CN101687039B

CN101687039B - 工程化抗αν-整联蛋白杂合抗体

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Publication number: CN101687039B
Application number: CN200880024003.1A
Authority: CN
Inventors: S·戈德曼; D·哈恩; F·米蒂亚斯; J·阿丹; 劳健明
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2007-07-17
Filing date: 2008-07-17
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2028-07-17
Also published as: DK2167128T3; JP2010533480A; HK1143523A1; EP2167128B1; WO2009010290A3; ZA201001124B; ES2395799T3; KR101559596B1; CA2693863A1; SI2167128T1; EA201070150A1; EA019485B1; AU2008277907A1; PL2167128T3; WO2009010290A2; IL203269A; BRPI0815567B8; AU2008277907B2; CA2693863C; US20100254977A1

Abstract

本发明涉及特异性结合至整联蛋白受体，特别是αv整联蛋白受体亚基的工程化抗体。抗体包含已知的小鼠抗整联蛋白抗体的抗原结合部位(CDR)，以及杂合轻链可变序列、突变的重链可变序列(Fr)和修饰的重链恒定序列。新抗体具有改善的免疫原性和表达特性，并且在单一疗法中且尤其重要的是在与其他的血管发生和肿瘤抑制试剂组合治疗的人中引起极佳的抗血管发生活性和抗肿瘤活性。

Description

工程化抗αν-整联蛋白杂合抗体

发明领域

本发明涉及特异性结合至整联蛋白受体，特别是αv整联蛋白受体亚基的工程化抗体。抗体包含已知的小鼠抗整联蛋白抗体的抗原结合部位(CDR)，以及杂合轻链可变序列、突变的重链可变序列(Fr)和修饰的重链恒定序列。新抗体具有改善的免疫原性和表达特性，并且在单一疗法中且尤其重要的是在与其他的血管发生和肿瘤抑制试剂，诸如西仑吉肽、西妥昔单抗和化学治疗剂组合治疗的人中引起极佳的抗血管发生活性和抗肿瘤活性。

发明背景

癌症的治疗仍然是卫生保健中的主要问题。所提出的治疗癌症的一个策略是抑制血管发生，并且因此抑制向肿瘤提供生长相关物质的血管的发生和发育。第二个策略是直接抑制肿瘤细胞表面上的特异受体，诸如通过

抑制Her2或者通过西妥昔单抗

抑制EGFR。

考虑了整联蛋白抑制剂是潜在有用的抗肿瘤试剂，因为整联蛋白表达于肿瘤新血管系统上并且介导血管发生。此外，整联蛋白表达于某些肿瘤细胞上并且可直接促进肿瘤生长和存活。

整联蛋白不具有酶活性，但是能够结合它们的配体的整联蛋白(配体-活性的整联蛋白)通过结合至细胞外基质(ECM)的蛋白质而活化。整联蛋白一方面触发细胞内激酶级联反应以调节细胞生长和存活，并且在另一方面与细胞骨架结合以驱动细胞附着和行进。αvβ5整联蛋白特异性结合玻连蛋白，而αvβ3还结合临时细胞外基质的其他大分子。αvβ3在癌症中作为恶性黑素瘤上的进展依赖性标志物首次记录。它增强黑素瘤的体内生长和体外存活。αvβ3阻断剂逆转这些效应。后来，在其他肿瘤中，包括成胶质细胞瘤、肾癌、卵巢癌及其他癌症中发现了αvβ3。αvβ3还在多数恶性肿瘤的内皮细胞中很大程度上过表达。在体外，通过肿瘤衍生的生长因子活化的血管发生模型在新生脉管系统上过表达并且需要αvβ3，而αvβ3和αvβ5阻断可以抑制血管发生表型。αvβ5还显示支持由一些肿瘤衍生的生长因子所诱导的新脉管系统。抑制αvβ5会触发肿瘤细胞凋亡。

整联蛋白受体在肿瘤侵入性血管上、黑素瘤和一些其他恶性肿瘤上过表达，并且调节细胞对生长因子的反应。血管腔隙是有希望的治疗靶标，因为实体瘤依赖血管供应氧、营养物、解毒和血液传播的转移扩散；向血管发生表型的转变标记着恶性肿瘤诱导中分立的步骤，其适宜于治疗干预；并且脉管系统经历着连续的变化，而内皮细胞相对于肿瘤而言具有基因组稳定性并且通过突变变成药物抗性的可能性较小。

第一个抗整联蛋白药物是西仑吉肽，并且考虑作为有用的抗肿瘤剂(Eskens FA等，(2003)Eur J Cancer 39：917-26)。然而，西仑吉肽是小分子，其必须频繁给药。西仑吉肽的结构，例如所选择的盐形式的结构描述于EP0770622、WO 0015244和PCT/us07/01446中并且通过参考在本文中公开。

第二个抗整联蛋白药物是小鼠mAb 17E6(EMD 73034)，其特异性抑制具有人整联蛋白受体的细胞的αv整联蛋白亚基。小鼠IgG1抗体描述于例如Mitjans等(1995；J.Cell Sci.108，2825)和专利US 5,985,278和EP 719859中。全部的可变重链和轻链序列描述于SEQ ID No.25和26中(图20A、B)。鼠17E6从以纯化和Sepharose固定的人αvβ3免疫的小鼠产生。来自免疫小鼠的脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞融合并且所得到的一个杂交瘤克隆产生单克隆抗体17E6(EMD 73034)。小鼠mAb 17E6由杂交瘤细胞系272-17E6产生并且以登录号DSM ACC2160保藏。

小鼠17E6拮抗整联蛋白与细胞外基质(ECM)的相互作用，并且扰乱内皮细胞和肿瘤细胞的功能。该抗体的主要效应包括破坏内皮细胞(EC)附着和移动，诱导它们凋亡和抑制生长因子途径的活化。通过所述抗体的阻断直接抑制了活化内皮细胞和一些肿瘤细胞的存活。

单克隆抗体诸如17E6通常用于抑制细胞外蛋白质-蛋白质相互作用，诸如抑制配体-受体相互作用。然而，单克隆抗体常常难于表达并且经常引起免疫反应，诸如抗独特型反应，这限制了它们的有效性。

到目前为止收集的这些资料和主要知识支持需要开发具有改善特性的改良小鼠17E6抗体，其特异性结合整联蛋白、可以有效表达并且作为癌症治疗剂在人类中是相对非免疫原性的。此种工程化抗体应该具有既可通过肿瘤脉管系统间接抑制肿瘤发展又能直接作用于肿瘤细胞本身而直接抑制肿瘤发展的潜力。

发明简述

本发明涉及新抗体，所述抗体具有单克隆小鼠抗体17E6(EMD 73034)生物学特性，但是具有改善的特性，尤其是在人中的免疫原性方面具有改善的特性并且满足在工业生产和制造规模的哺乳动物表达系统中表达。

本发明提供少数具有修饰序列的工程化抗体，其与小鼠抗体17E6识别相同的受体表位，但是显示在人中免疫原性降低并且可以比相当的非改良抗体表达更佳。

应当注意到，一般来说，为了达到在人中免疫原性降低而改良或者工程改造小鼠衍生的抗体会伴随着表达和/或结合亲和性的不同损失。因此，根据众所周知的标准技术嵌合化或人源化通常导致表达、结合亲和性的降低，这通过特定回复突变或者其他措施仅可以部分解决。同时成功地降低免疫原性、具有高表达和满足结合亲和性的对各个蛋白质分子内的改良是不能预测的。因此，降低T细胞表位数以便消除或降低作为待解决主要问题的药物在人类内中的免疫反应，会导致不可忍受的表达或亲和性或者两者的损失，这将导致产生需要解决的更多问题。

因此，本发明的目标是提供具有确定的靶特异性的工程化抗体，所述抗体较少引起免疫原性、满足表达和良好的结合亲和性。这些特性可以通过在最初来源分子小鼠mAb 17E6内的令人惊奇的修饰得到。在许多实验中，将结果不直接与小鼠17E6抗体比较，而是与嵌合的17E6形式(包含人恒定区)比较是有意义的。本领域的成功的嵌合抗体，一般来说，显示具有足够的结合亲和性和足够的表达，但是经常在人个体中引起免疫原性反应。

主要地，本发明提供具有在人中降低或消除的免疫原性的工程化重组抗αv-整联蛋白杂合抗体，包含

(i)来自小鼠单克隆抗αv整联蛋白抗体17E6的CDR轻链和重链区，

(ii)来自人源化单克隆抗EGFR抗体425的轻链构架区，

(iii)来自小鼠单克隆抗αv整联蛋白抗体17E6的重链构架区，和

(iv)来自人IgG和人恒定轻链区的重链恒定区。

人源化单克隆抗体425(马妥珠单抗)是已知的，例如来自EP 531 472，和来自其鼠对等物425(小鼠MAb 425，ATCC HB9629)。抗体针对人A431癌细胞系产生并且发现结合人表皮生长因子受体(EGFR)外部结构域上的多肽表位。发现其抑制表皮生长因子(EGF)在低亲和性和高亲和性EGFR部位的结合。马妥珠单抗(matuzumab)在临床试验中显示具有高有效性。马妥珠单抗轻链FR序列描述于SEQ ID No.12-15，如在下文以及权利要求书中所详细说明。

除了其他修饰之外，来自抗整联蛋白小鼠抗体17E6的修饰的重链构架(FR)区与不同特异性的人源化抗EGFR抗体h425(马妥珠单抗)轻链构架区的组合已经产生了具有优良免疫原性特性的一些抗体，此外其还在标准哺乳动物表达系统中充分表达。令人惊奇地是，使用mAb h425的VL区(FR)，表达水平明显提高，但是如下面所示，必须进一步的突变以改善其他特性，尤其是结合亲和性。

进一步重要的修饰是替换小鼠17E6重链CDR2区内的氨基酸残基。令人惊奇的是，通过将半胱氨酸残基替换成酪氨酸残基，蛋白质稳定性和表达水平至少与嵌合的17E6形式相比明显改善。

表达和稳定性方面的进一步改善可以通过以具有修饰的人IgG1铰链区的人IgG2代替最初小鼠IgG1重链恒定区实现。在优选实施方案中，所述IgG2可以通过以谷氨酰胺替换第297位精氨酸残基(N297Q)进一步修饰。该修饰消除了N-糖基化位点，并且因此消除或降低待工程化抗体的ADCC和CDC活性。不幸的是，通过该措施，免疫原性增加了，显然是通过产生新T细胞表位所致。令人惊奇的是，通过以丙氨酸替代第296位苯丙氨酸，可以恢复至较小免疫原性。

为了降低小鼠mAb17E6最初重链构架区内的T细胞表位数，已经开展了许多种突变。具体而言，在小鼠抗体下列位点的一个、多个或全部位点的突变对于降低免疫原性是必需的：A9、E13、M20、K38、R40、A72、S76、Q82、G85、T87、S91和S113。

显示具有最佳改善特性数值的本发明的一个优选工程化抗体在下文命名为“DI-17E6”或同义词“DI-17E6γ2h(N297Q)”或“EMD 525797”，并且具有下列序列：

(i)可变和恒定轻链序列(SEQ ID No.3，图1C)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLIY

GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC

FGQGTKVEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ

DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC和

(ii)可变和恒定重链序列(SEQ ID No.4，图1D)：

QVQLQQSGGELAKPGASVKVSCKASGYTFS WVRQAPGQGLEWIG

RSGYTEYNEIFRDKATMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAS

WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG

ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV

APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ

STFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVS

NKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE

WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTQKSLSLSPGK，

其中加下划线的序列表示具有CDR(粗体)的可变区。轻链恒定区是人κ。重链恒定区是具有修饰的IgG1铰链区EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID No.40)的人IgG2。

