DE2515966B2 - Vorgefärbte Objektträger für die Blutuntersuchung - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf einen vorgefärbten Objektträger für die Blutuntersuchung, enthaltend Methylenblau NN und Kresylviolettacetat.

Das sogenannte Differential-Blutbild gehört zu den am häufigsten durchgeführten mikroskopischen Methoden. Hierbei werden die einzelnen Blutpartikel (Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten etc.) mit Farbstoffen selektiv angefärbt, wodurch die mikroskopische Differenzierung und die Erkennung von pathologischen Veränderungen ermöglicht wird. Die bisher üblichen Färbeverfahren (z. B. nach Wright, May-G r ü η w a I d und Pappenheim) beinhalten mehrere Arbeitsschritte wie z. B. Blutausstrich, Fixieren, z.T. mehrfaches Färben, Waschen und Trocknen und sind daher recht umständlich. Außerdem ist die Qualität der Anfärbung stark von der Qualität der Farbstoffe, sowie von Übung und Erfahrung der damit befaßten Personen abhängig.

Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, diese Verfahren zu vereinfachen. In jüngerer Zeit ist in der DE-OS 21 53 673 ein Verfahren beschrieben, welches sich sogenannter vorgefärbter Objektträger bedient, die mit Methylenblau NN und Kresylviolettacetat beschichtet sind. Wird auf diese Objektträger ein Tropfen Blut aufgebracht und mit einem Deckgläschen bedeckt, so kann nach ca. 5 Min. mikroskopiert werden. Hierbei ist neben der Differenzierung der verschiedenen l.eukozytenformen und der Thrombozyten, zusätzlich die Erkennung von jugendlichen Erythrozyten, der sogenannten Retikulozyten möglich. Dies ist neben der einfachen und sicheren Handhabung, ein weiterer Fortschritt gegenüber dem herkömmlichen Differentialblutbild.

Trotz des unbestreitbaren Fortschritts, den dieses Verfahren erbrachte, weist es aber auch einige gravierende Nachteile auf.

So sind die Färbungen allgemein relativ stumpf, diffus und kontrastarm, ferner lassen sich die drei verschiedenen Formen der granulierten Leukozyten (Eosinophile, Neutrophile und Basophile) nur schwierig differenzieren.

y, Es wurde überraschenderweise nun gefunden, daß man vorgefärbte Objektträger der eingangs beschriebenen Art erhält, die kontrastreiche und leuchtende Färbungen ergeben und die eine sichere Differenzierung der Granulozyten ermöglichen, wenn die Farbstoffe in chromatographisch reiner Form im Gewichtsverhältnis von 1 :1,5 bis 1 :5 enthalten sind.

Aus der DE-OS 21 53 673 geht nicht hervor, von welcher Qualität die verwendeten Farbstoffe waren. Die Tatsache, daß bei der Herstellung der Farbstoff-Lösungen von ungelösten Rückständen abfiltriert werden soll, läßt auf handelsübliche Qualitäten schließen. In der Tat wurden bei der Nacharbeitung der DE-OS mit handelsüblichen Farbstoffen vorgefärbte Objektträger erhalten, deren Färbeeigenschaften denen in der DE-OS (S. 5—6) entsprachen.

Die Reinigung von Mikroskopierfarbi'.iffen ist im allgemeinen nicht üblich. So werden oftmals schon seit Jahrzehnten Farbstoffe von zweifelhafter Reinheit benutzt, die sonst zur Textilfärbung verwendet werden. Bei vielen Farbstoffen ist zudem nicht bekannt, ob und welche Verunreinigungen das Färbeergebnis beeinflussen. So ist es z. B. nicht verwunderlich, daß die amerikanische Biological Stain Commission als wichtigstes Kriterium bei der Spezifikation eines Farbstoffs die Brauchbarkeit in bestimmten Färberezepturen ansieht und für die Gehaltsbestimmung lediglich photometrische und reduktometrische, aber keine chromatographischen Methoden vorschreibt (vgl. z. B. R. D. Li 11 ie »Conn's Biological Stains«, 8. Aufl, Williams and Wilkins Comp. Baltimore 1969, S. 10-14,416-417).

Diese photometrischen und reduktometrischen Methoden gehen aber höchstens Aufschlüsse über den Gesamtfarbstoffgehalt und nicht über etwaige färbende Verunreinigungen.

Methylenblau NN (Neumethylenblau, C. I. Basic Blue 24, 3,7-Bis-(r\-äthylamino)-2,8-dimethylphenothiazoniumchlorid) ist als ca. 50—7O°/oige Ware im Handel erhältlich und weist nach unteren Befunden bei der dünnschichtchromatographischen Analyse 3—4 Nebenflecken in wechselnder Menge auf. Der Rest ist Zinkchlorid und Natriumchlorid. Es wurde von uns gefunden, daß eine ausgezeichnete Reinigung durch Lösen in Wasser und Ausfällen des Hydrochlorides mit Salzsäure erfolgen kann. Man erhält so ein chromatographisch reines Produkt, das nur noch ca. 0,5% Zinkchlorid enthält und in Form des Monohydrochlorids vorliegt.

