JP5341889B2 - 操作された抗αＶインテグリンハイブリッド抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、インテグリンレセプター、特にαVインテグリンレセプターサブユニットと特異的に結合する操作された抗体に関する。本抗体は、公知のマウス抗インテグリン抗体の抗原結合部位（CDR）を含むとともに、ハイブリッド軽鎖可変配列、変異重鎖可変配列（Fr）および改変重鎖定常配列を含む。この新規な抗体は、改善された免疫原性特性および発現特性を有し、単独療法だけでなく、併用療法とりわけ他の血管形成および腫瘍阻害剤（例えばシレンジチド、セツキシマブ）並びに化学療法剤との併用でヒトにおいて優れた抗血管形成活性とともに抗腫瘍活性を誘引する。
癌治療は依然としてヘルスケアにおける主要な問題である。癌治療のために提唱される1つの戦略は血管形成の阻害、したがって、腫瘍に増殖関連手段を提供する血管の生成および発達を阻害することである。第二の戦略は、腫瘍細胞表面上の特異的なレセプターの直接阻害（例えばハーセプチン（Herceptin(商標)）によるHer2の阻害またはセツキシマブ（Erbitux(商標)）によるEGFRの阻害）である。
インテグリンの阻害物質は潜在的に有用な抗腫瘍剤であると考えられる。なぜならばインテグリンは腫瘍の新生血管系で発現され、血管形成を仲介するからである。さらにまた、インテグリンはある種の腫瘍細胞で発現され、腫瘍の増殖および生存を直接的に促進することができる。
インテグリンは酵素的活性をもたないが、しかしながらリガンドと結合することができるインテグリン（リガンドコンピテントインテグリン）は、ECMのタンパク質と結合することによって活性化される。一方でインテグリンは、細胞内キナーゼカスケードを始動させて細胞の増殖および生存を調節し、他方で細胞骨格と結合して細胞の付着および移動を駆動する。αvβ5インテグリンは特異的にビトロネクチンと結合し、一方、αvβ3はまた暫定的ECMの他の巨大分子と結合する。αvβ3は、最初、悪性メラノーマ上の進行依存性マーカーとして観察された。前記は、in vivoでのメラノーマの増殖およびin vitroでのメラノーマの生存を強化した。αvβ3ブロッカーはこれらの作用を逆行させた。その後、αvβ3は他の腫瘍（神経膠芽腫、腎癌、卵巣癌および他の癌を含む）で見出された。αvβ3はまた、多くの悪性疾患のECで広く過剰発現された。in vitroでは、腫瘍由来増殖因子によって活性化された血管形成モデルは、急激に成長し始めた血管系上でαvβ3を過剰発現し、かつこのαvβ3を必要としたが、一方、αvβ3およびαvβ5のブロッキングによってこの血管形成表現型を抑制することができた。αvβ5はまた、いくつかの腫瘍由来増殖因子によって誘発される新生血管系を支援することが示された。αvβ5の阻害は腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することができる。
インテグリンの阻害物質は潜在的に有用な抗腫瘍剤であると考えられる。なぜならばインテグリンは腫瘍の新生血管系で発現され、血管形成を仲介するからである。さらにまた、インテグリンはある種の腫瘍細胞で発現され、腫瘍の増殖および生存を直接的に促進することができる。
インテグリンは酵素的活性をもたないが、しかしながらリガンドと結合することができるインテグリン（リガンドコンピテントインテグリン）は、ECMのタンパク質と結合することによって活性化される。一方でインテグリンは、細胞内キナーゼカスケードを始動させて細胞の増殖および生存を調節し、他方で細胞骨格と結合して細胞の付着および移動を駆動する。αvβ5インテグリンは特異的にビトロネクチンと結合し、一方、αvβ3はまた暫定的ECMの他の巨大分子と結合する。αvβ3は、最初、悪性メラノーマ上の進行依存性マーカーとして観察された。前記は、in vivoでのメラノーマの増殖およびin vitroでのメラノーマの生存を強化した。αvβ3ブロッカーはこれらの作用を逆行させた。その後、αvβ3は他の腫瘍（神経膠芽腫、腎癌、卵巣癌および他の癌を含む）で見出された。αvβ3はまた、多くの悪性疾患のECで広く過剰発現された。in vitroでは、腫瘍由来増殖因子によって活性化された血管形成モデルは、急激に成長し始めた血管系上でαvβ3を過剰発現し、かつこのαvβ3を必要としたが、一方、αvβ3およびαvβ5のブロッキングによってこの血管形成表現型を抑制することができた。αvβ5はまた、いくつかの腫瘍由来増殖因子によって誘発される新生血管系を支援することが示された。αvβ5の阻害は腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することができる。
インテグリンは、腫瘍侵襲血管、メラノーマおよび他のいくつかの悪性疾患で過剰に発現され、さらに増殖因子に対する細胞の応答を調節する。血管という区画は有望な治療標的である。なぜならば、固形腫瘍は、酸素、栄養、解毒および血液介在転移の分散に依存し；血管形成表現型への切り替により、悪性疾患誘発において別個に分離される過程が区分され（前記は治療的介入を受けやすい）；さらに血管系は持続的変化を受けるが、腫瘍と比較して上皮細胞はなおゲノムの安定性を有し、変異によって薬剤耐性となる可能性は低いからである。
最初の抗インテグリン薬はシレンジチドであり、有用な抗腫瘍剤であると考えられる（FA Eskens et al. 2003, Eur J Cancer 39:917-26）。しかしながら、シレンジチドは頻繁に投与する必要がある小分子である。シレンジチドの構造（例えば選択された塩の形態）は以下で開示されている（EP0770622、WO0015244およびPCT/us0701446；前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
二番目の抗インテグリン薬はマウスのmAb 17E6（EMD 73034）であり、これは、ヒトインテグリンレセプター保持細胞のαvインテグリンサブユニットを特異的に阻害する。マウスIgG1抗体は、例えばMitjansら（J Cell Sci 1995, 108:2825）および米国特許5.985,278号およびEP 719859によって開示されている。完全な可変重鎖および軽鎖配列が配列番号:25および26に示されている（図20A、B）。マウス17E6は、精製してセファロースに固定したヒトαvβ3で免疫したマウスから作製された。免疫マウスの脾臓リンパ球をマウスのミエローマ細胞と融合させ、生じたハイブリドーマクローンの1つがモノクローナル抗体17E6（EMD 73034）を産生した。マウスのmAb 17E6はハイブリドーマ細胞株272-17E6によって産生され、アクセッション番号DSM ACC2160として寄託されている。
最初の抗インテグリン薬はシレンジチドであり、有用な抗腫瘍剤であると考えられる（FA Eskens et al. 2003, Eur J Cancer 39:917-26）。しかしながら、シレンジチドは頻繁に投与する必要がある小分子である。シレンジチドの構造（例えば選択された塩の形態）は以下で開示されている（EP0770622、WO0015244およびPCT/us0701446；前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
二番目の抗インテグリン薬はマウスのmAb 17E6（EMD 73034）であり、これは、ヒトインテグリンレセプター保持細胞のαvインテグリンサブユニットを特異的に阻害する。マウスIgG1抗体は、例えばMitjansら（J Cell Sci 1995, 108:2825）および米国特許5.985,278号およびEP 719859によって開示されている。完全な可変重鎖および軽鎖配列が配列番号:25および26に示されている（図20A、B）。マウス17E6は、精製してセファロースに固定したヒトαvβ3で免疫したマウスから作製された。免疫マウスの脾臓リンパ球をマウスのミエローマ細胞と融合させ、生じたハイブリドーマクローンの1つがモノクローナル抗体17E6（EMD 73034）を産生した。マウスのmAb 17E6はハイブリドーマ細胞株272-17E6によって産生され、アクセッション番号DSM ACC2160として寄託されている。
マウス17E6は、インテグリンと細胞外マトリックスとの相互作用と拮抗し、内皮細胞および腫瘍細胞の機能を混乱させる。この抗体の主要な作用には、内皮細胞（EC）の接着および移動の阻止、それらのアポトーシスの誘導、および増殖因子経路の活性化の抑制が含まれる。前記抗体によるブロッキングは、活性化された内皮細胞およびいくらかの腫瘍細胞の両方の生存を直接的に抑制する。
モノクローナル抗体（例えば17E6）は、一般的には細胞外タンパク質-タンパク質相互作用の阻害、例えばリガンド-レセプター相互作用の阻害に対して有用である。しかしながら、モノクローナル抗体は発現がしばしば困難であり、さらにしばしば免疫応答（例えば抗イディオタイプ応答）を惹起し、前記はそれらの有効性を限定する。
これらのデータおよびこれまで収集された重要な情報によって、インテグリンと特異的に結合し、効率的に発現され、さらにヒトで相対的に非免疫原性である、改善された特性を有する改変マウス17E6抗体を癌の治療薬剤として開発する必要性が認められた。そのような操作された抗体は、腫瘍の発達を間接的（腫瘍の血管系を介して）および直接的に（腫瘍細胞自体に対して）抑制する潜在能力を有するはずである。
モノクローナル抗体（例えば17E6）は、一般的には細胞外タンパク質-タンパク質相互作用の阻害、例えばリガンド-レセプター相互作用の阻害に対して有用である。しかしながら、モノクローナル抗体は発現がしばしば困難であり、さらにしばしば免疫応答（例えば抗イディオタイプ応答）を惹起し、前記はそれらの有効性を限定する。
これらのデータおよびこれまで収集された重要な情報によって、インテグリンと特異的に結合し、効率的に発現され、さらにヒトで相対的に非免疫原性である、改善された特性を有する改変マウス17E6抗体を癌の治療薬剤として開発する必要性が認められた。そのような操作された抗体は、腫瘍の発達を間接的（腫瘍の血管系を介して）および直接的に（腫瘍細胞自体に対して）抑制する潜在能力を有するはずである。
本発明は、モノクローナルマウス抗体17E6（EMD 73034）の生物学的特徴を有するが、工業的生産および製造スケールにおいて、とりわけヒトに対する免疫原性、および、哺乳動物発現系における十分な発現に関して改善された特性を有する新規な抗体に関する。
本発明は、改変された配列を有するいくつかの操作された抗体を提供する。これらの抗体は、マウス抗体17E6と同じレセプターエピトープを認識するが、ヒトにおける免疫原性の低下を示し、さらに、対応する非改変抗体より良好に発現されえる。
ヒトにおける免疫原性の低下を得るためにマウス由来抗体を改変または操作することは、通例では発現および／または結合親和性の明らかな低下によって達成されることは理解されよう。したがって、周知の標準的技術によるキメラ化またはヒト化は通常、発現、結合親和性などの低下をもたらし、この問題は、特別な復帰変異または他の手段によって単に部分的に解決されえるだけである。低免疫原性、高発現および十分な結合親和性に関して同時に成功をもたらす、対応タンパク質分子内の改変を予測することはできない。したがって、解決されるべき第一の問題として当該薬剤に対するヒトでの免疫応答を除去または低下させるためにT細胞エピトープの数を減少させることは、発現または結合親和性またはその両方の許容不能な低下をもたらす可能性があり、これは解決されねばならないさらに別の問題となろう。
したがって、本発明の目的は、免疫原性の低下、十分な発現および良好な結合親和性を示す、一定の範囲の標的特異性を有する操作された抗体を提供することである。これらの特性は、原型分子のマウスmAb 17E6内の驚くべき改変によって入手することができる。実験の多くで、結果をマウス17E6抗体と直接比較するのではなくキメラ17E6型（ヒト定常領域を含む）と比較することは道理にかなっている。従来技術による成功したキメラ抗体は、通例では十分な結合親和性および十分な発現を示すが、しばしばヒトの個体で免疫原性応答を誘引する。
本発明は、改変された配列を有するいくつかの操作された抗体を提供する。これらの抗体は、マウス抗体17E6と同じレセプターエピトープを認識するが、ヒトにおける免疫原性の低下を示し、さらに、対応する非改変抗体より良好に発現されえる。
ヒトにおける免疫原性の低下を得るためにマウス由来抗体を改変または操作することは、通例では発現および／または結合親和性の明らかな低下によって達成されることは理解されよう。したがって、周知の標準的技術によるキメラ化またはヒト化は通常、発現、結合親和性などの低下をもたらし、この問題は、特別な復帰変異または他の手段によって単に部分的に解決されえるだけである。低免疫原性、高発現および十分な結合親和性に関して同時に成功をもたらす、対応タンパク質分子内の改変を予測することはできない。したがって、解決されるべき第一の問題として当該薬剤に対するヒトでの免疫応答を除去または低下させるためにT細胞エピトープの数を減少させることは、発現または結合親和性またはその両方の許容不能な低下をもたらす可能性があり、これは解決されねばならないさらに別の問題となろう。
したがって、本発明の目的は、免疫原性の低下、十分な発現および良好な結合親和性を示す、一定の範囲の標的特異性を有する操作された抗体を提供することである。これらの特性は、原型分子のマウスmAb 17E6内の驚くべき改変によって入手することができる。実験の多くで、結果をマウス17E6抗体と直接比較するのではなくキメラ17E6型（ヒト定常領域を含む）と比較することは道理にかなっている。従来技術による成功したキメラ抗体は、通例では十分な結合親和性および十分な発現を示すが、しばしばヒトの個体で免疫原性応答を誘引する。
主として、本発明は、ヒトにおける免疫原性が低下または除去された、操作された組換え抗αvインテグリンハイブリッド抗体を提供する。前記抗体は以下を含む：
（i）マウスモノクローナル抗αvインテグリン抗体17E6に由来するCDR軽鎖および重鎖領域；
（ii）ヒト化モノクローナル抗EGFR抗体425から取得される軽鎖フレームワーク領域；
（iii）マウスモノクローナル抗αvインテグリン抗体17E6に由来する重鎖フレームワーク領域；および
（iv）ヒトIgGに由来する重鎖定常領域およびヒト定常軽鎖領域。
ヒト化モノクローナル抗体425（マツズマブ）は公知であり（例えばEP531472）、そのマウスの対応物である425（マウスMAb 425、ATCC HB9629）に由来する。この抗体はヒトA431癌腫細胞株に対して作製され、ヒト表皮増殖因子レセプター（EGFR）の外部ドメイン上のポリペプチドエピトープと結合することが見出された。前記抗体は、低親和性および高親和性EGFR部位の両方で上皮増殖因子（EGF）の結合を阻害することが見出された。臨床試験で、マツズマブは高い有効性を示した。マツズマブの軽鎖のFR配列は、下記および特許請求の範囲に記載される配列番号:12−15で明示される。
抗インテグリンマウス抗体17E6の改変重鎖フレームワーク（FR）領域と、異なる特異性を有するヒト化抗EGFR抗体h425（マツズマブ）の軽鎖フレームワーク領域との結合によって、他の改変はさておき、優れた免疫原性特性を有するいくつかの抗体が生成され、これらの抗体はさらにまた標準的な哺乳動物の発現系で十分に発現される。mAb h425のVL領域（FR）を用いたとき、驚くべきことに発現レベルは明瞭に増加するが、後で示すように、他の特性、とりわけ結合親和性を改善するためにはさらに別の変異を実施する必要があった。
（i）マウスモノクローナル抗αvインテグリン抗体17E6に由来するCDR軽鎖および重鎖領域；
（ii）ヒト化モノクローナル抗EGFR抗体425から取得される軽鎖フレームワーク領域；
（iii）マウスモノクローナル抗αvインテグリン抗体17E6に由来する重鎖フレームワーク領域；および
（iv）ヒトIgGに由来する重鎖定常領域およびヒト定常軽鎖領域。
ヒト化モノクローナル抗体425（マツズマブ）は公知であり（例えばEP531472）、そのマウスの対応物である425（マウスMAb 425、ATCC HB9629）に由来する。この抗体はヒトA431癌腫細胞株に対して作製され、ヒト表皮増殖因子レセプター（EGFR）の外部ドメイン上のポリペプチドエピトープと結合することが見出された。前記抗体は、低親和性および高親和性EGFR部位の両方で上皮増殖因子（EGF）の結合を阻害することが見出された。臨床試験で、マツズマブは高い有効性を示した。マツズマブの軽鎖のFR配列は、下記および特許請求の範囲に記載される配列番号:12−15で明示される。
抗インテグリンマウス抗体17E6の改変重鎖フレームワーク（FR）領域と、異なる特異性を有するヒト化抗EGFR抗体h425（マツズマブ）の軽鎖フレームワーク領域との結合によって、他の改変はさておき、優れた免疫原性特性を有するいくつかの抗体が生成され、これらの抗体はさらにまた標準的な哺乳動物の発現系で十分に発現される。mAb h425のVL領域（FR）を用いたとき、驚くべきことに発現レベルは明瞭に増加するが、後で示すように、他の特性、とりわけ結合親和性を改善するためにはさらに別の変異を実施する必要があった。
さらに別の重要な改変は、マウス17E6の重鎖のCDR2領域内のアミノ酸残基の置換である。システイン残基をチロシン残基で置換することによって、驚くべきことにタンパク質の安定性および発現レベルは、少なくともキメラ17E6型と比較して明瞭に改善されえる。
原型マウスIgG1重鎖定常領域を、改変ヒトIgG1ヒンジ領域をもつヒトIgG2で置換することによって、発現および安定性で更なる改善を得ることができる。好ましい実施態様では、前記IgG2は、297位のアルギニン残基をグルタミンで置換することによって（N297Q）さらに改変することができる。この改変は、N-グリコシル化部位を除去し、したがって操作されるべき抗体のADCCおよびCDC活性を停止または低下させる。残念なことにこの手段により、明らかに新規なT細胞エピトープの生成により免疫原性は増加する。驚くべきことに、296位のフェニルアラニンをアラニンで置換することによって、低免疫原性を回復させることができる。
マウスmAb 17E6の原型重鎖フレームワーク領域内のT細胞エピトープの数を減少させるために、多数の変異導入を実施した。詳述すれば、マウス抗体の以下の位置、A9、E13、M20、K38、R40、A72、S76、Q82、G85、T87、S91およびS113の1つ、2つ以上、または全ての変異が免疫原性の低下に要求される。
ある好ましい本発明の操作抗体（最高値の改善特性を示す）は、以下では“DI-17E6”または同義語として“DI-17E6γ2h(N297Q)”若しくは“EMD525797”と称され、以下の配列を有する：
（i）可変および定常軽鎖配列（配列番号:3、図1C）：
原型マウスIgG1重鎖定常領域を、改変ヒトIgG1ヒンジ領域をもつヒトIgG2で置換することによって、発現および安定性で更なる改善を得ることができる。好ましい実施態様では、前記IgG2は、297位のアルギニン残基をグルタミンで置換することによって（N297Q）さらに改変することができる。この改変は、N-グリコシル化部位を除去し、したがって操作されるべき抗体のADCCおよびCDC活性を停止または低下させる。残念なことにこの手段により、明らかに新規なT細胞エピトープの生成により免疫原性は増加する。驚くべきことに、296位のフェニルアラニンをアラニンで置換することによって、低免疫原性を回復させることができる。
マウスmAb 17E6の原型重鎖フレームワーク領域内のT細胞エピトープの数を減少させるために、多数の変異導入を実施した。詳述すれば、マウス抗体の以下の位置、A9、E13、M20、K38、R40、A72、S76、Q82、G85、T87、S91およびS113の1つ、2つ以上、または全ての変異が免疫原性の低下に要求される。
ある好ましい本発明の操作抗体（最高値の改善特性を示す）は、以下では“DI-17E6”または同義語として“DI-17E6γ2h(N297Q)”若しくは“EMD525797”と称され、以下の配列を有する：
（i）可変および定常軽鎖配列（配列番号:3、図1C）：
（ii）可変および定常重鎖配列（配列番号:4、図1D）：
配列中、下線付き配列はCDR（太字）を含む可変領域を示す。軽鎖定常領域はヒトカッパである。重鎖定常領域は、改変IgG1ヒンジ領域EPKSSDKTHTCPPCP（配列番号:40）を有するヒトIgG2である。
DI-17E6の対応するDNA配列は図17−19に示されている。
DI-17E6の対応するDNA配列は図17−19に示されている。
本発明はまた、サイトカイン（例えばIL-2、IL-12、TNFa、IFNa、IFNb）または増殖因子と直接またはリンカー分子を介して融合される上記および下記に記載の操作された抗体に関する。抗体融合サイトカインはまた腫瘍の治療および／または血管形成関連疾患で用いることができる。なぜならば、サイトカイン部分は細胞傷害性の強化に寄与することができるからである。抗体融合タンパク質、特にイムノサイトカインは当分野では周知である。本発明の好ましい融合タンパク質は、DI-17E6-IL2またはDI-17E6-(L)-IL2（Lはリンカーペプチド）である。
本発明にしたがえば、記載の操作抗体は、血管形成関連疾患および／または腫瘍関連疾患の治療のための医薬組成物で用いることができることが示された。驚くべきことに、本発明の抗体は腫瘍増殖に対して直接的な作用を示し、この作用は血管形成を妨害することによって惹起される間接的な抗腫瘍効果とは無関係のようである。
第二の治療薬剤を含む医薬組成物およびそれらの使用を提供することもまた本発明の目的である。前記第二の治療薬剤は、好ましくは化学療法剤、例えばシスプラチン、ドキソルビシンなど、αv-インテグリン阻害剤、例えばRGDペプチド、例えばシレンジチド、またはチロシンキナーゼ阻害剤、特に抗erbB1またはerbB2抗体である。好ましい例は、セツキシマブ（モノクローナル抗体c225、Erbitux(商標)）、マツズマブ（ヒト化モノクローナル抗体425）、またはHerceptin(商標)（ヒト化抗体4D5）である。
