Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
MD3368562T2 - Anticorp neutralizant anti virus sincițial respirator uman - Google Patents
[go: Go Back, main page]

MD3368562T2 - Anticorp neutralizant anti virus sincițial respirator uman - Google Patents

Anticorp neutralizant anti virus sincițial respirator uman

Info

Publication number
MD3368562T2
MD3368562T2 MDE20180859T MDE20180859T MD3368562T2 MD 3368562 T2 MD3368562 T2 MD 3368562T2 MD E20180859 T MDE20180859 T MD E20180859T MD E20180859 T MDE20180859 T MD E20180859T MD 3368562 T2 MD3368562 T2 MD 3368562T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
antibody
antigen
seq
protein
rsv
Prior art date
Application number
MDE20180859T
Other languages
English (en)
Inventor
Kalpit A Vora
Kara S Cox
Aimin Tang
Zhifeng Chen
Daniel Distefano
Lan Zhang
Hua-Poo Su
Original Assignee
Merck Sharp & Dohme Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Sharp & Dohme Llc filed Critical Merck Sharp & Dohme Llc
Publication of MD3368562T2 publication Critical patent/MD3368562T2/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/11—Paramyxoviridae (F); Pneumoviridae (F), e.g. respiratory syncytial virus [RSV]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Prezenta invenţie se referă la anticorpi monoclonali care au titruri neutralizante anti-RSV ridicate. Invenţia oferă, de asemenea, acizi nucleici izolaţi care codifică anticorpii invenţiei şi celule gazdă transformate cu aceştia. Invenţia oferă, de asemenea, metode de diagnostic, profilactice şi terapeutice care utilizează anticorpii şi acizii nucleici ai invenţiei, în special ca agent de imunoterapie pasivă la sugari şi vârstnici.

Description

[0001] DOMENIUL INVENŢIEI
[0002] Prezenta invenţie se referă la anticorpi monoclonali umani cu titruri neutralizante anti-RSV ridicate, precum şi la utilizarea acestor anticorpi ca agenţi de imunoterapie pasivă la sugari şi vârstnici.
[0003] STADIUL TEHNICII INVENŢIEI
[0004] Paramixovirusurile sunt virusuri ARN cu catenă negativă încapsulată, care sunt agenţi patogeni importanţi pentru oameni şi animale. Virusul sinciţial respirator uman (hRSV, RSV) aparţine familiei Paramyxoviridae, subfamiliei Pneumovirine. Două subtipuri, tipul A şi tipul B, au fost identificate şi reprezintă o cauză majoră a infecţiilor respiratorii severe şi uneori chiar fatale la copiii cu vârsta sub 6 luni. Adulţii cu boli de bază, cum ar fi COPB, astm, cancer, status imunocompromis, inclusiv HIV sau post-transplant, prezintă, de asemenea, riscul de a dezvolta infecţie severă cu RSV. 15% din spitalizările anuale la adulţii peste 50 de ani din cauza infecţiilor respiratorii acute sunt cauzate de RSV. În Statele Unite, RSV provoacă peste 100.000 de spitalizări anual şi se estimează faptul că provoacă aproximativ 160.000 de decese la nivel global în fiecare an. În prezent, nu există un vaccin contra RSV, iar un studiu clinic cu un virus inactivat cu formalină a fost asociat cu o severitate crescută a bolii la sugari la infecţia cu RSV. Alţi membri ai familiei, inclusiv Virusul Metapneumo Uman (hMPV) şi Human Parainfluenza Virus - Virusul Parainfluenţa Uman (hPIV), sunt, de asemenea, responsabile de boli respiratorii acute similare cu hRSV.
[0005] Genomul hRSV este o moleculă de ARN monocatenară cu sens negativ de aproximativ 15 kb care codifică 11 proteine. Două dintre aceste proteine sunt principalele glicoproteine de suprafaţă ale virionului. Acestea sunt (i) proteina de ataşare (G), care mediază legarea virusului la celule, şi (ii) proteina de fuziune (F), care promovează atât fuziunea membranelor virale şi celulare în stadiile iniţiale ale ciclului infecţios, cât şi fuziunea membranei celulelor infectate cu cea a celulelor adiacente pentru a forma sinciţiile caracteristice. Proteina de ataşare G se leagă de receptorii de suprafaţă celulară şi interacţionează cu F. Această interacţiune declanşează o modificare conformaţională a F pentru a induce fuziunea membranei, eliberând astfel complexul ribonucleoproteic viral în citoplasma celulei gazdă.
[0006] Anticorpii monoclonali anti proteina F sau G au demonstrat un efect neutralizant. in vitro şi efecte profilactice in vivo. A se vedea, de exemplu, Beeler şi Coelingh 1989, J. Virol. 63:2941-50; Garcia-Barreno şi colab, 1989, J. Virol. 63:925-32; Taylor şi colab, 1984, Immunology 52: 137-142; Walsh şi colab, 1984, Infection and Immunity 43:756-758 şi brevete de invenţie U.S. Nr. 5.842.307 şi 6.818.216. Epitopii neutralizanţi de pe glicoproteina F au fost iniţial map-aţi prin identificarea aminoacizilor care au fost alteraţi în variantele de scăpare de sub protecţia anticorpilor şi prin evaluarea legării anticorpilor la peptidele derivate din RSV F. Aceste studii au demonstrat faptul că anticorpii neutralizanţi sunt adesea direcţionaţi către doi epitopi liniari distincţi. A se vedea Graham şi colab, 2015, Curr Opin Immunol 35:30-38 pentru o analiză a site-urilor antigenice pentru formele F de pre-fuziune şi post-fuziune. Situsul antigenic II (numit şi situs A) include reziduurile 255 până la 275 şi este ţinta anticorpului cu substanţă activă palivizumab (SYNAGIS®, AstraZeneca). Se preconiza faptul că acest epitop este dependent conformaţional, iar structura unui derivat mai puternic de palivizumab în complex cu acest epitop a relevat faptul că epitopul liniar adoptă o conformaţie helix-buclă-helix. Situs-ul antigenic IV (numit şi situs C) include reziduurile 422 până la 438 şi este ţinta anticorpilor MAb19 şi 101F. Acest epitop este C-terminal faţă de regiunea bogată în cisteină şi face parte din domeniul II, care în glicoproteinele F ale paramixovirusului omolog rămâne structural neschimbat între conformaţiile pre- şi post-fuziune. 5C4, AM22 şi D25 delimitează un epitop desemnat ca situs 0, care este prezent doar pe proteina F de pre-fuziune şi a fost de 50 de ori mai puternic decât palivizumab. A se vedea McLellan şi colab, 2013, Science 340:1113-1117, cererea internaţională de brevet nr. WO 2008/147196 şi brevet de invenţie U.S. Nr. 8.568.726. Alţi anticorpi hRSV sunt descrişi în publicaţiile de cereri internaţionale de brevet nr. WO94/06448 şi WO92/04381 şi brevetul de invenţie U.S. Nr. 8.221.759.
[0007] Publicaţia de cerere internaţională de brevet de invenţie WO 2006/050280 dezvăluie anticorpi, antigeni şi utilizări ale acestora anti-virusul sinciţial respirator. Cererea internaţională de brevet de invenţie WO 97/11177 dezvăluie anticorpi monoclonali neutralizanţi anti-virusul sinciţial respirator.
[0008] Un vaccin împotriva RSV pentru imunizare activă, dacă este disponibil, nu ar putea fi utilizat pentru tratamentul nou-născuţilor cu sistem imunitar imatur sau al pacienţilor imunosupresaţi. La pacienţii la care este necesară imunoterapia pasivă profilactică, ca urmare a unei forme mai cronice a bolii, terapia actuală este mediată prin inoculare intravenoasă periodică cu IgG uman preparat din plasmă combinată. Acest tip de terapie, datorită titrurilor scăzute de anticorpi neutralizanţi anti-RSV, implică o cantitate mare de globuline (de exemplu, 0,75 gm per kg) şi, în consecinţă, necesită administrare intravenoasă, într-o clinică sau spital, pe o perioadă lungă de timp (2 până la 4 ore), lunar în lunile cu risc ridicat (toamna, iarna şi începutul primăverii).
[0009] EXPUNEREA PE SCURT A INVENŢIEI
[0010] Informaţiile tehnice prezentate mai jos pot, în anumite privinţe, să depăşească sfera de întindere a protecţiei invenţiei revendicate în prezent, care este definit de setul de revendicări anexat. Informaţiile tehnice suplimentare sunt furnizate pentru a plasa invenţia propriu-zisă într-un context tehnic mai larg şi pentru a ilustra posibile dezvoltări tehnice conexe. Referinţele din prezentul document la metode de tratament prin terapie sau intervenţie chirurgicală trebuie interpretate ca referinţe la compuşi, compoziţii farmaceutice, combinaţii şi/sau medicamente destinate utilizării în aceste metode.
[0011] Invenţia furnizează anticorpi anti-proteină F RSV şi fragmente de legare la antigen ale acestora, cuprinzând caracteristicile structurale şi funcţionale specificate mai jos.
[0012] Invenţia furnizează un anticorp izolat sau un fragment al acestuia de legare la antigen care se leagă la proteina F RSV uman, în care anticorpul sau fragmentul de legare la antigen cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:1, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:2, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:3, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:4, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:5 şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:6.
[0013] Într-un alt aspect, este prevăzut un acid nucleic izolat care codifică anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform invenţiei.
[0014] Într-un alt aspect, este prevăzut un vector de expresie cuprinzând acidul nucleic izolat conform invenţiei.
[0015] Într-un alt aspect, este prevăzută o compoziţie cuprinzând anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform invenţiei şi un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic.
[0016] Într-un alt aspect, este prevăzută o compoziţie imunogenă cuprinzând anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform invenţiei şi un antigen selectat dintre proteina F RSV şi proteina G a RSV şi fragmente ale acestora.
[0017] Într-un alt aspect, este prevăzută o metodă pentru detectarea prezenţei unei proteine F de pre-fuziune a RSV uman sau a unui fragment al acesteia într-o probă, cuprinzând contactarea probei cu un anticorp sau fragment de legare la antigen conform invenţiei şi detectarea prezenţei unui complex între anticorpul sau fragmentul de legare la antigen şi peptidă; în care detectarea complexului indică prezenţa proteinei F de pre-fuziune a RSV.
[0018] Într-un alt aspect, este prevăzut anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform invenţiei sau compoziţia conform invenţiei pentru utilizare în prevenirea sau tratarea unei infecţii cu RSV.
[0019] Într-un alt aspect, este prevăzută o celulă gazdă cuprinzând anticorpul, fragmentul de legare la antigen, acidul nucleic sau vectorul de expresie conform invenţiei.
[0020] Într-un alt aspect, este prevăzut anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform invenţiei sau compoziţia conform invenţiei pentru utilizare în terapie.
[0021] Într-un alt aspect, este prevăzută o combinaţie cuprinzând anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform invenţiei şi un alt agent profilactic sau terapeutic pentru utilizare în prevenirea sau tratarea infecţiei cu RSV uman.
[0022] Într-un alt aspect, este prevăzut anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform invenţiei sau compoziţia conform invenţiei pentru utilizare în prevenirea sau tratarea bolii RSV.
[0023] Într-un alt aspect, este prevăzută o celulă gazdă cuprinzând anticorpul, fragmentul de legare la antigen, acidul nucleic sau vectorul de expresie conform invenţiei.
[0024] Într-un alt aspect, este prevăzută o metodă de producere a unui anticorp sau a unui fragment de legare la antigen, cuprinzând: a) cultivarea unei celule gazdă cuprinzând anticorpul, fragmentul de legare la antigen, acidul nucleic sau vectorul de expresie conform invenţiei în condiţii favorabile exprimării anticorpului sau fragmentului de legare la antigen; şi b) opţional, recuperarea anticorpului sau a fragmentului de legare la antigen din celula gazdă şi/sau mediul de cultură.
[0025] Invenţia furnizează un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia care se leagă la proteina F RSV uman, cuprinzând: o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 3. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are opţional cel puţin una dintre următoarele caracteristici: (i) se leagă la proteina F de pre-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET); sau (ii) se leagă la proteina F post-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-6 M până la aproximativ 1 x 10-9 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). În anumite variante de realizare, lanţul greu cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23.
[0026] Invenţia furnizează un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia care se leagă la proteina F RSV uman, cuprinzând: o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 6. În anumite variante de realizare, lanţul uşor sau regiunea variabilă a lanţului uşor nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 8. În anumite variante de realizare, lanţul uşor nu este asociat cu un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. În anumite variante de realizare, lanţul uşor este asociat cu un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 7. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are opţional cel puţin una dintre următoarele caracteristici: (i) se leagă la proteina F de pre-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET); sau (ii) se leagă la proteina F post-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-11 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). În anumite variante de realizare, lanţul uşor cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
[0027] Invenţia furnizează un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia care se leagă la proteina F RSV uman, cuprinzând: (i) o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 1; (ii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 2; şi (iii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 3. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are opţional cel puţin una dintre următoarele caracteristici: (i) se leagă la proteina F de pre-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET); sau (ii) se leagă la proteina F post-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-11 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). În anumite variante de realizare, lanţul greu cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23.
[0028] Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde: (i) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 4; (ii) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 5; şi (iii) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 6. În anumite variante de realizare, lanţul uşor sau regiunea variabilă a lanţului uşor nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 8. În anumite variante de realizare, lanţul uşor nu este asociat cu un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. În anumite variante de realizare, lanţul uşor este asociat cu un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 7. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de anticorp al acestuia are opţional cel puţin una dintre următoarele caracteristici: (i) se leagă la proteina F de pre-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET); sau (ii) se leagă la proteina F post-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-11 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). În anumite variante de realizare, lanţul uşor cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
[0029] Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde: (i) o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 1; (ii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 2; (iii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 3; (iv) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 4; (v) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 5; şi (vi) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 6. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are opţional cel puţin una dintre următoarele caracteristici: (i) se leagă la proteina F de pre-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET); sau (ii) se leagă la proteina F post-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-11 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). În anumite variante de realizare, lanţul greu cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23, iar lanţul uşor cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25
[0030] Într-o altă variantă de realizare, invenţia furnizează un anticorp sau un fragment de legare la antigen care se leagă la proteina F RSV uman, cuprinzând: (i) o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 1; (ii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 2; (iii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 3; (iv) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 4; (v) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 5; şi (vi) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 6; în care anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând cel puţin 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identitate cu o regiune variabilă a lanţului greu constând în SECV ID NR: 7 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând cel puţin 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identitate cu o regiune variabilă a lanţului uşor constând în SECV ID NR: 8. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 9. În aceste variante de realizare menţionate anterior, variaţiile secvenţei apar în regiunile cadru. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are opţional cel puţin una dintre următoarele caracteristici: (i) se leagă la proteina F de pre-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET); sau (ii) se leagă la proteina F post-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-11 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). În anumite variante de realizare, lanţul greu cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23, iar lanţul uşor cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
[0031] Invenţia prezintă, de asemenea, un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia care se leagă de RSV uman, cuprinzând: (i) o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 1; (ii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 2; (iii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 3; (iv) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 4; (v) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 5; şi (vi) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 a cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 6. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde 1, 2 sau 3 substituţii de aminoacizi în CDR lanţului greu (SECV ID NR: 1-3) şi/sau în CDR lanţului uşor (SECV ID NR: 4-6). Secvenţa VH a SECV ID NR: 7 are CDR SECV ID NR: 1-3; iar secvenţa VL a SECV ID NR: 8 are CDR SECV ID NR: 4-6. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are opţional cel puţin una dintre următoarele caracteristici: (i) se leagă la proteina F de pre-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET); sau (ii) se leagă la proteina F post-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-11 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu., KinExa sau OCTET). În anumite variante de realizare, lanţul greu cuprinde, constă în esenţă în sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23, iar lanţul uşor cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
[0032] Într-o variantă de realizare, invenţia furnizează un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia, cuprinzând: un lanţ greu variabil cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 7 şi/sau un lanţ uşor variabil cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 8, în care anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia se leagă la proteina F RSV uman. Într-o altă variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde un lanţ greu cuprinzând sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23 şi un lanţ uşor cuprinzând sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25, în care anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia se leagă la proteina F RSV uman. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are opţional cel puţin una dintre următoarele caracteristici: (i) se leagă la proteina F de pre-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET); sau (ii) se leagă la proteina F post-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-11 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET).
[0033] Într-o altă variantă de realizare, invenţia furnizează un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia care se leagă de acelaşi epitop al proteinei F RSV uman ca un anticorp cuprinzând lanţul greu al SECV ID NR: 23 şi lanţul uşor al SECV ID NR: 25, în care anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are cel puţin una dintre următoarele caracteristici: (i) se leagă la proteina F de pre-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET); sau (ii) se leagă la proteina F post-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-11 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). Într-o variantă de realizare, anticorpul cuprinde cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identitate de secvenţă cu regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor din SECV ID NR: 7 şi respectiv 8. Într-o altă variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 sau 30 de substituţii de aminoacizi în regiunea variabilă a lanţului greu din SECV ID NR: 7 şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor din SECV ID NR: 8. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 9.
[0034] De asemenea, este dezvăluit în conţinut un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia care blochează încrucişat legarea (sau este în competiţie cu) un anticorp cuprinzând lanţul greu al SECV ID NR: 23 şi lanţul uşor al SECV ID NR: 25 la RSV uman, în care anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are cel puţin una dintre următoarele caracteristici: (i) se leagă la proteina F de pre-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET); sau (ii) se leagă la proteina F post-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-11 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identitate de secvenţă cu regiunea variabilă a lanţului greu din SECV ID NR: 7 sau regiunea variabilă a lanţului uşor din SECV ID NR: 8. Într-o altă variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 sau 30 de substituţii de aminoacizi în regiunea variabilă a lanţului greu din SECV ID NR: 7 sau regiunea variabilă a lanţului uşor din SECV ID NR: 8. Într-o altă variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde 1, 2 sau 3 substituţii de aminoacizi în CDR lanţului greu (SECV ID NR: 1-3) şi/sau în CDR lanţului uşor (SECV ID NR: 4-6). În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 9.
[0035] Într-o variantă de realizare, invenţia se referă la un anticorp izolat sau fragment de legare la antigen care se leagă la proteina F RSV uman, cuprinzând: un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 7 sau o variantă a acesteia cuprinzând până la 30 de substituţii de aminoacizi şi/sau un lanţ uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 8 cuprinzând până la 12 substituţii de aminoacizi. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9.
[0036] În anumite variante de realizare, invenţia se referă la un anticorp izolat sau fragment de legare la antigen care se leagă la proteina F RSV uman, în care anticorpul se leagă la proteina F RSV uman prin una sau mai multe dintre următoarele interacţiuni sau prin toate interacţiunile următoare:
[0037] 1) Bucla CDR3 a lanţului uşor, prin reziduurile Phe 91 şi Leu 92, interacţionează cu lanţul lateral al Arg 429 al proteinei F RSV uman prin formarea a două legături de hidrogen între atomii de oxigen carbonilic ai Phe 91 şi Leu 92 din bucla CDR3 şi atomii de azot guanidino ai Arg 429 ai proteinei F RSV uman;
[0038] 2) Bucla CDR2 a lanţului uşor, prin reziduurile Asp 50 şi Glu 55, formează legături de hidrogen cu Asn 426 şi Lys 445 ale proteinei F RSV uman;
[0039] 3) Bucla CDR3 a lanţului greu, prin reziduurile Tyr 104 şi Tyr 110, formează o suprafaţă pentru interacţiunea van der Waals cu Ile 432 ai proteinei F RSV uman;
[0040] 4) Bucla CDR3 a lanţului greu, prin Asn 107, formează o legătură de hidrogen cu Lys 433 a proteinei F RSV uman; şi
[0041] 5) Lanţul uşor se grupează contra Glu 161 şi Ser 182 ale monomerului vecin al unui trimer de pre-fuziune RSV.
[0042] În anumite aspecte ale oricăreia dintre variantele de realizare de mai sus, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia este izolat.
[0043] În anumite aspecte ale oricăreia dintre variantele de realizare de mai sus, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia este un anticorp recombinant.
[0044] În anumite aspecte ale oricăreia dintre variantele de realizare de mai sus, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia este un anticorp de lungime completă.
[0045] În anumite aspecte ale oricăreia dintre variantele de realizare menţionate mai sus, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia conform invenţiei poate cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând în: (a) oricare dintre lanţurile grele variabile descrise mai sus şi (b) o peptidă lider (de exemplu, peptida lider cu SECV ID NR: 10). În anumite aspecte ale oricăreia dintre variantele de realizare menţionate mai sus, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia conform invenţiei poate cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor constând în: (a) oricare dintre lanţurile uşoare variabile descrise mai sus şi (b) o peptidă lider (de exemplu, peptida lider cu SECV ID NR: 10).
[0046] În anumite aspecte ale oricăreia dintre variantele de realizare menţionate mai sus, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia conform invenţiei este un anticorp cuprinzând oricare dintre lanţurile grele variabile descrise mai sus şi orice domeniu constant al lanţului greu uman. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia conform invenţiei este de izotip IgG şi cuprinde un domeniu constant al lanţului greu uman IgG1, IgG2, IgG3 sau IgG4. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia conform invenţiei cuprinde un domeniu constant IgG1 al lanţului greu uman, în care domeniul constant IgG1 este fără fucoză.
[0047] În anumite aspecte ale oricăreia dintre variantele de realizare menţionate mai sus, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia conform invenţiei poate cuprinde oricare dintre lanţurile uşoare variabile descrise mai sus şi un domeniu constant al lanţului uşor uman. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia conform invenţiei cuprinde un domeniu constant al lanţului uşor kappa uman sau o variantă a acestuia, în care varianta cuprinde până la 20, 10, 5, 3, 2 sau 1 substituţii de aminoacizi modificaţi. Într-o altă variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia conform invenţiei cuprinde un domeniu constant al lanţului uşor lambda uman sau o variantă a acestuia, în care varianta cuprinde până la 20, 10, 5, 3, 2 sau 1 substituţii de aminoacizi modificaţi. Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia conform invenţiei cuprinde un domeniu constant al lanţului uşor kappa uman cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 14.
[0048] Într-o variantă de realizare, anticorpul anti-proteină F hRSV conform invenţiei cuprinde o structură tetramerică completă având două lanţuri uşoare şi două lanţuri grele, în care fiecare lanţ uşor cuprinde: o regiune variabilă cuprinzând SECV ID NR: 8 şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa uman (SECV ID NR: 14); şi fiecare lanţ greu cuprinde: o regiune variabilă cuprinzând SECV ID NR: 7 şi un domeniu constant IgG1 uman (SECV ID NR: 13).
[0049] În anumite aspecte ale oricăreia dintre variantele de realizare menţionate mai sus, anticorpul anti-proteină F hRSV sau fragmentul acestuia de legare la antigen conform invenţiei poate fi conjugat cu cel puţin un agent profilactic sau terapeutic. Într-o variantă de realizare, agentul terapeutic cuprinde un al doilea anticorp sau fragment al acestuia, un imunomodulator, un hormon, un agent citotoxic, o enzimă, un radionuclid, un al doilea anticorp conjugat cu cel puţin un imunomodulator, enzimă, marker radioactiv, hormon, oligonucleotidă antisens sau agent citotoxic sau o combinaţie a acestora.
[0050] Invenţia furnizează, de asemenea, polipeptide izolate cuprinzând secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre secvenţele SECV ID NR: 1-8, 23 sau 25 sau un fragment al oricăreia dintre secvenţele menţionate. În anumite variante de realizare, polipeptidele cuprinzând secvenţe de aminoacizi ale lanţului greu nu cuprind secvenţa de aminoacizi a secvenţei SECV ID NR: 9.
[0051] Invenţia furnizează, de asemenea, acizi nucleici izolaţi care codifică oricare dintre anticorpii anti-proteină F hRSV sau fragmentele de legare la antigen conform invenţiei. Într-o variantă de realizare, invenţia furnizează acizi nucleici izolaţi care codifică oricare dintre polipeptidele cu SECV ID NR: 1-8, 23 sau 25, în care respectivele polipeptide pot cuprinde opţional o secvenţă lider. În anumite variante de realizare, polipeptidele cuprinzând secvenţe de aminoacizi ale lanţului greu nu cuprind secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. Invenţia furnizează, de asemenea, vectori de expresie cuprinzând un acid nucleic care codifică oricare dintre polipeptidele cu SECV ID NR: 1-8, 23 sau 25 (în care respectivele polipeptide pot cuprinde opţional o secvenţă lider). În anumite variante de realizare, polipeptidele cuprinzând secvenţe de aminoacizi ale lanţului greu nu cuprind secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. Aceşti acizi nucleici izolaţi şi vectorii de expresie care îi cuprind pot fi utilizaţi pentru a exprima anticorpii conform invenţiei sau fragmentele de legare la antigen a acestora în celule gazdă recombinant. Astfel, invenţia furnizează şi celule gazdă cuprinzând acizi nucleici izolaţi care codifică oricare dintre polipeptidele cu SECV ID NR: 1-8, 23 sau 25 (unde respectivele polipeptide pot cuprinde opţional o secvenţă lider). În anumite variante de realizare, polipeptidele cuprinzând secvenţe de aminoacizi ale lanţului greu nu cuprind secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. Într-o variantă de realizare, celula gazdă este o celulă ovariană de hamster chinezesc. Într-o variantă de realizare, celula gazdă este o celulă de drojdie, de exemplu o celulă gazdă Pichia sau o celulă gazdă Pichia pastoris.
[0052] Invenţia furnizează, de asemenea, compoziţii farmaceutice cuprinzând un anticorp sau un fragment de legare la antigen conform invenţiei şi un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic. Într-o variantă de realizare, purtătorul sau diluantul acceptabil farmaceutic este L-Histidina. Într-un aspect al acestei variante de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen este formulat în 10 mM L-Histidină, 7% (g/v) zaharoză şi 0,02% (g/v) polisorbat-80, pH 6,0. Anticorpul sau fragmentul de legare la antigen este în mod tipic prezent la aproximativ 100 mg/mL într-o astfel de formulare.
[0053] Într-o variantă de realizare, prezenta invenţie furnizează compoziţii cuprinzând un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia conform invenţiei şi cuprinzând un alt agent profilactic sau terapeutic. Într-o variantă de realizare, agentul profilactic sau terapeutic suplimentar este selectat din grupul constând în: un al doilea anticorp anti-hRSV sau un fragment de legare la antigen al acestuia. Într-o variantă de realizare, al doilea anticorp anti-hRSV sau fragment de legare la antigen conform invenţiei cuprinde: (i) o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 1; (ii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 2; (iii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 3; (iv) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 4; (v) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 5; şi (vi) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 9.
[0054] Dezvăluirea furnizează, de asemenea, un rezervor sau dispozitiv de injectare cuprinzând oricare dintre anticorpii anti-proteină F hRSV sau fragmentele de legare la antigen conform invenţiei. Anticorpul anti-proteină F hRSV sau fragmentul de legare la antigen conform invenţiei cuprinde: (i) o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 1; (ii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 2; (iii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 3; (iv) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 4; (v) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 5; şi (vi) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 6. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. În anumite variante de realizare, lanţul greu cuprinde, constă în esenţă din sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23, iar lanţul uşor cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
[0055] Invenţia furnizează, de asemenea, o metodă de producere a unui anticorp anti-proteină F hRSV sau a unui fragment de legare la antigen conform invenţiei, cuprinzând: cultivarea unei celule gazdă cuprinzând o polinucleotidă care codifică un lanţ greu şi/sau un lanţ uşor al unui anticorp conform invenţiei (sau un fragment de legare la antigen al acestuia) în condiţii favorabile exprimării polinucleotidei; şi, opţional, recuperarea anticorpului sau a fragmentului de legare la antigen din celula gazdă şi/sau mediul de cultură. Într-o variantă de realizare, polinucleotida care codifică lanţul greu şi polinucleotida care codifică lanţul uşor se află într-un singur vector. Într-o altă variantă de realizare, polinucleotida care codifică lanţul greu şi polinucleotida care codifică lanţul uşor se află în vectori diferiţi. Într-o variantă de realizare, polinucleotida care codifică lanţul greu şi polinucleotida care codifică lanţul uşor codifică un anticorp sau un fragment de legare la antigen cuprinzând: (i) o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 1; (ii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 2; (iii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 3; (iv) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:4; (v) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:5; şi (vi) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:6. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. În anumite variante de realizare, lanţul greu cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23, iar lanţul uşor cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
[0056] Invenţia furnizează, de asemenea, o metodă de prevenire sau tratare a infecţiei cu hRSV la un subiect care necesită aceasta, cuprinzând administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente dintr-un anticorp anti-proteină F hRSV sau un fragment de legare la antigen conform invenţiei, opţional în asociere cu un alt agent profilactic sau terapeutic sau o procedură terapeutică. Într-o variantă de realizare, subiectul tratat este un subiect uman. Într-o variantă de realizare, agentul profilactic sau terapeutic suplimentar este selectat din grupul constând în: un al doilea anticorp anti-hRSV sau un fragment de legare la antigen al acestuia, un acid nucleic care codifică anticorpul anti-RSV F sau fragmentul de legare la antigen sau un conjugat de anticorpi. Anticorpul anti-proteină F hRSV sau fragmentul de legare la antigen conform invenţiei cuprinde: (i) o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 1; (ii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 2; (iii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 3; (iv) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 4; (v) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 5; şi (vi) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 6. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. În anumite variante de realizare, lanţul greu cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23, iar lanţul uşor cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
[0057] Invenţia furnizează, de asemenea, o metodă de prevenire sau tratare a infecţiei cu hRSV la un subiect care necesită aceasta, cuprinzând administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente dintr-un anticorp anti-proteină F hRSV sau un fragment de legare la antigen conform invenţiei, opţional în combinaţie cu un alt agent profilactic sau terapeutic sau o procedură terapeutică. Anticorpul anti-proteină F hRSV sau fragmentul de legare la antigen conform invenţiei cuprinde: (i) o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 1; (ii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 2; (iii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 3; (iv) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 4; (v) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 5; şi (vi) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 6. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. În anumite variante de realizare, lanţul greu cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23, iar lanţul uşor cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
[0058] Invenţia furnizează, de asemenea, un vaccin sau o compoziţie imunogenă, cuprinzând un anticorp sau un fragment de legare la antigen conform invenţiei. Anticorpul sau fragmentul de legare la antigen anti-proteină F hRSV conform invenţiei cuprinde: (i) o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 1; (ii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 2; (iii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 3; (iv) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 4; (v) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 5; şi (vi) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 6. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. În anumite variante de realizare, lanţul greu cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23, iar lanţul uşor cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
[0059] Într-o variantă de realizare, vaccinul sau compoziţia imunogenă cuprinde în plus un antigen selectat dintre proteina F RSV şi proteina G a RSV şi fragmente ale acestora.
