RS67711B1 - Anti‑btn3a antitela i njihova upotreba u lečenju kancera ili infektivnih poremećaja - Google Patents

Description

[0001] <Opis>

[0003] <U daljem tekstu su opisana anti-BTN3A aktivirajuća antitela koja se specifično vezuju za BTN3A i aktiviraju citolitičku funkciju Vγ9/Vδ2 T ćelija. Takva antitela su korisna posebno u lečenju>kancerogenih poremećaja, kao što su kancer krvi ili čvrsti tumori. Pronalazak se konkretnije odnosi na specifična humanizovana anti-BTN3A aktivirajuća antitela, sa ekvivalentnim ili poboljšanim svojstvima u poređenju sa odgovarajućim roditeljskim mišjim antitelima 7.2, ili njihovim himernim verzijama sa Fc-utišanim konstantnim regijama ljudskog IgG1 ili IgG4.

[0005] <Pozadina pronalaska>

[0007] Bela krvna zrnca su ćelije imunog sistema koje učestvuju u odbrani tela od patogena. Među ovim<ćelijama mogu se navesti limfociti, monociti i dendritične ćelije. Monociti mogu migrirati iz krvotoka u druga tkiva i diferencirati se u makrofage koji žive u tkivu ili dendritične ćelije.>

[0008] <Dendritske ćelije igraju ulogu antigen prezentujućih ćelija (APC) koje aktiviraju limfocite. Među>limfocitima, T ćelije se mogu podeliti na αβ T ćelije i γδ T ćelije. Vγ9 Vδ2, podskup γδ T ćelija, važni su efektori imunog odbrambenog sistema. One direktno liziraju ćelije zaražene patogenima ili abnormalne ćelije. Pored toga, regulišu imune odgovore indukovanjem sazrevanja dendritskih<ćelija (DC), kao i prebacivanjem izotipa i proizvodnjom imunoglobulina. Ovaj važan podskup ćelija imunog sistema je strogo regulisan površinskim receptorima, hemokinima i citokinima.>

[0010] <Prajmiranje T-ćelija je modulirano učešćem specijalizovanih ćelija i lučenjem hemotaktičkih>citokina. Hipoteza o dva signala pretpostavlja da je aktivacija T-ćelija rezultat dva sinergistička<događaja. Prvi je interakcija između T-ćelijskih receptora (TCR) i glavnog kompleksa>histokompatibilnosti (MHC) u kompleksu sa obrađenim antigenom na površini ćelija koje<prezentuju antigen (APC). Drugi događaj je kostimulatorni signal nezavisan od antigena koji>uključuje molekule CD28 i B7. Nedostatak kostimulatornih signala indukuje anergiju i neodziv, što

rezultira odsustvom proliferacije T-ćelija, lučenja citokina i citotoksičnih aktivnosti. Proučavanje<ovih puteva pruža uvid u pokretanje patoloških događaja, kao što su autoimuni ili limfoproliferativni poremećaji. Porodica B7 je proširena grupa kostimulatornih molekula (Coyle>and Gutierrez-Ramos, 2001; Sharpe and Freeman, 2002). Porodici B7 pripadaju ligandi B7-1<(CD80) i B7-2 (CD86): njihovi receptori su CD28, koji dovodi do aktivacije T ćelija, i CTLA-4 (CD152), koji se takmiči sa CD28 i prenosi inhibitorni signal (pregledano u Alegre et al., 2001).>Kritična uloga CD152 kao negativnog regulatora aktivacije T ćelija demonstrirana je pojavom limfoproliferativnih poremećaja kod miševa sa nedostatkom CTLA-4. Važni nalazi o inhibitornoj funkciji koju vrši CD152 potiču iz studija proliferacije ili proizvodnje citokina od strane naivnih T limfocita tokom prajminga T ćelija. Konkretno, CD152 se ekspresuje nakon aktivacije T-limfocita i<inhibira citolitičke funkcije CTL klonova dobijenih nakon PHA stimulacije ili Ag selekcije. B7-H1 (PD-L1, CD274) i B7-DC (PD-L2, CD273), čiji je receptor PD-1 (CD279), pokazali su da inhibiraju proliferaciju T ćelija i lučenje citokina (pregledano u Sharpe and Pauken, 2018). Inače, različite studije su pokazale da angažovanje PD-L1 i PD-L2 povećava proliferaciju T ćelija i proizvodnju>IL-10 ili IFN-γ. Drugi molekuli povezani sa porodicom B7 koji se eksprimiraju na površini T ćelija,<uključujući B7-H2 (ICOS-L), novije identifikovane B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 i B7-H7 takođe su implicirane kao kontrolni regulatori imune funkcije (pregledano u Ni i Dong, 2017).>

[0011] <Henry et al. (1999) su otkrili da se region koji kodira butirofilin (BT) nalazi na telomernoj poziciji u>odnosu na MHC region I klase na ljudskom hromozomu 6. Posebno su opisali dva gena Bt2 i Bt3,<koji kodiraju novu grupu kostimulatornih molekula (BT2.1, BT2.2, BT2.3, BT3.1, BT3.2 i BT3.3) koji pripadaju Ig superfamiliji (IgSF) (Linsley et al., 1992; Williams and Barclay, 1988), i povezani su sa B7 familijom analizom sličnosti sekvenci: posebno, pokazuju sličnost sa Ig-V sličnim ekstracelularnim domenima CD80 i CD86.>

[0012] <Članovi porodice BT3 pojavljuju se u literaturi pod različitim imenima: BT3.1 se takođe naziva BTF5 (Ruddy et al., 1997), ili BTN3A1 (Rhodes et al., 2001), ili u skorije vreme CD277 (Bensussan and Olive, 2005); BT3.2 se takođe naziva BTF4 (Ruddy et al., 1997), ili BTN3A2; i, konačno, BT3.3 se pojavljuje i kao BTF3 (Ruddy et al., 1997) ili BTN3A3 (Rhodes et al., 2001). BT3 ima dva ekstracelularna domena slična Ig koji karakterišu IgSF.>

[0013] <Pretpostavljeno je da geni B7 i geni MHC klase I i II mogu imati zajednički pretkovski gen i kodirati proteine uključene u sličnu funkciju, kao što je aktivacija T-ćelija (Rhodes et al., 2001). Molekuli>BT3 su pronađeni na imunim ćelijama, kao što su T, B i NK ćelije, monociti i dendritične ćelije, kao i hematopoetski prekursori i neke neoplastične ćelijske linije. Što se tiče drugih kostimulatornih molekula, njihovu strukturu karakterišu tri domena: ekstracelularni domen za vezivanje liganda, transmembranski domen i intracelularni domen nazvan B30.2, koji je verovatno uključen u regulaciju intracelularnih koncentracija superoksida. Do sada, ligand(i) CD277 još uvek nisu poznati (pregledano u Gu et al., 2015).

[0014] <Do danas su predložene različite terapijske i vakcinske strategije koje se oslanjaju na modulaciju T>ćelija; nekoliko imunomodulatornih antitela na CTLA-4, PD-1 i PD-L1 već je odobreno za kliničku

upotrebu od strane više regulatornih agencija širom sveta. Iako ovi lekovi predstavljaju veliki<napredak u terapiji kancera, i dalje postoje nezadovoljene medicinske potrebe za veliki deo populacije pacijenata obolelih od kancera koji ne reaguju na trenutno dostupne tretmane.>

[0015] <Patenti WO 2012080351 A1, US2015/353643A1, EP2651441A1, EP2946791A1, US20140322235, WO2012080769A1 odnose se na različita antitela protiv BTN3A koja mogu da aktiviraju ili inhibiraju citolitičku funkciju, proizvodnju citokina i proliferaciju Vy9 Vδ2 T ćelija. Međutim, ova mišja antitela nisu bila pogodna za terapijsku primenu. Zaista, za primenu kod ljudskih pacijenata, danas je obavezno humanizovati antitela kako bi se izbegle imunogene reakcije.>

[0017] <Humanizacija često zahteva modifikovanje aminokiselina u okvirnim regionima bez sigurnosti održavanja potencije na istom nivou kao originalna mišja antitela. Ovo je posebno tačno kada se modifikuju aminokiseline neposredno pored CDR regiona (videti npr. Queen patent US5,585,089).>

[0018] <Uprkos teškoćama, pronalazači su sada odabrali specijalna humanizovana antitela aktivirajućih mAbs 7.2, koja ne samo da kombinuju očuvana funkcionalna svojstva roditeljskih antitela mAbs 7.2 sa predviđenom smanjenom imunogenošću za ljude, već i iznenađujuće pokazuju superiorna svojstva razvoja, kao što su poboljšani prinos u proizvodnji ćelijskih linija, veća termička stabilnost u poređenju sa roditeljskim mišjim antitelom i jaka otpornost na kiselinski i toplotni stres. Pored toga, humanizovano antitelo mAb1 ovog pronalaska se povoljno vezuje za BTN3A kod cynomolgus primata i dobro se toleriše do doza od 100 mg/kg/nedeljno kod cynomolgus primata, čime predstavlja odličnog kandidata za upotrebu kao lek u humanim terapijama.>

[0020] <Rezime pronalaska>

[0022] Ovaj pronalazak se tako odnosi na izolovano anti-BTN3A antitelo koje sadrži varijabilni polipeptid<teškog lanca VH sa SEQ ID NO:1 i varijabilni polipeptid lakog lanca VL sa SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:3. Takva antitela su humanizovana antitela, posebno sa predviđenom smanjenom>imunogenošću u odnosu na njihovo roditeljsko mišje antitelo. Takvo izolovano anti-BTN3A antitelo se vezuje za ljudski BTN3A. Konkretno, vezuje se za ljudski BTN3A sa KD od 10 nM ili manje,<poželjno sa KD od 5 nM ili manje, mereno površinskom plazmonskom rezonancom.>

[0024] <U specifičnim izvođenjima, navedeno antitelo prema ovom pronalasku indukuje aktivaciju γδ-T>ćelija, tipično Vγ9Vδ2 T ćelija, u ko-kulturi sa ćelijama koje ekspresuju BTN3, sa EC50 ispod 5 µg/ml, poželjno od 1 µg/ml ili manje, mereno u testu degranulacije. Shodno tome, navedeno antitelo indukuje ubijanje ciljnih ćelija tumora nezavisno od njihovog tkivnog porekla.

[0026] <U specifičnim izvođenjima, navedeno izolovano anti-BTN3A antitelo sadrži mutantni ili hemijski modifikovani konstantni region IgG1, pri čemu navedeni mutantni ili hemijski modifikovani konstantni region IgG1 ne daje nikakvo ili smanjeno vezivanje za Fcγ receptore u poređenju sa>odgovarajućim antitelom sa konstantnim regionom izotipa divljeg tipa IgG1. Tipično, navedeni mutantni konstantni region IgG1 je trostruki mutant IgG1 L247F L248E i P350S. Primeri navedenog izolovanog anti-BTN3A antitela su mAb1 koji sadrži teški lanac SEQ ID NO:4 i laki lanac SEQ ID NO:6, ili mAb2 koji sadrži teški lanac SEQ ID NO:4 i laki lanac SEQ ID NO:7.

[0028] <U drugim izvođenjima, navedeno izolovano anti-BTN3A antitelo ovog pronalaska je antitelo monovalentnog formata, poželjno odabrano iz Fab ili scFv antitela.>

[0030] <Izolovano anti-BTN3A antitelo ovog pronalaska može se koristiti (i) kao terapeutsko ili (ii) kao>dijagnostičko sredstvo. Na primer, korisni su u lečenju kancera, na primer hematološkog kancera, a<posebno limfoma ili leukemije. U drugim izvođenjima, mogu se koristiti i u lečenju solidnih tumora, a posebno kancera prostate, jajnika ili endometrijuma. Alternativno, mogu se koristiti u lečenju>infektivnih poremećaja.

[0031] <Opis se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-BTN3A antitelo kao što je gore opisano, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, razblaživača ili>nosača, opciono koji sadrže i druge aktivne sastojke.

[0032] Još jedan aspekt ovog pronalaska odnosi se na formulaciju liofilizata, prethodno napunjen špric ili<bočicu koja sadrži anti-BTN3A antitelo kao što je gore opisano.>

[0033] Opis se dalje odnosi na vektor ekspresije za rekombinantnu proizvodnju anti-BTN3A antitela kao<što je gore opisano u ćeliji domaćina, tipično ćeliji domaćina sisara, kao što je CHO ćelija domaćina, koja sadrži najmanje jednu nukleinsku kiselinu koja kodira pomenuto anti-BTN3A antitelo. Jedno>izvođenje takvog vektora ekspresije sadrži najmanje nukleinske kiseline koje kodiraju teške i lake lance mAb1 kao što je ovde opisano. Ćelija domaćin koja sadrži takve vektore ekspresije takođe je ovde opisana.

[0034] <Ovde je takođe opisan postupak za proizvodnju anti-BTN3A antitela ovog pronalaska, koji obuhvata: (i) kultivaciju ćelije domaćina kao što je gore definisano za ekspresiju pomenutog>antitela od strane ćelije domaćina; opciono (ii) prečišćavanje pomenutog antitela; (iii) regenerisanje antitela.

[0035] <Ovaj opis se dalje odnosi na multispecifična antitela, kao što su bispecifična antitela, koja sadrže najmanje jedan krak koji sadrži Fab ili scFv, uključujući VH i VL anti-BTN3A antitela kao što je gore definisano.>

[0036] <Detaljan opis pronalaska>

[0037] <Definicije>

[0038] <Radi lakšeg razumevanja ovog pronalaska, prvo su definisani određeni izrazi. Dodatne definicije su navedene u detaljnom opisu.>

[0039] <Kako se ovde koristi, izraz „BTN3A“ ima svoje opšte značenje u struci. U specifičnim izvođenjima, odnosi se na humane BTN3A polipeptide, uključujući ili BTN3A1 sa SEQ ID NO:18, BTN3A2 sa SEQ ID NO:19 ili BTN3A3 sa SEQ ID NO:20.>

[0040] <Izraz „antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, tj. molekule koji sadrže mesto vezivanja antigena koje>imunospecifično vezuje antigen. Kao takav, termin antitelo obuhvata ne samo cele molekule antitela, već i fragmente antitela, kao i varijante (uključujući derivate) antitela.

[0041] Kod prirodnih antitela glodara i primata, dva teška lanca su međusobno povezana disulfidnim<vezama, a svaki teški lanac je povezan sa lakim lancem disulfidnom vezom. Postoje dve vrste lakih lanaca, lambda (λ) i kappa (κ). Postoji pet glavnih klasa teških lanaca (orizotipova) koji određuju>funkcionalnu aktivnost molekula antitela: IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. Svaki lanac sadrži različite sekvencijalne domene. Kod tipičnih IgG antitela, laki lanac uključuje dva domena, varijabilni domen (VL) i konstantni domen (CL). Teški lanac uključuje četiri domena, varijabilni domen (VH) i tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3, zajednički nazvani CH). Varijabilni regioni i lakih (VL) i teških (VH) lanaca određuju prepoznavanje vezivanja i specifičnost za antigen. Domeni konstantnih regiona lakih (CL) i teških (CH) lanaca daju važna biološka svojstva kao što su povezivanje lanaca<antitela, sekrecija, transplacentalna mobilnost, vezivanje komplementa i vezivanje za Fc receptore (FcR).>

[0043] <Fv fragment je N-terminalni deo Fab fragmenta imunoglobulina i sastoji se od varijabilnih delova jednog lakog lanca i jednog teškog lanca. Specifičnost antitela leži u strukturnoj komplementarnosti>između mesta kombinovanja antitela i antigenske determinante. Mesta kombinovanja antitela

sastoje se od ostataka koji su prvenstveno iz hipervarijabilnih ili regiona koji određuju<komplementarnost (CDRs). Povremeno, ostaci iz nehipervarijabilnih ili okvirnih regiona (FR) mogu>učestvovati u mestu vezivanja antitela ili uticati na ukupnu strukturu domena, a samim tim i na mesto kombinovanja. Regioni koji određuju komplementarnost ili CDRs odnose se na aminokiselinske sekvence koje zajedno definišu afinitet vezivanja i specifičnost prirodnog Fv regiona nativnog mesta vezivanja imunoglobulina. Laki i teški lanci imunoglobulina imaju po tri CDRs, označena kao L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 i H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respektivno. Mesto vezivanja antigena, stoga, tipično uključuje šest CDRs, koji obuhvataju skup CDRs iz svakog od teškog i lakog lanca V regiona. Okvirni regioni (FRs) odnose se na aminokiselinske sekvence smeštene između CDRs. Shodno tome, varijabilni regioni lakih i teških lanaca obično obuhvataju 4 okvirna regiona i 3 CDRs sledeće sekvence: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

[0045] <Ostaci u varijabilnim domenima antitela su konvencionalno numerisani prema sistemu koji su osmislili Kabat et al. Ovaj sistem je naveden u Kabat et al., 1987, u Sequences of Proteins of Immunological Interest, Ministarstvo zdravlja i socijalnih službi SAD, NIH, SAD (Kabat i dr., 1992, u daljem tekstu „Kabat et al“). Ovaj sistem numeracije se koristi u ovoj specifikaciji. Oznake Kabatovih>ostataka ne odgovaraju uvek direktno linearnom numerisanju aminokiselinskih ostataka u SEQ ID sekvencama. Stvarna linearna sekvenca aminokiselina može da sadrži manje ili više aminokiselina nego u strogoj Kabat numeraciji, što odgovara skraćivanju ili umetanju u strukturnu komponentu, bilo da je u pitanju okvir ili region koji određuje komplementarnost (CDR), osnovne strukture varijabilnog domena. Ispravna Kabat numeracija ostataka može se odrediti za dato antitelo poravnanjem ostataka homologije u sekvenci antitela sa „standardnom“ Kabat numerisanom sekvencom. CDRs varijabilnog domena teškog lanca nalaze se na ostacima 31-35 (H-CDR1), ostacima 50-65 (H-CDR2) i ostacima 95-102 (H-CDR3) prema Kabat sistemu numeracije. CDRs varijabilnog domena lakog lanca nalaze se na ostacima 24-34 (L-CDR1), ostacima 50-56 (L-CDR2) i ostacima 89-97 (L-CDR3) prema Kabat sistemu numeracije.

[0047] <U specifičnim izvođenjima, antitelo koje je ovde dato je fragment antitela, a posebno bilo koji protein koji uključuje domen koji vezuje antigen antitela kako je ovde opisano. Fragmenti antitela>uključuju, ali nisu ograničeni na, Fv, Fab, F(ab’)2, Fab’, dsFv, scFv, sc(Fv)2 i diatela.

[0049] Kako se ovde koristi, izraz „specifičnost“ se odnosi na sposobnost antitela da se detektovano veže za<epitop predstavljen na antigenu, kao što je BTN3A. U nekim ostvarenjima, namera je da se odnosi na antitelo koje se vezuje za humani BTN3A kako je ekspresovan na ćelijama periferne krvne srži>(PBMC), poželjno sa EC50 ispod 50 µg/ml i poželjnije ispod 10µg/ml kao što je određeno u primerima (videti Tabelu 4). U drugim izvođenjima, vezuje se za antigenski rekombinantni polipeptid sa KD od 100nM ili manje, 10nM ili manje, 1nM ili manje, 100pM ili manje, ili 10pM ili manje, mereno SPR merenjima kao što je određeno u Primerima (videti Tabelu 4).

[0050] <Antitelo koje „unakrsno reaguje sa antigenom koji nije BTN3A“ odnosi se na antitelo koje vezuje taj antigen koji nije BTN3A sa KD od 10nM ili manje, 1 nM ili manje, ili 100 pM ili manje. Antitelo koje „ne unakrsno reaguje sa određenim antigenom“ odnosi se na antitelo koje se vezuje za taj antigen, sa KD od 100 nM ili više, ili KD od 1µM ili više, ili KD od 10µM ili više. U određenim izvođenjima, takva antitela koja ne unakrsno reaguju sa antigenom pokazuju suštinski nedetektabilno vezivanje protiv ovih proteina u standardnim testovima vezivanja. U specifičnom izvođenju, humanizovano antitelo ovog pronalaska, npr. mAb1, unakrsno reaguje sa BTN3A1, BTN3A2 i BTN3A3 kod cynomolgusa sa SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 i SEQ ID NO:23 respektivno, na primer, mereno u>Biacore testu (videti Tabelu 21).

[0051] <„Izolovano antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje je u suštini slobodno od drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje se specifično vezuje za BTN3A je u suštini slobodno od antitela koja se specifično vezuju za druge antigene osim BTN3A). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za BTN3A može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima, kao što su srodni molekuli BTN3A iz drugih vrsta. Štaviše, izolovano antitelo može biti u suštini slobodno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. Izraz „monoklonalno antitelo“ ili „kompozicija monoklonalnog antitela“, kako se ovde koristi, odnosi se na pripremu molekula antitela jedne molekularne kompozicije. Kompozicija monoklonalnog antitela pokazuje jedinstvenu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Izrazi „antitelo koje prepoznaje antigen“ i „antitelo koje ima specifičnost za antigen“ se ovde koriste>naizmenično sa izrazom „antitelo koje se specifično vezuje za antigen“.

[0052] <Izraz „Kassoc“ ili „Ka“, kako se ovde koristi, odnosi se na brzinu asocijacije određene interakcije antitelo-antigen, dok se izraz „Kdis“ ili „Kd“, kako se ovde koristi, odnosi na brzinu disocijacije>određene interakcije antitelo-antigen.

[0053] <Izraz „K>D<“, kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu disocijacije, koja se dobija iz odnosa K>d<i K>a (tj. Kd/Ka) i izražava se kao molarna koncentracija (M). KD vrednosti za antitela mogu se odrediti<korišćenjem metoda dobro utvrđenih u struci. Metod za određivanje KD antitela je korišćenje>površinske plazmonske rezonance ili korišćenje biosenzorskog sistema kao što je Biacore® sistem.<Specifičnost se dalje može pokazati, npr., odnosom afiniteta/avidnosti od oko 10:1, oko 20:1, oko 50:1, oko 100:1, 10.000:1 ili većim u vezivanju za specifični antigen u odnosu na nespecifično vezivanje za druge irelevantne molekule (u ovom slučaju specifični antigen je BTN3A polipeptid).>Izraz „afinitet“, kako se ovde koristi, označava jačinu vezivanja antitela za epitop.

[0054] <Kako se ovde koristi, izraz „Avidnost“ odnosi se na informativnu meru ukupne stabilnosti ili snage kompleksa antitelo-antigen. Kontrolišu ga tri glavna faktora: afinitet epitopa antitela; valenca i antigena i antitela; i strukturni raspored delova koji interaguju. Na kraju krajeva, ovi faktori>definišu specifičnost antitela, odnosno verovatnoću da se određeno antitelo vezuje za precizni antigenski epitop.

[0055] <Kako se ovde koristi, izraz „aktivirajuće antitelo“ odnosi se na antitelo koje je sposobno da direktno>ili indirektno indukuje imune funkcije efektorskih ćelija. Konkretno, kako se ovde koristi,

aktivirajuće anti-BTN3A antitelo ima barem kapacitet da indukuje aktivaciju γδ T ćelija, tipično<Vγ9Vδ2 T ćelija, u ko-kulturi sa ćelijama koje ekspresuju BTN3, sa EC50 ispod 5 µg/ml, poželjno od 1 µg/ml ili niže, mereno u testu degranulacije kao što je opisano u Primerima ispod.>

[0056] <Kako se ovde koristi, izraz „subjekat“ uključuje bilo koju humanu ili ne-humanu životinju. Termin „ne-humana životinja“ obuhvata sve kičmenjake, npr. sisare i nesisare, kao što su ne-humani primati, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, vodozemci, gmizavci itd.>

[0057] <Kako se ovde koristi, izraz „optimizovan“ znači da je nukleotidna sekvenca izmenjena da bi kodirala aminokiselinska sekvenca korišćenjem kodona koji su preferirani u proizvodnoj ćeliji ili organizmu, generalno eukariotskoj ćeliji, na primer, ćeliji jajnika kineskog hrčka (CHO) ili humanoj ćeliji.>

[0058] <Optimizovana nukleotidna sekvenca je konstruisana tako da u potpunosti ili što je više moguće zadrži aminokiselinsku sekvencu koju je prvobitno kodirala početna nukleotidna sekvenca.>

[0059] <Aminokiselinske sekvence kodirane optimizovanim nukleotidnim sekvencama se takođe nazivaju optimizovanim.>

[0060] <Kako se ovde koristi, procenat identiteta između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj. % identiteta = broj identičnih pozicija/ukupan broj pozicija x 100), uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, koje je potrebno uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identiteta između dve sekvence može se izvršiti korišćenjem matematičkog algoritma, kao što je opisano u nastavku.>

[0061] <Procenat identiteta između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti korišćenjem algoritma E. Meyers i W. Millera (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) koji je uključen u ALIGN program (verzija 2.0), koristeći PAM120 tabelu težinskih ostataka, nadoknadu za dužinu praznine od 12 i nadoknadu za prazninu od 4. Alternativno, procenat identiteta između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti korišćenjem algoritma Needleman i Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970) koji je uključen u GAP program u GCG softverskom paketu (dostupnom na http://www.gcg.com), koristeći ili Blossom 62 matricu ili PAM250 matricu, i težinu praznine od 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i težinu dužine od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.>

[0062] <Procenat identiteta između dve nukleotidne aminokiselinske sekvence može se odrediti>korišćenjem, na primer, algoritama kao što je BLASTN program za nukleinske kiselinske sekvence, koristeći podrazumevane vrednosti dužine reči (W) od 11, očekivanja (E) od 10, M=5, N=4 i<poređenje oba lanca.>

[0063] Rekombinantna humanizovana anti-BTN3A aktivirajuća antitela

[0064] <Antitela iz ovog pronalaska uključuju odabrana humanizovana rekombinantna antitela mAb1, mAb2, mAb4 i mAb5, koja su strukturno okarakterisana svojim varijabilnim aminokiselinskim>sekvencama teškog i lakog lanca i humanim konstantnim regionima (izotipovima) kao što je<opisano u Tabeli 1 ispod:>

[0065] Tabela 1: Varijabilne aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca mAb1-mAb6

[0067]

[0069] <Odgovarajuće kodirajuće sekvence aminokiselina i nukleotida konstantnih izotipskih regiona IgG1, IgG4 i njihovih mutantnih verzija IgG1 L247F/L248E/P350S i IgG4 S241 P/L248E koje se koriste za generisanje mAb1 do mAb6 su dobro poznate u struci (Oganesyan et al., 2008; Reddy et al., 2000). C-terminalni lizin koji se nalazi u IgG može se prirodno odvojiti i ova modifikacija ne utiče na>svojstva antitela; tako, ovaj ostatak može dodatno biti uklonjen u konstrukcijama mAb1 do mAb6. Laki i teški lanci pune dužine i odgovarajuće kodirajuće sekvence mAb1, mAb2, mAb4 i mAb 5 prikazane su u Tabeli 2 ispod.