本発明にしたがえば、本明細書で開示される前記医薬組成物中の操作された抗体は、第二の治療薬剤の作用を、多くの事例で相乗的相互作用により強化することができる。
本発明にしたがえば、好ましい操作抗体DI-17E6または同様な変種と抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）との組合せは、驚くべき効果、すなわち操作抗体（好ましくはDI-17E6）の投与を停止した後の腫瘍組織の再増殖の遅延または防止をもたらす。
第二の治療薬剤を含む医薬組成物はまた、第一のパッケージに操作抗体（好ましくはDI-17E6）、および第二のパッケージに第二の治療薬剤（例えば血管形成阻害剤、化学療法剤、またはチロシンキナーゼ阻害剤（例えば抗EGFR抗体若しくは抗Her2抗体））を含むパーツのキットとして用いることができる。前記キットの好ましい第二の治療薬剤は、血管形成阻害剤シレンジチド、または抗EGFR抗体セツキシマブ若しくはマツズマブ、または化学療法剤である。
本発明にしたがえば、記載の操作抗体は、血管形成関連疾患および／または腫瘍関連疾患の治療のための医薬組成物で用いることができることが示された。驚くべきことに、本発明の抗体は腫瘍増殖に対して直接的な作用を示し、この作用は血管形成を妨害することによって惹起される間接的な抗腫瘍効果とは無関係のようである。
第二の治療薬剤を含む医薬組成物およびそれらの使用を提供することもまた本発明の目的である。前記第二の治療薬剤は、好ましくは化学療法剤、例えばシスプラチン、ドキソルビシンなど、αv-インテグリン阻害剤、例えばRGDペプチド、例えばシレンジチド、またはチロシンキナーゼ阻害剤、特に抗erbB1またはerbB2抗体である。好ましい例は、セツキシマブ（モノクローナル抗体c225、Erbitux(商標)）、マツズマブ（ヒト化モノクローナル抗体425）、またはHerceptin(商標)（ヒト化抗体4D5）である。
本発明にしたがえば、本明細書で開示される前記医薬組成物中の操作された抗体は、第二の治療薬剤の作用を、多くの事例で相乗的相互作用により強化することができる。
本発明にしたがえば、好ましい操作抗体DI-17E6または同様な変種と抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）との組合せは、驚くべき効果、すなわち操作抗体（好ましくはDI-17E6）の投与を停止した後の腫瘍組織の再増殖の遅延または防止をもたらす。
第二の治療薬剤を含む医薬組成物はまた、第一のパッケージに操作抗体（好ましくはDI-17E6）、および第二のパッケージに第二の治療薬剤（例えば血管形成阻害剤、化学療法剤、またはチロシンキナーゼ阻害剤（例えば抗EGFR抗体若しくは抗Her2抗体））を含むパーツのキットとして用いることができる。前記キットの好ましい第二の治療薬剤は、血管形成阻害剤シレンジチド、または抗EGFR抗体セツキシマブ若しくはマツズマブ、または化学療法剤である。
要約すれば、本発明は以下に関連する：
−以下の（i）−（iv）を含む操作された組換え抗αvインテグリンハイブリッド抗体：
（i）マウスモノクローナル抗αvインテグリン抗体17E6に由来するCDR軽鎖および重鎖領域；
（ii）ヒト化モノクローナル抗EGFR抗体425から取得される軽鎖フレームワーク領域；
（iii）マウスモノクローナル抗αvインテグリン抗体17E6に由来する重鎖フレームワーク領域；および
（iv）ヒトIgGに由来する重鎖定常領域およびヒト定常軽鎖領域；
−記載の操作された抗体であって、
CDR軽鎖領域（マウスモノクローナル抗αvインテグリン抗体17E6に由来する）が、
CDR1：RASQDISNYLA（配列番号:5）
CDR2：YTSKIHS（配列番号:6）
CDR3：QQGNTFPYT（配列番号:7）であり、
さらにCDR重鎖領域が、
CDR1：SFWMH（配列番号:8）
CDR2：YINPRSGYTE(X)NEIFRD（配列中、X = CまたはY）（配列番号:11）、
CDR3：FLGRGAMDY（配列番号:10）である、前記操作抗体；
−重鎖のCDR2領域が配列YINPRSGYTEYNEIFRD（配列番号:9）有する、記載の操作抗体；
−記載の操作抗体であって、
軽鎖フレームワーク領域（ヒト化モノクローナル抗EGFR抗体425に由来する）が、
FR-1：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC（配列番号:12）
FR-2：WYQQKPGKAPKLLIY（配列番号:13）
FR-3：GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC（配列番号:14）
FR-4：FGQGTKVEIK（配列番号:15）を含む、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、マウス抗体17E6に由来する前記重鎖フレームワーク領域（FR1−FR4）が、1−15アミノ酸残基位置で変異し、T細胞エピトープの数、したがってヒトでの免疫原性が低下または除去される、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、前記重鎖フレームワーク領域が、マウス抗体の以下の位置、A9、E13、M20、K38、R40、A72、S76、Q82、G85、T87、S91およびS113の1つ、2つ以上、または全てで変異する、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、操作された抗体内の前記変異アミノ酸残基位置が、A9G、E13K、M20V、K38R、R40A、A72T、S76T、Q82E、G85S、T87R、S91T、S113Tである、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、前記重鎖フレームワーク領域が、以下の変異A9G、E13K、M20V、K38R、R40A、A72T、S76T、Q82E、G85S、T87R、S91T、およびS113Tを含む、前記操作抗体；
−以下を含む、操作された組換え抗αvインテグリンハイブリッド抗体：
（i）軽鎖CDR領域：
CDR1：RASQDISNYLA（配列番号:5）
CDR2：YTSKIHS（配列番号:6）
CDR3：QQGNTFPYT（配列番号:7）
（ii）重鎖CDR領域：
CDR1：SFWMH（配列番号:8）
CDR2：YINPRSGYTEYNEIFRD（配列番号:9）
CDR3：FLGRGAMDY（配列番号:10）
（iii）軽鎖フレームワーク領域
FR-1：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC（配列番号:12）
FR-2：WYQQKPGKAPKLLIY（配列番号:13）
FR-3：GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC（配列番号:14）
FR-4：FGQGTKVEIK（配列番号:15）
（iv）重鎖フレームワーク領域
−以下の（i）−（iv）を含む操作された組換え抗αvインテグリンハイブリッド抗体：
（i）マウスモノクローナル抗αvインテグリン抗体17E6に由来するCDR軽鎖および重鎖領域；
（ii）ヒト化モノクローナル抗EGFR抗体425から取得される軽鎖フレームワーク領域；
（iii）マウスモノクローナル抗αvインテグリン抗体17E6に由来する重鎖フレームワーク領域；および
（iv）ヒトIgGに由来する重鎖定常領域およびヒト定常軽鎖領域；
−記載の操作された抗体であって、
CDR軽鎖領域（マウスモノクローナル抗αvインテグリン抗体17E6に由来する）が、
CDR1：RASQDISNYLA（配列番号:5）
CDR2：YTSKIHS（配列番号:6）
CDR3：QQGNTFPYT（配列番号:7）であり、
さらにCDR重鎖領域が、
CDR1：SFWMH（配列番号:8）
CDR2：YINPRSGYTE(X)NEIFRD（配列中、X = CまたはY）（配列番号:11）、
CDR3：FLGRGAMDY（配列番号:10）である、前記操作抗体；
−重鎖のCDR2領域が配列YINPRSGYTEYNEIFRD（配列番号:9）有する、記載の操作抗体；
−記載の操作抗体であって、
軽鎖フレームワーク領域（ヒト化モノクローナル抗EGFR抗体425に由来する）が、
FR-1：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC（配列番号:12）
FR-2：WYQQKPGKAPKLLIY（配列番号:13）
FR-3：GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC（配列番号:14）
FR-4：FGQGTKVEIK（配列番号:15）を含む、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、マウス抗体17E6に由来する前記重鎖フレームワーク領域（FR1−FR4）が、1−15アミノ酸残基位置で変異し、T細胞エピトープの数、したがってヒトでの免疫原性が低下または除去される、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、前記重鎖フレームワーク領域が、マウス抗体の以下の位置、A9、E13、M20、K38、R40、A72、S76、Q82、G85、T87、S91およびS113の1つ、2つ以上、または全てで変異する、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、操作された抗体内の前記変異アミノ酸残基位置が、A9G、E13K、M20V、K38R、R40A、A72T、S76T、Q82E、G85S、T87R、S91T、S113Tである、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、前記重鎖フレームワーク領域が、以下の変異A9G、E13K、M20V、K38R、R40A、A72T、S76T、Q82E、G85S、T87R、S91T、およびS113Tを含む、前記操作抗体；
−以下を含む、操作された組換え抗αvインテグリンハイブリッド抗体：
（i）軽鎖CDR領域：
CDR1：RASQDISNYLA（配列番号:5）
CDR2：YTSKIHS（配列番号:6）
CDR3：QQGNTFPYT（配列番号:7）
（ii）重鎖CDR領域：
CDR1：SFWMH（配列番号:8）
CDR2：YINPRSGYTEYNEIFRD（配列番号:9）
CDR3：FLGRGAMDY（配列番号:10）
（iii）軽鎖フレームワーク領域
FR-1：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC（配列番号:12）
FR-2：WYQQKPGKAPKLLIY（配列番号:13）
FR-3：GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC（配列番号:14）
FR-4：FGQGTKVEIK（配列番号:15）
（iv）重鎖フレームワーク領域
（配列中、太字および下線付きの位置の1つ、2つ以上または全てが変異して、T細胞エピトープ、したがってヒトでの免疫原性が低下または除去される）、および
（v）ヒトIgGに由来する重鎖定常領域およびヒト定常軽鎖領域；
−上記の操作抗体であって、前記重鎖フレームワーク領域が、
FR1：QVQLQQSGGELAKPGASVKVSCKASGYTFS（配列番号:20）
FR2：WVRQAPGQGLEWIG（配列番号:21）
FR3：KATMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAS（配列番号:22）
FR4：WGQGTTVTVSS（配列番号:23）である、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、重鎖定常領域がIgG2に由来し、好ましい実施態様では、前記IgG2定常領域が改変IgG1ヒンジ領域を含む、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、前記改変IgG1ヒンジ領域が、配列EPKSSDKTHTCPPCP（配列番号:24）を含む、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、前記IgG2定常領域が、297位でアミノ酸NをQに置換する（N297Q）ことによって改変される、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、296位のアミノ酸残基FがAによって置換されて（F296A）、297位の改変によって生じたT細胞エピトープが除去される、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、軽鎖定常領域がヒトカッパである、前記操作抗体；
−本質的に以下から成る、“DI-17E6”と称される組換え抗αvインテグリンハイブリッド抗体：
（i）可変および定常軽鎖配列（配列番号:3）：
（v）ヒトIgGに由来する重鎖定常領域およびヒト定常軽鎖領域；
−上記の操作抗体であって、前記重鎖フレームワーク領域が、
FR1：QVQLQQSGGELAKPGASVKVSCKASGYTFS（配列番号:20）
FR2：WVRQAPGQGLEWIG（配列番号:21）
FR3：KATMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAS（配列番号:22）
FR4：WGQGTTVTVSS（配列番号:23）である、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、重鎖定常領域がIgG2に由来し、好ましい実施態様では、前記IgG2定常領域が改変IgG1ヒンジ領域を含む、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、前記改変IgG1ヒンジ領域が、配列EPKSSDKTHTCPPCP（配列番号:24）を含む、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、前記IgG2定常領域が、297位でアミノ酸NをQに置換する（N297Q）ことによって改変される、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、296位のアミノ酸残基FがAによって置換されて（F296A）、297位の改変によって生じたT細胞エピトープが除去される、前記操作抗体；
−上記の操作抗体であって、軽鎖定常領域がヒトカッパである、前記操作抗体；
−本質的に以下から成る、“DI-17E6”と称される組換え抗αvインテグリンハイブリッド抗体：
（i）可変および定常軽鎖配列（配列番号:3）：
（ii）可変および定常重鎖配列（配列番号:4）：
（配列中、下線付き配列は、CDR（太字）を含む可変領域を示す。定常領域内の太字の配列は、可変ヒンジ領域（EPKSSDKTHTCPPCP）および296位と297位の変異を示す）；
−上記の抗体を含む融合タンパク質であって、好ましくはそのC-末端を介してサイトカインまたは増殖因子、好ましくはサイトカインと融合する、前記融合タンパク質；
−上記の抗体または抗体融合タンパク質をコードするDNA分子；
−上記DNA分子を含む発現ベクター；
−図？？？に記載され、pdHL10-DI-17E6g2h(N297Q)と称されるDNAセグメントを含む発現プラスミド；
−上記発現プラスミドで形質転換された哺乳動物宿主細胞を含むタンパク質発現系；
−上記および下記で明記される抗体または抗体融合タンパク質を医薬的に有効な量で、場合によって医薬的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤と一緒に含む医薬組成物；
−第一および第二の医薬的に有効な治療薬剤を、場合によって医薬的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤と一緒に含む医薬組成物であって、第一の薬剤が上記の抗体または抗体融合タンパク質であり、第二の薬剤が、化学療法剤、血管形成阻害剤および抗腫瘍剤から成る群から選択される、前記医薬組成物；
−第二の治療薬剤が、抗腫瘍抗体、特に抗EGFR（erbB1）または抗Her2（erbB2）抗体である、対応する医薬組成物；
−第二の薬剤が、インテグリン阻害剤のシレンジチド、抗EGFR抗EGFR阻害剤のmAb c225（セツキシマブ、Erbitux(商標)）およびmAb h425（マツズマブ）、ならびに化学療法剤のシスプラチンまたはDTICである、対応する医薬組成物；
−血管形成関連疾患および／または固形腫瘍または腫瘍転移の治療用医薬の製造を目的とする、明記された操作抗体または抗体融合タンパク質の使用；
−前記操作抗体が第二の薬剤の有効性を高める、腫瘍治療用医薬の製造を目的とする、明記された医薬組成物の使用；
−第二の薬剤が抗EGFR抗体であり、さらに前記操作された抗体が、前記操作抗体の投与停止後の腫瘍の再増殖を防止するかまたは遅延させる、腫瘍治療用医薬の製造を目的とする明記された医薬組成物の使用；
−第一の治療薬剤が請求項17に記載の操作抗体（DI−17E6）であり、第二の治療薬剤がmAb c225（セツキシマブ）である、請求項29に記載の使用。
−上記の抗体を含む融合タンパク質であって、好ましくはそのC-末端を介してサイトカインまたは増殖因子、好ましくはサイトカインと融合する、前記融合タンパク質；
−上記の抗体または抗体融合タンパク質をコードするDNA分子；
−上記DNA分子を含む発現ベクター；
−図？？？に記載され、pdHL10-DI-17E6g2h(N297Q)と称されるDNAセグメントを含む発現プラスミド；
−上記発現プラスミドで形質転換された哺乳動物宿主細胞を含むタンパク質発現系；
−上記および下記で明記される抗体または抗体融合タンパク質を医薬的に有効な量で、場合によって医薬的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤と一緒に含む医薬組成物；
−第一および第二の医薬的に有効な治療薬剤を、場合によって医薬的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤と一緒に含む医薬組成物であって、第一の薬剤が上記の抗体または抗体融合タンパク質であり、第二の薬剤が、化学療法剤、血管形成阻害剤および抗腫瘍剤から成る群から選択される、前記医薬組成物；
−第二の治療薬剤が、抗腫瘍抗体、特に抗EGFR（erbB1）または抗Her2（erbB2）抗体である、対応する医薬組成物；
−第二の薬剤が、インテグリン阻害剤のシレンジチド、抗EGFR抗EGFR阻害剤のmAb c225（セツキシマブ、Erbitux(商標)）およびmAb h425（マツズマブ）、ならびに化学療法剤のシスプラチンまたはDTICである、対応する医薬組成物；
−血管形成関連疾患および／または固形腫瘍または腫瘍転移の治療用医薬の製造を目的とする、明記された操作抗体または抗体融合タンパク質の使用；
−前記操作抗体が第二の薬剤の有効性を高める、腫瘍治療用医薬の製造を目的とする、明記された医薬組成物の使用；
−第二の薬剤が抗EGFR抗体であり、さらに前記操作された抗体が、前記操作抗体の投与停止後の腫瘍の再増殖を防止するかまたは遅延させる、腫瘍治療用医薬の製造を目的とする明記された医薬組成物の使用；
−第一の治療薬剤が請求項17に記載の操作抗体（DI−17E6）であり、第二の治療薬剤がmAb c225（セツキシマブ）である、請求項29に記載の使用。
発明の詳細な説明
ヒトにおける免疫原性に対する潜在能力を低下させるために、DI-17E6（EMD525797）を、17E6（EMD73034）の免疫能除去（de-immunization）および遺伝子工学によって作製した。本発明の抗体の免疫能除去は、原型マウス抗体からヒトT細胞エピトープを検出および除去することを意味する。この技術は、マウスの配列をヒトのコンセンサス配列で置き換える“ヒト化”アプローチとは異なる。使用される免疫能除去技術は、例えばWO98/52976、WO00/34317およびWO02/69232に記載されている。
マウス17E6の軽鎖および重鎖の可変領域（それぞれVLおよびVH）をin silicoで解析し、潜在的なTヘルパー細胞エピトープを除去する。結合のために必須のマウスの配列（例えばCDR）由来のアミノ酸を保持するように免疫能除去VHおよびVL配列を設計する。
発現を最適化するために、軽鎖のフレームワーク領域をヒト化425抗体のものと置き換えた。さらにまた、VH内の対を形成しないシステイン-60（VH配列では稀である）をチロシンに変換し（C60Y）、タンパク質の安定性を改善した。
EMD525797の特徴の1つは免疫応答を開始させないことである。これを達成するために、免疫グロブリンの定常領域もまた以下のように改変した。軽鎖のためには、ゲノム性ヒトカッパ定常領域を用いた。重鎖のためには、ゲノム性ヒトガンマ-2（72）定常領域を用いたが、4つのシステインジスルフィド結合をもつヒンジ領域を改変γ1ヒンジ領域によって置き換えて、ジスルフィド結合スクランブリングを最小限にし、さらに発現を改善した。CH2ドメインのAsn-297のGlnへの変異（N297Q）を導入し、N-グリコシル化シグナルを除去した。脱グリコシル化の結果、エフェクター機能が失われ、抗体の血中半減期が長くなる。
最後にPhe-296をAlaに変異させ、これによってN297Q変異によって生じた潜在的T細胞エピトープを除去した。
ヒトにおける免疫原性に対する潜在能力を低下させるために、DI-17E6（EMD525797）を、17E6（EMD73034）の免疫能除去（de-immunization）および遺伝子工学によって作製した。本発明の抗体の免疫能除去は、原型マウス抗体からヒトT細胞エピトープを検出および除去することを意味する。この技術は、マウスの配列をヒトのコンセンサス配列で置き換える“ヒト化”アプローチとは異なる。使用される免疫能除去技術は、例えばWO98/52976、WO00/34317およびWO02/69232に記載されている。