DI-17E6的相应DNA序列示于图17-19。

本发明还涉及如上和如下所述的直接融合至或者通过连接分子融合至细胞因子，诸如IL-2、IL-12、TNFa、IFNa、IFNb或生长因子的工程化抗体。抗体融合细胞因子还可以用于肿瘤治疗和/或血管发生相关疾病治疗中，因为细胞因子部分可以促进提高细胞毒性。抗体融合蛋白，特别是免疫细胞因子在本领域众所周知。优选的本发明融合蛋白是DI-17E6-IL2或DI-17E6-(L)-IL2，其中L是连接肽。

根据本发明显示所述的工程化抗体可以用于治疗血管发生相关疾病和/或肿瘤相关疾病的药物组合物中。令人惊讶的是，本发明的抗体引起对肿瘤生长的直接效果，这似乎独立于由阻断血管发生所导致的间接抗肿瘤效果。

提供包含第二治疗剂的药物组合物及其它们的用途也是本发明的目标，所述第二治疗剂优选是化学治疗剂，诸如顺铂、阿霉素等，αv-整联蛋白抑制剂，诸如RGD-肽，例如西仑吉肽，或酪氨酸激酶抑制剂，特别是抗erbB1或erbB2抗体。在这里优选的实例是西妥昔单抗(单克隆抗体c225，

)、马妥珠单抗(人源化单克隆抗体425)或

(人源化抗体4D5)。

根据本发明，如本文所公开所述药物组合物中的工程化抗体可以加强第二治疗剂的效果，在许多情况下通过协同相互作用加强。

根据本发明，优选的工程化抗体DI-17E6或相似变体与抗EGFR抗体，优选西妥昔单抗的组合产生令人惊奇的效果，停止施用工程化抗体，优选DI-17E6之后即延缓或预防肿瘤组织的再生长。

包含第二治疗剂的药物组合物还可以用作试剂盒部分，所述试剂盒部分在第一个包装中包含工程化抗体，优选DI-17E6，并且在第二个包装中包含第二治疗剂，例如血管发生抑制剂、化学治疗剂或酪氨酸激酶抑制剂，诸如抗EGFR或抗Her2抗体。所述试剂盒的优选的第二治疗剂是血管发生抑制剂西仑吉肽或抗EGFR抗体西妥昔单抗或马妥珠单抗或化学治疗剂。

总之，本发明涉及：

·工程化重组抗αv-整联蛋白杂合抗体，包含

(i)来自小鼠单克隆抗αv整联蛋白抗体17E6的CDR轻链和重链区，

(ii)来自人源化单克隆抗EGFR抗体425的轻链构架区，

(iii)来自小鼠单克隆抗αv整联蛋白抗体17E6的重链构架区，和

(iv)来自人IgG和人恒定轻链区的重链恒定区。

·如所述的工程化抗体，其中来自小鼠单克隆抗αv整联蛋白抗体17E6的CDR轻链区是：

CDR1：RASQDISNYLA(SEQ ID No.5)，

CDR2：YTSKIHS(SEQ ID No.6)，

CDR3：QQGNTFPYT(SEQ ID No.7)，

并且CDR重链区是：

CDR1：SFWMH(SEQ ID No.8)，

CDR2：YINPRSGYTE(X)NEIFRD，其中X＝C或Y(SEQ ID No.11)，

CDR3：FLGRGAMDY(SEQ ID No.10)。

·如所述的工程化抗体，其中重链的CDR2区具有序列YINPRSGYTEYNEIFRD(SEQ ID No.9)。

·如所述的工程化抗体，其中来自人源化单克隆抗EGFR抗体425的轻链构架区包含序列

FR-1：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID No.12)，

FR-2：WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID No.13)

FR-3：GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC(SEQ ID No.14)

FR-4：FGQGTKVEIK(SEQ ID No.15).。

·如所述的工程化抗体，其中来自小鼠抗体17E6的所述重链构架区(FR1-FR4)在1-15氨基酸残基位置被突变以降低或消除T细胞表位数，并且因此降低或消除在人中的免疫原性。

·如所述的工程化抗体，其中所述重链构架区在小鼠抗体的下列位点的一个、多个或全部位点被突变：A9、E13、M20、K38、R40、A72、S76、Q82、G85、T87、S91和S113。

·如所述的工程化抗体，其中在工程化抗体中被突变的所述氨基酸残基位置是：A9G，E13K，M20V，K38R，R40A，A72T，S76T，Q82E，G85S，T87R、S91T、S113T。

·如所述的工程化抗体，其中所述重链构架区包含下列突变：

A9G、E13K、M20V、K38R、R40A、A72T、S76T、Q82E、G85S、T87R，S91T和S113T。

·工程化重组抗αv-整联蛋白杂合抗体，包含

i)轻链CDR区：

CDR1：RASQDISNYLA(SEQ ID No.5)，

CDR2：YTSKIHS(SEQ ID No.6)，

CDR3：QQGNTFPYT(SEQ ID No.7)，

ii)重链CDR区：

CDR1：SFWMH(SEQ ID No.8)，

CDR2：YINPRSGYTEYNEIFRD(SEQ ID No.9)，和

CDR3：FLGRGAMDY(SEQ ID No.10)，

iii)轻链构架区：

FR-1：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID No.12)，

FR-2：WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID No.13)

FR-3：GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC(SEQ ID No.14)

FR-4：FGQGTKVEIK(SEQ ID No.15)，

(iv)重链构架区：

FR1：QVQLQQSG

ELA

PGASVK

SCKASGYTFS(SEQ ID No.16)

FR2：WV Q

PGQGLEWIG(SEQ ID No.17)

FR3：KATMT

DTS

STAYM

LS L SED

AVYYCAS(SEQ ID No.18)

FR4：WGQGT

VTVSS(SEQ ID No.19)，

其中粗体并加下划线的位置中的一个、多个或全部位置被突变以降低或消除T细胞表位数，并且因此降低或消除在人中的免疫原性，和

(v)来自人IgG和人恒定轻链区的重链恒定区。

·如所述的工程化抗体，其中所述重链构架区是：

FR1：QVQLQQSGGELAKPGASVKVSCKASGYTFS(SEQ ID No.20)

FR2：WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID No.21)

FR3：KATMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAS(SEQ ID No.22)

FR4：WGQGTTVTVSS(SEQ ID No.23).

·如所述的工程化抗体，其中重链恒定区来自IgG2，其中在优选的实施方案中所述IgG2恒定区包含修饰的IgG1铰链区。

·如所述的工程化抗体，其中所述修饰的IgG1铰链区包含序列EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID No.24)。

·如所述的工程化抗体，其中所述IgG2恒定区通过第297位氨基酸N被Q替换(N297Q)而修饰。

·如所述的工程化抗体，其中第296位的氨基酸残基F被A替换(F296A)以消除通过第297位修饰所产生的T细胞表位。

·如所述的工程化抗体，其中轻链恒定区是人κ。

·命名为“DI-17E6”的重组抗αv-整联蛋白杂合抗体，基本上由下列构成

(i)可变和恒定轻链序列(SEQ ID No.3)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLIY

GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC

FGQGTKVEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ

DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC和

(ii)可变和恒定重链序列(SEQ ID No.4)：

QVQLQQSGGELAKPGASVKVSCKASGYTFS WVRQAPGQGLEWIG

RSGYTEYNEIFRDKATMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAS

WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG

ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV

APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ

STFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVS

NKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE

WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTQKSLSLSPGK，

其中，加下划线的序列标记表示包括CDR(粗体)的可变区。在恒定区中的粗体序列表示修饰的铰链区(EPKSSDKTHTCPPCP)和位置296和297的突变。

·包含如所述抗体的融合蛋白，其优选通过其C-末端融合至细胞因子或生长因子，优选细胞因子。

·编码如所述抗体或抗体融合蛋白的DNA分子。

·包含所述DNA分子的表达载体。

·包含如图中所详细说明的DNA片段并命名为pdHL10-DI-17E6g2h(N297Q)的表达质粒。

·包含以所述表达质粒转化的哺乳动物宿主细胞的蛋白质表达系统。

·包含药物有效量的如上面和下面详细说明的抗体或抗体融合蛋白以及任选的可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

·包含第一和第二药物有效治疗剂以及任选的可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物，其中第一治疗剂是如详细说明的抗体或抗体融合蛋白，并且第二治疗剂选自：化学治疗剂、血管发生抑制剂和抗肿瘤剂。

·相应药物组合物，其中第二治疗剂是抗肿瘤抗体，特别是抗EGFR(erbB1)或抗Her2(erbB2)抗体。

·相应药物组合物，其中所述第二治疗剂是整联蛋白抑制剂西仑吉肽、抗EGFR抗EGFR抑制剂mAb c225(西妥昔单抗，

)和mAb h425(马要珠单抗)和化学治疗剂顺铂或DTIC。

·如详细说明的工程化抗体或抗体融合蛋白用于制造用于治疗血管发生相关疾病和/或实体瘤或肿瘤转移的药物的用途。

·如详细说明的药物组合物用于制造治疗肿瘤的药物的用途，其中所述工程化抗体增加第二治疗剂的有效性。

·如详细说明的药物组合物用于制造治疗肿瘤的药物的用途，其中第二治疗剂是抗EGFR抗体并且所述工程化抗体阻止或延缓停止施用工程化抗体之后肿瘤的再生长。

·权利要求29的用途，其中第一治疗剂是权利要求17(DI-17E6)的工程化抗体并且第二治疗剂是mAb c225(西妥昔单抗)。

发明详述

为了降低鼠17E6(EMD 73034)在人中的免疫原性的可能性，通过将鼠17E6(EMD 73034)去免疫化和遗传工程化产生DI-17E6(EMD 525797)。

根据本发明的抗体的去免疫化意味着从最初小鼠抗体检测和去除人T细胞表位。该技术与以人共有序列代替小鼠序列的“人源化”方法不同。所使用的去免疫化技术描述于例如WO 98/52976、WO 00/34317和WO02/69232。

通过计算机分析鼠17E6轻链(VL)和重链(VH)可变区以去除潜在T-辅助细胞表位。去免疫的VH和VL序列特意保留来自鼠的结合关键序列诸如CDR的那些氨基酸。

为了优化表达，轻链构架区由人源化425抗体的那些轻链构架区替代。此外，为了提高蛋白质稳定性，将VH序列中罕见的非配对半胱氨酸-60转化成酪氨酸(C60Y)。

EMD 525797的特征之一是不触发免疫反应。为了实现该目的，还将免疫球蛋白恒定区做如下修饰。对于轻链，使用基因组人κ恒定区。对于重链，使用基因组人γ-2(72)恒定区，但是具有四个半胱氨酸二硫键的铰链区被修饰的y1铰链区替代以使二硫键乱序最小化并改善表达。CH2结构域中Asn-297至Gln(N297Q)突变的引入去除了N-糖基化信号：所得到的去糖基化消除了效应功能并且延长了抗体的血清半寿期。