[0070] Tabela 2: Kodirajuće sekvence DNK teškog i lakog lanca pune dužine

[0072]

[0074] <Primeri aminokiselinskih sekvenci VH CDR1ss (takođe nazvanih HCDR1), VH CDR2s (takođe nazvanih HCDR2), VH CDR3s (takođe nazvanih HCDR1), VL CDR1s (takođe nazvanih LCDR1), VL CDR2s (takođe nazvanih LCDR2), VL CDR3s (takođe nazvanih HCDR3) nekih antitela prema ovom pronalasku prikazani su u Tabeli 3.>

[0075] <U Tabeli 3, CDR regioni antitela ovog pronalaska su označeni korišćenjem Kabat numeracije (Kabat et al., 1992, u daljem tekstu „Kabat et al.“).>

[0076] Radi lakšeg čitanja, CDR regioni se u daljem tekstu nazivaju HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2,<LCDR3 respektivno.>

[0077] Tabela 3: CDR regioni mAb1, mAb2, mAb4 i mAb5 i parentalnih mišjih mAb 7.2 antitela prema<Kabat numeraciji>

[0079]

[0081] <U specifičnom izvođenju, navedeno rekombinantno anti-BTN3A antitelo, kako je gore definisano, ima jedno ili više sledećih svojstava:>

[0082] <(i) vezuje se za BTN3A sa aKD od 10 nM ili manje, poželjno sa KD od 1 nM ili manje, mereno sa SPR, na primer kao što je opisano u dole navedenim Primerima;>

[0083] <(ii) unakrsno reaguje sa BTN3A kod cynomolgusa sa KD od 100 nM ili manje, poželjno sa KD od 10 nM ili manje, mereno sa SPR, na primer kao što je opisano u dole navedenim Primerima;>

[0084] <(iii) vezuje se za humane PBMC sa EC50 od 50 µg/ml ili manje, poželjno od 10 µg/ml ili manje, mereno protočnom citometrijom kao što je opisano u dole navedenim Primerima;>

[0085] <(iv) indukuje aktivaciju γδ-T ćelija, tipično Vγ9Vδ2 T ćelija, u ko-kulturi sa ćelijama koje ekspresuju BTN3, sa EC50 ispod 5 µg/ml, poželjno od 1 µg/ml ili manje, mereno u testu degranulacije kao što je>opisano u Primerima ispod.

[0086] <U određenim izvođenjima koja se mogu kombinovati sa prethodnim izvođenjima, antitelo koje je ovde dato je fragment antitela gore definisanih antitela.>

[0087] <Fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, Unibody i scFv fragmente, dijatela, jednodomenska ili nanotela i druge fragmente.>

[0088] <Poželjno je da je to monovalentno antitelo, kao što je Fab scFv fragmenata.>

[0089] <Izraz „dijatela“ odnosi se na male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, koji fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Korišćenjem linkera koji je prekratak da bi>omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su primorani da se upare sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvore dva mesta za vezivanje antigena.

[0090] <Jednodomenska antitela su fragmenti antitela koji sadrže ceo ili deo varijabilnog domena teškog>lanca ili ceo ili deo varijabilnog domena lakog lanca antitela. U određenim izvođenjima,<jednodomensko antitelo je humano jednodomensko antitelo (Domantis, Inc., Waltham, MA; videti,>npr., U.S. Patent br.6,248,516 B1).

[0091] <Fragmenti antitela mogu se napraviti različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na,>proteolitičku digestiju intaktnog antitela, kao i proizvodnju od strane rekombinantnih ćelija<domaćina kao što je ovde opisano.>

[0092] <Antitelo ovog pronalaska je humanizovano antitelo. Tipično, ne-humano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, a da pritom ima barem isti afinitet (ili superiorni afinitet) kao roditeljsko ne-humano antitelo. U preferiranim izvođenjima, antitela ovog pronalaska su humanizovana antitela roditeljskog antitela mAb 7.2 kao što je objavljeno u WO2012/080351. Uporedni primeri uključuju humanizovana antitela roditeljskog antitela mAb 20.1 kao što je>objavljeno u WO2012/080351.

[0093] <Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena u kojima su CDRs (ili njihovi delovi) izvedeni iz ne-humanog antitela, npr. mišja mAb 7.2, a FRs (ili njihovi delovi) su izvedeni iz sekvenci mišjeg antitela sa mutacijama radi smanjenja imunogenosti. Humanizovano antitelo će opciono takođe sadržati barem deo humanog konstantnog regiona.>

[0094] <Poželjno je da rekombinantno antitelo prema ovom pronalasku bude humanizovano utišano,>tipično humanizovano utišano IgG1 ili IgG4 antitelo.

[0095] <Kako se ovde koristi, izraz „utišano“ antitelo se odnosi na antitelo koje ne pokazuje ili pokazuje nisko vezivanje za FcγR i/ili C1q, mereno u testovima vezivanja kao što su oni opisani u Primerima. U jednom izvođenju, izraz „bez ili sa niskim nivoom vezivanja za FcγR i/ili C1q“ znači da utišano antitelo pokazuje vezivanje za FcγR i/ili C1q koje je najmanje ispod 50%, na primer ispod 80% vezivanja za FcγR i/ili C1q koje je primećeno kod odgovarajućeg antitela sa divljim tipom humanog IgG1 ili IgG4 izotipa.>

[0096] <Okvir ili Fc inženjering>

[0097] <Antitela iz ovog pronalaska uključuju modifikacije napravljene na ostacima okvira unutar VH i VL, kako bi se smanjila imunogenost antitela u poređenju sa odgovarajućim mišjim antitelima mAb 7.2.>U jednom specifičnom izvođenju, antitelo iz ovog pronalaska je humanizovano monoklonsko antitelo matičnog mišjeg antitela mAb 7.2, uključujući najmanje sledeće mutacije aminokiselina u VH okvirnim regionima: V5Q; V11L; K12V; R66K; S74F; l75S; E81Q; S82AR; R82BS; R83T; D85E; T87S; L108S; i najmanje sledeće mutacije aminokiselina u Vκ okvirnim regionima: T5N; V15L; R18T; V19I; K42N; A43I; D70G; F73L; Q100G.

[0098] <U drugom specifičnom izvođenju, antitelo prema ovom pronalasku je humanizovano monoklonsko antitelo matičnog mišjeg antitela mAb 7.2, koje uključuje najmanje sledeće mutacije aminokiselina u VH okvirnim regionima u poređenju sa mAb 7.2: V5Q; V11L; K12V; R66K; S74F; I75S; E81Q; S82AR; R82BS; R83T; D85E; T87S; L108S; i najmanje sledeće mutacije aminokiselina u Vκ okvirnim regionima: T5N; V15L; R18T; V19I; K42N; A43I; S63T; D70G; F73L; Q100G.>

[0099] <Pored modifikacija napravljenih unutar okvirnih regiona, antitela prema ovom pronalasku mogu biti konstruisana tako da uključuju modifikacije unutar Fc regiona, obično da bi se promenilo jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela, kao što su poluživot u serumu, fiksacija komplementa, vezivanje za Fc receptor i/ili ćelijska citotoksičnost zavisna od antigena.>

[0100] <Štaviše, antitelo prema ovom pronalasku može biti hemijski modifikovano (npr., jedan ili više hemijskih delova mogu biti vezani za antitelo) ili modifikovano da bi se promenila njegova>glikozilacija, ponovo da bi se promenilo jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela. Svako od ovih izvođenja je detaljnije opisano u nastavku.

[0101] <Kako se ovde koristi, izraz „izotipski konstantni region“ ili „Fc region“ se koristi naizmenično da bi se definisao C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina, uključujući Fc region prirodne sekvence i varijantne Fc regione. Fc region teškog lanca humanog IgG je generalno definisan kao deo koji obuhvata aminokiselinske ostatke od pozicije C226 ili od P230 do karboksil-terminusa IgG antitela, gde je numeracija u skladu sa EU sistemom numeracije. C-terminalni lizin (ostatak K447) Fc regiona može biti uklonjen, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela ili njegov>odgovarajući kodon može biti obrisan u rekombinantnim konstruktima. Shodno tome, kompozicija antitela prema ovom pronalasku može da sadrži populacije antitela sa svim uklonjenim K447 ostacima, populacije antitela bez uklonjenih K447 ostataka i populacije antitela koje imaju mešavinu antitela sa i bez K447 ostatka.

[0102] <U jednom specifičnom izvođenju, zglobni region CH1 je modifikovan tako da se broj cisteinskih ostataka u zglobnom regionu menja, npr. povećava ili smanjuje. Ovaj pristup je dalje opisan u U.S. Patentu br.5,677,425 od strane Bodmera et al. Broj cisteinskih ostataka u zglobnom regionu CH1 je promenjen da bi se, na primer, olakšalo sklapanje lakih i teških lanaca ili povećala ili smanjila stabilnost antitela.>

[0103] <U drugom izvođenju, Fc zglobni region antitela je mutiran da bi se smanjio biološki poluživot antitela. Preciznije, jedna ili više mutacija aminokiselina se uvode u region interfejsa CH2-CH3 domena Fc-zglobnog fragmenta tako da antitelo ima oštećeno vezivanje Stafilokokil proteina A (SpA) u odnosu na vezivanje SpA prirodnog Fc-zglobnog domena. Ovaj pristup je detaljnije opisan u>U.S. Patentu br. 6,165,745 od strane Word et al.

[0104] <U još nekim izvođenjima, Fc region se menja zamenom najmanje jednog ostatka aminokiseline drugim ostatkom aminokiseline da bi se promenile efektorske funkcije antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselina mogu se zameniti različitim ostatkom aminokiseline tako da antitelo ima izmenjeni afinitet za efektorski ligand, ali zadržava sposobnost vezivanja antigena matičnog antitela. Efektorski ligand za koji se afinitet menja može biti, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentima br.5.624.821 i 5.648.260, oba od strane Winter et al.>

[0105] <U drugom izvođenju, jedna ili više aminokiselina odabranih iz ostataka aminokiselina mogu se zameniti drugim ostatkom aminokiseline tako da antitelo ima izmenjeno vezivanje za C1q i/ili smanjenu ili ukinutu komplement zavisnu citotoksičnost (CDC). Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentima br. 6.194.551 od strane Idusogie et al.>

[0106] <U drugom izvođenju, jedan ili više ostataka aminokiselina su izmenjeni kako bi se time promenila sposobnost antitela da fiksira komplement. Ovaj pristup je detaljnije opisan u PCT publikaciji WO 94/29351 od strane Bodmer et al.>

[0107] <U drugim izvođenjima, Fc region je modifikovan kako bi se smanjila sposobnost antitela da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i/ili da bi se smanjio afinitet antitela za Fcγ receptor modifikovanjem jedne ili više aminokiselina. Takva antitela sa smanjenim efektorskim funkcijama, a posebno sa smanjenim ADCC, uključuju utišana antitela.>

[0108] <U određenim izvođenjima, koristi se Fc domen IgG1 izotipa. U nekim specifičnim izvođenjima, koristi se mutantna varijanta IgG1 Fc fragmenta, npr. utišani IgG1 Fc koji smanjuje ili eliminiše sposobnost fuzionog polipeptida da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i/ili da se veže za Fcγ receptor.>

[0109] <U određenim izvođenjima, koristi se Fc domen IgG4 izotipa. U nekim specifičnim izvođenjima, koristi se mutantna varijanta IgG4 Fc fragmenta, npr. utišani IgG4 Fc koji smanjuje ili eliminiše sposobnost fuzionog polipeptida da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i/ili da se veže za Fcγ receptor.>

[0110] <Utišane efektorske funkcije mogu se dobiti mutacijom u Fc konstantnom delu antitela i opisane su u struci (Baudino et al., 2008; Strohl, 2009). Primeri utišanih IgG1 antitela obuhvataju trostruku mutantnu varijantu IgG1 L247F L248E P350S. Primeri utišanih IgG4 antitela obuhvataju dvostruko mutantnu varijantu IgG4 S241P L248E.>

[0111] <U određenim izvođenjima, Fc domen je utišani Fc mutant koji sprečava glikozilaciju na poziciji 314 Fc domena. Na primer, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju asparagina na poziciji 314. Primer takve aminokiselinske supstitucije je zamena N314 glicinom ili alaninom.>

[0112] <U još jednom izvođenju, glikozilacija antitela je modifikovana. Na primer, može se napraviti aglikozilirano antitelo (tj. antitelu nedostaje glikozilacija). Glikozilacija se može izmeniti da bi se, na primer, povećao afinitet antitela za antigen. Takve modifikacije ugljenih hidrata mogu se postići, na primer, promenom jednog ili više mesta glikozilacije unutar sekvence antitela. Na primer, mogu se napraviti jedna ili više aminokiselinskih supstitucija koje rezultiraju eliminacijom jednog ili više mesta glikozilacije varijabilnog regiona okvira da bi se time eliminisala glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može povećati afinitet antitela za antigen. Takav pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentima br. 5,714,350 i 6,350,861 od strane Co et al.>

[0113] <Još jedna modifikacija antitela ovde koja je razmatrana ovim pronalaskom je pegilacija ili hesilacija ili srodne tehnologije. Antitelo se može pegilovati da bi se, na primer, povećao biološki (npr. serum) poluživot antitela. Da bi se pegiliralo antitelo, antitelo, ili njegov fragment, obično reaguje sa polietilen glikolom (PEG), kao što je reaktivni estarski ili aldehidni derivat PEG, pod uslovima u kojima se jedna ili više PEG grupa vezuju za antitelo ili fragment antitela. Pegilacija se može izvršiti reakcijom acilacije ili reakcijom alkilacije sa reaktivnim PEG molekulom (ili analognim reaktivnim polimerom rastvorljivim u vodi). Kako se ovde koristi, termin „polietilen glikol“ treba da obuhvati bilo koji od oblika PEG-a koji su korišćeni za derivatizaciju drugih proteina, kao što su mono (C1->C10) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol ili polietilen glikol-maleimid. U određenim izvođenjima, antitelo koje se pegilira je aglikozilovane antitelo. Metode za pegilaciju proteina su poznate u struci i mogu se primeniti na antitela iz ovog pronalaska. Videti na primer, EP 0154316 od strane Nishimura et al. i EP 0401384 od strane Ishikawa et al.

[0114] <Druga mogućnost je fuzija barem regiona za vezivanje antigena antitela ovog pronalaska sa proteinima sposobnim da se vežu za serumske proteine, kao što je humani serumski albumin, kako bi se povećalo vreme poluraspada rezultujućeg molekula. Takav pristup je, na primer, opisan u Nygren et al., EP 0486525.>

[0115] <U određenim izvođenjima, C-terminalni lizin, koji je obično prisutan na konstantnim domenima teškog lanca humanog IgG, je konstruisan da bi se smanjila heterogenost usled cepanja ovog smanjenja koje se obično primećuje tokom proizvodnje ili skladištenja. Takve modifikacije ne menjaju primetno poželjne funkcije ovih antitela, dok istovremeno daju prednost stabilnosti ovim molekulima.>

[0116] <Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju antitela ovog pronalaska>

[0117] <Ovde su takođe otkriveni molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju anti-BTN3A antitela ovog pronalaska. Primeri nukleotidnih sekvenci varijabilnog lakog i teškog lanca su oni koji kodiraju aminokiselinske sekvence varijabilnog lakog i teškog lanca bilo kog od mAb1, mAb2, mAb4 i mAb5, pri čemu se ove poslednje sekvence lako izvode iz Tabele 1 i Tabele 2, koristeći genetski kod i, opciono, uzimajući u obzir pristrasnost kodona u zavisnosti od vrste ćelije domaćina.>

[0118] <Ovaj pronalazak se takođe odnosi na molekule nukleinskih kiselina koje potiču iz ovih poslednjih sekvenci, a koje su optimizovane za ekspresiju proteina u ćelijama sisara, na primer, ćelijskim linijama CHO.>

[0119] <Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili mogu biti nukleinske kiseline u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je „izolovana“ ili>„učinjena suštinski čistom“ kada se prečisti od drugih ćelijskih komponenti ili drugih zagađivača, npr. drugih ćelijskih nukleinskih kiselina ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući

alkalni/SDS tretman, CsCl trajanje, kolonsku hromatografiju, elektroforezu na agaroznom gelu i<druge dobro poznate tehnike u struci (Ausubel et al., 1988). Nukleinska kiselina iz ovog pronalaska može biti, na primer, DNK ili RNK i može, ali i ne mora da sadrži intronske sekvence. U jednom>izvođenju, nukleinska kiselina može biti prisutna u vektoru kao što je vektor za prikaz faga ili u rekombinantnom plazmidnom vektoru.

[0120] <Nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu se dobiti korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Kada se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju, na primer, VH i VL segmente, ovi fragmenti>DNK mogu se dalje manipulisati standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer da bi se<geni varijabilnog regiona konvertovali u gene lanca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenata ili u scFv gen. U ovim manipulacijama, VL- ili VH-kodirajući fragment DNK (na primer VL i VH kako je definisano u Tabeli 1) je operativno povezan sa drugim molekulom DNK ili sa fragmentom koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Izraz „operativno povezan“, kako se koristi u ovom kontekstu, treba da znači da su dva fragmenta DNK spojena na>funkcionalan način, na primer, tako da aminokiselinske sekvence kodirane od strane dva fragmenta DNK ostaju u okviru, ili tako da se protein ekspresuje pod kontrolom željenog promotera.

[0121] <Izolovana DNK koja kodira VH region može se konvertovati u gen teškog lanca pune dužine operativnim povezivanjem VH-kodirajuće DNK sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence gena konstantnog regiona ljudskog teškog lanca su poznate u struci (Kabat et al., 1992) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti konstantni region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD. U nekim izvođenjima, konstantni region teškog lanca je izabran među IgG1 izotipovima, na primer ljudski IgG1 izotip. U drugim izvođenjima, konstantni region teškog lanca je izabran među IgG4 izotipovima, na primer ljudski IgG4 izotip. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, VH-kodirajuća DNK može se operativno povezati sa drugim molekulom DNK koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.>

[0122] <Izolovana DNK koja kodira VL region može se konvertovati u gen lakog lanca pune dužine (kao i u gen lakog lanca Fab) operativnim povezivanjem VL-kodirajuće DNK sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena konstantnog regiona humanog lakog lanca su poznate u struci (Kabat et al., 1992) i fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti kappa ili lambda konstantni region.>

[0123] <Da bi se stvorio scFv gen, VH- i VL-kodirajući fragmenti DNK su operativno povezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr. koji kodira aminokiselinska sekvenca (Gly4-Ser)3, tako da se VH i VL sekvence mogu ekspresovati kao susedni jednolančani protein, sa VL i VH>regionima spojenim fleksibilnim linkerom (Bird et al., 1988; Huston et al., 1988; McCafferty et al., 1990).

[0124] <Generisanje transfektoma koji proizvode monoklonska antitela>

[0125] <Antitela ovog pronalaska mogu se proizvesti u transfektomu ćelije domaćina koristeći, na primer, kombinaciju tehnika rekombinantne DNK i metoda transfekcije gena, kao što je dobro poznato u struci (Morrison, 1985).>

[0126] <Na primer, da bi se ekspresovala antitela ili njihovi fragmenti antitela, DNK koje kodiraju delimične ili pune lake i teške lance mogu se dobiti standardnim tehnikama molekularne biologije ili biohemije (npr. hemijska sinteza DNK, PCR amplifikacija ili kloniranje cDNK korišćenjem hibridoma koji ekspresuje antitelo od interesa) i DNK se mogu umetnuti u vektore ekspresije tako da su geni operativno povezani sa sekvencama za kontrolu transkripcije i translacije. U ovom kontekstu, izraz „operativno povezan“ treba da znači da je gen antitela ligiran u vektor tako da sekvence za kontrolu transkripcije i translacije unutar vektora služe svojoj namenjenoj funkciji regulisanja transkripcije i translacije gena antitela. Vektor ekspresije i sekvence za kontrolu ekspresije su odabrane tako da budu kompatibilne sa korišćenom ćelijom domaćinom ekspresije. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu se umetnuti u odvojene vektore ili, tipičnije, oba gena se umetnu u isti ekspresioni vektor. Geni antitela se umetnu u ekspresioni vektor standardnim metodama (npr. ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu gena antitela i vektoru ili ligacijom tupih krajeva ako nisu prisutna restrikciona mesta). Varijabilni regioni lakog i teškog lanca antitela>opisanih ovde mogu se koristiti za kreiranje gena antitela pune dužine bilo kog izotipa antitela umetanjem u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teškog i lakog lanca željenog izotipa tako da je VH segment operativno povezan sa CH segmentom(ima) unutar vektora, a VL segment je operativno povezan sa CL segmentom unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može kodirati signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može se klonirati u vektor tako da je signalni peptid povezan u okviru za amino-terminus gena lanca antitela. Signalni peptid može biti<imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signalni peptid (tj. signalni peptid iz>

[0127] <ne-imunoglobulinskog proteina).>

[0129] <Pored gena lanca antitela, rekombinantni vektori ekspresije opisani ovde nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanca antitela u ćeliji domaćinu. Izraz „regulatorna sekvenca“ treba da obuhvati promotere, pojačivače i druge elemente za kontrolu ekspresije (npr. signale poliadenilacije) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela. Takve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel-ovoj publikaciji (Goeddel, 1990).>

[0130] <Stručnjacima u ovoj oblasti će biti jasno da dizajn vektora ekspresije, uključujući izbor regulatornih>sekvenci, može zavisiti od faktora kao što su izbor ćelije domaćina koja se transformiše, nivo<ekspresije željenog proteina itd. Regulatorne sekvence za ekspresiju ćelija domaćina sisara>uključuju virusne elemente koji usmeravaju visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promoteri i/ili pojačivači izvedeni iz citomegalovirusa (CMV), Simijan Virus 40 (SV40), adenovirusa (npr. glavni kasni promoter adenovirusa (AdMLP)) i polioma. Alternativno, mogu se koristiti nevirusne regulatorne sekvence, kao što su ubikvitinski promoter ili P-globinski promoter.<Dalje, regulatorni elementi sastavljeni od sekvenci iz različitih izvora, kao što je SRa promoterski sistem, koji sadrži sekvence iz ranog SV40 promotera i dugog terminalnog ponavljanja virusa humane T ćelijske leukemije tipa 1 (Takebe et al., 1988).>

[0132] <Pored gena lanca antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori ovog pronalaska mogu nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u>ćelijama domaćinima (npr. porekla replikacije) i selektabilne marker gene. Selektabilni marker gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je vektor uveden (videti, npr., U.S. Patente br. 4,399,216,

4,634,665 i 5,179,017, sve od Axel et al.). Na primer, obično selektivni marker gen daje otpornost na<lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, na ćeliji domaćina u koju je vektor uveden. Selektivni marker geni uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za upotrebu u dhfr-ćelijama>domaćinima sa selekcijom/amplifikacijom metotreksata) i neo gen (za selekciju G418).

[0134] <Za ekspresiju lakih i teških lanaca, vektor(i) ekspresije koji kodiraju teške i lake lance se transfektuju u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici izraza „transfekcija“ treba da obuhvate širok spektar tehnika koje se obično koriste za unošenje egzogene DNK u prokariotsku ili>eukariotsku ćeliju domaćina, npr. elektroporacija, precipitacija kalcijum-fosfatom, transfekcija DEAE dekstranom i slično. Teoretski je moguće ekspresovati antitela ovog pronalaska u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina. Ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, na primer ćelijama domaćina sisara, kvascu ili filamentoznim gljivicama, razmatra se jer takve eukariotske ćelije, a posebno ćelije sisara, imaju veću verovatnoću od prokariotskih ćelija da sastave i luče pravilno savijeno i imunološki aktivno antitelo.

[0135] <U jednom specifičnom izvođenju, vektor za kloniranje ili ekspresiju prema pronalasku sadrži jednu>od kodirajućih sekvenci teškog i lakog lanca bilo kog od mAb1, mAb2, mAb4 i mAb5 operativno<povezanih sa odgovarajućim promoterskim sekvencama.>

[0136] <Ćelije domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela iz ovog pronalaska uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije), uključujući dhfr- CHO ćelije (opisane kod Urlaub and Chasin,>1980) koje se koriste sa DHFR selektivnim markerom (kao što je opisano kod Kaufmana i Sharp, 1982), CHOK1 dhfr+ ćelijske linije, NSO ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije, na primer GS CHO<ćelijske linije zajedno sa GSXceed™ sistemom za ekspresiju gena (Lonza). Kada se rekombinantni>vektori ekspresije koji kodiraju gene antitela uvedu u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode<kultivacijom ćelija domaćina tokom vremenskog perioda dovoljnog za ekspresiju antitela u ćelijama>domaćina i, opciono, sekreciju antitela u medijum za kultivaciju u kojem se ćelije domaćina gaje.

Antitela se mogu izdvojiti i prečistiti, na primer, iz medijuma za kultivaciju nakon njihove sekrecije<korišćenjem standardnih metoda prečišćavanja proteina (Shukla et al., 2007).>

[0137] <U jednom specifičnom izvođenju, ćelija domaćin prema ovom pronalasku je ćelija domaćin transfektovana ekspresionim vektorom koji ima kodirajuće sekvence pogodne za ekspresiju mAb1, mAb2, mAb4 i mAb5 respektivno, operativno povezane sa odgovarajućim promoterskim>

[0138] <sekvencama.>

[0139] <Na primer, ovaj pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži najmanje nukleinske kiseline SEQ ID NO:8 i 10 koje kodiraju teške i lake lance mAb1, respektivno.>

[0140] <Potonje ćelije domaćina mogu se zatim dalje kultivisati pod odgovarajućim uslovima za ekspresiju i proizvodnju antitela iz pronalaska izabranog iz grupe koja se sastoji od mAb1, mAb2, mAb4 i mAb5, respektivno.>

[0141] <Alternativno, sistemi ekspresije bez ćelija mogu se koristiti za proizvodnju bilo kog od mAb1, mAb2, mAb4 i mAb5. Tipično, metode ekspresije proteina ili antitela bez ćelija su već opisane (Stech et al., 2017).>

[0142] <Imunokonjugati>

[0143] <U drugom aspektu, ovaj pronalazak sadrži anti-BTN3A antitelo kako je ovde opisano, ili njegov fragment, konjugovan sa terapeutskim delom, kao što je citotoksin, lek (npr. imunosupresiv) ili radiotoksin. Takvi konjugati se ovde nazivaju „imunokonjugati“. Imunokonjugati koji sadrže jedan ili više citotoksina nazivaju se „imunotoksini“. Citotoksin ili citotoksični agens obuhvata bilo koji agens koji je štetan za (npr. ubija) ćelije. Primeri uključuju takson, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, t. kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihove analoge ili homologe. Terapeutski agensi takođe uključuju, na primer, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), ablacione agense (npr. mehloretamin, tioepa hloraksinbucil, meifalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibrommanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlordiamin platina (II) (DDP) cisplatin, antracikline (npr. daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike>(npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin i antramicin (AMC)), monometil auristatin E i antimitotičke agense (npr. vinkristin i vinblastin).