Somit ist eine bevorzugte AuiTührungsform des erfindungsgemäßen Objektträgers dadurch gekennzexhnet, daß das Methylenblau NN als Monohydrochlorid vorlieg'..

Kresylvioleltacetat (Cresylcchtviolett, Cresyl Fast Violett Acetate, 5,^l.'-Diaminobenzo{a)phenoxazoniumacetat) ist im Handel mit mehr oder weniger großen Mengen Natriumacetat verunreinigt erhältlich. Auch hier weist die dünnschichtchromatographische Analyse 3 Nebenflecken in wechselnder Menge auf. Die Reinigung kann wie folgt vorgenommen werden:

Zuerst wird durch vorsichtiges Digerieren in Wasser das Natriumacetat entfernt. Danach wird in Methanol gelöst und mit Äther ausgefällt. Die Wiederholung dieser Prozedur liefert ein chromatographisch reines Produkt.

Die so gereinigten Farbstoffe lösen sich im Gegensatz zu den Handelsprodukten rückstandsfrei in Methanol und können in der in der DE-OS 21 53 673 (Seite 4) beschriebenen Weise auf Objektträger ausgestrichen

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werden. Sie können auch gemäß DE-OS 24 24 955 in Wasser gelöst und zusammen mit Polyoxyäthylen-sorbitan-monopalmitat (Tween 80) aufgebracht werden.

Es ist weiterhin sehr erstaunlich, dal! man nur dann brauchbare Objektträger mit den überraschend verbesserten Eigenschaften erhält, wenn man das Verhältnis der zwei Farbstoffe zwischen 1 :1,5 und 1 :5 wählt. In der DE-OS21 53 673 wird nämlich umgekehrt behauptet und beansprucht, daß das Verhältnis 3 : 1 bzw. gemäß DE-OS 24 24 955 2,5:1 sein soll und merkliche Abweichungen tunlichst zu vermeiden sind.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erhält man, wenn man die Farbstofflösung gemäß unserer am gleichen Tage eingereichten Patentanmeldung P 25 15 869.4 auf die Objektträger aufsprüht.

Die gereinigten Farbstoffe werden dabei in Gesamtmengen von ca. 0,5 bis lOjVcm² auf die Objektträger aufgebracht Dp« Verhältnis von Methylenblau NN zu Kresvlviolettacetat darf dabei zwischen den Werten von 1 :1,5 bis 1 :5 variieren.

Die erfindungsgemäßen vorbeschichteten Objektträger können wie die in der DE-OS 21 53 673 (Seite 4-5) beschriebenen, mit einem Blutstropfen und danach mit einem Deckgläschen versehen und nach ca. 3—5 Minuten mit einem Ölimmersionsobjektiv mikroskopiert werden.

Die Färbungen sind außerordentlich klar, kontrastreich und gut reproduzierbar. Gegenüber den in der DE-OS 21 53 673 (Seiten 5—6) beschriebenen Färbecharakteristiken treten folgende Besonderheiten aus:

a) Die Granula der Eosinophilen sind leuchtend gelb gefärbt, gegenüber eine* dort beschriebenen Orangefärbung.

b) Üie Granula der Basophilen sind orangerot gefärbt im Gegensatz zur dort beschriebenen Purpurfärbung. Die als wirksames identifizierendes Merkmal bezeichnete Orangefärbung tritt dort nur am Rand der Zelle bei geeigneter Fokussierung auf.

c) Die Konturen der Kerne sind außerordentlich klar erkennbar, was die Differenzierung von Lymphozyten, Monozyten und den verschiedenen Reifestadien der Granulozyten sehr erleichtert.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen diagno- *'■ stischen Mittel besteht darin, daß die Färbungen nicht mehr von den Qualitätsschwankungen der handelsüblichen Farbstoffe abhängen. Bei der technischen Herstellung großer Stückzahlen ist die Reproduzierbarkeit bezüglich Farbstoffauftrag und -zusammensetzung von w größter Bedeutung.

Als Material für die Objektträger kann Glas verwendet werden. Sofern die Farbstoffe gemäß unserer Anmeldung P 25 15 869.4 aufgesprüht werden, können auch Kunststoffe verwendet werden, wobei die 5*> Farbstoffe natürlich auch auf Deckgläschen aus Glas oder Kunststoff aufgebracht sein können.

In den folgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläutert werden.

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Beispiel I
Reinigung von Kresylviolettacetat