[0060] Invenţia furnizează, de asemenea, o metodă pentru detectarea prezenţei RSV într-o probă (prin detectarea proteinei F sau a unui fragment al acesteia), cuprinzând contactarea probei cu un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia conform invenţiei şi detectarea prezenţei unui complex între anticorp sau fragment şi peptidă; în care detectarea complexului indică prezenţa proteinei F RSV. Anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform invenţiei cuprinde: (i) o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 1; (ii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 2; (iii) o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 3; (iv) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 4; (v) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 5; şi (vi) o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 6. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9. În anumite variante de realizare, lanţul greu cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23, iar lanţul uşor cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
[0061] Dezvăluirea furnizează, de asemenea, o metodă de creştere a activităţii anti-hRSV a unui anticorp anti-proteină F hRSV, cuprinzând: obţinerea unui anticorp anti-proteină F hRSV parental şi creşterea funcţiei efector a anticorpului anti-proteină F hRSV parental; în care activitatea anticorpului anti-proteină F hRSV rezultat este crescută în comparaţie cu anticorpul anti-proteină F hRSV parental. Aşa cum este utilizat în conţinut, un "anticorp parental" se referă la un anticorp care are o regiune Fc de tip sălbatic şi/sau glicozilare de tip sălbatic (adică, model de glicozilare rezultat din exprimarea polipeptidei într-o celulă gazdă de mamifer nemodificată). Funcţia efector a unui anticorp parental poate fi crescută prin mutarea regiunii sale Fc sau prin modificarea glicozilării sale, de exemplu prin îndepărtarea grupării fucoză a anticorpului (aşa cum se discută mai detaliat mai jos). Într-o variantă de realizare, funcţia efector a unui anticorp anti-proteină F hRSV parental este crescută prin efectuarea de mutaţii în regiunea Fc a anticorpului anti-proteină F hRSV parental. Într-o altă variantă de realizare, funcţia efector a unui anticorp parental anti-proteină F hRSV este crescută prin îndepărtarea reziduurilor de fucoză din anticorp sau prin exprimarea anticorpului într-o celulă gazdă care a fost modificată genetic pentru a elimina activitatea enzimei care adaugă fucoză la glicoproteine.
[0062] DESCRIEREA PE SCURT A FIGURILOR
[0063] Figurile 1A-B prezintă curbele de legare (din ELISA) ale anticorpilor umani RSV D25, palivizumab şi RB1 la proteinele de fuziune RSV-F umane pre (A) şi post (B).
[0064] Figurile 2A-B prezintă curbele de neutralizare pentru anticorpii umani RSV în tulpina RSV A Long (A) şi tulpina RSV B Washington (B).
[0065] Figurile 3A-B prezintă maparea epitopilor RB1 prin mutageneza cu scanare cu alanină a proteinei de fuziune F (A) şi reziduurile mapate ale epitopilor pe structura cristalină Pre-Fuziune F (B).
[0066] Figurile 4A-D prezintă eficacitatea RB1 comparativ cu D25 în plămâni într-un model de provocare cu RSV A la şobolani de bumbac, reprezentat grafic în funcţie de concentraţiile de anticorpi (A) şi model de provocare cu RSV B, reprezentat grafic în funcţie de concentraţiile de anticorpi (B) sau particule virale (PFU/g) prezente în ţesuturi, reprezentat grafic în funcţie de doza de anticorpi pentru provocarea cu RSV A (C) şi provocarea cu RSV B (D).
[0067] Figurile 5A-D prezintă eficacitatea RB1 comparativ cu D25 nazal într-un model de provocare cu RSV A la şobolani de bumbac, reprezentat grafic în funcţie de concentraţiile de anticorpi (A) şi de provocare cu RSV B, reprezentat grafic în funcţie de concentraţiile de anticorpi (B) sau particule virale (PFU/g) prezente în ţesuturi, reprezentat grafic în funcţie de doza de anticorpi pentru provocarea cu RSV A (C) şi provocarea cu RSV B (D).
[0068] Figura 6 prezintă o curbă de legare (din testul ELISA) a anticorpului uman RSV RB1+YTE la proteina F RSV A uman.
[0069] Figura 7 prezintă proprietăţi farmacocinetice la maimuţe Rhesus ale RB1-YTE (RB1+YTE) vs. motavizumab având setul de mutaţii YTE.
[0070] DESCRIERE DETALIATĂ
[0071] Abrevieri
[0072] În descrierea detaliată şi în exemplele invenţiei se vor utiliza următoarele abrevieri:
ADCC
Citotoxicitate celulară dependentă de anticorp
CDC
Citotoxicitate dependentă de complement
CDR
Regiunea de determinare a complementarităţii în regiunile variabile ale imunoglobulinelor, definită folosind sistemul de numerotare Kabat
CHO
ovar de hamster chinezesc
ELISA
Test imunosorbent legat de enzime
FR
Regiunea cadru a anticorpului: regiunile variabile ale imunoglobulinelor, excluzând regiunile CDR
HRP
Peroxidază de hrean
IC50
concentraţie rezultând o inhibare de 50%
IgG
Imunoglobulină G
Kabat
Un sistem de aliniere şi numerotare a imunoglobulinelor, iniţiat de Elvin A. Kabat ((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)
mAb sau MAB sau MAb
Anticorp monoclonal
Regiune V
Segmentul de lanţuri IgG a cărui secvenţă este variabilă între diferiţi anticorpi. Se extinde până la reziduul Kabat 109 din lanţul uşor şi 113 din lanţul greu.
VH
Regiunea variabilă a lanţului greu al imunoglobulinei
VK
Regiunea variabilă a lanţului uşor kappa al imunoglobulinei
[0074] Definiţii
[0075] Pentru ca invenţia să fie mai uşor de înţeles, anumiţi termeni tehnici şi ştiinţifici sunt definiţi în mod specific mai jos. Cu excepţia cazului în care sunt definiţi în mod specific în altă parte a acestui document, toţi ceilalţi termeni tehnici şi ştiinţifici utilizaţi în conţinut au sensul înţeles în mod uzual de către o persoană cu experienţă în domeniul căruia îi aparţine această invenţie.
[0076] Aşa cum sunt utilizate în conţinut, inclusiv în revendicările anexate, formele de singular ale cuvintelor precum "o", "un" şi "cea" includ referinţele corespunzătoare la plural, cu excepţia cazului în care contextul dictează în mod clar altfel.
[0077] "Administrare" şi "tratament", aşa cum se aplică unui animal, om, subiect experimental, celulă, ţesut, organ sau fluid biologic, se referă la contactul unui agent farmaceutic, terapeutic, de diagnostic sau al unei compoziţii exogene cu animalul, omul, subiectul, celula, ţesutul, organul sau fluidul biologic. Tratamentul unei celule cuprinde contactul unui reactiv cu celula, precum şi contactul unui reactiv cu un fluid, unde fluidul este în contact cu celula. "Administrare" şi "tratament" înseamnă, de asemenea tratamente in vitro şi ex vivo, de exemplu, ale unei celule, de către un reactiv, un diagnostic, un compus de legare sau de către o altă celulă.
[0078] "Boala RSV" înseamnă o boală cauzată de o infecţie cu RSV, inclusiv pneumonia şi bronşiolita.
[0079] "A trata" sau "prin tratare" înseamnă administrarea unui agent terapeutic, cum ar fi o compoziţie care conţine oricare dintre anticorpii sau fragmentele de legare la antigen conform prezentei invenţii, intern sau extern, unui subiect sau pacient care prezintă unul sau mai multe simptome ale bolii sau este suspectat că are o boală, pentru care agentul are activitate terapeutică. În mod tipic, agentul este administrat într-o cantitate eficientă pentru a ameliora unul sau mai multe simptome ale bolii la subiectul sau populaţia tratată, fie prin inducerea regresiei, fie prin inhibarea progresiei unui astfel de simptom (acestor simptome) prin orice grad măsurabil clinic. Cantitatea de agent terapeutic care este eficientă pentru a ameliora orice simptom particular al bolii poate varia în funcţie de factori precum starea bolii, vârsta şi greutatea pacientului şi capacitatea medicamentului de a provoca un răspuns dorit la subiect. Dacă un simptom al bolii a fost ameliorat poate fi evaluat prin orice măsurătoare clinică utilizată în mod tipic de medici sau alţi furnizori de servicii medicale calificaţi pentru a evalua severitatea sau starea de progresie a acelui simptom. Tratamentul cu anticorpi anti-VRS poate fi, de asemenea, combinat cu alte intervenţii (anticorpi, acizi nucleici, vaccinuri şi compuşi cu molecule mici) pentru a trata alţi agenţi patogeni respiratori.
[0080] "A preveni" sau "prevenire" înseamnă administrarea unui agent profilactic, cum ar fi o compoziţie care conţine oricare dintre anticorpii sau fragmentele de legare la antigen din prezenta invenţie, intern sau extern, unui subiect sau pacient cu risc de infectare cu hRSV, pentru care agentul are activitate profilactică. Prevenirea include reducerea probabilităţii sau severităţii unei infecţii ulterioare cu RSV, ameliorarea simptomelor asociate cu infecţia tractului respirator inferior (LRI) la infecţia cu RSV şi inducerea imunităţii pentru a proteja împotriva infecţiei cu RSV. În mod tipic, agentul este administrat într-o cantitate eficientă pentru a neutraliza RSV în plămâni şi/sau nas pentru a bloca infecţia. Cantitatea de agent profilactic care este eficientă pentru a ameliora orice simptom particular al bolii poate varia în funcţie de factori precum vârsta şi greutatea pacientului şi capacitatea agentului de a provoca un răspuns dorit la subiect. Dacă un simptom al bolii a fost ameliorat poate fi evaluat prin orice măsurătoare clinică utilizată în mod tipic de medici sau alţi furnizori de servicii medicale calificaţi pentru a evalua severitatea sau starea de progresie a acelui simptom sau, în anumite cazuri, va ameliora necesitatea spitalizării.
[0081] Proteina F hRSV
[0082] Proteina F RSV uman este sintetizată ca un precursor trimeric metastabil (F0) care este scindat proteolitic în subunităţile F1 şi F2 asociate covalent. Structurile atomice ale trimerilor F în forma de pre-fuziune au fost determinate pentru membrii PIV5 şi RSV din familia paramyxoviridae. A se vedea McLellan şi colab, 2011, J Virol. 85:7788-7796 (RSV) şi Welch şi colab, 2012, Proc Natl Acad Sci 109:16672-16677 (PIV). Conformaţia F de pre-fuziune are o coadă citoplasmatică C-terminal scurtă, un singur domeniu transmembranar, o tulpină elicoidală şi un domeniu de cap globular. Structurile atomice ale F NDV, hPIV3 şi RSV în forma post-fuziune arată faptul că are loc un eveniment de repliere amplă pentru a converti F de pre-fuziune în F post-fuziune, în care o parte a domeniului capului globular se rearanjează pentru a forma un fascicul cu şase helix-uri. Aceste structuri, împreună cu datele inhibitorii peptidice, sugerează un model pentru fuziunea membranară mediată de F, unde, la activare, F1/F2 se rearanjează pentru a insera o peptidă de fuziune hidrofobă de la capătul N-terminal al F1 în membrana celulară ţintă, formând un intermediar tip pre-ac de păr. Această structură relativ extinsă leagă virusul de membrana celulară şi colapsează pentru a forma fasciculul stabil cu şase helix-uri al structurii post-fuzionale. Tranziţia de la pre-fuziunea metastabilă, la intermediarul pre-ac de păr, la conformaţia post-fuziune are loc pe un gradient energetic, forma post-fuziune reprezentând starea cea mai stabilă, iar energia eliberată în timpul replierii F este cuplată cu fuziunea membranară.
[0083] Termenul "proteină F hRSV" include proteina F RSV uman, precum şi fragmente ale acesteia, cum ar fi fragmentul matur al acesteia căruia îi lipseşte peptida semnal. Într-o variantă de realizare a invenţiei, secvenţa de aminoacizi a proteinei F RSV uman cuprinde secvenţa de aminoacizi descrisă în Genbank Număr de acces AAR14266 (tulpina hRSV B 9320).
[0084] Anticorpi anti-hRSV şi Fragmente ale Acestora care se Leagă la Antigen
[0085] Prezenta invenţie furnizează anticorpi sau fragmente ale acestora care se leagă la antigen şi care leagă proteina F RSV uman, de preferinţă din ambele tulpini RSV A şi B, care leagă atât proteina F de pre-fuziune, cât şi proteina F de post-fuziune, şi utilizări ale unor astfel de anticorpi sau fragmente. În unele variante de realizare, anticorpii anti-proteina F RSV sunt izolaţi. Anticorpii descrişi în conţinut se leagă de un epitop la situsul IV al proteinei F. În oricare dintre variantele de realizare ale invenţiei descrise în conţinut, în anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 9 şi/sau lanţul uşor sau regiunea variabilă a lanţului uşor nu cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 8. În anumite variante de realizare, lanţul greu cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23, iar lanţul uşor cuprinde sau constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
[0086] În variante de realizare preferate, anticorpii anti-proteina F RSV sunt complet umani. Un avantaj major al anticorpilor monoclonali conform invenţiei derivă din faptul că aceştia includ secvenţe CDR3 umane şi, în unele variante de realizare, pot fi anticorpi monoclonali complet umani. Prin urmare, utilizarea in vivo a anticorpilor monoclonali complet umani conform invenţiei pentru imunoprofilaxia şi imunoterapia bolii RSV reduce considerabil problema răspunsului imun al gazdei la anticorpii administraţi pasiv. Această problemă este întâlnită frecvent atunci când se utilizează anticorpii monoclonali anteriori de origine xenogenă sau himerică. Un al doilea aspect important al acestui avantaj este siguranţa potenţială a acestor anticorpi monoclonali umani pentru aplicaţii de terapie genetică, în care exprimarea proteinelor xenogene sau himerice care conţin secvenţe non-umane nu poate fi terminată.
[0087] Aşa cum este utilizat în conţinut, un anticorp anti-proteină F RSV sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen se referă la un anticorp sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen şi care se leagă specific la proteina F RSV uman. Un anticorp sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen şi care "se leagă specific la RSV uman" este un anticorp sau un fragment al acestuia care se leagă la proteina F RSV uman pre-fuziune sau post-fuziune cu o Kd de aproximativ 1 nM sau o afinitate mai mare (de exemplu, 1 nM-2 pM, 1 nM, 100 pM, 10 pM sau 2 pM), dar nu se leagă la alte proteine cărora le lipsesc secvenţele proteice F ale RSV. Într-o variantă de realizare, anticorpul conform invenţiei care se leagă specific la proteina F RSV uman este, de asemenea, reactiv încrucişată cu proteina F RSV bovină. Aşa cum este utilizat în conţinut, "reactivitate încrucişată" se referă la capacitatea unui anticorp de a reacţiona cu o proteină omoloagă de la alte specii. Indiferent dacă un anticorp se leagă specific la proteina F RSV uman, poate fi determinat folosind orice test cunoscut în domeniu. Exemple de teste cunoscute în domeniu pentru determinarea afinităţii de legare includ rezonanţa plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET).
[0088] Prezenta invenţie include anticorpi anti-proteina F hRSV şi metode de utilizare a acestora. Aşa cum este utilizat în conţinut, termenul "anticorp" se referă la orice variantă de anticorp care prezintă activitatea biologică dorită. Astfel, este utilizat în sensul cel mai larg şi acoperă în mod specific, dar fără a se limita la, anticorpi monoclonali (inclusiv anticorpi monoclonali de lungime completă cuprinzând două lanţuri uşoare şi două lanţuri grele), anticorpi policlonali, anticorpi multispecifici (de exemplu, anticorpi bispecifici), anticorpi umanizaţi, anticorpi complet umani şi anticorpi himerici.
[0089] Prezenta invenţie include fragmente de legare la antigen proteinei F anti-hRSV şi metode de utilizare a acestora. Aşa cum este utilizat în conţinut, cu excepţia cazului în care se indică altfel, "fragment de anticorp" sau "fragment de legare la antigen" se referă la fragmente de anticorpi care se leagă la antigen, adică fragmente de anticorpi care îşi păstrează capacitatea de a se lega specific la antigenul legat de anticorpul de lungime completă, de exemplu, fragmente care păstrează una sau mai multe regiuni CDR. Exemple de fragmente de legare la antigen includ, dar nu se limitează la, fragmente Fab, Fab', F(ab')2 şi fragmente Fv; diacorpi; anticorpi liniari; molecule de anticorpi cu lanţ unic, de exemplu, sc-Fv; şi anticorpi multispecifici formaţi din fragmente de anticorpi.
[0090] Prezenta invenţie include fragmente Fab anti-proteină F RSV şi metode de utilizare a acestora. Un "fragment Fab" este compus dintr-un lanţ uşor şi CH1 şi regiuni variabile ale unui lanţ greu. Lanţul greu al unei molecule Fab nu poate forma o legătură disulfidică cu o altă moleculă a lanţului greu. Un "fragment Fab" poate fi produsul de clivaj al unui anticorp de către papaină.
[0091] Prezenta invenţie include anticorpi anti-proteină F RSV şi fragmente ale acestora care se leagă la antigen, cuprinzând o regiune Fc, şi metode de utilizare a acestora. O regiune "Fc" conţine două fragmente de lanţ greu cuprinzând domenii CH1 şi CH2 ale unui anticorp. Cele două fragmente ale lanţului greu sunt menţinute împreună prin două sau mai multe legături disulfidice şi prin interacţiuni hidrofobe ale domeniilor CH3.
[0092] Prezenta invenţie include fragmente Fab' anti proteină F RSV şi metode de utilizare a acestora. Un "fragment Fab" conţine un lanţ uşor şi o porţiune sau fragment al unui lanţ greu care conţine domeniul VH şi domeniul CH1 şi, de asemenea, regiunea dintre domeniile CH1 şi CH2, astfel încât o legătură disulfidică inter-catenară poate fi formată între cele două lanţuri grele ale două fragmente Fab' pentru a forma o moleculă F(ab')2.
[0093] Prezenta invenţie include fragmente F(ab')2 anti-proteina F RSV şi metode de utilizare a acestora. Un "fragment F(ab')2" conţine două lanţuri uşoare şi două lanţuri grele care conţin o porţiune din regiunea constantă dintre domeniile CH1 şi CH2, astfel încât se formează o legătură disulfidică între cele două lanţuri grele. Astfel un fragment F(ab')2, este compus din două fragmente Fab' care sunt ţinute împreună printr-o legătură disulfidică între cele două lanţuri grele. Un "fragment F(ab')2" poate fi produsul clivajului unui anticorp de către pepsină.
[0094] Prezenta invenţie include fragmente Fv anti proteina F RSV şi metode de utilizare a acestora. "Regiunea Fv" cuprinde regiunile variabile atât ale lanţului greu, cât şi ale lanţului uşor, dar îi lipsesc regiunile constante.
[0095] Prezenta invenţie include fragmente scFv anti-proteină F RSV şi metode de utilizare a acestora. Termenul "Fv cu lanţ unic" sau anticorp "scFv" se referă la fragmente de anticorpi cuprinzând domeniile VH şi VL. ale unui anticorp, în care aceste domenii sunt prezente într-un singur lanţ polipeptidic. În general, polipeptida Fv cuprinde în plus un linker polipeptidic între domeniile VH şi VL. care permit scFv să formeze structura dorită pentru legarea la antigen. Pentru o analiză a scFv, vezi Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES vol. 113, ed. Rosenburg şi Moore. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315. A se vedea, de asemenea, publicaţia cererii internaţionale de brevet de invenţie nr. WO 88/01649 şi brevetele de invenţie U.S. Nr. 4.946.778 şi 5.260.203.
[0096] Prezenta invenţie include anticorpi anti-domeniul proteinei F RSV şi metode de utilizare a acestora. Un "anticorp cu domeniu" este un fragment de imunoglobulină funcţional din punct de vedere imunologic care conţine doar regiunea variabilă a unui lanţ greu sau regiunea variabilă a unui lanţ uşor. În unele cazuri, două sau mai multe regiuni VH sunt legate covalent cu un linker peptidic pentru a crea un anticorp cu domeniu bivalent. Cele două regiuni VH ale unui anticorp cu domeniu bivalent pot ţinti aceleaşi antigene sau antigene diferite.
[0097] Prezenta invenţie include anticorpi bivalenţi anti-proteina F RSV şi metode de utilizare a acestora. Un „anticorp bivalent» cuprinde două site-uri de legare la antigen. În unele cazuri, cele două site-uri de legare au aceleaşi specificităţi antigenice. Cu toate acestea, anticorpii bivalenţi pot fi bispecifici (vezi mai jos).
[0098] Prezenta invenţie include diacorpi anti-proteină F RSV şi metode de utilizare a acestora. Aşa cum este utilizat în conţinut, termenul "diacorpi" se referă la fragmente scurte de anticorpi cu două site-uri de legare la antigen, fragmente cuprinzând un domeniu variabil al lanţului greu (VH) conectat la un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) în acelaşi lanţ polipeptidic (VH-VL sau VL.-VH). Prin utilizarea unui linker prea scurt pentru a permite împerecherea între cele două domenii de pe acelaşi lanţ, domeniile sunt forţate să se împerecheze cu domeniile complementare ale unui alt lanţ şi să creeze două site-uri de legare la antigen. Diacorpii sunt descrişi mai detaliat în, de exemplu, EP 404,097; WO 93/11161şi Holliger şi colab. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Pentru o analiză generală a variantelor de anticorpi modificaţi genetic, consultaţi Holliger şi Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.
[0099] În mod tipic, un anticorp sau fragment de legare la antigen conform invenţiei, care este modificat într-un fel, îşi păstrează cel puţin 10% din activitatea sa de legare (în comparaţie cu anticorpul parental) atunci când acea activitate este exprimată molar. De preferinţă, un anticorp sau fragment de legare la antigen conform invenţiei păstrează cel puţin 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% sau 100% sau mai mult din afinitatea de legare a proteinei F RSV ca anticorp parental. De asemenea, se intenţionează ca un anticorp sau fragment de legare la antigen conform invenţiei să poată include substituţii de aminoacizi conservative sau neconservative (denumite "variante conservative" sau "variante cu funcţie conservată" ale anticorpului) care nu modifică substanţial activitatea sa biologică.
[0100] Prezenta invenţie include anticorpi izolaţi anti-proteina F hRSV şi fragmente de legare la antigen ale acestora, precum şi metode de utilizare a acestora. Anticorpii "izolaţi" sau fragmentele de legare la antigen ale acestora sunt cel puţin parţial lipsiţi de alte molecule biologice din celulele sau culturile celulare în care sunt produşi. Astfel de molecule biologice includ acizi nucleici, proteine, lipide, carbohidraţi sau alte materiale, cum ar fi resturi celulare şi mediu de creştere. Un anticorp izolat sau un fragment de legare la antigen poate fi, de asemenea, cel puţin parţial lipsit de componente ale sistemului de expresie, cum ar fi molecule biologice dintr-o celulă gazdă sau din mediul de creştere al acesteia. În general, termenul "izolat" nu este destinat să se refere la o absenţă completă a unor astfel de molecule biologice sau la o absenţă a apei, a substanţelor tampon sau a sărurilor sau la componentele unei formulări farmaceutice care include anticorpii sau fragmentele.
[0101] Prezenta invenţie include anticorpi monoclonali anti-proteina F hRSV şi fragmente de legare la antigen ale acestora, precum şi compoziţii de anticorpi monoclonali cuprinzând o pluralitate de anticorpi monoclonali izolaţi. Termenul "anticorp monoclonal", aşa cum este utilizat în conţinut, se referă la o populaţie de anticorpi substanţial omogeni, adică, moleculele de anticorpi care alcătuiesc populaţia sunt identice în ceea ce priveşte secvenţa de aminoacizi, cu excepţia posibilelor mutaţii naturale care pot fi prezente în cantităţi minore. În schimb, preparatele convenţionale de anticorpi (policlonali) includ în mod tipic o multitudine de anticorpi diferiţi având secvenţe de aminoacizi diferite în domeniile lor variabile, în particular CDR lor care sunt adesea specifice pentru epitopi diferiţi. Modificatorul "monoclonal" indică caracterul anticorpului ca fiind obţinut dintr-o populaţie substanţial omogenă de anticorpi şi nu trebuie interpretat ca necesitând producerea anticorpului prin nicio metodă anume. De exemplu, anticorpii monoclonali care urmează să fie utilizaţi în conformitate cu prezenta invenţie pot fi produşi prin metode de ADN recombinant (vezi, de exemplu, brevet de invenţie U.S. Nr. 4.816.567).
[0102] În general, unitatea structurală de bază (sau "de lungime completă") a anticorpului cuprinde un tetramer. Fiecare tetramer include două perechi identice de lanţuri polipeptidice, fiecare pereche având un lanţ "uşor" (aproximativ 25 kDa) şi un lanţ "greu" (aproximativ 50-70 kDa). Porţiunea amino-terminală a fiecărui lanţ include o regiune sau un domeniu variabil de aproximativ 100 până la 110 sau mai mulţi aminoacizi, responsabilă în principal pentru recunoaşterea antigenului. Porţiunea carboxi-terminală a lanţului greu poate defini o regiune sau un domeniu constant responsabil în principal pentru funcţia efector. În mod tipic, lanţurile uşoare umane sunt clasificate ca lanţuri uşoare kappa şi lambda. În plus, lanţurile grele umane sunt în mod tipic clasificate ca mu, delta, gamma, alfa sau epsilon şi definesc izotipul anticorpului ca IgM, IgD, IgG, IgA şi respectiv IgE. În cadrul lanţurilor uşoare şi grele, regiunile variabile şi constante sunt unite printr-o regiune "J" de aproximativ 12 sau mai mulţi aminoacizi, lanţul greu incluzând şi o regiune "D" de aproximativ 10 aminoacizi în plus. Vezi în general, Fundamental Immunology, capitolul 7 (Paul, W, ed. a 2-a. Raven Press, N.Y. (1989). În contextul unui anticorp sau al unui fragment de legare la antigen al acestuia, termenii domeniu şi regiune pot fi utilizaţi interschimbabil, acolo unde este cazul.
[0103] Regiunile variabile ale fiecărei perechi de lanţuri uşoare/grele formează situs-ul de legare al anticorpilor. Astfel, în general, un anticorp intact are două site-uri de legare. Cu excepţia anticorpilor bifuncţionali sau bispecifici, cele două site-uri de legare sunt, în general, aceleaşi.
[0104] În mod tipic, domeniile variabile atât ale lanţurilor grele, cât şi ale celor uşoare cuprind trei regiuni hipervariabile, numite şi regiuni de determinare a complementarităţii (CDR), situate în regiuni cadru (FR) relativ conservate. CDR sunt în mod tipic aliniate de regiunile cadru, permiţând legarea la un epitop specific. În general, de la N-terminal la C-terminal, domeniile variabile atât ale lanţurilor uşoare, cât şi ale celor grele cuprind FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 şi FR4. Atribuirea aminoacizilor fiecărui domeniu este, în general, în conformitate cu definiţiile Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat şi colab.; National Institutes of Health Bethesda, Md.; ediţia a 5-a; Publicaţia NIH nr. 91-3242 (1991)); Kabat, 1978, Adv. Prot. Chim. 32:1-75; Kabat şi colab, 1977, J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia şi colab, 1987, J Mol. Biol. 196:901-917 sau Chothia şi colab, 1989, Nature 342:878-883.
[0105] Aşa cum este utilizat în conţinut, termenul "regiune hipervariabilă" se referă la reziduurile de aminoacizi ale unui anticorp sau ale unui fragment de legare la antigen al acestuia, care sunt responsabile pentru legarea la antigen. Regiunea hipervariabilă cuprinde reziduuri de aminoacizi dintr-o "regiune de determinare a complementarităţii" sau "CDR" (adică CDRL1, CDRL2 şi CDRL3 în domeniul variabil al lanţului uşor şi CDRH1, CDRH2 şi CDRH3 în domeniul variabil al lanţului greu). Vezi Kabat şi colab. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, ediţia a 5-a. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda Md. (definirea regiunilor CDR ale unui anticorp prin secvenţă); vezi şi Chothia şi Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (definind regiunile CDR ale unui anticorp prin structură). Aşa cum este utilizat în conţinut, termenul de reziduuri "cadru" sau "FR" se referă la acele reziduuri de domeniu variabil, altele decât reziduurile regiunii hipervariabile definite în conţinut ca reziduuri CDR.
[0106] "Moleculă izolată de acid nucleic" sau "polinucleotidă izolată" înseamnă un ADN sau ARN de origine genomică, ARNm, ADNc sau de sinteză sau o combinaţie a acestora, care nu este asociat cu întreaga sau o porţiune a unei polinucleotide în care polinucleotida izolată se găseşte în natură sau este legată de o polinucleotidă de care nu este legată în natură. În sensul acestei dezvăluiri, trebuie înţeles faptul că "o moleculă de acid nucleic cuprinzând" o anumită secvenţă de nucleotide nu cuprinde cromozomii intacţi. Moleculele de acid nucleic izolate care "cuprind" secvenţe specificate de acid nucleic pot include, pe lângă secvenţele specificate, secvenţe codificatoare pentru până la zece sau chiar până la douăzeci sau mai multe alte proteine sau porţiuni sau fragmente ale acestora sau pot include secvenţe de reglare legate operaţional care controlează exprimarea regiunii codificatoare a secvenţelor de acid nucleic menţionate şi/sau pot include secvenţe vectoriale.
[0107] Expresia "secvenţe de control" se referă la secvenţele de ADN necesare pentru exprimarea unei secvenţe codificatoare legată operaţional într-un anumit organism gazdă. Secvenţele de control adecvate pentru procariote, de exemplu, includ un promotor, opţional o secvenţă operator şi un situs de legare a ribozomilor. Se cunoaşte faptul că celulele eucariote utilizează promotori, semnale de poliadenilare şi amplificatori.