[0145] <Citotoksini se mogu konjugovati sa antitelima ovog pronalaska korišćenjem tehnologije linkera>dostupne u struci. Primeri tipova linkera koji su korišćeni za konjugovanje citotoksina sa antitelom<uključuju, ali nisu ograničeni na, hidrazone, tioetre, estre, disulfide i linkere koji sadrže peptide, kao što je valin-citrulinski linker. Može se izabrati linker koji je, na primer, podložan cepanju niskim pH unutar lizozomskog odeljka ili podložan cepanju proteazama, kao što su proteaze preferencijalno eksprimirane u tumorskom tkivu kao što su katepsini (npr. katepsini B, C, D).>

[0147] <Za dalju diskusiju o vrstama citotoksina, linkerima i metodama za konjugaciju terapeutskih sredstava sa antitelima, videti takođe Panowski i dr., 2013 za pregled konjugata antitela i lekova.>

[0148] <Antitela ovog pronalaska takođe se mogu konjugovati sa radioaktivnim izotopom da bi se generisali>citotoksični radiofarmaceutici, takođe poznati kao radioimunokonjugati. Primeri radioaktivnih izotopa koji se mogu konjugovati sa antitelima za dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu uključuju,<ali nisu ograničeni na, jod131, indijum111, itrijum90 i lutecijum177. Metode za pripremu radioimunokonjugata su utvrđene u struci.>

[0150] <Bispecifični ili multispecifični molekuli>

[0152] <U drugom aspektu, ovde su dalje opisani bispecifični ili multispecifični molekuli koji sadrže anti-BTN3A antitelo ovog pronalaska. Antitelo može biti derivatizovano ili povezano sa drugim>funkcionalnim molekulom, npr. drugim peptidom ili proteinom (npr. drugim antitelom ili ligandom<za receptor) da bi se generisao bispecifični molekul koji se vezuje za najmanje dva različita mesta vezivanja ili ciljnih molekula. Antitelo može zapravo biti derivatizovano ili povezano sa više od jednog drugog funkcionalnog molekula da bi se generisali multispecifični molekuli koji se vezuju za više od dva različita mesta vezivanja i/ili ciljnih molekula; takvi multispecifični molekuli su takođe>obuhvaćeni izrazom „bispecifični molekul“ kako se ovde koristi. Da bi se stvorio bispecifični molekul, antitelo ovog pronalaska može biti funkcionalno povezano (npr. hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim povezivanjem ili na drugi način) sa jednim ili više drugih<molekula vezivanja, kao što je drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili mimetik vezivanja, tako da se dobije bispecifični molekulski rezultat.>

[0154] <Shodno tome, ovaj pronalazak uključuje bispecifične molekule koji sadrže najmanje jednu prvu>specifičnost vezivanja za BTN3A, na primer, jedan deo za vezivanje antigena bilo kog od mAb1,

mAb2, mAb4 i mAb5 i drugu specifičnost vezivanja za drugi ciljni epitop.

[0156] <Pored toga, za izvođenje u kojem je bispecifični molekul multispecifičan, molekul može dalje da>uključuje treću specifičnost vezivanja, pored prvog i drugog ciljnog epitopa.

[0158] <U jednom izvođenju, bispecifični molekuli kako je ovde opisano sadrže kao specifičnost vezivanja najmanje jedno antitelo ili njegov fragment antitela, uključujući, npr., Fab, Fab’, F(ab’)>2<, Fv, Unibody>ili jednolančani Fv. Antitelo takođe može biti dimer lakog ili teškog lanca, ili bilo koji njihov minimalni fragment kao što je Fv ili jednolančana konstrukcija kao što je opisano u Ladner et al., U.S. Patent br.4,946,778.

[0159] Druga antitela koja se mogu koristiti u bispecifičnim molekulima opisanim ovde su mišja, himerna i<humanizovana monoklonska antitela.>

[0160] Bispecifični molekuli ovog pronalaska mogu se pripremiti konjugacijom specifičnosti vezivanja<sastojaka, korišćenjem metoda poznatih u struci. Na primer, svaka specifičnost vezivanja>bispecifičnog molekula može se generisati odvojeno, a zatim konjugovati jedna sa drugom. Kada su<specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, za kovalentnu konjugaciju mogu se koristiti različiti agensi za spajanje ili umrežavanje. Primeri agensa za umrežavanje uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzojevu kiselinu) (DTNB), o-fenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) ciklohaksan-I-karboksilat (sulfo-SMCC) (Karpovsky et al., 1984; Liu et al., 1985). Druge metode uključuju one opisane u Brennan et al., 1985; Glennie et al., 1987; Paulus, 1985.>

[0161] <Alternativno, obe specifičnosti vezivanja mogu biti kodirane u istom vektoru i eksprimirane i sastavljene u istoj ćeliji domaćinu. Ova metoda je posebno korisna kada je bispecifični molekul>fuzioni protein mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)2 ili ligand x Fab. Bispecifični molekul ovog pronalaska može biti jednolančani molekul koji sadrži jednolančano antitelo i determinantu vezivanja, ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve determinante vezivanja.

[0162] <Vezivanje bispecifičnih molekula za njihove specifične ciljeve može se potvrditi, na primer, enzimski povezanim imunosorbentnim testom (ELISA), radioimunološkim testom (REA), FACS analizom, biološkim testom (npr. inhibicija rasta i apoptoza) ili Western Blot testom. Svaki od ovih testova generalno detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo od posebnog interesa>korišćenjem obeleženog reagensa (npr. antitela) specifičnog za kompleks od interesa.

[0163] Antitela ovog pronalaska mogu se takođe koristiti za pripremu veštačkih T ćelijskih receptora<(takođe poznatih kao himerni T ćelijski receptori ili himerni antigenski receptori (CARs)). Na primer, varijabilni regioni antitela mogu se koristiti za formiranje Fab ili scFv koji je povezan preko razmaknice sa transmembranskim domenom (tipično transmembranskim domenom CD8 alfa) i signalnim endodomenom TCR (na primer CD3 zeta), i opciono, kostimulatornim signalnim domenom (na primer od 4-1BB ili CD28) i mogu se proizvoditi na površini T ćelija. Takvi CARs mogu se koristiti u terapiji adoptivnog transfera, na primer za lečenje proliferativnih poremećaja. Farmaceutske kompozicije>

[0164] <U drugom aspektu, ovaj pronalazak daje kompoziciju, npr. farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži>jedno ili kombinaciju antitela opisanih ovde, na primer, jedno antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od mAb1, mAb2, mAb4 i mAb5 ili njihovih delova koji vezuju antigen, formulisanih zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve kompozicije mogu da uključuju jedno ili kombinaciju (npr. dva ili više različitih) antitela, ili imunokonjugata ili bispecifičnih molekula kao što je gore opisano.

[0165] <Farmaceutske kompozicije opisane ovde takođe se mogu primenjivati u kombinovanoj terapiji, tj. kombinovane sa drugim sredstvima. Na primer, kombinovana terapija može da uključuje anti->BTN3A antitelo ovog pronalaska, na primer jedno antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od mAb1, mAb2, mAb4 i mAb5 ili njihovih delova koji vezuju antigen, kombinovano sa najmanje jednim antivirusnim, antiinflamatornim ili drugim antiproliferativnim sredstvom. Primeri terapeutskih sredstava koja se mogu koristiti u kombinovanoj terapiji detaljnije su opisani u nastavku u odeljku o upotrebi antitela ovog pronalaska.

[0166] <Kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ obuhvata sve rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična sredstva i sredstva za usporavanje apsorpcije i slično koja su fiziološki kompatibilna. Nosač treba da bude pogodan za intravenoznu, intramuskularnu, subkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr. injekcijom ili infuzijom). U jednom izvođenju, nosač treba da bude pogodan za subkutani put ili intratumoralnu injekciju. U zavisnosti od puta primene, aktivno jedinjenje, tj. antitelo, imunokonjugat ili bispecifični molekul, može biti obložen materijalom da bi se jedinjenje zaštitilo od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu inaktivirati jedinjenje.>

[0167] <Sterilni fosfatno puferovani fiziološki rastvor je jedan primer farmaceutski prihvatljivog nosača.>Drugi pogodni nosači su dobro poznati stručnjacima u struci. (Remington i Gennaro, 1995) Formulacije mogu dalje da sadrže jedan ili više ekscipijenata, konzervansa, solubilizatora, puferskih sredstava, albumina za sprečavanje gubitka proteina na površinama bočica itd.

[0168] <Oblik farmaceutskih kompozicija, način primene, doza i režim prirodno zavise od stanja koje se leči, težine bolesti, starosti, težine i pola pacijenta itd.>

[0169] <Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu se formulisati za lokalnu, oralnu, parenteralnu, intranazalnu, intravenoznu, intramuskularnu, subkutanu ili intraokularnu primenu i slično.>

[0170] <Poželjno je da farmaceutske kompozicije sadrže vehikulume koji su farmaceutski prihvatljivi za formulaciju koja se može injektirati. To mogu biti posebno izotonični, sterilni, fiziološki rastvori (mononatrijum ili dinatrijum fosfat, natrijum, kalijum, kalcijum ili magnezijum hlorid i slično ili smeše takvih soli), ili suve, posebno liofilizovane kompozicije koje, nakon dodavanja, u zavisnosti od slučaja, sterilisane vode ili fiziološkog rastvora, omogućavaju pravljenje rastvora za injekcije. Doze koje se koriste za primenu mogu se prilagoditi u zavisnosti od različitih parametara, a posebno u zavisnosti od načina primene, relevantne patologije ili alternativno željenog trajanja>lečenja.

[0171] <Za pripremu farmaceutskih kompozicija, efikasna količina antitela može se rastvoriti ili dispergovati u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili vodenoj sredini.>

[0172] <Farmaceutski oblici pogodni za injekcionu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije; formulacije koje uključuju susamovo ulje, ulje kikirikija ili vodeni propilen glikol; i sterilne praškove ili liofilizate za ekstemporalno pripremanje sterilnih rastvora ili disperzija za injekcije. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i mora biti tečan u meri u kojoj se lako može koristiti špricem. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti zaštićen od>kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice.

[0173] <Rastvori aktivnih jedinjenja kao slobodne baze ili farmakološki prihvatljivih soli mogu se pripremiti u vodi, odgovarajuće pomešanoj sa surfaktantnim sredstvom, kao što je hidroksipropilceluloza.>Disperzije se takođe mogu pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama, kao i u uljima. U uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans koji<sprečava rast mikroorganizama.>

[0175] Antitelo prema ovom pronalasku može se formulisati u kompoziciju u neutralnom ili obliku soli.<Farmaceutski prihvatljive soli uključuju soli dobijene adicijom kiselina (formirane sa slobodnim amino grupama proteina) i koje se formiraju sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer,>hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organskim kiselinama kao što su sirćetna, oksalna, vinska, bademova i slično. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama takođe mogu biti izvedene iz neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksidi, i organskih baza kao što su izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slično.

[0177] <Nosilac takođe može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), odgovarajuće smeše istih i biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost se može održati, na primer, upotrebom premaza, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata.>

[0178] <Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antifungalnim sredstvima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere ili>natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injekcionih kompozicija može se postići upotrebom u kompozicijama sredstava koja odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0179] <Sterilni injekcioni rastvori se pripremaju ugradnjom aktivnih jedinjenja u potrebnoj količini u>odgovarajući rastvarač sa raznim drugim sastojcima navedenim gore, po potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom različitih sterilisanih aktivnih sastojaka u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke iz<onih navedenih gore. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, poželjne metode pripreme su tehnike vakuumskog sušenja i liofilizacije koje daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno-filtriranog rastvora.>

[0181] <Takođe se razmatra priprema veće količine ili visoko koncentrovanih rastvora za direktno ubrizgavanje, gde se predviđa da upotreba DMSO kao rastvarača rezultira izuzetno brzom>penetracijom, isporučujući visoke koncentracije aktivnih agenasa na malu površinu tumora.

[0183] <Nakon formulacije, rastvori će se primenjivati na način kompatibilan sa formulacijom doziranja i u>količini koja je terapeutski efikasna. Formulacije se lako primenjuju u različitim oblicima doziranja, kao što su gore opisani tipovi rastvora za injekcije, ali se mogu koristiti i kapsule za oslobađanje leka i slično.

[0185] <Za parenteralnu primenu u vodenom rastvoru, na primer, rastvor treba po potrebi odgovarajuće>puferovati, a tečni razblaživač prvo učiniti izotoničnim sa dovoljno fiziološkog rastvora ili glukoze. Ovi posebni vodeni rastvori su posebno pogodni za intravenoznu, intramuskularnu, potkožnu i intraperitonealnu primenu. U vezi sa tim, sterilni vodeni medijumi koji se mogu koristiti biće poznati stručnjacima u ovoj oblasti u smislu ovog pronalaska. Na primer, jedna doza može se<rastvoriti u 1 ml izotoničnog rastvora NaCl i ili dodati u 1000 ml tečnosti za hipodermoklizu ili ubrizgati na predloženo mesto infuzije (videti na primer, „Remington’s Pharmaceutical Sciences“, 15. izdanje, stranice 1035-1038 i 1570-1580). Izvesne varijacije u doziranju će se nužno javiti u zavisnosti od stanja subjekta koji se leči. Osoba odgovorna za primenu će, u svakom slučaju, odrediti odgovarajuću dozu za pojedinačnog subjekta.>

[0186] <Antitela prema ovom pronalasku mogu biti formulisana u terapeutskoj smeši tako da sadrže oko 0,0001 do 1,0 miligrama, ili oko 0,001 do 0,1 miligrama, ili oko 0,1 do 1,0 ili čak 1,0 do oko 10 miligrama po dozi. Takođe se mogu primeniti višestruke doze.>

[0187] <Pogodne formulacije za rastvor za infuziju ili subkutanu injekciju antitela su opisane u struci i, na primer, su pregledane u Cui et al (Drug Dev Ind Pharm 2017, 43(4): 519-530).>

[0188] <Pored jedinjenja formulisanih za parenteralnu primenu, kao što su intravenska ili intramuskularna injekcija, drugi farmaceutski prihvatljivi oblici uključuju, npr. tablete ili druge čvrste supstance za oralnu primenu; kapsule sa vremenskim oslobađanjem; i bilo koji drugi oblik koji se trenutno koristi.>

[0189] <U određenim izvođenjima, upotreba lipozoma i/ili nanočestica je predviđena za unošenje antitela u>ćelije domaćina. Formiranje i upotreba lipozoma i/ili nanočestica su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.

[0190] <Nanokapsule generalno mogu da uhvate jedinjenja na stabilan i reproducibilan način. Da bi se>izbegli neželjeni efekti usled intracelularnog polimernog preopterećenja, takve ultrafine čestice<(veličine oko 0,1 µm) su generalno dizajnirane korišćenjem polimera koji se mogu razgraditi in vivo. Biorazgradive polialkil-cijanoakrilatne nanočestice koje ispunjavaju ove zahteve su predviđene za upotrebu u ovom pronalasku, a takve čestice se mogu lako napraviti.>

[0191] <Lipozomi se formiraju od fosfolipida koji su dispergovani u vodenoj sredini i spontano formiraju višelamelarne koncentrične dvoslojne vezikule (takođe nazvane višelamelarne vezikule (MLVs)). MLVs generalno imaju prečnike od 25 nm do 4 µm. Sonikacija MLV rezultira formiranjem malih>jednolamelarnih vezikula (SUVs) sa prečnikom u opsegu od 200 do 500 Å, koje sadrže vodeni rastvor u jezgru. Fizičke karakteristike lipozoma zavise od pH, jonske jačine i prisustva dvovalentnih katjona.

[0192] <Upotreba antitela ovog pronalaska>

[0193] <Antitela ovog otkrića imaju in vitro i in vivo dijagnostičke i terapeutske primene. Na primer, ovi molekuli se mogu primenjivati u ćelije u kulturi, npr. in vitro, ex vivo ili in vivo, ili kod subjekta, npr.>in vivo, radi lečenja, sprečavanja ili dijagnostikovanja različitih poremećaja.

[0194] <Kako se ovde koristi, izraz „lečiti“, „lečenje“ ili „tretman“ odnosi se na jedno ili više od (1) inhibiranja bolesti; na primer, inhibiranja bolesti, stanja ili poremećaja kod osobe koja doživljava ili>pokazuje patologiju ili simptomatologiju bolesti, stanja ili poremećaja (tj. zaustavljanje daljeg razvoja patologije i/ili simptomatologije); i (2) ublažavanja bolesti; na primer, ublažavanja bolesti, stanja ili poremećaja kod osobe koja doživljava ili pokazuje patologiju ili simptomatologiju bolesti,

stanja ili poremećaja (tj. preokretanje patologije i/ili simptomatologije), kao što je smanjenje težine<bolesti ili smanjenje ili ublažavanje jednog ili više simptoma bolesti. Konkretno, kada se odnosi na>lečenje tumora, izraz „lečenje“ može se odnositi na inhibiciju rasta tumora ili smanjenje veličine tumora.

[0195] <Antitela iz ovog pronalaska su antitela koja aktiviraju BTN3A i mogu aktivirati citolitičku funkciju, proizvodnju citokina i/ili proliferaciju Vy9 Vδ2 T ćelija, i time se mogu koristiti za prevazilaženje imunosupresivnih mehanizama primećenih kod pacijenata obolelih od kancera i tokom hroničnih infekcija.>

[0196] <Kako se ovde koriste, termini „kancer“, „hiperproliferativni“ i „neoplastični“ odnose se na ćelije koje imaju sposobnost autonomnog rasta, tj. abnormalno stanje ili stanje koje karakteriše brzi proliferativni rast ćelija. Hiperproliferativna i neoplastična bolesna stanja mogu se kategorisati kao>patološka, tj. koja karakterišu ili čine bolesno stanje, ili se mogu kategorisati kao nepatološka, tj. odstupanje od normalnog, ali nije povezano sa bolesnim stanjem. Izraz treba da obuhvati sve vrste kancerogenih izraslina ili kanceroznih procesa, metastatska tkiva ili maligno transformisane ćelije, tkiva ili organe, bez obzira na histopatološki tip ili stadijum invazivnosti.

[0197] <Izrazi „kancer“ ili „neoplazme“ obuhvataju maligniteterazličitih organskih sistema, kao što su oni koji pogađaju pluća, dojke, štitnu žlezdu, limfoidni, gastrointestinalni i genitourinarni trakt, kao i adenokarcinome koji uključuju maligne tumore kao što su većina karcinoma debelog creva, karcinom bubrežnih ćelija, kancer prostate i/ili tumori testisa, nesitnoćelijski karcinom pluća, rak tankog creva i kancer jednjaka.>

[0198] <Primeri karcinoma uključuju, ali nisu ograničeni na, hematološke maligne bolesti kao što su>B-ćelijski limfoidni neoplazmi, T-ćelijski limfoidni neoplazmi, ne-Hodžkinov limfom (NHL), B-NHL, T-NHL, hronična limfocitna leukemija (CLL), mali limfocitni limfom (SLL), limfom mantle ćelija (MCL), NK-ćelijski limfoidni neoplazmi i neoplazme mijeloidne ćelijske loze, uključujući akutnu mijeloidnu leukemiju.

[0199] <Primeri nehematoloških karcinoma uključuju, ali nisu ograničeni na, kancer debelog creva, kancer>dojke, kancer pluća, kancer mozga, kancer prostate, kancer glave i vrata, kancer pankreasa, kancer<bešike, kolorektalni kancer, kancer kostiju, kancer grlića materice, kancer jajnika, kancer jetre, kancer usne duplje, kancer jednjaka, kancer štitne žlezde, kancer bubrega, kancer želuca, kancer testisa i kancer kože.>

[0200] <Primeri hroničnih infekcija uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne, bakterijske, parazitske ili>gljivične infekcije kao što su hronični hepatitis, infekcije pluća, infekcije donjih disajnih puteva, bronhitis, grip, upala pluća i polno prenosive bolesti.

[0201] <Primeri virusnih infekcija uključuju, ali nisu ograničeni na, hepatitis (HAV, HBV, HCV), herpes>simpleks (HSV), herpes zoster, HPV, influenca (grip), AIDS i AIDS-om povezani kompleks, ovčije<boginje (varičela), običnu prehladu, citomegalovirusnu (CMV) infekciju, male boginje (variola), Colorado krpeljnu groznicu, denga groznicu, ebolu hemoragičnu groznicu, bolest stopala i usta, lassa groznicu, male boginje, marburg hemoragičnu groznicu, infektivnu mononukleozu, zauške, norovirus, poliomijelitis, progresivnu multifokalnu leukencefalopatiju (PML), besnilo, rubeolu,>SARS, virusni encefalitis, virusni gastroenteritis, virusni meningitis, virusnu upalu pluća, bolest<Zapadnog Nila i žutu groznicu. Primeri bakterijskih infekcija uključuju, ali nisu ograničeni na, upalu>pluća, bakterijski meningitis, koleru, difteriju, tuberkulozu, antraks, botulizam, brucelozu, kampilobakteriozu, tifus, gonoreju, listeriozu, lajmsku bolest, reumatsku groznicu, pertusis (veliki<kašalj), kugu, salmonelozu, šarlah, šigelozu, sifilis, tetanus, trahom, tularemiju, tifus i infekcije urinarnog trakta. Primeri takođe uključuju bakterijske infekcije izazvane Coxiella burnetii, Brucella>abortus, Tropheryma whipplei, Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium canettii.

[0203] Primeri parazitskih infekcija uključuju, ali nisu ograničeni na, malariju, lajšmanijazu,<tripanozomijazu, Chagasovu bolest, kriptosporidiozu, fasciolijazu, filarijazu, amebne infekcije,>đardijazu, infekciju ostricama, šistosomijazu, tenijazu, toksoplazmozu, trihinelozu i tripanozomijazu. Primeri gljivičnih infekcija uključuju, ali nisu ograničeni na, kandidijazu, aspergilozu, kokcidioidomikozu, kriptokokozu, histoplazmozu i tinea pedis.

[0205] <Shodno tome, pronalazak se odnosi na antitela za upotrebu u metodu za lečenje jednog od gore opisanih poremećaja, kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu navedeni metod obuhvata davanje navedenom subjektu terapeutski efikasne količine anti-BTN3A antitela kao što je gore opisano, tipično, jednog od mAb1, mAb2, mAb4 ili mAb5.>

[0207] <U određenim izvođenjima, navedeni subjekt je izabran među pacijentima koji imaju tumore koji ekspresuju BTN3A.>

[0209] <Antitela za upotrebu kao što je gore opisano mogu se primenjivati kao jedini aktivni sastojak ili u kombinaciji sa, npr. kao adjuvans ili u kombinaciji sa, drugim lekovima npr. citokinima, antivirusnim, antiinflamatornim sredstvima ili citotoksičnim, antiproliferativnim, hemoterapijskim ili antitumorskim sredstvima, proizvodom ćelijske terapije (npr. γδ T ćelijska kompozicija), npr. za>lečenje ili prevenciju gore pomenutih bolesti.

[0211] <Na primer, antitela za upotrebu kao što je gore opisano mogu se koristiti u kombinaciji sa ćelijskom terapijom, posebno γδ T ćelijskom terapijom, hemoterapijom, antineoplastičnim sredstvima ili imunoterapeutskim sredstvima.>

[0213] <Kako se ovde koristi, izraz „ćelijska terapija“ odnosi se na terapiju koja obuhvata in vivo primenu najmanje terapeutski efikasne količine ćelijske kompozicije subjektu kome je to potrebno. Ćelije koje se primenjuju pacijentu mogu biti alogene ili autologne. Izraz „γδ T ćelijska terapija“ odnosi se na ćelijsku terapiju gde ćelijska kompozicija uključuje, kao aktivni princip, γδ T ćelije, posebno>Vγ9/Vδ2 T ćelije.

[0215] Proizvod ćelijske terapije odnosi se na ćelijsku kompoziciju koja se primenjuje navedenom<pacijentu u terapeutske svrhe. Navedeni proizvod ćelijske terapije sadrži terapeutski efikasnu dozu>ćelija i opciono, dodatne ekscipijente, adjuvanse ili druge farmaceutski prihvatljive nosače.

[0217] <Pogodni antineoplastični agensi mogu da uključuju, bez ograničenja, alkilacione agense (kao što su>ciklofosfamid, mehloretamin, hlorambucil, melfalan, nitrosureje, temozolomid), antracikline (kao što su daunorubicin, doksorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoksantron, valrubicin), taksane (kao što su Paklitaksel, Docetaksel), epotilone, inhibitore Topoizomeraze I (kao što su Irinotekan ili<Topotekan), inhibitore Topoizomeraze II (kao što su Etopozid, tenipozid ili Taflupozid), nukleotidne analoge i prekursorske analoge (kao što su azacitidin, azatioprin, kapecitabin, citarabin, flurouracil, gemcitabin, hidroksiurea, merkaptopurin, metotreksat ili Tioguanin), peptidne antibiotike (kao što su karboplatin, cisplatin i oksaliplatin), retinoide (kao što su tretinoin, alitretinoin, beksaroten), vinka alkaloidi i derivati (kao što su vinblastin, vinkristin, vindezin,>vinorelbin), ciljane terapije kao što su inhibitori kinaze (kao što su Ibrutinib, Idelalisib, Erlotinib,<Gefitinib, Imatinib, Vemurafenib, Vismodegib), inhibitori proteazoma (kao što su bortezomib, karfilzomib), inhibitori histon deacetilaze (kao što su Vorinostat ili Romidepsin).>

[0218] <Primeri imunoterapeutskih sredstava uključuju, bez ograničenja, fosfoantigene (npr. zoledronska kiselina ili drugi bisfosfonati), anti PD-1 antitela, anti-PD-L1 antitela, anti-BTLA antitela, anti->CTLA-4 antitela i citokine (kao što su interleukin 2 (IL-2) (Choudhry H et al, 2018, Biomed Res Int.

[0219] <2018 6. maj), interleukin 15 (IL-15) (Patidar M et al., Cytokine Growth Factor Rev. 2016>Oct;31:49-59), interleukin 21 (IL-21) (Caccamo N. et al., PLoS One. 2012;7(7):e41940), ili interleukin 33 (IL-33) (Duault C et al., J Immunol. 2016 Jan 1;196(1):493-502)), ili njihove rekombinantne oblike i njihove derivate, ili bilo koje citokine sposobne da indukuju aktivnost limfocita (npr. proliferaciju ili proizvodnju citokina ili metaboličke promene). Izraz derivat se koristi za bilo koje modifikacije citokina koje mogu da se oslanjaju na PEGilaciju (npr. konjugaciju sa lancima polietilen glikola (PEG)), mutaciju kao što je delecija, supstitucija ili insercija aminokiselina, ili povezivanje sa potencijatorskim agensima (na primer, IL15/IL15Ra kompleksi

fuzionisani sa IgG1 Fc, u kojima je IL-15 dodatno mutiran (asn72asp) što dodatno povećava<biološku aktivnost čineći ovaj kompleks superagonistom IL-2 i IL-15Rβγ (RhodePR et al, Cancer Immunol Res. 2016;4(1):49-60)) (Barroso-Sousa R et al, Curr Oncol Rep.2018 Nov 15;21(1):1). Izraz „IL-2“ ima svoje opšte značenje i odnosi se na humani interleukin-2. IL-2 je deo prirodnog imunog odgovora tela. IL-2 uglavnom reguliše aktivnost limfocita vezivanjem za IL-2 receptore. Izraz „IL-15“ ima svoje opšte značenje i odnosi se na humani interleukin-15. Kao i IL-2, IL-15 se vezuje za i signalizira kroz kompleks sastavljen od beta lanca receptora IL-2/IL-15 (CD122) i>zajedničkog gama lanca (gama-C, CD132). IL-15 reguliše aktivaciju i proliferaciju T i prirodnih ćelija ubica (NK).

[0220] <Izraz „IL-21“ ima svoje opšte značenje i odnosi se na humani interleukin-21. IL-21 su pripisana pleiotropna svojstva, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pojačavanje citotoksičnosti NK ćelija i CD8+T ćelija, modulaciju diferencijacije plazma ćelija i inhibiciju Treg ćelija.>

[0221] <Izraz „IL-33“ ima svoje opšte značenje i odnosi se na humani interleukin-33. IL-33, koji se smatra alarminom koji se oslobađa pri stresu ili oštećenju tkiva, član je porodice IL-1 i vezuje se za ST2>receptor. IL-33 je poznat kao efikasan stimulator imunih ćelija TH1, prirodnih ćelija ubica (NK), iNKT ćelija i CD8 T limfocita.