最后，Phe-296被突变成Ala，这去除了由N297Q突变所产生的潜在T细胞表位。

通过上面简短描述的方法得到的优选抗体DI-17E6(示意结构描述于图16)具有下列特性：

DI-17E6显示在分离的受体和细胞水平具有潜能和选择性(例如受体结合、细胞附着和细胞迁移研究)。

DI-17E6显示在体外和动物模型中具有肿瘤生长抑制性活性(例如实验肿瘤裸小鼠，SCID小鼠/人皮肤嵌合体)。

DI-17E6显示在动物模型中具有抗血管发生活性(例如SCID小鼠/人皮肤嵌合体，猴类中的基质胶塞)。

DI-17E6选择性抑制细胞外基质(ECM)蛋白质结合至αv-整联蛋白受体并阻断αv-整联蛋白介导的细胞黏着、附着和迁移。一旦诱导细胞脱离，则会发生两个另外的事件：细胞活化途径被阻断和αv-整联蛋白被内化在组织培养中。血纤蛋白原结合至血小板受体GPIIbIIIa和血小板凝集不受影响，并且EMD既不触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)也不触发补体依赖性细胞毒性(CDC)。

DI-17E6(EMD 525797)表现出窄的物种特异性，并且仅人和猴αv-整联蛋白被识别。在移植至SCID小鼠的人皮肤中，人αv-整联蛋白缺损黑素瘤的生长和血管生长响应被EMD 525797抑制。健康猴类全身施用EMD 525797阻断由皮下植入包含血管发生生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的塞所引起的血管发生。还证明，EMD 525797在表达αvβ3-整联蛋白的人肿瘤，包括一些黑素瘤的异种移植模型中具有直接的抗肿瘤活性。在组合治疗研究中，EMD 525797活性与化学治疗药物良好协同，使得可以使用较低的、毒性较小浓度的标准化学治疗剂并且在诊所式环境中仍然有效。这些实验仅能够证明EMD 525797的潜在抗肿瘤活性，因为鼠血管内皮不表达靶标ocv整联蛋白，并且因此不被抗体识别。

4-周毒理学研究数据没有显示DI-17E6对临床观察、体重和食物消费、ECG、身体温度、呼吸速率、临床病理学(血液学、血清化学)、尿液分析、器官重量、肉眼检查和组织病理学具有任何治疗相关的效应。

基于这些资料，认为10、33和100mg EMD 525797/kg体重/天的剂量，每周静脉内灌注(1h)施用一次，施用4周是可以良好耐受的并且处于研究条件之下。抗体经口服没有活性，但是在动物研究中已经通过静脉内和腹膜内途径成功施用，在该动物研究中已经显示抑制若干种不同实验肿瘤的血管发生和生长。

研究EMD 525797的诱变潜能的细菌筛选试验表明EMD525797不是诱变性的。在食蟹猴中的重复剂量毒性研究中没有观察到EMD 525797的安全药理学改变。

EMD 525797具有145,208Da的理论分子量，这已经通过MALDI-TOF-MS和LC-ESI-Q-TOF MS分析经实验验证。等电点范围为从7.35至8.15，平均为7.75。消光系数是1.42。

EMD 525797以大约10nM的EC50抑制人内皮细胞附着至玻连蛋白。EMD 525797以0.1至50nM范围的EC50阻断由αv-整联蛋白介导的肿瘤细胞黏着。VEGF诱导的人内皮细胞在玻连蛋白上的迁移也被EMD 525797阻断，EC50为50nM左右。同样地，接种于αv-整联蛋白配体上的人内皮细胞的增殖和存活也被EMD 525797阻断。

EMD 525797靶向内皮αv-整联蛋白并且破坏血管形成。它尤其抑制整联蛋白αv3和αv5并且阻断αv-整联蛋白介导的细胞行为，包括附着和迁移。αv整联蛋白和生长因子信号途径相互作用，因此EMD 525797结合也能破坏分化、增殖和存活。除了其具有抗血管发生作用之外，EMD525797作为直接的抗肿瘤效应，在呈递靶标的恶性细胞中明显地促进凋亡。EMD 525797可以阻断细胞附着、诱导细胞脱离、阻断αv-整联蛋白配体上的迁移、增殖和存活。

DI-17E6是第一个去免疫的蛋白质，对于在人中的免疫原性资料可以得到：在各个临床试验中，在超过500mg的剂量时，没有检测到抗DI-17E6 抗体，该剂量是对于抗体常用的治疗有效剂量。相比之下，在动物试验中，在相应计算的剂量下可以检测到抗药物抗体。一般而言，DI-17E6的免疫行为认为更加复杂：17E6结合至αv会促进摄取进入树突细胞。FcR被17E6的结合似乎被破坏。17E6结合至整联蛋白受体或许会抑制天然免疫抑制机制。因此，通过工程化抗体，优选DI-17E6得到的结果无论如何是不可预料的并且是令人惊奇的。

DI-17E6对αvβ整联蛋白受体具有结合亲和性，其是相似的嵌合17E6，17E6包含与DI-17E6相同的恒定区。令人惊奇的是，已经包含人源化mAb 425可变构架区但仍然是小鼠17E6抗体最初VH区的抗体的突变不能结合至整联蛋白受体。

DI-17E6由NS0细胞和其它哺乳动物细胞系良好地表达。有趣的是，如上所述对整联蛋白不具有结合亲和性的突变显示具有相同的良好表达率。这些结果和相似结果表明，不可能预测出三种目的特性：降低的免疫原性、高表达水平和满足结合亲和性。

DI-17E6扰乱体外和体内血管发生步骤，如在黑素瘤肿瘤生长中。DI-17E6可以增强基于细胞毒性药物的治疗的活性，导致体内抗肿瘤活性更高。

DI-17E6导致依赖于αvβ3和αvβ5的黏着斑的解聚。在整联蛋白连接作用之后，这些信号复合体装配。它们组织与生长、存活和运动性途径通讯，并且它们的破坏会触发凋亡。

因此，DI-17E6使用机械化学和生物化学效应的组合以影响内皮并增加对肿瘤细胞的胁迫。

DI-17E6通过影响肿瘤内的至少两种不同细胞区室，即肿瘤细胞本身和血管原性活化的肿瘤内皮细胞在体内发挥其生物学活性。DI-17E6破坏通过αvβ3或αvβ5介导的肿瘤和内皮细胞附着。培养的内皮细胞迁移到临时细胞外基质上，并且该迁移可被DI-17E6破坏。血管形成中所涉及的形态发生改变是复杂的，但是可以在人内皮细胞迁移测定中体外模拟，在该测定中DI-17E6可以阻断该过程。当在人皮肤-SCID小鼠嵌合体模型和猴类基质胶塞模型中体内全身施用时，它还阻断血管发生。这表明DI-17E6影响血管发生内皮。抗血管发生的间接证据在下面给出。取决于VEGFA或FGF2是否是诱导剂，所触发的血管发生依赖于αvβ5或αvβ3。由于DI-17E6阻断该两种αv-整联蛋白，它可以阻断该两种途径。

虽然DI-17E6被认为是主要的靶向内皮细胞，但是它还可以抑制肿瘤细胞本身的生长和存活。到目前为止，这还仅仅证明对于表达αvβ3的肿瘤是这样。

来自不同肿瘤适应症(黑素瘤、卵巢、肾、结肠、乳腺和肺肿瘤)的肿瘤细胞系在用DI-17E6体外处理时的生长受到影响。DI-17E6诱导抗增殖的活性根据细胞系不同而不同，并且这可归因于每一细胞系的遗传背景和这些细胞系的αv-整联蛋白表达水平两者。

DI-17E6可以抑制小鼠中异种移植肿瘤的生长。在与化学治疗试剂组合中，其还表现出协同效应。这些效应依赖于肿瘤背景和其它条件(例如体外/体内)，但是已经在皮下和原位如胰中观察到功效(见实施例))。

在实体瘤中，配体活性的αvβ3常常在肿瘤侵袭的脉管系统上以及在一些人肿瘤，包括黑素瘤、肾癌、脑肿瘤上过表达。该表达伴随着ocvβ3配体，如玻连蛋白、von Willebrand因子和血纤蛋白原的沉积以及此类蛋白质的异常合成。例如，主要在肝中产生的玻连蛋白在一些肿瘤中表达。在健康成人中，玻连蛋白和血纤蛋白原是血液产生的无活性形式，但是当它们活化时(例如在肿瘤患者中)经历构象变化并沉积在内皮下细胞外基质内。因此，肿瘤侵袭的血管和一些肿瘤表达DI-17E6靶标，所述肿瘤还表达玻连蛋白受体。

表达αvβ3的黑素瘤细胞的皮下生长被不同剂量的EMD 525797抑制。在人皮肤-SCID小鼠嵌合模型(其中缺乏αv整联蛋白的人黑素瘤被人内皮细胞血管化)中，EMD 525797也抑制肿瘤生长，表明其具有抗血管发生作用。

此外，在猴类的无肿瘤模型(其中血管发生被血管发生生长因子bFGF诱导)中，DI-17E6也阻断生长因子诱导的血管发生。基于体内研究和根据在若干PK/PD体内研究中鉴定的实验血浆峰浓度，在临床试验中EMD525797的施用包括给与剂量达到从10至500μg/ml的血浆峰浓度范围。

如果应用于黑素瘤异种移植小鼠模型(M21、MeWo或CAKI-1)，较低剂量(大约30mg/Kg)DI-17E6导致微小的肿瘤退化效应，而当施用较高剂量(500ul/ml)时，效应相当大地增强。

应当注意到，如上面针对DI-17E6所详细说明的基本生物学特性和治疗性特性同样也适用于在本申请中详细说明的DI-17E6的其它变体。

组合治疗

内皮细胞响应可溶性细胞因子和肿瘤所分泌的生长因子增殖并侵入肿瘤环境。此类内皮细胞是治疗的适宜靶标，如已经于最近在人类癌症患者中得到验证。此类肿瘤侵袭性内皮从头表达的αv整联蛋白支持它们在过渡细胞外基质的外来环境中存活，并且这些整联蛋白的抑制可以具有抗血管发生效应。

因此，αvβ3或αv整联蛋白靶向治疗提出了一个理想方案，以在用于癌症组合治疗的药物组合物和试剂盒部分中组合本发明的抗体与化学治疗剂、其它整联蛋白抑制剂或肿瘤受体阻断剂。

令人惊奇的是，发现直接的抗肿瘤效应可以通过组合本发明的工程化抗体、优选DI-17E6与另外的抗肿瘤剂、特别是酪氨酸激酶抑制剂、优选抗erbB1(EGFR)和抗erbB2(Her2)抗体而增强。抗肿瘤治疗通过阻断肿瘤特异性受体而靶向肿瘤组织本身，并且因此阻止肿瘤生长或促进肿瘤缩小。

根据本发明，可以证明一些化学治疗剂与本发明的工程化抗体、优选DI-17E6组合仅产生累加效应，而在使用其它化学治疗剂(例如达卡巴嗪、DTIC)的其它实验中可以观察到协同效应。此外，结果取决于所使用的系统，例如是否采用体内或体外系统。来自组合实验的一个重要结果是，组合使用优选的DI-17E6和西仑吉肽，一种环状RGD肽和整联蛋白抑制剂(环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal))显示在体外以及体内的肿瘤生长退化中具有协同效应。

如果DI-17E6与西妥昔单抗

组合，可以得到降低肿瘤生长的相似协同效应。Erbitux(西妥昔单抗)是IgG1亚类的嵌合小鼠/人单克隆抗体(MAb)，其靶向人表皮生长因子受体(EGFR)。不同的肾细胞癌(RCC)细胞系表达EGFR。Erbitux是推向市场的产品并且批准用于若干肿瘤适应症。