[0108] Un acid nucleic sau o polinucleotidă este "legat operaţional" atunci când este plasat într-o relaţie funcţională cu o altă secvenţă de acid nucleic. De exemplu, ADN pentru o pre-secvenţă sau un lider secretor este legat operaţional de ADN pentru o polipeptidă dacă este exprimat ca o pre-proteină care participă la secreţia polipeptidei; un promotor sau un amplificator este legat operaţional de o secvenţă codificatoare dacă afectează transcripţia secvenţei; sau un situs de legare a ribozomilor este legat operaţional de o secvenţă codificatoare dacă este poziţionat astfel încât să faciliteze translaţia. În general, dar nu întotdeauna, "legat operaţional" înseamnă faptul că secvenţele de ADN care sunt legate sunt alăturate şi, în cazul unui lider secretor, alăturate şi în faza de citire. Cu toate acestea, amplificatorii nu trebuie să fie alăturaţi. Legarea se realizează prin ligatura la site-uri de restricţie convenabile. Dacă astfel de site-uri nu există, moleculele adaptor sau linkerii oligonucleotidici sintetici sunt utilizaţi în conformitate cu practica convenţională.
[0109] Aşa cum sunt utilizate în conţinut, expresiile "celulă", "linie celulară" şi "cultură celulară" sunt folosite interschimbabil şi toate aceste denumiri includ urmaşii. Astfel, cuvintele "transformanţi" şi "celule transformate" includ celula subiect principală şi culturile derivate din aceasta, indiferent de numărul de transferuri. De asemenea, se înţelege faptul că nu toţi urmaşii vor avea un conţinut de ADN exact identic, din cauza mutaţiilor deliberate sau accidentale. Sunt incluşi urmaşii mutanţi care au aceeaşi funcţie sau activitate biologică ca şi cea analizată în celula transformată iniţial. În cazul în care se intenţionează denumiri distincte, acest lucru va fi clarificat din context.
[0110] Aşa cum este utilizat în conţinut, "secvenţa liniei germinale" se referă la o secvenţă de secvenţe de ADN de imunoglobuline nerearanjate. Se poate utiliza orice sursă adecvată de secvenţe de imunoglobuline nerearanjate. Secvenţele liniei germinale umane pot fi obţinute, de exemplu, din bazele de date de linii germinale JOINSOLVER de pe site-ul web National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the United States National Institutes of Health. Secvenţele liniei germinale de şoarece pot fi obţinute, de exemplu, aşa cum este descris în Giudicelli şi colab, 2005, Nucleic Acids Res. 33:D256-D261.
[0111] Proprietăţi Fizice şi Funcţionale ale Anticorpilor anti-proteina F RSV Exemplari
[0112] Prezenta invenţie se referă la anticorpi anti-proteina F hRSV şi fragmente de legare la antigen ale acestora, având caracteristici structurale şi funcţionale specificate, precum şi la metode de utilizare a anticorpilor sau a fragmentelor de legare la antigen ale acestora în tratamentul sau prevenirea bolilor/afecţiunilor asociate cu infecţia cu RSV.
[0113] Un "anticorp anti-proteină F RSV sau fragment al acestuia care se leagă la antigen" include: orice anticorp sau fragment al acestuia care se leagă la antigen, aşa cum este discutat în conţinut (de exemplu, RB1) sau o variantă a acestuia (de exemplu, variantă de secvenţă sau variantă funcţională); orice anticorp sau fragment de legare la antigen cuprinzând oricare dintre CDR prezentate în Tabelul 7; orice anticorp sau fragment de legare la antigen care se leagă de acelaşi epitop din proteina F RSV uman ca şi anticorpii discutaţi în conţinut (de exemplu, RB1); şi orice anticorp sau fragment de legare la antigen care blochează încrucişat (parţial sau total) sau este blocat încrucişat (parţial sau total) de un anticorp discutat în conţinut (de exemplu, RB1) pentru legarea RSV.
[0114] Anticorpii blocanţi încrucişat şi fragmentele acestora de legare la antigen pot fi identificaţi pe baza capacităţii lor de a concura încrucişat cu un anticorp conform invenţiei în teste standard de legare (de exemplu, BIACore, ELISA, citometrie în flux). De exemplu, se pot utiliza teste ELISA standard în care o proteină F RSV recombinant este imobilizată pe placă, unul dintre anticorpi este marcat fluorescent şi se evaluează capacitatea anticorpilor nemarcaţi de a concura cu legarea anticorpului marcat. În plus sau alternativ, analiza BIAcore poate fi utilizată pentru a evalua capacitatea anticorpilor de a concura încrucişat. Capacitatea unui anticorp test de a inhiba legarea unui alt anticorp (de exemplu, anticorpul D25) la proteina F RSV demonstrează faptul că anticorpul test poate concura cu un alt anticorp (de exemplu, D25) pentru legarea la proteina F RSV şi, prin urmare, în unele cazuri, se poate lega de acelaşi epitop de pe proteina F RSV ca şi anticorpul D25 la un epitop suprapus.
[0115] Aşa cum s-a menţionat mai sus, sunt dezvăluiţi şi anticorpi şi fragmente ale acestora care se leagă de acelaşi epitop ca oricare dintre anticorpii anti-proteină F RSV sau fragmentele acestora care se leagă la antigen din prezenta invenţie. Există mai multe metode disponibile pentru map-area epitopilor de anticorpi pe antigenele ţintă, inclusiv: spectrometria de masă H/D-Ex, cristalografia cu raze X, analiza Pepscan şi mutageneza direcţionată. De exemplu, HDX (schimb de hidrogen şi deuteriu) cuplat cu proteoliză şi spectrometrie de masă poate fi utilizat pentru a determina epitopul unui anticorp pe un antigen Y specific. HDX-MS se bazează pe măsurarea şi compararea precisă a gradului de încorporare a deuteriului de către un antigen atunci când este incubat în D2O singur şi în prezenţa anticorpului său la diferite intervale de timp. Deuteriul este schimbat cu hidrogen pe catena amidică a proteinelor în zonele expuse, în timp ce regiunile antigenului legat de anticorp vor fi protejate şi vor prezenta un schimb mai mic sau lipsă după analiza prin LC-MS/MS a fragmentelor proteolitice.
[0116] Exemple de lanţuri de imunoglobulină ale anticorpilor anti-proteină F RSV, precum şi CDR acestora includ, dar nu se limitează la, cele descrise în Tabelul 7 (SECV ID NR: 1-8, 23 şi 25). Prezenta dezvăluire include orice polipeptidă cuprinzând, care constă în esenţă în sau constă în secvenţele de aminoacizi ale SECV ID NR: 1-8, 23 şi 25, şi nucleotidele recombinant care codifică astfel de polipeptide.
[0117] Sfera de întindere a protecţiei prezentei invenţii include anticorpi izolaţi anti-proteina F hRSV şi fragmente ale acestora care se leagă la antigen, cuprinzând o variantă a unui lanţ de imunoglobulină prezentat în conţinut, de exemplu, oricare dintre SECV ID NR: 7, 8; în care varianta prezintă una sau mai multe dintre următoarele proprietăţi: (i) se leagă la proteina F de pre-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET); sau (ii) se leagă la proteina F post-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-11 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 9.
[0118] În anumite variante de realizare, invenţia furnizează anticorpi sau fragmente ale acestora care se leagă la proteina F a hRSV uman şi au domenii VL şi domenii VH cu o identitate de secvenţă de cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% cu SECV ID NR: 8 (VL) şi 7 (VH); în care varianta prezintă legarea şi proprietăţile dorite, de exemplu, (i) se leagă la proteina F de pre-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET); sau (ii) se leagă la proteina F post-fuziune a RSV uman cu o valoare Kd de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-11 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 9.
[0119] "Variante modificate conservativ" sau "substituţie conservativă" se referă la substituţiile aminoacizilor dintr-o proteină cu alţi aminoacizi având caracteristici similare (de exemplu sarcina, dimensiunea lanţului lateral, caracterul hidrofob/hidrofil, conformaţia şi rigiditatea scheletului etc.), astfel încât modificările pot fi făcute frecvent fără a altera activitatea biologică a proteinei. Specialiştii din acest domeniu recunosc faptul că, în general, substituţiile unui singur aminoacid în regiunile neesenţiale ale unei polipeptide nu modifică substanţial activitatea biologică (vezi, de exemplu, Watson şi colab. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co, p. 224 (ediţia a 4-a). În plus, substituţiile aminoacizilor similari din punct de vedere structural sau funcţional sunt mai puţin susceptibile de a perturba activitatea biologică. Exemple de substituţii conservative sunt prezentate în Tabelul 1.
[0120] TABELUL 1. Substituţii Conservative Exemplare ale Aminoacizilor
Reziduu original
Substituţie conservatoare
Ala (A)
Glicemie; Ser
Arg (R)
Lys; His
Asn (N)
Gln; His
Asp (D)
Glu; Asn
Cys (C)
Ser; Ala
Gln (Q)
Asn
Glu (E)
Asp; Gln
Gly (G)
Ala
His (H)
Asn; Gln
Ile (I)
Leu; Val
Leu (L)
Ile; Val
Lys (K)
Arg; His
Met (M)
Leu; Ile; Tyr
Phe (F)
Tyr; Met; Leu
Pro (P)
Ala
Ser (S)
Thr
Thr (T)
Ser
Trp (V)
Tyr; Phe
Tyr (Y)
Trp; Phe
Val (V)
Ile; Leu
[0122] Sunt descrise, de asemenea, variante care păstrează funcţia ale anticorpilor conform invenţiei.
[0123] "Variantele cu funcţie conservativă", aşa cum sunt utilizate în conţinut, se referă la anticorpi sau fragmente în care unul sau mai multe reziduuri de aminoacizi au fost modificate fără a altera o proprietate dorită, cum ar fi afinitatea şi/sau specificitatea antigenului. Astfel de variante includ, dar nu se limitează la, înlocuirea unui aminoacid cu unul având proprietăţi similare, cum ar fi substituţiile conservatoare de aminoacizi din Tabelul 1. De asemenea, sunt furnizate polipeptide izolate cuprinzând domenii VL ale anticorpilor anti-proteină F hRSV conform invenţiei (de exemplu, SECV ID NR: 8), şi polipeptide izolate cuprinzând domenii VH (de exemplu, SECV ID NR: 7) dintre anticorpii anti-hRSV ai invenţiei având până la 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 sau mai multe substituţii de aminoacizi, care pot apărea exclusiv în regiunea cadru sau dintre care una sau mai multe pot fi localizate într-una sau mai multe CDR. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 9.
[0124] Într-o altă variantă de realizare, este furnizat un anticorp sau un fragment al acestuia care se leagă la proteina F a hRSV şi are domenii VL şi domenii VH cu cel puţin 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% sau 75% identitate de secvenţă cu unul sau mai multe dintre domeniile VL sau domeniile VH descrise în conţinut şi prezintă legare specifică la proteina F a hRSV. Într-o altă realizare, anticorpul de legare sau fragmentul de legare la antigen al acestuia din prezenta invenţie cuprinde domenii VL şi VH (cu şi fără secvenţă semnal) având până la 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 sau mai multe substituţii de aminoacizi, care pot apărea exclusiv în regiunea cadru sau dintre care una sau mai multe pot fi localizate într-una sau mai multe CDR şi prezintă legare specifică la proteina F hRSV. În anumite variante de realizare, lanţul greu sau regiunea variabilă a lanţului greu nu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 9.
[0125] Polinucleotide şi Polipeptide
[0126] Prezenta invenţie cuprinde în plus polinucleotidele care codifică oricare dintre polipeptidele sau lanţurile de imunoglobulină ale anticorpilor anti-proteină F hRSV şi fragmentele de legare la antigen ale acestora conform invenţiei. Într-o variantă de realizare, polinucleotida izolată codifică un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia cuprinzând cel puţin un domeniu variabil al lanţului uşor al imunoglobulinei mature (VL) conform invenţiei şi/sau cel puţin un domeniu variabil al lanţului greu al imunoglobulinei mature (VH) conform invenţiei. În unele variante de realizare, polinucleotida izolată codifică atât un lanţ uşor, cât şi un lanţ greu pe o singură moleculă de polinucleotidă, iar în alte variante de realizare, lanţurile uşoare şi grele sunt codificate pe molecule de polinucleotidă separate. Într-o altă variantă de realizare, polinucleotidele codifică în plus o secvenţă semnal. De exemplu, prezenta invenţie include polinucleotidele care codifică aminoacizii descrişi în SECV ID NR: 1-8, 23 şi 25, precum şi polinucleotidele care hibridizează la acestea şi, de asemenea, orice polipeptidă codificată de o astfel de polinucleotidă hibridizant. Într-o variantă de realizare, invenţia cuprinde o secvenţă de acid nucleic cuprinzând, care constă în esenţă în sau constă în SECV ID NR: 15 (lanţ greu variabil) sau SECV ID NR: 16 (lanţ uşor variabil). În anumite variante de realizare, optimizarea codonilor poate fi utilizată pentru a îmbunătăţi o proprietate a acidului nucleic, de exemplu, expresie într-o anumită gazdă. Într-o variantă de realizare, invenţia cuprinde o secvenţă de acid nucleic cuprinzând sau care constă în SECV ID NR: 17 (secvenţă variabilă grea optimizată pentru codoni) sau SECV ID NR: 18 (secvenţă variabilă uşoară optimizată pentru codoni). În anumite variante de realizare, se poate utiliza o secvenţă lider. Într-o variantă de realizare, invenţia cuprinde o secvenţă de acid nucleic cuprinzând sau constă în SECV ID NR: 19 (secvenţă lider şi lanţ greu) sau SECV ID NR: 20 (secvenţă lider şi lanţ uşor) conectată cu lanţul greu sau lanţul uşor pentru a da SECV ID NR: 21 sau respectiv SECV ID NR: 22.
[0127] În general, polinucleotidele hibridizează în condiţii de stringenţă scăzută, moderată sau ridicată şi codifică anticorpi sau fragmente ale acestora care se leagă la antigen şi care îşi menţin capacitatea de a se lega de proteina F a hRSV. O primă moleculă de polinucleotidă este "hibridizabilă" cu o a doua moleculă de polinucleotidă atunci când o formă monocatenară a primei molecule de polinucleotidă se poate lega la a doua moleculă de polinucleotidă în condiţii adecvate de temperatură şi tărie ionică a soluţiei (vezi Sambrook, şi alţii, supra). Condiţiile de temperatură şi tăria ionică determină "stringenţa" hibridizării. Condiţiile tipice de hibridizare cu stringenţă scăzută includ 55°C, 5X SSC, 0,1% SDS şi fără formamidă; sau 30% formamidă, 5X SSC, 0,5% SDS la 42°C. Condiţiile tipice de hibridizare cu stringenţă moderată sunt 40% formamidă, cu 5X sau 6X SSC şi 0,1% SDS la 42°C. Condiţiile de hibridizare cu stringenţă ridicată sunt 50% formamidă, 5X sau 6X SSC la 42°C sau, opţional, la o temperatură mai ridicată, de exemplu, 57°C, 59°C, 60°C, 62°C, 63°C, 65°C sau 68°C). În general, SSC este 0,15M NaCl şi 0,015M Na-citrat. Hibridizarea necesită ca cele două polinucleotide să conţină secvenţe complementare, deşi, în funcţie de stringenţa hibridizării, sunt posibile nepotriviri între baze. Stringenţa adecvată pentru hibridizarea polinucleotidelor depinde de lungimea polinucleotidelor şi de gradul de complementare, variabile bine cunoscute în domeniu. Cu cât este mai mare gradul de similaritate sau omologie dintre două secvenţe de nucleotide, cu atât este mai mare stringenţa sub care acizii nucleici pot hibridiza. Pentru hibrizi cu o lungime mai mare de 100 de nucleotide, au fost derivate ecuaţii pentru calcularea temperaturii de topire (vezi Sambrook şi alţii, supra, 9.50-9.51). Pentru hibridizare cu polinucleotide mai scurte, de exemplu, oligonucleotide, poziţia nepotrivirilor devine mai importantă, iar lungimea oligonucleotidei îi determină specificitatea (vezi Sambrook, şi alţii, supra, 11.7-11.8).
[0128] Într-o variantă de realizare, invenţia cuprinde o polinucleotidă izolată care codifică un domeniu variabil (VH) al lanţului greu al anticorpului sau un fragment de legare la antigen al acestuia, cuprinzând CDR-H1 (SECV ID NR: 1), CDR-H2 (SECV ID NR: 2) şi CDR-H3 (SECV ID NR: 3).
[0129] Într-o variantă de realizare, invenţia cuprinde o polinucleotidă izolată care codifică un domeniu variabil (VL) al lanţului uşor al anticorpului sau un fragment de legare la antigen al acestuia, cuprinzând CDR-L1 (SECV ID NR: 4), CDR-L2 (SECV ID NR: 5) şi CDR-L3 (SECV ID NR: 6).
[0130] Într-o variantă de realizare, invenţia cuprinde o polinucleotidă izolată care codifică domeniul variabil (VH) al lanţului greu al imunoglobulinei al SECV ID NR: 7 sau un lanţ greu al SECV ID NR: 23.
[0131] Într-o variantă de realizare, invenţia cuprinde o polinucleotidă izolată care codifică domeniul variabil (VL) al lanţului greu al imunoglobulinei al SECV ID NR: 8 sau un lanţ uşor al SECV ID NR: 25.
[0132] Prezenta invenţie furnizează, de asemenea, vectori, de exemplu, vectori de expresie, cum ar fi plasmide, cuprinzând polinucleotidele izolate ale invenţiei, în care polinucleotida este legată operaţional de secvenţe de control care sunt recunoscute de o celulă gazdă atunci când celula gazdă este transfectată cu vectorul. De asemenea, sunt furnizate celule gazdă cuprinzând un vector conform prezentei invenţii şi metode pentru producerea anticorpului sau a fragmentului de legare la antigen al acestuia sau a polipeptidei descrise în conţinut, cuprinzând cultivarea unei celule gazdă care cuprinde un vector de expresie sau un acid nucleic care codifică lanţurile de imunoglobulină ale anticorpului sau fragmentului de legare la antigen al acestuia în mediul de cultură şi izolarea antigenului sau a fragmentului de legare la antigen al acestuia din celula gazdă sau mediul de cultură.
[0133] De asemenea, în prezenta invenţie sunt incluse polipeptide, de exemplu, polipeptide imunoglobuline, cuprinzând secvenţe de aminoacizi care sunt identice în proporţie de cel puţin aproximativ 75%, 80% identice, mai preferabil cel puţin aproximativ 90% identice şi cel mai preferabil cel puţin aproximativ 95% identice (de exemplu, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) faţă de secvenţele de aminoacizi ale anticorpilor furnizaţi în conţinut atunci când comparaţia este efectuată printr-un algoritm BLAST, în care parametrii algoritmului sunt selectaţi pentru a oferi cea mai mare potrivire între secvenţele respective pe întreaga lungime a secvenţelor de referinţă respective (de exemplu, prag aşteptat: 10; dimensiune cuvânt: 3; potriviri maxime într-un interval de interogare: 0; matrice BLOSUM 62; valori spaţii: existenţă 11, extensie 1; ajustare condiţionată a matricei scorului compoziţional).
[0134] Identitatea secvenţei se referă la gradul în care aminoacizii a două polipeptide sunt identici în poziţii echivalente atunci când cele două secvenţe sunt aliniate optim.
[0135] Următoarele referinţe se referă la algoritmii BLAST adesea utilizaţi pentru analiza secvenţelor: ALGORITMI BLAST: Altschul şi colab., (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109; Altschul, S.F. şi colab, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. şi colab, (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. şi colab, (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. şi colab, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J, şi colab, (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C. şi colab, (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. şi colab, (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS, M.O. şi colab, "A model of evolutionary change in proteins" in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, supliment 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found, Washington, DC; Schwartz, R.M. şi colab, "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found, Washington, DC; Altschul, S.F, (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J. şi colab, (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S. şi colab, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F. şi colab, (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S. şi colab, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S. şi colab, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A, şi colab, (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039 şi Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York.
[0136] Afinitate de Legare
[0137] Cu titlu de exemplu, şi fără a se limita la aceasta, anticorpii şi fragmentele de legare la antigen descrise în conţinut se pot lega de proteina F de pre-fuziune a RSV uman sau de proteina F de post-fuziune cu o valoare KD de cel puţin aproximativ 1 x 10-9 M (adică un valoarea KD 1 x 10-9 M sau mai mică) determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). Într-o variantă de realizare, anticorpii şi fragmentele de legare la antigen descrise în conţinut se pot lega de proteina F de pre-fuziune a RSV uman sau de proteina F de post-fuziune cu o valoare KD de cel puţin aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). Într-o variantă de realizare, anticorpii şi fragmentele de legare la antigen descrise în conţinut se pot lega de proteina F de pre-fuziune a RSV uman sau de proteina F de post-fuziune cu o valoare KD de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET). Într-o variantă de realizare, anticorpii şi fragmentele de legare la antigen descrise în conţinut se pot lega de proteina F de pre-fuziune a RSV uman sau de proteina F de post-fuziune cu o valoare KD de cel puţin aproximativ 100 pM (adică o valoare KD de aproximativ 100 pM sau mai mică) determinată prin BIACORE sau o tehnică similară. Într-o variantă de realizare, anticorpii şi fragmentele de legare la antigen dezvăluite în conţinut se pot lega de proteina F de pre-fuziune a RSV uman sau de proteina F de post-fuziune cu o valoare KD de cel puţin aproximativ 10 pM (adică o valoare KD cu aproximativ 10 pm mai mică) determinată prin BIACORE sau o tehnică similară. Într-o variantă de realizare, anticorpii şi fragmentele de legare la antigen conform invenţiei se pot lega de proteina F de pre-fuziune a RSV uman sau de proteina F de post-fuziune cu o valoare KD de aproximativ 1 pM până la aproximativ 100 pM, determinat prin BIACORE sau o tehnică similară.
[0138] Metode de Obţinere a Anticorpilor şi a Fragmentelor Acestora de Legare la Antigen
[0139] Prezenta invenţie include metode pentru producerea unui anticorp anti-proteină F hRSV sau a unui fragment al acestuia care se leagă la antigen conform prezentei invenţii, cuprinzând cultivarea unei linii celulare care exprimă anticorpul sau fragmentul în condiţii favorabile unei astfel de exprimări şi, opţional, izolarea anticorpului sau fragmentului din celule şi/sau din mediul de creştere (de exemplu, mediu de cultură celulară).
[0140] Anticorpii anti-proteină F hRSV descrişi în conţinut pot fi produşi şi recombinant (de exemplu, într-un sistem de expresie E. coli/T7, la nivelul celulelor mamiferelor sau un sistem de expresie la nivelul eucariotelor inferioare). În această realizare, acizii nucleici care codifică moleculele de imunoglobulină de anticorpi ale invenţiei (de exemplu, VH sau VL.) poate fi inserat într-o plasmidă bazată pe pET şi exprimat în sistemul E. coli /T7. De exemplu, prezenta invenţie include metode pentru exprimarea unui anticorp sau a unui fragment de legare la antigen al acestuia sau a unui lanţ de imunoglobulină al acestuia într-o celulă gazdă (de exemplu, celula gazdă bacteriană, cum ar fi E. coli cum ar fi BL21 sau BL21DE3) cuprinzând exprimarea ARN polimerazei T7 în celulă, care include şi o polinucleotidă care codifică un lanţ de imunoglobulină care este legat operaţional de un promotor T7. De exemplu, într-o variantă de realizare a invenţiei, o celulă gazdă bacteriană, cum ar fi E. coli, include o polinucleotidă care codifică gena ARN polimerazei T7 legată operaţional de un promotor lac şi expresia polimerazei şi a lanţului este indusă prin incubarea celulei gazdă cu IPTG (izopropil-beta-D-tiogalactopiranozidă).
[0141] Există mai multe metode prin care se pot produce anticorpi recombinant, care sunt cunoscute în domeniu. Un exemplu de metodă pentru producerea recombinantă de anticorpi este descris în brevetul de invenţie U.S. Nr. 4.816.567.
[0142] Transformarea se poate realiza prin orice metodă cunoscută pentru introducerea polinucleotidelor într-o celulă gazdă. Metodele de introducere a polinucleotidelor heterologe în celulele mamiferelor sunt bine cunoscute în domeniu şi includ transfecţia mediată de dextran, precipitarea cu fosfat de calciu, transfecţia mediată de polibren, fuziunea protoplastelor, electroporarea, încapsularea polinucleotidei (polinucleotidelor) în lipozomi, injecţia biolistică şi microinjecţia directă a ADN în nuclee. În plus, moleculele de acid nucleic pot fi introduse în celulele mamiferelor prin vectori virali. Metodele de transformare a celulelor sunt bine cunoscute în domeniu. A se vedea, de exemplu, brevetele de invenţie U.S. Nr. 4.399.216; 4.912.040; 4.740.461 şi 4.959.455.
[0143] Astfel, prezenta invenţie include metode recombinant pentru producerea unui anticorp anti-hRSV sau a unui fragment de legare la antigen al acestuia conform prezentei invenţii sau a unui lanţ de imunoglobulină al acestuia, cuprinzând introducerea unei polinucleotide care codifică unul sau mai multe lanţuri de imunoglobulină ale anticorpului sau fragmentului (de exemplu, lanţ greu şi/sau uşor de imunoglobulină); cultivarea celulei gazdă (de exemplu, CHO sau Pichia sau Pichia pastoris) în condiţii favorabile unei astfel de exprimări şi, opţional, izolarea anticorpului, fragmentului sau lanţului din celula gazdă şi/sau mediul în care este crescută celula gazdă.
[0144] Anticorpii anti-proteina F hRSV pot fi, de asemenea, sintetizaţi prin oricare dintre metodele prezentate în brevetul de invenţie U.S. Nr. 6.331.415.
[0145] Celulele gazdă eucariote şi procariote, inclusiv celulele de mamifer drept gazde pentru exprimarea anticorpilor sau fragmentelor sau lanţurilor de imunoglobuline descrise în conţinut, sunt bine cunoscute în domeniu şi includ multe linii celulare imortalizate disponibile de la American Type Culture Collection (ATCC). Acestea includ: printre altele, Celule ovariene de hamster chinezesc (CHO), NSO, celule SP2, celule HeLa, celule renale de pui de hamster (BHK), celule renale de maimuţă (COS), celule de carcinom hepatocelular uman (de exemplu, Celulele Hep G2), A549, celulele 3T3, celulele HEK-293 şi o serie de alte linii celulare. Celulele gazdă de mamifere includ celule umane, de şoarece, şobolan, câine, maimuţă, porc, capră, bovină, cal şi hamster. Liniile celulare de preferinţă specială sunt selectate prin determinarea liniilor celulare care au niveluri ridicate de expresie. Alte linii celulare care pot fi utilizate sunt liniile celulare de insecte, cum ar fi celulele Sf9, celulele amfibiene, celulele bacteriene, celulele vegetale şi celulele fungice. Celulele fungice includ celule de drojdie şi fungi filamentoşi, inclusiv, de exemplu, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens şi Neurospora crassa. Pichia sp., oricare dintre Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, oricare dintre Kluyveromyces sp., Candida albicans, oricare dintre Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, oricare dintre Fusarium sp., Yarrowia lipolytica, şi Neurospora crassa. Când vectorii de expresie recombinanţi care codifică lanţul greu sau porţiunea sau fragmentul acestuia care se leagă la antigen, lanţul uşor şi/sau fragmentul acestuia care se leagă la antigen sunt introduşi în celule gazdă de mamifere, anticorpii sunt produşi prin cultivarea celulelor gazdă pentru o perioadă de timp suficientă pentru a permite exprimarea anticorpului sau fragmentului sau lanţului în celulele gazdă sau secreţia acestuia în mediul de cultură în care sunt crescute celulele gazdă.
[0146] Anticorpii şi fragmentele acestora care se leagă la antigen, precum şi lanţurile de imunoglobuline pot fi recuperate din mediul de cultură utilizând metode standard de purificare a proteinelor. În plus, exprimarea anticorpilor şi a fragmentelor acestora care se leagă la antigen şi a lanţurilor de imunoglobuline ale invenţiei (sau a altor componente ale acestora) din liniile celulare de producţie poate fi îmbunătăţită utilizând o serie de tehnici cunoscute. De exemplu, sistemul de exprimare a genei glutamin sintetazei (sistemul GS) este o abordare comună pentru îmbunătăţirea exprimării în anumite condiţii. Sistemul GS este discutat în întregime sau parţial în legătură cu brevetele de invenţie europene Nr. 0 216 846, 0 256 055 şi 0 323 997 şi cererea de brevet de invenţie europeană Nr. 89303964.4. Astfel, într-o variantă de realizare a invenţiei, celulele gazdă de mamifere (de exemplu, CHO) nu au o genă a glutamin sintetazei şi sunt cultivate în absenţa glutaminei în mediu, în care, totuşi, polinucleotida care codifică lanţul de imunoglobulină cuprinde o genă a glutamin sintetazei care completează lipsa genei în celula gazdă.
[0147] Prezenta invenţie include metode pentru purificarea unui anticorp anti-hRSV sau a unui fragment al acestuia care se leagă la antigen conform prezentei invenţii, cuprinzând introducerea unei probe care conţine anticorpul sau fragmentul într-un mediu de purificare (de exemplu, mediu de schimb cationic, mediu de schimb anionic, mediu de schimb hidrofob, mediu de purificare prin afinitate (de exemplu, proteina-A, proteina-G, proteina-A/G, proteina-L)) şi fie colectarea anticorpului sau fragmentului purificat din fracţiunea de flux a probei respective care nu se leagă de mediu; fie, aruncarea fracţiunii de flux şi eluarea anticorpului sau fragmentului legat din mediu şi colectarea eluatului. Într-o variantă de realizare conform invenţiei, mediul se află într-o coloană pe care se aplică proba. Într-o variantă de realizare a invenţiei, metoda de purificare este efectuată după exprimarea recombinantă a anticorpului sau fragmentului într-o celulă gazdă, de exemplu, în care celula gazdă este mai întâi lizată şi, opţional, lizatul este purificat de materiale insolubile înainte de purificarea pe un mediu.