[0222] <Izraz „PD-1“ ima svoje opšte značenje u struci i odnosi se na receptor programirane smrti-1. Izraz „PD-1“ se takođe odnosi na transmembranski protein tipa I, koji pripada signalnoj porodici receptora CD28-B7, koja uključuje CD28, citotoksični antigen 4 povezan sa T-limfocitima (CTLA-4), inducibilni kostimulator (ICOS) i atenuator B- i T-limfocita (BTLA) (Greenwald RJ et al., 2005, Riley JL et al., 2005).>

[0223] <Izraz „BTLA“ ima svoje opšte značenje u struci i odnosi se na atenuator B- i T-limfocita. Izraz „BTLA“ se takođe odnosi na CD272, člana CD28-B7 signalne porodice receptora koja uključuje CD28, citotoksični T-limfocitno asocirani antigen 4 (CTLA-4), inducibilni kostimulator (ICOS) i receptor programirane smrti-1 (PD-1 (Greenwald RJ et al., 2005, Riley JL et al., 2005).>

[0224] <Izraz „anti-PD-1 antitelo“ ili „anti-PD-L1“ ima svoje opšte značenje u struci i odnosi se na antitelo sa afinitetom vezivanja za PD-1 ili PD-L1 respektivno, i antagonističkom aktivnošću prema PD-1, tj. inhibira kaskadu prenosa signala povezanu sa PD-1 i inhibira vezivanje PD-1 liganda (PD-L1; PD-L2). Takvo anti-PD-1 antitelo ili anti-PD-L1 antitelo preferencijalno inaktivira PD-1 sa većim afinitetom i snagom, respektivno, nego njegova interakcija sa drugim podtipovima ili izoformama CD28-B7 signalne porodice receptora (CD28; CTLA-4; ICOS; BTLA). Testovi i analize za određivanje da li je jedinjenje PD-1 antagonist su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti, kao što je opisano u Greenwald et al., 2005; Riley et al., 2005.>

[0225] <Primeri takvih anti-PD1 ili anti-PDL1 antitela uključuju, bez ograničenja, nivolumab, pembrolizumab, avelumab, durvalumab, cemiplimab ili atezolizumab.>

[0226] <Primeri takvih anti-CTLA4 antitela uključuju, bez ograničenja, ipilimumab.>

[0227] <Izraz „anti-BTLA antitela“ ima svoje opšte značenje u struci i odnosi se na antitela koja imaju afinitet vezivanja i antagonističku aktivnost za BTLA, tj. mogu inhibirati kaskadu prenosa signala povezanu sa BTLA. Testovi i analize za određivanje da li je jedinjenje BTLA antagonist su dobro>poznati stručnjacima u ovoj oblasti, kao što je opisano u (Greenwald et al., 2005; Riley et al., 2005). U nekim izvođenjima, anti-BTLA antitela su odabrana od onih opisanih u međunarodnoj patentnoj prijavi WO2010/106051; WO2011/014438; WO2017/144668.

[0228] <U nekim izvođenjima, anti-BTLA antitelo je BTLA antitelo (BTLA8.2) koje se može dobiti iz hibridoma dostupnog pod CNCM brojem depozita I-4123, kao što je otkriveno u WO2010/106051. U nekim izvođenjima, anti-BTLA antitelo je 4C7 mAb otkriveno u WO2011/014438.>

[0229] <U nekim izvođenjima, anti-BTLA antitelo je mAb 629.3 mAb otkriveno u WO2017/144668, ili njegova humanizovana verzija ili varijanta.>

[0230] <U skladu sa gore navedenim, ovaj pronalazak daje u još jednom aspektu:>

[0231] <Metod kako je gore definisan, koji obuhvata ko-primenu, npr. istovremeno ili uzastopno, terapeutski efikasne količine anti-BTN3A antitela prema ovom pronalasku i najmanje jedne druge lekovite supstance, pri čemu je navedena druga lekovita supstanca antivirusno ili antiproliferativno sredstvo ili imunoterapeutska sredstva (kao što su anti-PD-1, anti-PD-L1 antitela), ili citokini, npr. IL-2 ili IL-15, ili proizvod ćelijske terapije (kao što su γδ T ćelije), npr. kao što je gore naznačeno. U jednom izvođenju, antitela prema ovom pronalasku mogu se koristiti za detekciju nivoa rastvorljivog BTN3A ili nivoa ćelija koje ekspresuju BTN3A. Ovo se može postići, na primer,>kontaktiranjem uzorka (kao što je in vitro uzorak) i kontrolnog uzorka sa anti-BTN3A antitelom pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela i BTN3A (kako je ekspresovano

na površini ćelija ili rastvorljivog BTN3A, na primer u uzorku krvi). Svi kompleksi formirani između<antitela i BTN3A se detektuju i upoređuju u uzorku i kontroli. Na primer, standardne metode detekcije, dobro poznate u struci, kao što su ELISA i protočni citometrijski testovi, mogu se izvršiti>korišćenjem kompozicija iz ovog pronalaska.

[0232] <Shodno tome, u jednom aspektu, pronalazak dalje pruža metode za detekciju prisustva BTN3A (npr. ljudskog BTN3A antigena) u uzorku ili merenje količine BTN3A, što obuhvata kontaktiranje uzorka i>kontrolnog uzorka sa antitelom ili proteinom iz ovog pronalaska, ili njegovim regionom za vezivanje antigena, koji se specifično vezuje za BTN3A, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela ili njegovog dela i BTN3A. Zatim se detektuje formiranje kompleksa, pri

čemu je razlika u formiranju kompleksa između uzorka u poređenju sa kontrolnim uzorkom<indikativna za prisustvo BTN3A u uzorku.>

[0233] <Takođe u okviru ovog pronalaska su kompleti koji se sastoje od kompozicija (npr. humanizovanih antitela, konjugovanih antitela i multispecifičnih molekula) opisanih ovde i uputstva za upotrebu. Komplet može dalje da sadrži najmanje jedan dodatni reagens ili jedno ili više dodatnih antitela ili proteina. Kompleti obično uključuju etiketu koja ukazuje na namenu sadržaja kompleta. Izraz etiketa uključuje bilo koji pisani ili snimljeni materijal koji se isporučuje na ili sa kompletom, ili koji na drugi način prati komplet. Komplet može dalje da sadrži alate za dijagnostikovanje da li pacijent pripada grupi koja će reagovati na tretman anti-BTN3A antitelima, kao što je gore definisano.>

[0234] <Još jedna terapijska strategija zasniva se na upotrebi humanizovanih antitela opisanih ovde kao agenasa koji selektivno šire i/ili aktiviraju Vγ9 Vδ2 T ćelije izolovane iz uzorka ljudskog subjekta. Ovaj pronalazak se zato odnosi na anti-BTN3A antitela za upotrebu u metodu lečenja subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata:>

[0235] <(a) izolovanje krvnih ćelija koje sadrže Vγ9 Vδ2 T ćelije, na primer PBMC iz uzorka krvi>subjekta,

[0236] <(b) širenje in vitro Vγ9 Vδ2 T ćelija u prisustvu bilo kog od mAb 1, 2, 4 i 5, i, opciono, drugih tumorskih ili pomoćnih ćelija,>

[0237] <(c) sakupljanje proširenih Vγ9 Vδ2 T ćelija,>

[0238] <(d) opciono, formulisanje proširenih Vγ9 Vδ2 T ćelija i davanje terapeutski efikasne količine pomenutih Vγ9 Vδ2 T ćelija subjektu.>

[0239] <Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu humanizovanih antitela ovde opisanih (kao što su mAb1, mAb2, mAb4 ili mAb5) kao agenasa koji selektivno šire Vγ9 Vδ2 T ćelije Himernog Antigenskog Receptora (CAR). CAR γδ T ćelije i njihova upotreba u adoptivnoj imunoterapiji kancera T ćelijama opisane su, na primer, u Mirzaei et al (Cancer Lett 2016, 380(2): 413-423).>

[0240] <Ovaj pronalazak se takođe odnosi na anti-BTN3A antitela za upotrebu in vivo kao potencirajući agens tumorskih ćelija u γδ T ćelijskoj terapiji kod subjekta kome je to potrebno, obično boluje od kancera.>

[0241] <Kako se ovde koristi, izraz γδ T ćelijska terapija odnosi se na terapiju koja obuhvata davanje>subjektu kome je to potrebno najmanje efikasne količine γδ T ćelija. Takve γδ T ćelije mogu biti<alogene ili autologne. U specifičnim izvođenjima, γδ T ćelije mogu biti genetski modifikovane delecijom ili knock-out ili umetanjem ili knock-in specifičnih gena. U specifičnim izvođenjima, pomenute γδ T ćelije uključuju γδ T ćelije koje eksprimiraju himerni antigenski receptor. γδ T ćelije mogu biti ekspandirane i/ili prečišćene ex vivo. Alternativno, γδ T ćelije mogu biti uključene i u>ćelijsku kompoziciju koja obuhvata druge krvne ćelije, i na primer druge ćelije imunog sistema. Za reference u vezi sa terapijom γδ T ćelijama, pogledajte Pauza CD. et al, Front Immunol.2018 Jun 8;9:1305. doi: 10.3389, Saudemont A. et al, Front Immunol.2018 Feb 5;9:153. doi: 10.3389.

[0242] <Zaista, bez vezivanja za bilo koju posebnu teoriju, predloženi način delovanja anti-BTN3A antitela ovog pronalaska je da njihovo vezivanje za BTN3A ekspresovan na površini tumorske ćelije pokreće konformacionu promenu koja omogućava njegovu signalizaciju kontra-receptoru na Vγ9Vδ2 T>ćelijama.

[0243] <Pronalazak se zato odnosi na anti-BTN3A antitela za upotrebu u metodu lečenja subjekta koji pati od kancera, npr. hematoloških maligniteta, posebno leukemije kao što je akutna mijeloidna>leukemija, i ima tumorske ćelije, na primer ćelije tumora krvi, pri čemu navedeni metod obuhvata:

[0244] <(i) davanje navedenom subjektu efikasne količine anti-BTN3A antitela kako je ovde opisano,>tipično mAb1, mAb2, mAb4 ili mAb5, i,

[0245] <(ii) davanje efikasne količine γδ T ćelijske kompozicije navedenom subjektu,>

[0246] <pri čemu navedena efikasna količina anti-BTN3A antitela ima kapacitet da pojača antitumorsku>citolizu posredovanu navedenom γδ T ćelijskom kompozicijom protiv navedenih tumorskih ćelija. Pronalazak se dalje odnosi na metod za lečenje subjekta koji pati od kancera sa ćelijama čvrstog tumora, npr. ćelijama kancera jajnika, pri čemu navedeni metod obuhvata:

[0247] <(i) davanje navedenom subjektu efikasne količine anti-BTN3A antitela kako je ovde opisano,>tipično mAb1, mAb2, mAb4 ili mAb5, i,

[0248] (ii) davanje efikasne količine γδ T ćelijske kompozicije navedenom subjektu, pri čemu<navedena efikasna količina anti-BTN3A antitela ima sposobnost da pojača antitumorsku citolizu posredovanu navedenom γδ T ćelijskom kompozicijom protiv navedenih tumorskih>ćelija.

[0249] <Pronalazak se takođe odnosi na anti-BTN3A antitela za upotrebu u metodu za lečenje subjekta>kome je to potrebno, pri čemu navedeni metod obuhvata kombinovanu (simultanu ili sekvencijalnu) primenu CAR T ćelija, na primer CAR γδ T ćelija, i humanizovanog antitela kako je ovde opisano (kao što su mAb1, mAb2, mAb4 ili mAb5).

[0250] Opis slika

[0252] <Slika 1: A. Humane Vγ9Vδ2 T ćelije proširene iz PBMCs su ko-kultivisane sa Daudi ćelijskom linijom (Burkitov limfom) u odnosu E:T 1:1 sa naznačenim koncentracijama mAb1 (ili odgovarajuće izotipske kontrole) tokom 4 sata. Ćelije su obojene antitelima na CD107a i CD107b, a prolazi za pozitivnu ekspresiju su zasnovani na nestimulisanim kontrolama. Eksperiment je sproveden sa 3 zdrava donora. B. Daudi ćelije su pre-inkubirane 1 sat na 37°C sa naznačenim koncentracijama mAb1 (ili odgovarajuće izotipske kontrole). Nakon opsežnog ispiranja, Daudi ćelije pulsirane mAb>su ko-kultivisane tokom 4 sata sa proširenim humanim Vγ9Vδ2 T ćelijama na 37°C pre merenja aktivnosti kaspaze 3/7 na Daudi. Za A i B, krive su dobijene korišćenjem sigmoidne 4PL jednačine iz GraphPad Prism softvera. C. Isti protokol je korišćen kao što je prethodno opisano u (A) i (B) za procenu efikasnosti mAb1 (i odgovarajuće izotipske kontrole) korišćene u koncentraciji od 10 µg/ml na drugim tumorskim ćelijskim linijama (L-IPC: Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, HT29: Colorectal adenocarcinoma, A549: Lung carcinoma)) u poređenju sa Daudi ćelijskom linijom.

[0254] <Slika 2: mAb1 posreduje u ubijanju ciljnih ćelija koje ekspresuju BTN3A pomoću Vγ9Vδ2 T-ćelija.>

[0256] <A. 10.000 HL60-WT ili BTN3AKO ćelija (akutna mijeloidna leukemija) je ko-kultivisano 24 sata sa in vitro proširenim V γ 9V δ 2 T-ćelijama (odnos E:T 1:1) u prisustvu rastuće koncentracije>mAb1 (ili relevantne izotipske kontrole hlgG1) /- rHulL-2 (20 IU/ml). Vijabilnost ćelija je merena korišćenjem bioluminiscentnog ogleda kojim se detektuju nivoi ATP.

[0258] <B.10.000 HL60-WT ćelija je ko-kultivisano 4 dana sa in vitro ekspandiranim Vγ9Vδ2 T->ćelijama (odnos E:T 1:1) u prisustvu rastuće koncentracije mAb1 (ili relevantne izotipske kontrole hlgG1) /- rHulL-2 (20 IU/ml). Vijabilnost ćelija je merena svakog dana.

[0260] C.10.000 HL60-WT ćelija je ko-kultivisano 4 dana sa svežim Vγ9V δ2 T-ćelijama izolovanim iz<humanih PBMC (odnos E:T1:1 i 1:5) u prisustvu rastuće koncentracije mAb1 rHulL-2 (20 IU/ml). Vijabilnost ćelija je merena svakog dana. * oznaka preko signala.>

[0262] <Slika 3: 10.000 tumorskih ćelija različitog tkivnog porekla ko-kultivisano je 24 sata sa in vitro ekspandiranim Vγ9Vδ2 T-ćelijama (odnos E:T 1:1) u prisustvu različite koncentracije mAb1.>

[0263] Vijabilnost ćelija je merena bioluminiscentnim ogledom kojim se detektuju nivoi ATP. Vrednosti<bioluminescencije su naznačene. 4 crte se odnose na, s leva na desno: (1) No mAb, (2) mAb10,1 ug/ml, (3) mAb11 ug/ml, (4) mAb110 ug/ml>

[0265] <Slika 4: mAb1 podstiče ekspanziju i aktivaciju Vγ9Vδ2 T ćelija majmuna Cynomolgus>

[0267] A. Puna krv Cynomolgus majmuna od 3 životinje je tretirana puferom za lizu crvenih krvnih<zrnaca. Nakon opsežnog ispiranja, ćelije su posejane u koncentraciji od 1,5 M/mL u medijum koji sadrži 200 IU/mL rHuIL-2 i mAb1 (10µg/mL). Procenat Vγ9+ T ćelija je procenjen>protočnom citometrijom na dan 0, 3, 6, 8 i 10 koristeći specifično antitelo. Grafikon prikazuje

kinetiku procenta Vγ9+ T ćelija među živim ćelijama. Svaka kriva predstavlja pojedinačnu<životinju.>

[0268] <B. Nakon 10 dana ekspanzije, ćelije svake životinje su ko-kultivisane 4 sata sa Daudi, K562 ili>Raji ćelijama koje su korišćene kao ciljne ćelije (odnos E:T 1:1) u prisustvu medijuma za<kultivaciju, mAb1 ili izotipske kontrole (10 µg/mL) i analizirane na degranulaciju (CD107a/b)>protočnom citometrijom.

[0270] <Slika 5: Uzorci krvi Cyinomolgusa prikupljeni u naznačenim vremenima nakon doziranja ICT01>obojeni su specifičnim koktelom antitela da bi se kvantifikovale podskupovi T ćelija (CD4, CD8, Vγ9<T ćelije, regulatorne T ćelije), B ćelije, monociti, NK ćelije, mDCs, pDCs i granulociti i analizirani>protočnom citometrijom. Gornji panel je prikazao % Vγ9Vδ2 T ćelija među CD3+ T-ćelijama za<životinje koje su primale jednu dozu. Donji panel je prikazao % Vg9d2 T-ćelija među CD3+ T>ćelijama za životinje koje su primale ponovljene doze. Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti<±SD za svako uzorkovanje i grupu. Vertikalne isprekidane linije označavaju vreme doziranja ICT01.>

[0272] PRIMERI

[0274] Selekcija humanizovanih varijanti

[0276] 1. Opis strategija humanizacije

[0278] <a. Dizajn Sekvenci Varijabilnog Regiona Kompozitnog Humanog Antitela™>

[0280] Strukturni modeli V regiona mišjeg 7.2 i 20.1 antitela su proizvedeni korišćenjem Swiss PDB i<analizirani kako bi se identifikovale važne „ograničavajuće“ aminokiseline u V regionima koje su verovatno bile esencijalne za osobine vezivanja antitela. Većina ostataka sadržanih unutar CDRs>(koristeći i Kabat i Chothia definicije), zajedno sa brojnim ostacima okvira, smatrani su važnim. Iz<gore navedene analize, kreirane su kompozitne humane sekvence 7.2 i 20.1 antitela.>

[0282] <b. Izbegavanje epitopa CD4+ T ćelija>

[0284] Na osnovu strukturne analize, odabran je veliki preliminarni skup segmenata sekvenci koji bi se<mogli koristiti za kreiranje humanizovanih varijanti 7.2 i 20.1 i analiziran korišćenjem iTope™ tehnologije za in silico analizu vezivanja peptida za alele ljudskog MHC klase II (Perry et al., 2008), i>korišćenjem TCED™ poznatih epitopa T ćelija povezanih sa sekvencama antitela (Bryson et al., 2010). Segmenti sekvenci koji su identifikovani kao značajna ne-humanih veziva zametne linije koji za humani MHC klase II ili koji su postigli značajne rezultate u odnosu na TCED™ su odbačeni. Ovo je rezultiralo smanjenim skupom segmenata, a njihove kombinacije su ponovo analizirane, kao<gore, kako bi se osiguralo da spojevi između segmenata ne sadrže potencijalne epitope T ćelija. Odabrani segmenti sekvenci su sastavljeni u kompletne sekvence V regiona za koje se predviđa da su lišene značajnih epitopa T ćelija. Zatim je izabrano nekoliko sekvenci teških i lakih lanaca za sintezu i ekspresiju gena u ćelijama sisara za mAbs 7.2 i 20.1.>

[0286] 2. Generisanje humanizovanih varijanti i preliminarna karakterizacija

[0288] a. Konstrukcija plazmida humanizovanih varijanti

[0289] <Humanizovane varijante 7.2 i 20.1 su sintetizovane sa flankirajućim mestima restrikcionih enzima>za kloniranje u sistem ekspresionih vektora za teške i kappa lake lance ljudskog IgG4 (S241P,<L248E). Sve konstrukcije su potvrđene sekvenciranjem.>

[0291] <b. Ekspresija Antitela>

[0293] <Himerne 7.2 i 20.1 (VH0/Vk0), dve kontrolne kombinacije (VHO/Vk1, VH1/Vk0) i kombinacije humanizovanih teških i lakih lanaca su prolazno transfektovane u FreeStyle™ CHO-S ćelije (ThermoFisher, Loughborough, UK) korišćenjem MaxCyte STX® sistema za elektroporaciju (MaxCyte Inc., Gaithersburg, SAD) iz odgovarajuće DNK bez endotoksina. Transfekcije su izvršene za svako antitelo korišćenjem OC-400 sklopova za obradu. Nakon oporavka ćelija, ćelije su razblažene na 3 x 10⁶ ćelija/mL u CD Opti-CHO medijumu (ThermoFisher, Loughborough, UK) koji>sadrži 8 mM L-glutamina (ThermoFisher, Loughborough, UK) i 1 x Hipoksantin-Timidina (ThermoFisher, Loughborough, UK). 24 sata nakon transfekcije, temperatura kulture je smanjena na 32°C i dodat je 1 mM natrijum butirat (Sigma, Dorset, UK). Kulture su hranjene svakodnevno dodatkom 3,6% (početne zapremine) hrane (2,5% CHO CD Efficient Feed A (ThermoFisher, Loughborough, UK), 0,5% kvasca (BD Biosciences, Oxford, UK), 0,25 mM Glutamax (ThermoFisher, Loughborough, UK) i 2 g/L glukoze (Sigma, Dorset, UK)). Titeri IgG supernatanta praćeni su IgG ELISA testom, a transfekcije su kultivisane do 14 dana pre sakupljanja supernatanata.

[0295] c. Preliminarno merenje afiniteta: jednociklična kinetička analiza vezivanja humanizovanih<varijanti za BTN3A>

[0297] <Da bi se procenilo vezivanje svih 7.2 i 20.1 varijanti Composite Human Antibody™ i da bi se odabrala antitela sa najvećim afinitetom za BTN3A, jednociklična kinetička analiza je sprovedena na supernatantima iz transfektovane ćelijske kulture korišćenjem Biacore T200 (serijski broj 1909913) sa Biacore T200 Evaluation Software V2.0.1 (Uppsala, Švedska).>

[0299] <Antitela su razblažena u 2% BSA/PBS do konačne koncentracije od 2 µg/ml na osnovu koncentracija dobijenih iz supernatanta titriranog ELISA testom. Na početku svakog ciklusa, antitela su napunjena na Fc2, Fc3 i Fc4 Protein A chip (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). IgG su hvatani pri brzini protoka od 10 µl/min da bi se dobio nivo imobilizacije (RL) od ~ 146,5 RU, teorijska vrednost za dobijanje RMax od ~ 50 RU. Površina je zatim ostavljena da se stabilizuje.>Kinetički podaci jednog ciklusa dobijeni su sa BTN3A1-His kao analitom (Sino Biological Cat. No. 15973-H08H) pri brzini protoka od 60 µl/min da bi se minimizirali svi potencijalni efekti prenosa mase, kao i korišćenjem HBS-P+ (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) kao pufera za rad. Višestruka<ponavljanja sa himernim antitelom su izvršena da bi se proverila stabilnost površine i analita tokom kinetičkih ciklusa. Signal iz referentnog kanala Fc1 (bez antitela) je oduzet od signala Fc2, Fc3 i Fc4 da bi se korigovale razlike u nespecifičnom vezivanju za referentnu površinu. Korišćen je>trotačkasti, četvorostruki raspon razblaženja od 1,56 nM do 25 nM BTN3A1 bez regeneracije<između svake koncentracije. Faza asocijacije za tri injekcije rastućih koncentracija BTN3A1 praćena>je 240 sekundi svaki put, a jedna faza disocijacije merena je 2000 sekundi nakon poslednje injekcije<BTN3A1. Regeneracija površine Proteina A sprovedena je korišćenjem dve injekcije 10 mM glicin-HCl pH 1,5, nakon čega je usledio period stabilizacije od 240 sekundi.>

[0300] <Signal iz svakog blamko pokušaja antitela (bez CD277) je oduzet da bi se korigovale razlike u>stabilnosti površine. Kinetika jednog ciklusa pokazala je da su se sve humanizovane varijante vezale<za BTN3A.>

[0301] <d. Prečišćavanje antitela>

[0302] <Na osnovu afiniteta izračunatih pomoću Biacore, kao i iTope™ rezultata i procenta humanosti svake humanizovane varijante, 7,2 i 20,1 humanizovane varijante sa najboljim afinitetom i najboljim>iTope™ rezultatima su odabrane za dalju analizu.

[0303] <Odabrane humanizovane varijante, zajedno sa njihovom himernom verzijom i najkonzervativnije humanizovanom varijantom (VH1/Vk1), podvrgnute su prečišćavanju za dalje testiranje. Antitela su prečišćena iz supernatanata ćelijske kulture na kolonama sa Protein A sefarozom, a zatim>pomoću hromatografije isključivanja po veličini (SEC) (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) koristeći<10 mM natrijum acetat, 100 mM NaCl, pH 5,5 kao mobilnu fazu i pufer za finalnu formulaciju. Uzorci su kvantifikovani pomoću OD280nm koristeći koeficijent ekstinkcije (Ec(0,1%)) na osnovu>predviđene sekvence aminokiselina.

[0304] Antitela su analizirana pomoću SDS-PAGE nanošenjem 2 µg svakog antitela na gel i primećene su<trake koje odgovaraju profilu tipičnog antitela.>

[0305] e. Validacija svojstava vezivanja: ELISA analiza konkurencije između humanizovanih i himernih 7.2 i 20.1 mAbs

[0306] <Prečišćene varijante su testirane na vezivanje za rekombinantni BTN3A1-His (Sino Biological kat. br. 15973-H08H) dok su se takmičile sa odgovarajućim mišjim antitelom. Himerni (VH0/Vk0) i irelevantni ljudski IgG4 (S241P, L248E) su testirani na svakoj ploči radi poređenja.>

[0307] <BTN3A1 je razblažen u 1xPBS100,5 µg/ml i 100µl/posudica je premazano preko noći na 4°C na>ELISA ploči sa 96-posudica. Sledećeg dana, ploča je isprana 3x sa 1xPBS/0,05% Tween (PBS-T) i blokirana sa 200µl 2% mleka/PBS tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. U 96- posudica ploči za razblaživanje, fiksna koncentracija mišjih antitela 7,2 ili 20,1 (konačna koncentracija 0,15 µg/ml) je dodata u jednakoj zapremini u četvorostruku titarsku seriju test antitela (počevši od 80 µg/ml

(konačna koncentracija 40 µg/ml) razblaženih u blokirajućem puferu). Nakon pranja Nunc ELISA<ploče 3 x sa PBS-T, 100 µl mešavine mišjih/test antitela je dodato na ELISA ploču. Nakon jednosatne inkubacije na sobnoj temperaturi, ploča je isprana 3 x sa PBS-T i 100 µl sekundarnog antitela obeleženog anti-mišjeg Fc HRP (Sigma, Dorset, UK) razblaženog 1:1000 u blokirajućem puferu je primenjeno jedan sat na sobnoj temperaturi da bi se detektovalo vezano mišje antitelo. Za razvoj boje, ploča je isprana 3 x sa PBS-T, nakon čega je dodato 100 µl TMB supstrata i inkubirano pet>minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena sa 100 µl 3,0 M hlorovodonične kiseline i apsorpcija je odmah očitana pomoću Dynex čitača ploča na 450 nm.