マウス17E6の軽鎖および重鎖の可変領域（それぞれVLおよびVH）をin silicoで解析し、潜在的なTヘルパー細胞エピトープを除去する。結合のために必須のマウスの配列（例えばCDR）由来のアミノ酸を保持するように免疫能除去VHおよびVL配列を設計する。
発現を最適化するために、軽鎖のフレームワーク領域をヒト化425抗体のものと置き換えた。さらにまた、VH内の対を形成しないシステイン-60（VH配列では稀である）をチロシンに変換し（C60Y）、タンパク質の安定性を改善した。
EMD525797の特徴の1つは免疫応答を開始させないことである。これを達成するために、免疫グロブリンの定常領域もまた以下のように改変した。軽鎖のためには、ゲノム性ヒトカッパ定常領域を用いた。重鎖のためには、ゲノム性ヒトガンマ-2（72）定常領域を用いたが、4つのシステインジスルフィド結合をもつヒンジ領域を改変γ1ヒンジ領域によって置き換えて、ジスルフィド結合スクランブリングを最小限にし、さらに発現を改善した。CH2ドメインのAsn-297のGlnへの変異（N297Q）を導入し、N-グリコシル化シグナルを除去した。脱グリコシル化の結果、エフェクター機能が失われ、抗体の血中半減期が長くなる。
最後にPhe-296をAlaに変異させ、これによってN297Q変異によって生じた潜在的T細胞エピトープを除去した。
上記で簡単に述べた方法によって得られた好ましい抗体DI-17E6（図16に模式的構造が明示されている）は、以下の特性を有する：
DI-17E6は、単離レセプターおよび細胞性レベル（例えばレセプター結合、細胞接着および細胞遊走実験）で潜在能力および選択性を示す。
DI-17E6は、in vitroおよび動物モデル（例えば実験的ヌードマウス腫瘍、SCIDマウス/ヒト皮膚キメラ）で腫瘍増殖阻害活性を示す。
DI-17E6は、動物モデル（例えばSCIDマウス/ヒト皮膚キメラ、サルのマトリゲルプラグ）で抗血管形成活性を示す。
DI-17E6は、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質とαv-インテグリンレセプターとの結合を阻害し、αv-インテグリン仲介細胞接着、付着および遊走を妨害する。いったん細胞の脱離が誘発されると、さらに別の2つの事象が発生する。すなわち、細胞活性化経路がブロッキングされ、αv-インテグリンは組織培養では内在化される。フィブリノゲンと血小板レセプターGPIIbIIIaとの結合および血小板凝集は影響されず、EMDは抗体依存性細胞障害作用（ADCC）も補体依存性細胞障害作用（CDC）も始動させない。
DI-17E6（EMD525797）は狭い種特異性を示し、ヒトおよびサルのαv-インテグリンのみを認識する。ヒトαv-インテグリン欠損メラノーマの増殖および血管増殖応答は、SCIDマウスに移植されたヒト皮膚でEMD525797によって阻害された。健常なサルにおけるEMD525797の全身投与は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）のような血管形成増殖因子を含むプラグの皮下移植によって惹起される血管形成を妨害した。EMD525797はまた、αvβ3-インテグリン発現ヒト腫瘍（いくつかのメラノーマを含む）の異種移植モデルで直接的な抗腫瘍活性を示した。併用療法試験では、EMD525797活性は、化学療法薬と良好な相乗活性を示し、臨床準拠設定でより低濃度、より毒性の低い濃度の標準的化学療法剤の使用を可能にし、なおかつ有効性を維持した。これらの実験はEMD525797の潜在的抗腫瘍活性を示しえただけである。なぜならば、マウスの血管内皮は標的ocvインテグリンを発現せず、したがってこの抗体によって認識されないからである。
DI-17E6は、単離レセプターおよび細胞性レベル（例えばレセプター結合、細胞接着および細胞遊走実験）で潜在能力および選択性を示す。
DI-17E6は、in vitroおよび動物モデル（例えば実験的ヌードマウス腫瘍、SCIDマウス/ヒト皮膚キメラ）で腫瘍増殖阻害活性を示す。
DI-17E6は、動物モデル（例えばSCIDマウス/ヒト皮膚キメラ、サルのマトリゲルプラグ）で抗血管形成活性を示す。
DI-17E6は、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質とαv-インテグリンレセプターとの結合を阻害し、αv-インテグリン仲介細胞接着、付着および遊走を妨害する。いったん細胞の脱離が誘発されると、さらに別の2つの事象が発生する。すなわち、細胞活性化経路がブロッキングされ、αv-インテグリンは組織培養では内在化される。フィブリノゲンと血小板レセプターGPIIbIIIaとの結合および血小板凝集は影響されず、EMDは抗体依存性細胞障害作用（ADCC）も補体依存性細胞障害作用（CDC）も始動させない。
DI-17E6（EMD525797）は狭い種特異性を示し、ヒトおよびサルのαv-インテグリンのみを認識する。ヒトαv-インテグリン欠損メラノーマの増殖および血管増殖応答は、SCIDマウスに移植されたヒト皮膚でEMD525797によって阻害された。健常なサルにおけるEMD525797の全身投与は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）のような血管形成増殖因子を含むプラグの皮下移植によって惹起される血管形成を妨害した。EMD525797はまた、αvβ3-インテグリン発現ヒト腫瘍（いくつかのメラノーマを含む）の異種移植モデルで直接的な抗腫瘍活性を示した。併用療法試験では、EMD525797活性は、化学療法薬と良好な相乗活性を示し、臨床準拠設定でより低濃度、より毒性の低い濃度の標準的化学療法剤の使用を可能にし、なおかつ有効性を維持した。これらの実験はEMD525797の潜在的抗腫瘍活性を示しえただけである。なぜならば、マウスの血管内皮は標的ocvインテグリンを発現せず、したがってこの抗体によって認識されないからである。
4週間毒性試験のデータでは、臨床所見、体重および飼料消費、ECG、体温、呼吸数、臨床病理所見（血液学、血清化学）、尿分析、器官重量、肉眼的病理学および組織病理学に対するDI-17E6処置に関連する影響は全く示されなかった。
これらのデータに基づいて、10、33および100mgのEMD525797/kg体重/日の用量（週1回で4週間、静脈内輸液（1h）により投与）が、試験条件下で良好な耐性を示すと考えられた。この抗体は経口的には活性を持たないが、動物実験では静脈内および腹腔内ルートで投与されて成果を示した。前記動物実験では、血管形成およびいくつかの別個の実験腫瘍の増殖の阻害が示された。
EMD525797の変異原性潜在能力を調べる細菌スクリーニング試験では、EMD525797は変異原性ではないことが示された。EMD525797に関する安全性についての薬理学的警告は、カニクイザルでの反復投与毒性試験では認められなかった。
EMD525797の理論的分子量は145,208Daであり、この値は、MALDI-TOF-MSおよびLC-ESI-Q-TOF MS分析で実験的に実証された。等電点は7.35から8.15の範囲で、平均は7.75である。消光係数は1.42である。
EMD525797は、ヒト内皮細胞のビトロネクチンとの接着を約10nMのEC50で阻害する。EMD525797は、αv-インテグリンによって仲介される腫瘍細胞の接着を0.1から50nMの範囲のEC50で妨害する。ビトロネクチン上のヒト内皮細胞のVEGF誘発遊走もまた、ほぼ50nMのEC50でEMD525797によって妨害される。同様に、αv-インテグリンリガンド上にプレートしたヒト内皮細胞の増殖および生存もまたEMD525797によって妨害される。
EMD525797は内皮のαv-インテグリンを標的にし、血管形成を混乱させる。EMD525797は、特にαv3およびαv5を阻害し、αv-インテグリン仲介細胞活動（付着および遊走）を妨害する。αv-インテグリンおよび増殖因子シグナリング経路は相互作用して、EMD525797の結合はまた分化、増殖および生存の混乱をもたらしえる。その抗血管形成作用に加えて、EMD525797は明らかに、標的提示悪性細胞で直接的な抗腫瘍作用としてアポトーシスを促進する。EMD525797は、細胞付着を妨害し、細胞の脱離を誘発し、αv-リガンド上の遊走、増殖および生存を妨害することができる。
これらのデータに基づいて、10、33および100mgのEMD525797/kg体重/日の用量（週1回で4週間、静脈内輸液（1h）により投与）が、試験条件下で良好な耐性を示すと考えられた。この抗体は経口的には活性を持たないが、動物実験では静脈内および腹腔内ルートで投与されて成果を示した。前記動物実験では、血管形成およびいくつかの別個の実験腫瘍の増殖の阻害が示された。
EMD525797の変異原性潜在能力を調べる細菌スクリーニング試験では、EMD525797は変異原性ではないことが示された。EMD525797に関する安全性についての薬理学的警告は、カニクイザルでの反復投与毒性試験では認められなかった。
EMD525797の理論的分子量は145,208Daであり、この値は、MALDI-TOF-MSおよびLC-ESI-Q-TOF MS分析で実験的に実証された。等電点は7.35から8.15の範囲で、平均は7.75である。消光係数は1.42である。
EMD525797は、ヒト内皮細胞のビトロネクチンとの接着を約10nMのEC50で阻害する。EMD525797は、αv-インテグリンによって仲介される腫瘍細胞の接着を0.1から50nMの範囲のEC50で妨害する。ビトロネクチン上のヒト内皮細胞のVEGF誘発遊走もまた、ほぼ50nMのEC50でEMD525797によって妨害される。同様に、αv-インテグリンリガンド上にプレートしたヒト内皮細胞の増殖および生存もまたEMD525797によって妨害される。
EMD525797は内皮のαv-インテグリンを標的にし、血管形成を混乱させる。EMD525797は、特にαv3およびαv5を阻害し、αv-インテグリン仲介細胞活動（付着および遊走）を妨害する。αv-インテグリンおよび増殖因子シグナリング経路は相互作用して、EMD525797の結合はまた分化、増殖および生存の混乱をもたらしえる。その抗血管形成作用に加えて、EMD525797は明らかに、標的提示悪性細胞で直接的な抗腫瘍作用としてアポトーシスを促進する。EMD525797は、細胞付着を妨害し、細胞の脱離を誘発し、αv-リガンド上の遊走、増殖および生存を妨害することができる。
DI-17E6は、免疫原性データがヒトで利用可能な最初の免疫能除去タンパク質である。対応する臨床試験では、抗DI-17E6抗体は500mgを超える用量で検出されなかった（500mgは抗体の治療的に有効な一般的用量である）。比較すれば、対応するように算出した用量での動物試験では、抗治療薬抗体を検出することができた。一般的には、DI-17E6の免疫反応はより複雑であるように思われる。すなわち、17E6とαvとの結合は樹状細胞への取り込みを促進するであろう。17E6によるFcR結合はノックアウトされるように思われる。17E6とインテグリンレセプターとの結合は、おそらく天然の免疫抑制メカニズムを阻害するであろう。したがって、操作された抗体（好ましくはDI-17E6）によって得られた結果はいずれの事例においても予測不能であり、驚くべきことである。
DI-17E6はαvβインテグリンレセプターとの結合親和性を有する（前記はDI-17E6と同じ定常領域を含む同様なキメラ17E6である）。驚くべきことに、ヒト化mAb 425の可変フレームワーク領域を既に含むが、なおマウス17E6抗体の原型VH領域を含むこの抗体の変異はインテグリンレセプターとの結合をもたらさない。
DI-17E6はNS0細胞および他の哺乳動物細胞株によって良好に発現される。興味深いことに、上記のようにインテグリンとの結合親和性を示さない変異は、同じ良好な発現速度を示す。これらの結果および同様の結果は、3つの所望される特性（免疫原性低下、抗発現レベルおよび十分な結合親和性）の予測は可能ではないことを示している。
DI-17E6はαvβインテグリンレセプターとの結合親和性を有する（前記はDI-17E6と同じ定常領域を含む同様なキメラ17E6である）。驚くべきことに、ヒト化mAb 425の可変フレームワーク領域を既に含むが、なおマウス17E6抗体の原型VH領域を含むこの抗体の変異はインテグリンレセプターとの結合をもたらさない。
DI-17E6はNS0細胞および他の哺乳動物細胞株によって良好に発現される。興味深いことに、上記のようにインテグリンとの結合親和性を示さない変異は、同じ良好な発現速度を示す。これらの結果および同様の結果は、3つの所望される特性（免疫原性低下、抗発現レベルおよび十分な結合親和性）の予測は可能ではないことを示している。
DI-17E6は、メラノーマ腫瘍の場合のように、in vitroおよびin vivoで血管形成工程を混乱させる。DI-17E6は細胞傷害性薬剤による治療の活性を強化し、いっそうの抗腫瘍活性をin vivoでもたらす。
DI-17E6は、αvβ3およびαvβ5に依存する巣状接着の脱重合を引き起こす。これらのシグナリング複合体はインテグリン連結後に組み立てられる。それらは、増殖、生存および運動経路に関する情報を組織化し、前記の混乱はアポトーシスの引き金となりえる。
したがって、DI-17E6は、運動化学的および生化学的作用の組合せを利用して内皮細胞に影響を及ぼし、腫瘍細胞に対するストレスを増加させる。
DI-17E6は、腫瘍内の少なくとも2つの異なる細胞区画、すなわち腫瘍細胞自体および血管形成活性化腫瘍内皮細胞に対する作用を介してその生物学的活性を発揮する。αvβ3またはαvβ5によって仲介される腫瘍と内皮細胞との付着をDI-17E6は混乱させる。培養ECは暫定的ECMの上を遊走し、DI-17E6この遊走を混乱させる。血管の形成に必要とされる形態発生的変化は複雑であるが、ヒトの内皮細胞遊走アッセイでin vitroモデルを形成することができる。このアッセイではDI-17E6はこの形態発生的変化のプロセスを妨害することができる。DI-17E6はまた、in vivoで全身投与されたとき、ヒト皮膚SCIDマウスキメラモデル及びサルのマトリゲルプラグモデルで血管形成を妨害する。このことは、DI-17E6は血管形成内皮に影響を及ぼすことを示唆している。抗血管形成作用の間接的な証拠は下記に提示される。VEGFA又はFGF2のいずれが誘発物質であるか否かに応じて、惹起される血管形成はαvβ5またはαvβ3に依存する。DI-17E6は両方のαv-インテグリンを妨害するので、前記は両方の経路を妨害することができる。DI-17E6は主としてECを標的とすると考えられるが、前記はまた腫瘍細胞自体の増殖及び生存を阻害することができる。これまでのところ、このことは、αvβ3を発現する腫瘍についてのみ明示されている。
DI-17E6を用いてin vitroで処理したとき、種々の腫瘍適応症（メラノーマ、卵巣、腎、結腸、乳房及び肺）由来の腫瘍細胞株の増殖が影響を受けた。抗増殖を誘発するDI-17E6の活性は種々の細胞株で変動し、これは、各細胞株の遺伝的背景及びこれらの細胞株によるαv-インテグリン発現レベルの両方に起因する可能性がある。
DI-17E6は、αvβ3およびαvβ5に依存する巣状接着の脱重合を引き起こす。これらのシグナリング複合体はインテグリン連結後に組み立てられる。それらは、増殖、生存および運動経路に関する情報を組織化し、前記の混乱はアポトーシスの引き金となりえる。
したがって、DI-17E6は、運動化学的および生化学的作用の組合せを利用して内皮細胞に影響を及ぼし、腫瘍細胞に対するストレスを増加させる。
DI-17E6は、腫瘍内の少なくとも2つの異なる細胞区画、すなわち腫瘍細胞自体および血管形成活性化腫瘍内皮細胞に対する作用を介してその生物学的活性を発揮する。αvβ3またはαvβ5によって仲介される腫瘍と内皮細胞との付着をDI-17E6は混乱させる。培養ECは暫定的ECMの上を遊走し、DI-17E6この遊走を混乱させる。血管の形成に必要とされる形態発生的変化は複雑であるが、ヒトの内皮細胞遊走アッセイでin vitroモデルを形成することができる。このアッセイではDI-17E6はこの形態発生的変化のプロセスを妨害することができる。DI-17E6はまた、in vivoで全身投与されたとき、ヒト皮膚SCIDマウスキメラモデル及びサルのマトリゲルプラグモデルで血管形成を妨害する。このことは、DI-17E6は血管形成内皮に影響を及ぼすことを示唆している。抗血管形成作用の間接的な証拠は下記に提示される。VEGFA又はFGF2のいずれが誘発物質であるか否かに応じて、惹起される血管形成はαvβ5またはαvβ3に依存する。DI-17E6は両方のαv-インテグリンを妨害するので、前記は両方の経路を妨害することができる。DI-17E6は主としてECを標的とすると考えられるが、前記はまた腫瘍細胞自体の増殖及び生存を阻害することができる。これまでのところ、このことは、αvβ3を発現する腫瘍についてのみ明示されている。
DI-17E6を用いてin vitroで処理したとき、種々の腫瘍適応症（メラノーマ、卵巣、腎、結腸、乳房及び肺）由来の腫瘍細胞株の増殖が影響を受けた。抗増殖を誘発するDI-17E6の活性は種々の細胞株で変動し、これは、各細胞株の遺伝的背景及びこれらの細胞株によるαv-インテグリン発現レベルの両方に起因する可能性がある。
DI-17E6は、マウスの異種移植腫瘍の増殖を阻害することができる。前記はまた、化学療法剤の併用で相乗作用を示す。これらの作用は腫瘍の背景及び他の条件（例えばin vitro/in vivo）に左右されるが、有効性は皮下及び膵臓のような同所性位置で観察される（実施例参照）。
固形腫瘍では、リガンドコンピテントαvβ3は、腫瘍侵襲血管系で及びいくつかのヒト腫瘍（メラノーマ、腎癌、脳腫瘍を含む）でもまたしばしば過剰発現される。この発現は、ocvβ3のリガンド（例えばビトロネクチン、フォン・ビルブラント因子及びフィブリノゲン）の沈積、及びそのようなタンパク質の異常な合成を伴う。例えばビトロネクチン（主として肝で生成される）はいくつかの腫瘍で発現される。健康な成人では、ビトロネクチン及びフィブリノゲンは血液中で不活性形であるが、活性化時（例えば腫瘍患者で）にそれらは配座の変化を受け、内皮下ECMに沈積される。したがって、DI-17E6の標的は、腫瘍侵襲血管及びいくつかの腫瘍（前記はまたビトロネクチンレセプターを発現する）の両方によって発現される。
αvβ3発現メラノーマ細胞の皮下の増殖は、種々の用量でEMD525797によって抑制される。ヒト皮膚SCIDマウスキメラモデル（このモデルではαv-インテグリンを欠くヒトメラノーマはヒトECによって血管化された）では、EMD525797はまた腫瘍の増殖を阻害し、その抗血管形成作用を示唆した。
さらにまた、サルの無腫瘍モデル（このモデルでは血管形成は血管形成増殖因子bFGFによって誘発される）では、DI-17E6はまた増殖因子誘発血管形成を妨害した。このin vivo実験に基づき、さらにいくつかのPK/PD in vivo実験で認定された実験的血漿トロフ濃度にしたがえば、臨床試験でのEMD525797投与は、10から500μg/mLの範囲の血漿トロフ濃度を達成する投与量を含む。
メラノーマの異種移植マウスモデル（M21、MeWo又はCAKI-1）に適用する場合、DI-17E6は、より低い用量（約30mg/kg）ではわずかな腫瘍退縮効果を引き起こすが、一方、より高い用量（500μL/mＬ）が投与された場合、効果は極めて強化される。
DI-17E6について上記で明記される基礎的な生物学的及び治療的特性はまた、本出願で明記されるDI-17E6の他の変種についてもまた適用できることは留意されよう。
固形腫瘍では、リガンドコンピテントαvβ3は、腫瘍侵襲血管系で及びいくつかのヒト腫瘍（メラノーマ、腎癌、脳腫瘍を含む）でもまたしばしば過剰発現される。この発現は、ocvβ3のリガンド（例えばビトロネクチン、フォン・ビルブラント因子及びフィブリノゲン）の沈積、及びそのようなタンパク質の異常な合成を伴う。例えばビトロネクチン（主として肝で生成される）はいくつかの腫瘍で発現される。健康な成人では、ビトロネクチン及びフィブリノゲンは血液中で不活性形であるが、活性化時（例えば腫瘍患者で）にそれらは配座の変化を受け、内皮下ECMに沈積される。したがって、DI-17E6の標的は、腫瘍侵襲血管及びいくつかの腫瘍（前記はまたビトロネクチンレセプターを発現する）の両方によって発現される。
αvβ3発現メラノーマ細胞の皮下の増殖は、種々の用量でEMD525797によって抑制される。ヒト皮膚SCIDマウスキメラモデル（このモデルではαv-インテグリンを欠くヒトメラノーマはヒトECによって血管化された）では、EMD525797はまた腫瘍の増殖を阻害し、その抗血管形成作用を示唆した。
さらにまた、サルの無腫瘍モデル（このモデルでは血管形成は血管形成増殖因子bFGFによって誘発される）では、DI-17E6はまた増殖因子誘発血管形成を妨害した。このin vivo実験に基づき、さらにいくつかのPK/PD in vivo実験で認定された実験的血漿トロフ濃度にしたがえば、臨床試験でのEMD525797投与は、10から500μg/mLの範囲の血漿トロフ濃度を達成する投与量を含む。
メラノーマの異種移植マウスモデル（M21、MeWo又はCAKI-1）に適用する場合、DI-17E6は、より低い用量（約30mg/kg）ではわずかな腫瘍退縮効果を引き起こすが、一方、より高い用量（500μL/mＬ）が投与された場合、効果は極めて強化される。
DI-17E6について上記で明記される基礎的な生物学的及び治療的特性はまた、本出願で明記されるDI-17E6の他の変種についてもまた適用できることは留意されよう。
併用療法
内皮細胞は、可溶性サイトカイン及び腫瘍によって分泌される増殖因子に応答して、増殖しさらに腫瘍環境に侵入する。ヒト癌患者で最近実証されたように、そのような内皮細胞は治療のための適切な標的である。そのような腫瘍侵襲内皮によってde novoに発現されるαv-インテグリンは、移行性細胞外マトリックスの外来性環境でのそれらの生存を支援し、これらのインテグリンの阻害は抗血管形成作用を有することができる。
したがって、αvβ3またはαvインテグリン標的療法は、癌の併用療法で使用される医薬組成物及びキットとして本発明の抗体を化学療法剤、他のインテグリン阻害剤又は腫瘍レセプターブロッキング剤と併用するために理想的な環境を提供する。