在所有的协同作用的情况中，可以从结果得出结论，工程化DI-17E6抗体加强在组合中所使用的第二种治疗剂的抗肿瘤效应。

根据本发明，DI-17E6当与西妥昔单抗组合时，导致可以较长时间(大约40天)观察到肿瘤大小/生长的稳定减少，即使是停止施用药物也如此。如果西妥昔单抗在单一治疗中施用，情况不是这样。

本发明的工程化抗体可以在施用第二治疗剂之前、之后或者同时向需要其的患者施用。

用于与本发明的任一工程化抗体组合使用的化学治疗剂可以是，例如甲氨蝶呤、长春新碱、亚德里亚霉素、顺铂，非包含糖的氯乙基亚硝基脲、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、达卡巴嗪、紫杉醇、fragyline、Meglamine GLA、戊柔比星、卡莫司汀、UFT(替加氟/尿嘧啶)、ZD 9331、多西他赛/西紫杉醇、氟尿嘧啶(5-FU)、长春碱、和来自该类的其它良好化学物。

含有或不含有第二治疗剂的本发明治疗组合物或DI17E6组合物也可以用于与其它抗癌症策略组合使用，并且此类组合治疗在抑制和/或消除肿瘤生长和转移中是有效的。本发明的方法可以有利地与其它治疗法，包括但不限于放射疗法、手术、基因疗法和化学疗法一起使用。

令人惊奇的是，通过组合本发明的抗体与另外的血管发生抑制剂的治疗增强可以发现抗血管发生效应。抗血管发生治疗靶向肿瘤脉管系统并且阻止肿瘤生长超出某一大小，因此，在第二优选实施方案中，第二种药物是优选选自下列的血管发生抑制剂：

血管发生抑制剂可以是，但不限于，例如西仑吉肽(EMD 121974)、抗VEGF抗体LM609、BMS-275291、达肝素(法安明

)、苏拉明、2-甲氧雌二醇(2-ME)、沙立度胺、CC-5013(沙立度胺类似物)、考布他汀A4磷酸、LY317615(蛋白质激酶Cβ抑制剂)、AE-941(新伐司他^TM；GW786034)、抗VEGF抗体(贝伐单抗；阿瓦斯丁^TM)、ZD6474、羧基酰氨基三唑(CAI)、塞来昔布(西乐葆

)。

本发明的抗体可以掺入到适宜施用的药物组合物中。此类组合物通常包含抗体可变区和可药用载体。如本文所使用，术语“可药用载体”旨在包括与药物施用相容的任何的和全部的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域众所周知。

本发明的药物组合物配制成与旨在施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(局部)、经黏膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液剂或混悬剂可以包括下列成分：无菌稀释剂诸如注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱调节，诸如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以包装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量瓶中。

虽然数量根据药物的剂型变化，但是包含本发明抗体可变区的药物可以具有0.01至100％(w/w)的浓度。

施用优选每两周一次或者每月一次，但是取决于17E6/425-101蛋白质在特定个体内的药物代谢动力学行为可以更频繁或者更稀少。对于大约70千克的成人，DI-17E6或如本申请书详细说明的其他抗体(例如西妥昔单抗)的剂量在每剂量大约50至1000毫克的范围，优选的范围为每剂量大约100至500毫克。对于每月一次治疗的70kg成人的最优选的剂量是大约400毫克。

本文提到的化学治疗剂一般来说以10mg/Kg和100mg/Kg之间的剂量施用。

在与如详细说明的第二治疗剂组合治疗中，本发明的工程化抗体可以在治疗起始点与第二治疗剂同时施用，或者在第二治疗剂施用之后或之前施用。

附图简述

图1A：DI-17E6的可变轻链序列(SEQ ID No.1)。

图1B：DI-17E6的可变重链序列(SEQ ID No.2)。

图1C：DI-17E6的完整的轻链蛋白质序列：可变区加下划线，所带有的CDR为粗体。

图1D：DI-17E6的完整的重链蛋白质序列：可变区加下划线，所带有的CDR为粗体。恒定区中的粗体序列指示修饰的IgG1铰链区和第296和297位的修饰。

图2：DI-17E6在猴基质胶塞实验中的抗血管生成活性：猴血清中的抗抗体检测依赖于不同天数的药物浓度(单次剂量)。

图3：DI-17E6(EMD 525797)在猴基质胶塞实验中的抗血管生成活性：给予DI-17E6(30mg/Kg)剂量时猴血清中随时间的抗抗体检测。

图4：在具有皮内M21-L黑素瘤的SCID小鼠-人皮肤嵌合体模型中DI-17E6对肿瘤生长的影响(以1mg/剂量、每周三次腹膜内施用4周，肿瘤细胞接种后1天开始治疗)。

图5：DI-17E6在猴类基质胶塞模型中对生长因子诱导的血管发生的影响。在接受静脉内一次治疗施用(10或30mg/Kg)的猴中，生长因子诱导的血管发生被EMD 525797抑制。在基质胶植入的同一天进行治疗。每组使用包含多至6个基质胶塞的一个动物。血红蛋白含量分析(g血红蛋白/mg基质胶塞)在6天后开展；给出了平均值±SE。

图6：HUVE细胞中DI-17E6与紫杉醇组合在体外显示的抗增殖作用。

图7：M21人黑素瘤细胞系中DI-17E6与西仑吉肽组合在体外显示的抗增殖协同作用。上面的曲线：仅西仑吉肽，下面的曲线：DI-17E6+西仑吉肽。

图8：DI-17E6与西仑吉肽组合在体外CAKI-2人肾细胞系中显示的抗增殖协同作用。上面的曲线：仅西仑吉肽，下面的曲线：DI-17E6+西仑吉肽。

图9：DI-17E6与西仑吉肽组合在体外A498人细胞系中显示的抗增殖协同作用。带有三角形的曲线：DI-17E6+西仑吉肽，带有正方形的曲线：仅西仑吉肽。

图10：在同位胰癌症异种移植肿瘤模型中DI-17E6(EMD 525797)对化学治疗性治疗的体内效果：次优剂量EMD525797与不同剂量吉西他滨的组合对NP18-b3胰肿瘤(10mg肿瘤碎块同位缝合入裸小鼠胰腺内)的抑制。肿瘤碎块手术后6天开始治疗。EMD 525797以500μg/剂量每周腹膜内施用三次。吉西他滨以50μg/Kg每周腹膜内施用三次。在42天后描述肿瘤重量。

图11：使用次优剂量DI-17E6，DI-17E6(EMD 525797)与顺铂(cPT)组合在使用人M21肿瘤细胞移植入小鼠的异种移植肿瘤模型中的体内作用。在肿瘤细胞注射的同一天开始EMD 525797治疗。在肿瘤细胞注射后11天开始cPT治疗。EMD 525797以500μg/剂量每周腹膜内施用一次。cPT以10mg/Kg每周腹膜内施用一次。

图12：在与达卡巴嗪(DTIC)组合治疗中，使用次优剂量DI-17E6的DI-17E6(EMD 525797)在使用人MeWo肿瘤细胞移植入小鼠中的异种移植肿瘤模型中的体内作用。在肿瘤细胞注射的同一天开始EMD 525797治疗。在肿瘤细胞注射后11天开始DTIC治疗。EMD 525797以500μg/剂量每周腹膜内施用一次。DTIC以50mg/Kg每周腹膜内施用一次。

图13：使用不同剂量(ug/ml血清)DI-17E6，单独的DI-17E6(EMD525797)在使用人CAKI-1肾癌肿瘤细胞移植入小鼠内的异种移植肿瘤模型中的体内作用。y轴：肿瘤体积(mm3)，x轴：天数。

图14：与西妥昔单抗(Erbitux)组合治疗中的DI-17E6(EMD 525797)在移植入小鼠内的CAKI-1肾癌肿瘤细胞中的体内作用，其中以100ug/ml的恒定血清浓度使用DI-17E6和以4mg/Kg和12mg/Kg体重的剂量使用 Erbitux。剂量方案描述于实施例13中。y轴：肿瘤体积(mm3)，x轴：天数。

图15：DI-17E6表达质粒pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)的质粒图谱。

图16：mAb DI-17E6(EMD 525797)的示意结构。

图17A：如在表达质粒pdHL10-DI-17E6中使用的从完整轻链(人κ)的翻译起始密码子至翻译终止密码子的DI-17E6完整DNA序列(编码序列用大写字母表示，非编码序列用小写字母表示，可变和恒定序列用灰色表示，可变序列用斜体表示)(SEQ ID No.27)。

图17B：DI-17E6可变轻链的DNA序列(SEQ ID No.29)。

图17C：DI-17E6恒定轻链的DNA序列(SEQ ID No.31)。

图18A：如在表达质粒pdHL10-DI-17E6中使用的从完整重链的翻译起始密码子至翻译终止密码子的DI-17E6完整DNA序列(编码序列用大写字母表示，非编码序列用小写字母表示，可变和恒定序列用灰色表示，可变序列斜体表示；修饰的IgG1铰链用粗体表示)(SEQ ID No.33)。

图18B：DI-17E6可变重链DNA序列(SEQ ID No.35)。

图18C：DI-17E6恒定重链DNA序列(SEQ ID No.37)。

图18D：DI-17E6重链的修饰的IgG1铰链的DNA序列(SEQ ID No.39)。

图19A：DI-17E6的完整重链DNA序列(SEQ ID No.41)。

图19B：DI-17E6的完整轻链DNA序列(SEQ ID No.43)。

图20A：小鼠抗体17E6的可变轻链的蛋白质序列。粗体序列表示CDR(SEQ ID No.25)。

图20B：小鼠抗体17E6的可变重链的蛋白质序列。粗体序列表示CDR(SEQ ID No.26)。

图21A：不同形式工程化抗体的整联蛋白结合ELISA。

十字(x)＝17E6VH/425VL-g2h(N-Q)

星号(＊)＝mAb 425

三角形＝DI 17E6 VH33/VL60.2-g2h(N-Q)

菱形＝17E6-g2h(N-Q)

图21B：不同形式工程化抗体的整联蛋白结合ELISA。

实心三角形：鼠17E6-g2h(N-Q)

三角形：DI-17E6VL60.2CDR-425VLFR4/VH33(C60Y)-g2h(FN-＞AQ)

实心正方形：DI-17E6VL60.2CDR-425VLFR3FR4/VH33(C60Y)-g2h(FN-＞AQ)

实心圆圈：DI-17E6-g2h(N-Q)(C60Y)。

下列实施例进一步详细描述本发明。然而，虽然本发明使用特定的参数、分子、方法步骤等，但是如果技术人员可以容易地从这些资料得出本发明可以使用类似的手段和方法开展的结论，则本发明不限于这些特定的参数、分子、方法步骤等。

实施例1本发明工程化抗体的构建和表达

为了降低在人内的免疫原性，通过将鼠17E6去免疫化和遗传工程化产生DI-17E6(EMD 525797)。

来源抗体是如先前所述的单克隆小鼠抗体17E6。该抗体从以纯化的人αvβ3免疫的小鼠产生。来自免疫小鼠的脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，并且所得到的杂交瘤克隆之一产生单克隆抗体17E6(见例如EP0719859)。产生所述抗体的杂交瘤细胞系以DSM ACC2160保藏号保藏。

基本上，鼠17E6的轻链(VL)和重链(VH)可变区用所谓的去免疫化方法学(WO 98/52976，WO 00/34317和WO 02/069232)进行计算机分析，以去除潜在T细胞表位。设计去免疫化的VH和VL序列以保留来自对于结合至关重要的鼠序列，诸如CDR的那些氨基酸。