[0308] <IC50 vrednosti su izračunate za svaku varijantu, a relativne IC50 vrednosti su izračunate deljenjem IC50 humanizovane varijante sa IC50 himernog antitela testiranog na istoj ploči.>

[0309] 3. Selekcija humanizovanih kandidata

[0310] <a. Multi-ciklična kinetička analiza>

[0311] <Na osnovu podataka dobijenih kompetitivnim ELISA testom i procenom termičke stabilnosti,>sprovedena je multi-ciklična kinetička analiza na većini humanizovanih 7.2 i 20.1 varijanti zajedno sa VH0/Vk0 himernim antitelom korišćenjem instrumenta Biacore T200 (serijski broj 1909913) sa Biacore T200 Evaluation Software V2.0.1 (Uppsala, Švedska).

[0312] <Prečišćena antitela su razblažena do koncentracije od 2 µg/ml u 2% BSA/PBS. Na početku svakog ciklusa, svako antitelo je uhvaćeno na Proteinu A pri gustini (RL) od ~ 146,5 RU (teorijska vrednost>za dobijanje RMax od ~ 50 RU). Nakon hvatanja, površina je ostavljena da se stabilizuje pre<ubrizgavanja BTN3A1 antigena (Sino Biological kat. br. 15973-H08H). BTN3A1 je titriran u 0,1% BSA/HBS-P+ (pufer za rad) u dvostrukom opsegu razblaženja od 25 do 0,78 nM. Faza asocijacije je>praćena 400 sekundi, a faza disocijacije 35 minuta (2100 sekundi). Kinetički podaci su dobijeni<korišćenjem brzine protoka od 50 µl/min kako bi se minimizirali svi potencijalni efekti prenosa mase. Regeneracija površine proteina A je sprovedena korišćenjem dve injekcije 10 mM glicin-HCl pH 1,5 na kraju svakog ciklusa. Dve slepe probe (bez BTN3A1) i ponavljanje jedne koncentracije analita su izvršene za svako testirano antitelo kako bi se proverila stabilnost površine i analita>tokom kinetičkih ciklusa. Signal iz referentnog kanala Fc1 je oduzet od signala Fc2, Fc3 i Fc4 kako bi<se korigovale razlike u nespecifičnom vezivanju za referentnu površinu. Pored toga, slepe probe su oduzete za svaki Fc kako bi se korigovale bilo kakve varijacije signala nezavisne od antigena, kao što je drift. Senzogrami su podešeni korišćenjem matematičkog modela povezivanja jedan-na-jedan sa globalnim parametrom RMax i bez rasutog signala (Constant RI = 0 RU).>

[0313] <b. Ogled vezivanja protočnom citometrijom na humanim PBMCs>

[0314] <Humanizovane varijante 7.2 i 20.1 okarakterisane su po vezivanju za humane PBMCs, izolovane iz krvi zdravih donora. PBMCs su izolovani iz sloja bufa pomoću Lymphoprep (Axis-shield, Dundee, UK) centrifugiranja po gustini. PBMCs su zatim zamrznuti i čuvani na -80°C ili u tečnom azotu koliko je potrebno.>

[0315] <100 µl ćelija sa 1 x106 ćelija/ml je preneto u svaku posudicu U-oblika sveže ploče sa 96 posudica sa dnom, zatim je ploča centrifugirana i supernatant odbačen.>

[0316] <Serijsko razblaženje antitela, od 0,001 µg/ml do 150 µg/ml, pripremljeno je u PBS 2 mM EDTA. Humani PBMCs su resuspendovani u 50 µl pripremljene razblažene serije titracije test antitela.>Nakon inkubacije od 30 minuta na 4°C u mraku, ploča je centrifugirana i isprana dva puta sa 150 µl/ posudica PBS 2 mM EDTA, nakon čega su posudice resuspendovane u 50 µl smeše sastavljene od kozjeg anti-humanog antitela (PE obeleženog) razblaženog 1/100 i živih/mrtvih nerazblaženih IR razblaženih 1/500 u PBS 2 mM EDTA.

[0317] <Nakon inkubacije od 15 minuta na 4°C u mraku, ploča je centrifugirana i isprana jednom sa 150 µl/ posudica PBS 2 mM EDTA, nakon čega su posudice resuspendovane u 200 µl PBS 2 mM EDTA. Ćelije su analizirane na BDLSR Fortessa citometru. Podaci su analizirani korišćenjem FlowJo softvera (verzija 10, FlowJo, LLC, Ashland, SAD) (Podaci nisu prikazani).>

[0318] Isti protokol je sproveden na PBMCs cynomolgusa i na ćelijskoj liniji Daudi Burkittovog limfoma.<c. Funkcionalna efikasnost in vitro: ogled degranulacije γδ-T ćelija>

[0319] <Ogled se sastoji od merenja aktivirajućeg ili inhibitornog efekta humanizovanih varijanti 7.2 i 20.1 i njihovih himernih verzija na degranulaciju γδ -T ćelija protiv ćelijske linije limfoma Daudi Burkitt>(Harly et al., 2012). γδ-T ćelije su proširene iz PBMCs zdravih donora kultivacijom sa zoledronskom kiselinom (1 µM) i IL2 (200 Ui/ml) tokom 11-13 dana. IL2 se dodaje 5. dana, 8. dana i svaka 2 dana nakon toga. Procenat γδ-T ćelija je određen na početku kulture i procenjen tokom vremena kulture

protočnom citometrijom dok nije dostigao najmanje 80%. Zamrznute ili sveže γδ-T ćelije su zatim<korišćene u testovima degranulacije protiv ćelijske linije Daudi (E:T odnos 1:1), pri čemu su ćelije ko-kultivisane 4 sata na 37°C u prisustvu 10 µg/ml humanizovanih varijanti 7.2 i 20.1 i njihovih>himernih verzija. Aktivacija pomoću PMA (20 ng/ml) plus lonomicin (1 µg/ml) služila je kao<pozitivna kontrola za degranulaciju γδ-T ćelija, a sam medijum kao negativna kontrola. Na kraju 4 sata ko-inkubacije, ćelije su analizirane protočnom citometrijom da bi se procenio procenat γδ-T>ćelija pozitivnih na CD107a (LAMP-1, lizozomalno-asocirani membranski protein-1) CD107b (LAMP-2). CD107 se mobiliše na površinu ćelije nakon aktivacijom indukovane egzocitoze granula,<pa je merenje površinskog CD107 osetljiv marker za identifikaciju nedavno degranuliranih>citolitičkih T ćelija. Rezultati nisu pokazali značajne varijacije među testiranim kandidatima, koji su<pokazali sličan aktivirajući efekat u testu degranulacije kao i himerno antitelo 7.2 ili 20.1.>

[0320] <Isti protokol je sproveden korišćenjem blasta AML izolovanih od pacijenata kao ciljnih ćelija, umesto Daudi ćelija.>

[0321] <d. Analiza termostabilnosti>

[0322] Da bi se procenila termostabilnost odabranih varijanti 7.2 i 20.1 Composite Human Antibody™,<temperature topljenja (temperatura na kojoj je 50% proteinskog domena razvijeno) određene su>korišćenjem fluorescentnog ogleda termičkog pomeranja.

[0323] <Sva prečišćena humanizovana antitela, kao i himerna (VH0/Vk0) antitela, razblažena su do konačne koncentracije od 0,1 mg/ml u formulacionom puferu (10 mM natrijum acetat, 100 mM NaCl, pH 5,5) koji sadrži SYPRO® Orange (ThermoFisher, Loughborough, UK) u razblaženju 1:1000 i podvrgnuta>temperaturnom gradijentu od 25°C do 99°C na StepOnePlus sistemu za PCR u realnom vremenu (ThermoFisher, Loughborough, UK) tokom perioda od 56 minuta. 10 mM natrijum acetat, 100 mM NaCl, pH 5,5 korišćeno je kao negativna kontrola. Krive topljenja analizirane su korišćenjem softvera za termostabilnost proteina (verzija 1.2).

[0324] <e. Selekcija humanizovanih kandidata>

[0325] <Na osnovu svih rezultata dobijenih za gore opisane eksperimente, 3 varijante od 35 (15>humanizovanih varijanti generisanih za 7.2; 20 humanizovanih varijanti generisanih za 20.1) su<odabrane za dalju karakterizaciju: 7.2 (VH2/Vk1), 7.2 (VH2/Vk2) i 20.1 (VH3/Vk1).>

[0326] <Rezultati različitih eksperimenata opisanih gore za mAbs 7.2 i 20.1 su prikazani u Tabeli 4 i Tabeli>5 za 3 varijante i njihove himerne verzije.

[0327] Tabela 4: Odabrani humanizovani kandidati imaju istu potenciju kao i mišja roditeljska antitela

[0329]

[0331] <Tabela 5: Humanizovani odabrani kandidati mAb7.2 sa VH2 i ili Vk1 ili Vk2 imaju veću termostabilnost u poređenju sa mišjim kandidatom>

[0333]

[0335] <Proces humanizacije doveo je do stvaranja višestrukih 7.2 i 20.1 varijanti sa predviđenom>smanjenom imunogenošću.

[0336] <Odabrani skup od tri varijante (7.2 VH2/VK1, 7.2 VH2/VK2 i 20.1 VH3/VK1) pokazao je ekvivalentna svojstva kao i njihova himerna verzija u pogledu afiniteta, vezivanja i efikasnosti u funkcionalnim testovima: modifikacije napravljene u sekvencama varijanti radi smanjenja imunogenosti nisu promenile funkcije antitela.>

[0337] Iznenađujuće, termostabilnost odabranih humanizovanih varijanti 7.2 VH2/VK1, 7.2 VH2/VK2 je<poboljšana u poređenju sa himernim antitelima, a takva poboljšana termostabilnost je bila>neočekivana u ovom procesu humanizacije.

[0338] <Konstantni region antitela: poređenje utišanih Fc fragmenata>

[0340] Nekoliko Fc delova je testirano da bi se utišala ili smanjila efektorska funkcija antitela. Vezivanje<ovih Fc fragmenata za različite Fcγ receptore je procenjeno pomoću Biacore; njihovo vezivanje na C1q kompleks je procenjeno ELISA testom.>

[0342] <1. Vezivanje inženjerisanog Fc dela za različite Fcγ receptore korišćenjem Biacore>

[0343] Sposobnost različitih izotipova (IgG1, IgG1 [N314A], IgG1 [L247F, L248E P350S], IgG2, IgG4<[S241P] i IgG4 [S241P L248E]) himernog antitela 20.1 da se vežu za različite Fcγ receptore>određena je korišćenjem prečišćenih antitela i jednociklusne Biacore analize. Ljudski Fc receptori, FcγRI, FcγRIIA (polimorfizam Arg167) i IIB, i FcγRIIIA (polimorfizam Phe176) i IIIB, dobijeni su od<Sino Biological.>

[0345] <Fcγ receptori su razblaženi u HBS-P+ (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) do konačne koncentracije od 0,5 ili 1,0 µg/ml. Na početku svakog ciklusa, Fcγ receptori su skladišteni na Fc2, Fc3 i Fc4 anti>His CM5 čip (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Fcγ receptori su hvatani brzinom protoka od 5 µl/min da bi se postigao nivo imobilizacije između 30 i 180 RU u zavisnosti od molekulske težine<Fcγ receptora. Površina je zatim ostavljena da se stabilizuje. Podaci o kinetici jednog ciklusa dobijeni su korišćenjem himernih antitela kao analita brzinom protoka od 30 µl/min kako bi se>minimizirali svi potencijalni efekti prenosa mase. Signal iz referentnog kanala Fc1 (bez antitela) je<oduzet od signala Fc2, Fc3 i Fc4 da bi se korigovale razlike u nespecifičnom vezivanju za referentnu površinu. Za svako himerno antitelo korišćen je opseg razblaženja od pet tačaka, trostruko, pri>čemu je ovaj opseg koncentracije varirao za svaki pojedinačni Fcγ receptor zbog očekivanih razlika u afinitetu. Signal iz svake slepe probe (bez antitela) je oduzet da bi se korigovale razlike u stabilnosti površine. Faza asocijacije za svaku od pet injekcija rastućih koncentracija himernog

antitela praćena je između 25 i 180 sekundi (u zavisnosti od liganda Fcγ receptora), a jedna faza<disocijacije merena je između 25 i 300 sekundi nakon poslednje injekcije antitela. Regeneracija površine anti-His sprovedena je korišćenjem dve injekcije 10 mM glicin-HCl pH 1,5 tokom 15 sekundi svaka brzinom od 30 µl/min, nakon čega je usledio period stabilizacije od 180 sekundi.>

[0346] <Kinetičke konstante jednog ciklusa su određene gde je to bilo moguće korišćenjem standardnog modela analize 1:1. Za jake interakcije je generalno bilo pogodnije odrediti afinitet putem kinetičkih eksperimenata. Međutim, za nekoliko Fcγ receptora, interakcija je veoma slaba i u ovom scenariju, podaci su analizirani korišćenjem analize afiniteta u stabilnom stanju (koja je posebno pogodna za merenje slabih do umerenih interakcija). Dobijeni su senzorogrami za interakcije Fcγ receptora sa himernim antitelima (podaci nisu prikazani).>

[0348] Kao što se očekivalo, FcγRI receptor visokog afiniteta se vezao sa dobrim afinitetom za<nemodifikovane IgG1 i IgG4 (S241P). Modifikovani IgG1 izotipovi, zajedno sa IgG2 i IgG4 (S241P, L248E), nisu uspeli da se vežu za FcγRI. Preostali Fcγ receptori su pokazali mnogo niži afinitet interakcija za različita himerna antitela u poređenju sa FcγRI. Kao što se očekivalo, nemodifikovani IgG1 je pokazao najjače vezivanje za sva četiri receptora nižeg afiniteta, dok su modifikovane verzije IgG1 pokazale značajno smanjeno vezivanje za ove receptore. IgG2 i IgG4 (S241P) su pokazali izvesno vezivanje za FcγRIIA i B, ali samo marginalno vezivanje za FcγRIIIA i B.>

[0349] <2. Vezivanje genetski modifikovanog Fc dela za C1q kompleks ELISA ogledom>

[0350] <Himerno antitelo 20.1 je testirano kao različiti IgG izotipovi na vezivanje za C1q kompleks kako bi se utvrdila njihova sposobnost da aktiviraju sistem komplementa.>

[0351] <Na ploči sa 96 posudica sa U-dnom, pripremljena je serija razblaženja od 2,5 puta (od 10 µg/ml do 0,04 µg/ml) prečišćenog himernog antitela 20.1 u različitim izotipovima u 2% BSA/DPBS. Nunc Immuno MaxiSorp mikrotitarske ploče sa ravnim dnom i 96 posudica (ThermoFisher Scientific, Loughborough, UK) su prethodno obložene sa 100 µl/posudica ove titarske serije i inkubirane preko noći na 4°C. Sledećeg dana ploča je dva puta isprana sa PBST i blokirana jedan sat na sobnoj>temperaturi sa 2% BSA/DPBS pre nego što je pet puta isprana sa PBST. Prečišćeni komplementni protein C1q (Pathway Diagnostics Ltd, Dorking, UK), razblažen na 5 µg/ml u 2% BSA/PBS, dodat je na ploču (100 µl/posudica) i inkubiran jedan sat na sobnoj temperaturi. Nakon petostrukog ispiranja sa PBST, vezivanje C1q kompleksa je detektovano pomoću anti-C1q-HRP (Abcam, Cambridge, UK) (100 µl/posudica, razblaženo 1:100 u 2% BSA/DPBS) tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Nakon petostrukog ispiranja sa PBST, vezivanje je detektovano pomoću TMB supstrata (ThermoFisher Scientific, Loughborough, UK), nakon čega je reakcija zaustavljena sa 3 M HCl, apsorpcija je očitana na 450 nm na Dynex Technologies MRX TC II čitaču ploča i krive vezivanja su nacrtane.

[0352] <Kao što se očekivalo, samo je nemodifikovani IgG1 izotip pokazao dobro vezivanje za C1q, dok su drugi izotipovi pokazali minimalno ili nikakvo vezivanje (podaci nisu prikazani).>

[0353] <3. Selekcija inženjerskih Fc fragmenata>

[0354] Relativno vezivanje svih testiranih izotipova na Fcγ receptore i C1q kompleks opisano je u Tabeli 6.

[0355] Tabela 6: Relativno vezivanje svih izotipova na Fcγ receptore i C1q kompleks

[0357]

[0359] <Dva genetski modifikovana IgG1 L247F, L248E, P350S i IgG4 S241P, L248E Fc fragmenta bila su>jedina koja su pokazala potpuni gubitak vezivanja za FcγI receptor i C1q kompleks.

[0360] <Na osnovu dobijenih rezultata, dva genetski modifikovana IgG1 L247F, L248E, P350S i IgG4 S241P, L248E izotipa su odabrana za dalju karakterizaciju.>

[0361] <Generisanje 6 humanizovanih antitela>

[0362] <3 odabrane humanizovane varijante su klonirane da bi se spojile sa dva odabrana genetski modifikovana Fc fragmenta, što je dovelo do generisanja 6 različitih kandidata: mAb 1 do mAb 6.>Primeri mAb1 do mAb6, kao što je opisano u Tabeli 1, mogu se proizvesti korišćenjem konvencionalnih procesa rekombinantne proizvodnje i prečišćavanja antitela.

[0363] <Na primer, kodirajuće sekvence su klonirane u proizvodni vektor za rekombinantnu ekspresiju u>ćelijskoj liniji sisara.

[0364] <Sledeće Tabele 7 i 8 pružaju detaljne aminokiselinske i nukleotidne sekvence korisne za primenu>pronalaska, a posebno za proizvodnju nukleinskih kiselina, ekspresionih vektora i humanizovanih<antitela izvedenih iz mišjeg 7.2 ovog pronalaska.>

[0365] Tabela 7: Kratak opis korisnih aminokiselinskih i nukleotidnih sekvenci za primenu pronalaska

[0367]

[0368] <Tabela 8: Kratak opis korisnih aminokiselinskih i nukleotidnih sekvenci za primenu pronalaska u praksi>

[0369]

[0370] <(nastavak)>

[0371]

[0372] <(nastavak)>

[0373]

[0374] <(nastavak)>

[0375]

[0376] <(nastavak)>

[0378]

[0380] Razvojna svojstva 6 humanizovanih varijanti

[0381] 1. Generisanje ćelijskih linija

[0382] <a. Konstrukcija ekspresionog vektora>

[0383] <Sekvence gena koje kodiraju teške i lake lance klonirane su u vektor. Genski sistem je korišćen za>ekspresiju antitela u CHO ćelijama. Ekspresija antitela je bila pod kontrolom EF1 alfa promotera.<Ekspresioni vektori nose jedinstvene genetske elemente koji štite transgen od efekata utišavanja okolnog hromatina (Girod et al., 2007). Transkripcija se održava na maksimalnom nivou i nezavisna je od mesta integracije transgena, što rezultira stabilnom ekspresijom proteina visokog nivoa.>

[0384] b. Razvoj ćelijskih linija

[0386] <Ćelijska linija domaćina CHO je izvedena iz CHO-K1 CCL-61 ćelija iz Američke Kolekcije 124 Tipova Kultura (ATCC) i prilagođena je za rast u suspenziji u hemijski definisanom BalanCD Growth A>medijumu za kulturu (Irvine Scientific). Ćelije su transfektovane elektroporacijom korišćenjem Neon transfekcionog sistema (Invitrogen).

[0388] <c. Kloniranje pojedinačnih ćelija pomoću ClonePix FL uređaja.>

[0390] <Isti medijum (BalanCD Growth A, IrvineScientific) je korišćen kao bazalni medijum za transfekciju, kloniranje pojedinačnih ćelija i proizvodnju kako bi se okruženje ćelija održalo nepromenjenim tokom celog postupka. Nakon transfekcije svakog vektora, primenjen je selekcioni pritisak>puromicina da bi se generisali stabilni pulovi. Razblažene ćelije su posejane u polučvrsti medijum (CloneMedia©; Molecular Devices) i ploče su inkubirane na 37 °C sa 5% CO2, u vlažnom inkubatoru. Proširene kolonije su sakupljene pomoću ClonePix™ FL Imager od Molecular Devices i prebačene na

ploče sa 96 posudica, a zatim proširene prvo na TC ploče sa 24 posudica, a zatim na TC ploče sa 6<posudica.>

[0392] <d. Evaluacija performansi dopunske šaržne kulture>

[0394] <Rast i proizvodni učinak pojedinačnih klonova procenjeni su u bočicama za mućkanje od 125 ml kako bi se odabrali najbolji klonovi prema kriterijumima učinka rasta ćelija i produktivnosti u>10-dnevnom šaržnom procesu hranjenja koristeći Cell Boost7 A+7B dopunu (GE Healthcare, SAD). Dopunske šaržne kulture su započete pri koncentracijama ćelija od 0,3 x 10⁶ ćelija/ml.

[0396] <Dobijeni rezultati za rast i produktivnost ćelija sumirani su u Tabeli 9.>

[0398] <2. Priprema uzoraka za procenu proizvodnosti>

[0400] <Svako kandidatsko antitelo je prečišćeno hvatanjem proteina A iz prečišćenih bazena supernatanta CHO ćelija: dva bazena su bila potrebna za svaku varijantu kako bi se obezbedilo dovoljno materijala za testiranje. Koncentracija proteina je određena za sve uzorke nakon hvatanja UV metodom. Povraćaj uzorka i prinosi bili su veći od 80% za većinu uzoraka i sve varijante su>pokazale slične prinose. Svako antitelo je zatim puferski zamenjeno u 25 mM Histidina, 125 mM NaCl, pH 6,0 koristeći centrifugalne filtere MWCO od 30 kDa dok protok kroz materijal nije dostigao ciljni pH za formulaciju. Tokom koraka zamene, nije bilo indikatora precipitacije proteina ili usporenog protoka tokom zamene ni za jednu od varijanti. Nakon završetka zamene pufera, koncentracija svakog uzorka varijante je podešena na 1,0 mg/ml pomoću pufera za formulaciju, a dodato je 10% PS-80 do konačne koncentracije od 0,02% PS-80.

[0402] <3. Procena termičke stabilnosti>

[0404] Diferencijalna skenirajuća fluorimetrijska analiza je sprovedena radi procene i upoređivanja<termičke stabilnosti testiranih varijanti antitela. Svaka varijanta je analizirana u tri primerka i>srednje vrednosti Tonset, Tagg i Tm su određene za svaki posmatrani termički prelaz (podaci nisu prikazani).

[0405] Nisu primećene značajne razlike između vrednosti T<onset>i T<m>dobijenih za sve testirane varijante.<Utvrđena vrednost Tm1 za sva antitela bila je 61°C, a vrednosti određene za Tonset bile su od 54 do 55°C za sva antitela. Vrednosti Tagg određene na osnovu grafikona za koloidnu stabilnost kretale su se od 71 do 78°C.>

[0407] <Generalno, sve 4 odabrane varijante pokazuju uporedivu termičku stabilnost: primećene varijacije ne dovode do značajnih promena u termičkoj stabilnosti između testiranih antitela.>

[0409] 4. Studije prisilne degradacije

[0411] <a. Agitacija>

[0412] <Uzorci za svaku varijantu su podvrgnuti stresu agitacije na orbitalnom šejkeru podešenom na 500>rpm na sobnoj temperaturi. Jedan uzorak za svaku varijantu je mućkan 24, a drugi uzorak 48 sati. Jedna bočica svake varijante je čuvana na sobnoj temperaturi do 48 sati kao kontrola. Nisu

[0413] <primećene promene u izgledu uzoraka pod stresom u poređenju sa kontrolama: svi uzorci su bili bistri, bezbojni i bez vidljivih čestica (podaci nisu prikazani). Pored toga, nije bilo značajne promene u ukupnom sadržaju proteina određenom UV metodom (podaci nisu prikazani).>

[0415] <Efekti stresa agitacije na stabilnost panela varijanti procenjeni su SEC, redukovanim CGE, neredukovanim CGE i icIEF metodama (podaci nisu prikazani). Nisu primećene značajne promene u stabilnosti testiranih antitela, niti uočljivi trendovi tokom vremena u akumulaciji degradanata>

[0416] <između uzoraka pod stresom agitacije čuvanih na sobnoj temperaturi i uzoraka pod stresom agitacije. % glavnog pika određen u SEC analizi bio je ≥ 99,2% za sve kontrolne i uzorke pod>stresom agitacije. U R-CGE analizi % glavnog pika bio je ≥ 98,5% za sve kontrolne i uzorke pod stresom agitacije. NR-CGE analiza nije otkrila značajne trendove ili promene u % glavnog pika

između kontrolnih i uzoraka pod stresom. Zaključno, nisu primećene značajne razlike u stabilnosti između svih kandidat varijanti.

[0418] <b. Stres smrzavanja-odmrzavanja>

[0420] <Tri uzorka svakog kandidata su alikvotirana u Eppendorf epruvete i podvrgnuta stresu smrzavanja->odmrzavanja. Uzorci su čuvani na -75±10°C, a zatim odmrznuti na sobnoj temperaturi. Jedan uzorak za svakog kandidata je podvrgnut 3 ciklusa smrzavanja-odmrzavanja; drugi 6 ciklusa smrzavanja-odmrzavanja; i treći uzorak 10 ciklusa. Svi stresirani uzorci su bili bistri, bezbojni i bez vidljivih čestica (podaci nisu prikazani), i nije bilo značajne promene u ukupnom sadržaju proteina

[0421] <određenom UV metodom (podaci nisu prikazani).>

[0423] <Efekti stresa smrzavanja-odmrzavanja na stabilnost panela varijanti su procenjeni SEC, redukovanom CGE, neredukovanom CGE i icIEF metodama (podaci nisu prikazani). Stres>smrzavanja i odmrzavanja nije imao uticaja na stabilnost antitela na osnovu SEC, R-CGE i NR-CGE analize.

[0425] <icIEF analiza je otkrila primetne promene u heterogenosti naelektrisanja testiranih antitela.>

[0426] <Koncentracija baznih varijanti se smanjivala u uzastopnim F/T ciklusima, sa najnižom koncentracijom baznih varijanti pri 10X F/T ciklusima u poređenju sa opštim kontrolama. Jedini>izuzetak bila je varijanta IgG17.2 VH2/VK1, kod koje je smanjenje koncentracije baznih varijanti bilo na istom nivou za sve testirane F/T cikluse (videti Tabelu 9). Kod varijanti mAb1, mAb2 i mAb3, nakon 10X F/T ciklusa, bazne vrste su se smanjile za 1,0, 1,3 i 3,4%, respektivno. Smanjenje koncentracije baznih vrsta povezano je sa povećanjem % glavnog pika. Kod varijanti mAb4, mAb5 i<mAb6 smanjenje baznih vrsta je 4,8, 2,8 i 4,7%, respektivno. Promena kod varijante mAb4 je uglavnom povezana sa povećanjem % glavnog pika, dok su promene kod varijanti mAb5 i mAb6 povezane sa povećanjem i % glavnog pika i % kisele varijante.>

[0427] <Generalno, utvrđeno je da je najveća otpornost na promene usled stresa smrzavanja-odmrzavanja>primećena kod varijanti mAb1 (IgG17.2 VH2/VK1) i mAb2 (IgG17.2 VH2/VK2).