驚くべきことに、直接的な抗腫瘍作用は、本発明の操作された抗体（好ましくはDI-17E6）をさらに別に抗腫瘍剤、特にチロシンキナーゼ阻害剤、好ましくは抗erbB1（EGFR）及び抗erbB2（Her2）抗体と併用することによって強化することができる。抗腫瘍療法は腫瘍特異的レセプターをブロッキングすることによって腫瘍組織自体を標的とし、したがって腫瘍増殖を妨げるか、または腫瘍の退縮を促進する。
本発明にしたがえば、いくつかの化学療法剤は、本発明の操作された抗体（好ましくはDI-17E6）との併用で追加の作用のみを引き起こすが、一方、他の化学療法剤（例えばダカルバジン、DTIC）を用いた他の実験では、相乗作用を観察することができることを明示することができた。さらにまたこれらの結果は、用いられた系、例えばin vivoの系が使用されたかin vitroの系が使用されたかに左右される。
併用実験のある重要な結果は、好ましくはDI-17E6並びにシレンジチド、環式RGDペプチド及びインテグリン阻害剤（シクロ-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)）の併用は、腫瘍増殖の退縮（in vitroとともにin vivoでも）における相乗作用を示すということである。
内皮細胞は、可溶性サイトカイン及び腫瘍によって分泌される増殖因子に応答して、増殖しさらに腫瘍環境に侵入する。ヒト癌患者で最近実証されたように、そのような内皮細胞は治療のための適切な標的である。そのような腫瘍侵襲内皮によってde novoに発現されるαv-インテグリンは、移行性細胞外マトリックスの外来性環境でのそれらの生存を支援し、これらのインテグリンの阻害は抗血管形成作用を有することができる。
したがって、αvβ3またはαvインテグリン標的療法は、癌の併用療法で使用される医薬組成物及びキットとして本発明の抗体を化学療法剤、他のインテグリン阻害剤又は腫瘍レセプターブロッキング剤と併用するために理想的な環境を提供する。
驚くべきことに、直接的な抗腫瘍作用は、本発明の操作された抗体（好ましくはDI-17E6）をさらに別に抗腫瘍剤、特にチロシンキナーゼ阻害剤、好ましくは抗erbB1（EGFR）及び抗erbB2（Her2）抗体と併用することによって強化することができる。抗腫瘍療法は腫瘍特異的レセプターをブロッキングすることによって腫瘍組織自体を標的とし、したがって腫瘍増殖を妨げるか、または腫瘍の退縮を促進する。
本発明にしたがえば、いくつかの化学療法剤は、本発明の操作された抗体（好ましくはDI-17E6）との併用で追加の作用のみを引き起こすが、一方、他の化学療法剤（例えばダカルバジン、DTIC）を用いた他の実験では、相乗作用を観察することができることを明示することができた。さらにまたこれらの結果は、用いられた系、例えばin vivoの系が使用されたかin vitroの系が使用されたかに左右される。
併用実験のある重要な結果は、好ましくはDI-17E6並びにシレンジチド、環式RGDペプチド及びインテグリン阻害剤（シクロ-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)）の併用は、腫瘍増殖の退縮（in vitroとともにin vivoでも）における相乗作用を示すということである。
腫瘍増殖の低下における同様な相乗作用は、DI-17E6がセツキシマブ（Erbitux(商標)）と併用される場合に得ることができる。Erbitux（セツキシマブ）は、IgG1サブクラスのキメラマウス/ヒトモノクローナル抗体（MAb）であり、この抗体はヒト上皮増殖因子レセプター（EGFR）を標的とする。種々の腎細胞癌（RCC）細胞株がEGFRを発現する。Erbituxは市販製品であり、いくつかの腫瘍の適用に対して承認されている。
相乗作用の全ての例で、それらの結果から、操作されたDI-17E6抗体は、併用された第二の薬剤の抗腫瘍作用を強化すると結論することができる。
本発明にしたがえば、DI-17E6は、セツキシマブと併用したとき、薬剤の投与を停止した場合でも腫瘍サイズ／増殖の絶え間ない減少を長期間観察することができる。これはセツキシマブを単一療法で投与した場合には見られない。
本発明の操作された抗体は、投与の必要がある患者に第二の治療薬剤の前後または同時に投与することができる。
本発明の任意の操作抗体と併用される化学療法剤は、例えばメトトレキセート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、無糖クロロエチルニトロソウレア、5-フルオロウラシル、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン、メグラミンGLA、バルルビシン、カルムステイン、UFT（テガフール/ウラシル）、ZD9331、タキソテア／デセタキセル、フルオロウラシル（5-FU）、ビンブラスチン及び他の適切な化合物でありえる。
相乗作用の全ての例で、それらの結果から、操作されたDI-17E6抗体は、併用された第二の薬剤の抗腫瘍作用を強化すると結論することができる。
本発明にしたがえば、DI-17E6は、セツキシマブと併用したとき、薬剤の投与を停止した場合でも腫瘍サイズ／増殖の絶え間ない減少を長期間観察することができる。これはセツキシマブを単一療法で投与した場合には見られない。
本発明の操作された抗体は、投与の必要がある患者に第二の治療薬剤の前後または同時に投与することができる。
本発明の任意の操作抗体と併用される化学療法剤は、例えばメトトレキセート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、無糖クロロエチルニトロソウレア、5-フルオロウラシル、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン、メグラミンGLA、バルルビシン、カルムステイン、UFT（テガフール/ウラシル）、ZD9331、タキソテア／デセタキセル、フルオロウラシル（5-FU）、ビンブラスチン及び他の適切な化合物でありえる。
第二の治療薬剤を含む、または含まない本発明の治療組成物またはDI-17E6組成物はまた、他の抗癌治療と併用することができ、そのような併用療法は、腫瘍の増殖および転移の阻害および／または排除に有効である。本発明の方法は、他の治療様式（放射線療法、外科手術、遺伝子治療および化学療法を含むが、ただしこれらに限定されない）とともに有利に用いることができる。
驚くべきことに、抗血管形成作用は、本発明の抗体をさらに別の血管形成阻害剤による治療と併用することによって強化できることが見出された。抗血管形成療法は、腫瘍の血管系を標的とし、一定のサイズを超える腫瘍の増殖を妨げる。したがって、第二の好ましい実施態様では、第二の医薬は、好ましくは以下のリストから選択される血管形成阻害剤である。
この血管形成阻害剤は、例えばシレンジチド（EMD121974）、抗VEGF抗体LM609、BMS-275291、ダルテパリン（Fragmin(商標)）、スラミン、2-メトキシエステラジオール（2-ME）、サリドマイド、CC-5013（サリドマイド類似体）、コンブレタスタチンA4ホスフェート、LY317615（タンパク質キナーゼCベータ阻害剤）、AE-941（NeovastatTM、GW786034）、抗VEGF抗体（ベバシズマブ；SvastinTM）、ZD6474、カルボキシアミドトリアゾール（CAI）、セレコキシブ（Celebrex(商標)）でありえるが、ただしこれらに限定されない。
本発明の抗体は、投与に適した医薬組成物に取り込むことができる。そのような組成物は、典型的には抗体可変領域および医薬的に許容できる担体を含む。本明細書で用いられる“医薬的に許容できる担体”という用語は、医薬の投与に適合する、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗カビ剤、等張及び吸収遅延剤などを含むことを意図する。医薬的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当分野では周知である。
驚くべきことに、抗血管形成作用は、本発明の抗体をさらに別の血管形成阻害剤による治療と併用することによって強化できることが見出された。抗血管形成療法は、腫瘍の血管系を標的とし、一定のサイズを超える腫瘍の増殖を妨げる。したがって、第二の好ましい実施態様では、第二の医薬は、好ましくは以下のリストから選択される血管形成阻害剤である。
この血管形成阻害剤は、例えばシレンジチド（EMD121974）、抗VEGF抗体LM609、BMS-275291、ダルテパリン（Fragmin(商標)）、スラミン、2-メトキシエステラジオール（2-ME）、サリドマイド、CC-5013（サリドマイド類似体）、コンブレタスタチンA4ホスフェート、LY317615（タンパク質キナーゼCベータ阻害剤）、AE-941（NeovastatTM、GW786034）、抗VEGF抗体（ベバシズマブ；SvastinTM）、ZD6474、カルボキシアミドトリアゾール（CAI）、セレコキシブ（Celebrex(商標)）でありえるが、ただしこれらに限定されない。
本発明の抗体は、投与に適した医薬組成物に取り込むことができる。そのような組成物は、典型的には抗体可変領域および医薬的に許容できる担体を含む。本明細書で用いられる“医薬的に許容できる担体”という用語は、医薬の投与に適合する、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗カビ剤、等張及び吸収遅延剤などを含むことを意図する。医薬的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当分野では周知である。
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように処方される。投与経路の例には、非経口（例えば静脈内、皮内、皮下）、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が含まれる。非経口、皮内または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は以下の成分を含むことができる：無菌的希釈剤、例えば注射用水、食塩水溶液、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；バッファー、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、並びに張度の調節のための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。pHは、酸または塩基（例えば塩酸または水酸化ナトリウム）で調節することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射筒またはガラスもしくはプラスチック製のマルチドースバイアルに封入することができる。
本発明の抗体可変領域を含む医薬は0.01から100%（w/w）の濃度を有することができるが、ただし前記の量は医薬の投薬形体にしたがって変動する。
投与は、好ましくは2週間に1回または1ヶ月に1回であるが、各個体における17E6／425-101タンパク質の薬理動力学の態様にしたがって頻度は増減しえる。DI-17E6または本出願で明記した他の抗体（例えばセツキシマブ）の約70キログラムの成人に対する投与用量は、1用量当たり約50から1000ミリグラムの範囲であり、好ましい範囲は1用量当たり約100から500ミリグラムである。もっとも好ましい用量は、1ヶ月に1回処置される70kgの成人に対して約400ミリグラムである。
本明細書で述べた化学療法剤は、原則として10mg/kgから100mg/kgの用量で投与される。
明記した第二の治療薬剤との併用療法では、本発明の操作された抗体は、治療の開始時点で同時に、または第二の薬剤の投与後もしくは投与前に投与することができる。
本発明の抗体可変領域を含む医薬は0.01から100%（w/w）の濃度を有することができるが、ただし前記の量は医薬の投薬形体にしたがって変動する。
投与は、好ましくは2週間に1回または1ヶ月に1回であるが、各個体における17E6／425-101タンパク質の薬理動力学の態様にしたがって頻度は増減しえる。DI-17E6または本出願で明記した他の抗体（例えばセツキシマブ）の約70キログラムの成人に対する投与用量は、1用量当たり約50から1000ミリグラムの範囲であり、好ましい範囲は1用量当たり約100から500ミリグラムである。もっとも好ましい用量は、1ヶ月に1回処置される70kgの成人に対して約400ミリグラムである。
本明細書で述べた化学療法剤は、原則として10mg/kgから100mg/kgの用量で投与される。
明記した第二の治療薬剤との併用療法では、本発明の操作された抗体は、治療の開始時点で同時に、または第二の薬剤の投与後もしくは投与前に投与することができる。
以下の実施例は本発明をさらに詳細に記述する。しかしながら、具体的なパラメータ、分子、方法、工程などを用いているが、類似の手段および方法を用いて本発明を容易に実施できると当業者がこれらデータから結論することができる場合は、本発明はそれらに限定されない。
本発明の操作された抗体の構築および発現：
ヒトにおける免疫原性を低下させるために、マウス17E6の免疫能除去および遺伝子工学によってDI-17E6（EMD525797）を作製した。
供給源抗体は、先に述べたモノクローナルマウス抗体17E6であった。この抗体は、精製ヒトαvβ3で免疫したマウスから作製された。免疫マウスの脾臓リンパ球をマウスミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマクローンの1つがモノクローナル抗体17E6を産生した（例えばEP0719859を参照されたい）。前記抗体を産生するハイブリドーマ細胞株はDSM ACC2160として寄託された。
第一に、マウス17E6の軽鎖および重鎖可変領域（それぞれVLおよびVH）を、いわゆる免疫能除去方法論（WO98/52976、WO00／34317およびWO02/069232）を用いてin silicoで解析し、潜在的なT細胞エピトープを除去した。免疫能除去VHおよびVL配列を、結合に必須のマウス配列（例えばCDR）由来のアミノ酸を維持するように設計した。
この技術を単独で用いて抗体を得た。この抗体は、ヒトの個体で免疫原性の低下または除去を示すが、十分な結合親和性および哺乳動物発現系での十分な発現率を示さなかった。したがって、結合親和性および発現を再付与するために、アミノ酸配列をいくつかの位置で改変することによって抗体を再設計した。しかしながら、発現パターンは改善されるが、結合親和性は低下する（およびその逆）ことが明瞭になった。したがって多数の抗体型を構築し、それらを発現および結合親和性について精査する必要があった。新規な型はしばしば驚くべき結果を示し、前記結果は分子設計を計画したときに予想することができなかった。良好な発現を示す抗体型由来の配列を良好な結合親和性を示す抗体型の配列と組み合わせることによって、不十分な結合親和性および発現を有する新規な抗体型がしばしば生じる。したがって、既に指摘したように、どの特定の抗体変異が良好な発現および結合親和性を誘引するかという予測は不可能であった。
ヒトにおける免疫原性を低下させるために、マウス17E6の免疫能除去および遺伝子工学によってDI-17E6（EMD525797）を作製した。
供給源抗体は、先に述べたモノクローナルマウス抗体17E6であった。この抗体は、精製ヒトαvβ3で免疫したマウスから作製された。免疫マウスの脾臓リンパ球をマウスミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマクローンの1つがモノクローナル抗体17E6を産生した（例えばEP0719859を参照されたい）。前記抗体を産生するハイブリドーマ細胞株はDSM ACC2160として寄託された。
第一に、マウス17E6の軽鎖および重鎖可変領域（それぞれVLおよびVH）を、いわゆる免疫能除去方法論（WO98/52976、WO00／34317およびWO02/069232）を用いてin silicoで解析し、潜在的なT細胞エピトープを除去した。免疫能除去VHおよびVL配列を、結合に必須のマウス配列（例えばCDR）由来のアミノ酸を維持するように設計した。
この技術を単独で用いて抗体を得た。この抗体は、ヒトの個体で免疫原性の低下または除去を示すが、十分な結合親和性および哺乳動物発現系での十分な発現率を示さなかった。したがって、結合親和性および発現を再付与するために、アミノ酸配列をいくつかの位置で改変することによって抗体を再設計した。しかしながら、発現パターンは改善されるが、結合親和性は低下する（およびその逆）ことが明瞭になった。したがって多数の抗体型を構築し、それらを発現および結合親和性について精査する必要があった。新規な型はしばしば驚くべき結果を示し、前記結果は分子設計を計画したときに予想することができなかった。良好な発現を示す抗体型由来の配列を良好な結合親和性を示す抗体型の配列と組み合わせることによって、不十分な結合親和性および発現を有する新規な抗体型がしばしば生じる。したがって、既に指摘したように、どの特定の抗体変異が良好な発現および結合親和性を誘引するかという予測は不可能であった。
免疫能除去17E6（DI-17E6）の可変領域：
マウスモノクローナル抗体17E6の軽鎖および重鎖可変領域（それぞれVLおよびVH）を、上記に明記したように免疫能除去技術によってin silicoで免疫能を除去した（潜在的なTヘルパー細胞エピトープを除去した）。これによって、VL60.2と称するVLの免疫能除去型及びVH33と称するVHの免疫能除去型が得られた。
哺乳動物細胞のトランスフェクションによって生成されたVL60.2およびVH33から成る免疫能除去17E6抗体は、αvβ3インテグリンに対する結合親和性を保持したが、発現は不良であった。
発現を最適化するために、軽鎖のフレームワーク領域をヒト化425抗体（Kettleborough et al. Protein Engineering 4:773, 1991）の軽鎖フレークワーク領域で置き換えた。さらにまた、VH33内の対を形成しないシステイン-60（VH配列では稀である）をチロシンに変換し（C60Y）、タンパク質の安定性を提供した。
最終的な免疫能除去VL（DI-17E6VL、図1A）およびVH（DI-17E6VH、図1A）をコードするDNAを、哺乳動物の発現のために最適化されたコドンを用いて化学的に合成した。
マウスモノクローナル抗体17E6の軽鎖および重鎖可変領域（それぞれVLおよびVH）を、上記に明記したように免疫能除去技術によってin silicoで免疫能を除去した（潜在的なTヘルパー細胞エピトープを除去した）。これによって、VL60.2と称するVLの免疫能除去型及びVH33と称するVHの免疫能除去型が得られた。
哺乳動物細胞のトランスフェクションによって生成されたVL60.2およびVH33から成る免疫能除去17E6抗体は、αvβ3インテグリンに対する結合親和性を保持したが、発現は不良であった。
発現を最適化するために、軽鎖のフレームワーク領域をヒト化425抗体（Kettleborough et al. Protein Engineering 4:773, 1991）の軽鎖フレークワーク領域で置き換えた。さらにまた、VH33内の対を形成しないシステイン-60（VH配列では稀である）をチロシンに変換し（C60Y）、タンパク質の安定性を提供した。
最終的な免疫能除去VL（DI-17E6VL、図1A）およびVH（DI-17E6VH、図1A）をコードするDNAを、哺乳動物の発現のために最適化されたコドンを用いて化学的に合成した。
NS0-LD細胞株の起源および供給源：
マウスミエローマNS0は、ヨーロッパ細胞培養集積所から入手した（ECACC #85110503）。NS0-LD細胞株は、無脂質および無血清培養液での増殖についてNS0細胞を選別することによって得られた。無脂質および無血清培地は、1mMピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）、1g/Lグルコース（Merck KGaA）、1%非必須アミノ酸（Invitrogen）、0.1μMトロポロン（Sigma）、10μMエタノールアミン（Sigma）および2mMグルタミン（Invitrogen）が補充されたSM1F6培養液（Invitrogen）から成る。NS0-LDの凍結ストックは、10%（v/v）のろ過DMSO（Merck KGaA）、10%（v/v）の１％メチルセルロース懸濁水（Sigma）、40%の新しい増殖培養液および40%のNS0-LD細胞条件付け培養液から成る凍結用培養液中で調製した。
マウスミエローマNS0は、ヨーロッパ細胞培養集積所から入手した（ECACC #85110503）。NS0-LD細胞株は、無脂質および無血清培養液での増殖についてNS0細胞を選別することによって得られた。無脂質および無血清培地は、1mMピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）、1g/Lグルコース（Merck KGaA）、1%非必須アミノ酸（Invitrogen）、0.1μMトロポロン（Sigma）、10μMエタノールアミン（Sigma）および2mMグルタミン（Invitrogen）が補充されたSM1F6培養液（Invitrogen）から成る。NS0-LDの凍結ストックは、10%（v/v）のろ過DMSO（Merck KGaA）、10%（v/v）の１％メチルセルロース懸濁水（Sigma）、40%の新しい増殖培養液および40%のNS0-LD細胞条件付け培養液から成る凍結用培養液中で調製した。
DI-17E6γ2h(N297Q)のための発現ベクターの構築：
マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子のゲノム性シグナルペプチド配列（438bp）を重鎖および軽鎖の両方の分泌のために用いた。このシグナルペプチドの-2アミノ酸残基（-1アミノ酸はこのシグナルペプチドのC-末端残基である）をコードする遺伝子配列をセリン残基からロイシン残基へ変異させ（AGCからTTA）、それによりこのシグナルペプチドの末端をコードするDNAはCTTAAGCとなり、ここでCTTAAGはAflII部位として作り出されたものである（Lo et al. Proteinn Engineering 11:495, 1998）。さらにまた、Kozakコンセンサス配列CCACC“ATG”Gを、“ATG”での翻訳開始のための最適なリボソーム結合のために導入した（Kozak, Cell 44:283, 1986）。これは、前記開始コドンの後ろの最初のアミノ酸残基をAAGからGAGに変異させ、TCTAGACCACC“ATG”GAGなる配列を提供することによって達成した（Kozakコンセンサス配列には下線が付され、さらにTCTAGAはXbalI部位である）。したがって、このシグナルペプチドは、開始コドンの後ろの最初のアミノ酸残基に1つの置換、および-2位のアミノ酸残基にもう1つの置換を含む。シグナルペプチドは細胞内のシグナルペプチダーゼによって切断され、分泌タンパク質内には出現しないので、これらの変異は抗体生成物のアミノ酸組成に影響を与えない。
免疫能が除去されたVL DNAをAflII−BamHIフラグメントとして合成し、免疫能除去VH DNAはAflII−HindIIIフラグメントとして合成した。VLのためには、AflII部位を介するゲノム性リーダーとの連結は、シグナルペプチド-VLをコードするXbaI−BamHIフラグメントを生じた。同様に、VH DNAとAflII部位を介するゲノム性リーダーとの連結は、シグナルペプチド-VHをコードするXhoI−HindIIIフラグメントを生じた（ここでXhoIはリンカー連結によってXbaIと置き換えられた）。得られたXbaI−BamHIおよびXhoI−HindIIIフラグメントを続いてpdHL10発現ベクター（図15）に挿入した（前記発現ベクターは既に転写調節エレメントおよび免疫グロブリン定常領域の配列を含んでいる（下記を参照されたい））。
マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子のゲノム性シグナルペプチド配列（438bp）を重鎖および軽鎖の両方の分泌のために用いた。このシグナルペプチドの-2アミノ酸残基（-1アミノ酸はこのシグナルペプチドのC-末端残基である）をコードする遺伝子配列をセリン残基からロイシン残基へ変異させ（AGCからTTA）、それによりこのシグナルペプチドの末端をコードするDNAはCTTAAGCとなり、ここでCTTAAGはAflII部位として作り出されたものである（Lo et al. Proteinn Engineering 11:495, 1998）。さらにまた、Kozakコンセンサス配列CCACC“ATG”Gを、“ATG”での翻訳開始のための最適なリボソーム結合のために導入した（Kozak, Cell 44:283, 1986）。これは、前記開始コドンの後ろの最初のアミノ酸残基をAAGからGAGに変異させ、TCTAGACCACC“ATG”GAGなる配列を提供することによって達成した（Kozakコンセンサス配列には下線が付され、さらにTCTAGAはXbalI部位である）。したがって、このシグナルペプチドは、開始コドンの後ろの最初のアミノ酸残基に1つの置換、および-2位のアミノ酸残基にもう1つの置換を含む。シグナルペプチドは細胞内のシグナルペプチダーゼによって切断され、分泌タンパク質内には出現しないので、これらの変異は抗体生成物のアミノ酸組成に影響を与えない。
免疫能が除去されたVL DNAをAflII−BamHIフラグメントとして合成し、免疫能除去VH DNAはAflII−HindIIIフラグメントとして合成した。VLのためには、AflII部位を介するゲノム性リーダーとの連結は、シグナルペプチド-VLをコードするXbaI−BamHIフラグメントを生じた。同様に、VH DNAとAflII部位を介するゲノム性リーダーとの連結は、シグナルペプチド-VHをコードするXhoI−HindIIIフラグメントを生じた（ここでXhoIはリンカー連結によってXbaIと置き換えられた）。得られたXbaI−BamHIおよびXhoI−HindIIIフラグメントを続いてpdHL10発現ベクター（図15）に挿入した（前記発現ベクターは既に転写調節エレメントおよび免疫グロブリン定常領域の配列を含んでいる（下記を参照されたい））。
ヒト定常領域をコードするDNA構築物
軽鎖に関してはゲノム性ヒトカッパ定常領域を用いた。重鎖に関してはゲノム性ヒトガンマ-2（γ2）定常領域を以下のように改変して用いた。
第1に、免疫グロブリンγ2ヒンジ領域は4つのシステインジスルフィド結合を含む（ジスルフィドスクランブリングの増加及び精製時のタンパク凝集をもたらす）ので、このヒンジ領域を以下のように改変γ1ヒンジ領域を用いて遺伝子工学により置き換えた。改変γ1ヒンジ領域ならびにその後に続くγ2のCH2およびCH3領域をコードするFcγ2h DNAの構築は既に記載されている（Lo-et al. Protein Engineering, Desigen & Selection, 18:1, 2005）。
ヒトIgγ2遺伝子のγ2ヒンジ領域エクソンを改変γ1ヒンジ領域エクソンで置き換えるために、我々は、鋳型としてFcγ2h DNAを用いポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、ヒンジエクソンの直ぐ上流にPstI制限部位を再導入した。フォワードプライマーは配列5'-ctgcagAGCCCAAATCTTCを有する（ここでctgcagはイントロン（小文字）の末端に初めから存在するPstI制限部位で、agはスプライスアクセプター部位であり、さらにAGCCCAAATCTTCは、改変γ1ヒンジ領域エクソン（大文字）の5'末端である）。リバースプライマーは配列5'-cagctggggcctgtccctgを有する（前記はヒンジ領域とCH2エクソンとの間のイントロン内の配列とハイブリダイズする）。改変γ1ヒンジ領域エクソンを含む、生成された130bpのPstI-PvuII PCR生成物は、クローニングおよび配列の確認後に、pdHL10発現ベクターのIgγ2遺伝子内の対応するフラグメントの置き換えに用いられた（下記参照）。
第二に、CH2ドメイン内のAsn-297のGlnへの変異（N297Q）をオーバーラップPCRによって導入し、N-グリコシル化シグナルを除去する（これによってエフェクター機能が消失し、抗体の血中半減期が延長する）。さらにまた、Phe-296をAlaに変異させた（これによって、N297Q変異により生じた一切の潜在的Tヘルパー細胞エピトープが除去される）。
第三に、CH3ドメインをコードする野生型DNA配列内の翻訳終了コドンの約280bp上流に位置するSmaI制限部位が存在する。このSmaI部位をサイレント変異（TCCからTCA）の導入によって破壊した。別のサイレント変異を導入して、終了コドンの4bp上流に新規でただ1つのSmaI部位を作製し（Lo et al. Protein Engineering 11:495, 1998）、遺伝子操作を容易にした。
軽鎖に関してはゲノム性ヒトカッパ定常領域を用いた。重鎖に関してはゲノム性ヒトガンマ-2（γ2）定常領域を以下のように改変して用いた。
第1に、免疫グロブリンγ2ヒンジ領域は4つのシステインジスルフィド結合を含む（ジスルフィドスクランブリングの増加及び精製時のタンパク凝集をもたらす）ので、このヒンジ領域を以下のように改変γ1ヒンジ領域を用いて遺伝子工学により置き換えた。改変γ1ヒンジ領域ならびにその後に続くγ2のCH2およびCH3領域をコードするFcγ2h DNAの構築は既に記載されている（Lo-et al. Protein Engineering, Desigen & Selection, 18:1, 2005）。
ヒトIgγ2遺伝子のγ2ヒンジ領域エクソンを改変γ1ヒンジ領域エクソンで置き換えるために、我々は、鋳型としてFcγ2h DNAを用いポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、ヒンジエクソンの直ぐ上流にPstI制限部位を再導入した。フォワードプライマーは配列5'-ctgcagAGCCCAAATCTTCを有する（ここでctgcagはイントロン（小文字）の末端に初めから存在するPstI制限部位で、agはスプライスアクセプター部位であり、さらにAGCCCAAATCTTCは、改変γ1ヒンジ領域エクソン（大文字）の5'末端である）。リバースプライマーは配列5'-cagctggggcctgtccctgを有する（前記はヒンジ領域とCH2エクソンとの間のイントロン内の配列とハイブリダイズする）。改変γ1ヒンジ領域エクソンを含む、生成された130bpのPstI-PvuII PCR生成物は、クローニングおよび配列の確認後に、pdHL10発現ベクターのIgγ2遺伝子内の対応するフラグメントの置き換えに用いられた（下記参照）。
第二に、CH2ドメイン内のAsn-297のGlnへの変異（N297Q）をオーバーラップPCRによって導入し、N-グリコシル化シグナルを除去する（これによってエフェクター機能が消失し、抗体の血中半減期が延長する）。さらにまた、Phe-296をAlaに変異させた（これによって、N297Q変異により生じた一切の潜在的Tヘルパー細胞エピトープが除去される）。
第三に、CH3ドメインをコードする野生型DNA配列内の翻訳終了コドンの約280bp上流に位置するSmaI制限部位が存在する。このSmaI部位をサイレント変異（TCCからTCA）の導入によって破壊した。別のサイレント変異を導入して、終了コドンの4bp上流に新規でただ1つのSmaI部位を作製し（Lo et al. Protein Engineering 11:495, 1998）、遺伝子操作を容易にした。
プラスミドpdHL10（図15）の構築
発現ベクターpdHL10はpdHLに由来する（pdHL7は以前に開示された（Gillies et al. J Immunol 160:6195, 1998）。pdHL7のように、pdLH10内のL及びH鎖のための2つの転写ユニットはCMVエンハンサー-プロモータを含む（Boshart et al. Cell 41:521-530, 1985）。CMVエンハンサー-プロモータのためのDNAは、市販のpcDNAI（Invitrogen Corp., San Diego, CA）のAflIII−HindIIIフラグメントから入手した。
pdHL7とpdHL10との間の主要な相違は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）選別マーカーのための転写ユニットにある。この転写ユニットのためのSV40エンハンサーは以下のようにしてpdHL10で破壊された。SV40エンハンサー/プロモータには2つの72bpリピートが存在し、各72bp内には1つのSphI制限部位が存在する。エンハンサーのSalI部位5'と遠位SalI部位とのオリゴヌクレオチドリンカー-アダプターによる連結は2つの72bpリピートから120bpを欠失させた。そのようなエンハンサー欠落プロモータはDHFR選別マーカーのいっそう低い発現レベルをもたらすはずである。理論的には、これによって安定的にトランスフェクトされた細胞クローンが少なくなり、薬剤選別に生き残るためには、細胞クローンは、十分なDHFRをエンハンサー欠落プロモータから発現することができるように染色体の活発な転写領域にプラスミドを組み込ませる可能性がある。完全に機能的なエンハンサーおよびプロモータによって駆動される、対象の遺伝子は、この活発な転写領域ではさらに高レベルで発現されるはずである。さらにまた、この減弱転写ユニットの向きはpdHL10では逆方向で、その結果、L鎖のためのCMVエンハンサーは遠位のSV40プロモータに対して直接的な作用を発揮することができない。
構築物pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって徹底的にマッピングされた（図15）。完全なL及びH鎖のコード領域は完全に配列が決定された。その主要な特徴は以下の表に示されている。
発現ベクターpdHL10はpdHLに由来する（pdHL7は以前に開示された（Gillies et al. J Immunol 160:6195, 1998）。pdHL7のように、pdLH10内のL及びH鎖のための2つの転写ユニットはCMVエンハンサー-プロモータを含む（Boshart et al. Cell 41:521-530, 1985）。CMVエンハンサー-プロモータのためのDNAは、市販のpcDNAI（Invitrogen Corp., San Diego, CA）のAflIII−HindIIIフラグメントから入手した。
pdHL7とpdHL10との間の主要な相違は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）選別マーカーのための転写ユニットにある。この転写ユニットのためのSV40エンハンサーは以下のようにしてpdHL10で破壊された。SV40エンハンサー/プロモータには2つの72bpリピートが存在し、各72bp内には1つのSphI制限部位が存在する。エンハンサーのSalI部位5'と遠位SalI部位とのオリゴヌクレオチドリンカー-アダプターによる連結は2つの72bpリピートから120bpを欠失させた。そのようなエンハンサー欠落プロモータはDHFR選別マーカーのいっそう低い発現レベルをもたらすはずである。理論的には、これによって安定的にトランスフェクトされた細胞クローンが少なくなり、薬剤選別に生き残るためには、細胞クローンは、十分なDHFRをエンハンサー欠落プロモータから発現することができるように染色体の活発な転写領域にプラスミドを組み込ませる可能性がある。完全に機能的なエンハンサーおよびプロモータによって駆動される、対象の遺伝子は、この活発な転写領域ではさらに高レベルで発現されるはずである。さらにまた、この減弱転写ユニットの向きはpdHL10では逆方向で、その結果、L鎖のためのCMVエンハンサーは遠位のSV40プロモータに対して直接的な作用を発揮することができない。
構築物pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって徹底的にマッピングされた（図15）。完全なL及びH鎖のコード領域は完全に配列が決定された。その主要な特徴は以下の表に示されている。
1. pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)ベクターと公表された配列との間で、リーダーのイントロン内に6ヌクレオチド（nt）の変動が見出された。pdHL10-DI-17E6(C60Y)γ2h(N297Q)ベクターは、801にG、985にT、993にC,1006にT、1045にTおよび1071にAを含んでいる。公表された配列はこれらの対応する位置にC、A、A、G、AC（追加されたnt）、およびGを含む。
2. pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)ベクターと公表された配列との間で、リーダーのイントロン内に6ヌクレオチド（nt）の変動が見出された。pdHL10-DI-17E6(C60Y)γ2h(N297Q)ベクターは、3780にG、3964にT、3972にC、3985にT、4024にTおよび4050にAを含んでいる。公表された配列はこれらの対応する位置にC、A、A、G、AC（追加されたnt）、およびGを含む。
3. pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)ベクターと公表された配列との間で、CH2とCH3との間のイントロン内に2ヌクレオチド（nt）の変動が見出された。pdHL10-DI-17E6(C60Y)γ2h(N297Q)ベクターは、5908にAおよび5922にAを含んでいる。公表された配列は対応する両位置にGを含む。
4. pdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)ベクターと公表された配列との間で、CH1内に1ヌクレオチド（nt）の変動が見出された。pdHL10-DI-17E6(C60Y)γ2h(N297Q)ベクターは、4736にGを含んでいる。公表された配列はこの位置にCを含む。
生産細胞クローンの作製および研究用細胞バンク
トランスフェクションおよび高生産性クローンの選別：
制限エンドヌクレアーゼFspIによって直鎖状化した発現プラスミドpdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)（このプラスミドはβ-ラクタマーゼをコードする配列内で1回切断された）を用い、エレクトロポレーションによってNS0-LD細胞にトランスフェクトした。エレクトロポレーションは、Gene Pulser XcellTMシステム（BioRad, Hercules, CA）を用い、250ボルトで15msパルスの設定により実施した。安定的にトランスフェクトされたクローンを、200nMのメトトレキセート（Sigma, Cat. No. M-8407）を含むように補充したSuper CD培地中での増殖によって選別した。Super CD培地は、9.69g/LのAGT CDハイブリドーマ培養液（Invitrogen, P/N RM-00-136）、2.52g/Lの重炭酸ナトリウム（EMD, P/N SX0320-3）、30ml/LのCD Acid Soluble Concentrate（Invitrogen, P/N 00-0336DK）、1.46g/LのL-グルタミン（Sigma, P/N G8540）、3g/Lのグルコース（Sigma, P/N G-5400）、2g/LのBD Select Soytone（Becton Dickenson, P/N 212488）および2g/LのBD限外ろ過Select Phytone（Becton Dickenson, P/N 210931）を含んでいる。12枚の96ウェルプレートから得た約474個の安定クローンの上清を抗ヒトFc ELISAによってアッセイし、高生産性クローンを認定した。選別したクローンの発現レベルを、組換えプロテインAアフィニティ（rPA）クロマトグラフィーによってさらに確認した。制限希釈によるサブクローニングのために、クローン#395（このクローンは、25cm2のTフラスコの最終静止培養で607μg/mLのDI-17E6γ2h(N297Q)を産生した（rPAによる））を選択した。
トランスフェクションおよび高生産性クローンの選別：
制限エンドヌクレアーゼFspIによって直鎖状化した発現プラスミドpdHL10-DI-17E6γ2h(N297Q)（このプラスミドはβ-ラクタマーゼをコードする配列内で1回切断された）を用い、エレクトロポレーションによってNS0-LD細胞にトランスフェクトした。エレクトロポレーションは、Gene Pulser XcellTMシステム（BioRad, Hercules, CA）を用い、250ボルトで15msパルスの設定により実施した。安定的にトランスフェクトされたクローンを、200nMのメトトレキセート（Sigma, Cat. No. M-8407）を含むように補充したSuper CD培地中での増殖によって選別した。Super CD培地は、9.69g/LのAGT CDハイブリドーマ培養液（Invitrogen, P/N RM-00-136）、2.52g/Lの重炭酸ナトリウム（EMD, P/N SX0320-3）、30ml/LのCD Acid Soluble Concentrate（Invitrogen, P/N 00-0336DK）、1.46g/LのL-グルタミン（Sigma, P/N G8540）、3g/Lのグルコース（Sigma, P/N G-5400）、2g/LのBD Select Soytone（Becton Dickenson, P/N 212488）および2g/LのBD限外ろ過Select Phytone（Becton Dickenson, P/N 210931）を含んでいる。12枚の96ウェルプレートから得た約474個の安定クローンの上清を抗ヒトFc ELISAによってアッセイし、高生産性クローンを認定した。選別したクローンの発現レベルを、組換えプロテインAアフィニティ（rPA）クロマトグラフィーによってさらに確認した。制限希釈によるサブクローニングのために、クローン#395（このクローンは、25cm2のTフラスコの最終静止培養で607μg/mLのDI-17E6γ2h(N297Q)を産生した（rPAによる））を選択した。
Super CD培地でのサブクローニングの試みは成功しなかった。したがって、クローン#395は、DMEM/F12培養液（Invitrogen, cat# 21041-025）（以下を補充：5μMのTropolone（Sigma, cat# T7387）、10μL/Lエタノールアミン（Sigma, cat# E0135）、10μg/mLインスリン（ウシ、凍結乾燥、Invitrogen Cat No 13007-018）、2g/LのHypep 4601（Quest International, cat# 5Z10419）および2g/LのHypep 1510（Quest International, cat# 5X59053）、3.5mMのL-グルタミン（Invitrogen, cat# 25030-081）、および200nMメトトレキセート（Sigma, cat# M-8407））での増殖に一継代の間順化させ、さらに完全DMEM/F12培養液（200nMのメトトレキセートを含む）と条件付け完全DMEM/F12培養液の1：1混合物中でサブクローニングした（前記条件付け完全DMEM/F12培養液はトランスフェクトしていない宿主NS0-LD細胞の培養で条件付けされ、遠心し、続いてろ過された）。サブクローニングのためには、細胞を96ウェルプレートの各ウェル当たり1、5、10細胞をプレートした。ほぼ2週間して、サブクローンは10および5細胞/ウェルを含むプレートで出現した。ウェル中のサブクローンを顕微鏡下で精査し、ただ1個のクローンがウェル中に見えることを確認した。2枚の96ウェルプレート（10細胞/ウェル）から16サブクローンおよび2枚の96ウェルプレート（5細胞/ウェル）から1サブクローンの上清を抗ヒトFc ELISAによってアッセイし、高生産性クローンをrPA分析のために選択した。最良のサブクローンは#395-2および#395-6であり、75cm2のTフラスコでの最終静止培養で669μg/mLおよび735μg/mLのDI-17E6γ2h(N297Q)（rPAによる）を産生した。