[0148] În general, glicoproteinele produse într-o anumită linie celulară sau de animal transgenic vor avea un model de glicozilare caracteristic glicoproteinelor produse în linia celulară sau de animal transgenic. Prin urmare, modelul particular de glicozilare al unui anticorp va depinde de linia celulară sau de animal transgenic specific utilizat pentru a produce anticorpul. Cu toate acestea, toţi anticorpii codificaţi de moleculele de acid nucleic furnizate în conţinut sau cuprinzând secvenţele de aminoacizi furnizate în conţinut, cuprind prezenta invenţie, independent de modelul de glicozilare pe care îl pot avea anticorpii. În mod similar, în anumite variante de realizare, anticorpii cu un model de glicozilare cuprinzând doar anticorpi nefucozilaţi. N-glicanii pot fi avantajoşi, deoarece s-a demonstrat faptul că aceşti anticorpi prezintă în mod tipic o eficacitate mai puternică decât omologii lor cu fucoză, atât in vitro şi in vivo (A se vedea de exemplu, Shinkawa şi colab, J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); brevetele de invenţie U.S. Nr. 6.946.292 şi 7.214.775). Este puţin probabil ca aceşti anticorpi cu N-glicani nefucozilaţi să fie imunogeni deoarece structurile lor carbohidrat sunt o componentă normală a populaţiei existente în IgG serice umane.
[0149] Prezenta invenţie include anticorpi bispecifici şi bifuncţionali şi fragmente de legare la antigen având o specificitate de legare pentru proteina F a hRSV şi un alt antigen, cum ar fi, de exemplu, proteina G a hRSV, şi metode de utilizare a acestora. Un anticorp bispecific sau bifuncţional este un anticorp hibrid artificial având două perechi diferite de lanţuri grele/uşoare şi două site-uri de legare diferite. Anticorpii bispecifici pot fi produşi printr-o varietate de metode, inclusiv fuziunea hibridoamelor sau legarea fragmentelor Fab'. A se vedea, de exemplu, Songsivilai, şi colab, (1990) Clin. Exp. Imunol. 79: 315-321, Kostelny, şi colab, (1992) J Immunol. 148:1547-1553. În plus, anticorpii bispecifici se pot forma ca "diacorpi" (Holliger şi colab, (1993) PNAS SUA 90:6444-6448) sau de tip "Janusin" (Traunecker şi colab, (1991) EMBO J. 10:3655-3659) şi Traunecker şi colab, (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:51-52).
[0150] Prezenta invenţie include, de asemenea, fragmente de legare la antigen anti proteina F hRSV ale anticorpilor anti-hRSV descrişi în conţinut. Fragmentele de anticorpi includ fragmente F(ab)2, care pot fi produse prin clivajul enzimatic a unei IgG de către, de exemplu, pepsină. Fragmentele Fab pot fi produse, de exemplu, prin reducerea F(ab)2 cu ditiotreitol sau mercaptoetilamină.
[0151] Imunoglobulinele pot fi atribuite diferitelor clase în funcţie de secvenţele de aminoacizi ale domeniului constant al lanţurilor lor grele. Există cel puţin cinci clase principale de imunoglobuline: IgA, IgD, IgE, IgG şi IgM, iar câteva dintre acestea pot fi împărţite în continuare în subclase (izotipuri). de exemplu IgG1, IgG2, IgG3 şi IgG4; IgA1 şi IgA2. Invenţia cuprinde anticorpi şi fragmente de legare la antigen din oricare dintre aceste clase sau subclase de anticorpi.
[0152] Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen cuprinde o regiune constantă a lanţului greu, de exemplu o regiune constantă umană, cum ar fi regiunea constantă a lanţului greu uman γ1, γ2, γ3 sau γ4 sau o variantă a acesteia. Într-o altă variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen cuprinde o regiune constantă a lanţului uşor, de exemplu, o regiune constantă a lanţului uşor uman, cum ar fi regiunea lanţului uşor uman lambda sau kappa sau o variantă a acesteia. De exemplu, şi fără a se limita la aceasta, regiunea constantă a lanţului greu uman poate fi y4, iar regiunea constantă a lanţului uşor uman poate fi kappa. Într-o variantă alternativă, regiunea Fc a anticorpului este y4 cu o mutaţie Ser228Pro (Schuurman, J şi colab., 2001, Mol. Imunol. 38: 1-8).
[0153] Într-o variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen cuprinde o regiune constantă a lanţului greu a subtipului IgG1.
[0154] În unele variante de realizare, diferite domenii constante pot fi adăugate la regiuni VL şi VH derivate din CDR furnizate în conţinut. De exemplu, dacă o anumită utilizare intenţionată a unui anticorp (sau fragment) conform prezentei invenţii ar necesita funcţii efector modificate, se poate utiliza un domeniu constant al lanţului greu, altul decât IgG1 uman, sau se poate utiliza un hibrid IgG1/IgG4.
[0155] Deşi anticorpii IgG1 umani au un timp de înjumătăţire lung şi funcţii efector, cum ar fi activarea complementului şi citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpi, astfel de activităţi pot să nu fie de dorit pentru toate utilizările anticorpului. În astfel de cazuri, se poate utiliza, de exemplu, un domeniu constant IgG4 uman. Prezenta invenţie include anticorpi anti-proteina F hRSV şi fragmente de legare la antigen ale acestora, cuprinzând un domeniu constant IgG4, de exemplu, antagonist, anticorpi şi fragmente anti-proteină F hRSV umanizaţi şi metode de utilizare a acestora. Într-o variantă de realizare, domeniul constant IgG4 poate diferi de domeniul constant IgG4 uman nativ (Swiss-Prot Număr de acces P01861.1) la o poziţie corespunzătoare poziţiei 228 în sistemul EU şi poziţiei 241 în sistemul KABAT, unde Ser108 nativ este înlocuit cu Pro, pentru a preveni o potenţială legătură disulfidică inter-catenară între Cys106 şi Cys109 (corespunzătoare poziţiilor Cys 226 şi Cys 229 în sistemul EU şi poziţiilor Cys 239 şi Cys 242 în sistemul KABAT) care ar putea interfera cu formarea corectă a legăturii disulfidice intra-catenară. A se vedea Angal şi colab. (1993) Mol. Imunol. 30:105În alte cazuri, se poate utiliza un domeniu constant IgG1 modificat, care a fost modificat pentru a creşte timpul de înjumătăţire sau a reduce funcţia efectoare.
[0156] Obţinerea Anticorpilor prin Inginerie Genetică
[0157] Anticorpii conform invenţiei pot fi supuşi unor mutaţii ale cadrului pentru a îmbunătăţi proprietăţile anticorpului. O astfel de modificare a cadrului implică mutarea unuia sau mai multor reziduuri din regiunea cadrului sau chiar din una sau mai multe regiuni CDR, pentru a elimina epitopii celulelor T şi, astfel, a reduce potenţiala imunogenitate a anticorpului. Această abordare este denumită şi "deimunizare" şi este descrisă mai detaliat în brevetul de invenţie U.S. Nr. 7.125.689.
[0158] În anumite variante de realizare, va fi de dorit să se schimbe anumiţi aminoacizi care conţin lanţuri laterale expuse cu un alt reziduu de aminoacid pentru a asigura o stabilitate chimică mai mare a anticorpului final, astfel încât să se evite de-amidarea sau izomerizarea. De-amidarea asparaginei poate avea loc pe secvenţele NG, DG, NG, NS, NA, NT, QG sau QS şi poate duce la crearea unui reziduu de acid izoaspartic care introduce o îndoire în lanţul polipeptidic şi îi scade stabilitatea (efectul acidului izoaspartic). Izomerizarea poate avea loc la secvenţele DG, DS, DA sau DT. În anumite variante de realizare, anticorpii din prezenta dezvăluire nu conţin site-uri de de-amidare sau izomerie asparaginei.
[0159] De exemplu, un reziduu de asparagină (Asn) poate fi substituit în Gln sau Ala pentru a reduce potenţialul de formare a izoaspartatului la orice secvenţă Asn-Gly, în particular într-o CDR. O problemă similară poate apărea la o secvenţă Asp-Gly. Reissner şi Aswad (2003) Cell. Mol. Life Science. 60:1281Formarea de izoaspartat poate slăbi sau anula complet legarea unui anticorp la antigenul său ţintă. A se vedea, Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 la 734. Într-o variantă de realizare, asparagina este transformată în glutamină (Gln). De asemenea, poate fi de dorit să se modifice un aminoacid adiacent unui reziduu de asparagină (Asn) sau glutamină (Gln) pentru a reduce probabilitatea de-amidării, care apare la rate mai mari atunci când aminoacizi mici apar adiacent asparaginei sau glutaminei. A se vedea, Bischoff şi Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261. În plus, orice reziduuri de metionină (în mod tipic Met expuse la solvent) din CDR pot fi substituie în Lys, Leu, Ala sau Phe sau alţi aminoacizi pentru a reduce posibilitatea oxidării sulfului de metionină, ceea ce ar putea reduce afinitatea de legare la antigen şi ar putea contribui, de asemenea, la heterogenitatea moleculară în prepararea finală a anticorpilor. Id. În plus, pentru a preveni sau minimiza potenţialele legături peptidice Asn-Pro scindabile, ar putea fi de dorit să se modifice orice combinaţii Asn-Pro regăsite într-o CDR în Gln-Pro, Ala-Pro sau Asn-Ala. Anticorpii cu astfel de substituţii sunt ulterior analizaţi pentru a se asigura faptul că substituţiile nu scad afinitatea sau specificitatea anticorpului pentru proteina F hRSV sau altă activitate biologică dorită la niveluri inacceptabile.
[0160] TABELUL 2. Variante CDR de Stabilizare Exemplare
Reziduu CDR
Secvenţă Variant de Stabilizare
Asn-Gly
Gln-Gly, Ala-Gly sau Asn-Ala
(N-G)
(Q-G), (A-G) sau (N-A)
Asp-Gly
Glu-Gly, Ala-Gly sau Asp-Ala
(D-G)
(E-G), (A-G) sau (D-A)
Met (în mod tipic expus la solvent)
Lys, Leu, Ala sau Phe
(M)
(K), (L), (A) sau (F)
Asn
Gln sau Ala
(N)
(Q) sau (R)
Asn-Pro
Gln-Pro, Ala-Pro sau Asn-Ala
(N-P)
(Q-P), (A-P) sau (N-A)
[0162] Obţinerea prin Ingineria Genetică a Anticorpilor din Regiunea Fc
[0163] Anticorpii şi fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) poate fi, de asemenea, modificate prin inginerie genetică pentru a include modificări în regiunea Fc, în mod tipic pentru a altera una sau mai multe proprietăţi ale anticorpului, cum ar fi timpul de înjumătăţire seric, fixarea complementului, legarea receptorului Fc şi/sau funcţia efector (de exemplu, citotoxicitate celulară dependentă de antigen). În plus, anticorpii şi fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) pot fi modificate chimic (de exemplu, una sau mai multe componente chimice pot fi ataşate la anticorp) sau pot fi modificate pentru a-i altera glicozilarea, din nou pentru a altera una sau mai multe proprietăţi ale anticorpului sau fragmentului. Fiecare dintre aceste variante de realizare este descrisă mai detaliat mai jos. Numerotarea reziduurilor din regiunea Fc este cea din indexul EU al Kabat.
[0164] Anticorpii şi fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) includ, de asemenea, anticorpi şi fragmente cu regiuni Fc modificate (sau blocate) pentru a furniza funcţii efector alterate. A se vedea, de exemplu, brevet de invenţie U.S. Nr. 5.624.821; publicaţiile de cereri internaţionale de brevet de invenţie WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702. Astfel de modificări pot fi utilizate pentru a intensifica sau suprima diverse reacţii ale sistemului imunitar, cu posibile efecte benefice în diagnostic şi terapie. Modificările regiunii Fc includ modificări ale aminoacizilor (substituţii, deleţii şi inserţii), glicozilare sau deglicozilare şi adăugarea mai multor regiuni Fc. Modificările regiunii Fc pot altera, de asemenea, timpul de înjumătăţire al anticorpilor din anticorpii terapeutici, permiţând o dozare mai puţin frecventă şi, prin urmare, o comoditate sporită şi o utilizare redusă a materialului. A se vedea Presta, 2005, J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 la 734-35.
[0165] Într-o variantă de realizare a invenţiei, regiunea balama a CH1 este modificată astfel încât numărul de reziduuri de cisteină din regiunea balama este crescut sau scăzut. Această abordare este descrisă mai detaliat în brevetul de invenţie U.S. Nr. 5.677.425. Numărul de reziduuri de cisteină din regiunea balama a CH1 este modificat, de exemplu, pentru a facilita asamblarea lanţurilor uşoare şi grele sau pentru a creşte sau a reduce stabilitatea anticorpului.
[0166] Într-o altă variantă de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform invenţiei (de exemplu, RB1) este modificat pentru a-i creşte timpul de înjumătăţire biologic. Sunt posibile diverse abordări. De exemplu, se pot introduce una sau mai multe dintre următoarele mutaţii: T252L, T254S, T256F, aşa cum este descris în brevetul de invenţie U.S. Nr. 6.277.375. Alternativ, pentru a creşte timpul de înjumătăţire biologic, anticorpul poate fi modificat în regiunea CH1 sau CL pentru a conţine un epitop de legare a receptorului de salvare, prelevat din două bucle ale unui domeniu CH2 al unei regiuni Fc a unui IgG, aşa cum este descris în brevetele de invenţie U.S. Nr. 5.869.046 şi 6.12.022. Într-o variantă de realizare, este introdusă o mutaţie M252Y/S254T/T256E (YTE). A se vedea, de exemplu, Oganesyan şi colab, Mol. Imunol. 2009, 46:1750.
[0167] În alte variante de realizare, regiunea Fc este modificată prin înlocuirea a cel puţin unui reziduu de aminoacid cu un reziduu de aminoacid diferit pentru a modifica funcţia (funcţiile) efector ale anticorpului sau fragmentului de legare la antigen. De exemplu, unul sau mai mulţi aminoacizi selectaţi dintre reziduurile de aminoacizi 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 şi 322 pot fi înlocuiţi cu un reziduu de aminoacid diferit, astfel încât anticorpul să aibă o afinitate modificată pentru un ligand efector şi să păstreze capacitatea de legare la antigen a anticorpului părinte. Ligandul efector faţă de care afinitatea este modificată poate fi, de exemplu, un receptor Fc sau componenta C1 a complementului. Această abordare este descrisă mai detaliat în brevetele de invenţie U.S. Nr. 5.624.821 şi .564.8260.
[0168] Într-un alt exemplu, unul sau mai mulţi aminoacizi selectaţi dintre reziduurile de aminoacizi 329, 331 şi 322 pot fi înlocuiţi cu un reziduu de aminoacid diferit, astfel încât anticorpul să aibă legarea C1q modificată şi/sau să reducă sau să anuleze citotoxicitatea dependentă de complement (CDC). Această abordare este descrisă mai detaliat în brevetul de invenţie U.S. Nr. 6.194.551.
[0169] Într-un alt exemplu, unul sau mai multe reziduuri de aminoacizi din poziţiile de aminoacizi 231 şi 239 sunt modificate pentru a modifica astfel capacitatea anticorpului de a fixa complementul. Această abordare este descrisă în detaliu în Publicaţia Cererii Internaţionale de brevet de invenţie nr. WO 94/29351.
[0170] Într-un alt exemplu, regiunea Fc este modificată pentru a reduce capacitatea anticorpului sau a fragmentului de legare la antigen conform invenţiei (de exemplu, RB1) pentru a media citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpi (ADCC) şi/sau pentru a reduce afinitatea anticorpului sau fragmentului pentru un receptor Fcy prin modificarea unuia sau mai multor aminoacizi la următoarele poziţii: 238, 239, 243, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 sau 439. Această abordare este descrisă mai detaliat în publicaţia Cererii Internaţionale de brevet de invenţie nr. WO 00/42072. Mai mult, au fost mapate site-urile de legare de pe IgG1 uman pentru FcγR1, FcyRII, FcyRIII şi FcRn şi au fost descrise variante cu legare îmbunătăţită (a se vedea Shields şi colab. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604).
[0171] Într-o variantă de realizare a invenţiei, regiunea Fc este modificată pentru a reduce capacitatea anticorpului conform invenţiei (de exemplu, RB1) pentru a media funcţia efector şi/sau pentru a creşte proprietăţile antiinflamatorii prin modificarea reziduurilor 243 şi 264. Într-o realizare, regiunea Fc a anticorpului sau fragmentului este modificată prin schimbarea reziduurilor din poziţiile 243 şi 264 în alanină. Într-o realizare, regiunea Fc este modificată pentru a reduce capacitatea anticorpului sau fragmentului de a media funcţia efector şi/sau de a creşte proprietăţile antiinflamatorii prin modificarea reziduurilor 243, 264, 267 şi 328.
[0172] Îmbunătăţirea Funcţiei Efector
[0173] În unele variante de realizare, regiunea Fc a unui anticorp anti-hRSV este modificată pentru a creşte capacitatea anticorpului sau a fragmentului de legare la antigen de a media funcţia efector şi/sau de a creşte legarea acestora la receptorii Fcgamma (FcyR).
[0174] Termenul "Funcţie efector", aşa cum este utilizat în conţinut, se referă la unul sau mai multe dintre următoarele răspunsuri mediate de activitatea citotoxică mediată de celule dependentă de anticorpi (ADCC), răspunsurile mediate de activitatea citotoxică dependentă de complement (CDC), fagocitoza mediată de Fc sau fagocitoza celulară dependentă de anticorpi (ADCP) şi reciclarea anticorpilor prin intermediul receptorului FcRn.
[0175] Se consideră că interacţiunea dintre regiunea constantă a unei proteine care se leagă la antigen şi diverşi receptori Fc (FcR), inclusiv FcgammaRI (CD64), FcgammaRII (CD32) şi FcgammaRIII (CD16), mediază funcţiile efector, cum ar fi ADCC şi CDC, ale proteinei care se leagă la antigen. Receptorul Fc este, de asemenea, important pentru reticularea anticorpilor, care poate fi importantă pentru imunitatea antitumorală.
[0176] Funcţia efector poate fi măsurată în mai multe moduri, inclusiv, de exemplu, prin legarea FcyRIII la celulele Natural Killer sau prin FcyRI la monocite/macrofage pentru a măsura funcţia efector ADCC. De exemplu, o proteină de legare la antigen din prezenta invenţie poate fi evaluată pentru funcţia efector ADCC într-un test al celulelor Natural Killer. Exemple de astfel de teste pot fi regăsite în Shields şi colab, 2001 J. Biol. Chem, Vol. 276, p. 6591-6604; Chappel şi colab, 1993 J. Biol. Chim. 268: 25124-25131; Lazar şi colab, 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103:4005-4010.
[0177] Proprietăţile ADCC sau CDC ale anticorpilor prezentei invenţii sau proprietăţile lor de reticulare pot fi îmbunătăţite în mai multe moduri.
[0178] S-a demonstrat faptul că regiunile constante ale IgG1 umane care conţin mutaţii specifice sau glicozilare alterată pe reziduul Asn297 accentuează legarea la receptorii Fc. În unele cazuri, s-a demonstrat, de asemenea, faptul că aceste mutaţii sporesc ADCC şi CDC (Lazar şi colab, Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103:4005-4010; Shields şi colab, J Biol Chem 2001, 276:6591-6604; Nechansky şi colab, Mol Immunol 2007, 44:1815-1817).
[0179] Într-o variantă de realizare a prezentei invenţii, astfel de mutaţii se află într-una sau mai multe poziţii selectate dintre 239, 332 şi 330 (IgG1) sau poziţiile echivalente în alte izotipuri IgG. Exemple de mutaţii adecvate sunt S239D, I332E şi A330L. Într-o variantă de realizare, proteina de legare la antigen conform invenţiei descrisă în conţinut este mutată la poziţiile 239 şi 332, de exemplu S239D şi I332E sau, într-o altă variantă de realizare, este mutată la trei sau mai multe poziţii selectate dintre 239, 332 şi 330, de exemplu S239D, I332E şi A330L. (Numerotare index UE).
[0180] Într-o variantă alternativă a prezentei invenţii, este prevăzut un anticorp cuprinzând o regiune constantă a lanţului greu cu un profil de glicozilare modificat, astfel încât proteina de legare la antigen are o funcţie efector îmbunătăţită. De exemplu, în care anticorpul are ADCC îmbunătăţit sau CDC îmbunătăţit sau în care are atât funcţie efector ADCC, cât şi CDC îmbunătăţite. Exemple de metodologii adecvate pentru a produce proteine de legare la antigen cu un profil de glicozilare modificat sunt descrise în publicaţiile cererilor de brevet internaţionale nr. WO2003011878 şi WO2006014679 şi cererea de brevet european nr. EP 1.229.125.
[0181] Într-un alt aspect, prezenta invenţie furnizează anticorpi "ne-fucozilaţi" sau "afucozilaţi". Anticorpii nefucozilaţi au o structură centrală tri-manozilică de N-glicani de tip complex din Fc fără reziduuri de fucoză. Aceşti anticorpi glico produşi prin inginerie genetică cărora le lipseşte reziduul de fucoză centrală din N-glicanii Fc pot prezenta o ADCC mai puternică decât echivalenţii fucozilaţi datorită creşterii capacităţii de legare a FcyRIIIa.
[0182] Prezenta invenţie furnizează, de asemenea, o metodă pentru producerea unui anticorp conform invenţiei, cuprinzând etapele de: a) cultivare a unei celule gazdă recombinant cuprinzând un vector de expresie cuprinzând un acid nucleic izolat aşa cum este descris în conţinut, în care celula gazdă recombinant nu cuprinde o alfa-1,6-fucoziltransferază; şi b) recuperare a proteinei de legare la antigen. Celula gazdă recombinant poate să nu conţină în mod normal o genă care codifică o alfa-1,6-fucoziltransferază (de exemplu, celule gazdă de drojdie, cum ar fi Pichia sp.) sau poate fi modificată genetic pentru a inactiva o alfa-1,6-fucoziltransferază. Sunt disponibile celule gazdă recombinant care au fost modificate genetic pentru a inactiva gena FUT8 care codifică o alfa-1,6-fucoziltransferază. A se vedea, de exemplu, sistem tehnologic POTELLIGENT™ disponibil de la BioWa, Inc. (Princeton, N.J.) în care celulele CHOK1SV cărora le lipseşte o copie funcţională a genei FUT8 produc anticorpi monoclonali cu activitate de citotoxicitate mediată de celule dependentă de anticorpi (ADCC) îmbunătăţită, care este crescută în raport cu un anticorp monoclonal identic produs într-o celulă cu o genă FUT8 funcţională. Aspecte ale sistemului tehnologic POTELLIGENT™ sunt descrise în brevetul de invenţie U.S. Nr. 7.214.775; 6.946.292 şi cererile internaţionale de brevet nr. WO0061739 şi WO0231240. Persoanele de specialitate în domeniu vor recunoaşte şi alte sisteme adecvate.
[0183] Va fi evident pentru specialiştii în domeniu faptul că astfel de modificări pot fi utilizate nu numai singure, ci pot fi utilizate în combinaţie unele cu altele pentru a îmbunătăţi în continuare funcţia efector.
[0184] Obţinerea de Anticorpi cu Glicozilare Modificată
[0185] Într-o altă variantă de realizare, anticorpii sau fragmentele de legare la antigen conform invenţiei (de exemplu, RB1) prezintă un anumit model de glicozilare. De exemplu, se poate produce un anticorp sau un fragment afucosilat sau aglicozilat (adică, anticorpul nu conţine fucoză sau respectiv, glicozilare). Modelul de glicozilare al unui anticorp sau fragment poate fi modificat, de exemplu, pentru a creşte afinitatea sau aviditatea anticorpului sau fragmentului pentru un antigen proteic F al hRSV. Astfel de modificări pot fi realizate, de exemplu, prin modificarea unuia sau mai multor site-uri de glicozilare din secvenţa anticorpului sau fragmentului. De exemplu, se pot realiza una sau mai multe substituţii de aminoacizi care duc la îndepărtarea unuia sau mai multor site-uri de glicozilare ale cadrului regiunii variabile pentru a elimina astfel glicozilarea la acel situs. O astfel de aglicozilare poate creşte afinitatea sau aviditatea anticorpului sau fragmentului pentru antigen. A se vedea, de exemplu, brevetele de invenţie U.S. Nr. 5.714.350 şi 6.350.861.
[0186] Anticorpi şi fragmente de legare la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) poate include, de asemenea, pe cele produse în celulele gazdă eucariote inferioare, în particular celulele gazdă fungice, cum ar fi drojdia şi ciupercile filamentoase, care au fost modificate genetic pentru a produce glicoproteine care au modele de glicozilare asemănătoare mamiferelor sau oamenilor (vezi, de exemplu, Choi şi colab, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5022-5027; Hamilton şi colab, (2003) Science 301: 1244-1246; Hamilton şi colab, (2006) Science 313: 1441-1443; Nett şi colab, (2011) Yeast 28(3):237-52; Hamilton şi colab, (2007) Curr Opin Biotechnol. Oct;18(5):387-92). Aceste celule gazdă modificate genetic au capacitatea de a controla profilul de glicozilare al glicoproteinelor produse în celule, astfel încât să poată fi produse compoziţii de glicoproteine în care predomină o anumită structură N-glicanică (vezi, de exemplu, brevet de invenţie U.S. Nr. 7.029.872 şi brevet de invenţie U.S. Nr. 7.449.308). Aceste celule gazdă modificate genetic au fost utilizate pentru a produce anticorpi care au predominant anumite structuri N-glican (vezi, de exemplu, Li şi colab, (2006) Nat. Biotechnol. 24: 210-215).
[0187] În anumite variante de realizare, anticorpii şi fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) includ, de asemenea, pe cele produse în celulele gazdă eucariote inferioare şi cuprinzând complexe şi hibride fucozilate şi nefucozilate N-glicani, inclusiv specii bisectate şi multiantenare, inclusiv, dar fără a se limita la, N-glicani precum GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2.
[0188] În anumite variante de realizare, anticorpii şi fragmentele acestora care se leagă la antigen furnizate în conţinut (de exemplu, RB1) pot cuprinde anticorpi sau fragmente având cel puţin un hibrid N-glican selectat din grupul format din GlcNAcMan5GlcNAc2; GalGlcNAcMan5GlcNAc2; şi NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2. În anumite aspecte, hibridul N-glican este reprezentat predominant de specii de N-glican din compoziţie.
[0189] În anumite variante de realizare, anticorpii şi fragmentele acestora care se leagă la antigen furnizate în conţinut (de exemplu, RB1) cuprind anticorpi şi fragmente având cel puţin un complex N-glican selectat din grupul format din GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan3GlcNAc2; NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2; GlcNAc2Man3GlcNAc2; GalGlcNAc2Man3GlcNAc2; Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; şi NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2. În anumite aspecte, complexul N-glicani sunt predominant specii de N-glican în compoziţie. În alte aspecte, complexul N-glican este o anumită specie de N-glican cuprinzând aproximativ 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% din complex N-glican în compoziţie. Într-o variantă de realizare, anticorpul şi fragmentele de legare la antigen ale acestora furnizate în conţinut cuprind N-glicani complecşi, în care cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% din complexul N-glican alcătuiesc structura NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, în care o astfel de structură este afucosilată. Astfel de structuri pot fi produse, de exemplu, în celule gazdă Pichia pastoris prin inginerie genetică.
[0190] În anumite implementări, N-glican este fucozilat. În general, fucoza se află într-o legătură α1,3 cu GlcNAc la capătul reducător al N-glican, o legătură α1,6 cu GlcNAc la capătul reducător al N-glican, o legătură α1,2 cu Gal la capătul nereducător al N-glican, o legătură α1,3 cu GlcNac la capătul nereducător al N-glican sau o legătură α1,4 cu un GlcNAc la capătul nereducător al N-glican.
[0191] Prin urmare, în anumite aspecte ale compoziţiilor glicoproteice de mai sus, glicoforma se află într-o fucoză cu legătură α1,3 sau α1,6 pentru a produce o glicoformă selectată din grupul constând în Man5GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc), Man3GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc), GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), şi NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc); într-o fucoză cu legătură α1,3 sau α1,4 pentru a produce o glicoformă selectată din grupul constând în GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2, GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2, GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, şi NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2; sau într-o fucoză cu legătură α1,2 pentru a produce o glicoformă selectată din grupul constând în Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, şi NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2
[0192] În alte aspecte, anticorpii sau fragmentele acestora care se leagă la antigen cuprind un conţinut ridicat de manoză. N-glicani, inclusiv, dar fără a se limita la, Man8GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man5GlcNAc2, Man4GlcNAc2 sau N-glicani care constau în structura Man3GlcNAc2 N-glican.
[0193] În alte aspecte ale celor de mai sus, complexul N-glicanii include, de asemenea, specii fucozilate şi nefucozilate, bisectate şi multiantenare.
[0194] Aşa cum sunt utilizaţi în conţinut, termenii "N-glican" şi "glicoform" sunt utilizate interschimbabil şi se referă la un oligozaharidă N-legată, de exemplu, una care este ataşată printr-o legătura asparagină-N-acetilglucozamină la un reziduu de asparagină al unei polipeptide. Glicoproteinele N-legate conţin un reziduu de N-acetilglucozamină legat de azotul amidic al unui reziduu de asparagină din proteină. Zaharurile predominante găsite pe glicoproteine sunt glucoza, galactoza, manoza, fucoza, N-acetilgalactozamină (GalNAc), N-acetilglucozamina (GlcNAc) şi acid sialic (de exemplu, acid N-acetil-neuraminic (NANA). Prelucrarea grupărilor zaharide are loc co-translaţional în lumenul RE şi continuă post-translaţional în aparatul Golgi pentru glicoproteine N-legate.
[0195] N-glicanii au un nucleu pentazaharidic comun al Man3GlcNAc2 ("Man" se referă la manoză; "Glc" se referă la glucoză; iar "NAc" se referă la N-acetil; GlcNAc se referă la N-acetilglucozamină). În mod tipic, structurile N-glican sunt prezentate cu capătul nereducător la stânga şi capătul reducător la dreapta. Capătul reducător al N-glican este capătul care este ataşat de reziduul Asn cuprinzând situsul de glicozilare de pe proteină. N-glicanii diferă în funcţie de numărul de ramificaţii (antene) cuprinzând zaharurile periferice (de exemplu, GlcNAc, galactoză, fucoză şi acid sialic) care sunt adăugate la Man3GlcNAc2 ("Man3") structură centrală, denumită şi "nucleu trimanozic", "nucleu pentazacharidic" sau "nucleu paucimanozic". N-glicanii sunt clasificaţi în funcţie de constituenţii lor ramificaţi (de exemplu, (cu conţinut ridicat de manoză, complex sau hibrid). Un tip de N-glican "cu conţinut ridicat de manoză" are cinci sau mai multe reziduuri de manoză. În mod tipic N-glican tip "complex" are cel puţin un GlcNAc ataşat la braţul 1,3-manoză şi cel puţin un GlcNAc ataşat la braţul 1,6-manoză al unui nucleu "trimanoză". N-glicanii complecşi pot conţine şi galactoză ("Gal") sau reziduuri de N-acetilgalactozamină ("GalNAc") care sunt opţional modificate cu acid sialic sau derivaţi (de exemplu, "NANA" sau "NeuAc", unde "Neu" se referă la acid neuraminic şi "Ac" se referă la acetil). N-glicanii complecşi pot avea, de asemenea, substituţii intracatenare cuprinzând GlcNAc "bisectant" şi fucoză centrală ("Fuc"). N-glicanii complecşi pot avea, de asemenea, antene multiple pe "nucleul trimanozei", adesea denumiţi "glicani antenari multipli". Un N-glican "hibrid" are cel puţin un GlcNAc pe terminalul braţului 1,3 de manoză al nucleului trimanozei şi zero sau mai multe manoze pe braţul 1,6 de manoză al nucleului trimanozei. Diferiţii N-glicani sunt denumiţi şi "glicoforme".