[0428] <c. Kiseli pH stres>

[0429] <Uzorci za svakog kandidata su podvrgnuti kiselom pH stresu na sobnoj temperaturi: svaki uzorak je podešen pomoću HCl na pH 3,5 i držan na sobnoj temperaturi 2 sata, 4 sata i 24 sata, nakon čega su uzorci neutralisani sa 1 M Tris, pH 7,0. Svi uzorci su bili bistri, bezbojni i bez vidljivih čestica (podaci nisu prikazani), i nije bilo značajne promene u koncentraciji proteina određenoj UV metodom (podaci nisu prikazani).>

[0430] <Efekti kiselog pH stresa na panel varijanti su procenjeni SEC, redukovanim CGE, neredukovanim CGE i icIEF metodama (podaci nisu prikazani). Nisu otkrivene značajne promene u akumulaciji proizvoda razgradnje tokom vremena za uzorke izložene niskom pH u poređenju sa 48-časovnom>RT kontrolom pomoću R-CGE ili NR-CGE analize. U analizi heterogenosti naelektrisanja, koncentracija baznih varijanti je smanjena u svim uzorcima izloženim kiselom pH stresu, međutim, nisu primećeni jasni trendovi tokom vremena.

[0431] <Najmanji ukupni uticaj kiselog stresa na smanjenje baznih varijanti primećen je za varijante mAb1 (IgG17.2 VH2/VK1) i mAb2 (IgG17.2 VH2/VK2). Ovaj rezultat je u dobroj saglasnosti sa rezultatima dobijenim icIEF u studiji zamrzavanja-odmrzavanja. U SEC analizi, primećeno je da sve varijante akumuliraju neke agregate nakon izlaganja kiselom stresu, što je povezano sa smanjenjem % glavnog pika, međutim, nisu primećeni jasni trendovi tokom vremena. Generalno, akumulacija agregata bila je oko 9 puta veća za IgG4 varijante u poređenju sa IgG1 varijantama. Akumulacija agregata za IgG1 varijante bila je 0,3 do 1,0% za sve uzorke kiselog stresa, a za IgG4 varijante akumulacija je bila 4,3 do 7,8% za uzorke stresa, što je značajno više (videti Tabelu 9).>

[0432] Zaključno, utvrđeno je da je najveća otpornost na kiseli stres primećena kod varijanti mAb1 (IgG1<7.2 VH2/VK1) i mAb2 (IgG17.2 VH2/VK2).>

[0433] <d. Toplotni stres>

[0434] <Uzorci za svaku varijantu su podvrgnuti toplotnom stresu u toplotnom bloku na 50°C tokom 3 dana,>1 nedelje i 2 nedelje, a zatim su upoređeni sa skupom opštih kontrolnih uzoraka čuvanih na 2 - 8°C. Testiranje izgleda uzoraka je vršeno periodično i nisu primećeni dokazi o razdvajanju faza, promeni neprozirnosti ili taloženju. Svi uzorci su bili bistri, bezbojni i bez vidljivih čestica za sve vremenske

tačke (podaci nisu prikazani). Pored toga, nije bilo značajne promene u koncentraciji proteina određenoj UV metodom (podaci nisu prikazani).

[0435] <Efekti toplotnog stresa na panel varijanti su procenjeni SEC, R-CGE, NR-CGE i icIEF metodama. Rezultati su pokazali da su sve varijante bile podložne toplotnom stresu.>

[0437] <U SEC analizi, primećeni su jasni trendovi povećanja koncentracije agregata u funkciji vremena za>sve testirane varijante. Značajno veća akumulacija agregata je primećena za IgG4 varijante u

[0438] <poređenju sa IgG1. Posle dve nedelje, povećanje % ukupnih agregata kretalo se od 33,7 do 44,7% za IgG4 varijante, ali samo 13,0 do 18,2% za IgG1 varijante (videti Tabelu 9). Pored toga, varijante mAb1 (IgG17,2 VH2/VK1) i mAb2 (IgG17,2 VH2/VK2) akumulirale su manje agregata nego kontrolno mAb3 (IgG120,1 VH3/VK1).>

[0440] <U R-CGE analizi, primećeni su jasni trendovi smanjenja čistoće (definisane kao smanjenje % LC>+HC) u zavisnosti od vremena za sve testirane varijante, međutim, nisu primećene značajne razlike u stabilnosti između njih. Nivo razgradnje uzoraka bio je uporediv za sva testirana antitela (podaci nisu prikazani). Slično tome, NR-CGE podaci su otkrili jasne trendove smanjenja čistoće (definisane kao smanjenje glavnog vrha) u zavisnosti od vremena za sve testirane varijante. Značajno niža

[0441] <čistoća je primećena za IgG4 varijante u poređenju sa IgG1 (podaci nisu prikazani). Nakon dve nedelje, % čistoće je smanjen za 34,8 do 41,7% za IgG4 varijante, ali samo za 20,0 do 30,0% za IgG1 varijante (podaci nisu prikazani). Pored toga, varijante mAb1 (IgG17,2 VH2/VK1) i mAb2 (IgG17,2>VH2/VK2) pokazale su manju degradaciju od mAb3 IgG120,1 VH3/VK1. Za IgG1 antitela, smanjenje glavnog pika je prvenstveno praćeno povećanjem nečistoća (fragmenata) na prednjem glavnom piku. Međutim, za IgG4 antitela, akumulacija i nečistoća (fragmenata) na prednjem glavnom piku i

nečistoća (agregata) na zadnjem glavnom piku je primećena kao funkcija smanjenja glavnog pika<(podaci nisu prikazani). Ovaj rezultat je u dobroj saglasnosti sa SEC podacima gde je primećena>

[0442] <značajno veća koncentracija agregata za IgG4 antitela u poređenju sa IgG1.>

[0444] Uzorci od 1 nedelje za IgG4 varijante bili su previše degradirani za analizu pomoću icIEF, a uzorci<od 2 nedelje za sve varijante bili su previše degradirani za analizu. Zato su samo podaci od 3 dana>korišćeni za procenu promena u heterogenosti naelektrisanja između testiranih antitela. Razlika u<čistoći, određena % glavnog pika, bila je 12,4 do 14,4% za IgG1 uzorke i 16,0 do 16,6% za IgG4 uzorke (podaci nisu prikazani).>

[0446] <Ukupno, pokazano je da je degradacija pri toplotnom stresu bila veća za IgG4 varijante u poređenju>sa IgG1 varijantama, i to je primećeno u svim vremenskim tačkama. Analiza pokazuje da su varijante mAb1 (IgG17,2 VH2/VK1) i mAb2 (IgG17,2 VH2/VK2) najmanje podložne toplotnom stresu i ovaj rezultat je u skladu sa podacima dobijenim za stresove smrzavanja-odmrzavanja i kisele pH vrednosti.

[0448] <Selekcija najboljeg kandidata u smislu svojstava razvoja>

[0450] Što se tiče produktivnosti u ćelijskim linijama, najbolji rezultati su dobijeni sa humanizovanom<varijantom mAb1 (7.2 VH2/VK1), sa gustinom održivih ćelija koja je dostigla 54 x 10⁶ održivih>

[0451] <ćelija/ml nakon 10 dana za mAb1.>

[0453] <U studiji termičke stabilnosti, uzorci su procenjeni u standardnoj matrici DSF analizom kako bi se>odredili Tonset, Tm i Tagg za svakog kandidata. Nisu primećene varijacije u Tonset i Tm1, a Tagg je bio veći

od 70°C za sve varijante. Rezultati ukazuju da mAb1, mAb2, mAb4 i mAb5 pokazuju uporedivu<termičku stabilnost.>

[0454] <U studiji prisilne degradacije, uzorci su bili izloženi agitaciji, smrzavanju-odmrzavanju, kiselom pH i toplotnim stresovima. Rezultati ukazuju da je panel kandidatskih varijanti bio podložan degradaciji>u različitim stepenom pod relevantnim uslovima stresa:

[0455] <• Nije primećen značajan odgovor na stres agitacije nijednom od analitičkih metoda.>

[0456] <• SEC ili CGE metodama nije primećen značajan odgovor na stres smrzavanja-odmrzavanja,>međutim, icIEF analiza je otkrila razlike u heterogenosti naelektrisanja između testiranih varijanti i pokazala da su varijante mAb1 (IgG17.2 VH2/VK1) i mAb2 (IgG17.2 VH2/VK2) pokazale najveću otpornost na promene izazvane stresom smrzavanja-odmrzavanja.

[0457] <• icIEF i SEC su primećeni odgovor na stres kisele pH vrednosti, pri čemu su svi kandidati akumulirali neke nečistoće nakon izlaganja. Varijante mAb1 (IgG17.2 VH2/VK1) i mAb2 (IgG17.2 VH2/VK2) pokazale su najveću otpornost na stres kisele pH vrednosti.>

[0458] <• Najznačajniji primećeni odgovor na stres bio je na skladištenje uzorka na 50°C. SEC, NR-CGE i icIEF analize su otkrile značajan trend smanjenja čistoće uzorka tokom vremena. Primećeno smanjenje čistoće bilo je konstantno veće za IgG4 varijante u poređenju sa IgG1 varijantama. U grupi IgG1 varijanti, mAb1 (7.2 VH2/VK1) i mAb2 (IgG17.2 VH2/VK2) pokazali su najveću otpornost na kiseli toplotni stres.>

[0459] <Rezultati svojstava razvoja različitih humanizovanih kandidata sumirani su u Tabeli 9 ispod:>

[0460] <Tabela 9: mAb1 humanizovani kandidat ima viša razvojna svojstva u poređenju sa svim ostalim>testiranim humanizovanim varijantama

[0462]

[0463]

[0466] <1 Promena u % Osnovnih Varijanti izračunata je na osnovu nezaokruženih rezultata, oduzimanjem % osnovnih varijanti stresiranih uzoraka od onog kod odgovarajućeg kontrolnog uzorka.>

[0467] <Kao zaključak, varijanta mAb1 je pokazala najbolje rezultate u pogledu razvojnosti i izabrana je kao>vodeći kandidat.

[0468] Funkcionalna svojstva humanizovanih varijanti mAb 7.2 kao monovalentnih i bivalentnih molekula

[0469] 1. Priprema Fab i Fab<2>fragmenata

[0470] <a. Digestija pepsinom za generisanje F(ab’)2>

[0471] <Imobilizovani pepsin u 50% suspenziji (Thermo Scientific komplet, Cat n° 44988) je puferski zamenjen u pufer za digestiju (20 mM Natrijum acetat pH 4,4) centrifugiranjem suspenzije na 5000g 2 min. Supernatant je odbačen, a suspenzija je resuspendovana u 1 mL pufera za digestiju, nakon čega je usledilo još jedno centrifugiranje na 5000g 2 min. Ovaj korak je ponovljen još četiri>puta (ukupno pet ispiranja smole). Smola je zatim resuspendovana u puferu za digestiju do originalne zapremine suspenzije.

[0472] <mAb 4, mAb 5 i mAb 6 (7.2 VH2/VK1, 7.2 VH2/VK2 ili 20.1 VH3/VK1 IgG4 varijante) su puferski zamenjeni u pufer za digestiju korišćenjem Zeba Spin kolone od 5 ili 10 mL (zavisno od skale) i koncentrovani do 3 mg/mL korišćenjem Vivaspin koncentratora (10.000 MWCO) prema protokolu>proizvođača.

[0473] <mAb 4, 5 i 6 u koncentraciji od 3 mg/mL (prethodno puferski zamenjen u puferu za digestiju) su pomešani sa pepsinom imobilizovanim na smoli i inkubirani na 37°C rotirajući, 1,5 - 2 sata.>

[0474] <Smeše za digestiju su centrifugirane na 5000 g tokom 2 minuta. Supernatanti su uklonjeni i filtrirani>u novu epruvetu koristeći odgovarajući špric i mali filter od 0,22 µm (Merck Millipore, Millex Cat n° SLGV004SL). Smole su isprane sa 1 mL PBS, centrifugirane na 5000 g tokom 1 minuta. Supernatanti su uklonjeni, filtrirani i spojeni sa prethodnim supernatantima. Korak ispiranja je ponovljen.

[0475] <Digestirani i filtrirani supernatanti su prečišćeni korišćenjem HiLoad 16/600200 pg kolone za>isključivanje po veličini koristeći 10 mM Natrijum acetata, 100 mM NaCl, pH 5,5 kao mobilnu fazu. Frakcije koje odgovaraju eluiranom F(ab’)2 fragmentu su spojene, koncentrovane i sterilno<filtrirane.>

[0476] <F(ab’)2 fragmenti su analizirani SDS-PAGE, analitičkom SEC i OD280nm očitavanjem.>

[0477] <b. Digestija papaina za generisanje Fab>

[0478] <Imobilizovani papain u 50% suspenziji (Thermo Scientific komplet, Cat n° 20341) je puferski zamenjen u pufer za digestiju (20 mM Natrijum Fosfat, 10 mM EDTA, 150 mM Cistein pH 7,0) centrifugiranjem suspenzije na 5000 g 2 min. Supernatant je odbačen, a suspenzija je resuspendovana u većoj zapremini pufera za digestiju, nakon čega je usledilo još jedno>centrifugiranje na 5000 g 2 min. Ovaj korak je ponovljen još četiri puta (ukupno pet ispiranja smole). Smola je zatim resuspendovana u puferu za digestiju do originalne zapremine suspenzije. mAb 4, mAb 5 i mAb 6 (7.2 VH2/VK1, 7.2 VH2/VK2 ili 20.1 VH3/VK1 IgG4 varijante) su puferski zamenjeni u pufer za digestiju korišćenjem Zeba Spin kolone od 5 ili 10 mL (u zavisnosti od skale) i koncentrovani do 3 mg/mL korišćenjem Vivaspin koncentratora (10.000 MWCO) prema protokolu<proizvođača.>

[0479] <mAb 4, 5 i 6 u koncentraciji od 3 mg/mL (prethodno puferski zamenjen u puferu za varenje) su>pomešani sa papainom imobilizovanim na smoli i inkubirani na 37°C rotirajući, 42 sata.

[0480] <Smeše za digestiju su centrifugirane na 5000 g tokom 2 minuta. Supernatanti su uklonjeni i filtrirani u novu epruvetu korišćenjem odgovarajućeg šprica i malog filtera od 0,22 µm (Merck Millipore, Millex Cat n° SLGV004SL). Smole su isprane tri puta sa PBS, centrifugirane na 5000g 1 min,>sakupljajući i objedinjujući supernatant u svakom ciklusu. Objedinjene frakcije su zatim filtrirane u novu epruvetu korišćenjem odgovarajućeg šprica i malog filtera od 0,22 µm. Digestirani i filtrirani supernatanti su prvo puferski zamenjeni u 1xDPBS, pH 7,4, zatim prvo prečišćeni korišćenjem kolone sa proteinom A da bi se uklonili Fc i nedigestirani mAb, nakon čega je usledio korak<poliranja korišćenjem kolone za isključivanje po veličini (SEC) sa 10 mM natrijum acetata, 100 mM NaCl, pH 5,5 kao mobilnom fazom. Frakcije koje odgovaraju eluiranim Fab fragmentima su objedinjene, koncentrovane i sterilno filtrirane.>

[0481] <Fab fragmenti su analizirani sa SDS-PAGE, analitičkim SEC i OD280nm očitavanjem.>

[0482] 2. Merenje afiniteta humanizovanih 7.2 i 20.1 Fab, F(ab’)<2>fragmenata i IgG formata<korišćenjem Biacore>

[0483] <Da bi se procenio afinitet humanizovanih 7.2 i 20.1 antitela za BTN3A1 u njihovim različitim formatima (Fab, F(ab’)2 i IgG), sprovedena je kinetička analiza jednog ciklusa korišćenjem Biacore T200 (serijski broj 1909913) instrumenta sa Biacore T200 Control software V2.0.1 i Evaluation>software V3.0 (GEHealthcare, Uppsala, Švedska). Svi kinetički eksperimenti jednog ciklusa su sprovedeni na 25°C sa HBS-P+ puferom za rad (pH 7,4) koji sadrži 0,1% BSA (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).

[0484] <BTN3A1 His-označeni antigen (SinoBiological, Peking, Kina) je razblažen u puferu za rad do>konačne koncentracije od 0,4 µg/ml. Na početku svakog ciklusa, BTN3A1-His je hvatan na Fc2 CM5 senzorskog čipa pre-kuplovanog pomoću kompleta za hvatanje His (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) sa standardnom aminskom hemijom pri protoku od 10 µl/min. Nivo imobilizacije (RL) od ~ 34<RU, 16 RU ili 11 RU, različite teorijske vrednosti za dobijanje RMax od ~ 50 RU, korišćen je za analite Fab, F(ab’)2 i IgG, respektivno. Površina je zatim ostavljena da se stabilizuje. Kinetički podaci>jednog ciklusa dobijeni su sa prečišćenim uzorcima (Fab, F(ab’)2 i IgG) pri protoku od 40 µl/min kako bi se minimizirali svi potencijalni efekti prenosa mase. Signal iz referentnog kanala Fc1 (bez hvatanja antigena) je oduzet od signala Fc2 da bi se korigovale razlike u nespecifičnom vezivanju za referentnu površinu. Signal za BTN3A1-His slepe probe (bez analita) su oduzeti da bi se korigovale<razlike u stabilnosti površine. Faza asocijacije za pet injekcija rastućih koncentracija praćena je po 240 sekundi svaki put, a jedna faza disocijacije merena je 1400 sekundi nakon poslednje injekcije analita. Regeneracija površine čipa sprovedena je korišćenjem dve injekcije 10 mM glicin-HCl pH 1,5, nakon čega je usledio period stabilizacije od 240 sekundi. Sirovi senzogrami su uklopljeni sa 1:1 modelom za Fab uzorke i sa bivalentnim modelom analita za F(ab’)2 i IgG uzorke u skladu sa>različitim valencama analita. Kinetičke konstante su izračunate za svaku varijantu (videti Tabele 10, 11 i 12).

[0485] <Tabela 10: Kinetička IgG analiza u jednom ciklusu>

[0486]

[0488] <Tabela 11: Kinetička F(ab’)2 analiza u jednom ciklusu>

[0489]

[0491] <Tabela 12: Kinetička Fab analiza u jednom ciklusu>

[0493]

[0495] <3. Selekcija najboljeg kandidata u smislu afinitetnih svojstava>

[0496] <Humanizovane varijante 20.1 i 7.2 pokazale su značajne razlike u smislu afinitetnih svojstava. Ove>razlike se mogu primetiti kod IgG i F(ab’)2 formata, ali je razlika još veća kod Fab fragmenata: zaista, 20.1 je pokazao srednju KD vrednost od 20,30 nM, dok je 7.2 pokazao srednju KD vrednost od 3,22 (VH2/VK1) ili 3,01 (VH2/VK2).

[0497] 4. Avidnost vezivanja mAb 1 za primarne T ćelije i druge ćelijske linije

[0498] Zatim, avidnost vezivanja mAb1 je procenjena protočnom citometrijom na humanim primarnim T<ćelijama, kao i na različitim ćelijskim linijama, uključujući WT i BTN3A knock-out rekonstituisane sa BTN3A1, BTN3A2 ili BTN3A3 izoformama pojedinačno (Podaci nisu prikazani). Vrednosti EC50 dobijene za svaki testirani tip ćelija sumirane su u Tabeli 13.>

[0500] <Podaci dobijeni u BTN3A KO ćelijama jasno su pokazali da se mAb1 specifično vezuje za svoj cilj.>Pored toga, rekonstitucija sa pojedinačnim izoformama potvrdila je da mAb1 prepoznaje BTN3A1, BTN3A2 i BTN3A3 sa uporedivim aviditetom. Sve ostale testirane ćelije su izgledale pozitivne na vezivanje mAb1 sa rasponom vrednosti EC50 koje su se kretale od 9,6 nM za ćelijsku liniju Burkitovog limfoma Daudi do 112,3 nM za ćelijsku liniju kolorektalnog adenokarcinoma HT29.

[0502] Tabela 13: Aviditet vezivanja mAb1 na humanim ćelijama.

[0504]

[0507] 5. mAb1 se ne vezuje van cilja

[0508] <Potencijal za vezivanje mAb1 van cilja na druge molekule koji nisu BTN3A procenjen je pomoću Retrogenix tehnologije. Cilj ovog rada je bio da se demonstrira odsustvo vezivanja van cilja skriningom ćelijskog niza koji ekspresuje >5000 humanih membranskih receptora ili sekretovanih>proteina eksprimiranih na površini HEK293 ćelija (Retrogenix platforma).

[0510] <Istraživanje nivoa vezivanja mAb1 za netransfektovane HEK293 ćelije i za ćelije koje prekomerno ekspresuju BTN3A1, pre ili posle fiksacije ćelija, pokazalo je da je 5 µg/ml na fiksiranim ćelijama pogodan uslov za skrining. Pod ovim uslovom, mAb1 je testiran na vezivanje za humane HEK293>ćelije, pojedinačno ekspresujući 5528 humanih proteina, koji se sastoje od proteina ćelijske membrane i proteina sekretovanih na površini ćelija. Ovo je otkrilo deset primarnih pogodaka.

[0511] Svaki primarni pogodak je ponovo ekspresovan, zajedno sa dva kontrolna receptora (CD20 i EGFR),<i ponovo testiran sa 5 µg/ml mAb1, 5 µg/ml izotipskog kontrolnog antitela i drugim pozitivnim i negativnim kontrolnim tretmanima. Nakon uklanjanja pet nespecifičnih pogodaka, preostalo je pet>specifičnih interakcija za testirano antitelo. Svih 5 specifičnih pogodaka bilo je povezano sa BTN3A;<dve izoforme BTN3A1, dve izoforme BTN3A2 i jedna izoforma BTN3A3.>

[0513] Zaključci studije su da nisu identifikovane interakcije van cilja za mAb1, što ukazuje na visoku specifičnost mAb1 za njegov BTN3A epitop.

[0515] <6. mAb1 posreduje u aktivaciji Vγ9Vδ2 T ćelija i ubijanju ćelija tumora>

[0517] <Prvobitno je pokazano da mišja anti-BTN3A mAb pokreću prepoznavanje BTN3A od strane Vγ9Vδ2 T ćelija, posredujući u aktivaciji koja dovodi do (i) proliferacije ovog specifičnog podskupa u ljudskim PBMCs, (ii) proizvodnje citokina (IFNγ i TNFα) i (iii) citolize inficiranih ili transformisanih>ciljnih ćelija (npr. By Perforin, granzimi, TRAIL) (Harly et al, Blood, 2012 & Benyamine, A. et al. 2016, Oncoimmunology 5, e1146843).

[0519] <Bez vezivanja za bilo koju posebnu teoriju, predloženi mehanizam delovanja mAb1 je da njegovo vezivanje za BTN3A eksprimiran na površini ciljne ćelije tumora pokreće konformacionu promenu koja omogućava njegovu signalizaciju njegovom kontra-receptoru na Vγ9Vδ2 T ćelijama. Aktivnost anti-BTN3A antitela se rutinski procenjuje korišćenjem in vitro testa zasnovanog na ko-kulturi>ćelijske linije tumora (ciljne) sa primarnim ljudskim Vγ9Vδ2 T ćelijama (efektor) prethodno

ekspanziranim iz PBMCs zdravih donora tokom 10 do 14 dana, u prisustvu rHulL-2 (200 Ul/mL) i<aminobisfosfonata (Zometa, 1 µM). Na kraju faze ekspanzije, čistoća Vγ9Vδ2 T ćelija se procenjuje>protočnom citometrijom, a ove ćelije se zatim zamrzavaju za buduću upotrebu. Dan pre

eksperimenta, ekspanzirane Vγ9Vδ2 T ćelije se odmrzavaju i kultivišu preko noći sa 200 Ul/mL<rHuIL-2 kako bi se održalo preživljavanje in vitro. Nakon ko-kulture, aktivacija Vγ9Vδ2 T ćelija se prati ili detekcijom ekspresije CD107a/b na γδ T ćelijama protočnom citometrijom, ili kvantifikacijom aktivacije Caspase 3/7, kao mere ubijanja ciljnih ćelija.>

[0521] <Prvo, ljudske Vγ9Vδ2 T ćelije umnožene od 3 različita zdrava donora PBMCs su ko-kultivisane sa>Daudi ćelijskom linijom (ATCC-CCL213; Burkitov limfom) sa rastućim koncentracijama mAb1. Nakon 4 sata, ćelije su analizirane na ekspresiju CD107a/b u Vγ9Vδ2 T ćelijama protočnom citometrijom. Rezultati su pokazali povećanje procenta Vγ9Vδ2 T ćelija koje ekspresuju CD107a/b, povezano sa koncentracijom, sa srednjom vrednošću EC50 od 0,89 nM (+/-0,39) (Slika 1A).

[0522] <Paralelno, procenili smo citolitičku aktivnost Vγ9Vδ2 T ćelija protiv Daudi ćelija pulsiranih mAb1. Kao što je prikazano na Slici 1B, mAb1 je indukovao apoptozu ciljnih ćelija na način zavisan od koncentracije, sa EC50 od 0,35 nM. Pored toga, testirana je aktivacija Vγ9Vδ2 T ćelija (CD107a/b;>gornji panel Slike 1C) i liza tumorskih ćelija (Casp3/7; donji panel Slike 1C) korišćenjem ćelijskih linija tumora iz različitog tkivnog porekla i upoređena sa Daudi ćelijama. Rezultati su pokazali da su aktivacija Vγ9Vδ2 T ćelija, i naknadna liza tumorskih ćelija, indukovani vezivanjem mAb1 za

ćelijske linije L-IPC (duktalni adenokarcinom pankreasa), A549 (epitelne ćelije karcinoma pluća) i<HT29 (kolorektalni adenokarcinom).>

[0523] 7. mAb1 pojačava ubijanje Vγ9Vδ2 T-ćelija širokog spektra humanih ćelijskih linija koje ekspresuju BTN3A, bez obzira na njihovo tkivno poreklo.

[0524] a. Materijal & Metode.

[0525] Kultura tumorskih ćelija

[0526] HL-60 su ćelijska linija humanog promijeloblasta izvedena iz akutne promijelocitne leukemije. Daudi je ćelijska linija humanog B limfoblasta izvedena iz Burkitovog limfoma. Jurkat je ćelijska<linija akutne T ćelije leukemije.>

[0527] HT-29 i HCT116 su humane epitelne ćelije izvedene iz kolorektalnog adenokarcinoma.

[0528] PC3 i DU145 su izvedene iz karcinoma prostate (metastatsko mesto, kost i mozak, respektivno).

[0529] SUM159 i MDA-MB-231 su ćelijske linije trostruko negativnog kancera dojke (TNBC).

[0530] <Ćelije HL60, Daudi, Jurkat, DU145 i MDA-MB-231 su kultivisane u RPMI Glutamax, 10% FBS; 1 mM Natrijum Piruvata na 37°C/5% CO2. PC3 i HT-29 su kultivisane u DMEM 10% FBS, 1 mM Natrijum>Piruvata na 37°C/5% CO2. HCT116 su kultivisane u McCoy 5a medijumu sa 10% SVF. SUM159 su<kultivisane u F12 Nut Mix 1X+ Glutamax, 5% SVF, Hidrokortizon 2mg/ml, Insulin humalog 2mg/ml i ne-esencijalne aminokiseline.>

[0531] <In vitro ekspanzija Vγ9Vδ2 T-ćelija.>

[0532] <Periferne mononuklearne ćelije krvi (PBMC) su izolovane centrifugiranjem periferne krvi dobijene od Etablissement Français du Sang Provence Alpes Côte d’Azur (Francuska) u gradijentu gustine>Ficoll. Da bi se Vγ9Vδ2 T ćelije razmnožile, 50.106 PBMC je resuspendovano na 1,5x106 ćelija/ml u RPMI1640 dopunjenom sa 10% FBS i 1% natrijum piruvata u bočicama od 75 cm2 tokom 10 do 14 dana, u prisustvu rHulL-2 (200 Ul/mL) i aminobisfosfonata (Zoledronat, 1 µM). Od 5. dana, rHuIL-2 je obnavljan svaka 2 ili 3 dana, a ćelije su čuvane na 1x106/ml. Na kraju faze razmnožavanja, čistoća

Vγ9Vδ2 T ćelija je procenjena protočnom citometrijom, i ako je broj Vγ9Vδ2 T ćelija dostigao 80%<živih ćelija, ove ćelije su zatim zamrznute u FBS 20% DMSO za buduću upotrebu.>

[0534] Prečišćavanje Vγ9Vδ2 T-ćelija iz humanog PBMC.

[0535] <Sveže humane PBMC su resuspendovane na 50.106 ćelija/ml u PBS 2% FBS 1mM EDTA. Vγ9Vδ2 su izolovane korišćenjem EasySep™ kompleta za izolaciju ljudskih gama/delta T ćelija (Stemcell #>19255) prema uputstvima proizvođača. Na kraju postupka, čistoća ćelija je merena protočnom citometrijom. Žive CD3+ Vγ9+ ćelije su bile veće od 80%.

[0537] <Test ubijanja Vγ9Vδ2 T-ćelija.>

[0539] 10.000 proširenih ili svežih Vγ9Vδ2 T-ćelija je ko-kultivisano sa tumorskim ćelijskim linijama u pločama sa 96 posudica u naznačenom odnosu (E:T 1:1 ili 1:5) u RPMI 1640 glutamaks, 10% FBS<+ 1mM NaPy u prisustvu mAb1 ili relevantne izotipske kontrole. Kada je dodat u ko-kulturu,>rHuIL-2 je korišćen u koncentraciji od 20 IU/ml. Nakon naznačenog vremena, ATP je meren pomoću Glo reagensa (Promega # G7572) koji generiše luminescentni signal proporcionalan broju<živih ćelija.>

[0541] <b. Rezultati>

[0543] Pored metode zasnovane na bojenju ciljnih ćelija kaspazom 3/7 za praćenje ubijanja nakon ko-<kulture sa Vγ9Vδ2 T-ćelijama, razvili smo komplementarni pristup zasnovan na proceni broja održivih ćelija u kulturi na osnovu kvantifikacije prisutnog ATP, indikatora metabolički aktivnih>ćelija.

[0545] Ovim ogledom, pratili smo preživljavanje ćelijske linije akutne mijeloidne leukemije HL60-WT, ili<-BTN3A-KO, 24 sata nakon ko-kulture sa proširenim Vγ9Vδ2 T-ćelijama (odnos E:T 1:1) u prisustvu mAb1 ili relevantne izotipske kontrole /-rHulL-2 (20 IU/ml) (Slika 2A). Rezultati su pokazali>smanjenje preživljavanja HL60-WT zavisno od koncentracije u prisustvu mAb1, što ukazuje na efikasno ubijanje ciljnih tumorskih ćelija zavisno od BTN3A od strane aktiviranih Vγ9Vδ2 T-ćelija.<Slični eksperimenti su sprovedeni sa in-vitro proširenim ili sveže izolovanim Vγ9Vδ2 T-ćelijama>(Slika 2B i 2C respektivno), a vijabilnost ćelija je merena tokom perioda od 4 dana.

[0547] <Slika 2B je pokazala da in vitro proširene Vγ9Vδ2 T-ćelije kontrolišu proliferaciju HL60-WT na>način zavisan od koncentracije. Dodavanje rHu-IL2 poboljšava kapacitet ubijanja efektorskih ćelija tokom vremena, verovatno obezbeđivanjem signala preživljavanja potrebnih za in-vitro kulturu primarnih T-ćelija. Slični rezultati su dobijeni sa svežim Vγ9Vδ2 T-ćelijama izolovanim iz humanog PBMC, ko-kultivisanih 4 dana sa HL60-WTat E:T odnosom 1:1 i 1:5. Ovi rezultati ukazuju na kapacitet pojedinačnih Vγ9Vδ2 T-ćelija da više puta angažuju i ubijaju više tumorskih meta nakon mAb1-posredovane aktivacije (Slika 2C).

[0549] <Zatim, koristili smo ovaj test da pratimo aktivnost ubijanja Vγ9Vδ2 T-ćelija posredovanih mAb1>protiv ćelijskih linija koje ekspresuju BTN3A iz različitog tkivnog porekla (debelo crevo, dojka, prostata, T limfom i Burkitov limfom). Ćelije HT29, PC3, DU145, MDA-MB-231, HCT116, SUM159, Jurkat i Daudi su ko-kultivisane preko noći sa in-vitro ekspandiranim Vγ9Vδ2 T-ćelijama u prisustvu rastuće koncentracije mAb1 i merena je vijabilnost ćelija. Rezultati su potvrdili da mAb1 poboljšava ubijanje Vγ9Vδ2 T-ćelija širokog spektra humanih ćelijskih linija koje ekspresuju BTN3A, bez obzira na njihovo tkivno poreklo (Slika 3).

[0551] Tabela 15: 10.000 tumorskih ćelija je ko-kultivisano 24 sata sa in-vitro ekspandiranim Vγ9Vδ2 T-ćelijama (odnos E:T 1:1) u prisustvu različitih koncentracija mAb1. Vijabilnost ćelija je merena<korišćenjem bioluminescentnog testa kojim se detektuju nivoi ATP. Navedene su vrednosti>bioluminescencije x105.

[0553]

[0556] 8. mAb1 poboljšava terapiju Vγ9Vδ2 T ćelijama u modelu miša sa graftovanim humanim<ćelijskim linijama AML.>

[0558] Pošto ciljni mAb1 BTN3A nije ekspresovan kod glodara, a podpopulacija Vγ9Vδ2 T ćelija je specifična za primate, eksperimentalni dokaz koncepta anti-tumorske aktivnosti Vγ9Vδ2 T ćelija se<obično testira na imunokompromitovanim NSG miševima kojima su graftovane humane ćelijske linije tumora koje ekspresuju BTN3A, i adoptivno prebačene sa Vγ9Vδ2 T ćelijama od zdravih ljudskih donora (Vγ9Vδ2 T ćelije u takvim rekonstitucijama su alogene ćelijskoj liniji tumora). Ovi modeli su široko korišćeni za validaciju antitumorskog terapeutskog potencijala Vγ9Vδ2 T ćelija u>širokom spektru čvrstih, kao i hematoloških maligniteta (Pauza, C. D. et al. 2018, Immunol. 9).

[0559] <Pored toga, opisano je da mišje anti-humano BTN3A antitelo, m20.1, primenjeno miševima koji su primili humane Vγ9Vδ2 T ćelije, poboljšava preživljavanje životinja i smanjuje leukemijsko>opterećenje u krvi i koštanoj srži miševa sa AML i NGS (benyamine et al 2016, videti gore). U ovom modelu, m20.1 je ubrizgan u kombinaciji sa RLI, rHuIL-15/IL-15Rα fuzionim proteinom za koji je pokazano da proširuje podskupove antitumorskih limfocita i poboljšava njihovo preživljavanje kod

miševa, što dovodi do bolje antitumorske aktivnosti prenetih humanih Vγ9Vδ2 T ćelija.

[0561] <Za dalju karakterizaciju efikasnosti mAb1 u in vivo modelima na miševima, istražili smo potencijal transfera humanih Vγ9Vδ2 T ćelija u kombinaciji sa mAb1 da odloži rast tumora i poboljša preživljavanje životinja kod miševa sa AML i NGS.>

[0563] a. Model U937.

[0564] <Zdrave ženke miševa stare 6-8 nedelja (n=30) primile su 0,2x106 ćelija U937 transdukovanih>luciferazom nultog dana, kao što je opisano u Gertner-Dardenne, J. et al.2012. J. Immunol. 188,<4701-4708. Prvog dana, tumorsko opterećenje je procenjeno korišćenjem bioluminescentnog snimanja i miševi su nasumično raspoređeni u šest grupa da bi primili intravenske injekcije in-vitro>utrošenih humanih Vγ9Vδ2 T ćelija prvog dana (3x10<6>ćelija) same ili u kombinaciji sa anti-BTN3A<mAb1 ili relevantnom izotipskom kontrolom (10 mg/kg, 200 ug/miš). Tretman je ponovljen 7. dana. U grupi 2 i 4, antitela su takođe primenjena 4. i 10. dana. Pošto kompleksi rHuIL-15/rHuIL15->Rα omogućavaju proliferaciju Vγ9Vδ2 T ćelija (J. Immunol. (2006) 177, 6072-608), ovi kompleksi

su primenjeni zajedno sa Vγ9Vδ2 T ćelijama.

[0566] <Sve grupe su opisane u Tabeli 16.>

[0568] <hIL-15/IL-15R-Fc kompleksi su prethodno kompleksovani na sobnoj temperaturi (RT) 30 minuta pre injekcije (0,2 ug hIL-15 1,2 ug IL-15R-Fc po mišu) i pomešani sa Vγ9Vδ2 T ćelijama pre injekcije. Konačna zapremina za svaku injekciju bila je 100 µl. Terapeutska mAb su injektirana 4>sata pre graftovanja Vγ9Vδ2 T ćelija.

[0570] <Naši rezultati su potvrdili da infuzija Vγ9Vδ2 T ćelija plus rHuIL-15/rHuIL15-Rα smanjuje>opterećenje tumorom. Ovaj efekat je bio još upečatljiviji i povezan je sa značajnim povećanjem preživljavanja kada je dodato anti-BTN3A mAb1 zajedno sa Vγ9Vδ2 T ćelijama (Tabela 16 i 17).

Važno je napomenuti da je Citarabin (Ara-C), jedan od najefikasnijih lekova za lečenje akutne<mijeloidne leukemije, korišćen u ovom veoma agresivnom modelu miševa (10 mg/kg kod NSG miševa sa U937 tumorom), poboljšao preživljavanje miševa za 2 do 3 dana (~10%), kao što je>primećeno kod mAb1 u kombinaciji sa transferom humanih Vγ9Vδ2 T ćelija.

[0572] Ovi podaci ističu snažan antileukemijski efekat koji ima anti-BTN3A mAb u kombinaciji sa<imunoterapijom Vγ9Vδ2 T ćelija in vivo.>

[0574] Tabela 16: U937 AML model miševa: opis grupe.

[0576]

[0579] Tabela 17: Anti-BTN3A (mAb1) Aktivirajuće mAb ima Anti-leukemijsku Aktivnost In Vivo u AML Ksenograft Modelima. Podaci o Bioluminiscenciji U937 modela.

[0580]

[0582] Tabela 18: Anti-BTN3A (mAb1) Aktivirajuće mAb ima Anti-leukemijsku Aktivnost In Vivo u AML Ksenograft Modelima. Preživljavanje nakon ugrađivanja ćelijske linije U937.

[0583]

[0586] <b. MOLM14 model.>

[0588] In vivo efikasnost mAb1 naspram MOLM14, ćelijske linije izvedene iz humane AML otporne na<AraC, procenjena je u modelu ksenografta korišćenjem NSG miševa kojima je transplantirana>ćelijska linija ljudskog tumora i humanih Vγ9Vδ2 T ćelija. Cilj ove studije bio je da se potvrdi efekat ponovljenih intravenskih injekcija humanih Vγ9Vδ2 T ćelija u kombinaciji sa mAb1 na rast tumora i na preživljavanje miševa.

[0590] <Ženkama NSG miševa, starih šest do osam nedelja, intravenski (iv) je ubrizgano preko repne vene 0.>dana sa 0,2x106 po mišu u zapremini od 100µl ćelija MOLM14 (CVCL_7916) koje ekspresuju<luciferazu (luc2). Analiza bioluminescencije je izvršena 0. dana korišćenjem PhotonIMAGER (Biospace Lab) nakon dodavanja luciferina bez endotoksina (30 mg/kg) i miševi su randomizovani u homogene grupe od 7 miševa na osnovu jačine bioluminescentnog signala.3x106 humanih in-vitro ekspandiranih Vγ9Vδ2 T ćelija i hIL-15/IL-15R kompleksa su intravenski ubrizgani 1., 8., 15., 22. i 29. dana. mAb1 ili hIgG1 su intravenski ubrizgani 1., 5., 8., 12., 15., 19., 22., 26. i 29. dana.>

[0591] Različite eksperimentalne grupe su sumirane u Tabeli 19.

[0593] <hIL-15/IL-15R-Fc kompleksi su pre-kompleksovani na sobnoj temperaturi (RT) 30 minuta pre ubrizgavanja (0,2ug hIL-15 1,2ug IL-15R-Fc po mišu) i pomešani sa Vγ9Vδ2 T ćelijama pre ubrizgavanja. Konačna zapremina za svaku ubrizgavanje bila je 100 µl. mAb za tretman su ubrizgani>4 sata pre ubrizgavanja Vγ9Vδ2 T ćelija.

[0595] <Signal bioluminiscencije koji emituju ćelije MOLM14 meren je 0., 7., 14., 21. i 28. dana nakon injekcije ćelija kako bi se pratio rast tumora. Uzorkovanje krvi je sprovedeno 19. dana kako bi se procenio broj cirkulišućih ćelija MOLM14 protočnom citometrijom. Liza crvenih krvnih zrnaca je>izvršena pre bojenja. mCD45+ mišje ćelije su isključene iz analize, a tumorske ćelije MOLM14 su detektovane njihovom GFP ekspresijom. Akvizicija je izvršena na LSRII SORP citometru (Becton<Dickinson), a analiza je sprovedena pomoću softvera FlowJo. Dnevno praćenje miševa na simptome bolesti (značajan gubitak težine, načupana dlaka, pogrbljena leđa, slabost i smanjena pokretljivost)>

[0596] <određivalo je vreme ubijanja injektovanih životinja sa znacima patnje.>

[0598] <Kao što je prikazano u Tabeli 20, Vγ9Vδ2 T ćelije injektovane irelevantnim kontrolnim izotipovima>(hIgG1) ne kontrolišu značajno rast tumora. Nasuprot tome, kao što je pokazano nižim signalima bioluminescencije, rast tumora je bio značajno smanjen kada je anti-BTN3A mAb1 primenjen sekvencijalno sa humanim Vγ9Vδ2 ćelijama. Rezultati su takođe pokazali značajno smanjenje broja

[0599] <cirkulišućih blasta (procenjeno protočnom citometrijom u perifernoj krvi) 19. dana protokola (Tabela 20). Važno je napomenuti da smanjenje rasta tumora zavisno od anti-BTN3A mAb dovodi>do značajnog poboljšanja preživljavanja miševa od 45% (u poređenju sa odgovarajućom izotipskom kontrolom) (Tabela 22).

[0601] <Tabela 19: MOLM14 model miševa: opis grupe>

[0604]

[0607] Tabela 20: MOLM14 model miševa: merenje bioluminescencije na dan 0, 7, 14, 21 i 28 nakon<graftovanja ćelija tumora.>

[0609]

[0612] <(nastavak)>

[0614] Dan 28

[0616] Tabela 21: MOLM14 model miševa: Broj cirkulišućih blasta na 19. dan protokola. Podaci<predstavljaju broj ćelija/ul krvi.>

[0618]

[0620] Tabela 22: MOLM14 model miševa: preživljavanje životinja. Dan smrti za svaku životinju je naznačen zajedno sa srednjim preživljavanjem za svaku grupu.

[0621]

[0624] 9. mAb1 poboljšava terapiju Vγ9Vδ2 T ćelijama u modelu čvrstog tumora kod miša sa graftovanom ćelijskom linijom kancera jajnika kod ljudi SKOV-3.

[0626] a. Materijal & Metode.

[0628] <Ekspanzija Vγ9Vδ2 T-ćelija in vitro.>

[0630] <Alogeni ljudski Vγ9Vδ2 T limfociti su amplifikovani iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) dobijenih iz uzoraka krvi zdravih donora koje je obezbedila organizacija Etablissement Français du>Sang (EFS, Nantes, Francuska) i nakon centrifugiranja gustine Ficoll (Eurobio, Les Ulis, Francuska). Prvo, za specifične ekspanzije perifernih alogenih ljudskih Vγ9Vδ2 T limfocita, PBMC su inkubirane sa 3 µM bromohidrin pirofosfata (BrHPP), koji je ljubazno obezbedila kompanija Innate Pharma (Marseille, Francuska) u RPMI medijumu dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranog fetalnog<telećeg seruma, 2 mM L-glutamina, 10 mg/mL streptomicina, 100 IU/mL penicilina (sve od Gibco) i>100 IU/mL rekombinantnog humanog IL-2 (PROLEUKIN, Novartis, Bale, Suisse). Nakon 4 dana,<kulture su dopunjene sa 300 IU/mL IL-2. Na dan 21, čistoća je merena protočnom citometrijom>(čistoća> 90%). Čisti humani Vγ9Vδ2 T limfociti su dodatno prošireni korišćenjem ćelija za hranjenje (mešoviti i 35 Gy ozračeni B limfociti transformisani Epštajn-Bar Virusom i PBMC) i PHA-L u RPMI medijumu dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranog fetalnog telećeg seruma,<2 mM L-glutamina, 10 mg/mL streptomicina, 100 IU/mL penicilina (sve od Gibco) i 300 IU/mL rekombinantnog humanog IL-2 (Novartis). Nakon tri nedelje, mirujući ex vivo prošireni-Vγ9Vδ2 limfociti su korišćeni za in vivo eksperimente.>

[0631] <Model miša>

[0632] Na dan 0, 6-8 nedelja starosti, NSG miševima je intraperitonealno (ip) ubrizgano 1x106 SKOV-3 ćelija (ćelijska linija kancera jajnika, SKOV-3-luc-D3, Perkin Elmer, Waltham, MA) koje eksprimiraju<luciferazu po mišu u zapremini od 100µL sterilnog PBS. Nakon 7 dana, miševi su nasumično>raspoređeni u homogene grupe od 5 do 6 miševa. Na dan 7 i 14, tretmani mAb1, 200 µg po mišu mAb1 ili relevantne izotipske kontrole (hlgG1), ubrizgani su ip u 100µL sterilnog PBS.4 sata kasnije, 5x106 ljudskih in-vitro proširenih Vγ9Vδ2 T ćelija je takođe ubrizgano ip u 100µL sterilnog PBS po mišu.

[0633] <Signal bioluminescencije koji emituju SKOV-3 ćelije meren je 16., 23. i 30. dana nakon implantacije>tumorskih ćelija kako bi se pratio rast tumora. Bioluminiscentno snimanje je realizovano 8 minuta nakon ip injekcije 1,5 mg D-luciferina (Interchim, San Dijego, CA), na miševima anesteziranim 2% izofluranom, pomoću Biospace Imager (Biospace Lab, Nesles-la-Vallée, Francuska).

[0634] <Eksperimentalna završna tačka je dostignuta kada su miševi izgubili 10% svoje početne težine.>b. Rezultati

[0635] <In vivo efikasnost mAb1 protiv kancera jajnika je procenjena u modelu ksenografta korišćenjem NSG miševa kojima je transplantirana ćelijska linija ljudskog raka jajnika SKOV-3 i humane Vγ9Vδ2>T ćelije. Cilj ove studije bio je da se proceni efekat dve ip injekcije humanih Vγ9Vδ2 T ćelija u kombinaciji sa mAb1 na rast tumora i na preživljavanje miševa.

[0636] <NSG miševima je intraperitonealno (ip) ubrizgan SKOV3 na dan 0. Nakon 7 dana, miševi su randomizovani u homogene grupe prema tretmanima. Grupe su opisane u Tabeli 23:>

[0637] <Tabela 23: Model kancera jajnika kod miševa: opis grupe>

[0639]

[0641] <Rezultat je pokazao da su humane Vγ9Vδ2 T ćelije prebačene zajedno sa mAb1 značajno usporavale rast tumora (Tabela 24), što je dovelo do značajnog poboljšanja preživljavanja životinja (Tabela 25). Treba napomenuti da je ovaj efekat primećen u odsustvu pro-Vγ9Vδ2 T citokina koji doprinose preživljavanju, kao što su IL-2 ili IL-15.>

[0643] Tabela 24: Model kancera jajnika kod miševa: merenje bioluminescencije 16, 23 i 30 dana nakon graftovanja ćelija tumora.

[0644]

[0646] Tabela 25: Model kancera jajnika kod miševa: preživljavanje životinja. Dan smrti za svaku<životinju je naznačen zajedno sa srednjim preživljavanjem za svaku grupu.>

[0648]

[0650] <(nastavak)>

[0652]

[0653]

[0655] <10. In-vivo efekat na Vγ9Vδ2 T-ćelije kod cynomolgus majmuna>

[0656] Zbog odsustva BTN3A i Vγ9Vδ2 T podgrupe kod glodara, i na osnovu prethodnih podataka koji<dokumentuju in vitro i in vivo aktivaciju Vγ9Vδ2 T ćelija posredovanu PAg kod cynomolgus makakija, cynomolgus majmun (Macaca fascicularis) je izabran kao jedina relevantna vrsta za>nekliničku procenu bezbednosti mAb1.

[0657] a. Materijal & Metode

[0658] <Biacore>

[0659] <mAb1 je procenjen na vezivanje za rekombinantne humane ili cynomolgus BTN3A1, BTN3A2 i BTN3A3 proteine (SEQ ID NO 21, 22 i 23 respektivno) putem Biacore multiciklične kinetičke analize korišćenjem Biacore T200 (serijski broj 1909913) instrumenta. mAb1 je razblažen do koncentracije od 2 µg/ml u 2% BSA/PBS. Na početku svakog ciklusa, antitelo je uhvaćeno na>površini Proteina A pri gustini (RL) od ~ 150 RU (teorijska vrednost za dobijanje RMax od ~ 50 RU). Nakon hvatanja, površina je ostavljena da se stabilizuje pre ubrizgavanja antigena BTN3A. BTN3A je titriran u 0,1% BSA/HBS-P+ (pufer za rad) u dvostrukom opsegu razblaženja od 25 do 0,78 nM. Faza asocijacije je praćena 420 sekundi, a faza disocijacije 2000 sekundi. Kinetički podaci su dobijeni korišćenjem brzine protoka od 50µl/min kako bi se minimizirali svi potencijalni efekti prenosa mase. Dobijeni podaci su uklopljeni korišćenjem modela vezivanja 1:1.

[0660] <ELISA>

[0661] <Prividni afinitet mAb1 za humani i cynomolgus BTN3A1 je testiran ELISA testom. Ukratko, vezivanje mAb1 za cilj je procenjeno korišćenjem rekombinantnog BTN3A1 imobilizovanog na ploči u koncentraciji od 1 µg/ml u Fosfatnom puferu (1x PBS), nakon čega je usledio korak saturacije sa>blok puferom (2% mleko/PBS)). mAb1 je titriran u blok puferu u četvorostrukom opsegu<razblaženja od 0,00122 do 20 µg/ml. Za detekciju su korišćeni sekundarno antitelo (Kozji Anti-Humani Igκ lanac, HRP konjugovano antitelo, Millipore AP502P, razblaženo 1:4000 u blok puferu) i TMB rastvor. Prividni afinitet je izražen kao EC50% (koncentracija antitela potrebna za dobijanje 50% signalnog platoa).>

[0663] <Avidnost vezivanja mAb1 za humane i cynomolgus CD3+ ćelije.>

[0664] Nakon lize crvenih krvnih zrnaca, humane ili cynomolgus PBL su inkubirane sa rastućom<koncentracijom mAb1 ili izotipske kontrole tokom 30 minuta na 4°C, isprane dva puta i obojene>kozjim anti-humanim-lgG- PE konjugovanim sekundarnim antitelom (eBioscience™ #12-4998-82). Nakon 2 ispiranja, ćelije su obojene sa anti-CD3-PC3 mAb (BD Bioscience #557749) i reagensom za žive/Mrtve ćelije (Life Technology # L10119). Nakon ispiranja, ćelije su resuspendovane u 200µL Flow pufera. Ćelije su zatim analizirane na Cytoflex citometru (Beckman Coulter). Podaci su<analizirani korišćenjem FlowJo softvera (Verzija 10, FlowJo, LLC, Ashland, SAD) na osnovu žive CD3+ populacije. Vrednosti MFI iz PE kanala su zatim izračunate i prikazano u odnosu na koncentraciju. Uklapanje krivih je dobijeno korišćenjem sigmoidne 4PL jednačine iz GraphPad Prism softvera.>

[0666] <Površinska ekspresija BTN3A na humanim i cynomolgus cirkulišućim ćelijama.>

[0668] <Za površinsku ekspresiju BTN3A na leukocitima, 100ul krvi Cynomolgusa i ljudske pune krvi je posejano u ploče sa 96 posudica sa koktelom specifičnih antitela (reagens Aqua live Dead, CD20->V450, CD8-BV605, CD4-BV650, Vg9 TCR-FITC, anti-BTN3A-PE (klon 20.1) (ili mIgG1-PE za kontrolu izotipa), CD3-PeCy7, CD45-AF700 i CD14-APC-H7) i inkubirano 15 minuta na RT, zaštićeno od svetlosti. Zatim su crvena krvna zrnca lizirana sa 900ul reagensa za lizu (BD Bioscience #349202) prema uputstvima proizvođača. Ćelije su isprane i analizirane korišćenjem multiparametarske

[0669] <protočne citometrije. Za površinsku ekspresiju BTN3A na crvenim krvnim zrncima i trombocitima, 100ul krvi cynomolgusa ili ljudske pune krvi je razblaženo sa 100ul PBS i inkubirano sa specifičnim koktelom antitela (Aqua live dead, CD41-APC, CD45-AF700 i anti-BTN3A (klon 20.1) (ili mlgG1-PE za kontrolu izotipa)) tokom 15 minuta na RT zaštićeno od svetlosti. Nakon ispiranja, ćelije su analizirane korišćenjem multiparametarske protočne citometrije. Da bi se dobila relativna>kvantifikacija površinske ekspresije BTN3A, kalibracione perlice (CellQuant Calibrator Biocytex #7208) i kozji anti-mišji IgG (H+L)-PE su paralelno korišćeni prema uputstvima proizvođača. Za svaki podskup ćelija, prijavljen je MFI od PE kanala za anti-BTN3A i kontrolu izotipa. Analiza je izvršena oduzimanjem MFI izotipske kontrole od MFI anti-BTN3A bojenja, a relativna površinska ekspresija je izračunata na osnovu standardne krive dobijene kalibracionim perlicama.

[0671] <Ekspanzija i aktivacija T ćelija Cynomolgusa Vγ9Vδ2 in-vitro.>

[0673] <Cela krv Cynomolgusa od 3 životinje tretirana je puferom za lizu crvenih krvnih ćelija. Nakon>opsežnog ispiranja, leukociti su posejani u koncentraciji od 1,5 M/ml RPMI 10% SVF u ploče sa 6 posudica u prisustvu rHulL-2 (200 IU/ml) i mAb1 (10ug/ml). rHuIL-2 je dodat 6. i 8. dana kako bi se imitirao uobičajeni protokol ekspanzije ćelija koji se koristi sa ljudskim PBMC i poboljšalo

dugoročno preživljavanje Vγ9Vδ2 T ćelija in vitro kako bi se dobio dovoljan broj ćelija za izvođenje<funkcionalnih testova. Procenat Vy9+ T ćelija je procenjen na dan 0, 6, 8 i 10 korišćenjem koktela>

[0674] <specifičnih antitela i analize protočnom citometrijom (CD3-PC7 BD Bioscience #557749, Vg9 TCR-FITC klon 7A5 Invitrogen # TCR2720, Live Dead Near IR ThermoFisher #L10119).>

[0676] <Na dan 10, proširene Vγ9Vδ2 T ćelije su prebrojane i ko-kultivisane u odnosu E:T od 1:1 sa ljudskim>tumorskim ćelijskim linijama.100.000 ciljnih tumorskih ćelijskih linija (Raji, DAUDI i K562) je<pomešano sa 100.000 Vγ9Vδ2 T ćelija cynomolgusa u prisustvu mAb1 ili hIgG1 izotipske kontrole (10ug/ml) ili PMA (20ng/ml)/jonomicina (1ug/ml) korišćenih kao pozitivna kontrola u pločama sa 96 posudica. Degranulacija Vγ9Vδ2 T-ćelija praćena je nakon 4 sata korišćenjem bojenja CD107a/b (BD bioscience #555800) i analize protočne citometrije.>

[0677] Studija in-vivo na majmunima Cynomolgus

[0679] <Studija in-vivo>

[0681] <U ovoj studiji korišćeni su majmuni cynomolgus (Macaca fascicularis) vijetnamskog porekla, stari od četiri do šest godina i težine od 3 do 5 kg. Sve životinje su održavane i korišćene u skladu sa>smernicama institucionalnog odbora za negu i korišćenje životinja u objektu za životinje sa dobrom laboratornom praksom (GLP). Kao postupak zdravlja uzgajivača, sve životinje su testirane na tuberkulozu, a profilaktički tretmani su dokumentovani u evidenciji uzgajivača. Nakon dolaska, životinje su aklimatizovane na procedure studije u periodu od najmanje 2 nedelje. Izvršen je

klinički pregled na bolest-zdravlje i testiranje. Procenu zdravlja životinja izvršio je veterinar pre<početka faze pre doziranja kako bi se potvrdila podobnost svake životinje za studiju.>

[0683] mAb1 je primenjen intravenozno (fiksiranje u stolici, infuzija tokom 15 minuta) nakon dezinfekcije<kože životinja koje nisu postile. Životinje iz grupa 1, 4 i 5 su primale doze 1., 8., 15. i 22. dana. Životinje iz grupa 2 i 3 su primale doze jednom 1. dana.>

[0685] <Farmakokinetika>

[0687] <Razvijen je kvalifikovani farmakokinetički test za kvantifikaciju mAb1 u serumu cynomolgus>majmuna. Ukratko, mAb1 se kvantifikuje pomoću ELISA spektrofotometrije. Ploča prethodno obložena Streptavidinom se koristi za hvatanje humanog IgG-FcPK Biotin Konjugata. mAb1 se zatim hvata na površini ploče, a vezani analit se detektuje pomoću kozjeg anti-humanog IgG-HRP (Fc

specifičnog) antitela, peroksidazom-obeleženog anti-specis antitela. Ciljni opseg kvantifikacije je od<90 ng/ml do 10000 ng/ml u čistom serumu.>

[0689] <Imunofenotipizacija>

[0691] <Uzorci krvi (1,0 mL) su uzeti od svih životinja iz vena cephalica antebrachii ili vena saphena u Li->Heparin epruvete. Imunofenotipizacija je urađena koktelima specifičnih monoklonskih antitela. Izvršene su analize relativnog broja ćelija (procenat limfocita/leukocita). Ukupan broj granulocita/limfocita/leukocita je određen istog dana hemoanalizatorom i korišćen za

izračunavanje apsolutnih brojeva. Apsolutni brojevi subpopulacija limfocita su izračunati iz<relativnih brojeva.>

[0693] <Popunjenost receptora>

[0695] <Uzorci krvi (400 µL) su uzeti od svih životinja iz vena cephalica antebrachii ili vena saphena u Li->Heparin epruvete. Obeleženo antitelo koje se nekonkurentno vezuje za BTN3A (klon 103.2) na

[0696] <ćelijama, koje je prethodno inkubirano sa viškom ICT01, korišćeno je za određivanje ukupne površinske ekspresije BTN3A na CD3+ T-ćelijama i CD19+ B ćelijama. Za detekciju slobodnih mesta vezivanja BTN3A, korišćeno je konkurentno vezivanje neobeleženog mAb1 za BTN3A, koje inhibira>vezivanje antitela anti-BTN3A (mAb1) obeleženog fluorescentnom bojom na CD3+ T-ćelije i CD19+ B ćelije. U zavisnosti od količine BTN3A koju je blokirao mAb1, meren je srednji intenzitet fluorescencije (MFI) konjugovanog-mAb1, jer je geometrijska sredina smanjena. Shodno tome,

intenzitet bojenja Ab7.2 blizak intenzitetu izotipskog antitela bio je indikativan za potpunu<saturaciju.>

[0697] b. Rezultati

[0698] <mAb1 se vezuje za BTN3A cynomolgusa.>

[0699] <Pošto diferencijalna identifikacija 3 BTN3A izoformnih gena nije bila moguća iz javnih baza podataka, ImCheck je izvršio ciljanu PCR na cDNA izolovanoj iz PBMC cynomolgusa, koristeći visoko konzerviranu cDNA sekvencu blizu transmembranskog domena za dizajniranje relevantnog prajmera. Sekvenciranje PCR proizvoda omogućilo je identifikaciju ektodomenskih sekvenci za BTN3A1, BTN3A2 i BTN3A3 kod cynomolgusa. Rekombinantni ektodomeni izoformi BTN3A1,>BTN3A2 i BTN3A3 kod cynomolgusa spojeni sa 6xHis oznakom proizvedeni su u CHO ćelijama na osnovu ovih sekvenci (SEQ ID NO 21, 22 i 23 respektivno).

[0700] <Rekombinantni proteini su testirani na vezivanje mAb1 pomoću BIAcore i ELISA (Tabela 26).>

[0701] <Rezultati BIAcore testa su pokazali da se mAb1 povoljno vezuje za 3 rekombinantna proteina BTN3A1, BTN3A2 i BTN3A3 kod cynomolgusa, iako sa nižim afinitetom za izoforme BTN3A1. ELISA testovi su sprovedeni na izoformama BTN3A1. Zanimljivo je da Tabela 26 prikazuje uporedivu EC50 za vezivanje mAb1 na rekombinantni humani ili cynomolgus BTN3A1.>

[0702] Tabela 26: Vezivanje mAb1 za Rekombinantne Proteine humanog i Cynomolgus BTN3A

[0705]

[0707] <Paralelno, vezivanje mAb1 na PBMCs cynomolgusa je procenjeno protočnom citometrijom. Srednja vrednost EC50 vezivanja mAb1 za CD3+ T ćelije cynomolgusa bila je uporediva sa onom kod humanih CD3+ T ćelija (Tabela 27). Ekspresija cilja na različitim subpopulacijama imunih ćelija iz>krvi cynomolgusa u odnosu na punu krv zdravih ljudi je ispitana višeparametarskom protočnom citometrijom, koristeći PE-konjugovano anti-BTN3A mAb (klon 20.1) zajedno sa panelom fenotipizacionih antitela sa poznatim unakrsnim reaktivnostima za ćelijske površinske markere ljudi i cynomolgus makaka (Podaci nisu prikazani). Ovi rezultati pokazuju da se BTN3A ekspresuje u širokom panelu populacija perifernih krvnih ćelija kod obe vrste, iako je kod cynomolgus makaka

primećena očigledna, generalno niža ekspresija.

[0709] Tabela 27: Vezivanje mAb1 na Humane i Cynomolgusne CD3+ T ćelije

[0710] Ćelije Poreklo

Opis

Prolaz

EC50 (x10<-9>M)<(+/-sem) (+/-sem)>Humani HV PBMCs EFS Marseille Primarni (n=6) 5.25 (+/-0.57) 34.9 (+/-3.8)<Cynomolgus PBMCs><Covance Munster Primarni (n=6)><7.02 (+/-0.89)><46.79 (+/-5.94)>mAb1 promoviše ekspanziju i aktivaciju Vγ9Vδ2 T-ćelija cynomolgusa in-vitro.

[0711] <Zatim je funkcionalna aktivnost mAb1 procenjena na Vγ9Vδ2 T ćelijama cynomolgusa in vitro. Prvo, procenili smo da li mAb1 podstiče širenje Vγ9Vδ2 T ćelija cynomolgusa kada se inkubira 10 dana sa>PBMCs cynomolgusa. Kao što je prikazano na Slici 4A, mAb1 je podstakao širenje Vγ9Vδ2 T ćelija kod sve 3 testirane životinje; ova populacija je dostigla 60% nakon 10 dana, nivo uporediv sa onim koji je primećen kod humanih ćelija. Nakon 10 dana ekspanzije, ćelije su ko-kultivisane 4 sata sa<ćelijskim linijama Daudi, K562 ili Raji koje su korišćene kao ciljne ćelije u prisustvu mAb1, i analizirane su na ekspresiju CD107a/b protočnom citometrijom. Ovaj eksperiment je pokazao da>mAb1 indukuje značajnu aktivaciju Vγ9Vδ2 T ćelija kada se ko-kultiviše sa sve 3 ćelijske linije tumora (Slika 4B).

[0712] <Zaključno, rezultati pokazuju da (i) mAb1 se vezuje za ćelije cynomolgus majmuna sa sličnim aviditetom kao i humane ćelije, (ii) BTN3A se ekspresuje na istim krvnim ćelijama kod ljudi i>cynomolgus majmuna, iako je kod ove druge vrste primećen niži nivo ekspresije, i (iii) mAb1<promoviše širenje podskupa Vγ9Vδ2 T ćelija u PBMC cynomolgus majmuna, a proširene ćelije su reaktivne protiv ciljnih ćelija tumora koje su pulsirane mAb1.>

[0713] <mAb1 utiče na T-ćelijski kompartman cynomolgus Vγ9Vδ2 in-vivo.>

[0714] <In-vivo studija je sprovedena na zdravim ženkama cynomolgus majmuna starim od 4 do 6 godina>koje su primale jednu ili višestruke intravenske infuzije mAb1 (Tabela 28).

[0715] <Intravenski put primene je izabran jer je to namenjeni terapijski put kod ljudi. Životinje su tretirane mAb1 prema postepenom eskalirajućem dizajnu doze.>

[0716] Tabela 28: Dizajn studije mAb1 PK/PD/tolerancije

[0719]

[0721] <Sledeći krajnji pokazatelji su procenjeni: klinički znaci, telesna težina, klinička patologija (hematologija, klinička hemija i koagulacija), imunofenotipizacija populacije leukocita u perifernoj krvi, markeri aktivacije / proliferacije / diferencijacije, farmakokinetika i farmakodinamika>(zauzetost BTN3A receptora na cirkulišućim T i B ćelijama).

[0722] <Sve životinje su preživele do zakazane nekropsije 29. Dana studije, nakon što su primile jednu ili 4 ponovljene 15-minutne infuzije mAb1. Nisu pronađeni efekti povezani sa testiranim lekom na>telesnu težinu ili konzumaciju hrane. Klinički znaci su bili u skladu sa zapažanjima primećenim kod

cynomolgus majmuna u laboratorijskim uslovima smeštaja i stoga se ne mogu pripisati testiranom<leku.>

[0723] <Farmakokinetika>

[0724] <mAb1 je pokazao približno proporcionalno farmakokinetsko ponašanje nakon intravenske (IV) primene u rasponu doza od 0,1 do 100 mg/kg (Podaci nisu prikazani), i dugi polu-život>polueliminacije tipično za IgG mAb u odsustvu klirensa posredovanog ciljem. Nakon ponovljenih doza od 10 ili 100 mg/kg/nedeljno tokom 4 doze (Podaci nisu prikazani), izloženost je održana kod svih životinja tokom perioda lečenja, sa samo minimalnom akumulacijom tokom perioda lečenja od 4 nedelje. Farmakokinetički profili za sentinel životinju nakon doza od 1 i 10 mg/kg IV u<eskalirajućem nedeljnom režimu doziranja pokazali su neke dokaze o povećanom klirensu pred>kraj nedeljnog intervala doziranja, što može biti rezultat formiranja ADAs za mAb1; nije bilo dokaza<o povećanom klirensu nakon poslednje IV doze od 100 mg/kg.>

[0725] <Zauzetost receptora (RO)>

[0726] <Prema profilu ekspresije BTN3A i zastupljenosti ćelijske populacije u krvi, mAb1 RO je izmeren na>CD3+ T ćelijama i CD20+ B ćelijama.

[0727] <Rezultati pokazuju da se BTN3A brzo popunjava nakon injekcije mAb1 i na CD3+ T ćelijama i na CD20+ B ćelijama (Podaci nisu prikazani). Ponovljeno doziranje od 100 mg/kg mAb1 izgleda da je bilo potrebno za potpunu popunjavanje receptora tokom nedeljnog intervala doziranja.>

[0728] <Imunofenotipizacija>

[0729] <U odabranim vremenskim tačkama nakon svake doze, krv životinja koje su primile mAb1 je obojena koktelom specifičnih mAbs kako bi se kvantifikovali podskupovi T ćelija (CD4, CD8, Vγ9 T ćelije,>regulatorne T ćelije), B ćelije, monociti, NK ćelije, mDCs, pDCs i granulociti i povezani markeri aktivacije (CD69, CD86, CD95, Granzyme B, Ki67) i analizirali protočnom citometrijom. Analiza je obuhvatala relativni broj ćelija (procenat limfocita/leukocita) za svaku populaciju, zajedno sa<apsolutnim brojem ćelija ekstrapoliranim iz ukupnog broja limfocita/leukocita utvrđenog iz>uzoraka krvi uzetih u isto vreme i analiziranih pomoću hematološkog brojača ćelija.

[0730] <Glavna zapažanja iz ove široke analize su:>

[0731] Vδ9+ T ćelije (% među CD3+) značajno opadaju nakon doziranja kod svih životinja koje su primale<mAb1 i progresivno se vraćaju nakon primene jedne doze kod životinja. Čini se da je ov aj efekat>specifičan, jer se ne primećuje kod CD4 i CD8 αβ T ćelija, i ukazuje na aktivaciju γδ T ćelija i njihovu marginalizaciju na tkivima, kao što je primećeno kod bi-specifičnih antitela za CD3 engager kod majmuna i ljudi (Smith et al., 2015 Sci Rep.2015 Dec 11;5:17943. doi: 10.1038/srep17943.).

[0732] <Rezultati su prikazani na slici 5.>

[0733] <Ova studija pokazuje da se mAb1, kada se primenjuje intravenskim putem, dobro podnosi u dozama do 100 mg/kg/nedeljno. Štaviše, među podskupovima T ćelija, Vγ9Vδ2 T ćelije su specifično i>značajno pogođene sa mAb1.

[0734] <Bibliografija>

[0735] <Alegre, M.-L., Frauwirth, K.A., and Thompson, C.B. (2001). T-cell regulation by CD28 and CTLA-4. Nat. Rev. Immunol.1, 220-228.>

[0736] <Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., and Struhl, K. (1988). Current>Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons).

[0737] <Baudino, L., Shinohara, Y., Nimmerjahn, F., Furukawa, J.-I., Nakata, M., Martínez-Soria, E., Petry, F., Ravetch, J.V., Nishimura, S.-I., and Izui, S. (2008). Crucial Role of Aspartic Acid at Position 265 in the CH2 Domain for Murine IgG2a and IgG2b Fc-Associated Effector Functions. J. Immunol.181,>6664-6669.

[0738] <Bensussan, A., and Olive, D. (2005). T-cell: Section report. Cell. Immunol. 236, 3-5.>

[0739] <Bird, R.E., Hardman, K.D., Jacobson, J.W., Johnson, S., Kaufman, B.M., Lee, S.M., Lee, T., Pope, S.H., Riordan, G.S., and Whitlow, M. (1988). Single-chain antigen-binding proteins. Science 242, 423-426. Brennan, M., Davison, P.F., and Paulus, H. (1985). Preparation of bispecific antibodies by chemical recombination of monoclonal immunoglobulin G1 fragments. Science 229, 81-83.>

[0740] <Bryson, C.J., Jones,T.D., and Baker, M.P.(2010). Prediction of Immunogenicity of Therapeutic Proteins. BioDrugs 24, 1-8.>

[0741] <Chapoval, A.I., Ni, J., Lau, J.S., Wilcox, R.A., Flies, D.B., Liu, D., Dong, H., Sica, G.L., Zhu, G., Tamada, K., et>al. (2001). B7-H3: A costimulatory molecule for T cell activation and IFN-y production. Nat.

[0742] <Immunol. 2, 269-274.>

[0743] <Collins, M., Ling, V., and Carreno, B.M. (2005). The B7 family of immune-regulatory ligands. Genome Biol. 6, 223.>

[0744] <Coyle,A.J., andGutierrez-Ramos, J.C.(2001).The expandingB7superfamily: increasing complexity in costimulatory signals regulating T cell function. Nat. Immunol. 2, 203-209.>

[0745] <Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., and Chen, L. (1999). B7-H1, a third member of the B7 family, costimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med.5, 1365-1369.>

[0746] <Freeman, G.J., Long, A.J., Iwai, Y., Bourque, K., Chernova, T., Nishimura, H., Fitz, L.J., Malenkovich, N., Okazaki, T., Byrne, M.C., et al. (2000). Engagement of the Pd-1 Immunoinhibitory Receptor by a Novel B7 Family Member Leads to Negative Regulation of Lymphocyte Activation. J. Exp. Med. 192,>1027-1034.

[0747] Glennie, M.J., McBride, H.M., Worth, A.T., and Stevenson, G.T. (1987). Preparation and performance<of bispecific F(ab’ gamma)2 antibody containing thioether-linked Fab’ gamma fragments. J.>

[0748] <Immunol. 139, 2367-2375.>

[0749] <Goeddel, D.V. (1990). [1] Systems for heterologous gene expression. In Methods in Enzymology, (Academic Press), pp. 3-7.>

[0750] <Gu, S., Nawrocka, W., and Adams, E.J. (2015). Sensing of Pyrophosphate Metabolites by Vγ9Vδ2 T Cells. Front. Immunol. 5.>

[0751] <Harly, C., Guillaume, Y., Nedellec, S., Peigné, C.-M., Mönkkönen, H., Mönkkönen, J., Li, J., Kuball, J., Adams, E.J., Netzer, S., et al.(2012). Key implication of CD277/butyrophilin-3 (BTN3A) in cellular stress sensing by a major human γδ T-cell subset. Blood 120, 2269-2279.>

[0752] <Huston, J.S., Levinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M.S., Novotný, J., Margolies, M.N., Ridge, R.J., Bruccoleri, R.E., Haber, E., and Crea, R. (1988). Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an antidigoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci.85, 5879-5883.>

[0753] <Kabat, E.A., Wu, T.T., Foeller, C., Perry, H.M., and Gottesman, K.S. (1992). Sequences of Proteins of Immunological Interest (DIANE Publishing).>

[0754] <Karpovsky, B., Titus, J.A., Stephany, D.A., and Segal, D.M. (1984). Production of target-specific effector cells using hetero-cross-linked aggregates containing anti-target cell and anti-Fc gamma receptor antibodies. J. Exp. Med.160, 1686-1701.>

[0755] <Kaufman, R.J., and Sharp, P.A. (1982). Construction of a modular dihydrofolate reductase cDNA gene: analysis of signals utilized for efficient expression. Mol. Cell. Biol. 2, 1304-1319.>

[0756] <Khattri, R., Auger, J.A., Griffin, M.D., Sharpe, A.H., and Bluestone, J.A. (1999). Lymphoproliferative Disorder in CTLA-4 Knockout Mice Is Characterized by CD28-Regulated Activation of Th2 Responses. J. Immunol. 162, 5784-5791.>

[0757] <Klocke,K., Sakaguchi,S., Holmdahl, R., and Wing,K. (2016). Induction of autoimmune disease by deletion of CTLA-4 in mice in adulthood. Proc. Natl. Acad. Sci.113, E2383-E2392.>

[0758] <Latchman, Y., Wood, C.R., Chernova, T., Chaudhary, D., Borde, M., Chernova, I., Iwai, Y., Long, A.J., Brown, J.A., Nunes, R., et al. (2001). PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nat. Immunol. 2, 261-268.>

[0759] <Linsley, P.S., Greene, J.L., Tan, P., Bradshaw, J., Ledbetter, J.A., Anasetti, C., and Damle, N.K. (1992). Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on activated T lymphocytes. J. Exp. Med. 176, 1595-1604.>

[0760] <Liu, M.A., Kranz, D.M., Kurnick, J.T., Boyle, L.A., Levy, R., and Eisen, H.N. (1985). Heteroantibody duplexes target cells for lysis by cytotoxic T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 8648-8652. McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G., and Chiswell, D.J. (1990). Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 348, 552-554.>

[0761] Morrison, S.L. (1985). Transfectomas provide novel chimeric antibodies. Science 229, 1202-1207.<Ni, L., and Dong, C. (2017). New B7 Family Checkpoints in Human Cancers. Mol. Cancer Ther.16,>1203-1211.

[0762] <Oganesyan, V., Gao, C., Shirinian, L., Wu, H., and Dall’Acqua, W.F. (2008). Structural characterization of a human Fc fragment engineered for lack of effector functions. Acta Crystallogr. D Biol.>

[0763] <Crystallogr. 64, 700-704.>

[0764] <Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., and Junutula, J.R. (2013). Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. MAbs 6, 34-45.>

[0765] <Paulus, H. (1985). Preparation and biomedical applications of bispecific antibodies. Behring Inst. Mitt. 118-132.>

[0766] <Perry, L.C.A., Jones, T.D., andBaker, M.P.(2008). New approaches to prediction of immune responses to therapeutic proteins during preclinical development. Drugs RD 9, 385-396.>

[0767] <Reddy, M.P., Kinney, C.A.S., Chaikin, M.A., Payne, A., Fishman-Lobell, J., Tsui, P., Monte, P.R.D., Doyle, M.L., Brigham-Burke, M.R., Anderson, D., et al. (2000). Elimination of Fc Receptor-Dependent Effector Functions of a Modified IgG4 Monoclonal Antibody to Human CD4. J. Immunol.164,>1925-1933.

[0768] <Remington, J.P., and Gennaro, A.R. (1995). Remington: the science and practice of pharmacy (Easton, PA: Mack Publishing).>

[0769] <Rhodes, D.A., Stammers, M., Malcherek, G., Beck, S., and Trowsdale, J. (2001). The Cluster of BTN Genes in the Extended Major Histocompatibility Complex. Genomics 71, 351-362.>

[0770] <Ruddy, D.A., Kronmal, G.S., Lee, V.K., Mintier, G.A., Quintana, L., Domingo, R., Meyer, N.C., Irrinki, A., McClelland, E.E., Fullan, A., et al. (1997). A 1.1-Mb Transcript Map of the Hereditary Hemochromatosis Locus. Genome Res.7, 441-456.>

[0771] <Saverino,D.,Tenca,C.,Zarcone,D., Merlo,A., Megiovanni,A.M.,Valle, M.T.,Manca,F.,Grossi,C.E., and Ciccone,E. (1999). CTLA-4 (CD152) Inhibits the Specific Lysis Mediated by Human Cytolytic T Lymphocytes in a Clonally Distributed Fashion. J. Immunol. 162, 651-658.>

[0772] <Sharpe, A.H., and Freeman, G.J. (2002). The B7-CD28 superfamily. Nat. Rev. Immunol. 2, 116-126. Sharpe, A.H., and Pauken, K.E. (2018). The diverse functions of the PD1 inhibitory pathway. Nat. Rev. Immunol. 18, 153-167.>

[0773] <Shukla, A.A., Hubbard, B., Tressel, T., Guhan, S., and Low, D. (2007). Downstream processing of monoclonal antibodies-Application of platform approaches. J. Chromatogr. B 848, 28-39.>

[0774] <Stech, M., Nikolaeva, O., Thoring, L., Stöcklein, W.F.M., Wüstenhagen, D.A., Hust, M., Dübel, S., and Kubick, S. (2017). Cell-free synthesis of functional antibodies using a coupled in vitro transcriptiontranslation system based on CHO cell lysates. Sci. Rep.7, 12030.>

[0775] <Strohl, W.R. (2009). Optimization of Fc-mediated effector functions of monoclonal antibodies. Curr.>Opin. Biotechnol. 20, 685-691.

[0776] <Takebe,Y.,Seiki, M.,Fujisawa, J., Hoy,P.,Yokota,K.,Arai,K.,Yoshida, M., andArai, N.(1988).SR alpha promoter: an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat. Mol. Cell. Biol. 8, 466-472.>

[0777] <Tseng,S.-Y., Otsuji, M., Gorski, K., Huang, X., Slansky, J.E., Pai, S.I., Shalabi, A., Shin, T., Pardoll, D.M., and Tsuchiya, H. (2001). B7-Dc, a New Dendritic Cell Molecule with Potent Costimulatory Properties for T Cells. J. Exp. Med. 193, 839-846.>

[0778] <Urlaub, G., and Chasin, L.A. (1980). Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in>dihydrofolate reductase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4216-4220.

[0779] <Williams, A.F., and Barclay, A.N. (1988). The immunoglobulin superfamily--domains for cell surface recognition. Annu. Rev. Immunol. 6, 381-405.>

[0781] Patentni zahtevi

Claims (11)

1. Izolovano anti-BTN3A antitelo naznačeno time, što sadrži varijabilni polipeptid teškog lanca VH<od SEQ ID NO:1 i varijabilni polipeptid lakog lanca VL od SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:3.>

2. Izolovano anti-BTN3A antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time, što sadrži mutantni<konstantni region IgG1, koji ima trostruke mutacije L247F L248E i P350S.>

3. Izolovano anti-BTN3A antitelo prema bilo kom od zahteva 1-2, naznačeno time, što je mAb1<koje sadrži teški lanac SEQ ID NO:4 i laki lanac SEQ ID NO:6.>

4. Izolovano anti-BTN3A antitelo prema bilo kom od zahteva 1-3, naznačeno time, što je za<upotrebu kao terapijsko sredstvo.>

<5. Izolovano anti-BTN3A antitelo prema bilo kom od zahteva 1-4, naznačeno time, što je za upotrebu u lečenju kancera, opciono u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojcima, na primer>anti-PD1 ili anti-PD-L1 antitelom, ili citokinom, kao što su IL-2 ili IL-15 ili njihove pegilovane varijante.

<6. Farmaceutska kompozicija naznačena time, što sadrži anti-BTN3A antitelo prema bilo kom od>zahteva 1-3, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, razblaživača ili nosača, koja opciono sadrži druge aktivne sastojke, na primer anti-PD1 ili anti-PD-L1 antitelo, ili<citokin, kao što su IL-2 ili IL-15.>

7. Formulacija liofilizata, prethodno napunjen špric ili bočica naznačena time, što sadrži<anti-BTN3A antitelo prema bilo kom od zahteva 1-3.>

<8. Vektor ekspresije za rekombinantnu proizvodnju anti-BTN3A antitela prema bilo kom od zahteva>1-3 u ćeliji domaćina, naznačen time, što sadrži najmanje jednu nukleinsku kiselinu koja kodira<pomenuto anti-BTN3A antitelo.>

9. Vektor ekspresije prema zahtevu 8, naznačen time, što sadrži najmanje nukleinske kiseline koje<kodiraju teške i lake lance mAb1 kako je definisano u zahtevu 3.>

10. Ćelija domaćin naznačena time, što sadrži vektor ekspresije prema zahtevima 8 ili 9.

11. Postupak za proizvodnju anti-BTN3A antitela prema bilo kom od zahteva 1-3, naznačen time,<što obuhvata: (i) kultivaciju ćelije domaćina prema zahtevu 10 radi ekspresije pomenutog antitela>od strane ćelije domaćina; opciono (ii) prečišćavanje pomenutog antitela; (iii) oporavak antitela.