50 g Kresylvioletlacetat (Metheson Coleman & Bell) werden in 100 ml Wasser suspendiert und 15 Min. kräftig gerührt. Danach wird der Farbstoff abgesaugt und zweimal mit je 100 ml eiskaltem Wasser gewaschen. Der Filterrücks'and wird in 1,6 Itr. Methanol unter Erwärmen gelöst und bei ca. 30° von den unlöslichen Anteilen abgesaugt. Das Filtrat wird langsam unter Rühren mit 3,5 Itr. Äther versetzt und unter Eiskühlung 30 Min. nachgerührt. Die gebildeten Kristalle werden abgesaugt, in 620 ml Methanol unter Erwärmen gelöst, die Lösung auf 30°Cabgekühlt und der Farbstoff durch Zugabe vor 1,85 Itr. Äther unter Rühren und Eiskühlung abgeschieden. Nach Absaugen und Waschen mit dreimal 120 ml Äther-Methanol (3:1) erhält man nach Trocknen über Diphosphorpentoxid 22 g Kresylviolettacetat in Form dunkelgrüner Kristalle. Zusammensetzung: ca. 82% Kresylviolettacetat, 8% Kresylviolettchlorid und 10% Wasser. Beim Erwärmen auf 150⁰C tritt Zersetzung ein. Die Substanz ist nach chromatographischer Untersuchung (DC-Fertigplatte Kieselgel 60 F 254 Merck, Laufmittelsystem Butanol-Eisessig-Wasser 4:1:5) praktisch rein. R_F-Wert: 0,6.

Beispiel 2
Reinigung von Methylblau NN

In einem 4 Itr.-Dreihalskolben werden 100 g Methylenblau NN (New Methylene Blue — Matheson Coleman & Bell) in 1 Itr. Wasser unter Rühren gelöst und mit 1 Itr. konzentrierter Salzsäure, d = 1,18, versetzt. Nach 4 Std Rühren unter Eiskühlung, 8 Std. Stehen im Kühlschrank bei +5° saugt man die gebildeten Kristalle ab, wäscht mit 400 ml eisgekühlter 6 N Salzsäure und 500 ml Äther. Man erhält 36,5 g schwarze, metallisch glänzende Kristalle, Zersetzung ab 253°. Der gereinigte Farbstoff besteht aus 95—97% Methylenblau NN-chlorid-Hydroch!orid und enthält 3—5% Wasser, Zink ist nur noch in Spuren vorhanden. Der Farbstoff ist nach chromatographischer Untersuchung (DC-Fertigplatte Kieselgel 60 F 254 Merck, Laufmittelsystem n-Butanol-Eisessig-Wasser 4:1 : 5) praktisch rein Rk-Wert: 0,5.

Beispiel 3
Vorgefärbte Objektträger

Es wird eine Lösung folgender Zusammensetzung unter Verwendung der gemäß Beispiel 1 und 2 gereinigten Farbstoffe hergestellt:

Methylenblau NN-Hydrochlorid 130 mg

Kresylvioleitacetat 270 mg

Methanol ad 100 ml

Diese Lösung wird mit einem Wattebausch auf Objektträger als Film verstrichen und getrocknet oder aus einer 0,5 mm Breitstrahldüse (SS 60 67228—45 der Fa. Spraying Systems) mit einem Sprühwinkel von ca. 25°C im Abstand von 20 cm durch eine Maske in einer Breite von 3 cm auf Objektträger gesprüht, die mit einer Geschwindigkeit von 1,5 m/min unter der Düse vorbeigeführt werden.

Sprühdruck: 1,2 atü; Flüssigkeitsdurchsatz durch die Düse: 10 ml/min.

Bei einer mittleren Tröpfchengröße von ca. 20 μ beträgt die aufgebrachle Farbstoffmenge ca. 3 μg/cm^{^}.

Auf so hergestellte vorgefärble Objektträger wird ein Blutstropfen von ca. 5—10 μΙ aufgebracht und mit einem Deckglas bedeckt. Nach ca. 3—5 Min. wird die Anfärbung unter dem Mikroskop bei ca. 800facher Vergrößerung unter Verwendung eines ölimmersionsobjektivs beurteilt.

Die einzelnen Partikel des Blutes stellen sich in folgender Anfärbung dar:

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kulozyten: groß kompakt granulierten orangerolfarbenen

purpurfarbenes Netzwerk innerhalb der kaum Plasmas,

angefärbten Erythrozyten. Lymphozyien:

trophile: purpurfarbener Kern mit hellpurpurfarbenem Piaspurpurfarbener Kern innerhalb eines fein granu- *> ma. lierten fast farblosen Plasmas. Monozyten:

nophile: wie Lymphozyten, nur größer und mit mehr

purpurfarbener Kern innerhalb eines grob granu- Plasma,

lierten gelben Plasma. Thrombozyten:

jphile: ίο kleine purpurfarbene Partikel, dunkelpurpurfarbener Kern innerhalb eines mittel-

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Vorgefärbter Objektträger fur die Blutuntersuchung, enthaltend Methylenblau NN und Kresylviolenacetat, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbstoffe in chrcrnatcgraphisch reiner Form und im Gewichtsverhältnis 1 :1,5 bis I :5 enthalten sind.

2. Objektträger gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Methyknblau NN als Monohydrochlorid vorliegt

3. Objektträger gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbstoffe aufgesprüht sind.

4. Verwendung von chromatographisch reinem >5 Methylenblau NN und Kresylviolettacetat im Verhältnis 1 :1,5 bis 1 :5 zur Herstellung vorgefärbter Objektträger für die Blutuntersuchung.

5. Verfahren zur Blutuntersuchung mit vorgefertigten Objektträgern, enthaltend Methylenblau NN >o und Kresyivioieuaceiai, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Objektträger nach einem der Ansprüche 1 bis 3 verwendet.