仅仅使用该技术产生了抗体，其在人个体中免疫原性被降低或消除，但不具有足够结合亲和性和在哺乳动物表达系统中令人满意的表达率。因此，通过修饰几个位置上的氨基酸序列重新设计抗体以重新建立结合亲和性和表达。然而，很明显，当改善表达模式时结合亲和性降低，反之亦然。因此，不得不构建大量抗体形式用于研究表达和结合亲和性。新形式经常具有在分子设计时不能意料到的令人惊奇的结果。将来自具有优良表达的抗体形式的序列与具有优良结合亲和性的抗体形式的序列组合常常导致产生具有差的结合亲和性和表达的新抗体形式。因此，如已经所指出，对特定抗体突变引起良好表达和结合亲和性的预测是不可能的。

去免疫化17E6(DI-17E6)的可变区：

小鼠单克隆抗体17E6轻链(VL)和重链(VH)可变区(SEQ.ID No.25和26)通过如上面详细说明的计算机去免疫化技术去免疫化，其去除了潜在T辅助细胞表位。这导致产生称作VL60.2的去免疫化形式VL和称作VH33的去免疫化形式VH。

通过转染哺乳动物细胞产生的由VL60.2和VH33组成的去免疫化17E6抗体保留了对αvβ3整联蛋白的结合亲和性，但是表达差。

为了优化表达，轻链构架区被人源化425抗体的那些构架区替代(Kettleborough等，Protein Engineering 4：773，1991)。

此外，在VH序列中罕见的VH33中的非配对半胱氨酸-60被改变成酪氨酸(C60Y)以提供蛋白质稳定性。

使用对哺乳动物表达优化的密码子，化学合成编码最终的去免疫化VL(DI-17E6VL，图1A)和VH(DI-17E6VH，图1A)的DNA。

NS0-LD细胞系的起源和来源：

小鼠骨髓瘤NS0从欧洲细胞培养物中心(European Collection of CellCultures)得到(ECACC#85110503)。通过选择在无脂质和无血清培养基上生长的NS0细胞得到NS0-LD细胞系，所述培养基由SM1 F6培养基(Invitrogen)构成，添加有1mM丙酮酸钠(Invitrogen)、1g/L葡萄糖(Merck KGaA)、1％非必需氨基酸(Invitrogen)、0.1μM托酚酮(Sigma)、10μM乙醇胺(Sigma)和2mM谷氨酰胺(Invitrogen)。NS0-LD冻存原种在冻存培养基中制备，所述冻存培养基由10％(v/v)过滤的DMSO(MerckKGaA)、10％(v/v)的悬浮于水中的1％甲基纤维素(Sigma)、40％新鲜生长培养基和40％的NS0-LD细胞条件培养基组成。

表达载体DI-17E6v2h(N297Q)的构建：

来自小鼠免疫球蛋白轻链基因的基因组信号肽序列(438-bp)用于分泌重链和轻链。编码信号肽-2氨基酸残基(-1氨基酸是信号肽的C-末端残基)的基因序列从丝氨酸残基突变成亮氨酸残基(AGC至TTA)，以致于编码信号肽末端的DNA是CTTAAGC，其中CTTAAG是产生的AflII位点(Lo等，Protein Engineering 11：495，1998)。此外，引入Kozak共有序列CCACCATGG用于优化核糖体结合以便在ATG翻译起始(Kozak，Cell44：283，1986)。这通过将起始密码子后的第一个氨基酸残基从AAG突变成GAG实现，得到序列TCTAGACCACCATGGAG，其中Kozak共有序列加下划线表示，TCTAGA是XbaI位点。因此，信号肽包含在起始密码子之后的第一个氨基酸残基的替代和在-2位置的氨基酸残基另一替代。由于信号肽被细胞内的信号肽酶切割下来，并且不出现在分泌的蛋白质中，所以这些突变不影响抗体产物的氨基酸组成。去免疫化的VLDNA作为AflII-BamHI片段合成，并且去免疫化的VH DNA作为AflII-HindIII片段合成。对于VL，通过AflII位点连接至基因组前导序列产生编码信号肽-VL的XbaI-BamHII片段。同样地，通过AflII位点连接VH DNA至基因组前导序列产生编码信号肽-VH的XhoI-HindIII片段，其中通过连接体连接用XhoI替代了XbaI。然后将所得到的XbaI-BamHI和XhoI-HindIII片段插入到已经包含了转录调节元件和免疫球蛋白恒定区序列(见下文)的pdHL10表达载体中(图15)。

编码人恒定区的DNA构建体

对于轻链，使用基因组人κ恒定区。对于重链，使用带有下列修饰的基因组人γ-2(γ2)恒定区：

首先，由于免疫球蛋白γ2铰链区包含4个半胱氨酸二硫键，这导致二硫键混乱增加和纯化过程中蛋白质凝集，所以将其通过遗传工程化使用如下修饰的γ1铰链区替代。编码修饰的γ1铰链及之后的γ2的CH2和CH3区的Fcγ2h DNA的构建已有描述(Lo等，Protein Engineering，Design& Selection，18：1，2005)。

为了用修饰的γ1铰链区外显子替代人Igγ2基因中的γ2铰链区外显子，我们使用Fcγ2h DNA作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)，以在铰链外显子的紧邻上游再次引入PstI限制酶切位点。正向引物具有序列5′-ctgcagAGCCCAAATCTTC，其中ctgcag是最初存在于内含子末端的PstI位点(小写字母)，其中的ag是剪接受体位点，并且AGCCCAAATCTTC是修饰的γ1铰链区外显子的5′末端(大写字母)。反向引物具有序列5′-cagctggggcctgtccctg，其杂交至铰链区和CH2外显子之间的内含子中的序列。所得到的包含修饰的γ1铰链区外显子的130-bpPstI-PvuII PCR产物在克隆和序列验证之后用于替代pdHL10表达载体中Igγ2基因中的相应片段(见下文)。

第二，CH2结构域中Asn-297向Gln的突变(N297Q)通过重叠PCR引入，以去除N-糖基化信号，其消除了抗体的效应子功能并且延长了抗体的血清半寿期。此外，Phe-296被突变成Ala，这去除了通过N297Q突变所产生的任何潜在T辅助细胞表位。第三，在编码CH3结构域的野生型DNA序列中翻译终止密码子上游大约280bp的位置存在SmaI限制性位点。该SmaI位点通过引入沉默突变(TCC至TCA)被破坏。另一个沉默突变被引入，以在终止密码子上游4bp产生新的、唯一的SmaI位点(Lo等，Protein Engineering 11：495，1998)以便于遗传操作。

质粒pdHL10的构建(图15)

表达载体pdHL10来自先前已经描述的pdHL7(Gillies等，J.Immunol.160：6195，1998)。如在pdHL7中那样，在pdHL10中的L和H链的两个转录单位包含CMV增强子-启动子(Boshart等，Cell 41：521-530，1985)。CMV增强子-启动子的DNA从商业可得的pcDNAI(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)的AflIII-HindIII片段得到。

pdHL7和pdHL10之间的主要的差别是二氢叶酸还原酶(DHFR)选择标记的转录单位。在pdHL10中如下破坏该转录单位的SV40增强子。在SV40增强子/启动子中有两个72-bp重复，并且在每一个72bp内有一个SphI限制性位点。将增强子的SalI位点5′与远端SphI位点通过寡核苷酸连接体-接头连接导致从72-bp重复序列中缺失120bp。此类无增强子的启动子应该使DHFR选择标记表达水平低得多。理论上，应该产生更少数的稳定转染的细胞克隆，这些克隆为了在药物选择中存活，可能将质粒整合入染色体的活性转录区以致于从无增强子的启动子表达出足够的DHFR。由全功能增强子和启动子驱动的目的基因在该活性转录区应该以甚至更高的水平表达。此外，该减弱的转录单位的定向在pdHL10中被反转，以致于L链的CMV增强子对远端SV40启动子不能发挥直接作用。

通过限制性内切核酸酶消化对构建体pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)精细作图(图15)。对整个L和H链的编码区完全测序。其突出的特征描述于下表：

1.在pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)载体和所公布序列之间发现前导序列内含子中有6个核苷酸(nt)差异。pdHL10-DI-17E6(C60Y)γ2h(N297Q)载体包含第801位的G、第985位的T、第993位的C、第1006位的T、第1045位的T和第1071位的A。所公布的序列在这些各个位置包含C、A、A、G、AC(一个额外的核苷酸)和G。

2.在pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)载体和所公布序列之间发现前导序列内含子中有6个核苷酸(nt)差异。pdHL10-DI-17E6(C60Y)γ2h(N297Q)载体包含第3780位的G、第3964位的T、第3972位的C、第3985位的T、第4024位的T和第4050位的A。所公布的序列在这些各个位置包含C、A、A、G、AC(一个额外的核苷酸)和G。

3.在pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)载体和所公布序列之间发现CH2和CH3间内含子内有2个核苷酸(nt)差异。 pdHL10-DI-17E6(C60Y)γ2h(N297Q)载体包含第5908位的A和第5922位的A。所公布的序列在该两个位置包含G。

4.在pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)载体和所公布序列之间发现CH1中有一个核苷酸(nt)差异。pdHL10-DI-17E6(C60Y)γ2h(N297Q)载体包含第4736位的G。所公布的序列包含在该位置的C。

生产性细胞克隆和研究性细胞库的产生

高产克隆的转染和选择

表达质粒pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)通过限制性内切核酸酶FspI线性化，FspI在编码β-内酰胺酶的序列中切割一次，线性化的表达质粒pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)用于通过电穿孔转染NS0-LD细胞。使用设置成250伏和15ms脉冲长度的Gene Pulser Xcell^TM系统(BioRad，Hercules，CA)进行电穿孔。通过在添加至包含200nM甲氨蝶呤(Sigma，目录号M-8407)的超级CD培养基上生长来选择稳定转染的克隆。超级CD培养基包含9.69g/L AGT CD杂交瘤培养基(Invitrogen，P/N RM-00-136)、2.52g/L碳酸氢钠(EMD，P/N SX0320-3)、30ml/L CD酸性可溶性浓缩物(Invitrogen，P/N 00-0336DK)、1.46g/L L-谷氨酰胺(Sigma，P/N G8540)、3g/L葡萄糖(Sigma，P/N G-5400)、2g/L BD精选大豆胨(BectonDickenson，P/N 212488)和2g/L BD超滤的精选植胨(Becton Dickenson，P/N 210931)。来自12个96孔板的大约474个稳定克隆的上清液通过抗人Fc ELISA测定以鉴定高生产者。所选择克隆的表达水平通过重组A蛋白亲和(rPA)层析进一步证实。在25cm²T烧瓶中的终末静置培养中产生607μg/ml DI-17E6γ2h(N297Q)(通过rPA测定)的克隆#395被选择用于通过有限稀释进行亚克隆。

尝试在超级CD培养基上亚克隆没有成功。因此，将克隆#395调整在添加至包含5μM托酚酮(Sigma，目录号T7387)、10μL/L乙醇胺(Sigma，目录号E0135)、10μg/mL胰岛素(冻干的牛胰岛素，Invitrogen，目录号13007-018)、2g/L Hypep 4601(Quest International，目录号 5Z10419)和2g/L Hypep 1510(Quest International，目录号5X59053)、3.5mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，目录号25030-081)和200nM甲氨蝶呤(Sigma，目录号M-8407)的DMEM/F12培养基(Invitrogen，目录号21041-025)中生长一代，并且在含200nM甲氨蝶呤的完全DMEM/F12培养基与完全DMEM/F12条件培养基(从非转染宿主NS0-LD细胞培养物条件化，旋转沉降然后过滤)的1∶1混合物中亚克隆。对于亚克隆，细胞以1、5、10个细胞/孔接种于96孔板中。在大约两周内，在包含10和5个细胞/孔的板内出现亚克隆。在显微镜下检查孔中的亚克隆以确保在一个孔中仅有一个可见的克隆。来自两个96孔板(10个细胞/孔)的16个亚克隆和来自两个96孔板(5个细胞/孔)的1个亚克隆的上清液通过抗人FcELISA测定，并且选择高产克隆用于rPA分析。最佳的亚克隆是#395-2和#395-6，在75cm²T烧瓶的终末静置培养中产生669μg/ml和735μg/mlDI-17E6γ2h(N297Q)(通过rPA测定)。