抗体の発現：
哺乳動物発現プラスミドを構築し、NS/0細胞にトランスフェクトし、安定したトランスフェクタントを単離した。典型的には、安定的に発現ベクターをNS/0細胞にトランスフェクトし、Tフラスコの75ミリリットル培養液に導入し、細胞密度が約400,000細胞/mLとなるように3日間増殖させた。これらの条件下では、分泌DI-17E6の濃度は約50−100マイクログラム/mLであった。
抗体の精製：
抗体は、以下の工程のいくつかまたは全てを順番に用いて精製することができる：Abx混合樹脂カラムクロマトグラフィー、組換えプロテインAクロマトグラフィーおよびQセファロースカラムクロマトグラフィー、その後、処方緩衝液への緩衝液交換のためにPellicon2タンジェンシャルフローによる透析ろ過。ウイルスの不活化および除去工程は、これらの工程の間に組み入れた。ウイルス不活化および除去工程は精製自体には必要ではないが、規制への配慮を充足させるために用いられる。
DI-17E6抗体とアルファVインテグリンレセプターサブユニットとの結合を決定するためのアッセイ：
DI-17E6抗体がアルファVインテグリンと結合する能力を、ELISAを用いてアッセイした。略記すれば、アルファVインテグリンを含むウェルに種々の量の抗体を添加し、続いてウェルを洗浄し、結合抗体を標準的方法にしたがってアッセイした。
哺乳動物発現プラスミドを構築し、NS/0細胞にトランスフェクトし、安定したトランスフェクタントを単離した。典型的には、安定的に発現ベクターをNS/0細胞にトランスフェクトし、Tフラスコの75ミリリットル培養液に導入し、細胞密度が約400,000細胞/mLとなるように3日間増殖させた。これらの条件下では、分泌DI-17E6の濃度は約50−100マイクログラム/mLであった。
抗体の精製：
抗体は、以下の工程のいくつかまたは全てを順番に用いて精製することができる：Abx混合樹脂カラムクロマトグラフィー、組換えプロテインAクロマトグラフィーおよびQセファロースカラムクロマトグラフィー、その後、処方緩衝液への緩衝液交換のためにPellicon2タンジェンシャルフローによる透析ろ過。ウイルスの不活化および除去工程は、これらの工程の間に組み入れた。ウイルス不活化および除去工程は精製自体には必要ではないが、規制への配慮を充足させるために用いられる。
DI-17E6抗体とアルファVインテグリンレセプターサブユニットとの結合を決定するためのアッセイ：
DI-17E6抗体がアルファVインテグリンと結合する能力を、ELISAを用いてアッセイした。略記すれば、アルファVインテグリンを含むウェルに種々の量の抗体を添加し、続いてウェルを洗浄し、結合抗体を標準的方法にしたがってアッセイした。
最適発現および結合親和性パターンの発見のための多様な抗体変異の作製
再操作によるDI-17E6の発現レベル増加に関するデータのまとめ
発現における問題：免疫能除去型の発現レベルはキメラの発現レベルよりも低かった：
再操作によるDI-17E6の発現レベル増加に関するデータのまとめ
発現における問題：免疫能除去型の発現レベルはキメラの発現レベルよりも低かった：
deImm17E6 VH33-VL49/VL60.2-g2h(FN->AQ)の発現レベルを増強させるために、我々は以下の変異を導入した：
a）VHのCDR2においてC60からSおよびYへ
b）VLにおいてGEAAをDGTVに戻して潜在的な弱いT細胞エピトープ以外のH-結合ネットワークを回復
c）VHのV20M復帰
一過性トランスフェクションの2セットの結果を下記にまとめる：
DeImm17E6変異体（C60S）の発現レベル対他の17E6の発現レベル（10cmプレートでのPER.C6, 24μgの一過性トランスフェクション）
a）VHのCDR2においてC60からSおよびYへ
b）VLにおいてGEAAをDGTVに戻して潜在的な弱いT細胞エピトープ以外のH-結合ネットワークを回復
c）VHのV20M復帰
一過性トランスフェクションの2セットの結果を下記にまとめる：
DeImm17E6変異体（C60S）の発現レベル対他の17E6の発現レベル（10cmプレートでのPER.C6, 24μgの一過性トランスフェクション）
DeImm17E6変異体の発現レベル（10cmプレートでのPER.C6, 24μgの一過性トランスフェクション）
ミニプレップ（miniprep）DNAによるトランスフェクション：
C60Sは極めてわずかな改善を示すだけである、一方、C60Yの結果は有望である。C60Yの結果がマクシプレップ（maxiprep）DNAに当てはまるならば（マクシプレップDNAのトランスフェクションがすでに実施されている）、我々は結合親和性の低下がないことを確認する必要がある。GEAAからDGTVへの復帰は、ほぼ0.5倍から2倍発現を改善した。ミニプレップDNAによるV20Mの結果は信頼できないが、マクシプレップDNAを用いてトランスフェクションを繰り返した。
C60Sは極めてわずかな改善を示すだけである、一方、C60Yの結果は有望である。C60Yの結果がマクシプレップ（maxiprep）DNAに当てはまるならば（マクシプレップDNAのトランスフェクションがすでに実施されている）、我々は結合親和性の低下がないことを確認する必要がある。GEAAからDGTVへの復帰は、ほぼ0.5倍から2倍発現を改善した。ミニプレップDNAによるV20Mの結果は信頼できないが、マクシプレップDNAを用いてトランスフェクションを繰り返した。
deImm17E6の発現の改善：以下の新規な構築物を用いてNS0細胞をトランスフェクトした：
pdHL10-DI-17E6[VH33(C60Y)/VL49(DGTV)]- g2h(FN->AQ)
pdHL10-DI-17E6[VH33(C60Y)/VL60.2(DGTV)]- g2h(FN->AQ)
pdHL10-DI-17E6[VH33(C60S)/VL49(DGTV)]- g2h(FN->AQ)
pdHL10-DI-17E6[VH33(C60S)/VL60.2 (DGTV)]- g2h(FN->AQ)
pdHL10-17E6-g2h(FN-AQ)（これは発現レベルを17E6g2hと比較するために作製した）
HuFc-ELISAによるPER.C6での一過性発現についての試験
ELISAのデータは、17E6-g2h(FN-AQ)と17E6-g2hは類似することを示した。驚くべきことに、(C60S)/(DGTV)の組合せの発現レベルは(C60Y)/(DGTV)の発現レベルより高く、一方、以前の結果は、C60YおよびDGTVはそれぞれ別々にDeImm17E6の発現レベルを1倍から2−3倍に増加させることを示し、C60Sは極めてわずかな利益しか示さない。
pdHL10-DI-17E6[VH33(C60Y)/VL49(DGTV)]- g2h(FN->AQ)
pdHL10-DI-17E6[VH33(C60Y)/VL60.2(DGTV)]- g2h(FN->AQ)
pdHL10-DI-17E6[VH33(C60S)/VL49(DGTV)]- g2h(FN->AQ)
pdHL10-DI-17E6[VH33(C60S)/VL60.2 (DGTV)]- g2h(FN->AQ)
pdHL10-17E6-g2h(FN-AQ)（これは発現レベルを17E6g2hと比較するために作製した）
HuFc-ELISAによるPER.C6での一過性発現についての試験
ELISAのデータは、17E6-g2h(FN-AQ)と17E6-g2hは類似することを示した。驚くべきことに、(C60S)/(DGTV)の組合せの発現レベルは(C60Y)/(DGTV)の発現レベルより高く、一方、以前の結果は、C60YおよびDGTVはそれぞれ別々にDeImm17E6の発現レベルを1倍から2−3倍に増加させることを示し、C60Sは極めてわずかな利益しか示さない。
17E6VH/425VL-g2h(FN->AQ)および以下の一過性トランスフェクションを実施した：
VLの変化は、425Abの発現レベルを明瞭に増加させた。
残念なことに、17E6VH/425VL-g2h(FN->AQ)は、結合ELISAでavb3と結合しなかった（図21参照）。
この発現／結合の問題を解決するために、以下の分子を構築した：
deImm17E6VLにおいてT8PおよびA44P置換：
DI-17E6 VL60.2(DGTV)でT8P / DI-17E6 VH33(C60Y) -g2h(FN->AQ)
DI-17E6 VL60.2(DGTV)でA44P / DI-17E6 VH33(C60Y) -g2h(FN->AQ)
DI-17E6 VL60.2(DGTV)でT8P / DI-17E6 VH33(C60S) -g2h(FN->AQ)
DI-17E6 VL60.2(DGTV)でA44P / DI-17E6 VH33(C60S) -g2h(FN->AQ)
細胞をトランスフェクトしたが、最終的な構築物は配列決定によって確認中である（制限消化は組換え体と親の分子を区別することができないため）。T8PおよびA44Pを組み合わせることが必要かもしれない。17E6 deImmVL CDRをdeImm425 VL FRに移植する。deImm425VL／deImm17E6 VHの発現レベルを試験した。なぜならば、deImm425VLは、hu425 VLと同じ高レベルで発現されないかもしれないからである。DI-425VL1を用いたが、ただし前記はPからLへの復帰を有する（VL1は結合しなかった）。結果として、CDR3のPからLへの復帰は結合を回復させた。前記をdeImm17E6 VH33（下記構築物a）およびch17E6 VH（下記構築物b）とペアにした。コントロールHu425VL/ch17E6 VH（下記構築物c）を用いて一過性トランスフェクションを実施した。
前記一過性発現の結果は、（c）が非常に高い発現レベルを示すが、一方、DI-425VLを有する構築物aおよびbはch17E6の発現レベルよりもずっと低いレベルを提示することを示した。
VLの変化は、425Abの発現レベルを明瞭に増加させた。
残念なことに、17E6VH/425VL-g2h(FN->AQ)は、結合ELISAでavb3と結合しなかった（図21参照）。
この発現／結合の問題を解決するために、以下の分子を構築した：
deImm17E6VLにおいてT8PおよびA44P置換：
DI-17E6 VL60.2(DGTV)でT8P / DI-17E6 VH33(C60Y) -g2h(FN->AQ)
DI-17E6 VL60.2(DGTV)でA44P / DI-17E6 VH33(C60Y) -g2h(FN->AQ)
DI-17E6 VL60.2(DGTV)でT8P / DI-17E6 VH33(C60S) -g2h(FN->AQ)
DI-17E6 VL60.2(DGTV)でA44P / DI-17E6 VH33(C60S) -g2h(FN->AQ)
細胞をトランスフェクトしたが、最終的な構築物は配列決定によって確認中である（制限消化は組換え体と親の分子を区別することができないため）。T8PおよびA44Pを組み合わせることが必要かもしれない。17E6 deImmVL CDRをdeImm425 VL FRに移植する。deImm425VL／deImm17E6 VHの発現レベルを試験した。なぜならば、deImm425VLは、hu425 VLと同じ高レベルで発現されないかもしれないからである。DI-425VL1を用いたが、ただし前記はPからLへの復帰を有する（VL1は結合しなかった）。結果として、CDR3のPからLへの復帰は結合を回復させた。前記をdeImm17E6 VH33（下記構築物a）およびch17E6 VH（下記構築物b）とペアにした。コントロールHu425VL/ch17E6 VH（下記構築物c）を用いて一過性トランスフェクションを実施した。
前記一過性発現の結果は、（c）が非常に高い発現レベルを示すが、一方、DI-425VLを有する構築物aおよびbはch17E6の発現レベルよりもずっと低いレベルを提示することを示した。
pdHL10-425VLFRs/DI17E6VL60.2CDRs/17E6VH33(C60S)-g2h(FN->AQ)-AbおよびpdHL10-425VLFRs/DI-17E6VL60.2CDRs/17E6VH33 (C60Y)-g2h(FN->AQ)-Abを有するNS0-LD生産クローン。
（FR1+FR2のみ）による移植は良好に発現されず、かつ結合も貧弱であるが、一方、（FR3+FR4）のみによる移植は極めて良好に発現されかつ結合も良好である。FR4のみでは成果をもたらさなかった。下記の表は、FR3のみでは発現を増加させなかったことを示している。
PER.C6の一過性トランスフェクション
（FR1+FR2のみ）による移植は良好に発現されず、かつ結合も貧弱であるが、一方、（FR3+FR4）のみによる移植は極めて良好に発現されかつ結合も良好である。FR4のみでは成果をもたらさなかった。下記の表は、FR3のみでは発現を増加させなかったことを示している。
PER.C6の一過性トランスフェクション
T25フラスコのDMEM/F12中のNS0-LDの安定なクローン
安定なNS0-LDクローンの発現レベルが高いことおよびこのクローンが結合親和性を維持していることから、DI-17E6-g2h(N->Q)(C60Y)を最終的な分子として選択した。
安定なNS0-LDクローンの発現レベルが高いことおよびこのクローンが結合親和性を維持していることから、DI-17E6-g2h(N->Q)(C60Y)を最終的な分子として選択した。
DI-17E6のインテグリン特異性の性状を調べるために、ELISA、細胞性ELISAおよびフローサイトメトリー分析を用い、これらの分析によって、我々はEMD525797の特異的リガンドとしてインテグリンのαv鎖を確認することができた。
EMD525797は精製αvインテグリンを認識するが、予測したように精製αIIbβ3に対する反応性はもたなかった。EMD525797はまた、細胞表面にαvインテグリンをもつヒト細胞株と、結合β鎖サブユニットとは無関係に相互作用する。EMD525797およびLM609の免疫反応性は下記の表に示される：
EMD525797は精製αvインテグリンを認識するが、予測したように精製αIIbβ3に対する反応性はもたなかった。EMD525797はまた、細胞表面にαvインテグリンをもつヒト細胞株と、結合β鎖サブユニットとは無関係に相互作用する。EMD525797およびLM609の免疫反応性は下記の表に示される：
精製インテグリンに対する免疫反応性
LM609（マウスモノクローナル抗体抗αvβ3）の反応性は比較のために示される。
LM609（マウスモノクローナル抗体抗αvβ3）の反応性は比較のために示される。
腫瘍細胞株に対する免疫反応性
LM609（マウスモノクローナル抗体抗αvβ3）の反応性は比較のために示されている。
ヒト腫瘍細胞株：M21、M21-LおよびMeWoメラノーマ；HT29およびColo205結腸癌；SKBR-3乳癌；A498腎癌；およびV+B2眼のメラノーマ。
CV-1はミドリザルの細胞株である。
ヒト腫瘍細胞株：M21、M21-LおよびMeWoメラノーマ；HT29およびColo205結腸癌；SKBR-3乳癌；A498腎癌；およびV+B2眼のメラノーマ。
CV-1はミドリザルの細胞株である。
EMD525797はヒトおよびサルのαvインテグリンのみを認識し、他の種のインテグリンは認識しない。この尋常ではないプロフィルの分子的基礎は、エピトープマッピング、配列比較及びｘ線-コクリスタログラフィーによって明瞭に確立されている。DI-17E6によって認識されるエピトープは、ヒトおよびサルに固有であることが、いくつかの種を用いて実施された免疫沈澱およびウェスタンブロッティング分析によって確認されている。
免疫原性
データは、DI-17E6は原型のマウス17E6型よりはるかに免疫原性が低いことを示している。図2は、実験動物に投与されたマウス17E6血清レベルは実験時間にしたがって顕著に低下することを示している。
他方、マウス17E6に対して特異性を有するサル抗体の血清レベルは実験時間にしたがって増加し、下降するマウス17E6血清レベルと逆の相関性を示す。
この逆相関性は、マウス17E6はサルおよびヒトで高度に免疫原性であり、したがってサルまたはヒトはそれぞれMAMAおよびHAMA応答（マウス17E6の薬理動力学に悪影響を及ぼす）を立ち上げることを示唆している。
本実験の別の目的は、DI-17E6の抗血管形成活性をサルのマトリゲルプラグ実験でさらに評価することである。比較のために、マウス17E6を参照化合物として用いた。
各々1匹の動物を含む4つの別個の群（ビヒクル、30mg/kgのマウス17E6、30mg/kgのDI-17E6、及び10mg/kgのDI-17E6）を用いた。6日間続く実験の開始時に、サルは、マウス17E6またはDI-17E6の静脈内注射（腕）を1回受けた（図2）。
血清を異なる3時点（抗体の注射の直前、抗体注射直後（1−2分）、実験終了時に動物をサクリファイスする前）で（脚から）採取した。マウス17E6 およびDI-17E6の両方のレベルを分析した。検出のために適切な血清希釈が血清中の異なる２つの時点で見いだされた：抗体投与直後、および実験終了時。これは、10および30mg/kgの両DI-17E6処置群で見出された。
しかしながら、マウス17E6の血清レベルは抗体注射直後にのみ検出可能であった。それら血清レベルは実験終了時までにはほぼゼロであった。実験では、17E6に対する大規模なサル抗マウス中和抗体（MAMA）応答が示され、これは、サルおよび他の霊長類（例えばヒト）におけるマウス17E6の高い免疫原性を明瞭に示している。この応答は、サル血清から急速で完全な17E6の排除をもたらした。
したがって、これは、マウス17E6が大規模なHAMA応答によってヒトでより急速に排除されることを示唆している。
データは、DI-17E6は原型のマウス17E6型よりはるかに免疫原性が低いことを示している。図2は、実験動物に投与されたマウス17E6血清レベルは実験時間にしたがって顕著に低下することを示している。
他方、マウス17E6に対して特異性を有するサル抗体の血清レベルは実験時間にしたがって増加し、下降するマウス17E6血清レベルと逆の相関性を示す。
この逆相関性は、マウス17E6はサルおよびヒトで高度に免疫原性であり、したがってサルまたはヒトはそれぞれMAMAおよびHAMA応答（マウス17E6の薬理動力学に悪影響を及ぼす）を立ち上げることを示唆している。
本実験の別の目的は、DI-17E6の抗血管形成活性をサルのマトリゲルプラグ実験でさらに評価することである。比較のために、マウス17E6を参照化合物として用いた。
各々1匹の動物を含む4つの別個の群（ビヒクル、30mg/kgのマウス17E6、30mg/kgのDI-17E6、及び10mg/kgのDI-17E6）を用いた。6日間続く実験の開始時に、サルは、マウス17E6またはDI-17E6の静脈内注射（腕）を1回受けた（図2）。
血清を異なる3時点（抗体の注射の直前、抗体注射直後（1−2分）、実験終了時に動物をサクリファイスする前）で（脚から）採取した。マウス17E6 およびDI-17E6の両方のレベルを分析した。検出のために適切な血清希釈が血清中の異なる２つの時点で見いだされた：抗体投与直後、および実験終了時。これは、10および30mg/kgの両DI-17E6処置群で見出された。
しかしながら、マウス17E6の血清レベルは抗体注射直後にのみ検出可能であった。それら血清レベルは実験終了時までにはほぼゼロであった。実験では、17E6に対する大規模なサル抗マウス中和抗体（MAMA）応答が示され、これは、サルおよび他の霊長類（例えばヒト）におけるマウス17E6の高い免疫原性を明瞭に示している。この応答は、サル血清から急速で完全な17E6の排除をもたらした。
したがって、これは、マウス17E6が大規模なHAMA応答によってヒトでより急速に排除されることを示唆している。
別の実験では、DI-17E6の1回投与の薬理動力学パラメータを評価し、さらにこの実験はDI-17E6の免疫原性を精査するために計画した。DI-17E6は、実験の開始時に静脈内1回注射として1mg/kgで投与した。アッセイの期間は6週間であった。血清を投与前、ならびに投与後1、3および6週後に採取した。DI-17E6に対するサル抗体レベルを分析した。この実験では、この実験タイプのために指定した特別なELISA法（方法は未だ認可されていない）を用いて、免疫原性について直接検討を加えた。
図3は、DI-17E6に対するサル抗体はアッセイのいずれの時点でも検出できなかったことを示し、したがって、低いサル抗ヒト（MAHA）応答が生じたことを明瞭に示している。
さらに別の実験では、2つの変種17E6抗体（マウス17E6およびDI-17E6）の持続敵血清レベルを調査することによって、両抗体の免疫原性について間接的に検討を加えた。DI-17E6はアッセイの各時点で高い血清レベルを示し、DI-17E6は抗体応答を始動させず、したがってサルでは免疫原性がないことが示唆された。対照的に、マウス17E6は最後の時点までに検出することができなかった（非常に低レベルから0まで）。これはまた、サルは、マウス17E6に対してその免疫原性のためにMAMA応答を高めたことを示している。
17E6はヒトT細胞認識エピトープの除去を基準にして免疫能除去されたので、DI-17E6の免疫原性はヒトで低く、治療有効性を相殺する可能性がある免疫応答の出現という合併症をもたらすことなく反復して治療的に投与することを可能にする。これは、サルとヒトゲノム（17E6抗原のアルファ-vインテグリンを含む）との高度な相同性のために、ヒトでの状況に容易に拡大可能な他に匹敵するものがない発見である。
一方で、このことは米国で2006年／2007年に実施された最初の臨床試験で確認された。DI-17E6は、5群の健常な志願者（各群は6人の志願者を含む）に以下の種々の用量で投与された：200mg/kg、120mg/kg、70mg/kg、35mg/kg（前記は250mg、500mg、1000mgおよび1500mg/用量に相当する）。250mgの群でのみ1人の志願者が抗薬剤抗体を生じさせたが、より高い用量群（これらの用量は標準的な治療的投与の範囲にある）においていずれの志願者もDI-17E6に対して全く免疫応答を生じさせなかった。前記とは対照的に、マウス17E6は、動物モデルで強力な免疫応答を生じさせた。
本明細書で用いたT細胞エピトープマッピングおよび除去方法（この方法ではマウス抗体の配列はオーバーラップするペプチドとして分割される）にしたがえば、免疫能除去後の免疫原性の低下は、潜在的なヒトT細胞エピトープが欠失したことを示すin vitro T細胞アッセイでのスコアによって確認された。したがって、スコアは、軽鎖で147（マウス17E6）から92（DI-17E6）に、さらに重鎖で181（マウス17E6）から85（DI-17E6）に減少した。
図3は、DI-17E6に対するサル抗体はアッセイのいずれの時点でも検出できなかったことを示し、したがって、低いサル抗ヒト（MAHA）応答が生じたことを明瞭に示している。
さらに別の実験では、2つの変種17E6抗体（マウス17E6およびDI-17E6）の持続敵血清レベルを調査することによって、両抗体の免疫原性について間接的に検討を加えた。DI-17E6はアッセイの各時点で高い血清レベルを示し、DI-17E6は抗体応答を始動させず、したがってサルでは免疫原性がないことが示唆された。対照的に、マウス17E6は最後の時点までに検出することができなかった（非常に低レベルから0まで）。これはまた、サルは、マウス17E6に対してその免疫原性のためにMAMA応答を高めたことを示している。
17E6はヒトT細胞認識エピトープの除去を基準にして免疫能除去されたので、DI-17E6の免疫原性はヒトで低く、治療有効性を相殺する可能性がある免疫応答の出現という合併症をもたらすことなく反復して治療的に投与することを可能にする。これは、サルとヒトゲノム（17E6抗原のアルファ-vインテグリンを含む）との高度な相同性のために、ヒトでの状況に容易に拡大可能な他に匹敵するものがない発見である。
一方で、このことは米国で2006年／2007年に実施された最初の臨床試験で確認された。DI-17E6は、5群の健常な志願者（各群は6人の志願者を含む）に以下の種々の用量で投与された：200mg/kg、120mg/kg、70mg/kg、35mg/kg（前記は250mg、500mg、1000mgおよび1500mg/用量に相当する）。250mgの群でのみ1人の志願者が抗薬剤抗体を生じさせたが、より高い用量群（これらの用量は標準的な治療的投与の範囲にある）においていずれの志願者もDI-17E6に対して全く免疫応答を生じさせなかった。前記とは対照的に、マウス17E6は、動物モデルで強力な免疫応答を生じさせた。
本明細書で用いたT細胞エピトープマッピングおよび除去方法（この方法ではマウス抗体の配列はオーバーラップするペプチドとして分割される）にしたがえば、免疫能除去後の免疫原性の低下は、潜在的なヒトT細胞エピトープが欠失したことを示すin vitro T細胞アッセイでのスコアによって確認された。したがって、スコアは、軽鎖で147（マウス17E6）から92（DI-17E6）に、さらに重鎖で181（マウス17E6）から85（DI-17E6）に減少した。
マウス12E6軽鎖
DeI 17E6最終軽鎖
17E6マウス重鎖
DeI 17E6最終重鎖
DI-17E6は血小板フィブリノゲンレセプターαIIbβ3と相互作用しないが、血小板はまたいくつかのαvインテグリンを発現する。血小板に対する抗体の可能な副作用を排除するために、ヒト血小板濃縮血漿／コラーゲンを用いてin vitroの血小板凝集阻害についてEMD525797を評価した。160nMでも1600nMでも抗凝集活性は検出されなかった。凝集および活性化試験は、血小板濃縮血漿（Platelet Rich Plasma, PRP）、暴露内皮下マトリックスを用いる灌流チャンバーによる血栓形成を用いて実施した。
実験の結果は以下のように要約される：
DI-17E6は、いずれの濃度（非常に低い濃度（0.1μg/mL）から非常に高い濃度（1000μg/mL）まで）においても血小板の活性化も血小板の凝集も全く誘発しない。
驚くべきことに、DI-17E6は、弱い凝集誘発物質（例えばADP）によって誘発される血小板凝集を用量依存態様で妨害する。DI-17E6は、強力な凝集誘発物質（例えばコラーゲン）によって誘発される血小板凝集に影響を及ぼさない。DI-17E6は、用量依存態様で灌流チャンバーでの血小板血栓形成に同様に影響し（妨害し）、抗血栓活性を示す。
血小板凝集に関する弱い干渉は、治療的に有用となりえる潜在能力としてDI-E176の予想に反する発見である。なぜならば、腫瘍周辺は多くの血栓形成性血管部位を特徴とするからである。
実験の結果は以下のように要約される：
DI-17E6は、いずれの濃度（非常に低い濃度（0.1μg/mL）から非常に高い濃度（1000μg/mL）まで）においても血小板の活性化も血小板の凝集も全く誘発しない。
驚くべきことに、DI-17E6は、弱い凝集誘発物質（例えばADP）によって誘発される血小板凝集を用量依存態様で妨害する。DI-17E6は、強力な凝集誘発物質（例えばコラーゲン）によって誘発される血小板凝集に影響を及ぼさない。DI-17E6は、用量依存態様で灌流チャンバーでの血小板血栓形成に同様に影響し（妨害し）、抗血栓活性を示す。
血小板凝集に関する弱い干渉は、治療的に有用となりえる潜在能力としてDI-E176の予想に反する発見である。なぜならば、腫瘍周辺は多くの血栓形成性血管部位を特徴とするからである。
マウス異種移植腫瘍モデルにおけるin vivo抗血管形成活性
ヒトM21メラノーマ細胞を含むヒト皮膚をインプランテーション／トランスプランテーションによってSCIDマウスまたはヌードマウスに移植した。腫瘍細胞の皮内接種後この組織内で実験的腫瘍が増殖し、初期血管形成作用による血管系はヒトの皮膚内の血管に由来した。次の実験で、αvインテグリンをもたないM21-L細胞の使用は、移植されたヒト皮膚内の内皮細胞上で発現されたインテグリンのみが標的となったことを意味する。
DI-17E6は、SCIDマウス-ヒト皮膚キメラモデルにおいてM21-L腫瘍の増殖を阻害した。腫瘍細胞接種の1日後に処置を開始し、週に3回腹腔内に投与した1mg/用量の投与量で活性を示した（図4）。この発見は、EMD525797は腫瘍の増殖に対して抗血管形成作用を誘引することを示している。
ヒトM21メラノーマ細胞を含むヒト皮膚をインプランテーション／トランスプランテーションによってSCIDマウスまたはヌードマウスに移植した。腫瘍細胞の皮内接種後この組織内で実験的腫瘍が増殖し、初期血管形成作用による血管系はヒトの皮膚内の血管に由来した。次の実験で、αvインテグリンをもたないM21-L細胞の使用は、移植されたヒト皮膚内の内皮細胞上で発現されたインテグリンのみが標的となったことを意味する。
DI-17E6は、SCIDマウス-ヒト皮膚キメラモデルにおいてM21-L腫瘍の増殖を阻害した。腫瘍細胞接種の1日後に処置を開始し、週に3回腹腔内に投与した1mg/用量の投与量で活性を示した（図4）。この発見は、EMD525797は腫瘍の増殖に対して抗血管形成作用を誘引することを示している。
EMD525797の静脈内注射による、サルのマトリゲルプラグモデルにおける増殖因子誘発血管形成の阻害
EMD525797の抗血管形成活性の判定を広げるために、サルの無腫瘍モデル（血管形成は血管形成因子bFGFによって誘発される）で前記活性を試験した。
bFGFを含むマトリゲルプラグを健常なカニクイザルの腹部の皮下に移植した。この動物の静脈内にEMD525797を10mg/kgまたは30mg/kgで1回注射した。血管形成の判定は、マトリゲルプラグ内のヘモグロビン含有量の定量によって6日後に実施した。サルのEMD525797の処置は、新規な血管形成を用量依存態様で阻害し、30mg/kgでは高度に有効であるが10mg/kgでは活性を示さなかった（図5）。
EMD525797の抗血管形成活性の判定を広げるために、サルの無腫瘍モデル（血管形成は血管形成因子bFGFによって誘発される）で前記活性を試験した。
bFGFを含むマトリゲルプラグを健常なカニクイザルの腹部の皮下に移植した。この動物の静脈内にEMD525797を10mg/kgまたは30mg/kgで1回注射した。血管形成の判定は、マトリゲルプラグ内のヘモグロビン含有量の定量によって6日後に実施した。サルのEMD525797の処置は、新規な血管形成を用量依存態様で阻害し、30mg/kgでは高度に有効であるが10mg/kgでは活性を示さなかった（図5）。
HUVE細胞における化学療法剤併用DI17E6のin vitro試験
従来の試験で、アルファv-インテグリン阻害剤シレンジチドおよびDi-17E6との併用で種々のクラスの阻害物質に由来する代表的な化学療法剤が調べられた。この実験設計は、腫瘍増殖因子VEGFAおよびFGF2の存在下における内皮細胞増殖阻害に対する一方の阻害は、他方のIC50を低下させるか否かの疑問に回答を与える。この試験はHUVECおよび微細血管内皮細胞を用いて実施した。前記には、そのような細胞の増殖を500%まで刺激するVEGFAおよびFGF2を補充した。
96ウェル当たり100μLのVN（1μg/mL PBS溶液）でプレートを一晩4℃にて被覆した。細胞を100μLの2%FCS含有199培地に5ｘ10e3細胞/ウェルでプレートした。37℃で60分後、αVブロッカーおよび化学療法剤を単独または一緒に、2倍濃度で、100μL/ウェルの2%FCS添加199培地中に、HUVE細胞については20ng/mLのFGF-2、またはHDMVEC細胞については20ng/mLのVEGF（増殖因子の最終濃度は10ng/mL）とともに添加した。一緒に添加するとき、この2つの試験物質を出発濃度で混合し、この混合物を単独の薬剤の場合のように連続希釈した。いくつかのアッセイでは、化学療法剤は、IC50またはIC70濃度の定常量のαVブロッカーの存在下で連続希釈した。プレートを72時間インキュベートし、続いて20μL/ウェルのAlamar Blue（Resazurin）を添加することにより相対的細胞数を決定した。37℃で4時間インキュベートした後、蛍光をGeniosプレートリーダー（SLT）により535／590nm（励起／発光）で読み取った。
各ポイントで二つ組または三つ組で読み取りを実施した。培養液およびAlamar Blueを含み細胞を含まない試薬ブランクを各プレートで使用した。ブランクの値を試験値から差し引いた。ブランクの値は通常、阻害を受けていないコントロール値の5−10％であった。
シレンジチドは50μMから0.1nMの範囲で試験した。抗体17E6およびDI-17E6は50μg/mLから0.1ng/mLで試験した。試験した化学療法剤の出発濃度は下記の表に示されている：
従来の試験で、アルファv-インテグリン阻害剤シレンジチドおよびDi-17E6との併用で種々のクラスの阻害物質に由来する代表的な化学療法剤が調べられた。この実験設計は、腫瘍増殖因子VEGFAおよびFGF2の存在下における内皮細胞増殖阻害に対する一方の阻害は、他方のIC50を低下させるか否かの疑問に回答を与える。この試験はHUVECおよび微細血管内皮細胞を用いて実施した。前記には、そのような細胞の増殖を500%まで刺激するVEGFAおよびFGF2を補充した。
96ウェル当たり100μLのVN（1μg/mL PBS溶液）でプレートを一晩4℃にて被覆した。細胞を100μLの2%FCS含有199培地に5ｘ10e3細胞/ウェルでプレートした。37℃で60分後、αVブロッカーおよび化学療法剤を単独または一緒に、2倍濃度で、100μL/ウェルの2%FCS添加199培地中に、HUVE細胞については20ng/mLのFGF-2、またはHDMVEC細胞については20ng/mLのVEGF（増殖因子の最終濃度は10ng/mL）とともに添加した。一緒に添加するとき、この2つの試験物質を出発濃度で混合し、この混合物を単独の薬剤の場合のように連続希釈した。いくつかのアッセイでは、化学療法剤は、IC50またはIC70濃度の定常量のαVブロッカーの存在下で連続希釈した。プレートを72時間インキュベートし、続いて20μL/ウェルのAlamar Blue（Resazurin）を添加することにより相対的細胞数を決定した。37℃で4時間インキュベートした後、蛍光をGeniosプレートリーダー（SLT）により535／590nm（励起／発光）で読み取った。
各ポイントで二つ組または三つ組で読み取りを実施した。培養液およびAlamar Blueを含み細胞を含まない試薬ブランクを各プレートで使用した。ブランクの値を試験値から差し引いた。ブランクの値は通常、阻害を受けていないコントロール値の5−10％であった。
シレンジチドは50μMから0.1nMの範囲で試験した。抗体17E6およびDI-17E6は50μg/mLから0.1ng/mLで試験した。試験した化学療法剤の出発濃度は下記の表に示されている：
αVインテグリンブロッキング剤シレンジチド（EMD121974）および2つのαVインテグリン機能阻害抗体、17E6（EMD73034）およびその免疫能除去型DI-17E6（EMD525979）を単独でおよび一般的化学療法剤と併用して、通常のヒト内皮細胞（HUVEC）を用いるFGF刺激増殖アッセイで、またはヒト皮膚微小血管内皮細胞を用いるVEGF刺激アッセイで試験した。このアッセイ系では、細胞は、血清減量（199培地に2%FCS）培養液で唯一の増殖刺激としてFGF-2またはVEGFを用いて培養される。Alamar Blueアッセイを用いて測定したとき、増殖因子FGF-2はHUVECに対する最良の増殖刺激であることが判明し、VEGFはHDMVECに対する最良の刺激物質であった。HUVECは、増殖因子無添加コントロールよりも12.5ng/mLのFGF-2投与で406%の増加、さらにVEGF投与で238%の増加をVN上での72時間の増殖後に示した。対照的に、HDMVECはFGF-2よりもVEGFによってもっぱら刺激された（484%）。試験は、10ng/mLのFGF-2を含む培養液でHUVECを用い、または10ng/mLのVEGFを含む培養液でHDMVECを用いて日常的に実施した。αVインテグリンブロッカーおよびパクリタキセルは、単一薬剤として添加したとき細胞増殖を阻害した。HUVECを用いる典型的な試験では、シレンジチドのIC50は700nMで、17E6については5ng/mLで、DI-17E6については4ng/mLであった。パクリタキセルについては、単独で添加したときIC50は0.27ng/mLであったが、シレンジチドと併用したときIC50は0.13ng/mL減少した。抗体17E6およびDI-17E6は、パクリタキセルのIC50を0.18ng/mLおよび0.1mg/mLにそれぞれ減少させた。パクリタキセルと併用したときのDI-17E6についての典型的な結果は図6に示されている。
パクリタキセルとαVインテグリンブロッカーとの相加的作用は、HDMVECをもちいても同様に得られた。試験した化学療法剤の完全なリストは以下の表に示されている。
パクリタキセルとαVインテグリンブロッカーとの相加的作用は、HDMVECをもちいても同様に得られた。試験した化学療法剤の完全なリストは以下の表に示されている。
これらの結果は、パクリタキセルのような第二の化学療法剤と併用されたとき、DI-17E6はHUVECで別個の相加的効果を引き起こすが、一方、他の化学療法剤は、本発明の操作された抗体と併用されたとき効果を示さないか、またはわずかな相加的効果しか示さないことを示している。
種々のヒトメラノーマ細胞におけるDI17E6と化学療法剤との併用in vitro試験
種々のヒトメラノーマ細胞株（m21、SKMEL-23、SKMEI、MeWo、WM-793）で、周知であり腫瘍治療に適用される多様な化学療法剤のDI-17E6併用時の効果をin vitro増殖アッセイで調べた。
これらの結果は、使用した化学療法剤（この場合シスプラチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびテモヨロミド）に関しては、わずかな相違しかないことを示している。
使用した腫瘍細胞株に関して相違が認められる。全ての事例で、DI-17E6は、化学療法剤の相加的影響を超えるものを引き起こさない。
要約すれば、DI-17E6とDI-17E6に感受性を示さない腫瘍細胞株のための化学療法剤との併用に関しては、効果はないか、またはわずかな相加的効果しか観察されない。
強力な相加的効果は、DI-17E6とDI-17E6に感受性を示す腫瘍細胞株のための化学療法剤との併用に関して検出することができた。これらの事例では、増殖プロフィルは、HUVECでのパクリタキセル＋DI-17E6について示されたプロフィルと一致する（図6参照）。
種々のヒトメラノーマ細胞株（m21、SKMEL-23、SKMEI、MeWo、WM-793）で、周知であり腫瘍治療に適用される多様な化学療法剤のDI-17E6併用時の効果をin vitro増殖アッセイで調べた。
これらの結果は、使用した化学療法剤（この場合シスプラチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびテモヨロミド）に関しては、わずかな相違しかないことを示している。
使用した腫瘍細胞株に関して相違が認められる。全ての事例で、DI-17E6は、化学療法剤の相加的影響を超えるものを引き起こさない。
要約すれば、DI-17E6とDI-17E6に感受性を示さない腫瘍細胞株のための化学療法剤との併用に関しては、効果はないか、またはわずかな相加的効果しか観察されない。
強力な相加的効果は、DI-17E6とDI-17E6に感受性を示す腫瘍細胞株のための化学療法剤との併用に関して検出することができた。これらの事例では、増殖プロフィルは、HUVECでのパクリタキセル＋DI-17E6について示されたプロフィルと一致する（図6参照）。
DI-17E6およびシレンジチドのin vitroにおける相乗的併用
予想に反した発見が、DI-17E6とシレンジチドとの併用がin vitroで試験されたときに得られた。NSCLC細胞株H322、A549、H1975およびH460、ヒトメラノーマ細胞株M21、ならびに腎癌細胞株ACHN、A498、Caki１およびCaki 2を、DI-17E6の存在下でシレンジチドで処理した。これらの結果は、シレンジチドまたはDi-17E6単独下と比べて、通常の培養液中での3日間の増殖後にはるかに多くの細胞死を示した。
DI-17E6とシレンジチドとの相乗効果の試験を目的とする典型的な実験設計をM21、CAKI-2およびA498細胞を用いる増殖アッセイとして実施した。96ウェルプレートをビトロネクチンで被覆し、ブロッキングした後、細胞を添加し（3000−5000細胞/ウェル）、4時間後（細胞を付着および伸展させるために十分な時間）薬剤を添加し、連続希釈シレンジチド単独下でまたはDI-17E6（1μg/mL）との併用下で増殖させた。細胞をさらに3日間インキュベートし、細胞生存率をAlamar Blue試薬の供給業者の指示にしたがって測定した。
図7は、M21細胞における前記併用に対する細胞死亡率を示す（上方の曲線：シレンジチド単独、下方の曲線：シレンジチド＋DI-17E6）。
図8は、CAKI-2細胞における前記併用に対する細胞死亡率を示す（上方の曲線：シレンジチド単独、下方の曲線：シレンジチド＋DI-17E6）。
図9は、A498細胞における前記併用に対する細胞死亡率を示す（上方の曲線：シレンジチド単独、下方の曲線：シレンジチド＋DI-17E6）。
いずれのαvインテグリン結合剤も、アロステリック阻害剤が存在しつづける中で競合的阻害剤のパルス添加を行う以前に、この系がアロステリック阻害剤により予備飽和されていることを予想するものであって、これは異常な発見である。これは、インテグリンの相乗的なブロッキングを提供し、競合的阻害剤単独またはステリック／アロステリック阻害剤単独の作用を顕著に増幅させる。重要なことには、競合的阻害剤の持続的な存在は通常必要ではなく、その役割は、初期相互作用を開放して、アロステリック阻害剤のアクセスを可能にすることである。
予想に反した発見が、DI-17E6とシレンジチドとの併用がin vitroで試験されたときに得られた。NSCLC細胞株H322、A549、H1975およびH460、ヒトメラノーマ細胞株M21、ならびに腎癌細胞株ACHN、A498、Caki１およびCaki 2を、DI-17E6の存在下でシレンジチドで処理した。これらの結果は、シレンジチドまたはDi-17E6単独下と比べて、通常の培養液中での3日間の増殖後にはるかに多くの細胞死を示した。
DI-17E6とシレンジチドとの相乗効果の試験を目的とする典型的な実験設計をM21、CAKI-2およびA498細胞を用いる増殖アッセイとして実施した。96ウェルプレートをビトロネクチンで被覆し、ブロッキングした後、細胞を添加し（3000−5000細胞/ウェル）、4時間後（細胞を付着および伸展させるために十分な時間）薬剤を添加し、連続希釈シレンジチド単独下でまたはDI-17E6（1μg/mL）との併用下で増殖させた。細胞をさらに3日間インキュベートし、細胞生存率をAlamar Blue試薬の供給業者の指示にしたがって測定した。
図7は、M21細胞における前記併用に対する細胞死亡率を示す（上方の曲線：シレンジチド単独、下方の曲線：シレンジチド＋DI-17E6）。
図8は、CAKI-2細胞における前記併用に対する細胞死亡率を示す（上方の曲線：シレンジチド単独、下方の曲線：シレンジチド＋DI-17E6）。
図9は、A498細胞における前記併用に対する細胞死亡率を示す（上方の曲線：シレンジチド単独、下方の曲線：シレンジチド＋DI-17E6）。
いずれのαvインテグリン結合剤も、アロステリック阻害剤が存在しつづける中で競合的阻害剤のパルス添加を行う以前に、この系がアロステリック阻害剤により予備飽和されていることを予想するものであって、これは異常な発見である。これは、インテグリンの相乗的なブロッキングを提供し、競合的阻害剤単独またはステリック／アロステリック阻害剤単独の作用を顕著に増幅させる。重要なことには、競合的阻害剤の持続的な存在は通常必要ではなく、その役割は、初期相互作用を開放して、アロステリック阻害剤のアクセスを可能にすることである。
DI-17E6と化学療法剤との併用in vivo試験
ヒトNP18-b3膵臓ヒト細胞におけるジェムシタビン＋DI-17E6：
EMD525797の全身投与＋ジェムシタビン同時処置下での同所性異種移植膵臓腫瘍のヌードマウスにおける増殖を調べた。ジェムシタビンはこの適応症ではもっとも推奨される化学療法剤であるので、同所性異種移植ヒト膵臓腫瘍モデルの併用療法のために選択した。
NP18-b3膵臓ヒト細胞株（αvβ3インテグリンを発現する）を、免疫抑制マウスの膵臓内に同所性移植した。動物を任意抽出し、1週間後に薬剤およびビヒクルによる処置を開始した。
腫瘍を取り出し、各々10mgの細片に切断した。続いてこれらの細片を健康な動物の膵臓に縫合した（1細片/動物）。4−6週間後に、腫瘍を取り出し、再び細片に切断し、新しい動物に縫合した。続いてこれらの新しい動物を任意に抽出し、1週間後に薬剤およびビヒクルによる処置を開始した。EMD525797は動物の腹腔内に500μg/動物で週に3回投与した。ジェムシタビンは、50mg/kgの最適未満の用量として週に3回投与した（最適未満用量は以前の実験を基にした）。第四の群では、EMD525797を以前の実験を基にした最適未満用量のジェムシタビンと併用した。腫瘍の増殖測定（取り出した腫瘍の秤量）は腫瘍の移植後6週間で実施した。
EMD525797で処置した同所性腫瘍は、コントロールのビヒクル処置動物と比べて同様なサイズおよび重量を示した。同様に、ジェムシタビンもまた最適未満の用量では活性を示さなかった。しかしながら、単剤治療法と同じ用量のジェムシタビン＋EMD525797は相乗活性を示し、腫瘍は52%減少した（図10）。
ヒトNP18-b3膵臓ヒト細胞におけるジェムシタビン＋DI-17E6：
EMD525797の全身投与＋ジェムシタビン同時処置下での同所性異種移植膵臓腫瘍のヌードマウスにおける増殖を調べた。ジェムシタビンはこの適応症ではもっとも推奨される化学療法剤であるので、同所性異種移植ヒト膵臓腫瘍モデルの併用療法のために選択した。
NP18-b3膵臓ヒト細胞株（αvβ3インテグリンを発現する）を、免疫抑制マウスの膵臓内に同所性移植した。動物を任意抽出し、1週間後に薬剤およびビヒクルによる処置を開始した。
腫瘍を取り出し、各々10mgの細片に切断した。続いてこれらの細片を健康な動物の膵臓に縫合した（1細片/動物）。4−6週間後に、腫瘍を取り出し、再び細片に切断し、新しい動物に縫合した。続いてこれらの新しい動物を任意に抽出し、1週間後に薬剤およびビヒクルによる処置を開始した。EMD525797は動物の腹腔内に500μg/動物で週に3回投与した。ジェムシタビンは、50mg/kgの最適未満の用量として週に3回投与した（最適未満用量は以前の実験を基にした）。第四の群では、EMD525797を以前の実験を基にした最適未満用量のジェムシタビンと併用した。腫瘍の増殖測定（取り出した腫瘍の秤量）は腫瘍の移植後6週間で実施した。
EMD525797で処置した同所性腫瘍は、コントロールのビヒクル処置動物と比べて同様なサイズおよび重量を示した。同様に、ジェムシタビンもまた最適未満の用量では活性を示さなかった。しかしながら、単剤治療法と同じ用量のジェムシタビン＋EMD525797は相乗活性を示し、腫瘍は52%減少した（図10）。
ヒトM21またはMeWOメラノーマ異種移植モデルにおけるシスプラチン／ダカルバジン＋DI-17E6：
αvβ3インテグリン発現陽性M21またはMeWoヒトメラノーマ細胞をSCIDまたはヌードマウスの皮下に周知の標準的プロトコルにしたがって接種した。
DI-17E6をシスプラチン（cPT）またはダカルバジン（DTIC）（メラノーマの臨床治療で用いられる2つの化学療法剤）のどちらかと一緒に全身投与した。
DI-17E6は、最適未満の1週間の維持用量27.2mg/kg（およそ500μL/ml血清に相当する）で、M21またはMeWo細胞の動物への皮下注射の当日から週に1回投与した。DTICは、50mg/kgで週に1回腹腔内投与し、cPTは10mg/kgで週に1回腹腔内投与し、各々腫瘍細胞の注射後11日で開始した。
M21異種移植モデルでシスプラチンを用いて得られた結果は図11に示されている。以前に示したin vitroのデータと対比して、シスプラチン＋DI-17E6のin vivo併用は、一方の薬剤処置単独投与と比較して統計的に有意な相乗性応答増加を明瞭に誘引する。
MeWo異種移植モデルでDTICを用いて得られた結果は図12に示されている。以前に示したin vitroのデータと対比して、シスプラチン＋DI-17E6のin vivo併用は、一方の薬剤処置単独投与と比較して統計的に有意な相乗性応答増加を明瞭に誘引する。
αvβ3インテグリン発現陽性M21またはMeWoヒトメラノーマ細胞をSCIDまたはヌードマウスの皮下に周知の標準的プロトコルにしたがって接種した。
DI-17E6をシスプラチン（cPT）またはダカルバジン（DTIC）（メラノーマの臨床治療で用いられる2つの化学療法剤）のどちらかと一緒に全身投与した。
DI-17E6は、最適未満の1週間の維持用量27.2mg/kg（およそ500μL/ml血清に相当する）で、M21またはMeWo細胞の動物への皮下注射の当日から週に1回投与した。DTICは、50mg/kgで週に1回腹腔内投与し、cPTは10mg/kgで週に1回腹腔内投与し、各々腫瘍細胞の注射後11日で開始した。
M21異種移植モデルでシスプラチンを用いて得られた結果は図11に示されている。以前に示したin vitroのデータと対比して、シスプラチン＋DI-17E6のin vivo併用は、一方の薬剤処置単独投与と比較して統計的に有意な相乗性応答増加を明瞭に誘引する。
MeWo異種移植モデルでDTICを用いて得られた結果は図12に示されている。以前に示したin vitroのデータと対比して、シスプラチン＋DI-17E6のin vivo併用は、一方の薬剤処置単独投与と比較して統計的に有意な相乗性応答増加を明瞭に誘引する。
ヒトCAKI-1腎癌異種移植マウスモデルにおけるDI-17E6のin vivo試験
CAKI-1を周知の標準的なプロトコルにしたがってSCIDまたはヌードマウスの皮下に接種した。
DI-17E6は、M21またはMeWo細胞の動物への皮下注射の当日から週に1回、種々の用量で腹腔内から全身投与した。
図13は、驚くべきことに、DI-17E6は、低用量（1μg/mL）から中用量（100μg/mL血清）でほぼ同程度に（実質的な用量効果はない）腫瘍の体積／サイズを減少させることができ、一方、高用量（500μg/mL）の投与は腫瘍体積の完全な退縮をもたらす。
CAKI-1を周知の標準的なプロトコルにしたがってSCIDまたはヌードマウスの皮下に接種した。
DI-17E6は、M21またはMeWo細胞の動物への皮下注射の当日から週に1回、種々の用量で腹腔内から全身投与した。
図13は、驚くべきことに、DI-17E6は、低用量（1μg/mL）から中用量（100μg/mL血清）でほぼ同程度に（実質的な用量効果はない）腫瘍の体積／サイズを減少させることができ、一方、高用量（500μg/mL）の投与は腫瘍体積の完全な退縮をもたらす。
CAKI-1ヒト腎細胞癌異種移植モデルにおけるDI-17E6とセツキシマブ（Erbitux（エルビタックス）(商標)）との組合せ効果
腎細胞癌細胞株CAKI-1を10%FCS（加熱不活化）＋2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100単位/mLのペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMIで増殖させた。コンフルエント時に陽イオンを含まないPBSで1回洗浄し、続いてトリプシン（0.5μg/mL）／EDTA（0.2μg/mL）のPBS溶液中で37℃にて3分インキュベートすることによって細胞を継代した。細胞を培養液中に回収し、遠心し、培養液に採取して計数した。
この実験に用いた動物は、HARLAN INTERFAUNA IBERICA S.L.（Sant Feliu de Codines, Barcelona, Spain）から供給された。最低限5日の環境馴化期間中、前記動物を特定病原体フリーの施設の隔離室に収容した。
環境馴化期間の間、観察の全てを記録した。獣医が全動物を精査し、動物の健康を確認した。
処置は全ての群で実験の0日目（細胞注射と同じ日）に開始した。動物は、EMD525797については毎週1回、Erbituxについては毎週2回、10mg/mLの体積で製品またはビヒクルを腹腔内に処置された。
EMD525797についての処置用量は、100μg/mLの予想血清トロフ値が得られるように調節した。この血清トロフ値を達成するために、動物には17.1mg/kgの単回負荷投与量とともに5.1mg/kgの複数回（毎週）の維持投与量を次表に示すように投与した。
全ての動物を毎日観察し、それらの健康状態、行動、傷の有無、及び何らかの臨床的徴候について管理した。
群：
腎細胞癌細胞株CAKI-1を10%FCS（加熱不活化）＋2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100単位/mLのペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMIで増殖させた。コンフルエント時に陽イオンを含まないPBSで1回洗浄し、続いてトリプシン（0.5μg/mL）／EDTA（0.2μg/mL）のPBS溶液中で37℃にて3分インキュベートすることによって細胞を継代した。細胞を培養液中に回収し、遠心し、培養液に採取して計数した。
この実験に用いた動物は、HARLAN INTERFAUNA IBERICA S.L.（Sant Feliu de Codines, Barcelona, Spain）から供給された。最低限5日の環境馴化期間中、前記動物を特定病原体フリーの施設の隔離室に収容した。
環境馴化期間の間、観察の全てを記録した。獣医が全動物を精査し、動物の健康を確認した。
処置は全ての群で実験の0日目（細胞注射と同じ日）に開始した。動物は、EMD525797については毎週1回、Erbituxについては毎週2回、10mg/mLの体積で製品またはビヒクルを腹腔内に処置された。
EMD525797についての処置用量は、100μg/mLの予想血清トロフ値が得られるように調節した。この血清トロフ値を達成するために、動物には17.1mg/kgの単回負荷投与量とともに5.1mg/kgの複数回（毎週）の維持投与量を次表に示すように投与した。
全ての動物を毎日観察し、それらの健康状態、行動、傷の有無、及び何らかの臨床的徴候について管理した。
群：
ヒト腎CAKI-1異種移植腫瘍をもつ動物をDI17E6、Erbituxまたは両者の組合せで0日目（腫瘍細胞を接種したとき）から処置した。DI17E6の処置期間は40日で、Erbituxおよび併用群は29日であった。腫瘍の増殖は、腫瘍細胞の接種後111日まで追跡した。D17E6の初回投与量17.1mg/kgとそれに続く毎週5.1mg/kgの処置は100μg/mLのトロフ値をもたらし、40日目（処置終了）で腫瘍の有意な増殖阻害を引き起こした（T/C：25%）。
40日後にも、増殖遅延は観察期間の終了までなお観察することができた。4mg/kgまたは12mg/kgのErbituxによる週2回の処置は強力で有意な抗腫瘍効果を引き起こした。29日目（処置終了）のT/Cは9%であった。類似する強力な抗腫瘍効果が、D17E6＋4mg/kgのErbitux（2/w）およびD17E6＋12mg/kg（2/w）の両組合せで観察された。29日目（処置終了）のT/Cは、それぞれ10%および9%であった（表1参照）。
10μg/mL血清/血漿は0.55mg/kg体重に相当するということは特記する必要がある。
しかしながら、Erbitux単独処置群の腫瘍は、処置を停止した後再び増殖を開始した。対照的に、両併用群では、腫瘍サイズの平均値および中央値の減少から明らかなように腫瘍増殖阻害は持続した（図14）。
両併用群で観察期間の終了時に、1つの腫瘍のみが7日目の体積に達した（7日目は最初の腫瘍測定の日である）。
Erbitux単剤治療群では、3つの腫瘍が顕著なサイズ（＞1000mm3）に成長し、それらの多くは7日目の腫瘍サイズを超えるサイズに成長した。
一般的に、実験中の体重増加により示されるとおり、全ての処置が十分に耐ええるものであった。測定日におけるただ1度のビヒクル群およびDI17E6処置群の体重減少は、おそらく水の補給不足によって引き起こされたように思われる。対応する両方の群で、体重減少は可逆的であり、その後で体重は増加した。
DI17E6の初回投与量17.1mg/kgとその後の5.1mg/kgの毎週の投与を用いる処置（前記は処置期間中100μg/mLのトロフ値をもたらす）は、ヒト腎CAKI-1腫瘍の有意な増殖阻害を引き起こした。2週間スケジュールを用いる2つの異なる用量のErbituxによる単一処置もまた有意な増殖阻害を引き起こした。Erbituxの両用量が、抗腫瘍活性においてほぼ等しく有効であった。D17E6と4mg/kgのErbituxまたは12mg/kgのErbituxとの併用はまた、強力な抗腫瘍効果をもたらした（この効果は処置期間中の単一Erbitux処置に匹敵する）。
しかしながら、Erbitux単一療法と併用療法との間の驚くべき相違は、29日目に処置を停止した後の増殖の態様である。処置停止後82日もの長期間、併用群の腫瘍の１つが7日目（腫瘍サイズ測定の最初の日）のサイズに成長しただけであり、ここのとは、DI17E6およびErbituxで処置された腫瘍は退縮または安定な症状を示すことを意味している。
対照的に、Erbituxのみで処置された2つの群では、いくつか腫瘍は、処置停止後に相当なサイズ（429から3581mm3まで変動する）に成長し、DI17E6とErbituxとの併用は、Erbitux処置後の腫瘍増殖の再発を防ぐことができることを示した。
チロシンキナーゼ阻害剤（例えばセツキシマブ（Erbitux(商標)）による処置に対するDI-17E6の強力な相乗効果は並外れたものと考えられ、有望な腫瘍の併用療法のための分野を開いた。
40日後にも、増殖遅延は観察期間の終了までなお観察することができた。4mg/kgまたは12mg/kgのErbituxによる週2回の処置は強力で有意な抗腫瘍効果を引き起こした。29日目（処置終了）のT/Cは9%であった。類似する強力な抗腫瘍効果が、D17E6＋4mg/kgのErbitux（2/w）およびD17E6＋12mg/kg（2/w）の両組合せで観察された。29日目（処置終了）のT/Cは、それぞれ10%および9%であった（表1参照）。
10μg/mL血清/血漿は0.55mg/kg体重に相当するということは特記する必要がある。
しかしながら、Erbitux単独処置群の腫瘍は、処置を停止した後再び増殖を開始した。対照的に、両併用群では、腫瘍サイズの平均値および中央値の減少から明らかなように腫瘍増殖阻害は持続した（図14）。
両併用群で観察期間の終了時に、1つの腫瘍のみが7日目の体積に達した（7日目は最初の腫瘍測定の日である）。
Erbitux単剤治療群では、3つの腫瘍が顕著なサイズ（＞1000mm3）に成長し、それらの多くは7日目の腫瘍サイズを超えるサイズに成長した。
一般的に、実験中の体重増加により示されるとおり、全ての処置が十分に耐ええるものであった。測定日におけるただ1度のビヒクル群およびDI17E6処置群の体重減少は、おそらく水の補給不足によって引き起こされたように思われる。対応する両方の群で、体重減少は可逆的であり、その後で体重は増加した。
DI17E6の初回投与量17.1mg/kgとその後の5.1mg/kgの毎週の投与を用いる処置（前記は処置期間中100μg/mLのトロフ値をもたらす）は、ヒト腎CAKI-1腫瘍の有意な増殖阻害を引き起こした。2週間スケジュールを用いる2つの異なる用量のErbituxによる単一処置もまた有意な増殖阻害を引き起こした。Erbituxの両用量が、抗腫瘍活性においてほぼ等しく有効であった。D17E6と4mg/kgのErbituxまたは12mg/kgのErbituxとの併用はまた、強力な抗腫瘍効果をもたらした（この効果は処置期間中の単一Erbitux処置に匹敵する）。
しかしながら、Erbitux単一療法と併用療法との間の驚くべき相違は、29日目に処置を停止した後の増殖の態様である。処置停止後82日もの長期間、併用群の腫瘍の１つが7日目（腫瘍サイズ測定の最初の日）のサイズに成長しただけであり、ここのとは、DI17E6およびErbituxで処置された腫瘍は退縮または安定な症状を示すことを意味している。
対照的に、Erbituxのみで処置された2つの群では、いくつか腫瘍は、処置停止後に相当なサイズ（429から3581mm3まで変動する）に成長し、DI17E6とErbituxとの併用は、Erbitux処置後の腫瘍増殖の再発を防ぐことができることを示した。
チロシンキナーゼ阻害剤（例えばセツキシマブ（Erbitux(商標)）による処置に対するDI-17E6の強力な相乗効果は並外れたものと考えられ、有望な腫瘍の併用療法のための分野を開いた。
Claims (24)
- 以下の（i）−（v）を含む操作された組換え抗αvインテグリンハイブリッド抗体：
（i）以下の軽鎖CDR領域：
CDR1:RASQDISNYLA；
CDR2：YTSKIHS；
CDR3：QQGNTFPYT；
（ii）以下の重鎖CDR領域：
CDR1：SFWMH；
CDR2：YINPRSGYTEYNEIFRD；
CDR3：FLGRGAMDY；
（iii）以下の軽鎖フレーム領域：
FR-1:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC；
FR-2:WYQQKPGKAPKLLIY；
FR-3:GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC；
FR-4:FGQGTKVEIK；
（iv）以下の重鎖フレーム領域：
FR1：QVQLQQSGGELAKPGASVKVSCKASGYTFS ；
FR2：WVRQAPGQGLEWIG；
FR3：KATMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAS；
FR4：WGQGTTVTVSS；
および、
（v）ヒトIgGに由来する重鎖定常領域およびヒト定常軽鎖領域。 - 重鎖定常領域がIgG2に由来する、請求項１に記載の操作された抗体。
- IgG2定常領域が改変されたIgG1ヒンジ領域を含む、請求項２に記載の操作された抗体。
- 改変IgG1ヒンジ領域が、配列EPKSSDKTHTCPPCPを含む、請求項３に記載の操作された抗体。
- IgG2定常領域が、297位でアミノ酸NをQに置換することによって改変された、請求項２から４のいずれかに記載の操作された抗体。
- 296位のアミノ酸残基FがAによって置換されて、297位の改変によって生じたT細胞エピトープが除去された、請求項５に記載の操作された抗体。
- 軽鎖定常領域がヒトカッパである、請求項１から６のいずれか１項に記載の操作された抗体。
- 以下から成る、請求項１から７のいずれか１項に記載の組換え抗αvインテグリンハイブリッド抗体：
（i）可変および定常軽鎖配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTSKIHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
および、
（ii）可変および定常重鎖配列：
QVQLQQSGGELAKPGASVKVSCKASGYTFSSFWMHWVRQAPGQGLEWIGYINPRSGYTEYNEIFRDKATMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASFLGRGAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTQKSLSLSPGK。 - C-末端でサイトカインまたは増殖因子と融合した、請求項１−８のいずれか１項に記載の抗体を含む、融合タンパク質。
- 請求項１−９のいずれか１項に記載の抗体または抗体融合タンパク質をコードするDNA分子。
- 請求項1０に記載のDNA分子を含む発現ベクター。
- 請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換されたヒトを除く哺乳動物宿主細胞を含むタンパク質発現系。
- 請求項１−９のいずれか１項に記載の抗体または抗体融合タンパク質を医薬的に有効な量で含む医薬組成物。
- 第一および第二の医薬的に有効な治療薬剤を含む医薬組成物であって、第一の薬剤が請求項１−９のいずれかに記載の抗体または抗体融合タンパク質であり、第二の薬剤が、化学療法剤、血管形成阻害剤および抗腫瘍剤から成る群から選択される、前記医薬組成物。
- 抗腫瘍剤が抗腫瘍抗体である、請求項１４に記載の医薬組成物。
- 抗腫瘍抗体が抗EGFR抗体または抗Her2抗体である、請求項１５に記載の医薬組成物。
- 抗腫瘍抗体が、抗EGFR抗体セツキシマブまたはマツズマブである、請求項１６記載の医薬組成物。
- 血管形成阻害剤がインテグリン阻害剤シレンジチドである、請求項１４記載の医薬組成物。
- 化学療法剤がシスプラチンまたはDTICすなわちダカルバジンである、請求項１４記載の医薬組成物。
- 固形腫瘍または腫瘍転移の治療用医薬の製造を目的とする、請求項１−９のいずれか１項に記載の操作された抗体または抗体融合タンパク質の使用。
- 腫瘍増殖に対する効果が、血管形成妨害効果によって惹起される間接的な抗腫瘍効果とは無関係である、請求項２０記載の操作された抗体または抗体融合タンパク質の使用。
- 腫瘍治療用医薬の製造を目的とする請求項１３−１９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
- 抗腫瘍抗体が抗EGFR抗体であり、かつ操作された抗体が、前記操作抗体の投与停止後の腫瘍の再増殖を防止するかまたは遅延させる、腫瘍治療用医薬の製造を目的とする請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
- 操作された抗体が請求項８に記載の操作された抗体であり、かつ抗EGFR抗体がセツキシマブである、請求項２３に記載の使用。
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