[0196] În ceea ce priveşte N-glicani complecşi, termenii "G-2", "G-1", "G0", "G1", "G2", "A1", şi "A2" au următoarele semnificaţii. "G-2" se referă la o structură de N-glicanică ce poate fi caracterizată ca fiind Man3GlcNAc2, termenul "G-1" se referă la o structura N-glican care poate fi caracterizată ca GlcNAcMan3GlcNAc2, termenul "G0" se referă la o structură de N-glican care poate fi caracterizată ca GlcNAc2Man3GlcNAc2; termenul "G1" se referă la o structură N-glican care poate fi caracterizată ca GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, termenul "G2" se referă la o structură de N-glican care poate fi caracterizată ca Gal2GlcNAcMan3GlcNAc2; termenul "A1" se referă la o structură N-glican care poate fi caracterizată ca NANAGal2GlcNAc2Om3GlcNAc2; şi termenul "A2" se referă la o structură N-glican ce poate fi caracterizată ca NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2. Dacă nu se specifică altfel, termenii "G-2", "G-1", "G0", "G1", "G2", "A1", şi "A2" se referă la specii de N-glican cărora le lipseşte fucoza ataşată la reziduul GlcNAc de la capătul reducător al N-glican. Când termenul include un "F", "F" indică faptul că specia de N-glican conţine un reziduu de fucoză pe reziduul GlcNAc de la capătul reducător al N-glican. De exemplu, G0F, G1F, G2F, A1F şi A2F indică toate faptul că N-glican include în plus un reziduu de fucoză ataşat la reziduul GlcNAc la capătul reducător al N-glican. Eucariotele inferioare, cum ar fi drojdia şi ciupercile filamentoase, nu produc în mod normal N-glicani care produc fucoză.
[0197] În ceea ce priveşte N-glican multiantenar, termenul "N-glican multiantenar"» se referă la N-glicani cuprinzând în plus un reziduu de GlcNAc pe reziduul de manoză cuprinzând capătul nereducător al braţului 1,6 sau al braţului 1,3 al N-glican sau un reziduu de GlcNAc pe fiecare dintre reziduurile de manoză cuprinzând capătul nereducător al braţului 1,6 şi braţul 1,3 al N-glican. Astfel, N-glicani multiantenari pot fi caracterizaţi prin formulele GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2, Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2, or NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2. Termenul "1-4" se referă la 1, 2, 3 sau 4 reziduuri.
[0198] În ceea ce priveşte N-glicani bisectaţi, termenul "N-glican bisectat" se referă la N-glicani în care un reziduu de GlcNAc este legat de reziduul de manoză la capătul reducător al N-glican. Un N-glican bisectat poate fi caracterizat prin formula GlcNAc3Man3GlcNAc2 în care fiecare reziduu de manoză este legat la capătul său nereducător de un reziduu de GlcNAc. În schimb, atunci când un N-glican multiantenar este caracterizat ca GlcNAc3Man3GlcNAc2, formula indică faptul că două reziduuri de GlcNAc sunt legate de reziduul de manoză de la capătul nereducător al unuia dintre cele două braţe ale N-glican şi un reziduu de GlcNAc este legat de reziduul de manoză de la capătul nereducător al celuilalt braţ al N-glican.
[0199] Proprietăţile Fizice ale Anticorpilor
[0200] Anticorpii şi fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) pot conţine în plus unul sau mai multe site-uri de glicozilare fie în regiunea variabilă a imunoglobulinei cu lanţ uşor, fie în cea cu lanţ greu. Anumite site-uri de glicozilare pot duce la o imunogenitate scăzută a anticorpului sau fragmentului sau la o modificare a pK a anticorpului din cauza legării alterate a antigenului (Marshall şi colab, 1972, Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala şi Morrison, 2004, J Immunal 172:5489-94; Wallick şi colab, 1988, J Exp Med 168:1099-109; Spiro, 2002, Glycobiology 12:43R-56R; Parekh şi colab, 1985, Nature 316:452-7; Mimura şi colab, 2000, Mol Immunol 37:697-706). Se cunoaşte faptul că glicozilarea are loc la motivele care conţin o secvenţă N-X-S/T.
[0201] Fiecare anticorp sau fragment de legare la antigen (de exemplu, RB1) va avea un punct izoelectric (pI) unic, care se încadrează în general în intervalul de pH între 6 şi 9,5. pI-ul pentru un anticorp IgG1 se încadrează în mod tipic în intervalul de pH 7-9,5, iar pI-ul pentru un anticorp IgG4 se încadrează în mod tipic în intervalul de pH 6-8.
[0202] Fiecare anticorp sau fragment de legare la antigen (de exemplu, RB1) va avea o temperatură de topire caracteristică, o temperatură de topire mai mare indicând o stabilitate generală mai mare in vivo (Krishnamurthy R şi Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnology 3:361-71). În general, TM1 (temperatura de de-pliere iniţială) poate fi mai mare de 60°C, mai mare de 65°C sau mai mare de 70°C. Punctul de topire al unui anticorp sau fragment poate fi măsurat folosind calorimetria diferenţială de scanare (Chen şi colab, (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando şi colab, (1999) Immunol Lett 68:47-52) sau dicroism circular (Murray şi colab, (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
[0203] Într-o altă variantă de realizare, anticorpii şi fragmentele acestora care se leagă la antigen (de exemplu, RB1) sunt selectate astfel încât să nu se degradeze rapid. Degradarea unui anticorp sau fragment poate fi măsurată folosind electroforeza capilară (CE) şi MALDI-MS (Alexander AJ şi Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
[0204] Într-o altă variantă de realizare, anticorpii (de exemplu, RB1) şi fragmentele acestora care se leagă la antigen sunt selectate astfel încât să aibă efecte minime de agregare, ceea ce poate duce la declanşarea unui răspuns imun nedorit şi/sau la proprietăţi farmacocinetice alterate sau nefavorabile. În general, anticorpii şi fragmentele sunt acceptabile cu o agregare de 25% sau mai puţin, 20% sau mai puţin, 15% sau mai puţin, 10% sau mai puţin sau 5% sau mai puţin. Agregarea poate fi măsurată prin mai multe tehnici, inclusiv cromatografie pe coloană de excludere dimensională (SEC), cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC) şi difuzia luminii.
[0205] Conjugate de Anticorpi
[0206] Anticorpii anti-proteina F hRSV şi fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) pot fi, de asemenea, conjugaţi cu o grupare chimică. Gruparea chimică poate fi, printre altele, un polimer, un radionuclid sau un factor citotoxic. În anumite variante de realizare, gruparea chimică este un polimer care creşte timpul de înjumătăţire al anticorpului sau fragmentului în corpul unui subiect. Polimerii adecvaţi includ, dar nu se limitează la, polimeri hidrofili care includ, dar nu se limitează la, polietilen glicol (PEG) (de exemplu, PEG cu o greutate moleculară de 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa sau 40 kDa), dextran şi monometoxipolietilen glicol (mPEG). Lee şi colab, (1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981)) descrie anticorpi cu lanţ unic conjugaţi cu PEG. Wen şi colab, (2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553)) prezintă conjugarea anticorpilor cu PEG ataşat la un chelator radiometal (acid dietilenetriaminpentaacetic (DTPA)).
[0207] Anticorpii şi fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) poate fi, de asemenea, conjugat cu etichete precum 99Tc,90Y, 111In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S, 51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67CU, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, şi 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr, şi 56Fe.
[0208] Anticorpii şi fragmentele de legare la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) pot fi, de asemenea, PEGilat, de exemplu pentru a le creşte capacitatea biologică (de exemplu, timpul de înjumătăţire (ser). Pentru a PEGila un anticorp sau fragment, anticorpul sau fragmentul reacţionează în mod tipic cu o formă reactivă de polietilen glicol (PEG), cum ar fi un ester reactiv sau un derivat aldehidic al PEG, în condiţii în care una sau mai multe grupări PEG se ataşează la anticorp sau fragmentul de anticorp. În anumite variante de realizare, PEGilarea se efectuează printr-o reacţie de acilare sau o reacţie de alchilare cu o moleculă de PEG reactivă (sau un polimer reactiv analog solubil în apă). Aşa cum este utilizat în conţinut, termenul "polietilen glicol" este destinat să cuprindă oricare dintre formele de PEG care au fost utilizate pentru a derivatiza alte proteine, cum ar fi mono (C1-C10) alcoxi- sau ariloxi-polietilen glicol sau polietilen glicol-maleimidă. În anumite variante de realizare, anticorpul sau fragmentul care urmează să fie PEGilat este un anticorp sau fragment aglicozilat. Metodele pentru PEGilarea proteinelor sunt cunoscute în domeniu şi pot fi aplicate anticorpilor invenţiei. A se vedea, de exemplu, brevetele europene nr. EP 0 154 316 şi EP 0 401 384.
[0209] Anticorpii şi fragmentele de legare la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) pot fi, de asemenea, conjugaţi cu etichete fluorescente sau chemiluminiscente, inclusiv fluorofori precum chelaţi de pământuri rare, fluoresceină şi derivaţii acesteia, rodamină şi derivaţii acesteia, izotiocianat, ficoeritrină, ficocianină, aloficocianină, o-ftaladehidă, fluorescamină, 152Eu, dansil, umbeliferonă, luciferină, marcaj luminal, marcaj izoluminal, un marcaj aromatic cu ester de acridinium, un marcaj imidazol, un marcaj cu sare de acridinium, un marcaj cu ester de oxalat, un marcaj cu aequorină, 2,3-dihidroftalazindione, biotină/avidină, marcaje spin şi radicali liberi stabili.
[0210] Anticorpii şi fragmentele acestora care se leagă la antigen conform invenţiei (de exemplu, RB1) pot fi, de asemenea, conjugaţi cu un factor citotoxic, cum ar fi toxina difterică, Pseudomonas aeruginosa lanţul A al exotoxinei, lanţul A al ricinei, lanţul A al abrinei, lanţul A al modeccinei, alfa-sarcinei, proteine şi compuşi Aleurites fordii (de exemplu, acizi graşi), proteine diantină, Phytoiacca americana proteinele PAPI, PAPII şi PAP-S, inhibitor Momordica charantia, curcină, crotină, inhibitor saponaria officinalis, mitogelină, restrictocină, fenomicină şi enomicină.
[0211] Orice metodă cunoscută în domeniu pentru conjugarea anticorpilor şi a fragmentelor de legare la antigen ale acestora conform invenţiei (de exemplu, RB1) la diferitele fragmente pot fi utilizate, inclusiv metodele descrise de Hunter şi colab, 1962, Nature 144:945; David şi colab, 1974, Biochemistry 13:1014; Pain şi colab, 1981, J. Immunol. Meth. 40:219şi Nygren, 1982, Histochem. şi Cytochem. 30:407. Metodele de conjugare a anticorpilor şi fragmentelor sunt convenţionale şi foarte bine cunoscute în domeniu.
[0212] Utilizări Profilactice şi Terapeutice ale anticorpilor Anti-hRSV
[0213] Sunt furnizate în plus metode pentru prevenirea, tratarea sau ameliorarea unui simptom al infecţiei cu RSV la subiecţi, inclusiv subiecţi umani, care au nevoie de o astfel de prevenire, tratament sau ameliorare cu anticorpii izolaţi sau fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1). Într-o variantă de realizare a invenţiei, un astfel de subiect suferă de o infecţie cu RSV. Într-o variantă de realizare a invenţiei, un astfel de subiect prezintă riscul unei infecţii cu RSV.
[0214] Într-o variantă de realizare specifică, unui mamifer, de preferinţă un om, i se administrează o compoziţie profilactică, terapeutică sau farmaceutică cuprinzând unul sau mai mulţi anticorpi ai prezentei invenţii sau fragmente ale acestora pentru tratamentul, prevenirea sau ameliorarea unuia sau mai multor simptome asociate cu o infecţie cu RSV, într-o cantitate eficientă pentru scăderea titrurilor de RSV. În conformitate cu această variantă de realizare, o cantitate eficientă de anticorpi sau fragmente de anticorpi reduce titrurile de RSV din plămân, măsurate, de exemplu, prin concentraţia de RSV în probele de spută sau într-un lavaj din plămânii unui mamifer. Într-o altă variantă de realizare, unui mamifer, de preferinţă un om, i se administrează o compoziţie profilactică, terapeutică sau farmaceutică cuprinzând unul sau mai mulţi anticorpi ai prezentei invenţii sau fragmente ale acestora pentru tratamentul, prevenirea sau ameliorarea simptomelor asociate cu o infecţie cu RSV, într-o cantitate eficientă pentru neutralizarea RSV şi/sau blocarea infecţiei cu RSV la mamifer.
[0215] Anticorpii monoclonali sau fragmentele acestora care se leagă la antigen pot fi, de asemenea, utilizaţi imunoterapeutic pentru boala RSV atât la oameni, cât şi la alte animale. Termenul "imunoterapeutic" sau "imunoterapie", aşa cum este utilizat în conţinut în conjuncţie cu anticorpii monoclonali sau fragmentele acestora care se leagă la antigen din invenţie, semnifică atât administrarea profilactică, cât şi cea terapeutică, şi atât imunizarea pasivă cu produse polipeptidice substanţial purificate, cât şi terapia genică prin transferul de secvenţe polinucleotidice care codifică produsul sau o parte a acestuia. Imunizarea pasivă include transferul imunităţii umorale active sau furnizarea de anticorpi către un subiect care are nevoie de aceasta. În consecinţă, în anumite variante de realizare ale invenţiei, prezenta invenţie furnizează metode pentru transferul imunităţii umorale active şi metode de furnizare a anticorpilor RSV sau a fragmentelor acestora care se leagă la antigen, cum ar fi anticorpii IgG, către un pacient cu risc de infecţie cu RSV. Astfel, anticorpii monoclonali sau fragmentele acestora care se leagă la antigen pot fi administraţi subiecţilor cu risc ridicat pentru a reduce probabilitatea şi/sau severitatea bolii RSV sau administraţi subiecţilor care deja prezintă o infecţie activă cu RSV.
[0216] Prezenta invenţie furnizează, de asemenea, o metodă pentru modularea sau tratarea a cel puţin unei boli legate de RSV la adulţi sau copii, la o celulă, ţesut, organ, animal sau pacient, inclusiv, dar fără a se limita la, infecţii ale căilor respiratorii inferioare, pneumonie, traheobronşită, bronşiolită, bronşită şi orice infecţii sau tulburări inflamatorii înrudite, cum ar fi, dar fără a se limita la, cel puţin una dintre, sau cel puţin o inflamaţie legată de, sindromul de răspuns inflamator sistemic, sindromul de sepsis, sepsis gram-pozitiv, sepsis gram-negativ, sepsis cu cultură negativă, sepsis fungic, febra neutropenică, urosepsis, meningococemie, sindromul de detresă respiratorie la adulţi, rinită alergică, rinită perenă, astm, anafalaxie sistemică, reacţii de hipersensibilitate la receptori, boală pulmonară obstructivă cronică (BPOC), pneumonită de hipersensibilitate, granuloame datorate organismelor intracelulare, sensibilitate la medicamente, caşexie, fibroză chistică, boală pulmonară cronică neonatală; cel puţin o boală infecţioasă la nivelul unei celule, ţesut, organ, animal sau pacient, inclusiv, dar fără a se limita la, cel puţin una dintre: infecţie bacteriană acută sau cronică, procese parazitare sau infecţioase acute şi cronice, inclusiv infecţii bacteriene, virale şi fungice, infecţie cu HIV, neuropatie cu HIV, meningită, hepatită (A, B sau C sau altele asemenea), artrită septică, peritonită, pneumonie, epiglotită, E. coli 0157:h7, sindrom hemolitic uremic, purpură trombocitopenică trombolitică, malarie, febră hemoragică dengue, leishmanioză, lepră, sindrom de şoc toxic, miozită streptococică, gangrenă gazoasă, mycobacterium tuberculosis, mycobacterium avium intracellulare, pneumonie cu pneumocystis carinii, boală inflamatorie pelvină, orhită, epididimită, legionella, boala Lyme, gripă A, virusul Epstein-Barr, sindrom hemafagocitar asociat cu vitalitatea, encefalită vitală, meningită aseptică şi altele asemenea. O astfel de metodă poate cuprinde opţional administrarea unei cantităţi eficiente dintr-o compoziţie sau compoziţie farmaceutică cuprinzând cel puţin un anticorp RSV sau un fragment antigenic al acestuia, unei celule, ţesut, organ, animal sau pacient care are nevoie de o astfel de modulare, tratament sau terapie.
[0217] Într-o variantă de realizare, compoziţiile profilactice, terapeutice sau farmaceutice cuprinzând anticorpi conform invenţiei sau fragmente ale acestora sunt administrate unui mamifer, de preferinţă unui om, pentru a trata, preveni sau ameliora unul sau mai multe simptome asociate cu infecţia cu RSV. Într-o altă variantă de realizare, compoziţiile profilactice, terapeutice sau farmaceutice cuprinzând anticorpi conform invenţiei sau fragmente ale acestora sunt administrate unui om cu fibroză chistică, displazie bronhopulmonară, cardiopatie congenitală, imunodeficienţă congenitală sau imunodeficienţă dobândită sau unui om care a suferit un transplant (de exemplu, transplant de măduvă osoasă, plămân sau celule stem hematopoietice (HSCT) pentru a trata, preveni sau ameliora unul sau mai multe simptome asociate cu infecţia cu RSV.
[0218] Într-o altă variantă de realizare, compoziţiile profilactice, terapeutice sau farmaceutice cuprinzând anticorpi conform invenţiei sau fragmente ale acestora sunt administrate unui sugar uman, de preferinţă unui sugar uman născut prematur sau unui sugar uman cu risc de spitalizare din cauza infecţiei cu RSV, pentru a trata, preveni sau ameliora unul sau mai multe simptome asociate cu infecţia cu RSV. Într-o altă variantă de realizare, compoziţiile profilactice, terapeutice sau farmaceutice cuprinzând anticorpi conform invenţiei sau fragmente ale acestora sunt administrate persoanelor în vârstă sau persoanelor din cămine de plasament (de exemplu, aziluri de bătrâni sau centre de reabilitare) sau persoane imunocompromise.
[0219] Se preferă utilizarea de anticorpi inhibitori in vivo şi/sau anticorpi neutralizanţi sau fragmente de legare la antigen ale acestora cu afinitate mare şi/sau puternice care se leagă imunospecific de un antigen RSV, atât pentru prevenirea infecţiei cu RSV, cât şi pentru terapia infecţiei cu RSV. De asemenea, se preferă utilizarea polinucleotidelor care codifică anticorpi inhibitori in vivo şi/sau anticorpi neutralizanţi sau fragmente ale acestora afinitate ridicată şi/sau anticorpi puternici care se leagă la antigen şi care se leagă imunospecific de un antigen RSV, atât pentru prevenirea infecţiei cu RSV, cât şi pentru terapia infecţiei cu RSV. Astfel de anticorpi sau fragmente ale acestora vor avea, de preferinţă, o afinitate pentru glicoproteina F RSV şi/sau fragmente ale glicoproteinei F.
[0220] Anticorpii şi echivalenţii funcţionali (cum ar fi fragmentele acestora care se leagă la antigen) conform prezentei invenţii recunosc un epitop din proteina F RSV. Anticorpii sau echivalenţii funcţionali ai acestora care recunosc în mod specific epitopul respectiv pot fi combinaţi cu anticorpi specifici RSV care se leagă de un epitop diferit, deja cunoscut, cum ar fi palivizumab, D25, AM14, AM16 şi AM23. Prin combinarea unui anticorp sau echivalent funcţional conform invenţiei care recunoaşte în mod specific epitopul respectiv cu un anticorp specific RSV cunoscut, doi sau mai mulţi epitopi diferiţi ai RSV sunt recunoscuţi în timpul aceleiaşi terapii. În acest fel, se poate obţine un răspuns imunogen mai puternic la RSV şi/sau o specificitate mai mare a anticorpilor împotriva RSV. Cu un răspuns imunogen mai puternic şi o specificitate mai mare împotriva RSV, o astfel de combinaţie poate duce la un tratament şi/sau la prevenirea mai eficientă a unei tulburări legate de RSV.
[0221] Unul sau mai mulţi anticorpi ai prezentei invenţii sau fragmente ale acestora care se leagă imunospecific la unul sau mai mulţi antigeni RSV pot fi utilizaţi local sau sistemic în organism ca profilactic. Anticorpii acestei invenţii sau fragmentele acestora pot fi, de asemenea, utilizaţi în mod avantajos în combinaţie cu alţi anticorpi monoclonali sau himerici sau cu limfokine sau factori de creştere hematopoietici (cum ar fi, de exemplu, IL-2, IL-3, IL-7 şi IL-15), care, de exemplu, servesc la creşterea numărului sau a activităţii celulelor efectoare care interacţionează cu anticorpii. Anticorpii acestei invenţii sau fragmente ale acestora pot fi, de asemenea, utilizaţi în mod avantajos în combinaţie cu alţi anticorpi monoclonali sau himerici sau cu limfokine sau factori de creştere hematopoietici (cum ar fi, de exemplu, IL-2, IL-3 şi IL-7), care, de exemplu, servesc la creşterea răspunsului imun. Anticorpii conform acestei invenţii sau fragmente ale acestora pot fi, de asemenea, utilizaţi în mod avantajos în combinaţie cu unul sau mai multe medicamente utilizate pentru tratarea infecţiei cu RSV, cum ar fi, de exemplu, agenţi antivirali.
[0222] Anticorpii sau fragmentele invenţiei pot fi utilizaţi în combinaţie cu unul sau mai multe dintre următoarele medicamente: NIH-351 (Gemini Technologies), vaccinul RSV recombinant (Aviron), RSVf-2 (Intracel), F-50042 (Pierre Fabre), T-786 (Trimeris), VP-36676 (ViroPharma), RFI-641 (American Home Products), VP-14637 (ViroPharma), PFP-1 şi PFP-2 (American Home Products), vaccinul RSV (Avant Immunotherapeutics) şi F-50077 (Pierre Fabre).
[0223] Anticorpii sau fragmentele de legare la antigen ale acestora conform invenţiei pot fi administraţi singuri sau în combinaţie cu alte tipuri de tratamente (de exemplu, terapie hormonală, imunoterapie şi agenţi antiinflamatori). În general, se preferă administrarea de produse de origine specifică sau reactivitate specifică (în cazul anticorpilor) care este aceeaşi specie ca şi cea a pacientului. Astfel, într-o variantă de realizare preferată, anticorpii umani sau umanizaţi, derivaţii fragmentelor, analogii sau acizi nucleici sunt administraţi unui pacient uman pentru terapie sau profilaxie.
[0224] Un "subiect" poate fi un mamifer, cum ar fi un om, un câine, o pisică, un cal, o vacă, un şoarece, un şobolan, o maimuţă (de exemplu, maimuţă cynomolgous, de exemplu, Macaca fascicularis) sau iepure. În variantele de realizare preferate ale invenţiei, subiectul este un subiect uman.
[0225] În anumite variante de realizare, anticorpii sau fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) pot fi utilizaţi singuri sau în asociere cu terapia antivirală.
[0226] În anumite variante de realizare, anticorpii sau fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) pot fi utilizaţi singuri sau în asociere cu un alt anticorp monoclonal împotriva RSV.
[0227] În anumite variante de realizare, anticorpii sau fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) pot fi utilizaţi singuri sau în asociere cu un alt vaccin împotriva RSV.
[0228] Termenul "în asociere cu" indică faptul că, componentele administrate într-o metodă a prezentei invenţii (de exemplu, un anticorp anti-hRSV sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen (de exemplu, RB1) împreună cu, de exemplu, palivizumab) poate fi formulat într-o singură compoziţie pentru administrare simultană sau formulat separat în două sau mai multe compoziţii (de exemplu, un kit). Fiecare componentă poate fi administrată unui subiect la un moment diferit faţă de momentul în care este administrată cealaltă componentă; de exemplu, fiecare administrare poate fi efectuată în mod nesimultan (de exemplu, separat sau secvenţial) la mai multe intervale pe o anumită perioadă de timp. Mai mult, componentele separate pot fi administrate unui subiect pe aceeaşi cale sau pe o cale diferită.
[0229] Utilizări Experimentale şi de Diagnostic
[0230] Anticorpii anti-proteina F hRSV şi fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) pot fi utilizaţi ca agenţi de purificare prin afinitate. În acest proces, anticorpii anti-proteina F hRSV şi fragmentele acestora care se leagă la antigen sunt imobilizaţi pe o fază solidă, cum ar fi Sephadex®, răşină de sticlă sau agaroză sau hârtie de filtru, utilizând metode bine cunoscute în domeniu. Anticorpul sau fragmentul imobilizat este pus în contact cu o probă care conţine proteina F hRSV (sau un fragment al acesteia) care urmează să fie purificată, iar ulterior suportul este spălat cu un solvent adecvat care va îndepărta substanţial tot materialul din probă, cu excepţia proteinei F hRSV, care este legată de anticorpul sau fragmentul imobilizat. În final, suportul este spălat cu un solvent care eluează proteina F hRSV legată (de exemplu, proteina A). Astfel de anticorpi şi fragmente imobilizaţi fac parte din prezenta invenţie.
[0231] Sunt furnizate în plus antigene pentru generarea de anticorpi secundari care sunt utili, de exemplu, pentru efectuarea analizei Western blot şi a altor imunoteste discutate în conţinut. În special, sunt descrise polipeptide cuprinzând regiunile variabile şi/sau secvenţele CDR ale unui anticorp terapeutic descris în conţinut (de exemplu, RB1) şi care pot fi utilizate pentru a genera anticorpi anti-idiotipici pentru utilizarea în detectarea specifică a prezenţei anticorpului, de exemplu, într-un context terapeutic.
[0232] Anticorpii anti-proteina F a hRSV şi fragmentele acestora care se leagă la antigen pot fi, de asemenea, utili în testele de diagnostic pentru proteina F a hRSV, de exemplu, detectând expresia sa în celule, ţesuturi sau ser specifice. Astfel de metode de diagnostic pot fi utile în diagnosticarea diferitelor boli.
[0233] Prezenta invenţie include teste ELISA (test imunosorbent legat de enzime) care încorporează utilizarea unui anticorp anti-proteină F hRSV sau a unui fragment al acestuia care se leagă la antigen, descris în conţinut (de exemplu, RB1).
[0234] De exemplu, o astfel de metodă cuprinde următoarele etape:
[0235] (a) acoperirea unui substrat (de exemplu, suprafaţa unui godeu al plăcii de microtitrare, de exemplu, o placă de plastic) cu anticorp anti-proteină F hRSV sau fragment al acestuia care se leagă la antigen;
[0236] (b) aplicarea pe substrat a unei probe care urmează să fie testată pentru prezenţa proteinei F RSV;
[0237] (c) spălarea plăcii, astfel încât materialul nelegat din probă să fie îndepărtat;
[0238] (d) aplicarea de anticorpi marcaţi detectabil (de exemplu, anticorpi legaţi de enzime) care sunt, de asemenea, specifici antigenului proteic F al RSV;
[0239] (e) spălarea substratului, astfel încât anticorpii marcaţi şi nelegaţi să fie îndepărtaţi;
[0240] (f) dacă anticorpii marcaţi sunt legaţi enzimatic, se aplică o substanţă chimică care este convertită de enzimă într-un semnal fluorescent; şi
[0241] (g) detectarea prezenţei anticorpului marcat.
[0242] Detectarea marcajului asociat cu substratul indică prezenţa proteinei F hRSV.
[0243] Într-o altă realizare, anticorpul marcat sau fragmentul acestuia care se leagă la antigen este marcat cu peroxidază care reacţionează cu ABTS (de exemplu, acid 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonic) sau 3,3',5,5'-tetrametilbenzidină pentru a produce o schimbare de culoare detectabilă. Alternativ, anticorpul sau fragmentul marcat este marcat cu un radioizotop detectabil (de exemplu, 3H) care poate fi detectată de un contor de scintilaţie în prezenţa unui agent de scintilaţie.
[0244] Un anticorp anti-proteină F hRSV sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen conform invenţiei (de exemplu, RB1) poate fi utilizat într-o procedură Western blot sau imunoprotein blot. O astfel de procedură face parte din prezenta invenţie şi include de exemplu:
[0245] (1) opţional transferul de proteine dintr-o probă care urmează să fie testată pentru prezenţa proteinei F hRSV (de exemplu, dintr-o separare electroforetică PAGE sau SDS-PAGE a proteinelor din probă) pe o membrană sau alt substrat solid utilizând o metodă cunoscută în domeniu (de exemplu, blotting semi-uscat sau blotting în rezervor); contactarea membranei sau a altui substrat solid care urmează să fie testat pentru prezenţa proteinei F hRSV legate sau a unui fragment al acesteia cu un anticorp anti-hRSV sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen conform invenţiei.
[0246] O astfel de membrană poate lua forma unei membrane pe bază de nitroceluloză sau vinil (de exemplu, membrană de fluorură de poliviniliden (PVDF) pe care au fost transferate proteinele care urmează să fie testate pentru prezenţa hRSV într-un gel PAGE (electroforeză pe gel de poliacrilamidă) nedenaturant sau un gel SDS-PAGE (electroforeză pe gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu) de exemplu, (după separarea electroforetică în gel). Înainte de a intra în contact cu membrana cu anticorpul sau fragmentul anti-hRSV, membrana este opţional blocată, de exemplu, cu lapte praf degresat sau similar, astfel încât să se lege de site-urile de legare nespecifice ale proteinelor de pe membrană.
[0247] (2) spălarea membranei de una sau de mai multe ori pentru a îndepărta anticorpul sau fragmentul de proteină F anti-hRSV nelegat şi alte substanţe nelegate; şi
[0248] (3) detectarea anticorpului sau fragmentului de proteină F anti-hRSV legat.
[0249] Detectarea anticorpului sau fragmentului legat indică faptul că proteina hRSV este prezentă pe membrană sau substrat şi în probă. Detectarea anticorpului sau fragmentului legat se poate realiza prin legarea anticorpului sau fragmentului cu un anticorp secundar (un anticorp anti-imunoglobulină) care este marcat detectabil şi, apoi, detectarea prezenţei anticorpului secundar.
[0250] Anticorpii anti-proteina F hRSV şi fragmentele acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) pot fi utilizaţi şi pentru imunohistochimie. O astfel de metodă face parte din prezenta invenţie şi cuprinde: de exemplu,
[0251] (1) contactarea unei celule care urmează să fie testată pentru prezenţa proteinei F hRSV cu un anticorp anti-proteină F hRSV sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen, conform invenţiei; şi
[0252] (2) detectarea anticorpului sau fragmentului pe sau în celulă.
[0253] Dacă anticorpul sau fragmentul în sine este marcat detectabil, acesta poate fi detectat direct. Alternativ, anticorpul sau fragmentul poate fi legat de un anticorp secundar marcat detectabil, care este detectat.
[0254] Compoziţii Farmaceutice şi Administrare
[0255] Pentru a prepara compoziţii farmaceutice sau sterile ale anticorpilor anti-proteină F hRSV şi fragmentelor de legare la antigen conform invenţiei (de exemplu, RB1), anticorpul sau fragmentul acestuia care se leagă la antigen este amestecat cu un purtător sau excipient acceptabil farmaceutic. A se vedea, de exemplu, Remington's Pharmaceutical Sciences şi U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).
[0256] Formulările de agenţi terapeutici şi de diagnostic pot fi preparate prin amestecarea cu purtători, excipienţi sau stabilizatori acceptabili sub formă de: de exemplu, pulberi liofilizate, suspensii, soluţii apoase sau suspensii (vezi, de exemplu, (Hardman, şi colab., (2001) Goodman şi Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, şi Wilkins, New York, NY; Avis, şi colab., (ed.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, şi colab., (ed.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, şi colab., (ed.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner şi Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY). Într-o variantă de realizare, anticorpii sau fragmentele acestora care se leagă la antigen conform prezentei invenţii sunt diluaţi la o concentraţie adecvată într-un tampon histidină pH 5-7, la 1-20 mM şi se adaugă opţional NaCl sau zaharoză (de exemplu, 2-15% (g/v)) pentru tonicitate. Se pot adăuga agenţi suplimentari, cum ar fi polisorbat 20 sau polisorbat 80, la 0,01 până la 0,10% (g/v) pentru a spori stabilitatea. O formulare reprezentativă este 10 mM L-histidină, 7% (g/v) zaharoză şi 0,02% (g/v) polisorbat-80, pH 6,0.
[0257] Toxicitatea şi eficacitatea terapeutică a anticorpilor sau fragmentelor de legare la antigen ale acestora conform invenţiei, administraţi singuri sau în combinaţie cu un alt agent terapeutic, pot fi determinate prin proceduri farmaceutice standard în culturi celulare sau animale de experiment. de exemplu, pentru determinarea LD50 (doza letală pentru 50% din populaţie) şi DE50 (doza eficientă terapeutic la 50% din populaţie). Raportul dozei dintre efectele toxice şi cele terapeutice este indicele terapeutic (DL5050/ ED50). Datele obţinute din aceste teste de cultură celulară şi studii pe animale pot fi utilizate în formularea unei game de dozaj pentru utilizare la om. Dozajul acestor compuşi se situează de preferinţă într-un interval de concentraţii circulante care includ ED50 cu toxicitate redusă sau fără toxicitate. Dozajul poate varia în acest interval în funcţie de forma farmaceutică utilizată şi de calea de administrare.
[0258] Modul de administrare poate varia. Căile de administrare includ orală, rectală, transmucoasă, intestinală, parenterală; intramusculară, subcutanată, intradermică, intramedulară, intratecală, intraventriculară directă, intravenoasă, intraperitoneală, intranazală, intraoculară, prin inhalare, prin insuflaţie, topică, cutanată, transdermică sau intraarterială. Modurile de administrare preferate sunt intramusculară, intravenoasă şi intranazală.
[0259] În anumite variante de realizare, anticorpii anti-proteină F hRSV sau fragmentele acestora care se leagă la antigen conform invenţiei (de exemplu, RB1) pot fi administraţi pe o cale invazivă, cum ar fi prin injecţie. În alte variante de realizare ale invenţiei, un anticorp anti-proteină F hRSV sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen, sau o compoziţie farmaceutică a acestuia, este administrat intravenos, subcutanat, intramuscular, intraarterial, intratumoral sau prin inhalare, prin aerosoli. Administrare pe căi neinvazive (de exemplu, oral; de exemplu, într-o pilulă, capsulă sau tabletă) se încadrează, de asemenea, în domeniul de aplicare conform prezentei invenţii.
[0260] Prezenta invenţie furnizează un recipient (de exemplu, o fiolă de plastic sau de sticlă, de exemplu, cu un capac sau o coloană de cromatografie, un ac cu orificiu gol sau un cilindru de seringă) cuprinzând oricare dintre anticorpii sau fragmentele de legare la antigen conform invenţiei (de exemplu, RB1) sau o compoziţie farmaceutică a acesteia. Prezenta invenţie furnizează, de asemenea, un dispozitiv de injectare cuprinzând oricare dintre anticorpii sau fragmentele de legare la antigen conform invenţiei (de exemplu, RB1) sau o compoziţie farmaceutică a acestuia. Un dispozitiv de injectare este un dispozitiv care introduce o substanţă în corpul unui pacient pe cale parenterală, de exemplu, intramuscular, subcutanat sau intravenos. De exemplu, un dispozitiv de injectare poate fi o seringă (de exemplu, pre-umplută cu compoziţia farmaceutică, cum ar fi un auto-injector) care include, de exemplu, un cilindru sau un rezervor pentru a conţine fluidul care urmează să fie injectat (de exemplu, anticorp sau fragment sau o compoziţie farmaceutică a acestuia), un ac pentru perforarea pielii şi/sau a vaselor de sânge pentru injectarea fluidului; şi un piston pentru împingerea fluidului în afara cilindrului şi prin orificiul acului. Într-o variantă de realizare, un dispozitiv de injectare cuprinzând un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia din prezenta invenţie sau o compoziţie farmaceutică a acestuia este un dispozitiv de injectare intravenoasă (IV). Un astfel de dispozitiv include anticorpul sau fragmentul sau o compoziţie farmaceutică a acestuia într-o canulă sau trocar/ac care poate fi ataşat la un tub care poate fi ataşat la o pungă sau rezervor pentru reţinerea fluidului. (de exemplu, soluţie salină sau soluţie Ringer lactat care conţine NaCl, lactat de sodiu, KCl, CaCl2 şi, opţional, incluzând glucoză) introduse în corpul pacientului prin canulă sau trocar/ac. Anticorpul sau fragmentul sau o compoziţie farmaceutică a acestuia poate, într-o variantă de realizare a invenţiei, să fie introduse în dispozitiv odată ce trocarul şi canula sunt introduse în vena unui subiect şi trocarul este scos din canula introdusă. Dispozitivul intravenos poate fi, de exemplu, introdus într-o venă periferică (de exemplu, în mână sau braţ); vena cavă superioară sau vena cavă inferioară sau în atriul drept al inimii (de exemplu, o venă intravenoasă centrală); sau într-o venă subclaviculară, jugulară internă sau femurală şi, de exemplu, avansează spre inimă până ajunge la vena cavă superioară sau la atriul drept (de exemplu, o linie venoasă centrală). Într-o variantă de realizare, un dispozitiv de injectare este un autoinjector; un injector cu jet sau o pompă de perfuzie externă. Un injector cu jet utilizează un jet îngust de lichid de înaltă presiune care pătrunde în epidermă pentru a introduce anticorpul sau fragmentul sau o compoziţie farmaceutică a acestuia în corpul pacientului. Pompele de perfuzie externe sunt dispozitive medicale care livrează anticorpul sau fragmentul sau o compoziţie farmaceutică a acestuia în corpul pacientului în cantităţi controlate. Pompele de perfuzie externe pot fi alimentate electric sau mecanic. Diferite pompe funcţionează în moduri diferite, de exemplu, o pompă de seringă menţine fluidul în rezervorul unei seringi, iar un piston mobil controlează livrarea de fluid, o pompă elastomerică menţine fluidul într-un rezervor de balon extensibil, iar presiunea din pereţii elastici ai balonului acţionează livrarea de fluid. Într-o pompă peristaltică, un set de role apasă o lungime de tub flexibil, împingând fluidul înainte. Într-o pompă multicanal, fluidele pot fi livrate din mai multe rezervoare la rate multiple.
[0261] Compoziţiile farmaceutice descrise în conţinut pot fi administrate şi cu un dispozitiv de injectare hipodermică fără ac; cum ar fi dispozitivele descrise în brevetele de invenţie U.S. Nr. 6.620.135; 6.096.002; 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 sau 4.596.556. Astfel de dispozitive fără ac cuprinzând compoziţia farmaceutică fac, de asemenea, parte a prezentei invenţii. Compoziţiile farmaceutice descrise în conţinut pot fi administrate şi prin perfuzie. Exemple de implanturi şi module bine cunoscute pentru administrarea compoziţiilor farmaceutice includ cele descrise în: brevet de invenţie U.S. Nr. 4.487.603, care dezvăluie o micro-pompă de perfuzie implantabilă pentru distribuirea de medicamente la o rată controlată; brevet de invenţie U.S. Nr. 4.447.233, care dezvăluie o pompă de perfuzie a medicamentelor pentru administrarea de medicamente la o rată de perfuzie precisă; brevet de invenţie U.S. Nr. 4.447.224, care dezvăluie un aparat de perfuzie implantabil cu flux variabil pentru administrare continuă de medicamente; brevet de invenţie U.S. Nr 4.439.196, care dezvăluie un sistem osmotic de administrare a medicamentelor având compartimente multi-camerale. Multe alte astfel de implanturi, sisteme de administrare şi module sunt bine cunoscute de către specialiştii în domeniu, iar cele cuprinzând compoziţiile farmaceutice ale prezentei invenţii se încadrează în sfera de întindere a protecţiei prezentei invenţii.
[0262] Schema de administrare depinde de mai mulţi factori, inclusiv rata de rotaţie serică sau tisulară a anticorpului terapeutic sau a fragmentului de legare la antigen, nivelul simptomelor, imunogenitatea anticorpului profilactic/terapeutic şi accesibilitatea celulelor ţintă în matricea biologică. De preferinţă, schema de administrare furnizează suficient anticorp sau fragment terapeutic pentru a realiza ameliorarea stării bolii ţintă, reducând în acelaşi timp la minimum efectele secundare nedorite. În consecinţă, cantitatea de produs biologic administrată depinde parţial de anticorpul profilactic/terapeutic specific şi de severitatea afecţiunii tratate. Sunt disponibile îndrumări pentru selectarea dozelor adecvate de anticorpi sau fragmente terapeutice (vezi, de exemplu, Wawrzynczak, (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, şi colab., 2003, New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom şi colab., 1999, New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon şi colab., 2001, New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al., 2000, New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh şi colab., 2003, New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky şi colab., 2000, New Engl. J. Med. 343:1594-1602).
[0263] Determinarea dozei adecvate este realizată de către medic, de exemplu, utilizând parametri sau factori cunoscuţi sau suspectaţi în domeniu că ar putea influenţa prevenţia sau tratamentul. În general, doza începe cu o cantitate ceva mai mică decât doza optimă şi este crescută ulterior cu trepte mici până când se obţine efectul dorit sau optim în raport cu orice efecte secundare negative. Măsurile diagnostice importante includ cele ale simptomelor de, de exemplu, inflamaţia sau nivelul citokinelor inflamatorii produse. În general, este de dorit ca un produs biologic care va fi utilizat să fie derivat din aceeaşi specie ca animalul ţintit pentru tratament, reducând astfel la minimum orice răspuns imun la reactiv. În cazul subiecţilor umani, de exemplu, pot fi de dorit anticorpi umanizaţi şi complet umani.
[0264] Anticorpi sau fragmente ale acestora care se leagă la antigen descrise în conţinut (de exemplu, RB1) pot fi administraţi prin perfuzie continuă sau prin doze administrate, de exemplu.., zilnic, de 1-7 ori pe săptămână, săptămânal, la două săptămâni, lunar, bilunar, trimestrial, semestrial, anual etc. Se pot administra doze, de exemplu, intravenos, subcutanat, topic, oral, nazal, rectal, intramuscular, intracerebral, intraspinal sau prin inhalare. O doză săptămânală totală este, în general, de cel puţin 0,05 µg/kg greutate corporală, mai general de cel puţin 0,2 µg/kg, 0,5 µg/kg, 1 µg/kg, 10 µg/kg, 100 µg/kg, 0,25 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg sau mai mult (vezi, de exemplu, Yang, şi colab, 2003, New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, şi colab, 2002, New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu şi colab, 1999, J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, şi colab, 2003, Cancer Immunol. Imunalt. 52:151-144). De asemenea, pot fi administrate doze pentru a atinge o concentraţie ţintă predeterminată de anticorpi anti-hRSV în serul subiectului, cum ar fi 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 µg/ml sau mai mult. În alte variante de realizare, se administrează un anticorp anti-hRSV conform prezentei invenţii, de exemplu subcutanat sau intravenos, săptămânal, la fiecare două săptămâni, "la fiecare 4 săptămâni", lunar, bilunar sau trimestrial, în doze de 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 sau 2500 mg/subiect.
[0265] Aşa cum este utilizat în conţinut, termenul "cantitate eficientă" se referă la o cantitate dintr-un anticorp anti-hRSV sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen conform invenţiei (de exemplu, RB1) care, atunci când este administrat singur sau în combinaţie cu un agent terapeutic/profilactic suplimentar unei celule, ţesut sau subiect, este eficient pentru neutralizarea RSV şi/sau prevenirea sau provocarea unei îmbunătăţiri măsurabile a unuia sau mai multor simptome ale bolii sau afecţiunii asociate cu infecţia cu RSV. O doză eficientă se referă, de asemenea, la acea cantitate de anticorp sau fragment suficientă pentru a duce la prevenirea sau ameliorarea cel puţin parţială a simptomelor. Atunci când este aplicat unui ingredient activ individual administrat singur, o doză eficientă se referă la acel ingredient singur. Atunci când este aplicat unei combinaţii, o doză eficientă se referă la cantităţile combinate ale ingredientelor active care au ca rezultat efectul profilactic sau terapeutic, indiferent dacă sunt administrate în combinaţie, în serie sau simultan. În anumite variante de realizare, o cantitate eficientă este o cantitate care asigură o concentraţie serică ţintă clinică de 10 µg/ml - 30 µg/ml timp de 5 luni. Într-o variantă de realizare, o cantitate eficientă este o doză umană care asigură o concentraţie serică minimă ţintă de 10 µg/ml - 30 µg/ml pentru eficacitate, aşa cum este determinată în modelele preclinice standard de şobolan de bumbac.
[0266] Kit-uri
[0267] Sunt furnizate în plus kit-uri cuprinzând una sau mai multe componente care includ, dar nu se limitează la, un anticorp anti-proteină F hRSV sau un fragment de legare la antigen, aşa cum se discută în conţinut (de exemplu, RB1) în asociere cu una sau mai multe componente suplimentare, inclusiv, dar fără a se limita la, un purtător acceptabil farmaceutic şi/sau un agent profilactic/terapeutic, aşa cum se discută în conţinut. Anticorpul sau fragmentul şi/sau agentul profilactic/terapeutic pot fi formulate ca o compoziţie pură sau în combinaţie cu un purtător acceptabil farmaceutic, într-o compoziţie farmaceutică.
[0268] Într-o variantă de realizare, kit-ul include un anticorp anti-proteină F hRSV sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen conform invenţiei (de exemplu, RB1) sau o compoziţie farmaceutică a acesteia într-un singur recipient (de exemplu, într-un flacon steril din sticlă sau plastic) şi o compoziţie farmaceutică a acesteia şi/sau un agent profilactic/terapeutic într-un alt recipient (de exemplu, într-un flacon steril de sticlă sau plastic).
[0269] Într-o altă variantă de realizare, kit-ul cuprinde o combinaţie a invenţiei, inclusiv un anticorp anti-proteină F hRSV sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen, conform invenţiei (de exemplu, RB1) împreună cu un purtător acceptabil farmaceutic, opţional în combinaţie cu unul sau mai mulţi agenţi profilactici/terapeutici formulaţi împreună, opţional, într-o compoziţie farmaceutică, într-un singur recipient comun.
[0270] Dacă kit-ul include o compoziţie farmaceutică pentru administrare parenterală unui subiect, kit-ul poate include un dispozitiv pentru efectuarea unei astfel de administrări. De exemplu, kit-ul poate include unul sau mai multe ace hipodermice sau alte dispozitive de injectare, aşa cum s-a discutat mai sus.
[0271] Kit-ul poate include un prospect care include informaţii privind compoziţiile farmaceutice şi formele de dozare din trusă. În general, astfel de informaţii ajută pacienţii şi medicii să utilizeze compoziţiile farmaceutice şi formele de dozare incluse în mod eficient şi sigur. De exemplu, următoarele informaţii privind o combinaţie a invenţiei pot fi furnizate în prospect: farmacocinetică, farmacodinamică, studii clinice, parametri de eficacitate, indicaţii şi utilizare, contraindicaţii, avertismente, precauţii, reacţii adverse, supradozaj, dozaj şi administrare corecte, mod de furnizare, condiţii de depozitare corecte, referinţe, informaţii despre producător/distribuitor şi informaţii despre brevet.
[0272] Kit-uri de Detecţie şi Kit-uri Profilactice/Terapeutice
[0273] Din motive de comoditate, un anticorp anti-hRSV sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen conform invenţiei (de exemplu, RB1) pot fi furnizate într-un kit, adică o combinaţie ambalată de reactivi în cantităţi predeterminate, cu instrucţiuni pentru efectuarea unui test de diagnostic sau de detectare. În cazul în care anticorpul sau fragmentul este marcat cu o enzimă, kit-ul va include substraturi şi co-factori necesari enzimei (de exemplu, un precursor de substrat care furnizează cromoforul sau fluoroforul detectabil). În plus, pot fi incluşi şi alţi aditivi, cum ar fi stabilizatori, agenţi tampon (de exemplu, un tampon de blocare sau un tampon de liză) şi altele asemenea. Cantităţile relative ale diferiţilor reactivi pot fi variate considerabil pentru a asigura concentraţii în soluţie ale reactivilor care optimizează substanţial sensibilitatea testului. În special, reactivii pot fi furnizaţi sub variantă de pulberi uscate, în mod tipic liofilizate, inclusiv excipienţi care, prin dizolvare, vor furniza o soluţie de reactivi având concentraţia corespunzătoare.
[0274] De asemenea, sunt furnizaţi reactivi şi kit-uri de diagnostic sau de detecţie cuprinzând unul sau mai mulţi astfel de reactivi pentru utilizare într-o varietate de teste de detecţie, inclusiv, de exemplu, imunoteste precum ELISA (tip sandwich sau format competitiv). Componentele kit-ului pot fi pre-ataşate la un suport solid sau pot fi aplicate pe suprafaţa unui suport solid atunci când se utilizează kit-ul. În unele variante de realizare, mijloacele de generare a semnalului pot fi pre-asociate cu un anticorp sau fragment conform invenţiei sau pot necesita combinarea cu una sau mai multe componente. de exemplu, soluţii tampon, conjugate anticorp-enzimă, substraturi enzimatice sau altele asemenea, înainte de utilizare. Kit-urile pot include şi reactivi suplimentari, de exemplu, reactivi de blocare pentru reducerea legării nespecifice la suprafaţa fazei solide, reactivi de spălare, substraturi enzimatice şi altele asemenea. Suprafaţa fazei solide poate fi sub forma unui tub, a unei bile, a unei plăci de microtitrare, a unei microsfere sau a altor materiale adecvate pentru imobilizarea proteinelor, peptidelor sau polipeptidelor. În aspecte particulare, o enzimă care catalizează formarea unui produs chemoluminiscent sau cromogenic sau reducerea unui substrat chemoluminiscent sau cromogenic este o componentă a mijloacelor de generare a semnalului. Astfel de enzime sunt bine cunoscute în domeniu. Kit-urile pot cuprinde oricare dintre agenţii de captare şi reactivii de detecţie descrişi în conţinut. Opţional, kit-ul poate cuprinde şi instrucţiuni pentru efectuarea metodelor invenţiei.
[0275] De asemenea, este furnizat un kit cuprinzând un anticorp anti-proteina F hRSV sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen, ambalat într-un recipient, cum ar fi un flacon sau o sticlă, şi cuprinzând în plus o etichetă ataşată la sau ambalată împreună cu recipientul, eticheta descriind conţinutul recipientului şi oferind indicaţii şi/sau instrucţiuni privind utilizarea conţinutului recipientului pentru a preveni/trata una sau mai multe stări de boală, aşa cum este descris în conţinut.
[0276] Într-un aspect, kit-ul este destinat prevenirii sau tratării bolilor/afecţiunilor asociate cu infecţia cu RSV şi cuprinde un anticorp anti-proteină F hRSV sau un fragment al acestuia care se leagă la antigen şi un alt agent profilactic/terapeutic sau un vaccin. Kit-ul poate include opţional şi o seringă pentru administrare parenterală, de exemplu, administrare intravenoasă. Într-un alt aspect, kit-ul cuprinde un anticorp anti-proteină F hRSV sau un fragment de legare la antigen al acestuia şi o etichetă ataşată sau ambalată împreună cu recipientul care descrie utilizarea anticorpului sau fragmentului cu vaccinul sau un alt agent profilactic/terapeutic. Într-un alt aspect, kit-ul cuprinde vaccinul sau un alt agent profilactic/terapeutic şi o etichetă ataşată sau ambalată împreună cu recipientul care descrie utilizarea vaccinului sau a unui alt agent profilactic/terapeutic cu anticorpul sau fragmentul de proteină F anti-hRSV. În anumite variante de realizare, un anticorp anti-proteină F hRSV şi un vaccin sau un alt agent profilactic/terapeutic se află în flacoane separate sau sunt combinate împreună în aceeaşi compoziţie farmaceutică.
[0277] Pentru profilaxia sau terapia combinată, administrarea concomitentă a doi agenţi profilactici/terapeutici nu necesită ca aceştia să fie administraţi în acelaşi timp sau pe aceeaşi cale, atâta timp cât există o suprapunere în perioada de timp în care agenţii îşi exercită efectul profilactic/terapeutic. Se are în vedere administrarea simultană sau secvenţială, la fel ca şi administrarea în zile sau săptămâni diferite.
[0278] Kit-urile profilactice/terapeutice şi de detecţie descrise în conţinut pot fi, de asemenea, preparate cuprinzând cel puţin unul dintre anticorpi, peptide, fragmente de legare la antigen sau polinucleotide descrise în conţinut şi instrucţiuni pentru utilizarea compoziţiei ca reactiv de detecţie sau agent profilactic/terapeutic. Recipientele destinate utilizării în astfel de kit-uri pot cuprinde în mod tipic cel puţin un flacon, eprubetă, balon, sticlă, seringă sau alt recipient adecvat, în care se poate plasa una sau mai multe compoziţii de detecţie şi/sau profilactice/terapeutice şi, de preferinţă, se pot distribui în alicote adecvate. În cazul în care este prevăzut şi un al doilea agent profilactic/terapeutic, kit-ul poate conţine, de asemenea, un al doilea recipient distinct în care se poate plasa această a doua compoziţie de detecţie şi/sau profilactică/terapeutică. Alternativ, se poate prepara o multitudine de compuşi într-o singură compoziţie farmaceutică şi se pot ambala într-un singur recipient, cum ar fi un flacon, un balon, o seringă, o sticlă sau un alt recipient unic adecvat. Kit-urile descrise în conţinut vor include, de asemenea, tipic, un mijloc pentru a conţine flaconul/flacoanele în condiţii de izolare închisă pentru vânzare comercială, cum ar fi, de exemplu recipiente din plastic turnate prin injecţie sau prin suflare în care sunt păstrate flacoanele dorite. În cazul în care în kit este inclus un marcaj radioactiv, cromogenic, fluorigen sau de alt tip detectabil sau un mijloc de detectare, agentul de marcare poate fi furnizat fie în acelaşi recipient ca şi compoziţia de detectare sau profilactică/terapeutică în sine, fie poate fi plasat alternativ într-un al doilea recipient distinct în care această a doua compoziţie poate fi plasată şi împărţită în alicote adecvate. Alternativ, reactivul de detectare şi eticheta pot fi preparate într-un singur recipient şi, în majoritatea cazurilor, kit-ul va include, de obicei, şi un mijloc pentru a conţine flaconul/flacoanele într-un spaţiu închis pentru vânzare comercială şi/sau ambalare şi livrare convenabile.
[0279] De asemenea, este prevăzut un dispozitiv sau aparat pentru efectuarea metodelor de detectare sau monitorizare descrise în conţinut. Un astfel de aparat poate include o cameră sau un tub în care se poate introduce proba, un sistem de manipulare a fluidelor care include opţional valve sau pompe pentru a direcţiona fluxul probei prin dispozitiv, opţional filtre pentru a separa plasma sau serul de sânge, camere de amestecare pentru adăugarea de agenţi de captare sau reactivi de detecţie şi, opţional, un dispozitiv de detecţie pentru detectarea cantităţii de marcaj detectabil legat de imunocomplexul agentului de captare. Fluxul probei poate fi pasiv (de exemplu, prin forţe capilare, hidrostatice sau de altă natură care nu necesită manipularea ulterioară a dispozitivului odată ce proba este aplicată) sau active (de exemplu, prin aplicarea forţei generate prin pompe mecanice, pompe electroosmotice, forţă centrifugă sau creşterea presiunii aerului) sau printr-o combinaţie de forţe active şi pasive.
[0280] În alte variante de realizare, sunt prevăzute şi un procesor, o memorie lizibilă de către computer şi o rutină stocată în memoria lizibilă de către computer şi adaptată pentru a fi executată pe procesor pentru a efectua oricare dintre metodele descrise în conţinut. Exemple de sisteme, medii şi/sau configuraţii de calcul adecvate includ computere personale, computere server, dispozitive portabile sau laptop, sisteme multiprocesor, sisteme bazate pe microprocesoare, set-top box-uri, electronice de larg consum programabile, PC de reţea, minicomputere, computere mainframe, medii de calcul distribuite care includ oricare dintre sistemele sau dispozitivele de mai sus sau orice alte sisteme cunoscute în domeniu.
[0281] METODE GENERALE
[0282] Sunt descrise metodele standard în biologia moleculară Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982, 1989 Ed 2 şi 2001 Ed 3) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, ed. 3., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Metodele standard apar şi în Ausbel şi colab. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1-4, John Wiley şi Sons, Inc. New York, NY, care descriu clonarea de celule bacteriene şi mutageneza ADN (Vol. 1), clonarea de celule de mamifer şi drojdii (Vol. 2), glicoconjugate şi exprimarea proteică (Vol. 3), şi bioinformatică (Vol. 4).
[0283] Sunt descrise metode de purificare a proteinelor, inclusiv imunoprecipitarea, cromatografia, electroforeza, centrifugarea şi cristalizarea (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). Chemical analysis, chemical modification, post-translational modification, production of fusion proteins, glycosylation of proteins are described (a se vedea, de exemplu, Coligan, şi colab., (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, şi colab., (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391). Sunt descrise producţia, purificarea şi fragmentarea anticorpilor policlonali şi monoclonali Coligan, şi colab., (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, supra). Standard techniques for characterizing ligand/receptor interactions are available (vezi, de exemplu, Coligan, şi colab., (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York).
[0284] Anticorpii şi diacorpii cu lanţ simplu sunt descrişi (vezi, de exemplu, Malecki şi colab, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrath şi colab, 2001, J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter şi colab, 2001, J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson şi Kortt, 1999, J. Immunol. Methods 231:177-189 şi brevet de invenţie U.S. Nr. 4.946.778). Sunt furnizaţi anticorpi bifuncţionali (vezi, de exemplu, Mack şi colab. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immun. Methods 248:7-15; Volkel, şi colab. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal şi colab. (2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennan şi colab. (1985) Science 229:81-83; Raso şi colab. (1997) J. Biol. Chim. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker şi colab. (1991) EMBO J. 10:3655-3659 şi brevet de invenţie U.S. Nr. 5.932.448, 5.532.210 şi 6.129.914).
[0285] Sunt furnizaţi şi anticorpi bispecifici (vezi, de exemplu, Azzoni şi colab. (1998) J. Immunol. 161:3493; Kita şi colab., (1999) J. Immunol. 162:6901; Merchant şi colab., (2000) J. Biol. Chim. 74:9115; Pandey şi colab., (2000) J. Biol. Chim. 275:38633; Zheng şi colab. (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propst şi colab. (2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875).
[0286] Anticorpii pot fi conjugaţi, de exemplu, la molecule mici de medicamente, enzime, lipozomi, polietilen glicol (PEG). Anticorpii sunt utili în scopuri terapeutice, diagnostice, de tip kit sau în alte scopuri şi includ anticorpi cuplaţi, de exemplu, la coloranţi, radioizotopi, enzime sau metale, de exemplu, aur coloidal (vezi, de exemplu, Le Doussal şi colab. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini şi colab., (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing şi Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts şi colab. (2002) J. Immunol. 168:883-889).
[0287] Sunt disponibile metode de citometrie în flux, inclusiv sortarea celulelor activate prin fluorescenţă (FACS) (vezi, de exemplu, Owens şi colab. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley şi Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, ediţia a 2-a; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley şi Sons, Hoboken, NJ. Reactivi fluorescenţi adecvaţi pentru modificarea acizilor nucleici, inclusiv primeri şi sonde de acid nucleic, polipeptide şi anticorpi, pentru utilizare, de exemplu, ca reactivi de diagnostic, sunt disponibili (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).
[0288] Sunt descrise metodele standard de histologie a sistemului imunitar (vezi, de exemplu, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, şi colab., (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, şi Wilkins, Phila, PA; Louis, şi colab.,. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY).
[0289] Sunt disponibile pachete software şi baze de date pentru determinarea, de exemplu de fragmente antigenice, secvenţe lider, pliere proteică, domenii funcţionale, site-uri de glicozilare şi alinieri de secvenţe (vezi, de exemplu, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); Pachetul GCG Wisconsin (Accelrys, Inc, San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp, Crystal Bay, Nevada); Menne şi colab. (2000) Bioinformatică 16: 741-742; Menne şi colab. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren şi colab. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochim. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).
[0290] EXEMPLE
[0291] Exemplul 1: Identificarea unui Anticorp Neutralizant al RSV Complet Uman
[0292] Pentru a identifica anticorpi neutralizanţi puternici împotriva HRSV, serul a fost obţinut de la donatori cu consimţământ informat şi testat pentru capacitatea de a neutraliza in vitro virusul HRSV. Pentru testul de neutralizare, probele de ser au fost mai întâi diluate în serie şi apoi incubate cu 600 pfu dintr-o tulpină hRSV-A care exprimă proteina fluorescentă verde amplificată (RSV-GFP). RSV-GFP a fost amestecat 1:1 cu diluţii de ser într-un volum total de 200 µl per godeu în plăci cu fund în U cu 96 de godeuri la 37°C timp de 1 oră. 100 µl din amestecul per godeu au fost apoi transferate pe plăci însămânţate cu celule HEp-2 (15.000 de celule per godeu). Plăcile au fost scanate pe Acumen® Cellista (TTP LabTech, Cambridge, MA) şi datele au fost exportate ca număr de evenimente GFP şi intensitate totală a fluorescenţei per godeu. Valorile NT50 au fost calculate folosind GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA) prin ajustarea curbei cu patru parametri. Titrurile de legare ELISA la proteinele pre-F şi post-F RSV au fost efectuate conform următoarelor instrucţiuni. Plăcile Nunc C96 Maxisorp® Nunc-Immuno™ (Thermo Scientific, Inc.) au fost acoperite cu 50 µl per godeu de hRSV pre-F (vezi McLellan şi colab, 2013, Science 342:592) sau proteina post-F (proteina F post-fuziune LZF21 constă în ectodomeniul F wt fără peptida de fuziune (vezi McLellen şi colab, 2011, J. Virol 85:7788) la 1 µg/ml în PBS la 4°C peste noapte. Plăcile au fost spălate cu PBS/Tween 20 şi apoi blocate cu lapte degresat 3% în PBS. Ulterior, s-au adăugat 50 µl de probe de ser diluate în serie per godeu şi s-au incubat la temperatura camerei timp de 90 de minute. Plăcile au fost spălate şi s-a adăugat IgG de capră anti-uman conjugat cu HRP (SouthernBiotech, Birmingham, AL) la o diluţie de 1:2.000. O oră mai târziu, plăcile au fost spălate şi developate cu soluţie SuperBlu Turbo TMB (ViroLabs, Inc, Sterling, VA). Citirile OD450nm au fost obţinute utilizând un aparat Contor Multimarcaj Wallac 1420 VICTOR2™ (Perkin Elmer, Waltham, MA). Valorile EC50 au fost calculate folosind GraphPad Prism 6 prin ajustarea curbei cu patru parametri. Un subset de donatori care au demonstrat titruri ridicate de neutralizare şi legare a HRSV au fost rechemaţi pentru a procura volume mai mari de sânge pentru generarea de PBMC. Prepararea PBMC a fost efectuată de un furnizor comercial, iar PBMC achiziţionate au fost depozitate în azot lichid până la utilizare ulterioară.
[0293] Celulele mononucleare periferice (PBMC) de la un subiect au demonstrat titruri bune de neutralizare şi au avut, de asemenea, cele mai mari titruri într-un test ELISA de legare la proteina F post-fuziune, fiind totodată unul dintre liganzii de elită la proteina F pre-fuziune (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, PBMC acestui donator au fost alese pentru a izola celulele B de memorie specifice Post-F prin sortare FACS.
[0294] Proteina F post-fuziune trimerică biotinilată (LZF21) a fost preparată prin biotinilarea LZF21 (McLellen şi colab, 2011, J. Virol 85:7788) folosind Kit-ul de biotinilare E-Z Link™ Sulfo-NHS-LC (Life Technologies, Grand Island, NY) conform instrucţiunilor producătorului. Proteina LZF21 constă în ectodomeniul proteinei F de tip sălbatic fără peptida de fuziune (McLellen şi colab, 2011, J. Virol 85:7788). Hibridomul murin 4D7 specific proteinei F de fuziune (4D7 este un hibridom de şoarece generat prin imunizarea şoarecilor Balb/c cu virusul RSV A2). Şoarecii Balb/c au fost imunizaţi de două ori, intraperitoneal, cu virusul RSV A2 şi au fost rapelaţi cu trei zile înainte de fuziune, utilizând 20 µg de RSV A2 purificat (Advanced Biotechnologies, Inc, Columbia, MD), prin injecţie intravenoasă. Splina a fost recoltată, iar splenocitele au fost fuzionate cu celule de mielom SP2/0 utilizând polietilen glicol. Celulele au fost adăugate în Medium D (StemCell Technologies Inc, Vancouver, BC), placate în plăci Petri pătrate de 245 mm x 245 mm şi incubate la 37°C, 5% CO2 timp de 2 săptămâni. Coloniile individuale au fost selectate folosind un ClonePix (Genetix), transferate pe plăci cu 96 de godeuri şi incubate conform instrucţiunilor de mai sus timp de 1 săptămână. Supernatantele au fost apoi testate pentru activitatea anti-RSV prin ELISA împotriva RSV A2 purificat. Clonele pozitive, inclusiv 4D7, au fost expandate şi subclonate în plus prin diluţie limitatoare. Subclonele au fost testate aşa cum s-a descris mai sus, iar 4D7-8 a fost identificată şi utilizată pentru a optimiza colorarea LZF21-biotinei pe celulele B de memorie prin FACS (datele nu sunt prezentate). Prin aceste experimente de optimizare, s-a stabilit faptul că 1,5 µg/ml de LZF21-biotină a fost cea mai bună concentraţie pentru colorarea celulelor B de memorie specifice post-F. Specificitatea reacţiei de colorare a fost demonstrată prin utilizarea unui hibridom murin irelevant ca şi control negativ şi prin concurenţa legării cu un exces de 100-1000X de LZF21 nemarcat.
[0295] Celulele B cu memorie specifică antigenului au fost delimitate ca CD3- CD3-CD19+IgG+LZF21+ . Aceste celule au fost sortate în plăci cu 96 de godeuri (o celulă/godeu) conţinând un ligand CD40 care exprimă linia celulară HEK293 (obţinută folosind tehnici standard de biologie moleculară) şi IL-21 (Sino Biological Inc, North Wales, PA). Din cele 30 de probe sortate, supernatantul din 6 godeuri a demonstrat legarea la proteina post-F într-un test ELISA (efectuat aşa cum s-a descris mai sus). Aceste probe s-au legat şi de proteina pre-F (datele nu sunt prezentate). Aceste şase probe au fost apoi testate în testul de neutralizare, aşa cum s-a descris mai sus, fără diluţie. Prezenţa activităţii de neutralizare a fost determinată pe baza reducerii evenimentelor GFP. Dintre cele şase probe, două dintre ele (denumite RB1 şi RB11) au prezentat neutralizarea completă a tulpinii HRSV-A (vezi Tabelul 3).
[0296] Tabelul 3
ELISA 450nm
Neutralizare
ID Godeu
IgG
Post F
Pre-F
Obiect GFP#
% Neut
A8
0,641
1,743
1,222
783
A9
1,743
1,915
1,754
689
A11
1,81
1,905
1,555
500
B1
1,82
1,925
1,910
0
100%
B11
1,851
1,748
1,900
1
100%
B12
1,801
1,838
1,679
548
Control
0,037
0,038
0,044
596
[0298] Extracţia ARN şi RT-PCT pentru Cultura de Celule B de Memorie cu Sortare Unică
[0299] Partea 1:
[0300] ARN de pe o placă cu 96 de godeuri din lizatul de hit RB1 a fost extras folosind un aparat RNeasy® Micro Kit (Qiagen, Inc, Valencia, CA) conform manualului producătorului. Concentraţia de ARN a fost determinată cu NanoDrop™ 2000C (Thermo Fisher Scientific Inc, Wilmington, DE) sub UV 260 nm. ARN extras din godeul RB1 a fost utilizat ca şablon în amplificarea RT-PCR a genelor lanţurilor grele şi uşoare de anticorpi folosind secvenţe de primeri folosind secvenţe din secvenţa lider (direct) şi capătul C' al IgG JH, regiunea constantă Kappa sau regiunea constantă Lambda (revers).
[0301] Kit-ul OneStep RT-PCR (Qiagen Inc, Valencia, CA) a fost utilizat conform instrucţiunilor producătorului pentru amplificarea secvenţelor de anticorpi. Condiţiile PCR au fost următoarele: 50°C timp de 30 de minute, 95°C timp de 15 minute, [94°C timp de 30 de secunde, 55°C timp de 30 de secunde, 72°C timp de 1 minut] x 40, 72°C timp de 10 minute şi menţinere la 4°C.
[0302] Produsul RT-PCR a fost utilizat direct ca şablon pentru tehnica nested-PCR
[0303] Partea 2: Tehnica nested-PCR
[0304] Produsele RT-PCR au fost utilizate ca şabloane în PCR pentru a amplifica regiunile variabile ale anticorpilor cu ADN polimeraza pfx50 (Invitrogen, nr. catalog: 12355-012). Designul primerilor tehnicii nested-PCR s-a bazat pe secvenţele germinale ale regiunii cadru 1 a regiunilor variabile ale lanţurilor grele şi uşoare ale IgG umane.
[0305] 1 µl de produs RT-PCR a fost amestecat cu 2,5 µl de tampon PCR 10X, 2,5 µl de amplificator PCR 10X (Invitrogen), 0,5 µl de amestec dNTP, 0,5 µl de primeri direcţi (câte 10 µM fiecare), 0,5 µl de primer revers (10 µM), 0,5 µl de ADN polimerază pfx50 şi 17 µl de apă. Condiţiile tehnicii nested-PCR au fost: 2 minute la 94°C, 10 cicluri de 94°C timp de 30 de secunde, 50°C timp de 30 de secunde, 68°C timp de 1 minut, urmate de 30 de cicluri de 94°C timp de 30 de secunde, 60°C timp de 30 de secunde, 68°C timp de 1 minut, apoi elongaţie timp de 7 minute la 68°C, urmată de menţinere la 4°C pentru depozitare pe termen scurt.
[0306] Produsele tehnicii nested-PCR RB1 ale produselor PCR amplificate cu VH şi VK sau VH şi VL au fost utilizate ca şablon în PCR suprapus cu linkeri specifici pentru legarea împreună a genelor lanţului uşor şi greu al anticorpilor, pentru a facilita următoarea etapă de clonare prin perfuzie.
[0307] Partea 3 Tehnica Overlap PCR şi Clonare prin Perfuzie
[0308] În această reacţie s-a utilizat ADN polimeraza pfx50 (Invitrogen). Primerii direcţi şi reverşi au fost concepuţi pentru a facilita clonarea prin infuzie a produselor prin tehnica Overlap PCR într-un vector de clonare. 1 µl de produs prin tehnica nested-PCR cu lanţ greu, 1 µl de produs prin tehnica nested-PCR cu lanţ uşor şi 1 µl de linker au fost amestecate cu 5 µl de tampon PCR 10x, 5 µl de amplificator PCRX 10x, 1 µl de amestec dNTP, 1 µl de primer direct (10 µM), 1 µl de primer revers (10 µM), 1 µl de ADN polimerază pfx50 şi 33 µl de apă.
[0309] Condiţiile PCR au fost următoarele: 94°C timp de 2 minute, [94°C timp de 30 sec, 60°C timp de 30 sec, 68°C timp de 2 min] x 10, [94°C timp de 30 sec, 65°C timp de 30 sec, 68°C timp de 2 min] x 30, 68°C timp de 7 min, menţinere la 4°C.
[0310] Produşii din tehnica Overlap PCR au fost purificaţi pe gel de agaroză pentru clonarea prin perfuzie (s-a obţinut un produs PCR suprapus RB1 VH+VK de aproximativ 1,2 kb). Produşii prin tehnica Overlap PCR RB1 VH+VK au fost clonaţi în vectorul pMab11Exp2 (cu secvenţă lider OmpA pentru exprimarea lanţului uşor, cu secvenţă lider PelB pentru exprimarea lanţului greu) prin aplicarea clonării prin perfuzie. S-a utilizat kit-ul de clonare prin infuzie HD® (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) şi s-au urmat instrucţiunile producătorului. Transformanţii au fost selectaţi şi trimişi la GeneWiz, Inc. (South Plainfield, NJ) pentru secvenţiere.
[0311] Rezultatele secvenţierii au fost analizate cu Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).
[0312] Secvenţele de nucleotide şi aminoacizi ale RB1 sunt prezentate în Tabelul 7 (secvenţele de aminoacizi ale lanţului greu variabil şi ale lanţului uşor variabil RB1 izolate de pacient sunt reprezentate de SECV ID NR: 9 şi respectiv SECV ID NR: 8). Datorită designului primerilor reverşi Jh care prezintă o modificare a nucleotidelor, o izoleucină prezentă în secvenţa naturală la poziţia 125 a fost schimbată în treonină în proteina exprimată (lanţul greu variabil RB1 rezultat este reprezentat de SECV ID NR: 7). Secvenţele de aminoacizi ale genelor domeniului greu şi uşor variabil ale anticorpilor RB1 au fost trimise către GenScript USA, Inc. (Piscataway, NJ) pentru optimizarea codonilor şi conversia IgG1 umană şi expresia şi producerea tranzitorie CHO. ADN sintetizat a fost sub-clonat în vectorul pTT5 pentru expresia celulară CHO-3E7. Plasmidele recombinant care codifică lanţurile grele şi uşoare ale fiecărui anticorp au fost co-transfectate tranzitoriu în culturi celulare CHO-3E7. Supernatantele culturilor celulare colectate în ziua 6 au fost utilizate pentru purificare prin coloană de Proteină A. IgG1 uman RB1 purificat a fost utilizat în testul de neutralizare şi alte experimente de caracterizare, aşa cum este descris în Exemplul 2.
[0313] Exemplul 2: Caracterizarea Anticorpilor Anti-hRSV
[0314] RB1 s-a legat atât de proteina F pre-F, cât şi de proteina F post-fuziune într-un test ELISA, aşa cum este descris în Exemplul 1 cu o valoare EC50 cuprinsă între 1-10 ng/ml, în timp ce anticorpul D25 (vezi Kwakkenbos şi colab, 2010, Nature Medicine 16:123-128) s-a legat preferenţial de F pre-fuziune. Vezi Fig. 1A-B.
ID mAb
Pre-F (EC50 ng/ml)
Post-F (EC50 ng/ml)
D25
8,939
>10,000
palivizumab
17,37
10,5
RB1
7,053
14,08
[0316] Neutralizarea pentru RB1, RB 11 şi unii anticorpi de referinţă raportaţi în literatura de specialitate (D25, palivizumab, lungime completă [anticorpul D25 a fost produs intern pe baza secvenţei publicate şi SYNAGIS® (palivizumab) a fost achiziţionat de la Myoderm, Norristown, PA]) a fost comparat în tulpina RSV A Long (numărul ATCC VR-26)™ şi tulpina RSV B Washington tulpina 18537 (număr ATCC VR-1580™). Probele testate au fost diluate în serie de trei ori în EMEM suplimentat cu 2% FBS inactivat termic, pentru unsprezece puncte de diluţie. Probele diluate în serie au fost apoi amestecate cu volume egale de EMEM suplimentat cu 2% FBS inactivat termic, conţinând 100 pfu/godeu de tulpini RSV A sau B. După incubare la 37°C timp de 1 oră, s-au adăugat 100 µl de celule HEp-2 la o concentraţie de 1,5x105 celule/ml a fost transferat pe plăcile cu 96 de godeuri care conţineau amestecul virus/anticorp. La 3 zile după infecţie, celulele au fost spălate o dată cu PBS şi apoi fixate în acetonă 80% timp de 10 minute la temperatura camerei. Un amestec de anticorpi monoclonali de şoarece specifici pentru RSV F (mAb143-F3-B138) şi RSV N (34C9) (obţinuţi intern) a fost adăugat pe plăci şi incubat timp de 1 oră la temperatura camerei. Plăcile au fost spălate cu PBS/0,05% Tween 20 şi s-a adăugat pe plăci IgG biotinilat de cal anti-şoarece şi s-a incubat timp de 1 oră la temperatura camerei. Plăcile au fost spălate cu PBS/0,05% Tween. S-a utilizat colorantul în infraroşu - Streptavidină pentru a detecta semnalul specific RSV, iar două coloranţi celulari pentru normalizarea testului au fost adăugaţi pe plăcile cu 96 de godeuri şi incubaţi timp de 1 oră la întuneric. După o oră de incubare, plăcile au fost spălate, uscate la aer timp de 20 de minute la întuneric şi citite pe Sistem automat de imagistică Licor Aerius® care utilizează un laser cu 700 de canale pentru normalizarea celulară şi un laser cu 800 de canale pentru detectarea semnalului specific RSV. Au fost calculate rapoartele 800/700 şi procentul de neutralizare, iar valorile IC50 au fost determinate prin ajustarea curbei cu patru parametri în GraphPad.
[0317] RB1 a fost capabil să neutralizeze tulpinile RSV-A şi RSV-B cu potenţă egală (IC50 de 1-5 ng/ml). RB1 a demonstrat, de asemenea, o neutralizare anti-RSV superioară în comparaţie cu anticorpii de referinţă. Vezi Figurile 2A-B şi Tabelul 4.
[0318] Tabelul 4: Potenţa de legare şi neutralizare a RB1 în comparaţie cu anticorpii de referinţă
Legare F pre-fuziune
Legare F post-fuziune
Activitate de Neutralizare, RSV A/Long
CI50 (ng/mL) RSV B/Washington
RB1
+
+
3
1,7
D25
+
-
3,6
25,9
AM22
+
-
50
172,8
131-2A, şoarece (Millipore)
+/-
+
1046
>10,000
4D7 (Merck), şoarece
+/-
+
2408
>10,000
palivizumab
+
+
211,5
166
MPE8
+
-
106,6
46
101F, şoarece
+
+
67
43,6
AM14
+
-
3,2
1,9
[0320] Determinarea afinităţii pentru legare a RB1 la proteina F pre- şi post-fuziune: Activitatea cinetică de legare a anticorpului RB1 anti-proteină F RSV uman (preparat conform descrierii din Exemplul 1) a fost măsurată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă utilizând un sistem Biacore T200 (Biacore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Aproximativ 5000 RU de IgG anti-şoarece, număr de catalog GE Healthcare BR-1008-38, sau aproximativ 13.000 RU de IgG Fc gamma de capră anti-şobolan, specific fragmentului, număr de catalog Jackson ImmunoResearch 112-006-071, au fost imobilizate prin chimie de cuplare aminică pe un cip senzor CM5 din seria S, număr de catalog BR-1005-30.
[0321] Senzogramele de legare prin scăderea fundalului au fost utilizate pentru analiza constantei de viteză de asociere (ka) şi disociere (kd) şi constanta de disociere la echilibru KD. Seturile de date rezultate au fost ajustate cu un model de legare Langmuir 1:1 utilizând software-ul de evaluare Biacore T200 (versiunea 2.0). Tabelul 5 prezintă un rezumat al afinităţilor anticorpului anti-proteina F RSV uman faţă de formele de pre-fuziune şi post-fuziune ale proteinei F RSV.
[0322] Tabelul 5: Măsurarea Afinităţii pentru RB1 faţă de F pre-fuziune şi F post-fuziune RSV utilizând BIAcore
Proteină
Kon (M-15-1)
K0ff (S-1)
KD. (nM)
F pre-Fuziune
4,4x106
1,4x10-4
0,031
F Post-Fuziune
2,2x106
9x10-4
0,41
[0324] RB1 este un liant foarte puternic al proteinei F pre-fuziune, cu un Kd de ~31 pM. Kd pentru legarea post-fuziune a fost cu o magnitudine mai mică, la 0,41 nM. Kd pentru D25, aşa cum este raportat în publicaţia Cererii Internaţionale de brevet nr. WO2014121021 A1 a fost de 57 pM. De asemenea, anticorpul RB1 rămâne activ mai mult timp pe F pre-fuziune decât post-fuziune, aşa cum se observă cu o rată de deconectare mai mică de 1,4 x 10-4 în comparaţie cu proteina F post-Fuziune.
[0325] Exemplul 3: Maparea Epitopilor Anticorpului RB1
[0326] Epitopul de legare al RB1 pe proteina F de fuziune a fost mapat prin efectuarea unui experiment de mutageneză cu scanare de alanină. Cartografierea epitopilor a fost efectuată prin mutageneză de tip shotgun la Integral Molecular, aşa cum este descris. (Davidson şi Doranz, 2014, Immunology 143(1): 13-20). Pentru a construi o bibliotecă de mutageneză rapidă, vectorul de expresie a proteinei RSV-F este mutagenizat pentru a crea o bibliotecă de clone, fiecare reprezentând un mutant punctual individual şi acoperind cumulativ toate reziduurile din proteină. Bibliotecile au fost construite folosind mutageneza prin scanare cu alanină, care furnizează o metodă mai controlată de definire a contribuţiilor lanţului lateral al fiecărui reziduu. Folosind protocoale robotice semiautomate, fiecare plasmidă mutantă a fost clonată individual, secvenţiată, mini-preparată şi aranjată în format de microplăci cu 384 de godeuri pentru teste repetate de transfecţie, expresie şi legare a anticorpilor în celule umane. Biblioteca de mutanţi prin scanare cu alanină a fost analizată în raport cu RB1 pentru pierderea legării anticorpilor. Două reziduuri de arginină-429 şi izoleucină-432 au fost identificate ca fiind critice pentru legarea RB1. Vezi mai jos şi Fig. 3A. RB1 pare a fi un anticorp monoclonal de situs IV (similar 101F), iar anticorpii de legare la situs IV din literatura de specialitate au fost raportaţi că se leagă atât de F pre-fuziune, cât şi de F post-fuziune.
[0327]
[0328] S-a co-cristalizat în continuare proteina F de pre-fuziune RB1 cu proteina F de pre-fuziune pentru a înţelege mai bine epitopul de legare. Datele de difracţie au fost colectate din cristale la 3,4-3,5A°. Anticorpul RB1 se leagă la proteina F pre-fuziune prin interacţiuni cu buclele CDR atât ale lanţurilor grele, cât şi ale celor uşoare. Bucla CDR3 a lanţului uşor interacţionează cu lanţul lateral al Arg 429 prin formarea a două legături de hidrogen între atomii de oxigen carbonilici ai Phe 91 şi Leu 92 şi azotul guanidino al Arg 429. De asemenea, pe lanţul uşor, Asp 50 şi Glu 55 de pe bucla CDR2 sunt poziţionate pentru a forma legături de hidrogen cu Asn 426 şi Lys 445 ale RSV. Interacţiuni extinse se produc prin bucla CDR3 a lanţului greu al RB1, Tyr 104 şi Tyr 110 formând o suprafaţă pentru interacţiunea van der Waals cu Ile 432 pe RSV. Lys 433 din RSV formează o legătură de hidrogen cu Asn 107 din bucla CDR3. Conform structurii cristaline, lanţul uşor al RB1 se grupează şi contra Glu 161 şi Ser 182 sau a monomerului adiacent al trimerului de pre-fuziune RSV.
[0329] Epitopul de legare identificat pentru RB1 este înalt conservat printre 944 din 946 de secvenţe de proteine F raportate în literatura de specialitate. Acest lucru sugerează faptul că rezistenţa la anticorpii împotriva acestei regiuni ar fi de aşteptat să fie scăzută.
[0330] Exemplul 4: Activitatea Anticorpilor anti-RSV în Modelul Animal
[0331] Anticorpul RB1 a fost comparat cu D25 şi palivizumab pentru a furniza protecţie în modelul de provocare la şobolan de bumbac. Studiul a inclus anticorpi palivizumab, D25 şi RB1 administraţi în doze de 2,5 mg/k şi diluaţi în serie de 10 ori până la 0,25 mg/km. În acest model de imunoterapie pasivă, şobolanilor de bumbac li s-au administrat RB1, D25 sau palivizumab în diferite concentraţii la ziua de infecţie şi li s-a administrat 105 ufp a RSV o zi mai târziu. Titrurile nazale şi pulmonare ale virusului RSV provocat au fost testate la patru zile după infectare şi utilizate pentru a determina răspândirea virală printr-un test de plăci.
[0332] Şobolan de bumbac: Cel puţin cinci şobolani de bumbac (Sigmodon hispidus), cu vârsta cuprinsă între 3 şi 7 săptămâni şi o greutate corporală medie de aproximativ 100 de grame, au fost obţinuţi de la SAGE Labs (Boyertown, PA). Hrană convenţională pentru rozătoare şi apă au fost furnizate ad libitum.
[0333] Reactivi pentru Anticorpi: Palivizumab 100 mg liofilizat (Myoderm, Norristown, PA) a fost formulat în apă la o concentraţie de 100 mg/ml. Ceilalţi anticorpi au fost exprimaţi şi purificaţi intern.
[0334] Formulări ale Reactivilor pentru Anticorpi: Tampoanele de formulare au fost specifice pentru fiecare anticorp pentru a stabiliza proteinele şi a preveni precipitarea. Formulările au fost următoarele: RB1 şi D25 au fost diluate în 1x soluţie salină tamponată cu fosfat, pH 7,2. Palivizumab a fost formulat conform sugestiei producătorului prin dizolvare în H₂O distilată, care ar tampona eficient proteina în 25 mM histidină şi 1,3 mM glicină, pH 6,0.
[0335] Prepararea Soluţiei de Dozare, Administrare şi Analize:
[0336] 0265] Cinci animale au fost cântărite aleatoriu pentru a determina greutatea medie a cohortelor utilizate. Formulările au fost preparate cu aproximativ o oră înainte de administrarea la animale. Stocurile congelate de anticorpi au fost decongelate pe gheaţă umedă pentru o singură decongelare. Fiecare anticorp a fost diluat la concentraţia dozei adecvate pentru a fi administrat fiecărui grup. În ziua 0 (iniţierea studiului), animalele care au fost repartizate aleatoriu în fiecare grup au fost uşor sedate cu anestezie cu izofluran 1-4% şi li s-au administrat 0,1 ml în cvadricepsul drept intramuscular cu o seringă şi un ac de calibru 26G. Animalele şi-au revenit după efectele sedării în două minute. Aproximativ 24 de ore mai târziu (+/- 2 ore), şobolanii de bumbac au fost sedaţi cu izofluran 1-4%, li s-a prelevat sânge prin plexul retroorbital şi apoi li s-a administrat imediat prin nări 0,1 ml de 1x105.5 ufp ale virusului RSV A2 sau RSV B Washington de tip sălbatic în mediu Williams E. La patru zile după inoculare, animalele au fost sacrificate prin CO2. Probele inhalatorii, pulmonare (lobii stângi) şi cornetele nazale au fost îndepărtate şi omogenizate în 10 volume de soluţie salină echilibrată Hanks (Lonza) conţinând tampon fosfat de zaharoză şi glutamină (SPG) pe gheaţă umedă. Probele au fost clarificate prin centrifugare la 2000 rpm timp de 10 minute, împărţite în alicote, congelate rapid şi depozitate imediat congelate la -70°C până la testarea în testul de placă.
[0337] Aşa cum se arată în Figurile 4A-D şi Figurile 5A-D, RB1 a reuşit să obţină o reducere de 2-3 log a titrurilor virale atât pentru RSV A, cât şi pentru RSV B în plămâni şi nas, la o doză de 2,5 mpk, similară cu D25, dar mai bună decât palivizumab, care nu a reuşit să influenţeze titrurile virale din nas.
[0338] Exemplul 5: Ingineria Fc RB1
[0339] Receptorul Fc neonatal pentru IgG (FcRn) a fost bine caracterizat în transferul imunităţii umorale pasive de la mamă la făt. În plus, pe tot parcursul vieţii, FcRn protejează IgG de degradare, explicând astfel timpul de înjumătăţire lung al acestei clase de anticorpi în ser. A se vedea, de exemplu, Israel şi colab, 1996, Immunology 89:573-8FcRn se leagă de porţiunea Fc a IgG într-un situs distinct de site-urile de legare ale FcγR clasice sau de componenta C1q a complementului. Structura co-cristalină FcRn-Fc a relevat faptul că FcRn se leagă de regiunea balama CH2-CH3 a anticorpilor IgG. O caracteristică distinctivă a căii IgG-FcRn este dependenţa obligatorie de pH. Legarea IgG-FcRn este determinată de pH-ul acid (6,0) din lizozom, în timp ce disocierea are loc la pH-ul neutru (7,4) al mediului extracelular. Acidularea (pH 6,0-6,5) în lizozomi permite legarea FcRn de regiunea Fc a IgG cu o afinitate micromolară scăzută şi o protejează de catabolism. IgG protejat legat de FcRn este ulterior transportat la suprafaţa celulei şi eliberat în mediul extracelular. Acest proces protejează anticorpii prin reducerea expunerii acestora la degradarea extracelulară.
[0340] Anticorpul RB1 a fost supus ingineriei Fc în efortul de a îmbunătăţi timpul de înjumătăţire. RB1+YTE este un derivat al RB1 cu mutaţia triplă (M252Y/S254T/T256E (YTE) introdusă în porţiunea Fc a RB1. Acest set de mutaţii YTE îmbunătăţeşte legarea anticorpilor la receptorii Fc neonatali, ducând la timpi de înjumătăţire mai lungi la om. A se vedea, de exemplu, Dall'Acqua şi colab, 2006, J Biol Chem. 281:23514-24. Mutaţiile la nivelul a 3 aminoacizi (YTE: M252Y/S254T/T256E) din regiunea Fc a motavizumab au dus la o creştere de 10 ori a legării FcRn in vitro la pH 6,0 atât la oameni, cât şi la maimuţe, rezultând în consecinţă o creştere de 4 ori a timpului de înjumătăţire plasmatică in vivo la maimuţe. Vezi Robbie şi colab, 2013, Antimicrob Agents Chemother. 57:6147-53.
[0341] Secvenţele de aminoacizi ale domeniilor variabile ale lanţului greu şi uşor al anticorpilor RB1+YTE au fost trimise către GenScript USA, Inc. (Piscataway, NJ) pentru optimizarea codonilor şi conversia IgG1 umană şi expresia şi producerea tranzitorie CHO. Secvenţele de nucleotide şi aminoacizi ale RB1+YTE sunt prezentate în Tabelul 7.
[0342] ADN sintetizate au fost subclonate în vectorul pTT5 pentru exprimarea celulară CHO-3E7. Plasmidele recombinant care codifică lanţurile grele şi uşoare ale fiecărui anticorp au fost co-transfectate tranzitoriu în culturi celulare CHO-3E7. Supernatantele culturilor celulare colectate în ziua 6 au fost utilizate pentru purificare prin coloană cu Proteină A. IgG1 uman RB1+YTE purificat a fost utilizat într-un test de neutralizare şi alte experimente de caracterizare.
[0343] Exemplul 6: Caracterizarea RB1+YTE
[0344] RB-1+YTE legat de proteina F într-un test ELISA efectuat aşa cum este descris în Exemplul 1 cu un EC50 variind de la 1,97 la 2,457 ng/ml. Vezi Figura 6. Neutralizare pentru RB1+YTE şi un anticorp de referinţă raportat în literatura de specialitate (Motavizumab, MedImmune, Gaithersburg, MD; vezi publicaţia cererii de brevet U.S. Nr. US20110158985) realizate intern pe baza secvenţei publicate, au fost comparate în tulpina RSV A Long (număr ATCC VR-26™) şi tulpina RSV B Washington tulpina 18537 (număr ATCC VR-1580™). Probele testate au fost diluate în serie de trei ori în EMEM suplimentat cu 2% FBS inactivat termic, pentru unsprezece puncte de diluţie. Probele diluate în serie au fost apoi amestecate cu volume egale de EMEM suplimentat cu 2% FBS inactivat termic, conţinând 100 pfu/godeu de tulpini RSV A sau B. După incubare la 37°C timp de 1 oră, s-au adăugat 100 µl de celule HEp-2 la o concentraţie de 1,5x105 celule/ml a fost transferat pe plăcile cu 96 de godeuri care conţineau amestecul virus/anticorp. La 3 zile după infecţie, celulele au fost spălate o dată cu PBS şi apoi fixate în acetonă 80% timp de 10 minute la temperatura camerei. Un amestec de anticorpi monoclonali de şoarece specifici pentru RSV F (mAb143-F3-B138) şi RSV N (34C9) (mAb143-F3-B138 şi 34C9 sunt anticorpi interni, derivaţi prin imunizarea şoarecilor cu antigenele respective şi imortalizarea celulelor B folosind tehnologia hibridomului) a fost adăugat pe plăci şi incubat timp de 1 oră la temperatura camerei. Plăcile au fost spălate cu PBS/0,05% Tween 20 şi s-a adăugat pe plăci IgG biotinilat de cal anti-şoarece şi incubat timp de 1 oră la temperatura camerei. Plăcile au fost spălate cu PBS/0,05% Tween. S-a utilizat colorant infraroşu - Streptavidină pentru a detecta semnalul specific RSV, iar două coloranţi celulari pentru normalizarea testului au fost adăugaţi pe plăcile cu 96 de godeuri şi incubaţi timp de 1 oră la întuneric. După o oră de incubare, plăcile au fost spălate, uscate la aer timp de 20 de minute la întuneric şi citite Sistem automat de imagistică pe Licor Aerius® care utilizează un laser cu 700 de canale pentru normalizarea celulară şi un laser cu 800 de canale pentru detectarea semnalului specific RSV. Au fost calculate rapoartele 800/700 şi procentul de neutralizare, iar valorile IC50 au fost determinate prin ajustarea curbei cu patru parametri în GraphPad.
[0345] RB-1+YTE a reuşit să neutralizeze tulpinile RSV-A şi RSV-B cu potenţă egală (IC50 de 5-10 ng/ml). Vezi Tabelul 6.
[0346] Tabelul 6: Măsurarea Neutralizării şi Afinităţii pentru RB1+YTE la F pre-fuziune şi F post-fuziune a RSV
Anticorp
IC50 Neutralizare in vitro (ng/ml)
Constante cinetice (F pre-fuziune)
Constante cinetice (F post-fuziune)
RSV A
RSV B
Kon (M)-1s-1)
Koff (s-1)
KD. (nM)
Kon (M)-1s-1)
Koff (s-1)
KD. (nM)
RB-1
3
1,7
4,4x106
1,4x10-4
0,031
2,2x106
9x10-4
0,41
RB-1+ YTE
3,6
3,49
3,2x106
2,3x10-4
0,071
1,4x106
7x10-4
0,48
[0348] Introducerea mutaţiilor YTE în porţiunea Fc a genei RB1 nu a modificat potenţa in vitro a anticorpului de a neutraliza tulpinile RSV A şi B. Potenţa de neutralizare in vitro pentru RSV A a fost de 3 şi 3,6 ng/ml pentru RB1 şi respectiv RB1+YTE. Potenţele de neutralizare in vitro pentru RSV B au fost de 1,7 şi 3,49 ng/m2 pentru RB1 şi respectiv RB1+YTE. Constantele cinetice măsurate prin Biocore au fost similare pentru RB1 şi RB1+YTE, ceea ce sugerează faptul că introducerea YTE în regiunea Fc a anticorpului nu a modificat proprietăţile sale de legare la antigen.
[0349] Un studiu farmacocinetic non-GLP (Good Laboratory Practice - Bune Practici de Laborator) a fost efectuat la Centrul de Cercetare New Iberia (UL Lafayette, LA). Opt maimuţe rhesus masculi, netrataţi anterior cu produse biologice, au fost randomizaţi şi repartizaţi într-unul din două grupuri de studiu (n=4 per grup). Fiecare animal a primit o singură doză intravenoasă (i.v.) de RB1+YTE sau Motavizumab-YTE la 10 mg/kg. Probele de sânge au fost prelevate înainte de administrare în ziua 0, la 0,5, 1, 3, 8 şi 24 de ore după administrare şi la 1, 2, 3, 5, 7 şi 10 zile după administrare. S-au utilizat imunoteste bazate pe ECL pentru a cuantifica atât RB1+YTE (anticorp monoclonal uman x [RSV] (RB1-YTE) IgG1 / Kappa (CE)), cât şi Motavizumab_YTE (anticorp monoclonal uman x [RSV] IgG1 / Kappa) în serul maimuţelor rhesus.
[0350] Testul a utilizat anticorpi IgG biotinilaţi de şoarece anti-IgG uman cu lanţ kappa (BD Biosciences, San Jose, CA) ca reactiv de captură şi anticorpi Fc IgG uman cu sulfoTAG de şoarece anti-IgG uman ca reactiv de detecţie (SouthernBiotech Birmingham, AL). Limita inferioară de cuantificare (LLOQ) a testului a fost determinată la 1,37 ng/ml cu o diluţie minimă necesară (MRD) de 20.
[0351] Farmacocinetica RB1+YTE şi Motavizumab-YTE a fost evaluată timp de până la 10 zile la macaci rhesus cărora li s-au administrat intravenos doze de 10 mg/kg, utilizând acelaşi test imunologic pentru a cuantifica RB1+YTE şi Motavizumab-YTE. Pentru fiecare animal, a fost ajustat un model non-compartimental pentru datele privind concentraţia serică a fiecărui animal utilizând Phoenix Winnonlin 6.3 (Certara, NJ) pentru a estima aria de sub curbă (AUC0-10 zile). AUC0-10 zile a fost mediată pe 4 animale pentru fiecare grup de tratament şi raportată ca medie ± deviaţie standard. Pentru RB1+YTE, AUCO-10 zile = 1159±116 µg/mL*zi, iar pentru Motavizumab-YTE, ASC0-10 zile = 1381±63,0 µg/mL*zi.
[0352] RB1+YTE (reprezentat ca RB1-YTE în legenda figurii) şi Motavizumab-YTE au prezentat profiluri de concentraţie serică şi farmacocinetică similare la macacul rhesus. Vezi Fig. 7. Farmacocinetica RB1+YTE în NHP s-a dovedit a fi, de asemenea, comparabilă cu farmacocinetica motavizumab-YTE raportată în literatura de specialitate la maimuţa cynomolgus. Vezi Dall'Acqua şi colab, 2006, J Biol Chem, 281:23514-24.
[0353] Tabelul 7: Informaţii despre Secvenţă
SECV ID NR:
Descriere
SECVENŢĂ
1
RB1 H - CDR1
DSAMS
2
RB1 H - CDR2
FIKSKTYGGTKEYASVKG
3
RB1 H - CDR3
GAPYGGNSDYYYGLDV
4
RB1 L - CDR1
RTSQDVRGALA
5
RB1 L - CDR2
DASSLET
6
RB1 L - CDR3
QQFLDFPFT
7
RB1 VH
8
RB1 VL
9
RB1 VH (pacient izolat)
10
Secvenţă lider
11
RB1 VH + lider
12
RB1 VL + lider
13
Domeniu constant al lanţului greu-IgG1
14
Domeniu constant al lanţului uşor kappa
15
Acid nucleic care codifică RB1 VH
16
Acid nucleic care codifică RB1 VL
17
Acid nucleic care codifică RB1 VH (optimizat pentru codoni)
18
Acid nucleic care codifică RB1 VL (optimizat pentru codoni)
19
Acid nucleic care codifică lanţul greu al secvenţei Lider
20
Acid nucleic care codifică lanţul uşor al secvenţei Lider
21
Acid nucleic care codifică domeniul constant al lanţului greu-IgG1
22
Acid nucleic care codifică domeniul constant al lanţului uşor Kappa
23
Lanţ greu RB1+YTE
24
Acid nucleic care codifică lanţul greu RB1+YTE (optimizat pentru codoni)
25
Lanţ uşor RB1+YTE
26
Acid nucleic care codifică lanţul uşor RB1+YTE

Claims (23)

1. Anticorp izolat sau fragment de legare la antigen al acestuia care se leagă la proteina F RSV uman, în care anticorpul sau fragmentul de legare la antigen cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 1, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:2, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:3, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:4, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:5 şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:6.
2. Anticorpul izolat sau fragmentul acestuia de legare la antigen conform revendicării 1, care se leagă la proteina F RSV uman, cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând cel puţin 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identitate cu SECV ID NR: 7 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând cel puţin 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identitate cu SECV ID NR: 8.
3. Anticorpul izolat sau fragmentul de legare la antigen conform revendicărilor 1 sau 2, în care anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia se leagă la proteina F pre-fuziune RSV uman cu o valoare KD de aproximativ 1 x 10-9 M până la aproximativ 1 x 10-12 M determinat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (de exemplu, BIACORE) sau o tehnică similară (de exemplu, KinExa sau OCTET).
4. Anticorpul izolat sau fragmentul de legare la antigen conform oricăreia dintre revendicările 1-3, în care anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 7 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 8.
5. Anticorpul izolat conform revendicării 4, care este un anticorp de lungime completă având două lanţuri uşoare şi două lanţuri grele, în care fiecare lanţ uşor cuprinde: o regiune variabilă cuprinzând SECV ID NR: 8 şi un lanţ uşor kappa uman (SECV ID NR: 14); şi fiecare lanţ greu cuprinde: o regiune variabilă cuprinzând SECV ID NR: 7 şi o regiune constantă IgG1 umană (SECV ID NR: 13).
6. Anticorpul izolat conform revendicării 4 sau 5, în care anticorpul cuprinde lanţul greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23 şi lanţul uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
7. Anticorpul izolat conform revendicării 4 sau 5, în care lanţul greu constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 23, iar lanţul uşor constă în secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 25.
8. Anticorpul izolat conform oricăreia dintre revendicările 1-4, care este un anticorp IgG.
9. Anticorpul izolat sau fragmentul de legare la antigen conform oricăreia dintre revendicările 1-4, care este un anticorp, sau anticorpul izolat conform revendicărilor 5-8, în care anticorpul este produs într-o celulă CHO.
10. Acid nucleic izolat care codifică anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform revendicărilor 1-8.
11. Vector de expresie cuprinzând acidul nucleic izolat conform revendicării 10.
12. Compoziţie cuprinzând anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform oricăreia dintre revendicările 1-9 şi un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic.
13. Compoziţia conform revendicării 12, cuprinzând în plus un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia împotriva unui agent patogen respirator selectat dintre gripă, citomegalovirus uman (hCMV), metapneumovirus uman (hMPV), parainfluenza umană (hPIV), rinovirus uman (hRV), pneumonia cu micoplasma, streptococcus pneumoniae, adenovirus, bocavirus, enterovirus, norovirus sau virus BK
14. Compoziţia conform revendicării 13, în care agentul patogen respirator este gripa, hCMV, hMPV, hPIV, norovirus sau virusul BK
15. Compoziţie imunogenă cuprinzând anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform oricăreia dintre revendicările 1-9 şi un antigen selectat dintre proteina F RSV şi proteina G RSV şi fragmente ale acestora.
16. Metodă pentru detectarea prezenţei unei proteine F pre-fuziune RSV uman sau a unui fragment al acesteia într-o probă, cuprinzând contactarea probei cu un anticorp sau fragment de legare la antigen conform oricăreia dintre revendicările 1-9 şi detectarea prezenţei unui complex între anticorpul sau fragmentul de legare la antigen şi peptidă; în care detectarea complexului indică prezenţa proteinei F pre-fuziune RSV.
17. Anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform revendicărilor 1-9 sau compoziţia conform oricăreia dintre revendicările 12-15 pentru utilizare în prevenirea sau tratarea unei infecţii cu RSV.
18. Anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform revendicărilor 1-9 sau compoziţia conform oricăreia dintre revendicările 12-15 pentru utilizare în terapie.
19. Combinaţie cuprinzând anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 9 şi un alt agent profilactic sau terapeutic pentru utilizare în prevenirea sau tratarea infecţiei cu RSV uman.
20. Anticorpul sau fragmentul de legare la antigen conform revendicărilor 1-9 sau compoziţia conform oricăreia dintre revendicările 12-15 pentru utilizare în prevenirea sau tratarea bolii RSV, în care boala RSV este pneumonia şi bronşiolita.
21. Celulă gazdă cuprinzând anticorpul, fragmentul de legare la antigen, acidul nucleic sau vectorul de expresie conform oricăreia dintre revendicările 1-11.
22. Metodă de producere a unui anticorp sau fragment de legare la antigen, cuprinzând: a) cultivarea unei celule gazdă cuprinzând anticorpul, fragmentul de legare la antigen, acidul nucleic sau vectorul de expresie conform oricăreia dintre revendicările 1-11 în condiţii favorabile exprimării anticorpului sau fragmentului de legare la antigen; şi b) opţional, recuperarea anticorpului sau a fragmentului de legare la antigen din celula gazdă şi/sau mediul de cultură.
23. Metoda conform revendicării 22, în care celula gazdă este o celulă ovariană de hamster chinezesc (CHO).
MDE20180859T 2015-10-29 2016-10-27 Anticorp neutralizant anti virus sincițial respirator uman MD3368562T2 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562247841P 2015-10-29 2015-10-29
US201662367359P 2016-07-27 2016-07-27
PCT/US2016/058975 WO2017075124A1 (en) 2015-10-29 2016-10-27 Antibody neutralizing human respiratory syncytial virus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3368562T2 true MD3368562T2 (ro) 2026-04-30

Family

ID=57227165

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20180859T MD3368562T2 (ro) 2015-10-29 2016-10-27 Anticorp neutralizant anti virus sincițial respirator uman

Country Status (35)

Country Link
US (9) US9963500B2 (ro)
EP (1) EP3368562B1 (ro)
JP (1) JP6880014B2 (ro)
KR (1) KR102140113B1 (ro)
CN (1) CN108431036B (ro)
AU (3) AU2016344070B2 (ro)
CA (1) CA3001878C (ro)
CL (1) CL2018001141A1 (ro)
CO (1) CO2018004321A2 (ro)
DK (1) DK3368562T3 (ro)
ES (1) ES3063694T3 (ro)
FI (1) FI3368562T3 (ro)
GE (2) GEP20217260B (ro)
HK (1) HK1254950A1 (ro)
HR (1) HRP20260070T1 (ro)
IL (1) IL258743B2 (ro)
JO (2) JO3555B1 (ro)
LT (1) LT3368562T (ro)
MA (1) MA43108B1 (ro)
MD (1) MD3368562T2 (ro)
MX (1) MX389274B (ro)
MY (1) MY192714A (ro)
NI (1) NI201800052A (ro)
PE (1) PE20181270A1 (ro)
PH (1) PH12018500916A1 (ro)
PT (1) PT3368562T (ro)
RS (1) RS67707B1 (ro)
SG (2) SG11201803524UA (ro)
SI (1) SI3368562T1 (ro)
SV (1) SV2018005678A (ro)
TN (1) TN2018000134A1 (ro)
TW (1) TWI743057B (ro)
UA (1) UA127516C2 (ro)
WO (1) WO2017075124A1 (ro)
ZA (1) ZA201802369B (ro)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA117466C2 (uk) 2012-12-13 2018-08-10 Мерк Шарп Енд Доме Корп. СТАБІЛЬНИЙ СКЛАД У ВИГЛЯДІ РОЗЧИНУ АНТИТІЛА ДО IL-23p19
EP3368092B9 (en) 2015-10-29 2020-07-29 Novartis AG Antibody conjugates comprising toll-like receptor agonist
TWI761453B (zh) 2017-03-01 2022-04-21 英商梅迪繆思有限公司 抗rsv單株抗體配製物
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
JP7382232B2 (ja) 2017-05-02 2023-11-16 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー 抗ｌａｇ３抗体の製剤および抗ｌａｇ３抗体と抗ｐｄ－１抗体との共製剤
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
AU2018346978B2 (en) * 2017-10-13 2024-02-15 Mapp Biopharmaceutical, Inc. Anti-respiratory syncytial virus antibodies, methods of their generation and use
BR112020015308A8 (pt) 2018-01-29 2023-02-07 Merck Sharp & Dohme Proteínas f de rsv estabilizadas e usos das mesmas
WO2019165019A1 (en) * 2018-02-21 2019-08-29 Vanderbilt University Antibodies to human respiratory syncytial virus protein f pre-fusion conformation and methods of use therefor
EP3833677A4 (en) 2018-08-08 2022-04-27 Trellis Bioscience, Inc. IMPROVED RSV PASSIVE AND ACTIVE VACCINES
WO2020081408A1 (en) * 2018-10-18 2020-04-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Formulations of anti-rsv antibodies and methods of use thereof
MX2021004928A (es) 2018-10-31 2021-06-08 Merck Sharp & Dohme Llc Cristales de anticuerpo anti-pd-1 humano y metodos de uso de los mismos.
EP3876990A4 (en) 2018-11-07 2023-09-06 Merck Sharp & Dohme LLC CO-FORMULATIONS OF ANTI-LAG3 ANTIBODIES AND ANTI-PD-1 ANTIBODIES
WO2020124846A1 (zh) * 2018-12-18 2020-06-25 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 抗呼吸道合胞病毒的中和抗体及其应用
CN111606993B (zh) * 2019-02-26 2022-06-28 中国科学院上海生命科学研究院 抗呼吸道合胞病毒的全人广谱中和抗体4f1及其应用
KR102467943B1 (ko) * 2020-06-25 2022-11-16 재단법인 목암생명과학연구소 항-rsv 항체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
CN112175073B (zh) * 2020-09-30 2022-08-02 上海市公共卫生临床中心 冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段
EP4265637A4 (en) * 2020-12-18 2025-01-15 Zhuhai Trinomab Pharmaceutical Co., Ltd. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS SPECIFIC BINDING MOLECULE
CN117136197A (zh) * 2021-02-09 2023-11-28 胡默波斯生物医学公司 抗呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒和小鼠肺炎病毒的抗体和其使用方法
CN115466326B (zh) * 2021-06-11 2024-06-04 中国科学院微生物研究所 一种呼吸道合胞病毒的人源单克隆抗体及其应用
WO2022268120A1 (en) * 2021-06-22 2022-12-29 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-rsv antibodies and uses thereof
US20250026815A1 (en) * 2021-08-25 2025-01-23 Gan & Lee Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-rsv antibody and application thereof
EP4446339A4 (en) * 2021-12-06 2026-01-14 Univ Xiamen ANTIBODIES TO RECOGNIZE A PRE-F PROTEIN OF RSV AND ITS USAGE
CN119264248A (zh) * 2022-07-22 2025-01-07 北京智仁美博生物科技有限公司 抗呼吸道合胞病毒中和性抗体及其用途
WO2024067151A1 (zh) * 2022-09-27 2024-04-04 深圳重链生物科技有限公司 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用
EP4588936A1 (en) * 2022-12-08 2025-07-23 Changchun Bcht Biotechnology Co. Antibodies specifically binding to rsv
CN119504985B (zh) * 2023-08-24 2025-11-18 菲鹏生物股份有限公司 一种抗呼吸道合胞病毒抗体及其应用
CN117720650B (zh) * 2024-02-04 2024-07-02 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 抗人呼吸道合胞病毒抗体及其应用

Family Cites Families (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
EP0216846B2 (en) 1985-04-01 1995-04-26 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
WO1990006952A1 (fr) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Facteur de stimulation de colonies de granulocytes modifies chimiquement
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
ATE207080T1 (de) 1991-11-25 2001-11-15 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US5824307A (en) 1991-12-23 1998-10-20 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
GB9207479D0 (en) 1992-04-06 1992-05-20 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of respiratory syncytial virus infection in animals and man
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE69332643T2 (de) 1992-09-16 2003-11-27 The Scripps Research Institute, La Jolla Menschliche, neutralisierende, monoklonale antikörper gegen das respiratorische synzytialvirus
US6685942B1 (en) 1993-12-10 2004-02-03 The Scripps Research Institute Human neutralizing monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5532210A (en) 1994-06-08 1996-07-02 E. I. Du Pont De Nemours And Company High temperature superconductor dielectric slow wave structures for accelerators and traveling wave tubes
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
DE69609188T2 (de) 1995-09-18 2000-12-21 Intracel Corp., Issaquah Neutralisierende monoklonale antikörper gegen respiratorischen synzytialvirus
EP0977590A4 (en) 1996-11-01 2001-03-14 Smithkline Beecham Corp HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES
US20020141990A1 (en) 1996-11-01 2002-10-03 Smithkline Beecham Corporation Anti-RSV human monoclonal antibodies
US5842307A (en) 1996-11-15 1998-12-01 May; Kenzel Self-adjusting, automatic spot weed sprayer
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9818110D0 (en) 1998-08-19 1998-10-14 Weston Medical Ltd Needleless injectors and other devices
US6096002A (en) 1998-11-18 2000-08-01 Bioject, Inc. NGAS powered self-resetting needle-less hypodermic jet injection apparatus and method
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
AR030019A1 (es) 1999-05-18 2003-08-13 Smithkline Beecham Corp Anticuerpos monoclonales humanos y fragmentos funcionales del mismo, un procedimiento para su produccion, composiciones farmaceuticas que los comprenden, una molecula aislada de acido nucleico, un plasmido recombinante, una celula hospedante y el uso de dichos anticuerpos para la manufactura de un m
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING A POLYPEPTIDE
US20050175986A1 (en) 2000-05-09 2005-08-11 Smit Kline Beecham Corporation Human monoclonal antibody
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
ES2252261T3 (es) 2000-06-28 2006-05-16 Glycofi, Inc. Metodos para producir glicoproteinas modificadas.
US6374470B1 (en) 2000-10-06 2002-04-23 Milliken & Company Face plate for spun-like textured yarn
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6818216B2 (en) 2000-11-28 2004-11-16 Medimmune, Inc. Anti-RSV antibodies
NZ571596A (en) 2001-08-03 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
AU2003226356A1 (en) 2002-04-12 2003-10-27 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Prevention of brain inflammation as a result of induced autoimmune response
GB2398783A (en) 2003-02-26 2004-09-01 Antonio Lanzavecchia A method for producing immortalised human B memory lymphocytes
US7410483B2 (en) 2003-05-23 2008-08-12 Novare Surgical Systems, Inc. Hand-actuated device for remote manipulation of a grasping tool
US20110142858A1 (en) 2004-06-07 2011-06-16 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Method of Passsive Immunization Against Disease or Disorder Charcterized by Amyloid Aggregation with Diminished Risk of Neuroinflammation
AU2005269759A1 (en) 2004-07-21 2006-02-09 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform
MX2007000998A (es) 2004-07-30 2007-07-11 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos peptido beta-amiloide y procedimientos que usan los mismos.
TW200636064A (en) * 2004-10-28 2006-10-16 Centocor Inc Anti-respiratory syncytial virus antibodies, antigens and uses thereof
WO2006050166A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Medimmune, Inc. Methods of preventing and treating rsv infections and related conditions
JP4976376B2 (ja) 2005-04-08 2012-07-18 メディミューン，エルエルシー 哺乳動物メタニューモウイルスに対する抗体
EP1997830A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
BR122017025062B8 (pt) 2007-06-18 2021-07-27 Merck Sharp & Dohme anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo para o receptor de morte programada humano pd-1, polinucleotídeo e composição compreendendo o referido anticorpo ou fragmento
WO2009042589A1 (en) 2007-09-24 2009-04-02 Vanderbilt University Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus and uses thereof
SG10202112838YA (en) 2008-04-09 2021-12-30 Genentech Inc Novel compositions and methods for the treatment of immune related diseases
JP5762408B2 (ja) 2009-08-13 2015-08-12 クルセル ホランド ベー ヴェー ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｒｓｖ）に対する抗体および使用方法
US8568726B2 (en) 2009-10-06 2013-10-29 Medimmune Limited RSV specific binding molecule
EP2486053B1 (en) * 2009-10-06 2017-01-18 Medimmune Limited Rsv-specific binding molecule
BR112012031638B1 (pt) 2010-07-09 2021-01-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. anticorpo anti-rsv ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, anticorpo multivalente, composição farmacêutica, uso de anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, método de detectar infecção por rsv, e, ácido nucleico isolado
US20140141037A1 (en) 2012-11-20 2014-05-22 Novartis Ag Rsv f prefusion trimers
EP2922570A1 (en) 2012-11-20 2015-09-30 GlaxoSmithKline Biologicals SA Rsv f prefusion trimers
HK1210964A1 (en) 2012-12-04 2016-05-13 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Immunotherapy with binding agents
CA2900110A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Medimmune, Llc Respiratory syncytial virus f protein epitopes
TWI659968B (zh) 2013-03-14 2019-05-21 再生元醫藥公司 針對呼吸道融合病毒ｆ蛋白質的人類抗體及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
CO2018004321A2 (es) 2018-11-22
MX389274B (es) 2025-03-20
LT3368562T (lt) 2026-02-10
KR102140113B1 (ko) 2020-07-31
WO2017075124A1 (en) 2017-05-04
ZA201802369B (en) 2019-01-30
NZ741503A (en) 2025-06-27
CL2018001141A1 (es) 2018-10-12
GEP20217260B (en) 2021-05-25
PH12018500916A1 (en) 2018-11-05
MA43108B1 (fr) 2026-01-30
US20180215808A1 (en) 2018-08-02
US20240247052A1 (en) 2024-07-25
AU2022202475A1 (en) 2022-05-05
TW201722991A (zh) 2017-07-01
SG10201809694PA (en) 2018-12-28
HK1254950A1 (zh) 2019-08-02
CN108431036B (zh) 2022-06-14
US10323079B2 (en) 2019-06-18
JP2019503648A (ja) 2019-02-14
MY192714A (en) 2022-09-05
US11008380B2 (en) 2021-05-18
CA3001878C (en) 2023-02-14
BR112018008577A8 (pt) 2023-02-07
US20180215809A1 (en) 2018-08-02
BR112018008577A2 (en) 2018-10-30
US20250388654A1 (en) 2025-12-25
IL258743B (en) 2022-11-01
KR20180069056A (ko) 2018-06-22
TWI743057B (zh) 2021-10-21
JOP20200091A1 (ar) 2022-10-30
US20230212269A1 (en) 2023-07-06
US10072072B2 (en) 2018-09-11
NI201800052A (es) 2018-07-24
US9963500B2 (en) 2018-05-08
MA43108A (fr) 2018-09-05
US11566065B2 (en) 2023-01-31
CA3001878A1 (en) 2017-05-04
DK3368562T3 (da) 2026-02-09
GEAP202114794A (en) 2021-02-10
AU2020200729A1 (en) 2020-02-20
AU2016344070A1 (en) 2018-05-10
JO3555B1 (ar) 2020-07-05
IL258743A (en) 2018-06-28
EP3368562B1 (en) 2025-12-17
SV2018005678A (es) 2018-12-14
PT3368562T (pt) 2026-02-18
EP3368562A1 (en) 2018-09-05
PE20181270A1 (es) 2018-08-03
SG11201803524UA (en) 2018-05-30
US11981726B2 (en) 2024-05-14
US20180215810A1 (en) 2018-08-02
IL258743B2 (en) 2023-03-01
ES3063694T3 (en) 2026-04-20
JP6880014B2 (ja) 2021-06-02
US20170121394A1 (en) 2017-05-04
CN108431036A (zh) 2018-08-21
RS67707B1 (sr) 2026-02-27
US20200002407A1 (en) 2020-01-02
HRP20260070T1 (hr) 2026-03-13
TN2018000134A1 (en) 2019-10-04
US20210188951A1 (en) 2021-06-24
UA127516C2 (uk) 2023-09-20
US12371478B2 (en) 2025-07-29
FI3368562T3 (fi) 2026-02-09
AU2016344070B2 (en) 2019-11-07
US10358480B2 (en) 2019-07-23
SI3368562T1 (sl) 2026-03-31
MX2018005047A (es) 2018-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12371478B2 (en) Antibody neutralizing human respiratory syncytial virus
US20220389114A1 (en) Pd-l1 antibodies binding canine pd-l1
CA2932515C (en) Caninized antibodies
KR20210057752A (ko) 항-cd38 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 제약 용도
BR112018008577B1 (pt) Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à proteína f do rsv humano, polipeptídeo isolado, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, composição, composição imunogênica, métodos de produção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e para detectar a presença de uma proteína f pré-fusão do rsv humano ou um fragmento da mesma e uso
EA039222B1 (ru) Антитело, нейтрализующее респираторно-синцитиальный вирус человека