抗体的表达

构建哺乳动物表达质粒，转染入NS/0细胞，并且分离稳定的转染子。有代表性地，NS/0细胞以表达载体稳定转染，引入到T-烧瓶的75毫升培养基中生长3天，使得细胞密度为每毫升约400,000个细胞。在这些条件下，所分泌的DI-17E6的浓度为大约50-100μg/ml。

抗体的纯化

抗体可以顺序使用下列步骤中的一些或全部步骤纯化：Abx混合的树脂柱层析、重组A蛋白层析和Q Sepharose柱层析，然后是用于将缓冲液交换成制剂缓冲液的Pellicon 2切向流渗滤。病毒失活和去除步骤交错置于这些步骤中。病毒失活和去除步骤对于纯化本身而言不是必须的，而是用于满足法规的考虑。

进行测定以确定DI17E6抗体结合至αv整联蛋白受体亚基。DI17E6抗体结合αv整联蛋白的能力使用ELISA测定。简言之，向包含αv整联蛋白的孔中加入多种量的抗体，然后洗涤孔，并且根据标准方法测定所结合的抗体。

实施例2产生多种抗体突变以发现最佳表达和结合亲和模式

通过再次工程化增加DI-17E6表达水平的资料总结

表达中的问题：去免疫化形式的表达水平甚至比嵌合的更低：

为了提高deImm17E6VH33-VL49A/L60.2-g2h(FN至AQ)的表达水平，我们将：

a.)VH的CDR2中C60突变成S和Y，

b.)VL中的GEAA回复突变成DGTV，以恢复H键网络，但有潜在弱的T细胞表位，

c.)VH中V20M逆转。

两组瞬时转染的结果总结如下：

DeImm 17E6突变体(C60S)表达水平对其它17E6(PER.C6中瞬时转染，10cm板中24μg)：

DeImm 17E6突变体表达水平(PER.C6中瞬时转染，10cm板中24μg)：

以小量制备DNA转染：

DeImm 119ng/ml 745ng/ml

17E6[VL49/VH33(C60Y)]-g2h(FN-＞AQ)#10(mi

ni，40μl)

C60S仅具有少量改善，而C60Y结果是有希望的。如果使用大量制备DNA支持C60Y的结果，其转染已经完成，则我们将不得不确信结合亲和性没有损失。GEAA至DGTV的回复突变改善表达约0.5倍至2倍。使用小量制备DNA的V20M结果是不可靠的，但是使用大量制备DNA重复了转染。

改善的deImm17E6的表达：下列新构建体用于转染NS0细胞：

pdHL10-DI-17E6[VH33(C60Y)/VL49(DGTV)]-g2h(FN-＞AQ)

pdHL10-DI-17E6[VH33(C60Y)/VL60.2(DGTV)]-g2h(FN-＞AQ)

pdHL10-DI-17E6[VH33(C60S)/VL49(DGTV)]-g2h(FN-＞AQ)

pdHL10-DI-17E6[VH33(C60S)/VL60.2(DGTV)]-g2h(FN-＞AQ)

pdHL10-17E6-g2h(FN-AQ)(产生该构建体以便与17E6g2h比较表达水平)。

通过HuFc-ELISA测试PER.C6中的瞬时表达：

ELISA数据显示17E6-g2h(FN-AQ)和17E6-g2h的表达水平是相当的。令人惊奇的是，(C60S)/(DGTV)组合的表达水平高于(C60Y)/(DGTV)，而较早的结果显示，C60Y和DGTV单独提高DeImm17E6表达水平1倍至2-3倍，而C60S具有最小益处。

进行17E6VH/425VL-g2h(FN至AQ)和下列瞬时转染：

显然，改变VL提高表达水平至425 Ab的水平！

不幸的是，在结合ELISA中，17E6VH/425VL-g2h(FN至AQ)不结合avb3(见图21)。

为了解决表达/结合问题，构建下列分子：

在deImm17E6 VL中的T8P和A44P替代：

带有T8P的DI-17E6VL60.2(DGTV)/DI-17E6VH33(C60Y)-g2h(FN至AQ)

带有A44P的DI-17E6VL60.2(DGTV)/DI-17E6VH33(C60Y)-g2h(FN至AQ)

带有T8P的DI-17E6VL60.2(DGTV)/DI-17E6VH33(C60S)-g2h(FN至AQ)

带有A44P的DI-17E6VL60.2(DGTV)/DI-17E6VH33(C60S)-g2h(FN至AQ)。

尽管最终构建体通过测序证实(因为限制性消化不能区分重组体和亲本)，还是转染了细胞。T8P和A44P的组合可能是必需的。将17E6deImmVL CDR移植入deImm425 VL FR中。测试deImm425VL/deImm17E6 VH的表达水平，因为deImm425 VL可能不会表达达到与hu425 VL同样的高水平。使用了DI-425VL1，但是带有P至L回复突变(VL1不结合)。因此，在CDR3中产生P至L回复突变，以恢复结合。它与deImm17E6 VH33(下面的构建体a)和ch17E6 VH(下面的构建体b)配对。使用对照Hu425VL/ch17E6 VH(下面的构建体c)和ch17E6进行瞬时转染。

瞬时结果表明，虽然(c)具有非常高的表达水平，但是带有DI-425VL的构建体a和b的表达水平甚至比ch17E6还低。

含有pdHL10-425VLFRs/DI17E6VL60.2CDRs/17E6VH33(C60S)-g2h(FN-＞AQ)-Ab和pdHL10-425VLFRs/DI-17E6VL60.2CDRs/17E6VH33(C60Y)-g2h(FN-＞AQ)-Ab的NS0-LD生产克隆。

仅具有(FR1+FR2)的移植物不能良好表达并且结合较差，而仅具有(FR3+FR4)的移植物相当好地表达并且结合良好。仅FR4不起作用。下表显示仅FR3不增加表达。

DI-17E6VL60.2CDR-425VLFR3/VH33 0.79 2.72

(C60Y)-g2h(FN-＞AQ)

选择DI-17E6-g2h(NtoQ)(C60Y)作为最终的分子，因为稳定NS0-LD克隆具有高表达水平并且它保留了结合亲和力。

实施例3

为了表征DI-17E6的整联蛋白特异性，使用了ELISA、细胞ELISA 和流式细胞术分析，并且这些分析使得我们可以鉴定作为EMD 525797特异配体的整联蛋白αv链。

EMD 525797识别纯化的αv-整联蛋白，但是如所预期的那样对纯化的αIIbβ3不具有反应性。EMD 525797还与在其细胞表面具有αv-整联蛋白的人细胞系相互作用，这独立于结合的β链亚基。EMD 525797和LM609的免疫反应性描述于下表：

对纯化整联蛋白的免疫反应性

显示LM609(鼠单克隆抗体抗αvβ3)的反应性用于比较。

对肿瘤细胞系的免疫反应性

显示LM609(鼠单克隆抗体抗αvβ3)的反应性用于比较。人肿瘤细胞系：M21、M21-L和MeWo黑素瘤；HT29和Colo205结肠癌；SKBR-3 乳腺癌；A498肾癌；和V+B2眼黑素瘤。CV-1是绿猴细胞系。

EMD 525797仅识别人和猴的αv-整联蛋白，而不识别其它种类。该罕见谱的分子基础已经通过表位作图、序列比较和x-射线共晶体学明确确立。通过使用几个物种进行的免疫沉淀和蛋白质印迹分析证实DI-17E6所识别的表位是人和猴特有的。

实施例4

免疫原性

数据显示，DI-17E6比最初鼠17E6形式的免疫原性小得多。图2显示，在实验动物中的鼠17E6血清水平随实验时间相当大地降低。

另一方面，对鼠17E6具有特异性的猴抗体的血清水平随着实验时间增加，并且与下降的鼠17E6血清水平呈负相关。

该负相关说明，鼠17E6在猴类和人类中是高免疫原性的，并且因此猴类或人分别产生MAMA和HAMA反应，这不利地影响鼠17E6的药代动力学。

研究的另一目标是进一步评价DI-17E6在猴基质胶塞实验中的抗血管发生活性。为了便于比较，使用鼠17E6作为参考化合物。

使用了4个不同的组，每一组包含一只动物：载体、30mg/Kg的鼠17E6、30mg/Kg的DI-17E6和10mg/Kg的DI-17E6。在实验开始时，猴子接受一次静脉内注射(在臂中)鼠17E6或DI-17E6，连续6天(图2)。

在3个不同时间点(从腿部)收集血清：抗体注射即刻前、抗体注射后即刻(1-2分钟)和在杀死动物之前研究结束时。分析鼠17E6和DI-17E6的水平。为了检测特定的血清稀释度，在两个不同的时间点收集血清：抗体施用后即刻和研究结束时。这在10和30mg/Kg两个DI-17E6治疗组中观察到。

然而，鼠17E6的血清水平仅在抗体注射后即刻之时可检测到。到研究结束时，它们几乎为零。实验显示了针对17E6的巨大的中和性猴抗鼠抗体(MAMA)反应，这清楚地指出，鼠17E6在猴类和其它灵长类诸如人类中具有高免疫原性。该反应导致17E6从猴血清中快速和完全的清除。因此，这表明鼠17E6在人体中通过巨大的HAMA反应更快地清除。

在另一研究中，评估单次剂量DI-17E6在猴中的药学动力学参数，并且该研究计划研究DI-17E6的免疫原性。在实验开始时，DI-17E6以1mg/Kg单次静脉内注射给药。测定期间是6周。在施用前以及施用后1、3和6周抽取血清。分析抗DI-17E6的猴抗体水平。在该研究中，使用针对该类型研究设计的特异性夹层ELISA方法(方法还没有验证)直接评估免疫原性。

图3显示，在任何测定时间点不能检测到抗DI-17E6的猴抗体，因此清楚地表明产生了低的猴抗人(MAHA)反应。

在另外的实验中，两种抗体的免疫原性通过研究两种变体17E6抗体，即鼠17E6和DI-17E6的持续的血清水平直接评估。DI-17E6在测定的每一时间点具有高血清水平，表明DI-17E6未触发抗体反应，并且因此在猴中不具有免疫原性。相比之下，在最后时间点的血清中检测不到鼠17E6(水平极低至零)。这再次表明由于鼠17E6的免疫原性，猴类产生了抗鼠17E6的清除性MAMA反应。

由于基于消除人T细胞识别表位而将17E6去免疫化，所以预计DI-17E6在人中的免疫原性低，这允许重复性治疗施用，而没有产生可能抵消治疗有效性的免疫反应难题。这是一个独特的发现，由于在猴和人基因组之间存在高度的同源性(包括17E6抗原αv整联蛋白)，所以这可以容易地扩展至人的情况。

这同时通过于2006/2007在美国进行的第一次临床研究证实。DI-17E6以不同剂量施用至5组健康志愿者(每组包括6名志愿者)：200mg/Kg；120mg/Kg；70mg/Kg，35mg/Kg，相当于250mg、500mg、1000mg和1500mg/剂量。仅在250mg的组中，一名志愿者产生了抗药物抗体，而在较高剂量组(这些剂量在标准治疗施用范围内)没有志愿者产生抗DI-17E6的任何免疫反应。与此相对照，小鼠17E6在动物模型中产生强的免疫反应。

根据T细胞表位作图和本文所使用的消除方法(其中小鼠抗体的序列在重叠肽中被分开)，去免疫化后的免疫原性损失通过体外T细胞测定法中分值的显著降低证实，表明潜在的人T细胞表位已经被缺失。因此，在轻链中，分值从147(小鼠17E6)降至92(DI-17E6)，并且在重链中分值从181(小鼠17E6)降至85(DI-17E6)。

小鼠12E6轻链

Del 17E6最终轻链

17E6小鼠重链

Del17E6最终重链

实施例5

虽然DI-17E6不与血小板血纤蛋白原受体αIIbβ3交叉反应，但是血小板也表达一些αv-整联蛋白。为了排除抗体对血小板的可能的副作用，使用人血小板丰富的血浆/胶原体外评价EMD 525797对血小板凝集的抑制。在160nM或1600nM均未检测到抗凝集活性。使用血小板丰富血浆(PRP)进行凝集和活化研究。血栓通过带有暴露的内皮下基质的灌注室形成。

实验结果可以总结如下：

任何浓度(从极低浓度到极高浓度：0.1至1000μg/ml)的DI-17E6没有诱导任何血小板活化，也没有诱导血小板凝集。

令人惊奇的是，DI-17E6以剂量依赖方式阻断弱凝集诱导剂如ADP所诱导的血小板凝集。DI-17E6没有影响强凝集诱导剂如胶原所诱导的血小板凝集。DI-17E6同样以剂量依赖方式影响(阻断)灌注室内的血小板血栓形成，并且显示抗血栓活性。

对于DI-17E6而言，弱干扰血小板凝集是意外的发现，表明DI-17E6具有潜在的治疗用途，因为在肿瘤附近有许多形成血栓的血管部位。

实施例6

小鼠异种移植肿瘤模型中的体内抗血管发生活性

通过植入/移植将包含人M21黑素瘤细胞的人皮肤移植在SCID或裸小鼠上。在皮内接种肿瘤细胞之后实验肿瘤在该组织中生长，并且最初的血管发生脉管系统从人皮肤中的血管衍生。在接下来的实验中，不具有αv-整联蛋白的M21-L细胞的使用意味着仅仅表达于所移植人皮肤内的内皮细胞上的那些整联蛋白被靶向。

DI-17E6抑制SCID小鼠-人皮肤嵌合体模型中M21-L肿瘤的生长，并且在肿瘤细胞接种之后一天开始的以1mg/剂量的剂量每周腹膜内施用3次的治疗中是有活性的(图4)。该发现证明，EMD 525797引起了对肿瘤生长的抗血管发生作用。

实施例7

在猴基质胶塞模型中，生长因子诱导的血管发生被静脉内注射EMD525797抑制。

为了扩展对EMD 525797抗血管发生活性的评估，在猴的无肿瘤模型中测试，其中在无肿瘤模型中血管发生通过血管发生因子bFGF诱导。

包含bFGF的基质胶塞被皮下植入健康食蟹猴的腹部。动物以10mg/Kg或30mg/Kg的EMD 525797静脉内注射一次。6天后，通过定量基质胶塞中的血红蛋白含量进行血管发生的评估。用EMD 525797治疗猴以剂量依赖方式阻断新的血管形成，在30mg/Kg时高度有效，但是在10mg/Kg时无活性(图5)。

实施例8

在HUVE细胞中体外试验DI17E6与化学治疗剂的组合

在本研究中，研究了来自不同种类抑制剂的代表性化学治疗剂与αv整联蛋白抑制剂西仑吉肽和DI-17E6的组合。实验设计给出了问题的答案，该问题即在肿瘤生长因子VEGFA和FGF2存在下阻断一个是否降低另一个对于阻断内皮细胞生长的IC50。试验用HUVEC和微血管内皮细胞进行，在试验中添加有刺激此类细胞生长达500％的VEGFA和FGF2。

平板以每个96孔板100μl的1μg/ml PBS中的VN于4℃包被过夜。细胞以5x10³个细胞/孔接种于100μl包含2％FCS的培养基199中。在37℃、60分钟之后，αv整联蛋白阻断剂和化学治疗剂单独或者以两倍浓度的组合，以100μl/孔加入到添加2％FCS和20ng/ml FGF-2(对于HUVE 细胞)或20ng/ml VEGF(对于HDMVEC细胞)(生长因子最终浓度为10ng/ml)的培养基199中。当组合加入时，两种测试物质以起始浓度混合，并且如单独的单个试剂那样将混合物连续稀释。在一些测定中，化学治疗剂在IC₅₀或IC₇₀浓度的恒定量αv阻断剂存在下连续稀释。将板孵育72小时，然后通过加入20μl/孔 Alamar Blue(Resazurin)确定相对细胞数。在于37℃孵育4小时之后，在Genios平板读出器(SLT)中在535/590nm(激发/发射)读取荧光。

各个点一式两份或一式三份运行。在每一板上运行包含培养基加Aiamar Blue但无细胞的试剂空白对照。空白对照从试验值中扣除，并且通常是非抑制对照数值的5-10％。

测试50μM至0.1nM范围的西仑吉肽。抗体17E6和DI-17E6以50μg/ml至0.1ng/ml测试。已经测试的化学治疗剂的起始浓度在下表中给出：

在使用常规人内皮细胞(HUVEC)的FGF刺激生长测定中或者在使用人皮肤微血管内皮细胞的VEGF刺激测定中，测试了单独的αv整联蛋白阻断物质西仑吉肽(EMD 121974)和两种αv整联蛋白功能阻断抗体，即 17E6(EMD 73034)及其去免疫形式DI-17E6(EMD 525979)，以及与普通的化学治疗剂的组合。在该测定系统中，细胞在含有作为仅有的生长刺激物的FGF-2或VEGF的降低血清(培养基199中2％FCS)培养基中培养。使用Alamar Blue测定法测定表明，生长因子FGF-2是HUVEC的最佳生长刺激剂，VEGF是HDMVEC的最佳刺激剂。在VN上生长72小时之后，接受12.5ng/ml FGF-2的HUVEC比未添加生长因子的对照细胞增加406％，并且含VEGF的比未添加生长因子对照细胞增加238％。相比之下，VEGF比FGF-2优先刺激HDMVEC(484％)。试验使用含有10ng/ml FGF-2的培养基中的HUVEC或者含有10ng/ml VEGF的培养基中的HDMVEC常规运行。当αv整联蛋白阻断剂和紫杉醇作为单一试剂加入时抑制细胞生长。在使用HUVEC的代表性的试验中，西仑吉肽的IC₅₀是700nM，17E6的IC₅₀是5ng/ml并且DI-17E6的IC₅₀是4ng/ml。当紫杉醇单独加入时IC₅₀是0.27ng/ml，但是当与西仑吉肽组合使用时IC₅₀降低至0.13ng/ml。抗体17E6和DI-17E6导致紫杉醇的IC₅₀分别降至0.18ng/ml和0.1mg/ml。DI17E6与紫杉醇组合使用的代表性结果示于图6。

使用HDMVEC同样得到紫杉醇与αv整联蛋白阻断剂的加性效应。所试验的化学治疗剂的完整列表示于下表。

结果显示，在HUVEC中DI-17E6与第二治疗剂如紫杉醇组合产生明显的加性效应，而其它化学治疗与本发明的工程化抗体组合没有或者仅有微小的加性效应。

实施例9

在不同人黑素瘤细胞中体外试验DI17E6与化学治疗剂的组合

在体外增殖测定中，研究了众所周知的且应用于肿瘤治疗中的多种化学治疗剂与DI-17E6组合在不同人黑素瘤细胞系m21、SKMEL-23、SKMEI、MeWo、WM-793中的效应。

结果显示，对于所使用的化学治疗剂而言仅存在微小的差异，在该情况下使用的是顺铂、紫杉醇、长春碱、长春新碱和替莫唑胺。

对于所使用的肿瘤细胞系而言可识别出差异。在所有情况中，DI-17E6至多产生化学治疗剂的加性效应。

总之，对于对DI-17E6不敏感的此类肿瘤细胞系，DI-17E6与化学治疗剂的组合没有或者仅产生微小的加性效应。对于对DI-17E6敏感的肿瘤细胞系，可检测到DI-17E6与化学治疗剂组合的强加性效应。在这些情况下，增殖谱对应于如对于紫杉醇+DI-17E6在HUVEC中所描述的那样(见图6)。

实施例10

DI-17E6和西仑吉肽在体外的协同组合

当体外试验DI-17E6和西仑吉肽组合时得到出乎意料的发现。NSCLC细胞系H322、A549、H1975和H460、人黑素瘤细胞系M21和肾癌细胞系ACHN、A498、Caki 1和Caki2在DI-17E6存在下用西仑吉肽处理。结果显示，在正常培养基中生长3天后，比单独存在西仑吉肽或DI-17E6时有明显更多的细胞死亡。

建立用于测试DI-17E6和西仑吉肽协同作用的代表性实验作为使用M21、CAKI-2和A498细胞的增殖测定开展：

用玻连蛋白将96孔板包被，在封闭之后加入细胞(3000-5000个细胞/孔)，4小时后(允许细胞贴壁和铺展的足够长时间)加入药物，允许在的连续稀释的西仑吉肽单独存在下或者与1μg/ml DI-17E6一起存在下生长。进一步培养细胞3天，并且按照Alamar Blue试剂提供者的说明书测定细胞生存力。

图7提供所述组合导致的M21细胞的细胞死亡率(上面的曲线：单独的西仑吉肽，下面的曲线：西仑吉肽+DI-17E6)。

图8提供所述组合导致的CAKI-2细胞的细胞死亡率(上面的曲线：单独的西仑吉肽，下面的曲线：西仑吉肽+DI-17E6)。

图9提供所述组合导致的A498细胞的细胞死亡率(上面的曲线：单独的西仑吉肽，下面的曲线：西仑吉肽+DI-17E6)。

对于两种αv整联蛋白结合剂而言这是个不寻常的发现，设想在变构抑制剂持续存在下脉冲加入竞争性抑制剂之前使用变构抑制剂预饱和系统。这给出了整联蛋白的协同阻断，单独的竞争性抑制剂或单独的立体/变构抑制剂极大地放大了效应。重要的是，竞争性抑制剂的持续存在通常是不必要的，其作用是释放初期的相互作用，允许变构抑制剂进入。

实施例11

体内测试DI-17E6与化学治疗剂组合

在人NP18-b3胰细胞中的吉西他滨加DI-17E6

在EMD 525797加吉西他滨全身共处理情况下研究了正位异种移植的胰肿瘤在裸鼠内的生长。选择吉西他滨用于正位异种移植人胰肿瘤模型的组合治疗，因为它是最认可用于该适应症的化学治疗剂。

表达αvβ3-整联蛋白的NP18-b3人胰细胞系正位植入免疫抑制小鼠的胰脏。随机选取动物，并且在1周后开始用药物和载体处理。

取出肿瘤并将肿瘤切成每块10 mg的小块。然后将这些块缝合在健康动物的胰腺中(每只动物一块)。4-6周后，取出肿瘤并再次切成块和缝合进新动物中。这些新动物随机选取，并且在一周后开始用药物和载体处理。EMD 525797以每只动物500μg的剂量腹膜内施用，一周三次。吉西他滨以50mg/Kg的次优剂量施用，一周三次(次优剂量基于以前的研究)。在第四组中，EMD 525797与基于以前实验的次优剂量吉西他滨组合。在肿瘤移植后6周测量肿瘤生长(所取出肿瘤的重量)。

以EMD 525797处理的原位肿瘤与对照载体处理的动物相比具有相似大小和重量。同样地，次优剂量的吉西他滨也没有效果。然而，在与单一治疗方案中相同剂量下，吉西他滨加EMD 525797具有协同活性，肿瘤缩小52％(图10)。

在人M21或MeWO黑素瘤异种移植模型中的顺铂/达卡巴嗪加DI-17E6

根据众所周知的标准方法，将确信表达αvβ3整联蛋白的M21或MeWo人黑素瘤细胞皮下接种入SCID或裸鼠中。

DI-17E6与在黑素瘤临床治疗中使用的两种化学治疗剂顺铂(cPT)或达卡巴嗪(DTIC)一起全身施用。

DI-17E6以27.2mg/Kg(相当于大约500μl/ml血清)的次优每周维持剂量，从M21或MeWo细胞皮下注射入动物的同一天腹膜内施用，每周一次。DTIC以50mg/Kg腹膜内施用，每周一次，cPT以10mg/Kg腹膜内施用，每周一次，每一施用在肿瘤细胞注射后11天开始。

使用顺铂在M21异种移植模型中得到的结果示于图11。与前面的体外数据相比，顺铂加DI-17E6的组合与单独施用任何一种药物处理相比，在体内明显地做出响应引起统计学显著的协同增加。

使用DTIC在MeWo异种移植模型中得到的结果示于图12。与前面的体外数据相比，顺铂加DI-17E6的组合与单独施用任何一种药物处理相比，在体内明显地做出响应引起具有统计学显著的协同增加。

实施例12

在人CAKI-1肾癌异种移植小鼠模型中体内试验DI-17E6

根据众所周知的标准方法，将CAKI-1皮下接种入SCID或裸鼠中。

从M21或MeWo细胞皮下注射入动物的同一天，DI-17E6以不同剂量全身腹膜内施用，每周一次。

图13显示，令人惊奇地，DI-17E6从低(1μg/ml)至中等(100μg/ml血清)剂量以几乎相同的程度(没有实际的剂量效应)降低肿瘤体积/大小，而施用高剂量(500μg/ml)导致完全缩小肿瘤体积。

实施例13：

DI-17E6与西妥昔单抗在CAKI-1人肾细胞癌异种移植模型中的组合效应

肾细胞癌细胞系CAKI-1在包含10％FCS(热灭活的)加2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI中生长。在细胞汇合时，通过在无阳离子PBS中洗涤一次，然后在PBS中的胰蛋白酶(0.5μg/ml)/EDTA(0.2μg/ml)溶液中于37℃孵育3分钟将细胞传代。从培养基中回收细胞，离心，置于培养基中并计数。

在该研究中使用的动物由HARLAN INTERFAUNA IBERICAS.L.(Sant Feliu de Codines(Barcelona)，西班牙)提供并且在最少5天的适应阶段栖息在无特定病原体的设施的隔离室内。

在适应阶段记录所有观察结果。所有动物经过兽医检查以确保动物健康。

对于所有组，在实验的第0天(细胞注射的同一天)开始治疗。

用产物或载体以10mg/ml的量腹膜内治疗动物，对于EMD 525797为每周一次，对于Erbitux为每周两次。

将EMD 525797的治疗剂量调整至100μg/ml的预期血清峰值。为了达到该血清峰值，按照如下表所述的17.1mg/kg的单次加载剂量加5.1mg/kg的多次(每周)维持剂量的方案向动物施用。

每日观察所有动物，控制它们的身体健康状况、行为、损伤的存在和任何临床病征。

组：

带有人肾CAKI-1异种移植肿瘤的动物在肿瘤细胞接种时的第0天开始用DI17E6、Erbitux或两者的组合治疗。治疗期间对于DI17E6是40天，对于Erbitux组和组合组是29天。追踪肿瘤生长直至肿瘤细胞接种后111天。用17.1mg/kg DI17E6的初始剂量治疗以及后续用5.1mg/kgDI17E6每周一次治疗的治疗在第40天治疗结束时产生100μg/ml的峰值，引起明显的肿瘤生长抑制(T/C：25％)。

在第40天后直至观察阶段结束仍观察到生长延缓。以4mg/kg或12mg/kg Erbitux每周两次治疗引起强的且明显的抗肿瘤效应。在第29天治疗结束时的T/C是9％。对于DI17E6加4mg/kg Erbitux一周两次的组合和DI17E6加12mg/kg一周两次的组合，观察到相似的强抗肿瘤效应。在第29天治疗结束时的T/C分别是10％和9％(见表1)。

应当注意到，10μg/ml血清/血浆对应于0.55mg/Kg体重。

然而，在单独的Erbitux治疗组中的肿瘤在停止治疗后开始再次生长。相比之下，在两个组合组中，肿瘤生长的抑制一直持续，这从降低的肿瘤大小平均值和中位数可以明显看出(图14)。

在观察阶段结束时，在两个组合组中仅有一个肿瘤达到了第7天的体积，第7天是第一次肿瘤大小测量日。在Erbitux单一治疗组中，有3个肿瘤生长至相当大的大小(＞1000mm³)，并且它们中的大多数生长超过第7天的肿瘤大小。

一般而言，如通过实验过程中的重量增加所指示，所有治疗均被良好耐受。在一次测量日时的载体组和DI17E6治疗组中的体重降低很可能是缺乏水供应造成的。在两个相关组中，体重减轻是可以通过后来的进行性体重增长逆转的。

以17.1mg/kg的初始剂量治疗，然后以5.1mg/kgDI17E6的每周剂量治疗导致在治疗阶段达到100μg/ml峰值，引起人肾CAKI-1肿瘤生长的明显生长抑制。同样，以两种不同剂量Erbitux以每两周一次的方案治疗引起明显的肿瘤生长抑制。两种剂量的Erbitux在抗肿瘤活性中有近似相等的效力。DI17E6与4mg/kg Erbitux或12mg/kg Erbitux的组合也产生有效的抗肿瘤效应，这与治疗阶段中单一Erbitux治疗是相当的。

然而，Erbitux单一治疗与组合治疗间的显著差异是在第29天治疗停止后的生长行为。直至停止治疗后的第82天，组合治疗组中仅一个肿瘤生长至第7天(肿瘤测量的第一天)的大小，这意味着用DI17E6和Erbitux治疗的肿瘤退化或显示稳定的疾病。

与此相比，在仅用Erbitux治疗的两个组中，一些肿瘤在停止治疗后生长成相当大的大小(从429至3581mm³)，表明DI17E6和Erbitux组合能够防止Erbitux治疗后肿瘤生长的复发。

DI-17E6对以酪氨酸激酶抑制剂，诸如西妥昔单抗

治疗的强协同作用可以看作是不同凡响的，并且开放了大有希望的肿瘤组合治疗领域。

Claims

1.工程化重组抗αv-整联蛋白杂合抗体，其包含

(i)轻链CDR区：

CDR1：RASQDISNYLA，

CDR2：YTSKIHS，

CDR3：QQGNTFPYT；

(ii)重链CDR区：

CDR1：SFWMH，

CDR2：YINPRSGYTEYNEIFRD，

CDR3：FLGRGAMDY，

(iii)轻链构架区：

FR-1：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC，

FR-2：WYQQKPGKAPKLLIY，

FR-3：GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC，

FR-4：FGQGTKVEIK，

(iv)重链构架区：

FR1：QVQLQQSGGELAKPGASVKVSCKASGYTFS，

FR2：WVRQAPGQGLEWIG，

FR3：KATMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAS，

FR4：WGQGTTVTVSS，

和

(v)来自人IgG的重链恒定区和轻链恒定区。

2.权利要求1的工程化抗体，其中重链恒定区来自IgG2。

3.权利要求2的工程化抗体，其中所述重链恒定区包含铰链区，该铰链区被修饰的IgG1铰链区替换。

4.权利要求3的工程化抗体，其中所述修饰的IgG1铰链区包含序列EPKSSDKTHTCPPCP。

5.权利要求2至4任意一项的工程化抗体，其中通过将第297位的氨基酸N替换成Q修饰所述IgG2恒定区。

6.权利要求5的工程化抗体，其中将第296位的氨基酸残基F替换成A，以便消除由第297位的修饰所产生的T细胞表位。

7.权利要求1至4任意一项的工程化抗体，其中轻链恒定区是人κ。

8.权利要求1-4任意一项的重组抗αv-整联蛋白杂合抗体，其由下列构成：

(i)可变和恒定轻链序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTSKIHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC和

(ii)可变和恒定重链序列：

QVQLQQSGGELAKPGASVKVSCKASGYTFSSFWMHWVRQAPGQGLEWIGYINPRSGYTEYNEIFRDKATMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASFLGRGAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

9.融合蛋白，包含在其C-末端融合至细胞因子或生长因子的权利要求1-8任意一项的抗体。

10.DNA分子，其编码如权利要求1-9任意一项详细说明的抗体或抗体融合蛋白。

11.表达载体，其包含权利要求10的DNA分子。

12.蛋白质表达系统，其包含用权利要求11的表达载体转化的哺乳动物宿主细胞。

13.药物组合物，其包含药物有效量的如权利要求1-9任一项详细说明的抗体或抗体融合蛋白以及任选地可药用载体、稀释剂或赋形剂。

14.药物组合物，其包含第一和第二药物有效治疗剂以及任选地可药用载体、稀释剂或赋形剂，其中第一治疗剂是如权利要求1-9任一项详细说明的抗体或抗体融合蛋白，并且第二治疗剂选自化学治疗剂、血管发生抑制剂或抗肿瘤剂。

15.权利要求14的药物组合物，其中所述抗肿瘤剂是抗肿瘤抗体。

16.权利要求15的药物组合物，其中所述抗肿瘤抗体是抗EGFR抗体或抗Her2抗体。

17.权利要求16的药物组合物，其中所述抗肿瘤抗体是抗EGFR抗体西妥昔单抗或马妥珠单抗。

18.权利要求14的药物组合物，其中所述血管发生抑制剂是整联蛋白抑制剂西仑吉肽。

19.权利要求14的药物组合物，其中所述化学治疗剂是顺铂、DTIC或达卡巴嗪。

20.如权利要求1-9任意一项详细说明的工程化抗体或抗体融合蛋白用于制造治疗实体瘤的药物的用途。

21.如权利要求1-9任意一项详细说明的工程化抗体或抗体融合蛋白用于制造治疗肿瘤转移的药物的用途。

22.权利要求20的工程化抗体的用途，其中对肿瘤生长的影响独立于由其阻断血管发生效果所导致的间接抗肿瘤效果。

23.如权利要求13-19任一项所述的药物组合物用于制造治疗肿瘤的药物的用途。

24.如权利要求16所述的药物组合物用于制造治疗肿瘤的药物的用途，其中所述抗肿瘤抗体是抗EGFR抗体，并且停止施用工程化抗体之后所述工程化重组抗体阻止或延缓肿瘤的再生长。

25.权利要求24的药物组合物的用途，其中所述工程化抗体是权利要求8的抗体并且所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗。