti, npr., Songsivilai, et al., (1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321, Kostelny, et al., (1992) J Immunol. 148:1547-1553. Pored toga, bispecifična antitela mogu se formirati kao „dijatela“ (Holliger, et al., (1993) PNAS USA 90:6444-6448) ili kao „Janusini“ (Traunecker, et al., (1991) EMBO J. 10:3655-3659 i Traunecker, et al., (1992) Int. J. Cancer Suppl.7:51-52).

[0320] Predmetni pronalazak dalje uključuje anti-hRSV F-proteinske antigen-vezujuće fragmente anti-hRSV antitela koji su ovde opisani. Fragmenti antitela uključuju F(ab)<2>fragmente, koji mogu biti proizvedeni enzimskim razlaganjem IgG, na primer, pepsinom. Fab fragmenti mogu se dobiti, na primer, redukcijom F(ab)<2>sa ditiotreitolom ili merkaptoetilaminom.

[0322] Imunoglobulini mogu biti svrstani u različite klase u zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca. Postoji najmanje pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih može biti dalje podeljeno na podklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4; IgA1 i IgA2. Pronalazak obuhvata antitela i antigen-vezujuće fragmente bilo koje od ovih klasa ili podklasa antitela.

[0324] U jednom izvođenju, antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži konstantni region teškog lanca, npr. ljudski konstantni region, kao što je γ1, γ2, γ3, ili γ4 ljudski konstantni region teškog lanca ili njegova varijanta. U drugom izvođenju, antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži konstantni region lakog lanca, npr. ljudski konstantni region lakog lanca, kao što je lambda ili kapa ljudski region lakog lanca ili njegova varijanta. Na primer, a ne kao ograničenje, ljudski konstantni region teškog lanca može biti y4, a ljudski konstantni region lakog lanca može biti kapa. U alternativnom izvođenju, Fc region antitela je y4 sa Ser228Pro mutacijom (Schuurman, J et. al., 2001, Mol. Immunol. 38: 1-8).

[0326] U jednom izvođenju, antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži konstantni region teškog lanca podtipa IgG1.

[0328] U nekim izvođenjima, različiti konstantni domeni mogu biti dodatni V<L>i V<H>regionima izvedenim iz CDR-ova koji su ovde dati. Na primer, ako bi određena namenjena upotreba antitela (ili fragmenta) ovog pronalaska zahtevala izmenjene efektorske funkcije, može se koristiti konstantni domen teškog lanca koji nije IgG1 čoveka, ili se može koristiti hibridni IgG1/IgG4.

[0329] Iako IgG1 antitela čoveka obezbeđuju dugo vreme poluraspada i efektorske funkcije, kao što su aktivacija komplementa i ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela, takve aktivnosti možda nisu poželjne za sve upotrebe antitela. U takvim slučajevima, na primer, može se koristiti konstantni domen IgG4 čoveka. Ovaj pronalazak uključuje anti-hRSV F-proteinska antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente koji sadrže IgG4 konstantni domen, npr. antagonist, humanizovana anti-hRSV F-proteinska antitela i fragmente, i metode njihove upotrebe. U jednom izvođenju, konstantni domen IgG4 može se razlikovati od nativnog konstantnog domena IgG4 čoveka (Swiss-Prot pristupni broj P01861.1) na poziciji koja odgovara poziciji 228 u EU sistemu i poziciji 241 u KABAT sistemu, gde je nativni Ser108 zamenjen sa Pro, kako bi se sprečila potencijalna međulančana disulfidna veza između Cys106 i Cys109 (što odgovara pozicijama Cys 226 i Cys 229 u EU sistemu i pozicijama Cys 239 i Cys 242 u KABAT sistemu) koja bi mogla da ometa pravilno formiranje disulfidnih veza unutar lanca. Videti Angal et al. (1993) Mol. Imunol.30:105. U drugim slučajevima, može se koristiti modifikovani konstantni domen IgG1 koji je modifikovan da bi se povećalo vreme poluraspada ili smanjila efektorska funkcija.

[0331] Inženjering antitela

[0333] Antitela ovog pronalaska mogu biti podvrgnuta mutacijama okvira kako bi se poboljšala svojstva antitela. Jedna takva modifikacija okvira uključuje mutiranje jednog ili više ostataka unutar okvirnog regiona, ili čak unutar jednog ili više CDR regiona, kako bi se uklonili T ćelijski epitopi i time smanjila potencijalna imunogenost antitela. Ovaj pristup se takođe naziva „deimunizacija“ i detaljnije je opisan u US patentu br.7,125,689.

[0335] U određenim ostvarenjima, biće poželjno promeniti određene aminokiseline koje sadrže izložene bočne lance drugim ostatkom aminokiseline kako bi se obezbedila veća hemijska stabilnost konačnog antitela, kako bi se izbegla deamidacija ili izomerizacija. Deamidacija asparagina može se desiti na NG, DG, NG, NS, NA, NT, QG ili QS sekvencama i rezultirati stvaranjem ostatka izoasparaginske kiseline koji uvodi pregib u polipeptidni lanac i smanjuje njegovu stabilnost (efekat izoasparaginske kiseline). Izomerizacija se može desiti na DG, DS, DA ili DT sekvencama. U određenim izvođenjima, antitela ovog otkrića ne sadrže mesta za deamidaciju ili izomeriju asparagina.

[0337] [0131] Na primer, ostatak asparagina (Asn) može se promeniti u Gln ili Ala da bi se smanjio potencijal za formiranje izoaspartata na bilo kojoj Asn-Gly sekvenci, posebno unutar CDR. Sličan problem može se javiti na Asp-Gly sekvenci. Reissner i Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60:1281. Formiranje izoaspartata može oslabiti ili potpuno ukinuti vezivanje antitela za njegov ciljni antigen. Videti, Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol.116:731 na 734. U jednom izvođenju, asparagin se menja u glutamin (Gln). Takođe može biti poželjno promeniti aminokiselinu pored ostatka asparagina (Asn) ili glutamina (Gln) da bi se smanjila verovatnoća deamidacije, koja se javlja većim brzinama kada se male aminokiseline nalaze pored asparagina ili glutamina. Videti, Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261. Pored toga, svi ostaci metionina (tipično Met izložen rastvaraču) u CDRs mogu se promeniti u Lys, Leu, Ala ili Phe ili druge aminokiseline kako bi se smanjila mogućnost da se metioninski sumpor oksiduje, što bi moglo smanjiti afinitet vezivanja antigena i takođe doprineti molekularnoj heterogenosti u konačnom preparatu antitela. Id. Pored toga, kako bi se sprečile ili minimizirale potencijalne Asn-Pro peptidne veze koje se mogu cepati, može biti poželjno promeniti bilo koje Asn-Pro kombinacije pronađene u CDR-u u Gln-Pro, Ala-Pro ili Asn-Ala. Antitela sa takvim supstitucijama se naknadno skrinira kako bi se osiguralo da supstitucije ne smanjuju afinitet ili specifičnost antitela za hRSV F-protein ili drugu željenu biološku aktivnost na neprihvatljive nivoe.

[0339] TABELA 2. Primeri stabilizujućih CDR varijanti

[0342]

[0343] CDR ostatak Stabilizirajuća varijanta sekvence

[0346]

[0349] Inženjering antitela Fc regiona

[0351] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene opisani ovde (npr. RB1) takođe mogu biti modigikovani genetskim inženjeringom tako da uključuju modifikacije unutar Fc regiona, obično da bi se promenilo jedno ili više svojstava antitela, kao što su poluživot u serumu, fiksacija komplementa, vezivanje za Fc receptor i/ili efektorska funkcija (npr. ćelijska citotoksičnost zavisna od antigena). Dalje, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene opisani ovde (npr. RB1) mogu biti hemijski modifikovani (npr., jedan ili više hemijskih delova mogu biti vezani za antitelo) ili modifikovani da bi se promenila njihova glikozilacija, ponovo da bi se promenilo jedno ili više svojstava antitela ili fragmenta. Svako od ovih otelotvorenja je detaljnije opisano u nastavku. Numeracija ostataka u Fc regionu je ona prema Kabat EU indeksu.

[0353] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene opisani ovde (npr. RB1) takođe uključuju antitela i fragmente sa modifikovanim (ili blokiranim) Fc regionima da bi se obezbedile izmenjene efektorske funkcije. Videti, npr., američki patent br. 5,624,821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702. Takve modifikacije mogu se koristiti za pojačavanje ili suzbijanje različitih reakcija imunog sistema, sa mogućim korisnim efektima u dijagnozi i terapiji. Promene Fc regiona uključuju promene aminokiselina (supstitucije, delecije i insercije), glikozilaciju ili deglikozilaciju i dodavanje više Fc regiona. Promene Fc regiona takođe mogu promeniti poluživot antitela u terapijskim antitelima, omogućavajući ređe doziranje i time povećanu pogodnost i smanjenu upotrebu materijala. Videti Presta, 2005, J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 na 734-35.

[0355] U jednom izvođenju pronalaska, zglobni region CH1 je modifikovan tako da se broj cisteinskih ostataka u zglobnom regionu povećava ili smanjuje. Ovaj pristup je detaljnije opisan u američkom patentu br. 5,677,425. Broj cisteinskih ostataka u šarnirnom regionu CH1 je promenjen, na primer, da bi se olakšalo sklapanje lakih i teških lanaca ili da bi se povećala ili smanjila stabilnost antitela.

[0356] U drugom izvođenju, antitelo ili fragment koji vezuje antigen ovog pronalaska (npr. RB1) je modifikovan da bi se povećao njegov biološki poluživot. Mogući su različiti pristupi. Na primer, može se uvesti jedna ili više sledećih mutacija: T252L, T254S, T256F, kao što je opisano u US patentu br.6,277,375. Alternativno, da bi se povećao biološki poluživot, antitelo se može izmeniti unutar CH1 ili CL regiona da bi sadržalo epitop za vezivanje receptora za spasavanje uzet iz dve petlje CH2 domena Fc regiona IgG, kao što je opisano u US patentima br. 5,869,046 i 6,121,022. U jednom izvođenju, uvodi se mutacija M252Y/S254T/T256E (YTE). Videti, npr., Oganesyan et al., Mol. Immunol. 2009, 46:1750.

[0358] U još nekim izvođenjima, Fc region je izmenjen zamenom najmanje jednog aminokiselinskih ostataka drugim aminokiselinskim ostatkom kako bi se promenila efektorska funkcija(e) antitela ili fragmenta koji vezuje antigen. Na primer, jedna ili više aminokiselina izabranih iz aminokiselinskih ostataka 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 i 322 mogu se zameniti drugim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjeni afinitet za efektorski ligand i zadržava sposobnost vezivanja za antigen matičnog antitela. Efektorski ligand za koji se afinitet menja može biti, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup je detaljnije opisan u US patentima br.5,624,821 i 5,648,260.

[0360] U drugom primeru, jedna ili više aminokiselina odabranih iz aminokiselinskih ostataka 329, 331 i 322 mogu biti zamenjene drugim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjeno vezivanje C1q i/ili smanjenu ili ukinutu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). Ovaj pristup je detaljnije opisan u US patentu br.6,194,551.

[0362] U drugom primeru, jedan ili više aminokiselinskih ostataka unutar aminokiselinskih pozicija 231 i 239 su izmenjeni kako bi se time promenila sposobnost antitela da fiksira komplement. Ovaj pristup je detaljnije opisan u međunarodnoj publikaciji patentne prijave br. WO 94/29351.

[0364] [0139] U još jednom primeru, Fc region je modifikovan da bi se smanjila sposobnost antitela ili fragmenta koji vezuje antigen prema pronalasku (npr. RB1) da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i/ili da bi se smanjio afinitet antitela ili fragmenta za Fcy receptor modifikovanjem jedne ili više aminokiselina na sledećim pozicijama: 238, 239, 243, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ili 439. Ovaj pristup je detaljnije opisan u međunarodnoj publikaciji patentne prijave br. WO 00/42072. Štaviše, mesta vezivanja na ljudskom IgG1 za FcγR1, FcyRII, FcyRIII i FcRn su mapirana i opisane su varijante sa poboljšanim vezivanjem (videti Shields et al. (2001) J. Biol. Chem.276:6591-6604).

[0366] U jednom izvođenju pronalaska, Fc region je modifikovan da bi se smanjila sposobnost antitela pronalaska (npr. RB1) da posreduje u efektorskoj funkciji i/ili da poveća antiinflamatorna svojstva modifikovanjem ostataka 243 i 264. U jednom izvođenju, Fc region antitela ili fragmenta je modifikovan promenom ostataka na pozicijama 243 i 264 u alanin. U jednom izvođenju, Fc region je modifikovan da bi se smanjila sposobnost antitela ili fragmenta da posreduje u efektorskoj funkciji i/ili da poveća antiinflamatorna svojstva modifikovanjem ostataka 243, 264, 267 i 328.

[0368] Pojačanje efektorske funkcije

[0370] U nekim izvođenjima, modifikovan je Fc region anti-hRSV antitela da bi se povećala sposobnost antitela ili fragmenta koji vezuje antigen da posreduje u efektorskoj funkciji i/ili da poveća njihovo vezivanje za Fcgama receptore (FcyRs).

[0372] Termin „Efektorska funkcija“, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više od sledećih odgovora: ćelijska citotoksična aktivnost zavisna od antitela (ADCC), ćelijska fagocitoza zavisna od komplementa (CDC), Fc-posredovana fagocitoza ili ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP) i recikliranje antitela putem FcRn receptora.

[0374] Veruje se da interakcija između konstantnog regiona proteina koji vezuje antigen i različitih Fc receptora (FcR), uključujući FcgRI (CD64), FcgRII (CD32) i FcgamaRIII (CD16), posreduje u efektorskim funkcijama, kao što su ADCC i CDC, proteina koji vezuje antigen. Fc receptor je takođe važan za umrežavanje antitela, što može biti važno za antitumorski imunitet.

[0376] Efektorska funkcija se može meriti na više načina, uključujući, na primer, putem vezivanja FcyRIII za prirodne ćelije ubice ili putem FcyRI za monocite/makrofage radi merenja efektorske funkcije ADCC. Na primer, protein koji vezuje antigen ovog pronalaska može se proceniti na efektorsku funkciju ADCC u testu prirodnih ćelija ubica. Primeri takvih testova mogu se naći u Shields et al., 2001 J. Biol. Chem., Vol.276, p 6591-6604; Chappel et al., 1993 J. Biol. Chem. 268: 25124-25131; Lazar et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103:4005-4010.

[0378] ADCC ili CDC svojstva antitela ovog pronalaska, ili njihova svojstva umrežavanja, mogu se poboljšati na više načina.

[0379] Pokazano je da konstantni regioni IgG1 čoveka koji sadrže specifične mutacije ili izmenjenu glikozilaciju na ostatku Asn297 poboljšavaju vezivanje za Fc receptore. U nekim slučajevima je takođe pokazano da ove mutacije pospešuju ADCC i CDC (Lazar et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103:4005-4010; Shields et al., J Biol Chem 2001, 276:6591-6604; Nechansky et al., Mol Immunol 2007, 44:1815-1817).

[0381] U jednom izvođenju ovog pronalaska, takve mutacije se nalaze na jednoj ili više pozicija izabranih od 239, 332 i 330 (IgG1), ili ekvivalentnih pozicija u drugim izotipovima IgG. Primeri pogodnih mutacija su S239D i I332E i A330L. U jednom izvođenju, protein koji vezuje antigen pronalaska opisan ovde je mutiran na pozicijama 239 i 332, na primer S239D i I332E ili u daljem izvođenju je mutiran na tri ili više pozicija izabranih od 239 i 332 i 330, na primer S239D i I332E i A330L. (EU indeksna numeracija).

[0383] U alternativnom izvođenju ovog pronalaska, obezbeđeno je antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca sa izmenjenim profilom glikozilacije tako da protein koji vezuje antigen ima poboljšanu efektorsku funkciju. Na primer, gde antitelo ima poboljšanu ADCC ili poboljšanu CDC ili gde ima poboljšanu ADCC i CDC efektorsku funkciju. Primeri odgovarajućih metodologija za proizvodnju proteina koji vezuju antigen sa izmenjenim profilom glikozilacije opisani su u publikacijama međunarodnih patentnih prijava br. WO2003011878 i WO2006014679 i evropskoj patentnoj prijavi br. EP1229125.

[0385] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje „nefukozilovana“ ili „afukozilovana“ antitela. Nefukozilovana antitela sadrže trimanozilnu jezgru N-glikana kompleksnog tipa Fc bez ostatka fukoze. Ova glikoinženjerska antitela kojima nedostaje jezgro ostatka fukoze iz Fc N-glikana mogu pokazati jači ADCC od fukozilovanih ekvivalenata usled poboljšanja kapaciteta vezivanja FcyRIIIa.

[0387] [0150] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metod za proizvodnju antitela prema ovom pronalasku koji obuhvata korake: a) kultivacije rekombinantne ćelije domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu kao što je ovde opisano, pri čemu rekombinantna ćelija domaćin ne sadrži alfa-1,6-fukoziltransferazu; i b) oporavka proteina koji vezuje antigen. Rekombinantna ćelija domaćin može normalno da ne sadrži gen koji kodira alfa-1,6-fukoziltransferazu (na primer, ćelije domaćina kvasca kao što je Pichia sp.) ili je možda genetski modifikovana da inaktivira alfa-1,6-fukoziltransferazu. Dostupne su rekombinantne ćelije domaćina koje su genetski modifikovane da bi inaktivirale gen FUT8 koji kodira alfa-1,6-fukoziltransferazu. Videti, npr., POTELLIGENT™ tehnološki sistem dostupan od BioWa, Inc. (Princeton, N.J.) u kome CHOK1SV ćelije kojima nedostaje funkcionalna kopija gena FUT8 proizvode monoklonska antitela sa poboljšanom aktivnošću ćelijski posredovane citotoksičnosti (ADCC) zavisne od antitela, koja je povećana u odnosu na identično monoklonsko antitelo proizvedeno u ćeliji sa funkcionalnim genom FUT8. Aspekti POTELLIGENT™ tehnološkog sistema su opisani u US patentima br.7,214,775; 6,946,292; i publikacijama međunarodnih patentnih prijava br. WO0061739 i WO0231240. Stručnjaci u ovoj oblasti će takođe prepoznati druge odgovarajuće sisteme.

[0389] Stručnjacima u ovoj oblasti biće očigledno da se takve modifikacije ne mogu koristiti samo same, već se mogu koristiti u kombinaciji jedna sa drugom kako bi se dodatno poboljšala efektorska funkcija.

[0391] Dobijanje antitela modifikovanom glikozilacijom

[0393] U još jednom izvođenju, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen ovog pronalaska (npr. RB1) sadrže određeni režim glikozilacije. Na primer, može se napraviti afukozilovano ili aglikozilovano antitelo ili fragment (tj. antitelu nedostaje fukoza ili glikozilacija, respektivno). Obrazac glikozilacije antitela ili fragmenta može se izmeniti, na primer, da bi se povećao afinitet ili avidnost antitela ili fragmenta za hRSV F-proteinski antigen. Takve modifikacije se mogu postići, na primer, promenom jednog ili više mesta glikozilacije unutar sekvence antitela ili fragmenta. Na primer, mogu se napraviti jedna ili više supstitucija aminokiselina koje rezultiraju uklanjanjem jednog ili više mesta glikozilacije okvira varijabilnog regiona kako bi se time eliminisala glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može povećati afinitet ili avidnost antitela ili fragmenta za antigen. Videti, npr., US patente br.5,714,350 i 6,350,861.

[0395] [0153] Antitela i fragmenti koji vezuju antigene opisani ovde (npr. RB1) mogu dalje uključivati one proizvedene u ćelijama domaćinima nižih eukariota, posebno gljivične ćelije domaćini kao što su kvasac i filamentozne gljivice su genetski modifikovane da proizvode glikoproteine koji imaju obrasce glikozilacije slične sisarskim ili ljudskim (videti na primer, Choi et al, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5022-5027; Hamilton et al., (2003) Science 301: 1244-1246; Hamilton et al., (2006) Science 313: 1441-1443; Nett et al., (2011) Yeast 28(3):237-52; Hamilton et al., (2007) Curr Opin Biotechnol. Oct;18(5):387-92). Ove genetski modifikovane ćelije domaćina imaju sposobnost da kontrolišu profil glikozilacije glikoproteina koji se proizvode u ćelijama tako da se mogu proizvesti kompozicije glikoproteina u kojima preovladava određena N-glikanska struktura (videti, npr., US patent br.7,029,872 i US patent br. 7,449,308). Ove genetski modifikovane ćelije domaćina su korišćene za proizvodnju antitela koja pretežno imaju određene N-glikanske strukture (videti, na primer, Li et al., (2006) Nat. Biotechnol.24: 210-215).

[0397] U posebnim ostvarenjima, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene opisani ovde (npr. RB1) dalje uključuju ona proizvedena u nižim eukariotskim ćelijama domaćinima i koja sadrže fukozilovane i nefukozilovane hibridne i kompleksne N-glikane, uključujući bisektovane i višeantenske vrste, uključujući, ali ne ograničavajući se na, N-glikane kao na primer GlcNAc<(1-4)>Man<3>GlcNAc<2>; Gal<(1-4)>GlcNAc<(1-4)>Man<3>GlcNAc<2>; NANA<(1-4)>Gal<(1->

[0398] <4)>GlcNAc<(1-4)>Man<3>GlcNAc<2>.

[0400] U posebnim ostvarenjima, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene opisani ovde (npr. RB1) mogu da sadrže antitela ili fragmente koji imaju najmanje jedan hibridni N-glikan izabran iz grupe koja se sastoji od GlcNAcMan<5>GlcNAc<2>; GalGlcNAcMan<5>GlcNAc<2>; i NANAGalGlcNAcMan<5>GlcNAc<2>. U posebnim aspektima, hibridni N-glikan je preovlađujuća vrsta N-glikana u kompoziciji.

[0402] U posebnim ostvarenjima, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen dati ovde (npr. RB1) obuhvataju antitela i fragmente koji imaju najmanje jedan kompleksni N-glikan izabran iz grupe koju čine GlcNAcMan<3>GlcNAc<2>; GalGlcNAcMan<3>GlcNAc<2>; NANAGalGlcNAcMan<3>GlcNAc<2>; GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>; GalGlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>; Gal<2>GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>; NANAGal<2>GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>; i NANA<2>Gal<2>GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>. U posebnim aspektima, kompleksni N-glikani su preovlađujuća vrsta N-glikana u kompoziciji. U daljim aspektima, kompleksni N-glikan je posebna vrsta N-glikana koja obuhvata oko 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% kompleksa N-glikana u kompoziciji. U jednom izvođenju, antitelo i njegovi fragmenti koji se vezuju za antigen ovde dati obuhvataju kompleksne N-glikane, gde najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% kompleksnih N-glikana obuhvata strukturu NANA<2>Gal<2>GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>, gde je takva struktura afukozilovana. Takve strukture mogu biti proizvedene, npr., u modifikovanim Pichia pastoris ćelijama domaćinima.

[0404] U određenim ostvarenjima, N-glikan je fukozilovan. Generalno, fukoza je u α1,3-vezi sa GlcNAc na redukujućem kraju N-glikana, α 1,6-vezi sa GlcNAc na redukujućem kraju N-glikana, α1,2-vezi sa Gal na neredukujućem kraju N-glikana, α1,3-vezi sa GlcNac na neredukujućem kraju N-glikana ili α1,4-vezi sa GlcNAc na neredukujućem kraju N-glikana.

[0406] [0158] Stoga, u posebnim aspektima gore navedenih sastava glikoproteina, glikoform je u α1,3-vezi ili α1,6-vezi fukoze da bi se proizveo glikoform izabran iz grupe koju čine Man<5>GlcNAc<2>(Fuc), GlcNAcMan<5>GlcNAc<2>(Fuc), Man<3>GlcNAc<2>(Fuc), GlcNAcMan<3>GlcNAc<2>(Fuc), GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>(Fuc), GalGlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>(Fuc), Gal<2>GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>(Fuc), NANAGal<2>GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>(Fuc), and NANA<2>Gal<2>GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>(Fuc); u α 1,3-vezi ili α 1,4-vezi fukoze da bi se dobio glikoform izabran iz grupe koju čine GlcNAc(Fuc)Man<5>GlcNAc<2>, GlcNAc(Fuc)Man<3>GlcNAc<2>, GlcNAc<2>(Fuc<1-2>)Man<3>GlcNAc<2>, GalGlcNAc<2>(Fuc<1->

[0407] <2>)Man<3>GlcNAc<2>, Gal<2>GlcNAc<2>(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2(Fuc<1->

[0408] <2>)Man<3>GlcNAc<2>, and NANA<2>Gal<2>GlcNAc<2>(Fuc<1-2>)Man<3>GlcNAc<2>; ili u α1,2-vezanoj fukozi da bi se proizveo glikoform izabran iz grupe koju čine Gal(Fuc)GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>, Gal<2>(Fuc<1-2>)GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>, NANAGal<2>(Fuc<1-2>)GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>, and NANA<2>Gal<2>(Fuc<1-2>)GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>.

[0410] U daljim aspektima, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen sadrže N-glikane sa visokim sadržajem manoze, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Man<8>GlcNAc<2>, Man<7>GlcNAc<2>, Man<6>GlcNAc<2>, Man<5>GlcNAc<2>, Man<4>GlcNAc<2>, ili N-glikane koji se sastoje od strukture Man<3>GlcNAc<2>N-glikana.

[0412] U daljim aspektima gore navedenog, kompleksni N-glikani dalje uključuju fukozilovane i nefukozilovane bisektovane i višeantenske vrste.

[0414] Kako se ovde koriste, termini „N-glikan“ i „glikoform“ se koriste naizmenično i odnose se na N-vezani oligosaharid, na primer, onaj koji je vezan asparagin-N-acetilglukozaminskom vezom za asparaginsku ostatak polipeptida. N-vezani glikoproteini sadrže N-acetilglukozaminski ostatak povezan sa amidnim azotom asparaginskog ostatka u proteinu. Preovlađujući šećeri koji se nalaze na glikoproteinima su glukoza, galaktoza, manoza, fukoza, N-acetilgalaktozamin (GalNAc), N-acetilglukozamin (GlcNAc) i sijalinska kiselina (npr. N-acetil-neuraminska kiselina (NANA)). Obrada šećernih grupa se odvija kotranslaciono u lumenu endoplazmatskog retikuluma (ER) i nastavlja se posttranslaciono u Goldžijevom aparatu za N-vezane glikoproteine.

[0416] [0162] N-glikani imaju zajedničko pentasaharidno jezgro Man<3>GlcNAc<2>(„Man“ se odnosi na manozu; „Glc“ se odnosi na glukozu; i „NAc“ se odnosi na N-acetil; GlcNAc se odnosi na N-acetilglukozamin). Obično su strukture N-glikana predstavljene sa neredukujućim krajem levo i redukujućim krajem desno. Redukujući kraj N-glikana je kraj koji je vezan za Asn ostatak koji sadrži mesto glikozilacije na proteinu. N-glikani se razlikuju po broju grana (antena) koje sadrže periferne šećere (npr. GlcNAc, galaktozu, fukozu i sijalinsku kiselinu) koji se dodaju strukturi jezgra Man<3>GlcNAc<2>(" („Man3“), koja se takođe naziva „trimanozno jezgro“, „pentasaharidno jezgro“ ili „paucimanozno jezgro“. N-glikani se klasifikuju prema svojim razgranatim sastojcima (npr., sa visokim sadržajem manoze, kompleksni ili hibridni). N-glikan tipa „sa visokim sadržajem manoze“ ima pet ili više ostataka manoze. N-glikan tipa „kompleks“ obično ima najmanje jedan GlcNAc vezan za 1,3 manozni krak i najmanje jedan GlcNAc vezan za 1,6 manozni krak „trimanoznog“ jezgra. Kompleksni N-glikani mogu takođe imati ostatke galaktoze („Gal“) ili N-acetilgalaktozamina („GalNAc“) koji su opciono modifikovani sijalinskom kiselinom ili derivatima (npr. „NANA“ ili „NeuAc“, gde se „Neu“ odnosi na neuraminsku kiselinu, a „Ac“ na acetil). Kompleksni N-glikani takođe mogu imati intralančane supstitucije koje obuhvataju „prepolovljenje“ GlcNAc i jezgra fukoze („Fuc“). Kompleksni N-glikani takođe mogu imati višestruke antene na „trimanoznom jezgru“, često nazivane „višestruki antenni glikani“. „Hibridni“ N-glikan ima najmanje jedan GlcNAc na terminalu 1,3 manoznog kraka trimanoznog jezgra i nula ili više manoza na 1,6 manoznom kraku trimanoznog jezgra. Različiti N-glikani se takođe nazivaju „glikoformi“.

[0418] Što se tiče složenih N-glikana, termini „G-2“, „G-1“, „G0“, „G1“, „G2“, „A1“ i „A2“ znače sledeće. „G-2“ se odnosi na strukturu N-glikana koja se može okarakterisati kao Man<3>GlcNAc<2>; termin „G-1“ se odnosi na strukturu N-glikana koja se može okarakterisati kao GlcNAcMan<3>GlcNAc<2>;termin „G0“ se odnosi na strukturu N-glikana koja se može okarakterisati kao GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>; termin „G1“ se odnosi na strukturu N-glikana koja se može okarakterisati kao GalGlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>; termin „G2“ se odnosi na strukturu N-glikana koja se može okarakterisati kao Gal<2>GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>; termin „A1“ se odnosi na strukturu N-glikana koja se može okarakterisati kao NANAGal<2>GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>; i termin „A2“ se odnosi na strukturu N-glikana koja se može okarakterisati kao NANA<2>Gal<2>GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>. Osim ako nije drugačije naznačeno, termini G-2“, „G-1“, „G0“, „G1“, „G2“, „A1“ i „A2“ odnose se na vrste N-glikana kojima nedostaje fukoza vezana za GlcNAc ostatak na redukujućem kraju N-glikana. Kada termin sadrži „F“, „F“ označava da vrsta N-glikana sadrži ostatak fukoze na GlcNAc ostatku na redukujućem kraju N-glikana. Na primer, G0F, G1F, G2F, A1F i A2F svi ukazuju na to da N-glikan dalje uključuje ostatak fukoze vezan za GlcNAc ostatak na redukujućem kraju N-glikana. Niži eukarioti poput kvasca i filamentoznih gljivica normalno ne proizvode N-glikane koji proizvode fukozu.

[0420] [0164] Što se tiče višeantentkih N-glikana, termin „višeantenski N-glikan“ odnosi se na N-glikane koji dalje sadrže GlcNAc ostatak na ostatak manoze koji obuhvata neredukujući kraj 1,6 kraka ili 1,3 kraka N-glikana ili GlcNAc ostatak na svakom od ostataka manoze koji obuhvataju neredukujući kraj 1,6 kraka i 1,3 kraka N-glikana. Dakle, višeantenski N-glikani mogu se okarakterisati formulama GlcNAc<(2-4)>Man<3>GlcNAc<2>, Gal<(1-4)>GlcNAc<(2->

[0421] <4)>Man<3>GlcNAc<2>, or NANA<(1-4)>Gal<(1-4)>GlcNAc<(2-4)>Man<3>GlcNAc<2>. Termin „1-4“ se odnosi na 1, 2, 3 ili 4 ostatka.

[0423] Što se tiče bisektovanih N-glikana, termin „bisektovan N-glikan“ se odnosi na N-glikane u kojima je GlcNAc ostatak povezan sa ostatkom manoze na redukujućem kraju N-glikan. Prepolovljeni N-glikan može se okarakterisati formulom GlcNAc<3>Man<3>GlcNAc<2>gde je svaki ostatak manoze povezan na svom neredukujućem kraju sa ostatkom GlcNAc. Nasuprot tome, kada je višeantenski N-glikan okarakterisan kao GlcNAc<3>Man<3>GlcNAc<2>, formula ukazuje da su dva ostatka GlcNAc povezana sa ostatkom manoze na neredukujućem kraju jednog od dva kraka N-glikana i jedan ostatak GlcNAc je povezan sa ostatkom manoze na neredukujućem kraju drugog kraka N-glikana.

[0425] Fizičke osobine antitela

[0427] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen opisani ovde (npr. RB1) mogu dalje sadržati jedno ili više mesta glikozilacije u varijabilnom regionu imunoglobulina lakog ili teškog lanca. Određena mesta glikozilacije mogu dovesti do smanjene imunogenosti antitela ili fragmenta ili promene pK antitela zbog izmenjenog vezivanja antigena (Marshall et al., 1972, Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison, 2004, J Immunal 172:5489-94; Wallick et al., 1988, J Exp Med 168:1099-109; Spiro, 2002, Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al., 1985, Nature 316:452-7; Mimura et al., 2000, Mol Immunol 37:697-706). Poznato je da se glikozilacija javlja na motivima koji sadrže N-X-S/T sekvencu.

[0429] Svako antitelo ili fragment koji vezuje antigen (npr. RB1) imaće jedinstvenu izoelektričnu tačku (pI), koja generalno pada u pH opsegu između 6 i 9,5. pI za IgG1 antitelo obično pada u pH opsegu od 7-9,5, a pI za IgG4 antitelo obično pada u pH opsegu od 6-8.

[0431] Svako antitelo ili fragment koji vezuje antigen (npr. RB1) imaće karakterističnu temperaturu topljenja, pri čemu viša temperatura topljenja ukazuje na veću ukupnu stabilnost in vivo (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Generalno, TM1 (temperatura početnog rasklapanja) može biti veća od 60°C, veća od 65°C ili veća od 70°C. Tačka topljenja antitela ili fragmenta može se meriti korišćenjem diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (Chen et al., (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al., (1999) Immunol Lett 68:47-52) or circular dichroism (Murray et al., (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).

[0432] U daljem izvođenju, odabrana su antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen (npr. RB1) koji se ne razgrađuju brzo. Razgradnja antitela ili fragmenta može se meriti korišćenjem kapilarne elektroforeze (CE) i MALDI-MS (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).

[0434] U daljem izvođenju, odabrana su antitela (npr. RB1) i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji imaju minimalne efekte agregacije, što može dovesti do pokretanja neželjenog imunog odgovora i/ili izmenjenih ili nepovoljnih farmakokinetičkih svojstava. Generalno, antitela i fragmenti su prihvatljivi sa agregacijom od 25% ili manje, 20% ili manje, 15% ili manje, 10% ili manje, ili 5% ili manje. Agregacija se može meriti pomoću nekoliko tehnika, uključujući ekskluziono razzdvajanje na koloni (SEC), tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC) i rasejanje svetlosti.

[0436] Konjugati antitela

[0438] Anti-hRSV F-proteink antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen ovde opisani (npr. RB1) takođe mogu biti konjugovani sa hemijskim delom. Hemijski deo može biti, između ostalog, polimer, radionuklid ili citotoksični faktor. U određenim izvođenjima, hemijski deo je polimer koji povećava poluživot antitela ili fragmenta u telu subjekta. Pogodni polimeri uključuju, ali nisu ograničeni na, hidrofilne polimere koji uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG) (npr. PEG sa molekulskom težinom od 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa ili 40 kDa), dekstran i monometoksipolietilen glikol (mPEG). Lee, et al., (1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981) otkrivaju PEG konjugovana antitela sa jednim lancem. Wen, et al., (2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553) otkrivaju konjugaciju antitela sa PEG koji je vezan za helator radiometala (dietilentriaminpentasirćetna kiselina (DTPA)).

[0440] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen ovde opisani (npr. RB1) takođe mogu biti konjugovani sa oznakama kao što su<99>Tc,<90>Y,<111>In,<32>P,<14>C,<125>I,<3>H,<131>I,<11>C,<15>O,<13>N,<18>F,<35>S,<51>Cr,<57>To,<226>Ra,<60>Co,<59>Fe,<57>Se,<152>Eu,<67>CU,<217>Ci,<211>At,<212>Pb,<47>Sc,<109>Pd,<234>Th, i<40>K,<157>Gd,<55>Mn,<52>Tr, i<56>Fe.

[0442] [0173] Antitela i fragmenti koji vezuju antigen opisani ovde (npr. RB1) takođe mogu biti PEGilovani, na primer da bi se povećalo njegovo biološko (npr. serumsko) vreme poluraspada. Da bi se PEGilovalo antitelo ili fragment, antitelo ili fragment obično reaguje sa reaktivnim oblikom polietilen glikola (PEG), kao što je reaktivni estarski ili aldehidni derivat PEG-a, pod uslovima u kojima se jedna ili više PEG grupa vezuju za antitelo ili fragment antitela. U određenim ostvarenjima, PEGilacija se sprovodi putem reakcije acilacije ili reakcije alkilacije sa reaktivnim PEG molekulom (ili analognim reaktivnim polimerom rastvorljivim u vodi). Kako se ovde koristi, termin „polietilen glikol“ treba da obuhvati bilo koji od oblika PEG-a koji su korišćeni za derivatizaciju drugih proteina, kao što su mono (C<1>-C<10>) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol ili polietilen glikol-maleimid. U određenim ostvarenjima, antitelo ili fragment koji treba PEGilovati je aglikozilovane antitelo ili fragment. Metode za pegilaciju proteina su poznate u struci i mogu se primeniti na antitela ovog pronalaska. Videti, npr., evropske patentne prijave br. EP 0154316 i EP 0401 384.

[0444] Antitela i fragmenti koji vezuju antigen opisani ovde (npr. RB1) mogu se takođe konjugovati sa fluorescentnim ili hemiluminiscentnim molekulima, uključujući fluorofore kao što su helati retkih zemalja, fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, izotiocijanat, fikoeritrin, fikocijanin, alofikocijanin, o-ftaladehid, fluoreskamin,<152>Eu, dansil, umbeliferon, luciferin, luminalni molekul, izoluminalni molekul, molekul aromatičnog akridinijum estra, molekul imidazola, molekul akridimijum soli, molekul oksalatnog estra, molekul ekvorina, 2,3-dihidroftalazindioni, biotin/avidin, spin molekuli i stabilni slobodni radikali.

[0446] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene prema ovom pronalasku (npr. RB1) mogu se takođe konjugovati sa citotoksičnim faktorom kao što je toksin difterije, lanac A egzotoksina Pseudomonas aeruginosa, lanac A ricina, lanac A abrina, lanac A modecina, alfasarcin, proteini i jedinjenja Aleurites fordii (npr. masne kiseline), proteini diantina, proteini, Phytoiacca americana PAPI, PAPII, i PAP-S, momordica charantia inhibitor, curcin, krotin, inhibitor saponaria officinalis, mitogelin, restriktocin, fenomicin i enomicin.

[0448] Može se koristiti bilo koja metoda poznata u struci za konjugaciju antitela i njihovih fragmenata koji vezuju antigene prema ovom pronalasku (npr. RB1) sa različitim delovima, uključujući one metode koje su opisali Hunter et al., 1962, Nature 144:945; David et al., 1974, Biochemistry 13:1014; Pain et al., 1981, J. Immunol. Meth. 40:219; and Nygren, 1982, Histochem. and Cytochem. 30:407. Metode za konjugaciju antitela i fragmenata su konvencionalne i veoma dobro poznate u struci.

[0450] Profilaktička i terapijska upotreba anti-hRSV antitela

[0452] Dalje su dati metodi za prevenciju, lečenje ili ublažavanje simptoma RSV infekcije kod subjekata, uključujući ljude, kojima je potrebna takva prevencija, lečenje ili ublažavanje izolovanim antitelima ili njihovim fragmentima koji vezuju antigen, a koji su ovde opisani (npr.

[0453] RB1). U jednom izvođenju pronalaska, takav subjekt pati od RSV infekcije. U jednom izvođenju pronalaska, takav subjekt je u riziku od infekcije RSV.

[0455] U specifičnom izvođenju, sisaru, poželjno čoveku, primenjuje se profilaktička, terapeutska ili farmaceutska kompozicija koja sadrži jedno ili više antitela ovog pronalaska ili njihovih fragmenata za lečenje, prevenciju ili ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa RSV infekcijom u količini efikasnoj za smanjenje RSV titara. U skladu sa ovim izvođenjem, efikasna količina antitela ili fragmenata antitela smanjuje RSV titre u plućima mereno, na primer, koncentracijom RSV u uzorcima sputuma ili lavažu iz pluća sisara. U drugom izvođenju, sisaru, poželjno čoveku, primenjuje se profilaktička, terapeutska ili farmaceutska kompozicija koja sadrži jedno ili više antitela ovog pronalaska ili njihovih fragmenata za lečenje, prevenciju ili ublažavanje simptoma povezanih sa RSV infekcijom u količini efikasnoj za neutralizaciju RSV i/ili blokiranje RSV infekcije kod sisara.

[0457] Monoklonalna antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu se takođe koristiti imunoterapeutski za RSV bolest i kod ljudi i kod drugih životinja. Termin „imunoterapeutski“ ili „imunoterapija“, kako se ovde koristi u vezi sa monoklonskim antitelima ili njihovim fragmentima koji vezuju antigen prema ovom pronalasku, označava i profilaktičku i terapeutsku primenu, kao i pasivnu imunizaciju sa značajno prečišćenim polipeptidnim proizvodima, kao i gensku terapiju prenosom polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju proizvod ili njegov deo. Pasivna imunizacija uključuje prenos aktivnog humoralnog imuniteta ili obezbeđivanje antitela subjektu kome je to potrebno. Shodno tome, u određenim izvođenjima pronalaska, ovaj pronalazak obezbeđuje metode za prenos aktivnog humoralnog imuniteta i metode obezbeđivanja antitela protiv RSV-a ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen, kao što su IgG antitela, pacijentu koji je u riziku od RSV infekcije. Dakle, monoklonska antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu se primenjivati kod subjekata sa visokim rizikom kako bi se smanjila verovatnoća i/ili težina RSV bolesti ili se mogu primenjivati kod subjekata koji već imaju aktivnu RSV infekciju.

[0459] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metod za modulaciju ili lečenje najmanje jedne bolesti povezane sa RSV-om kod odraslih ili dece, u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, ali ne ograničavajući se na, infekcije donjih disajnih puteva, upalu pluća, traheobronhitis, bronhiolitis, bronhitis i bilo koje povezane infekcije ili inflamatorne poremećaje, kao što su, ali ne ograničavajući se na, najmanje jedna od, ili najmanje jedna upala povezana sa, sindromom sistemskog inflamatornog odgovora, sindromom sepse, grampozitivnom sepsom, gram-negativnom sepsom, sepsom negativnom u kulturi, gljivičnom sepsom, neutropeničnom groznicom, urosepsom, meningokokemijom, respiratornim distresom kod odraslih, alergijskim rinitisom, višegodišnjim rinitisom, astmom, sistemskom anafalaksijom, reakcijama preosetljivosti na receptore, hroničnom opstruktivnom plućnom bolesti (HOBP/COPD), hipersenzitivnim pneumonitisom, granulomima usled intracelularnih organizama, osetljivošću na lekove, kaheksijom, cističnom fibrozom, neonatalnom hroničnom plućnom bolesti; najmanje jedna zarazna bolest u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, ali ne ograničavajući se na, najmanje jedno od: akutne ili hronične bakterijske infekcije, akutnih i hroničnih parazitskih ili zaraznih procesa, uključujući bakterijske, virusne i gljivične infekcije, HIV infekciju, HIV neuropatiju, meningitis, hepatitis (A, B ili C, ili slično), septički artritis, peritonitis, upalu pluća, epiglotitis, E. koli 0157:h7, hemolitičkouremički sindrom, trombolitičku trombocitopeničnu purpuru, malariju, denga hemoragičnu groznicu, lajšmanijazu, lepru, sindrom toksičnog šoka, streptokokni miozitis, gasna gangrena, mikobakterium tuberkulozu, mikobakterium avium intracelulare, pneumoniju izazvanu pneumocistis karini, karličnu inflamatornu bolest, orhitis, epididimitis, legionela, lajmska bolest, grip A, Epštajn-Barov virus, vitalno povezani hemafagocitni sindrom, vitalni encefalitis, aseptični meningitis i slično. Takav metod može opciono da obuhvati davanje efikasne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedno RSV antitelo ili njegov antigeni fragment ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu kome je potrebna takva modulacija, lečenje ili terapija.

[0461] U jednom izvođenju, profilaktičke, terapeutske ili farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela ovog pronalaska ili njihove fragmente administrirane sisaru, poželjno čoveku, radi lečenja, sprečavanja ili ublažavanja jednog ili više simptoma povezanih sa RSV infekcijom. U drugom izvođenju, profilaktičke, terapeutske ili farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela ovog pronalaska ili njihove fragmente primenjuju se čoveku sa cističnom fibrozom, bronhopulmonalnom displazijom, kongenitalnom srčanom bolešću, kongenitalnom imunodeficijencijom ili stečenom imunodeficijencijom, ili čoveku koji je imao transplantaciju (npr. transplantaciju koštane srži, pluća ili hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT)) radi lečenja, prevencije ili ublažavanja jednog ili više simptoma povezanih sa RSV infekcijom.

[0463] [0182] U drugom izvođenju, profilaktičke, terapeutske ili farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela ovog pronalaska ili njihove fragmente primenjuju se ljudskom odojčetu, poželjno ljudskom odojčetu rođenom prevremeno ili ljudskom odojčetu sa rizikom od hospitalizacije zbog RSV infekcije radi lečenja, sprečavanja ili ublažavanja jednog ili više simptoma povezanih sa RSV infekcijom. U još jednom izvođenju, profilaktičke, terapeutske ili farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela ovog pronalaska ili njihove fragmente primenjuju se starijim osobama ili ljudima u grupnim domovima (npr. domovima za stare ili rehabilitacionim centrima) ili imunokompromitovanim osobama.

[0465] Poželjno je koristiti antitela visokog afiniteta i/ili snažna in vivo inhibirajuća antitela i/ili neutrališuća antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen i koji se imunospecifično vezuju za RSV antigen, kako za prevenciju RSV infekcije, tako i za terapiju RSV infekcije. Takođe je poželjno koristiti polinukleotide koji kodiraju antitela visokog afiniteta i/ili snažna in vivo inhibirajuća antitela i/ili neutrališuća antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen i koji se imunospecifično vezuju za RSV antigen, kako za prevenciju RSV infekcije, tako i za terapiju RSV infekcije. Takva antitela ili njihovi fragmenti će poželjno imati afinitet za RSV F glikoprotein i/ili fragmente F glikoproteina.

[0467] Antitela i funkcionalni ekvivalenti (kao što su njihovi fragmenti koji vezuju antigen) prema ovom pronalasku prepoznaju epitop unutar RSV F proteina. Antitela ili njihovi funkcionalni ekvivalenti koji specifično prepoznaju navedeni epitop mogu se kombinovati sa antitelima specifičnim za RSV koja se vezuju za drugi epitop koji je već poznat, kao što su palivizumb, D25, AM14, AM16 i AM23. Kombinovanjem antitela ili funkcionalnog ekvivalenta prema ovom pronalasku koji specifično prepoznaje navedeni epitop sa poznatim antitelom specifičnim za RSV, dva ili više različitih epitopa RSV se prepoznaju tokom iste terapije. Na ovaj način se može postići jači imunogeni odgovor na RSV i/ili veća specifičnost antitela protiv RSV. Sa jačim imunogenim odgovorom i većom specifičnošću protiv RSV, takva kombinacija može rezultirati efikasnijim lečenjem i/ili prevencijom poremećaja povezanog sa RSV.

[0469] [0185] Jedno ili više antitela ovog pronalaska ili njihovih fragmenata koji se imunospecifično vezuju za jedan ili više RSV antigena mogu se koristiti lokalno ili sistemski u telu kao profilaktičko sredstvo. Antitela ovog pronalaska ili njihovi fragmenti mogu se takođe povoljno koristiti u kombinaciji sa drugim monoklonskim ili himernim antitelima, ili sa limfokinima ili hematopoetskim faktorima rasta (kao što su, npr., IL-2, IL-3, IL-7 i IL-15), koji, na primer, služe za povećanje broja ili aktivnosti efektorskih ćelija koje interaguju sa antitelima. Antitela ovog pronalaska ili njihovi fragmenti mogu se takođe povoljno koristiti u kombinaciji sa drugim monoklonskim ili himernim antitelima, ili sa limfokinima ili hematopoetskim faktorima rasta (kao što su, npr., IL-2, IL-3 i IL-7), koji, na primer, služe za povećanje imunog odgovora. Antitela ovog pronalaska ili njihovi fragmenti mogu se takođe povoljno koristiti u kombinaciji sa jednim ili više lekova koji se koriste za lečenje RSV infekcije, kao što su, na primer, antivirusni agensi.

[0471] Antitela pronalaska ili fragmenti mogu se koristiti u kombinaciji sa jednim ili više sledećih lekova: NIH-351 (Gemini Technologies), rekombinantna RSV vakcina (Aviron), RSVf-2 (Intracel), F-50042 (Pierre Fabre), T-786 (Trimeris), VP-36676 (ViroPharma), RFI-641 (American Home Products), VP-14637 (ViroPharma), PFP-1 i PFP-2 (American Home Products), RSV vakcina (Avant Immunotherapeutics) i F-50077 (Pierre Fabre).

[0473] Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigene pronalaska mogu se primenjivati sami ili u kombinaciji sa drugim vrstama tretmana (npr. hormonska terapija, imunoterapija i antiinflamatorni agensi). Generalno, poželjna je primena proizvoda vrstnog porekla ili vrstne reaktivnosti (u slučaju antitela) koja je iste vrste kao i pacijent. Dakle, u preferiranom izvođenju, ljudska ili humanizovana antitela, fragmenti, derivati, analozi ili nukleinske kiseline se primenjuju kod ljudskog pacijenta radi terapije ili profilakse.

[0475] „Subjekt“ može biti sisar kao što je čovek, pas, mačka, konj, krava, miš, pacov, majmun (npr. cinomolgozni majmun, npr. Macaca fascicularis) ili zec. U preferiranim izvođenjima pronalaska, subjekt je čovek.

[0477] U posebnim izvođenjima, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen opisani ovde (npr. RB1) mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa antivirusnom terapijom.

[0479] U posebnim izvođenjima, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen opisani ovde (npr. RB1) mogu se koristiti sâmi ili u kombinaciji sa drugim monoklonskim antitelom protiv RSV-a.

[0481] U određenim ostvarenjima, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen opisani ovde (npr. RB1) mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa drugom RSV vakcinom.

[0483] [0192] Termin „u kombinaciji sa“ označava da se komponente koje se administriraju u metodi ovog pronalaska (npr. anti-hRSV antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen (npr. RB1) zajedno sa, npr., palivizumbom) mogu formulisati u jednu kompoziciju za istovremenu primenu ili formulisati odvojeno u dve ili više kompozicija (npr. komplet). Svaka komponenta se može administrirati subjektu u različito vreme nego kada se primenjuje druga komponenta; na primer, svaka administracija se može dati u različita vremena (npr. odvojeno ili sekvencijalno) u nekoliko intervala tokom datog vremenskog perioda. Dodatno, odvojene komponente se mogu administrirati subjektu istim ili različitim putem.

[0485] Eksperimentalna i dijagnostička upotreba

[0487] Antitela protiv hRSV F proteina i njihovi fragmenti koji vezuju antigen opisani ovde (npr. RB1) mogu se koristiti kao sredstva za afinitetno prečišćavanje. U ovom procesu, antitela protiv hRSV F proteina i njihovi fragmenti koji vezuju antigen imobilišu se na čvrstoj fazi kao što je Sephadex®, staklo ili agarozna smola ili filter papir, koristeći metode dobro poznate u struci. Imobilizovano antitelo ili fragment se dovodi u kontakt sa uzorkom koji sadrži hRSV F protein (ili njegov fragment) koji treba prečistiti, a zatim se nosač ispira odgovarajućim rastvaračem koji će ukloniti praktično sav materijal u uzorku osim hRSV F proteina, koji je vezan za imobilizovano antitelo ili fragment. Konačno, nosač se ispira rastvaračem koji eluira vezani hRSV F protein (npr. protein A). Takva imobilizovana antitela i fragmenti čine deo ovog pronalaska.

[0489] Dalje su obezbeđeni antigeni za generisanje sekundarnih antitela koja su korisna, na primer, za izvođenje Western blot-ova i drugih imunoloških testova o kojima se ovde raspravlja. Posebno su opisani polipeptidi koji sadrže varijabilne regione i/ili CDR sekvence terapeutskog antitela opisanog ovde (npr. RB1) i koji se mogu koristiti za generisanje antiidiotipskih antitela za upotrebu u specifičnom otkrivanju prisustva antitela, npr. u terapeutskom kontekstu.

[0491] Anti- hRSV F protein antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu takođe biti korisni u dijagnostičkim testovima za hRSV F protein, npr. za otkrivanje njegove ekspresije u specifičnim ćelijama, tkivima ili serumu. Takve dijagnostičke metode mogu biti korisne u dijagnozama različitih bolesti.

[0493] Predmet ovog pronalaska su ELISA testovi (enzimski povezani imunosorbentni test) koji uključuju upotrebu antitela protiv F proteina hRSV ili njegovog fragmenta koji vezuje ove opisan antigen (npr. RB1).

[0495] Na primer, takav metod obuhvata sledeće korake:

[0497] (a) oblaganje supstrata (npr. površinu ležišta mikrotitar ploče, npr. plastičnu ploču) antitelom protiv hRSV F proteina ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen;

[0499] (b) naneti uzorak koji se testira na prisustvo RSV F proteina na supstrat;

[0500] (c) isprati ploču, tako da se ukloni nevezani materijal u uzorku;

[0502] (d) naneti detektabilno označena antitela (npr. enzimski povezana antitela) koja su takođe specifična za antigen RSV F proteina;

[0504] (e) isprati supstrat, tako da se uklone nevezana, obeležena antitela;

[0506] (f) ako su obeležena antitela enzimski povezana, naneti hemikaliju koju enzim pretvara u fluorescentni signal; i

[0508] (g) detektovati prisustvo obeleženog antitela.

[0510] Detekcija oznake povezane sa supstratom ukazuje na prisustvo hRSV F proteina.

[0512] U daljem izvođenju, obeleženo antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obeležen je peroksidazom koja reaguje sa ABTS (npr., 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina)) ili 3,3',5,5'-tetrametilbenzidinom da bi se proizvela promena boje koja se može detektovati. Alternativno, obeleženo antitelo ili fragment obeležen je detektovanim radioizotopom (npr.,<3>H) koji se može detektovati scintilacionim brojačem u prisustvu scintilanta.

[0514] Antitelo protiv hRSV F proteina ili njegov fragment koji vezuje antigen prema ovom pronalasku (npr. RB1) može se koristiti u Western blot ili imunoprotein blot postupku. Takav postupak čini deo ovog pronalaska i uključuje npr.:

[0516] (1) opciono prenošenje proteina iz uzorka koji se testira na prisustvo hRSV F proteina (npr. iz PAGE ili SDS-PAGE elektroforetskog razdvajanja proteina u uzorku) na membranu ili drugu čvrstu podlogu korišćenjem metode poznate u struci (npr. Polusuvi blotting ili blotint u rezervoaru); kontaktiranje membrane ili druge čvrste podloge koja se testira na prisustvo vezanog hRSV F proteina ili njegovog fragmenta sa anti-hRSV antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen prema ovom pronalasku.

[0518] Takva membrana može biti u obliku nitrocelulozne ili vinilne (npr. poliviniliden fluorid (PVDF)) membrane na koju su preneti proteini koji se testiraju na prisustvo hRSV u nedenaturišućem PAGE (poliakrilamidnom gelu elektroforeza) gelu ili SDS-PAGE (natrijum dodecil sulfat poliakrilamidnom gelu elektroforeza) gelu (npr., nakon elektroforetskog razdvajanja u gelu). Pre kontakta membrane sa anti-hRSV antitelom ili fragmentom, membrana se opciono blokira, npr. bezmasnom mlekom u prahu ili slično, kako bi se vezala nespecifična mesta vezivanja proteina na membrani.

[0519] (2) ispiranje membrane jednom ili više puta da bi se uklonilo nevezano anti-hRSV F proteinsko antitelo ili fragment i druge nevezane supstance; i

[0521] (3) detekciju vezanog anti-hRSV F proteinskog antitela ili fragmenta.

[0523] Detekcija vezanog antitela ili fragmenta ukazuje da je hRSV protein prisutan na membrani ili supstratu i u uzorku. Detekcija vezanog antitela ili fragmenta može se izvršiti vezivanjem antitela ili fragmenta sa sekundarnim antitelom (anti-imunoglobulinskim antitelom) koje je detektabilno obeleženo, a zatim detekcijom prisustva sekundarnog antitela.

[0525] Antitela protiv hRSV F proteina i njihovi antigen-vezujući fragmenti opisani ovde (npr. RB1) takođe se mogu koristiti za imunohistohemiju. Takav metod čini deo ovog pronalaska i obuhvata, npr.,

[0527] (1) kontaktiranje ćelije koja se testira na prisustvo hRSV F proteina sa antitelom protiv hRSV F proteina ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom ovog pronalaska; i

[0528] (2) detekciju antitela ili fragmenta na ili u ćeliji.

[0530] Ako je sâmo antitelo ili fragment detektabilno obeležen, može se direktno detektovati. Alternativno, antitelo ili fragment mogu biti vezani detektabilno obeleženim sekundarnim antitelom koje se detektuje.

[0532] Farmaceutske kompozicije i administracija

[0534] Da bi se pripremili farmaceutske ili sterilne kompozicije antitela protiv F proteina hRSV i fragmenata koji vezuju antigen prema ovom pronalasku (npr. RB1), antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se meša sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijentom. Videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

[0536] [0206] Formulacije terapeutskih i dijagnostičkih sredstava mogu se pripremiti mešanjem sa prihvatljivim nosačima, ekscipijentima ili stabilizatorima u obliku, npr., liofilizovanih prahova, emulzija, vodenih rastvora ili suspenzija (videti, npr., Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY). U jednom izvođenju, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen ovog pronalaska razblaženi su do odgovarajuće koncentracije u histidinskom puferu pH 5-7, pri 1-20 mM, a NaCl ili saharoza (npr. 2-15% (t/z)) se opciono dodaju za toničnost. Dodatna sredstva, kao što su polisorbat 20 ili polisorbat 80, pri 0,01 do 0,10% (t/z), mogu se dodati radi poboljšanja stabilnosti. Reprezentativna formulacija je 10 mM L-histidina, 7% (t/z) saharoze i 0,02% (t/z) polisorbata-80, pH 6,0.

[0538] Toksičnost i terapeutska efikasnost antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen prema ovom pronalasku, administrirani pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvom, mogu se odrediti standardnim farmaceutskim postupcima u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr. za određivanje LD<50>doze smrtonosne za 50% populacije) i ED<50>(doze terapeutski efikasne kod 50% populacije). Odnos doze između toksičnih i terapeutskih efekata je terapeutski indeks (LD<50>/ED<50>). Podaci dobijeni iz ovih testova na ćelijskim kulturama i studija na životinjama mogu se koristiti za formulisanje raspona doziranja za upotrebu kod ljudi. Doza takvih jedinjenja se poželjno nalazi u rasponu koncentracija u cirkulaciji koje uključuju ED<50>sa malom toksičnosti ili bez nje. Doza može da varira u ovom rasponu u zavisnosti od korišćenog oblika doziranja i načina administracije.

[0540] Način administracije može da varira. Putevi primene uključuju oralnu, rektalnu, transmukoznu, crevnu, parenteralnu; intramuskularno, potkožno, intradermalno, intramedularno, intratekalno, direktno intraventrikularno, intraventrikularno, intraventrikularno, intraperitonealno, intranazalno, intraokularno, inhalacijom, insuflacijom, topikalno, kutano, transdermalno ili intraarterijsko. Poželjni načini administracije su intramuskularno, intravenozno i intranazalno.

[0542] U posebnim ostvarenjima, antitela protiv hRSV F proteina ili njihovi antigen-vezujući fragmenti pronalaska (npr. RB1) mogu se administrati invazivnim putem kao što je injekcija. U daljim ostvarenjima pronalaska, antitelo protiv hRSV F proteina ili njegov antigen-vezujući fragment, ili njegov farmaceutsku kompoziciju, administriraju se intravenozno, potkožno, intramuskularno, intraarterijski, intratumoralno ili inhalacijom, aerosolnom isporukom. Administracija neinvazivnim putevima (npr. oralno; na primer, u piluli, kapsuli ili tableti) takođe je u okviru ovog pronalaska.

[0544] [0210] Predmetni pronalazak obezbeđuje sud (npr. plastičnu ili staklenu bočicu, npr. sa poklopcem ili hromatografskom kolonom, šuplju iglu ili cilindar šprica) koji sadrži bilo koje od antitela ili fragmenata koji vezuju antigene pronalaska (npr. RB1) ili njihovu farmaceutsku kompoziciju. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje uređaj za injekciju koji sadrži bilo koje od antitela ili fragmenata koji vezuju antigene pronalaska (npr. RB1) ili njihovu farmaceutsku kompoziciju. Uređaj za injekciju je uređaj koji unosi supstancu u telo pacijenta parenteralnim putem, npr. intramuskularno, potkožno ili intravenozno. Na primer, uređaj za injekciju može biti špric (npr. prethodno napunjen farmaceutskom kompozicijom, kao što je auto-injektor) koji, na primer, uključuje cilindar ili cev za držanje tečnosti koja se ubrizgava (npr. antitelo ili fragment ili njegova farmaceutsk kompozicija), iglu za probijanje kože i/ili krvnih sudova za ubrizgavanje tečnosti; i klip za istiskivanje tečnosti iz cilindra i kroz otvor igle. U jednom izvođenju, uređaj za injekciju koji sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ovog pronalaska ili njegovu farmaceutsku kompoziciju je intravenski (IV) uređaj za injekciju. Takav uređaj sadrži antitelo ili fragment ili njegovu farmaceutsku kompoziciju u kanili ili troaku/igli koja može biti pričvršćena za cev koja može biti pričvršćena za kesu ili rezervoar za držanje tečnosti (npr. fiziološki rastvor; ili laktatnog Ringerovog rastvora koji sadrži NaCl, natrijum laktat, KCl, CaCl<2>i opciono uključujući glukozu) uvedene u telo pacijenta kroz kanilu ili troakar/iglu. Antitelo ili fragment ili njegova farmaceutska kompozicija mogu se, u jednom izvođenju pronalaska, uvesti u uređaj nakon što se troakar i kanila umetnu u venu subjekta i troakar se ukloni iz umetnute kanile. Intravenski (IV) uređaj može, na primer, biti umetnut u perifernu venu (npr. u šaku ili ruku); gornju šuplju venu ili donju šuplju venu, ili unutar desne pretkomore srca (npr. centralni IV); ili u subklavijalnu, unutrašnju jugularnu ili femoralnu venu i, na primer, napreduje prema srcu dok ne stigne do gornje šuplje vene ili desne pretkomore (npr. centralna venska linija). U jednom izvođenju, uređaj za injekciju je autoinjektor; mlazni injektor ili spoljašnja infuziona pumpa. Mlazni injektor koristi uzak mlaz tečnosti pod visokim pritiskom koji prodire kroz epidermu da bi uveo antitelo ili fragment ili njegovu farmaceutsku kompoziciju u telo pacijenta. Spoljašnje infuzione pumpe su medicinski uređaji koji isporučuju antitelo ili fragment ili njegovu farmaceutsku kompoziciju u telo pacijenta u kontrolisanim količinama. Spoljašnje infuzione pumpe mogu biti napajane električno ili mehanički. Različite pumpe rade na različite načine, na primer, špric pumpa drži tečnost u rezervoaru šprica, a pokretni klip kontroliše isporuku tečnosti, elastomerna pumpa drži tečnost u rastegljivom rezervoaru balona, a pritisak elastičnih zidova balona pokreće isporuku tečnosti. U peristaltičkoj pumpi, skup valjaka steže dužinu fleksibilne cevi, gurajući tečnost napred. U višekanalnoj pumpi, tečnosti se mogu isporučivati iz više rezervoara različitim brzinama.

[0545] Farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu se takođe primenjivati pomoću uređaja za hipodermičku injekciju bez igle; kao što su uređaji opisani u US patentima br.

[0546] 6,620,135; 6,096,002; 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 or 4 ,596,556. Takvi uređaji bez igle koji sadrže farmaceutsku kompoziciju takođe su deo ovog pronalaska. Farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu se takođe primenjivati infuzijom. Primeri dobro poznatih implantata i modula za primenu farmaceutskih kompozicija uključuju one opisane u: US patentu br.4,487,603, koji opisuje implantabilnu mikroinfuzijsku pumpu za davanje lekova kontrolisanom brzinom; US patent br. 4,447,233, koji otkriva pumpu za infuziju lekova za isporuku lekova preciznom brzinom infuzije; Američki patent br.4,447,224, koji otkriva implantabilni infuzioni aparat sa promenljivim protokom za kontinuiranu isporuku lekova; Američki patent br. 4,439,196, koji otkriva osmotski sistem za isporuku lekova sa višekomornim odeljcima. Mnogi drugi takvi implantati, sistemi za isporuku i moduli su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti, a oni koji sadrže farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska su u okviru ovog pronalaska.

[0548] Režim primene zavisi od nekoliko faktora, uključujući brzinu obnove terapeutskog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen u serumu ili tkivu, nivo simptoma, imunogenost profilaktičkog/terapeutskog antitela i dostupnost ciljnih ćelija u biološkoj matrici. Poželjno je da režim primene isporučuje dovoljno terapeutskog antitela ili fragmenta da bi se poboljšalo ciljno stanje bolesti, uz istovremeno minimiziranje neželjenih sporednih efekata. Shodno tome, količina isporučenog biološkog leka delimično zavisi od određenog profilaktičkog/terapeutskog antitela i težine stanja koje se leči. Smernice za odabir odgovarajućih doza terapeutskih antitela ili fragmenata su dostupne (videti, npr., Wawrzynczak, (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al., 2003, New Engl. J. Med.348:601-608; Milgrom et al., 1999, New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al., 2001, New Engl. J. Med.

[0549] 344:783-792; Beniaminovitz et al., 2000, New Engl. J. Med.342:613-619; Ghosh et al., 2003, New Engl. J. Med.348:24-32; Lipsky et al., 2000, New Engl. J. Med.343:1594-1602).

[0551] [0213] Odgovarajuću dozu određuje lekar, npr. koristeći parametre ili faktore poznate ili sumnjive u struci da utiču na prevenciju ili lečenje. Generalno, doza počinje sa količinom nešto manjom od optimalne doze i nakon toga se povećava malim koracima dok se ne postigne željeni ili optimalni efekat u odnosu na bilo kakve negativne neželjene efekte. Važne dijagnostičke mere uključuju mere simptoma, npr. upale ili nivoa proizvedenih inflamatornih citokina. Generalno, poželjno je da biološki lek koji će se koristiti bude izveden iz iste vrste kao i životinja koja je ciljana za lečenje, čime se minimizira bilo kakav imuni odgovor na reagens. U slučaju ljudi, na primer, mogu biti poželjna humanizovana i potpuno ljudska antitela.

[0553] Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen opisani ovde (npr. RB1) mogu se dati kontinuiranom infuzijom ili dozama koje se primenjuju, npr. dnevno, 1-7 puta nedeljno, nedeljno, dvonedeljno, mesečno, dvomesečno, kvartalno, polugodišnje, godišnje itd. Doze se mogu dati, npr. intravenozno, subkutano, lokalno, oralno, nazalno, rektalno, intramuskularno, intracerebralno, intraspinalno ili inhalacijom. Ukupna nedeljna doza je generalno najmanje 0,05 µg/kg telesne težine, generalno najmanje 0,2 µg/kg, 0,5 µg/kg, 1 µg/kg, 10 µg/kg, 100 µg/kg, 0,25 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg ili više (videti, npr., Yang, et al., 2003, New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al., 2002, New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al., 1999, J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al., 2003, Cancer Immunol. Immunother.52:151-144). Doze se takođe mogu dati da bi se postigla unapred određena ciljna koncentracija anti-hRSV antitela u serumu subjekta, kao što je 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 µg/ml ili više. U drugim ostvarenjima, anti-hRSV antitelo ovog pronalaska se primenjuje, npr., subkutano ili intravenozno, nedeljno, dvonedeljno, „svake 4 nedelje“, mesečno, dvomesečno ili kvartalno u dozama od 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 ili 2500 mg/subjektu.

[0555] [0215] Kako se ovde koristi, termin „efikasna količina“ odnosi se na količinu anti-hRSV ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen prema pronalasku (npr. RB1) koja je, kada se primenjuje sama ili u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim/profilaktičkim sredstvom na ćeliju, tkivo ili subjekt, efikasna u neutralizaciji RSV i/ili sprečavanju ili izazivanju merljivog poboljšanja jednog ili više simptoma bolesti ili stanja povezanih sa RSV infekcijom. Efikasna doza se dalje odnosi na količinu antitela ili fragmenta dovoljnu da rezultira barem delimičnim sprečavanjem ili ublažavanjem simptoma. Kada se primenjuje na pojedinačni aktivni sastojak koji se primenjuje sam, efikasna doza se odnosi na taj sastojak sam. Kada se primenjuje na kombinaciju, efikasna doza se odnosi na kombinovane količine aktivnih sastojaka koje rezultiraju profilaktičkim ili terapeutskim efektom, bez obzira da li se primenjuju u kombinaciji, serijski ili istovremeno. U određenim ostvarenjima, efikasna količina je količina koja obezbeđuje kliničku ciljnu serumsku koncentraciju od 10 µg/ml - 30 µg/ml tokom 5 meseci. U jednom izvođenju, efikasna količina je ljudska doza koja obezbeđuje ciljnu koncentraciju Ctrough od 10 µg/ml - 30 µg/ml za efikasnost, kako je utvrđeno u standardnim prekliničkim modelima Cotton pacova.

[0557] Kompleti

[0559] Dalje su obezbeđeni kompleti koji sadrže jednu ili više komponenti koje uključuju, ali nisu ograničene na, antitelo protiv hRSV F proteina ili fragment koji vezuje antigen, kao što je ovde objašnjeno (npr. RB1) u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih komponenti, uključujući, ali nisu ograničene na, farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili profilaktičko/terapeutsko sredstvo, kao što je ovde objašnjeno. Antitelo ili fragment i/ili profilaktičko/terapeutsko sredstvo mogu biti formulisani kao čista kompozicija ili u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, u farmaceutskoj kompoziciji.

[0561] U jednom izvođenju, komplet uključuje antitelo protiv hRSV F proteina ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku (npr. RB1) ili njegovu farmaceutsku kompoziciju u jednom kontejneru/posudi za čuvanje (npr. u sterilnoj staklenoj ili plastičnoj bočici) i njegovu farmaceutsku kompoziciju i/ili profilaktičko/terapeutsko sredstvo u drugom kontejneru/ posudi za čuvanje (npr. u sterilnoj staklenoj ili plastičnoj bočici).

[0563] U drugom izvođenju, komplet sadrži kombinaciju pronalaska, uključujući antitelo protiv hRSV F proteina ili njegov fragment koji vezuje antigen (npr. RB1) zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, opciono u kombinaciji sa jednim ili više profilaktičkih/terapeutskih sredstava formulisanih zajedno, opciono, u farmaceutskoj kompoziciji, u jednom, zajedničkom kontejneru/ posudi za čuvanje.

[0565] Ako komplet sadrži farmaceutsku kompoziciju za parenteralnu administraciju subjektu, komplet može da sadrži uređaj za izvođenje takve administracije. Na primer, komplet može da sadrži jednu ili više hipodermičnih igala ili drugih uređaja za injekcije kao što je gore objašnjeno.

[0567] [0220] Komplet može da sadrži uputstvo za upotrebu koje sadrži informacije o farmaceutskim kompozicijama i doznim oblicima u kompletu. Generalno, takve informacije pomažu pacijentima i lekarima da efikasno i bezbedno koriste priložene farmaceutske kompozicije i dozne oblike. Na primer, sledeće informacije u vezi sa kombinacijom pronalaska mogu biti date u umetku: farmakokinetika, farmakodinamika, kliničke studije, parametri efikasnosti, indikacije i upotreba, kontraindikacije, upozorenja, mere predostrožnosti, neželjene reakcije, predoziranje, pravilno doziranje i primena, način isporuke, odgovarajući uslovi skladištenja, reference, informacije proizvođača/distributera i informacije o patentu.

[0569] Kompleti za detekciju i profilaktički/terapeutski kompleti

[0571] Radi lakšeg snalaženja, anti-hRSV antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment pronalaska (npr. RB1) može se obezbediti u kompletu, tj. upakovanoj kombinaciji reagensa u unapred određenim količinama sa uputstvima za izvođenje dijagnostičkog ili detekcionog testa. Tamo gde je antitelo ili fragment obeležen enzimom, komplet će sadržati supstrate i kofaktore potrebne enzimu (npr. prekursor supstrata koji obezbeđuje detektabilni hromofor ili fluorofor). Pored toga, mogu biti uključeni i drugi aditivi kao što su stabilizatori, puferi (npr. pufer za blokiranje ili pufer za lizu) i slično. Relativne količine različitih reagensa mogu se značajno menjati kako bi se obezbedile koncentracije reagensa u rastvoru koje značajno optimizuju osetljivost testa. Posebno, reagensi se mogu obezbediti kao suvi prahovi, obično liofilizovani, uključujući ekscipijente koji će nakon rastvaranja obezbediti rastvor reagensa odgovarajuće koncentracije.

[0573] Takođe su obezbeđeni dijagnostički ili detekcioni reagensi i kompleti koji sadrže jedan ili više takvih reagensa za upotrebu u različitim testovima detekcije, uključujući, na primer, imunotestove kao što je ELISA (sendvič tipa ili kompetitivni format). Komponente kompleta mogu biti prethodno pričvršćene za čvrstu podlogu ili se mogu naneti na površinu čvrste podloge kada se komplet koristi. U nekim izvođenjima, sredstvo za generisanje signala može biti prethodno povezano sa antitelom ili fragmentom pronalaska ili može zahtevati kombinaciju sa jednom ili više komponenti, npr. puferima, konjugatima antitela i enzima, enzimskim supstratima ili slično, pre upotrebe. Kompleti takođe mogu da sadrže dodatne reagense, npr. blokirajuće reagense za smanjenje nespecifičnog vezivanja za površinu čvrste faze, reagense za ispiranje, enzimske supstrate i slično. Površina čvrste faze može biti u obliku cevčice, perle, mikrotitar ploče, mikrosfere ili drugih materijala pogodnih za imobilizaciju proteina, peptida ili polipeptida. U posebnim aspektima, enzim koji katalizuje formiranje hemiluminescentnog ili hromogenog proizvoda ili redukciju hemiluminescentnog ili hromogenog supstrata je komponenta sredstva za generisanje signala. Takvi enzimi su dobro poznati u struci. Kompleti mogu da sadrže bilo koji od sredstava za hvatanje i reagensa za detekciju opisanih ovde. Opciono, komplet može takođe da sadrži uputstva za sprovođenje metoda pronalaska.

[0575] [0223] Takođe je obezbeđen komplet koji sadrži antitelo protiv hRSV F proteina ili njegov fragment koji vezuje antigen upakovan u kontejner, kao što je bočica ili bočica, i dalje sadrži etiketu pričvršćenu za ili upakovanu sa kontejnerom, pri čemu etiketa opisuje sadržaj kontejnera i obezbeđuje indikacije i/ili uputstva u vezi sa upotrebom sadržaja kontejnera za sprečavanje/lečenje jednog ili više bolesnih stanja kao što je ovde opisano.

[0577] U jednom aspektu, komplet je namenjen za prevenciju ili lečenje bolesti/stanja povezanih sa RSV infekcijom i sadrži antitelo protiv hRSV F proteina ili njegov fragment koji vezuje antigen i dodatni profilaktički/terapeutski agens ili vakcinu. Komplet može opciono dodatno da sadrži špric za parenteralnu, npr. intravenoznu, primenu. U drugom aspektu, komplet sadrži antitelo protiv hRSV F proteina ili njegov fragment koji vezuje antigen i etiketu pričvršćenu za ili upakovanu sa kontejnerom koja opisuje upotrebu antitela ili fragmenta sa vakcinom ili dodatnim profilaktičkim/terapeutskim sredstvom. U još jednom aspektu, komplet sadrži vakcinu ili dodatno profilaktičko/terapeutsko sredstvo i etiketu pričvršćenu za ili upakovanu sa kontejnerom koja opisuje upotrebu vakcine ili dodatnog profilaktičkog/terapeutskog sredstva sa antitelom ili fragmentom protiv hRSV F proteina. U određenim ostvarenjima, antitelo protiv hRSV F proteina i vakcina ili dodatno profilaktičko/terapeutsko sredstvo su u odvojenim bočicama ili su kombinovani zajedno u istoj farmaceutskoj kompoziciji.

[0579] Za kombinovanu profilaksu ili terapiju, istovremena primena dva profilaktička/terapeutska sredstva ne zahteva da se sredstva administriraju istovremeno ili istim putem, sve dok postoji preklapanje u vremenskom periodu tokom kojeg sredstva ispoljavaju svoj profilaktički/terapeutski efekat. Razmatra se istovremena ili sekvencijalna administracija, kao i primena različitim danima ili nedeljama.

[0581] [0226] Profilaktički/terapeutski i detekcioni kompleti opisani ovde mogu se takođe pripremiti tako da sadrže najmanje jedno od antitela, peptida, fragmenta koji vezuje antigen ili polinukleotida opisanih ovde i uputstva za upotrebu kompozicije kao reagensa za detekciju ili profilaktičkog/terapeutskog sredstva. Kontejneri za upotrebu u takvim kompletima mogu tipično da sadrže najmanje jednu bočicu, epruvetu, tikvicu, bočicu, špric ili drugu pogodnu posudu, u koju se može staviti jedna ili više kompozicija za detekciju i/ili profilaktičku/terapeutsku kompoziciju, i poželjno na odgovarajući način alikvotirati. Kada je takođe obezbeđeno drugo profilaktičko/terapeutsko sredstvo, komplet može takođe da sadrži drugu posebnu posudu u koju se može staviti ova druga kompozicija za detekciju i/ili profilaktičku/terapeutsku kompoziciju. Alternativno, više jedinjenja može se pripremiti u jednoj farmaceutskoj kompoziciji i može biti upakovano u jedno sredstvo za pakovanje, kao što je bočica, tikvica, špric, bočica ili drugo pogodno pojedinačno sredstvo za pakovanje. Kompleti opisani ovde će takođe tipično uključivati sredstvo za držanje bočice(a) u zatvorenom prostoru za komercijalnu prodaju, kao što su, npr., kontejneri za brizganje ili duvanje u kojima se čuvaju željene bočice. Kada je u kompletu uključena radioaktivna oznaka, hromogena, fluorogena ili druga vrsta detektabilne oznake ili sredstva za detekciju, sredstvo za obeležavanje može biti obezbeđeno ili u istoj posudi kao i sama detekcijska ili profilaktička/terapeutska kompozicija, ili se alternativno može staviti u drugu posebnu posudu u koju se ova druga kompozicija može staviti i odgovarajuće alikvotirati. Alternativno, reagens za detekciju i oznaka mogu se pripremiti u jednoj posudi, a u većini slučajeva, komplet će takođe obično uključivati sredstvo za držanje bočice(a) u zatvorenom prostoru za komercijalnu prodaju i/ili pogodno pakovanje i isporuku.

[0583] Takođe je obezbeđen uređaj ili aparat za sprovođenje ovde opisanih metoda detekcije ili praćenja. Takav aparat može uključivati komoru ili cev u koju se može uneti uzorak, sistem za rukovanje tečnostima koji opciono uključuje ventile ili pumpe za usmeravanje protoka uzorka kroz uređaj, opciono filtere za odvajanje plazme ili seruma od krvi, komore za mešanje za dodavanje sredstava za hvatanje ili reagensa za detekciju i opciono uređaj za detekciju za detekciju količine detektabilne oznake vezane za imunokompleks sredstva za hvatanje. Protok uzorka može biti pasivan (npr. kapilarnim, hidrostatičkim ili drugim silama koje ne zahtevaju dalju manipulaciju uređajem nakon što se uzorak nanese) ili aktivan (npr. primenom sile generisane putem mehaničkih pumpi, elektroosmotskih pumpi, centrifugalne sile ili povećanog vazdušnog pritiska), ili kombinacijom aktivnih i pasivnih sila.

[0585] U daljim otelotvorenjima, takođe je obezbeđen procesor, računarski čitljiva memorija i rutina sačuvana na računarski čitljivoj memoriji i prilagođena za izvršavanje na procesoru radi obavljanja bilo koje od ovde opisanih metoda. Primeri odgovarajućih računarskih sistema, okruženja i/ili konfiguracija uključuju lične računare, serverske računare, ručne ili laptop uređaje, multiprocesorske sisteme, sisteme zasnovane na mikroprocesorima, set-top boksove, programabilnu potrošačku elektroniku, mrežne (PC) računare, miniračunare, mejnfrejm računare, distribuirana računarska okruženja koja uključuju bilo koji od gore navedenih sistema ili uređaja, ili bilo koje druge sisteme poznate u struci.

[0587] OPŠTE METODE

[0589] [0229] Opisane su standardne metode u molekularnoj biologiji Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982, 1989 2nd Edition, and 2001 3rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Standard methods also appear in Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, koji opisuje kloniranje u bakterijskim ćelijama i DNK mutagenezu (tom 1), kloniranje u ćelijama sisara i kvasca (tom 2), glikokonjugate i ekspresiju proteina (tom 3) i bioinformatiku (tom 4).

[0591] Opisane su metode za prečišćavanje proteina, uključujući imunoprecipitaciju, hromatografiju, elektroforezu, centrifugiranje i kristalizaciju (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). Opisane su hemijska analiza, hemijska modifikacija, posttranslaciona modifikacija, proizvodnja fuzionih proteina, glikozilacija proteina (videti, npr., Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol.2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol.3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp.16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp.45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391). Opisane su proizvodnja, prečišćavanje i fragmentacija poliklonalnih i monoklonalnih antitela (Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, supra). Standardne tehnike za karakterizaciju interakcija ligand/receptor su dostupne (videti, npr., Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol.4, John Wiley, Inc., New York).

[0593] Opisana su jednolančana antitela i dijatela (videti, npr., Malecki et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrath et al., 2001, J. Biol. Chem.276:7346-7350; Desmyter et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson and Kortt, 1999, J. Immunol. Methods 231:177-189; and U.S. Pat. No. 4,946,778). Obezbeđena su bifunkcionalna antitela (videti, npr., Mack, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkel, et al. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal, et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennan, et al. (1985) Science 229:81-83; Raso, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker, et al. (1991) EMBO J.10:3655-3659; i U.S. Pat. Nos.5,932,448, 5,532,210, i 6,129,914).

[0594] Takođe su obezbeđena bispecifična antitela (videti, npr., Azzoni et al. (1998) J. Immunol. 161:3493; Kita et al. (1999) J. Immunol. 162:6901; Merchant et al. (2000) J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng et al. (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propst et al. (2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875).

[0596] Antitela mogu biti konjugovana, npr., sa malim molekulima lekova, enzimima, lipozomima, polietilen glikolom (PEG). Antitela su korisna za terapijske, dijagnostičke, komplet ili druge svrhe i uključuju antitela spregnuta, npr., sa bojama, radioizotopima, enzimima ili metalima, npr. koloidnim zlatom (videti, npr., Le Doussal et al. (1991) J. Immunol.

[0597] 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts et al. (2002) J. Immunol.168:883-889).

[0599] Dostupne su metode za protočnu citometriju, uključujući sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS) (videti, npr., Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Dostupni su fluorescentni reagensi pogodni za modifikovanje nukleinskih kiselina, uključujući prajmere i sonde nukleinskih kiselina, polipeptide i antitela, za upotrebu, npr., kao dijagnostički reagensi (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

[0601] Opisane su standardne metode histologije imunog sistema (videti, npr., Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY).

[0603] Dostupni su softverski paketi i baze podataka za određivanje, npr., antigenih fragmenata, liderskih sekvenci, savijanja proteina, funkcionalnih domena, mesta glikozilacije i poravnanja sekvenci (videti, npr., GenBank, Vector NTI<®>Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher<®>(TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res.14:4683-4690).

[0605] PRIMERI

[0606] Primer 1: Identifikacija potpuno ljudskog antitela za neutralizaciju RSV

[0608] Da bi se identifikovala snažna antitela za neutralizaciju HRSV-a, serum je dobijen od donora uz informisani pristanak i testiran na sposobnost neutralizacije virusa HRSV-a in vitro. Za test neutralizacije, uzorci seruma su prvo serijski razblaženi, a zatim inkubirani sa 600 pfu soja hRSV-A koji ekspresuje pojačani zeleni fluorescentni protein (RSV-GFP). RSV-GFP je pomešan 1:1 sa razblaženjima seruma u ukupnoj zapremini od 200 µl po ležištu u pločama sa U-dnom od 96 ležišta na 37°C tokom 1 sata.100 µl smeše po ležištu je zatim preneto na ploče zasejane ćelijama HEp-2 (15.000 ćelija po ležištu). Ploče su skenirane na acumen® Cellista (TTP LabTech, Cambridge, MA) i podaci su izvezeni kao broj GFP događaja i ukupni intenzitet fluorescencije po ležištu. Vrednosti NT50 su izračunate korišćenjem programa GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) fitovanjem krive sa četiri parametra. Titri vezivanja ELISA za RSV pre-F i post-F proteine su izvršeni na sledeći način. Nunc C96 Maxisorp® Nunc-Immuno™ ploče (Thermo Scientific, Inc.) su obložene sa 50 µl po ležištu hRSV pre-F (videti McLellan et al., 2013, Science 342:592) ili post-F proteina (post-fuzioni F LZF21 protein se sastoji od wt F ektodomena bez fuzionog peptida (videti McLellen et al., 2011, J. Virol 85:7788)) u koncentraciji od 1 µg/ml u PBS na 4°C preko noći. Ploče su isprane sa PBS/Tween 20, a zatim blokirane sa 3% obranog mleka u PBS. Nakon toga, dodato je 50 µl serijski razblaženih uzoraka seruma po ležištu i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 90 minuta. Ploče su isprane i dodato je HRP-konjugovano kozje anti-ljudsko IgG (SouthernBiotech, Birmingham, AL) u razblaženju 1:2.000. Jedan sat kasnije, ploče su isprane i razvijene rastvorom SuperBlu Turbo TMB (ViroLabs, Inc., Sterling, VA). Očitavanja OD450nm dobijena su korišćenjem Wallac 1420 VICTOR2™ multilabel brojača (Perkin Elmer, Waltham, MA). EC50 vrednosti su izračunate korišćenjem GraphPad Prism 6 fitovanjem krive sa četiri parametra. Podgrupa donora koja je pokazala visoke titre neutralizacije i vezivanja HRSV pozvana je da nabavi veće zapremine krvi za generisanje PBMC. Pripremu PBMC je izvršio komercijalni snabdevač, a kupljene PBMC su čuvane u tečnom azotu do dalje upotrebe.

[0610] PBMC od jednog subjekta pokazale su dobre titre neutralizacije i imale su takođe najviše titre u ELISA testu vezivanja za post-fuzijski F protein, kao i da su bile jedno od elitnih veziva za pre-fuzioni F protein (podaci nisu prikazani). Stoga su PBMC ovog donora odabrane za izolaciju post-F specifičnih memorijskih B-ćelija pomoću FACS sortiranja.

[0611] Biotinilovani trimerni postfuzioni F protein (LZF21) je pripremljen biotinilacijom LZF21 (McLellen et al., 2011, J. Virol 85:7788) korišćenjem E-Z Link™ Sulfo-NHS-LC biotinilacionog kompleta (Life Technologies, Grand Ajland, Njujork) prema uputstvima proizvođača. Protein LZF21 se sastoji od ektodomena F proteina divljeg tipa bez fuzionog peptida (McLellen et al., 2011, J. Virol 85:7788). Murin hibridom 4D7 specifičan za fuzioni F protein (4D7 je mišji hibridom koji je generisan imunizacijom Balb/c miševa RSV A2 virusom). Miševi Balb/c su imunizovani dva puta, intraperitonealno, virusom RSV A2 i busterovani tri dana pre fuzije, koristeći 20 µg prečišćenog RSV A2 (Advanced Biotechnologies, Inc., Kolumbija, Merilend), intravenskom injekcijom. Slezina je sakupljena i splenociti su fuzirani sa SP2/0 ćelijama mijeloma korišćenjem polietilen glikola. Ćelije su dodate u Medijum D (StemCell Technologies Inc., Vankuver, Britanska Kolumbija), posejane u kvadratne Petrijeve šolje dimenzija 245 mm x 245 mm i inkubirane na 37°C, 5% CO<2>tokom 2 nedelje. Pojedinačne kolonije su sakupljene pomoću ClonePix (Genetix), prebačene na ploče sa 96 ležišta i inkubirane kao gore tokom 1 nedelje. Supernatanti su zatim skrinovani na anti-RSV aktivnost pomoću ELISA testa na prečišćen RSV A2. Pozitivni klonovi, uključujući 4D7, su prošireni i dalje subklonirani ograničavajućim razblaživanjem. Subklonovi su skrinirani kao što je gore opisano i identifikovan je 4D7-8 i korišćen za optimizaciju bojenja LZF21-biotina na memorijske B-ćelije pomoću FACS-a (podaci nisu prikazani). Kroz ove eksperimente optimizacije, utvrđeno je da je 1,5 µg/ml LZF21-biotina najbolja koncentracija za bojenje post-F specifičnih memorijskih B-ćelija. Specifičnost reakcije bojenja je demonstrirana korišćenjem irelevantnog mišjeg hibridoma kao negativne kontrole i konkurencijom vezivanja sa 100-1000X viškom neobeleženog LZF21.

[0613] Antigen-specifične memorijske B-ćelije su označene kao CD3-CD19<+>IgG<+>LZF21<+>. Ove ćelije su sortirane u ploče sa 96 ležišta (jedna ćelija/ležištu) koje sadrže ćelijsku liniju HEK293 koja ekspresuje CD40 ligand (napravljenu korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije) i IL-21 (Sino Biological Inc., Severni Vels, Pensilvanija). Od 30 sortiranih uzoraka, supernatant iz 6 bunara je pokazao vezivanje za post-F protein u ELISA testu (izvedenom kao što je gore opisano). Ovi uzorci su se takođe vezali za pre-F protein (podaci nisu prikazani). Ovih šest uzoraka je zatim testirano u testu neutralizacije, kao što je gore opisano, bez razblaživanja. Prisustvo aktivnosti neutralizacije je određeno na osnovu smanjenja GFP događaja. Među šest uzoraka, dva od njih (označena kao RB1 i RB11) su pokazala potpunu neutralizaciju soja HRSV-A (videti Tabelu 3).

[0615] Tabela 3

[0616]

[0619] Ekstrakcija RNK i RT-PCT za kulturu jednostruko sortiranih memorijskih B ćelija

[0620] Deo 1:

[0622] RNK sa ploče sa 96-ležišta iz RB1 pogođenog lizata je ekstrahovana korišćenjem RNeasy® Micro Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA) prema uputstvu proizvođača. Koncentracija RNK je određena pomoću NanoDrop<™>2000C (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE) pod UV 260 nm. Ekstrahovana RNK iz RB1 ležišta je korišćena kao templat u RT-PCR amplifikaciji gena teškog i lakog lanca antitela korišćenjem prajmernih sekvenci koristeći sekvence iz lider sekvence (unapred) i C' kraja IgG JH, Kapa konstantnog regiona ili Lambda konstantnog regiona (unazad).

[0624] OneStep RT-PCR komplet (Qiagen Inc, Valencia, CA) je korišćen prema uputstvima proizvođača za amplifikaciju sekvenci antitela. Uslovi PCR-a bili su sledeći: 50°C tokom 30 minuta, 95°C tokom 15 minuta, [94°C tokom 30 sekundi, 55°C tokom 30 sekundi, 72°C tokom 1 minuta] x 40, 72°C tokom 10 minuta i zadržavanje na temperaturi od 4°C.

[0625] RT-PCR proizvod je direktno korišćen kao šablon za nested PCR (ugnježdeni ili umetnuti PCR).

[0627] Deo 2: Nested PCR

[0629] RT-PCR proizvodi su korišćeni kao šabloni u nested PCR-u za amplifikaciju varijabilnih regiona antitela pomoću DNK polimeraze pfx50 (Invitrogen, kataloški broj: 12355-012). Dizajn za nested PCR prajmere je bio zasnovan na sekvencama germinativne linije regiona okvira 1 varijabilnih regiona teškog i lakog lanca ljudskog IgG.

[0631] 1 µl RT-PCR proizvoda je pomešan sa 2,5 µl 10X PCR pufera, 2,5 µl 10X PCRX pojačivača (Invitrogen), 0,5 µl dNTP mešavine, 0,5 µl bazena direktnih prajmera (po 10 µM), 0,5 µl reverznog prajmera (10 µM), 0,5 µl pfx50 DNK polimeraze i 17 µl vode. Uslovi nested PCR su bili: 2 min na 94°C, 10 ciklusa od 94°C tokom 30 sekundi, 50°C tokom 30 sekundi, 68°C tokom 1 minuta, nakon čega je sledilo 30 ciklusa od 94°C tokom 30 sekundi, 60°C tokom 30 sekundi, 68°C tokom 1 minuta, zatim elongacija od 7 minuta na 68°C, nakon čega je sledilo zadržavanje na 4°C za kratkotrajno skladištenje.

[0633] RB1 nested PCR proizvodi VH i VK ili VH i VL amplifikovani PCR proizvodi korišćeni su kao šablon u preklapajućoj PCR sa specifičnim linkerima za spajanje gena lakih i teških lanaca antitela zajedno kako bi se olakšalo sledeće korak kloniranja infuzijom.

[0635] Deo 3. Preklapajuća PCR i kloniranje infuzijom

[0637] U ovoj reakciji je korišćena pfx50 DNK polimeraza (Invitrogen). Prajmeri za napred i reverzni prajmeri su dizajnirani da olakšaju infuziono kloniranje preklapajućih PCR proizvoda u vektor za kloniranje. 1 µl nested PCR proizvoda teškog lanca, 1 µl nested PCR proizvoda lakog lanca i 1 µl linkera su pomešani sa 5 µl 10x PCR pufera, 5 µl 10x PCRX pojačivača, 1 µl dNTP mešavine, 1 µl unapred prajmera (10 µM), 1 µl obrnutog prajmera (10 µM), 1 µl pfx50 DNK polimeraze i 33 µl vode.

[0639] Uslovi PCR su bili sledeći: 94°C tokom 2 minuta, [94°C tokom 30 sekundi, 60°C tokom 30 sekundi, 68°C tokom 2 minuta] x 10, [94°C tokom 30 sekundi, 65°C tokom 30 sekundi, 68°C tokom 2 minuta] x 30, 68°C tokom 7 minuta, zadržavanje na 4°C.

[0641] [0249] Preklapajući PCR proizvodi su prečišćeni na agaroznom gelu za infuziono kloniranje (dobijen je RB1 VH+VK preklapajući PCR proizvod od oko 1,2 kb). RB1 VH+VK preklapajući PCR proizvodi su klonirani u vektor pMab11Exp2 (sa OmpA liderskom sekvencom za ekspresiju lakog lanca, sa PelB liderskom sekvencom za ekspresiju teškog lanca) primenom infuzionog kloniranja. Korišćen je Infusion HD® kloning komplet (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) i praćena su uputstva proizvođača. Transformanti su odabrani i poslati kompaniji GeneWiz, Inc. (South Plainfield, NJ) na sekvenciranje.

[0643] Rezultati sekvenciranja su analizirani pomoću Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).

[0645] Nukleotidne i aminokiselinske sekvence RB1 su prikazane u Tabeli 7 (aminokiselinske sekvence varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca RB1 izolovane od pacijenta predstavljene su SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 8, respektivno). Zbog dizajna Jh reverznih prajmera koji imaju nukleotidnu promenu, izoleucin prisutan u prirodnoj sekvenci na poziciji 125 je promenjen u treonin u eksprimiranom proteinu (rezultujući varijabilni RB1 teški lanac je predstavljen SEQ ID NO: 7). Aminokiselinske sekvence gena varijabilnog domena teškog i lakog lanca RB1 antitela poslate su kompaniji GenScript USA, Inc. (Piscataway, NJ) radi optimizacije kodona i konverzije humanog IgG1 i prolazne ekspresije i proizvodnje CHO. Sintetizovane DNK su subklonirane u pTT5 vektor za ekspresiju ćelija CHO-3E7. Rekombinantni plazmidi koji kodiraju teške i lake lance svakog antitela su prolazno kotransfektovani u ćelijske kulture CHO-3E7. Supernatanti ćelijske kulture sakupljeni 6. dana korišćeni su za prečišćavanje kroz kolonu sa proteinom A. Prečišćeni RB1 humani IgG1 korišćen je u testu neutralizacije i drugim eksperimentima karakterizacije kao što je opisano u Primeru 2.

[0647] Primer 2: Karakterizacija anti-hRSV antitela

[0649] RB1 se vezao i za pre-F i za post-fuzioni F protein u ELISA testu kao što je opisano u Primeru 1 sa EC50 u rasponu od 1-10 ng/ml, dok se D25 antitelo (videti Kwakkenbos et al., 2010, Nature Medicine 16:123-128) preferencijalno vezivalo za pre-fuzioni F. Videti slike 1A-B.

[0652]

[0653] Neutralizacija za RB1, RB 11 i neka referentna antitela objavljena u literaturi (D25, palivizumb, pune dužine [antitelo D25 je napravljeno interno na osnovu objavljene sekvence, a SYNAGIS® (palivizumb) je kupljen od Myoderm, Norristown, PA]) je upoređena kod soja RSV A Long (ATCC broj VR-26™) i soja RSV B Washington 18537 (ATCC broj VR-1580™). Testirani uzorci su tri puta serijski razblaženi u EMEM-u dopunjenom sa 2% toplotno inaktiviranog FBS-a, za jedanaest tačaka razblaženja. Serijski razblaženi uzorci su zatim pomešani sa jednakim zapreminama EMEM-a dopunjenog sa 2% toplotno inaktiviranog FBS-a koji sadrži 100 pfu/bunarčiću sojeva RSV A ili B. Nakon inkubacije na 37°C tokom 1 sata, 100 µl HEp-2 ćelija u koncentraciji od 1,5x105 ćelija/ml je preneto na ploče sa 96 ležišta koje sadrže smešu virus/antitelo. 3 dana nakon infekcije, ćelije su jednom isprane sa PBS, a zatim fiksirane u 80% acetonu tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Smeša RSV F (mAb143-F3-B138) i RSV N (34C9) specifičnih mišjih mAb (dobijenih interno) je dodata na ploče i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane sa PBS/0,05% Tween 20 i biotinilisani konjski anti-mišji IgG je dodat na ploče i inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane sa PBS/0,05% Tween. Infracrvena boja - streptavidin je korišćena za detekciju specifičnog signala RSV, a dve ćelijske boje za normalizaciju testa su dodate na ploče sa 96 ležišta i inkubirane 1 sat u mraku. Nakon 1 sata inkubacije, ploče su isprane, sušene na vazduhu 20 minuta u mraku i očitane na Licor Aerius® automatizovanom sistemu za snimanje koristeći 700-kanalni laser za normalizaciju ćelija i 800-kanalni laser za detekciju specifičnog signala RSV. Izračunati su odnosi 800/700 i procenat neutralizacije, a vrednosti IC<50>su određene pomoću krive sa četiri parametra u GraphPad-u.

[0655] RB1 je bio u stanju da neutrališe sojeve RSV-A i RSV-B sa jednakom snagom (IC<50>od 1-5 ng/ml). RB1 je takođe pokazao superiornu neutralizaciju protiv RSV-a u poređenju sa referentnim antitelima. Videti slike 2A-B i Tabelu 4.

[0657] Tabela 4: Jačina vezivanja i neutralizacije RB1 u poređenju sa referentnim antitelima

[0658]

[0661] Određivanje afiniteta za vezivanje RB1 za pre- i post-fuzioni F protein: Kinetička aktivnost vezivanja antitela RB1 protiv humanog RSV F proteina (napravljenog kao što je opisano u Primeru 1) merena je površinskom plazmonskom rezonancom korišćenjem Biacore T200 sistema (Biacore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Približno 5000 RU anti-mišjeg IgG, GE Healthcare kataloški broj BR-1008-38, ili približno 13.000 RU kozjeg anti-pacovskog IgG Fc gama, specifičnog za fragment, Jackson ImmunoResearch kataloški broj 112-006-071, imobilisano je putem hemije aminskog kuplovanja na senzorski čip serije S CM5, kataloški broj BR-1005-30.

[0663] [0256] Senzogrami vezivanja sa pozadinskim oduzimanjem korišćeni su za analizu konstante brzine asocijacije (k<a>) i disocijacije (k<d>), i ravnotežne konstante disocijacije K<D>. Dobijeni skupovi podataka su fitovani sa 1:1 Lengmirovim modelom vezivanja korišćenjem softvera za evaluaciju Biacore T200 (verzija 2.0). Tabela 5 sumira afinitete antitela protiv ljudskog RSV F proteina prema prefuzionim i post-fuzionim oblicima RSV F proteina.

[0665] Tabela 5: Merenje afiniteta za RB1 prema RSV prefuzionom F i postfuzinom F pomoću BIAcore

[0667]

[0670] RB1 veoma snažno vezuje pre-fuzioni F proteina sa Kd od ~31 pM. Kd za post-fuziono vezivanje bio je znatno niži i iznosio je 0,41 nM. Kd za D25, kako je navedeno u međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO2014121021 A1, bio je 57 pM. Takođe, antitelo RB1 ostaje duže na prefuzionom F proteinu nego na postfuzionom, što se vidi sa sporijim brzinama oslobađanja od 1,4 x 10<-4>u poređenju sa post-fuzionim F proteinom.

[0672] Primer 3: Mapiranje epitopa RB1 antitela

[0674] Epitop za vezivanje RB1 na fuzionom F proteinu je mapiran eksperimentom mutageneze skeniranjem alaninom. Mapiranje epitopa je izvršeno mutagenezom sačmarkom u Integral Molecular kao što je opisano. (Davidson i Doranz, 2014, Immunology 143(1): 13-20). Da bi se konstruisala biblioteka za mutagenezu metodom „sačmar“, vektor ekspresije proteina RSV-F je mutagenizovan da bi se stvorila biblioteka klonova, od kojih svaki predstavlja pojedinačni tačkasti mutant i kumulativno pokriva sve ostatke u proteinu. Biblioteke su konstruisane korišćenjem mutageneze skeniranja alanina, koja obezbeđuje kontrolisaniji metod definisanja doprinosa bočnih lanaca svakog ostatka. Koristeći poluautomatizovane robotske protokole, svaki mutirani plazmid je pojedinačno kloniran, sekvencioniran, minipripremljen i raspoređen u formatu mikroploče sa 384 ležišta za ponovljene transfekcije, ekspresije i testove vezivanja antitela u ljudskim ćelijama. Biblioteka mutanata skeniranja alanina je testirana u odnosu na RB1 zbog gubitka vezivanja antitela. Dva ostatka, arginin-429 i izoleucin-432, identifikovana su kao kritična za vezivanje RB1. Videti dole i sliku 3A. RB1 izgleda da je monoklonsko antitelo mesta IV (slično 101F) i u literaturi je objavljeno da se antitela koja se vezuju za mesto IV vezuju i pre fuzije i posle fuzije F.

[0675] Reaktivnost vezivanja ( % WT)

[0677] Mutacij RB1 Mab RB1 Fa D25 MAb

[0680] R429A 33,1 (27) 5,1 (4) 385,0 (13)

[0683] I432A

39,7 (39)

3,6 (7)

327,8 (161)

[0685] Dalje smo kokristalizovali RB1 Fab sa prefuzijskim F proteinom kako bismo bolje razumeli epitop vezivanja. Podaci difrakcije su prikupljeni iz kristala na 3,4-3,5 Å. RB1 antitelo se vezuje za prefuzijski F protein kroz interakcije sa CDR petljama i teškog i lakog lanca. CDR3 petlja lakog lanca interaguje sa bočnim lancem Arg 429 kroz formiranje dve vodonične veze između karbonilnih kiseonika Phe 91 i Leu 92 i gvanidino azota Arg 429. Takođe na lakom lancu, Asp 50 i Glu 55 na CDR2 petlji su pozicionirani tako da formiraju vodonične veze sa Asn 426 i Lys 445 RSV. Opsežne interakcije se ostvaruju kroz CDR3 petlju teškog lanca RB1, pri čemu Tyr 104 i Tyr 110 formiraju površinu za van der Valsovu interakciju sa Ile 432 na RSV. Lys 433 RSV-a formira vodoničnu vezu sa Asn 107 CDR3 petlje. Iz kristalne strukture, laki lanac RB1 se takođe pakuje protiv Glu 161 i Ser 182 ili susednog monomera RSV prefuzionog trimera.

[0687] Epitop za vezivanje koji je identifikovan za RB1 je visoko konzerviran među 944 od 946 F proteinskih sekvenci prijavljenih u literaturi. Ovo sugeriše da se očekuje da će otpornost na antitela na ovaj region biti niska.

[0689] Primer 4: Anti-RSVA aktivnost RSV antitela na modelu životinja

[0691] RB1 antitelo je upoređeno sa D25 i palivizumbom radi pružanja zaštite u modelu izazivanja Cotton pacova. Studija je uključivala palivizumb, D25 i RB1 antitela data u dozi od 2,5 mg/k i serijski razblažena 10 puta do 0,25 mg/mk. U ovom modelu pasivne imunoterapije, Cotton pacovima su davani RB1, D25 ili palivizumb u različitim koncentracijama u d0 i dan kasnije su izloženi sa 10<5>pfu RSV. Titri izazvanog virusa RSV u nosu i plućima su mereni četiri dana nakon izazivanja i korišćeni su za određivanje oslobađanja virusa putem testa plakova.

[0693] Cotton pacov: Najmanje pet Cotton pacova (Sigmodon hispidus), starih 3-7 nedelja sa prosečnom telesnom težinom od približno 100 grama, nabavljeni su od SAGE Labs (Boyertown, PA). Konvencionalna hrana za glodare i voda su obezbeđeni ad libitum.

[0694] Reagensi za antitela: Palivizumb 100 mg liofilizovan (Myoderm, Norristown, PA) je formulisan u vodi u koncentraciji od 100 mg/ml. Ostala antitela su eksprimovana i prečišćena u laboratoriji.

[0696] Formulacije reagensa za antitela: Puferi za formulaciju bili su specifični za svako antitelo kako bi se stabilizovali proteini i sprečilo taloženje. Formulacije su bile sledeće: RB1 i D25 su razblaženi u 1x fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru, pH 7,2. Palivizumb je formulisan prema preporuci proizvođača rastvaranjem u destilovanoj H<2>O koja bi efikasno puferovala protein u 25 mM histidinu i 1,3 mM glicinu pH 6,0.

[0698] Priprema rastvora za doziranje, administraciju i analize:

[0700] Pet životinja je nasumično izmereno da bi se odredila prosečna težina korišćenih kohorti. Formulacije su pripremljene oko jedan sat pre primene kod životinja. Zamrznute zalihe antitela su odmrznute na vlažnom ledu za jedno odmrzavanje. Svako antitelo je razblaženo do odgovarajuće koncentracije doze za isporuku svakoj grupi. Na dan 0 (početak studije) životinje koje su nasumično raspoređene u svaku grupu su blago sedirane sa 1-4% izofluranskom anestezijom i primenjeno im je 0,1 ml u desni kvadriceps intramuskularno pomoću šprica i igle od 26G. Životinje su se oporavile od efekata sedacije u roku od dva minuta. Oko 24 sata kasnije (+/- 2 sata), pamučni pacovi su sedirani sa 1-4% izofluranom, iskrvareni su preko retroorbitalnog pleksusa, a zatim su im odmah kroz nozdrve dato 0,1 ml 1x10<5.5>pfu RSV A2 ili RSV B virusa Washington divljeg tipa u medijumu Williams E. Četiri dana nakon inokulacije, životinje su žrtvovane inhalacijom CO<2>, a pluća (levi režnjevi) i nosne školjke su uklonjene i homogenizovane u 10 zapremina Hanksovog uravnoteženog rastvora soli (Hanks Balanced Salt Solution , Lonza) koji sadrži saharozno-fosfatno-glutaminski pufer (SPG) na vlažnom ledu. Uzorci su razbistreni centrifugiranjem na 2000 o/min tokom 10 minuta, alikvotirani, brzo zamrznuti i odmah čuvani zamrznuti na -70°C do testiranja u testu plaka.

[0702] Kao što je prikazano na slikama 4A-D i slikama 5A-D, RB1 je bio u stanju da postigne smanjenje titra virusa za 2-3 logaritama i za RSV A i za RSV B u plućima i nosu pri dozi od 2,5 mpk sličnoj D25, ali boljoj od palivizumba koji nije mogao da utiče na titre virusa u nosu.

[0704] Primer 5: Fc inženjering RB1

[0706] [0267] Neonatalni Fc receptor za IgG (FcRn) je dobro okarakterisan u prenosu pasivnog humoralnog imuniteta sa majke na fetus. Pored toga, tokom života, FcRn štiti IgG od degradacije, čime se objašnjava dugo vreme poluraspada ove klase antitela u serumu. Videti, npr., Israel et al., 1996, Immunology 89:573-8. FcRn se vezuje za Fc deo IgG na mestu koje je različito od mesta vezivanja klasičnih FcgR ili C1q komponente komplementa. Kokristalna struktura FcRn-Fc otkrila je da se FcRn vezuje za CH2-CH3 šarnirni region IgG antitela. Karakteristična karakteristika IgG-FcRn puta je obligatna zavisnost od pH vrednosti. Vezivanje IgG-FcRn je vođeno kiselim pH (6,0) u lizozomu, dok se disocijacija dešava pri neutralnom pH (7,4) ekstracelularnog okruženja. Zakišeljavanje (pH 6,0-6,5) u lizozomima omogućava vezivanje FcRn za Fc region IgG sa niskim mikromolarnim afinitetom i štiti ga od katabolizma. Zaštićeni IgG vezan za FcRn se potom prenosi na površinu ćelije i oslobađa u ekstracelularno okruženje. Ovaj proces štiti antitela smanjenjem njihove izloženosti ekstracelularnoj razgradnji.

[0708] Antitelo RB1 je podvrgnuto Fc inženjeringu u nastojanju da se poboljša vreme poluraspada. RB1+YTE je derivat RB1 sa trostrukom mutacijom (M252Y/S254T/T256E (YTE)) uvedenom u Fc deo RB1. Ovaj skup mutacija YTE poboljšava vezivanje antitela za neonatalne Fc receptore što dovodi do dužeg vremena poluraspada kod ljudi. Videti, npr., Dall'Acqua et al., 2006, J Biol Chem. 281:23514-24. Mutacije u 3 aminokiseline (YTE: M252Y/S254T/T256E) unutar Fc regiona Motavizumaba dovele su do 10 puta većeg in vitro vezivanja FcRn pri pH 6,0 i kod ljudi i kod majmuna, što je rezultiralo 4 puta većim in vivo poluživotom seruma kod majmuna. Videti Robbie et al., 2013, Antimicrob Agents Chemother.

[0709] 57:6147-53.

[0711] Aminokiselinske sekvence varijabilnih domena teškog i lakog lanca antitela RB1+YTE poslate su kompaniji GenScript USA, Inc. (Piskatavej, Nju Džerzi) radi optimizacije kodona i konverzije ljudskog IgG1 i tranzijentne ekspresije i proizvodnje CHO. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence RB1+YTE prikazane su u Tabeli 7.

[0713] Sintetisane DNK su subklonirane u pTT5 vektor za ekspresiju ćelija CHO-3E7. Rekombinantni plazmidi koji kodiraju teške i lake lance svakog antitela su tranzijentno kotransfektovani u ćelijske kulture CHO-3E7. Supernatanti ćelijske kulture sakupljeni 6. dana korišćeni su za prečišćavanje kroz kolonu sa proteinom A. Prečišćeni ljudski IgG1 RB1+YTE korišćen je u testu neutralizacije i drugim eksperimentima karakterizacije.

[0715] Primer 6: Karakterizacija RB1+YTE

[0717] [0271] RB-1+YTE vezan za F protein u ELISA testu izvedenom kao što je opisano u Primeru 1 sa EC<50>u rasponu od 1,97 do 2,457 ng/ml. Videti Sliku 6. Neutralizacija za RB1+YTE i referentno antitelo objavljeno u literaturi (Motavizumab, MedImmune, Gaithersburg, MD; videti američku patentnu prijavu br. US20110158985) napravljeno u kompaniji na osnovu objavljene sekvence, upoređeni su u soju RSV A Long (ATCC broj VR-26™) i soju RSV B Washington 18537 (ATCC broj VR-1580™). Testirani uzorci su tri puta serijski razblaženi u EMEM dopunjenom sa 2% toplotno inaktiviranog FBS-a, za jedanaest tačaka razblaženja. Serijski razblaženi uzorci su zatim pomešani sa jednakim zapreminama EMEM dopunjenog sa 2% toplotno inaktiviranog FBS-a koji sadrži 100 pfu/bunarčiću sojeva RSV A ili B. Nakon inkubacije na 37°C tokom 1 sata, 100 µl HEp-2 ćelija u koncentraciji od 1,5x105 ćelija/ml je preneto na ploče sa 96 bunarčića koje sadrže smešu virus/antitelo.3 dana nakon infekcije, ćelije su jednom isprane sa PBS-om, a zatim fiksirane u 80% acetonu tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Smeša RSV F (mAb143-F3-B138) i RSV N (34C9) specifičnih mišjih mAb (mAb143-F3-B138 i 34C9 su interna antitela dobijena imunizacijom miševa odgovarajućim antigenima i immortalizacijom B-ćelija korišćenjem hibridomske tehnologije) je dodata na ploče i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane sa PBS/0,05% Tween 20 i biotinilisani konjski anti-mišji IgG su dodati na ploče i inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane sa PBS/0,05% Tween . Za detekciju specifičnog RSV signala korišćena je infracrvena boja-Streptavidin i dve ćelijske boje za normalizaciju testa su dodate na ploče sa 96 ležišta i inkubirane 1 sat u mraku. Nakon 1 sata inkubacije, ploče su isprane, sušene na vazduhu 20 minuta u mraku i očitane na Licor Aerius® automatizovanom sistemu za snimanje koristeći 700-kanalni laser za normalizaciju ćelija i 800-kanalni laser za detekciju specifičnog RSV signala. Izračunati su odnosi 800/700 i procenat neutralizacije, a vrednosti IC<50>su određene pomoću krive sa četiri parametra u GraphPad-u.

[0719] RB-1+YTE je bio u stanju da neutrališe sojeve RSV-A i RSV-B sa jednakom jačinom (IC<50>od 5-10 ng/ml). Videti Tabelu 6.

[0721] Tabela 6: Merenje neutralizacije i afiniteta za RB1+YTE prema RSV pre fuzije F i post-fuzije F

[0722] Mab IC<50>In vitro Kinetičke konstante (pre- Kinetičke konstante (postneutralizacija fuzioni F) fuzioni F)

[0725]

[0728] Uvođenje YTE mutacija u Fc deo RB1 nije promenilo in vitro potencijal antitela da neutrališe sojeve RSV A i B. In vitro potencijal neutralizacije za RSV A iznosio je 3 i 3,6 ng/ml za RB1 i RB1+YTE respektivno. Jačina za in vitro neutralizaciju za RSV B iznosila je 1,7 i 3,49 ng/m za RB1 i RB1+YTE respektivno. Kinetičke konstante merene pomoću Biocore bile su slične za RB1 i RB1+YTE, što sugeriše da uvođenje YTE u Fc region antitela nije promenilo njegova svojstva vezivanja za antigen.

[0730] Farmakokinetička studija koja nije u skladu sa GLP (Good Laboratory Practice/dobra laboratorijska praksa) sprovedena je u istraživačkom centru New Iberia (UL Lafayette, LA). Osam mužjaka rezus majmuna koji nisu primali biološke lekove nasumično je raspoređeno i raspoređeno u jednu od dve studijske grupe (n=4 po grupi). Svaka životinja je primila jednu intravensku (i.v.) dozu RB1+YTE) ili Motavizumab-YTE u dozi od 10 mg/kg. Uzorci krvi su uzeti pre doziranja 0. dana, 0,5, 1, 3, 8 i 24 sata nakon doziranja, i 1, 2, 3, 5, 7 i 10 dana nakon doziranja. Imunotestovi zasnovani na ECL su korišćeni za kvantifikaciju i RB1+YTE (ljudsko x [RSV] mAb (RB1-YTE) IgG1 / Kappa (CE)) i Motavizumab_YTE (humanizovano x[RSV] mAb IgG1 / Kappa) u serumu rezus majmuna.

[0732] U testu je korišćen biotinilovani mišji anti-ljudski IgG kapa lanac (BD Biosciences, San Hoze, Kalifornija) kao reagens za hvatanje i sulfoTAG mišji anti-ljudski IgG Fc kao reagens za detekciju (SouthernBiotech Birmingham, Alabama). Donja granica kvantifikacije (LLOQ) testa je određena na 1,37 ng/ml sa minimalnim potrebnim razblaženjem (MRD) od 20.

[0733] Farmakokinetika RB1+YTE i Motavizumab-YTE je procenjena do 10 dana kod rezus makakija kojima je data intravenska doza od 10 mg/kg korišćenjem istog imunološkog testa za kvantifikaciju RB1+YTE i Motavizumab-YTE. Za svaku životinju, model bez kompartmenta je prilagođen za podatke o koncentraciji u serumu svake životinje koristeći Phoenix Winnonlin 6.3 (Certara, NJ) da bi se procenila površina ispod krive (AUC0-10dan). AUC0-10dan je usrednjena za 4 životinje za svaku tretiranu grupu i prijavljena kao srednja vrednost ± standardna devijacija. Za RB1+YTE, AUCO-10dan = 1159±116 µg/mL*dan i za Motavizumab-YTE, AUC0-10dan = 1381±63,0 µg/mL*dan

[0735] RB1+YTE (prikazan kao RB1-YTE u legendi slike) i Motavizumab-YTE pokazali su slične profile koncentracije u serumu i farmakokinetiku kod rezus makakija. Videti sliku 7. Utvrđeno je da je RB1+YTE PK kod NHP takođe uporediva sa PK Motavizumab-YTE kod cinomolgus majmuna, što je objavljeno u literaturi. Videti Dall'Acqua et al., 2006, J Biol Chem, 281:23514-24.

[0737] Tabela 7: Informacije o sekvenci

[0739]

[0740] SEQ Opis SEQUENCE

[0741]

[0742] SEQ Opis SEQUENCE

[0743]

[0744]

[0745] SEQ Opis SEQUENCE

[0746]

Claims (23)

1. Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se vezuje za F protein RSV čoveka, pri čemu antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži hipervarijabilni region CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, hipervarijabilni region CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, hipervarijabilni region CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, hipervarijabilni region CDR1lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, hipervarijabilni region CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 i hipervarijabilni region CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6.

2. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema zahtevu 1 koji se vezuje za F protein RSV čoveka koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sa SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sa SEQ ID NO: 8.

3. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema zahtevima 1 ili 2, gde se antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje za prefuzioni F protein RSV čoveka sa K<D>vrednošću od oko 1 x 10<-9>M do oko 1 x 10<-12>M, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. BIACORE) ili sličnom tehnikom (npr. KinExa ili OCTET).

4. Izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1-3, gde antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8.

5. Izolovano antitelo prema zahtevu 4, koje je antitelo pune dužine koje ima dva laka lanca i dva teška lanca, gde svaki laki lanac sadrži: varijabilni region koji obuhvata SEQ ID NO: 8 i humani kapa laki lanac (SEQ ID NO: 14); i svaki teški lanac sadrži: varijabilni region koji obuhvata SEQ ID NO: 7 i konstantni region (SEQ ID NO: 13) IgG1 čoveka.

6. Izolovano antitelo prema zahtevu 4 ili 5, gde antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25.

7. Izolovano antitelo prema zahtevu 4 ili 5, gde teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23, a laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25.

8. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1-4 koje je IgG antitelo.

9. Izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1-4, koji je antitelo, ili izolovano antitelo prema zahtevima 5-8, pri čemu se antitelo proizvodi u CHO ćeliji.

10. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema zahtevima 1-8.

11. Ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema zahtevu 10.

12. Kompozicija koja sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1-9 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

13. Kompozicija prema zahtevu 12, koja dodatno sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen protiv respiratornog patogena izabranog od gripa, humanog citomegalovirusa (hCMV), humanog metapneumovirusa (hMPV), virusa humane parainfluence (hPIV), humanog rinovirusa (hRV), mikoplazmene pneumonije, streptokokus pneumonije, adenovirusa, bokavirusa, enterovirusa, norovirusa ili BK virusa.

14. Kompozicija prema zahtevu 13, gde respiratorni patogen je grip, hCMV, hMPV, hPIV, norovirus ili BK virus.

15. Imunogena kompozicija koja sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1-9 i antigen izabran od RSV F proteina i RSV G proteina i njihovih fragmenata.

16. Metod za detekciju prisustva prefuzionog F proteina RSV čoveka ili njegovog fragmenta u uzorku koji obuhvata kontaktiranje uzorka sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1-9 i detekciju prisustva kompleksa između antitela ili fragmenta koji vezuje antigen i peptida; pri čemu detekcija kompleksa ukazuje na prisustvo prefuzionog F proteina RSV.

17. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema zahtevima 1-9 ili kompozicija prema bilo kom od zahteva 12-15 za upotrebu u prevenciji ili lečenju RSV infekcije.

18. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema zahtevima 1-9 ili kompozicija prema bilo kom od zahteva 12-15 za upotrebu u terapiji.

19. Kombinacija koja sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 9 i dodatni profilaktički ili terapeutski agens za upotrebu u prevenciji ili lečenju RSV infekcije kod ljudi.

20. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema zahtevima 1-9 ili kompozicija prema bilo kom od zahteva 12-15 za upotrebu u prevenciji ili lečenju RSV bolesti, pri čemu RSV bolest je upala pluća i bronhiolitis.

21. Ćelija domaćin koja sadrži antitelo, fragment koji vezuje antigen, nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije prema bilo kom od zahteva 1-11.

22. Metod proizvodnje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen koji obuhvata:

a) kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži antitelo, fragment koji vezuje antigen, nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije prema bilo kom od zahteva 1-11 pod uslovima povoljnim za ekspresiju antitela ili fragmenta koji vezuje antigen; i

b) opciono, izdvajanje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen iz ćelije domaćina i/ili podloge za kultivaciju.

23. Postupak prema zahtevu 22, gde ćelija domaćina je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO).