DE3109252A1

DE3109252A1 - Verfahren und zusammensetzung zur bestimmung einzelner leukozyten durch metachromatische farbstoffdifferentialabsorption

Info

Publication number: DE3109252A1
Application number: DE19813109252
Authority: DE
Inventors: Lawrence 44233 Hinckley Ohio Kass
Original assignee: Individual
Current assignee: CYTOCOLOR Inc HINCKLEY OHIO US
Priority date: 1980-03-12
Filing date: 1981-03-11
Publication date: 1982-04-29
Also published as: IT1209851B; JPS56140253A; GB2074749A; US4581223A; IT8147999A0; GB2074749B; FR2478317B1; FR2478317A1; CA1176963A; JPH027427B2; DE3109252C2

Description

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung auf zytologischem Gebiet und bezieht sich insbesondere auf ein mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse, bei dem unter Einstrahlung eines normalen weißen Lichts auf ein mikroskopisches Feld eine optische Differenzierung, Identifizierung, Vergleiche und eine Aufzählung jeder von fünf weißen Blutzellen ermöglicht wird, indem ein einziger reiner Farbstoff ohne Fixiermittel verwenden wird, und das genauer und schneller ist als das bisher manuell oder mittels eines Leukozytendifferentialzählers automatisch durchgeführte Verfahren.

Ehrlich machte biologische Elemente bei der mikroskopischen Überprüfung und photographischen Beobachtung

15 durch Anfärben mit Farbstoffen (Anilin-Farbstoffe)

leichter und einfacher erkennbar, um bestimmte weiße Blutzellen zu identifizieren. Ehrlich war der erste, der feststellte, daß einige Farbstoffe metachromatisch sind, wobei er beobachtete, daß das Anfärben der Zelle dazu führt, daß die Zelle eine Farbe annimmt, die anders ist als die Farbe des Farbstoffs oder die Farbe, die aufgrund des Farbstoffs zu erwarten ist. Beispielsweise wurde bei Basophilen festgestellt, daß sie eine andere Farbe als die des Farbstoffs annehmen. Über andere histologische Proben als Blutzellen wird gleichfalls berichtet, daß sie in einer Vielzahl identifizierbarer unterschiedlicher Farben mit Farbstoff anfärbbar sind.

Ein Überblick des Standes der Technik zeigt, daß es eine fast weltweite Praxis ist, vor dem Anfärben (bei dem im allgemeinen ein Gemisch aus einer Vielzahl chemisch unterschiedlicher Farbstoffe verwendet wird) ein Fixierverfahren durchzuführen, das eine Behandlung bis zu einer

halben Stunde erfordern kann, bevor die biologische Probe dem Farbstoff ausgesetzt wird. Fixiermittel sind im allgemeinen Konservierungsmittel und Denaturierungsmittel, die die Empfindlichkeit der Farbstoffabsorption häufig beeinträchtigen. Beispielsweise enthalten Fixiermittel Formaldehyd sowohl als Flüssigkeit wie als Dampf, absolute Alkohole (Methyl), Picroformal usw. Sehr häufig werden lebende Zellen nicht angefärbt, wenn vitalfarbstoffe verwendet werden, wobei sich Fixiermittel als wesentlieh erwiesen haben, um Proben anzufärben. In der Zy tochemie gibt es eine umfangreiche Literatur über Verfahren, die entwickelt wurden, um ein reproduzierbares Anfärben von Blutzellen zu ermöglichen. Viele wesentliche Zusätze sind normalerweise nicht stabil und zersetzen sich schnell, so daß die Zellen-Identifizierung schwierig und manchmal unzuverlässig wird. Dr. Thomas E. Necheles hat in Bezug auf Leukozytenanalyse festgestellt, daß dieses "System sich in 50 Jahren wenig oder gar nicht geändert hat".

Das Anfärben mit Farbstoff stellt jedoch ein Mittel zur Unterscheidung sonst nicht unterscheidbarer Details durch Übertragung einer Farbreaktion auf die Zellen und deren anfärbbare Teile dar, und zwar metabolisch, funktionell oder pathologisch.

In den Krankenhäusern in den USA begann die Leukozytenzählung in den frühen 1900er Jahren, wobei die Zählung als Anhaltspunkt dafür dient, ob beispielsweise eine Notoperation notwendig ist oder nicht. Allein in den USA werden täglich mehr als eine halbe Million Differentialzählungen durchgeführt, die meisten nach manuellen Verfahren. Es ist wichtig, daß die Gesamtzählung der weißen Zellen und die Differentialzellenzählung ohne Verzögerungen durchgeführt und mitgeteilt werden. Die Zeit ist

essentiell und die erforderliche Analyse schneller zu haben, ist ein Bedürfnis und ein Wunsch.

Durch den Wert der Leukozytenzählung, die sich etabliert hatte, entwickelte sich das Bedürfnis nach einer schnellen Blutanalyse derart, daß die etwa zu Beginn der 1950er Jahre durch Arbeiten von Mellors und Papaincolaou (1952) % eingeleitete Entwicklung automatischer Differentialleuko- Γ" zytenzähleinrichtungen 1980 zu einer Vielzahl von Geräten

führte. Die "CYDAK"-Anlage wurde frühzeitig dazu benutzt, um die Ausführbarkeit der Blutzellenklassifizierung zu untersuchen, die die Bedeutung von spezialisierten Anfärbeverfahren aufzeigte, wobei die Merkmale der optischen Densitäts-Hystogramme, jedes Zellenbildes entnommen wurden.

Durch das Verfahren wurde festgestellt, daß die Zellen in vier oder fünf Klassen von Leukozyten differenziert werden können, nämlich Neutrophile, Eosinophile, Lymphozyten und MDnozyten. Young veröffentlichte Ergebnisse (1969) über eine automatische Klassifizierung von fünf * Klassen von Zellen und Bacus dehnte die Differenzierung 1971 aus.

Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die automatischen Differentialsysteme gegenwärtig auf einem Vielfarbstoffeinsatz beruhen, sowie auf Farbstoff-Abbausystemen oder indirektei Fluoreszenzmaßnahmen unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen. Die letzteren werden von Kleinemann in den ÜS-PS 3 916 205 und 4 146 604 beschrieben, die hier miteinbezogen werden und den gegenwärtigen Stand der Technik bei einigen Maßnahmen zeigen. Wie festzustellen ist, werden auch hier wieder Fixiermittel als Standardpraxis bei dem Verfahren des Patentinhabers verwendet.

Bei dem Anfärben von Blut nach dem Stand der Technik ist festgestellt worden, daß es die Praxis ist, einen oder mehrere Farbstoffe in Kombination zu verwenden (Romanowski, Giemsa und Wright-Anfärbungen). Bei diesen Methoden ist es in der Praxis schwierig, eine Qualitätskontrolle vorzusehen. Diese Methoden erfordern eine Standardisierung bei der Herstellung jedes Farbstoffbestandteile sowie bei dem Verfahren der Probeanfärbung. Bei der Entwicklung von erfolgreichen automatischen

<- 10 Leukozytenzählern ist die Reproduzierbarkeit der Anfärbung sogar noch wichtiger für eine kontrollierbare Analyse.

Es wird berichtet, daß das "LARC"-Anfärbemittel (das in den kommerziellen automatischen Differentialleukozytenzählern verwendet wird), ein Gemisch von etwa 10 Thiazinfarbstoffen, Eosin Y und 2,4,5 Tribromfluorescein ist (Mogler 1973) (P. N. Marshall). Die gegenwärtigen Anfärbemittel liegen häufig in einer alkoholischen Lösung mit einem Fixiermittel vor, wobei zwei oder mehr Farbstoffe in Kombination zum Einsatz kommen. Eine genaue Analyse durch Vitalblutanfärbung ist sehr schwierig. Durch die Schwierigkeit, die sich durch eine kontrollierte Oxidation von Methylen-Blau ergeben, was bei den Romanowski-Farbstoffen beispielsweise wesentlich ist, werden die Schwierigkeiten einer Qualitätskontrolle von zehn einzelnen unterschiedlichen zugegebenen Farbstoffen, die in Kombination benutzt werden, sehr groß.

Es ist festgestellt worden, daß die weit verbreitete Standardisierung und die Verwendung einer beschränkten Anzahl von Farbstoffen eine größere Genauigkeit und Reproduzierbarkeit bei zytologischen Studien sicherstellen würde. Wenn Fixiermittel verwendet werden, ist eine ernsthafte

Beeinträchtigung durch Artifakte beobachtet worden, was Schwierigkeiten bei der Interpretation und Mißinterpretationen bei der Leukozytendifferenzierung und -aufzählung verursacht. pH-Einstellungen und Schwermetallkationen sollen zytochemische Versuche daran hindern, in der erwarteten Weise zu arbeiten. Es wurde festgestellt, daß einige Farbstoffe, insbesondere Azofarbstoffe eine nicht spezifische Ausfällung um die Zellen zeigen. Andere degenerative Veränderungen der fixierten Blutprobe sind Vacuole, Kleeblattbildung der Kerne, Verzerrung der Zellenform sowie Verschmierung und Störung eines idealen Anfärbens. Die Bedeutung der Durchführung von Differentialzählungen an fast lebenden Zellen in der kürzestmöglichen Zeit, um optimal brauchbare und verwertbare Blutzellenanalysen zu erhalten, ist erkannt worden. Alkoholische Farbstofflösungen beeinträchtigen das supravitale Anfärben. Soweit bekannt, zeigen frisch zubereitete wasserlösliche Anfärbemittel den geringsten denaturierenden Effekt auf das supravitale Blut bei der Untersuchung. Alle Farbstoffe sind für die Blutzellen mehr oder weniger toxisch, jedoch sind es einige mehr als andere. Es ist wesentlich, daß die Zellen bei der Untersuchung so lang wie möglich am Leben bleiben. Die Schnelligkeit des Anfärbens verkürzt offenbar die Aussetzungszeit, so daß die Möglichkeit größer ist, die Leukozytenzellen zu untersuchen, bevor sie ihre Vitalität verloren haben. Es besteht ein Bedürfnis nach einer automatischen Differentialleukozytenzählung innerhalb weniger Minuten.

Studien und ein Überblick des Standes der Technik hinsichtlich der Durchführung von mikroskopischen Blutanalysen und Krankheitsdiagnosen haben gezeigt, daß es für den Pathologen nicht unüblich ist, den Farbstoff und die Blut-

probe auf Körpertemperatur (etwa 37° C) vor dem Kontakt zu erwärmen. Dr. Sabin hatte eine "Wärmebox", um eine Temperaturkontrolle sicherzustellen.

Es ist auch festgestellt worden, daß einige nach dem Stand der Technik verwendete Farbstoffe sehr temperaturempfindlich sind. In der Literatur wird berichtet, daß Cresylecht-Violett kein brauchbares Anfärbemittel oberhalb 30° C ist und das häufiger benutzte Neutralrot nicht oberhalb etwa 32° C anfärbt. Es wird für den Zweck der hier beschriebenen Methode als wesentlich angesehen, daß der Farbstoff in der Lage ist, Leukozyten bei einer Temperatur von 37° C anzufärben, und es konnten keine Schwierigkeiten bei den ausgewählten Farbstoffen bei Temperaturen bis etwa 40° C

15 beobachtet werden.

Es hat sich herausgestellt, daß diese Erfindung auf basische kationische Farbstoffe beschränkt ist, welche eine Klasse darstellen, die eine relativ kleine Zahl umfaßt im Vergleich zu all den vielen Klassifikationen bekannter Farbstoffe. Der "Colour Index" für 1956 bis 1963 führt etwa 3000 synthetische organische Farbstoffe auf. Von diesen sind lediglich 190 kationisch. Aus der relativ großen Katalogliste erhältlicher basischer kationischer Farbstoffe wurden 61 angegebene Arten erfindungsgemäß getestet. Von der gesamten Anzahl, die getestet wurde, haben sich drei für den Zweck und innerhalb des Bereichs dieser Erfindung als geeignet erwiesen. Bei einer anderen Übersicht über 18 basische quaternäre Farbstoffe in einer veröffentlichten Farbstoffangebotsliste hat sich lediglich einer als geeignet erwiesen, eine Art der Leukozyten metachromatisch anzufärben.

Soweit bekannt, gehört es nicht zum Stand der Technik,

daß basische kationische quaternäre Farbstoffe in der Lage sind, selektiv Leukozytenarten anzufärben, ractachromatisch wirksam zu sein, und zwar bei Temperaturen zwischen 37° C und 4O° C. Nach dem Stand der Technik werden keine spezifischen Farbstoffe beschrieben, die dazu verwendet werden, Monozyten sofort von anderen Leukozytenarten zu unterscheiden. Zum Stand der Technik gehört kein einfaches Verfahren zur Identifikation und zur Zählung von Lymphozyten.

Die vorliegende Erfindung stellt einen Fortschritt auf zytologischem Gebiet dar, indem sie eine Reihe von weniger als einem Dutzend basischer quaternärer kationischer organischer Farbstoffe bereitstellt, die selektiv durch ein oder mehrere peripherale Blutzellenleukozyten absorbiert werden, wodurch eine ungewöhnliche Verbesserung der Identifikation und Differenzierung zwischen Teilen von Arten weißer Blutzellen erreicht wird. Die peripheralen Blutzellenleukozytenarten umfassen: polymorphonukleare Leukozyten oder Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Lymphozyten und Monozyten. Bisher mußten zytochemische Maßnahmen und komplexe Färbemittel zur Differenzierung verwendet werden, wobei häufig eine Stunde und mehr an mühsamen Präparationen erforderlich war, um eine einzige Art zu präparieren und

25 mikroskopisch zu analysieren.

Durch die Erfindung ist es nunmehr möglich, differenziert anzufärben und mit einem einzigen reinen Farbstoff in einem einfachen wässrigen Kontakt eine peripherale venösen Blutprobe ohne Fixiermittel bei Körpertemperatur zu identifizieren oder eine leukozytenangereicherte Probe davon, und zwar jede der fünf Arten der weißen Blutzellen, wie angegeben. Diese Identifizierung erfolgt sehr schnell,

I. \J

und zwar ohne sorgfältige zystochemische oder schwierige Präparation.

Durch Absorption oder Nicht-Absorption des Farbstoffes in einigen Fällen wird jede der Leukozytenarten differenziert, indem ein Bild reflektiert wird, das spektral identifizierbare unterschiedliche Farben aufweist, wobei andere Farben innerhalb des normalen Lichtspektrums absorbiert werden, das hauptsächlich den sichtbaren Lichtbereich IQ einschließt, jedoch Infrarot- und Ultraviolettbereiche nicht ausschließt, welche bei einer automatischen Einrichtung Bedeutung haben, die nicht auf das Ansprechen des menschlichen Auges beschränkt ist.

Dadurch kann jede einzelne Art von ihren Nachbarn differenziert werden, wobei jede Art gezählt wird, die Gesamtleukozytenzählung festgestellt wird, jede Art hinsichtlich ihrer Morphologie untersucht werden kann und viele Bestimmungen gemacht werden können, die von großem medizini-

2o sehen Wert sind.

Grundsätzlich absorbiert jeder der vorstehend genannten Leukozyte differentiell Licht von dem gleichen reinen Farbstoff, in Abhängigkeit von der Qualität des Farbstoffs und der Art der angefärbten Leukozyten.

Wenn keine Fixiermittel vorhanden sind, wird ein basischer Farbstoff metachromatisch absorbiert, so daß jede Klasse, Art und Gattung der Leukozyten ein charakteristisches Lichtspektrum oder Farbe reflektiert, die sich von jeder anderen Klasse, Art und Gattung von Leukozyten, die in der Probe vorhanden sind, unterscheidet. Die Metachromosie der acht erfindungsgemäßen Grundfarbstoffe dürfte einzig-

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artig sein. Die ersten vier Farbstoffe, die in Tabelle I angegeben sind, färben jede Klasse, Art und Gattung von Leukozyten, so daß sie eine identifizierbare unterschiedliche Spektralfarbe reflektieren- Diese Farbstoffe machen jeder für sich die Durchführung der Erfindung möglich. Die zweiten vier Farbstoffe, die in Tabelle I angegeben sind, färben metachromatisch, jede Klasse, Typ oder Gattung von Leukozyten, ausgenommen Lymphozyten. Jede Art absorbiert den metachromatischen Farbstoff, so daß ein unterscheidbares Lichtspektrum oder Farbe im sichtbaren Lichtbereich reflektiert wird. Kombinationen der erfindungsgemäßen Farbstoffe können für einige Leukozytenanalysen geeignet sein.

Das primäre Bezugssystem zur Identifizierung dieser neuen Klasse von Farbstoffen sind deren Spektralkurven.

Jeder Farbstoff wird durch einen Standardnamen identifiziert, soweit der Name bekannt ist, und mit einem Namen versehen, soweit derselbe nicht bekannt ist. Ein sekundäres Bezugssystem zur Identifizierung ist eine Standard-"Colour Index"-Zahl oder eine "Michrome"-Zahl, sofern dieselbe bekannt ist. In den nachstehenden Beispielen und .der Beschreibung werden manchmal chemische Strukturformeln angegeben, soweit dieselben bekannt sind, um die geeigneten Farbstoffe dieser Erfindung zu identifizieren.

In lediglich einem Fall ist der geeignete Farbstoff von solcher obskurer Natur, daß es sich als unmöglich herausgestellt hat, seine Geschichte, Chemie oder Verwendung zu erhellen. Dieser obskure Farbstoff ist als Greifswalder Blau bekannt. In einem zweiten Fall zeigte ein obskurer Literaturhinweis, der nach einer umfangreichen Recherche

gefunden wurde, daß der Farbstoff,der dort als Borreis Blau (Borreis¹ blue oder blue borrel) bezeichnet wurde, sich direkt vom Methylenblau ableitet. Das Verfahren ist nachstehend angegeben. Aufgrund der Information über die Herstellung und die Struktur von Methylenblau hat sich herausgestellt, daß die wahrscheinliche Farbstruktur nach der allgemeinen chemischen Klassendefinition Borrel-Blau umfaßt.

Die hier benutzen Klassifikationsangaben zur Identifizierung der einzigartigen Farbstoffe, die für den hier angegebenen Zweck geeignet sind, nämlich basische quaternäre metachromatische kationische organische Farbstoffe, umfassen alle bekannten reinen Farbstoffe, die in den Tabellen I, Il und III angegeben sind und sich für den erfindungsgemäßen Zweck als geeignet erwiesen haben. Die bekannten Farbstoffzusammensetzungen sind alle strukturell : verwandt und liegen im Rahmen der vorstehenden Klassifikationsangaben. Die drei Farbstoffe in Tabelle II sind metachromatisch in einem eingeschränkten Sinn nach Ehrlich, jedoch sind sie ebenfalls sehr unüblich, indem sie lediglich für Monozyten spezifisch sind. Lediglich Monozyten werden bei wässrigem Kontakt mit diesen Farbstoffen angefärbt. Ihre Verwendung ist ebenfalls in Verbindung mit den Farbstoffen

25 der Tabelle I möglich.

Die Definition "supravital", wie sie vorliegend verwendet wird, stellt eine wichtige Einschränkung dar. Sie wird für die Originalblutprobe verwendet, sowie für lebende Zellen, die von einem lebenden Organismus frisch entnommen worden sind, oder von einem frisch Getöteten oder dergleichen. So wie die Bezeichnung hier verwendet wird, sollen alle Fixiermittel ausgeschlossen werden, jedoch

soll der Einsatz von Antikoagulantien (Heparin, E.D.T.A. und dergleichen) möglich sein. Die Blutzellen können vom Knochenmark, Urin oder anderen biologischen Proben, die sie enthalten, entnommen sein.
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In allen Fällen sollen die mikroskopischen Beobachtungen die Einstrahlung von weißem Licht einschließen, das in der klinischen Mikroskopie der Standard ist. Eine automatische Differentialleukozytenzählung ist gegenwärtig durch Einstrahlung von normalem weißen Licht möglich, jedoch ist, soweit bekannt, kein gegenwärtig im Handel befindliches Gerät bekannt, das hier direkt nutzbar wäre. Das erfindungsgemäße Verfahren ist durchführbar und beseitigtviele Probleme, die eine erfolgreiche Entwicklung von computerbezogenen automatischen Differentialleukozytenzähleinrichtungen gehemmt haben.

Die einzigartigen Farbstoffe, die zu dem erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden, werden in einer gefilterten wässrigen Lösung mit einer Konzentration des reinen Farbstoffs von etwa 1 % verwendet. Die Farbstoffkonzentration ist jedoch nicht besonders kritisch, sondern kann variiert werden. Vorzugsweise werden die wässrigen Lösungen im frischen Zustand eingesetzt, wobei toxische Zusätze ausgeschlossen sein sollen. Die Interferenz der metachromatischen Reaktion zwischen Farbstoff und spezifischer Art oder Klasse des Leukozyten kann durch den Einsatz der herkömmlichen Fixiermittel völlig verhindert werden.

Die Bezeichnung "metachromatisch" dürfte zuerst von Ehrlich benutzt worden sein, um einen Farbstoff zu beschreiben, der seine Farbe deutlich ändert, wenn er von bestimmten Zellen absorbiert wird. Ein solcher Farbstoff zeigt Metachromosie,

welche eine Eigenschaft relativ weniger reiner Farbstoffe ist, hauptsächlich basischer Farbstoffe, die Gewebeelemente in verschiedenen Farben anfärben. Metachromosie setzt auch voraus, daß verschiedene Substanzen zu verschiedenen Farbspektren führen, wenn sie mit dem gleichen Farbstoff angefärbt werden. In der Zytologie sind metachromatische Körper jene, die eine Farbe annehmen, die anders ist als die des Farbstoffs, der zu ihrer Anfärbung benutzt wurde.
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Im Zusammenhang mit der vorstehenden Erörterung der Bezeichnungen "metachromatisch" und "Metachromosie" sind zwei Faktoren zu nennen. Einer ist die biologische Zelle (und ihre spezialisierten Teile), die "metachromatisch" oder "chromotrop" bezeichnet wird und ein Qualitätsmerkmal oder eine Eigenschaft der biologischen Zellprobe darstellt, und der andere ist die Qualität des Farbstoffs. Sehr wenige Farbstoffe besitzen die wesentliche Eigenschaft, eine Struktur oder Strukturen in der Zelle zu stimulieren, um Metachromosie zu zeigen. Conn (9. Auflage) berichtet "es gibt nur eine geringe Anzahl reiner Farbstoffe, die diese Reaktion zeigen". Es konnten wenige Berichte festgestellt werden, die andeuten, daß dieses Phänomen mehr als zwei unterschiedliche Farbspektren umfaßt. In einem Fall wurde von "einem hellgrün-blauen Kern-Färbemittel mit einer violetten Metachromosie für Knorpel" berichtet. Bei Farbstoffen, die normalerweise bei fixierten Geweben angewendet werden, deren chemische und physikalische Natur sich durch das übliche Präparationsverfahren vor dem Anfärben ändert, also die wesentliche Wechselwirkung zwischen dem Charakter der natürlichen biologischen Strukturen innerhalb einer Zellprobe (kann sich hierdurch ändern und unempfindlich werden gegenüber etwas, was sonst reagiert), so daß eine Färb-

stoffabsorption nicht erfolgt.

Der Umstand, daß lediglich wenige Farbstoffe "metachromatisch" sind und gegenüber verschiedenen Teilen der Zelle sich metachromatisch verhalten, verdeutlicht den Zufall bei der Auffindung der hier beschriebenen überraschend wirksamen Wechselwirkung zwischen Leukozyten und den Farbstoffen dieser Erfindung.

' 10 Die große Klasse basischer Farbstoffe, die die metachromatischen Farbstoffe dieser Erfindung einschließt, umfaßt jene, bei denen die auxochrome Gruppe eine primäre, sekundäre oder tertiäre Amingruppe ist. Einem Stickstoff kommt wenigstens die Funktion eines quaternären Stickstoffatoms zu, wobei bei Zugabe eines farblosen Anions, am häufigsten einer Halogensäure, sich ein Salz bilden kann. Da die Halogensäuren relativ stark sind, verglichen mit der Immoniumbase, reagieren sie meistens schwach sauer oder zeigen einen sauren pH. Die organische chromophore Gruppe ist ein Kation, das eine positive Ladung trägt, wobei das Halogenion ein Anion oder eine negative Ladung darstellt.

Die Neuheit und die Brauchbarkeit des hier beschriebenen Verfahrens beruht auf mehreren Konzepten. Zum ersten Mal kann man leicht, einfach und schnell sämtliche peripheralen weißen Blutzellen oder Leukozyten in einer lebenden Zellprobe anfärben, wobei im wesentlichen nur ein einziger reiner Farbstoff verwendet wird. Beispielsweise ermöglicht eine Methode die Identifizierung, Differenzierung und das Studium ausschließlich von Lymphozyten, indem ein Farbstoff verwendet wird, nämlich Borrel-Blau, bei einer Temperatur von etwa 21-25° C. Der gleiche Farbstoff führt, wenn er bei normaler Bluttemperatur (37° C) benutzt wird, zu

Differentialanfärbungen und identifiziert jede Art von Leukozyten durch eine unterschiedliche reflektierte Spektralfarbe.

Monozyten, die bisher mittels komplexer zytochemischer Verfahren identifiziert wurden, die eine mühsame Stunde sorgfältiger Zytochemie erforderten, können mit einem ausgewählten einzigen reinen Farbstoff der Erfindung sofort identifiziert und zu diagnostischen Zwecken studiert werden.

^v 10

Die allgemeine Durchführung der Erfindung wird nachstehend erläutert:

Eine l%ige Lösung in destilliertem Wasser ist aus einem ausgewählten basischen quaternären kationischen Farbstoff hergestellt worden. Wenn es sich in der Praxis als erforderlich erweisen sollte, können einer oder mehrere der betreffenden Farbstoffe miteinander als Lösungen vermischt werden.

Wenn ausschließlich Monozyten von Bedeutung sind, wird ein basischer quaternärer kationischer Farbstoff verwendet, der aus einer Klasse ausgewählt wird, die aus Carbocyanin K-5 und den Methin- und Polymethinfarbstoffen besteht, die aus einer Klasse ausgewählt werden, die aus Basisch Rot (Spektralkurve 9) und Basisch Violett 16 (Spektralkurve 8) besteht.

Wenn andererseits die spezifischen Leukozyten von Interesse Lymphozyten sind, dann ist ausschließlich für die Lymphozytenuntersuchung Borrel-Blau bei einer eingestellten Temperatur zwischen 2O und 25° C spezifisch, wobei die Aufrechterhaltung der Temperatur des Farbstoffs und der Temperatur der supravitalen Blutprobe unterhalb Bluttemperatur völlig überraschend dazu führt, daß ausschließlich

Lymphozyten selektiv angefärbt werden. Es hat sich herausgestellt, daß dieser Farbstoff keine anderen Leukozyten als Lymphozyten in diesem niedrigen Temperaturbereich anfärbt. Bei einer geringen Zunahme der Bluttemperatur oder der Körpertemperatur (37 - 4O° C) ermöglicht Borrel-Blau jedoch, wenn es als einzelner reiner Farbstoff vorliegt, eine spektrale Definition und Differenzierung sämtlicher fünf Leukozyten.

Für den weiteren Einsatz wird eine frische Probe intakten Blutes (ohne Fixiermittel) hergestellt, die mit bekannten Mitteln, beispielsweise Heparin, E.D.T.A oder Citrat antikoaguliert worden ist, von der die Erytrozyten durch Zentrifugieren, hypotone Lyse, Dichtegradientensedimentation oder ein anderes ähnliches · Verfahren entfernt worden sind, oder eine Plasmaprobe, die mit Leukozyten (oder weißen Blutzellen) nach einer von mehreren physiko-chemisehen Verfahren, wie sie vorstehend genannt sind, angereichert worden ist.

Die wässrige Lösung des ausgewählten einzigen reinen Farbstoffs oder der Kombination eines oder mehrerer reiner Farbstoffe, wie in Tabelle I und II angegeben (wie in Tabelle III erläutert), wird vermischt, um eine einfache wässrige Farbstoff lösung zu bilden.(Die Beachtung der verschiedenen volumetrischen Verhältnisse der wässrigen Farbstofflösung und der verschiedenen Stärken der wässrigen Farbstofflösungen kann zu optimalen Bedingungen bei den verschiedenen spezifischen zytologischen Analysen führen). Einige Versuche können zu spezifischen Kombinationen führen, die besondere Vorteile aufweisen und in Erwägung zu ziehen sind, jedoch außerhalb des Rahmens dieser Beschreibung.

Die Blutproben können von den unterschiedlichsten Quellen

stammen, jedoch werden frische Proben venösen Blutes bevorzugt, aus dem dieErythrozyten entfernt worden sind (Zentrifugieren, hypotone Lyse, Sedimentation durch Schwerkraft, Dichtegradientsedimentation usw.), oder die Probe kann ein Plasma sein, das mit weißen Blutzellen durch physiko-chemische Verfahren angereichert worden ist, zu denen auch die vorstehend Erwähnten gehören.

Es wird vorgezogen, den wässrigen Farbstoff und die Blut- -w 10 probe zu vereinigen, wobei beide frisch hergestellt worden sind, und zwar bei normaler Temperatur des Blutes oder Körpers (etwa 36 - 40° C), sofern die geplanten Analysen dies anzeigen. Bei einer höheren Temperatur wird im allgemeinen ein schärferes Anfärben erhalten.

Die Farbstoff- und die Blut-Lösungen verhalten sich gut, wenn sie in einem Volumenverhältnis von etwa 1:4 vereinigt werden. Das Gemisch wird einige Sekunden leicht gerührt und es wird ein Tropfen des Gemische sofort als nasse Aufbringung unter Verwendung eines Glasdeckstreifens unter

einem Lichtmikroskop oder mittels eines automatischen Differentialleukozytenzählgeräts, sofern verfügbar, untersucht. ~ Andere Mittel für den Kontakt zwischen dem Farbstoff und

den Blutzellen umfassen bekannte Medien, beispielsweise Gelatin, Emulsionen usw., die mit dem Farbstoff mit einer Farbstoffkonzentration von etwa 1 % imprägniert sind. Es ist allerdings sehr wichtig, die Blutprobe nicht zu fixieren, wie es meistens geschieht. Eine Fixierung der Probe führt zu einer ernsthaften Beeinträchtigung des ungewöhnlichen metachromatischen Verhaltens der Farbstoffe der Erfindung.

Jede der Leukozyten oder weißen Blutzellen kann identifiziert und von einer anderen Art, Klasse oder Gattung durch

die absorbierte Differentialspektralfarbe oder die unterschiedliche Spektralreflektion von jeder der charakteristisch angefärbten Arten unterschieden werden. Die nachstehenden Beispiele erläutern dem Fachmann den Umfang des vorgeschlagenen neuen Verfahrens. Die Vorteile des Verfahrens sind nicht zuletzt die Leukozytenzählung (insgesamt), die Leukozytenzählung der Arten, Krankheitsdiagnosen, insbesondere von Leukämie, sowie die Überwachung von Patienten, die einer Reihe kritischer Behandlungemanterzogen werden, beispielsweise einer Chemotherapie, einer Bestrahlungsthearpie, ACTH usw.

Es ist bekannt, daß die Identifizierung und die Aufzählung sämtlicher Leukozytenarten von wesentlicher Bedeutung bei der Diagnose und der Behandlung vieler Krankheiten ist.

Die nachstehenden Beispiele sollen die Brauchbarkeit der Erfindung und deren Ausführung verdeutlichen. Sie sind freilich nicht erschöpfend oder einschränkend zu verstehen.

Durch die Erfindung wird eine einzige einzigartige reine Farbstoffzusammensetzung sowie ein Verfahren zur Unterscheidung jeder Art, Gattung und Klasse einer Serie von im Blut vorliegenden Leukozyten von einer anderen bereitgestellt, einschließlich Polymorphonuklearleukozyten (ausgereifte und noch nicht ausgereifte Neutrophile), Eosinophile, Basophile, Lymphozyten und Monozyten, und zwar durch mikroskopische Untersuchung einer einzigen Probe einer supravitalen Blutprobe, wobei die Einstrahlung des üblichen weißen Lichtes die Differenzierung ,Identifizierung, den Vergleich, die Diagnose und die Aufzählung jeder der vorstehend genannten Leukozytenarten ermöglicht.

Wenigstens eine supravitale Blutprobe wird in einem Zustand ohne Fixiermittel in innige Berührung in wässriger Lösung mit wenigstens einem wässrigen basischen quaternären kationischen organischen Farbstoff gebracht, der in der Lage ist, wenigstens vier der fünf vorstehend genannten Leukozytenarten metachromatisch bei normaler Körpertemperatur (Temperatur des normalen Blutes - etwa 37° C) anzufärben.

._. 10 Obwohl es sehr ungewöhnlich und sehr praktisch ist, daß man nur einen der vorstehend genannten reinen Farbstoffe bei einer bestimmten Leukozytenanalyse verwendet, ist es nicht wesentlich, daß lediglich ein einziger der reinen Farbstoffe der Erfindung zu dem genannten Zweck eingesetzt wird, d. h- Kombinationen werden dadurch nicht ausgeschlossen. Aufgrund der gegenwärtigen Erfahrungen mit basischen quaternären kationischen Farbstoffen, wird es als außergewöhnlich angesehen, von den vielen Untersuchten herausgefunden zu haben, daß nur wenige in der Lage sind, vier oder sämtliche Leukozytenarten differentiell anzufärben.

Von den vier ersten Farbstoffen in Tabelle I färben alle

^v sämtliche Leukozytenarten mit einem ausreichenden unterschiedlichen spektralen Ansprechen im Bereich des sichtbaren Lichts an, um die Identifikation, Differenzierung und Aufzählung jeder der fünf Arten zu ermöglichen. Drei der vorstehend genannten Färbstoffarten werden durch ihre chemische Struktur ausreichend identifiziert, um sicherzustellen, daß sie basische quaternäre kationische organische Farbstoffe sind, die die beobachtete ungewöhnliche metaChromatisehe Eigenschaft aufweisen, d. h. der gleiche Farbstoff färbt jede der Leukozyten mit einer individuell unterschiedlichen Spektralfarbe an.

Aus Tabelle I geht auch hervor, daß es vier weitere Farbstoffe gibt, die in den vorstehend gezogenen Rahmen der gleichen Klasse fallen. Diese vier Farbstoffe sind jedoch nicht in der Lage, Lymphozyten anzufärben. Der Einsatz eines dieser reinen Farbstoffe in Verbindung mit Borrel-Blau bei etwa 21 - 40° C führt jedoch ebenfalls zu einer vollständigen Differentialanfärbung sämtlicher Leukozyten, wie es bei den ersten vier Farbstoffen in Tabelle I der Fall ist.

Borrel-Blau in Tabelle I ist überaus außergewöhnlich in seiner Eigenschaft, ausschließlich Lymphozyten bei niederer Temperatur (beispielsweise 21 - 25° C) anzufärben. Dadurch werden Einzeluntersuchungen der Arten der weißen Blutzellen ohne weitere Beeinträchtigung möglich. Wenn jedoch bei normaler Bluttemperatur mit der Probe und dem Farbstoff gearbeitet wird, können sämtliche Arten gleichzeitig untersucht werden, wenn eine Blutprobe sowie Borrel-Blau-Farbstoff verwendet werden.

Der erste Farbstoff der Tabelle I, Greifswalder Blau, ist im Handel erhältlich. Nach umfangreichen Nachforschungen und einigen vorläufigen chemischen und physikalischen Untersuchungen konnte jedoch keine Literaturstelle gefunden werden, um dessen chemische Struktur zu identifizieren. Wie es bei Farbstoffen manchmal der Fall ist, stellt die Spektralanalyse eine positive Identifizierung dieses sehr brauchbaren Farbstoffs dar, wobei er durch seine Spektralkurve Nr. 1 wiedergegeben wird. In Beispiel I hat sich die Dünnschichtchromato-

30 graphie ebenfalls als zuverlässig erwiesen.

Es ist weiterhin darauf hinzuweisen, daß die Farbstoffe der Erfindung, sofern ihre chemische Struktur sicher ist, manchmal als Methin- oder Polymethinfarbstoffe bezeichnet

TABELLE

METACHROMATISCHER SPEKTRALKURVE, FARBSTOFF ART und HERSTELLER

POLYMORPHONU- EOSINOPHILE
KLEARE LEUKOZYTEN
(NEUTROPHILE)

BASOPHILE LYMPHOZYTEN

MONOZYTEN

1.	GREIFSWALDER BLAU 21 - 40° C	Spektralkurve 1 keine CI Nr. (Chroma)	GELBE Körnchen	GRÜNE Körnchen	BLAUE Körnchen	BLAUGRÜNER Kern	PURPURFAR BENER Kern
2.	BORREL-BLAU 21 - 25° C BORREL-BLAU 37 - 40° C	Spektralkurve 2 Michrorae 376 (Chroma)	(nicht angefärbt) BLAUE Körnchen	(nicht ange-. färbt) PURPURFAR BENE Körn chen	(nicht an gefärbt) ROTE Körnchen	BLAUGRÜNER Kern BLAUGRÜNES Zytoplasma und Kern	(nicht angefärbt) PURPURFAR BENES Zyto plasma ROSAROTE Körnchen
3.	RHODANIL-BLAU 21 - 40° C	Spektralkurve 3 Mi chrome 1156 E. Merck	MAGENTAFARBENE Körnchen ROTES Zytoplasma	PURPURFARBENE Körnchen	ROTE Körnchen	BLAUGRÜNER Kern	LILA Zytoplasma
33.	TOLUYLEN-BLAU 21 - 40° C	Spektralkurve 11 CI 49410 (Math. CoIe & Bell, Norwood)	BLAUER Kern GELBE Körnchen	PURPURFAR BENE Körnchen	ROTE Kern	GRÜNER Kern	PURPURFAR BENER Kem und Zyto plasma
4.	NACHTBLAU 21 - 40° C	Spektralkurve 4 CI 44085 (Chroma)	GRÜNE Körnchen	BLAUE Körnchen	PURPURFAR BENE Körn chen	(nicht angefärbt)	PURPURFAR BENER Kem GRÜNES Zy toplasma

TABELLE

(Portsetzung)

METACHROMATIS CHER FARBSTOFF

SPEKTRALKURVE, ART und HERSTELLER

POLYMORPHONU-KLEARE LEUKOZYTEN (NEUTROPHILE)

EOSINOPHILE

BASOPHILE LYMPHOZYTEN

MONOZYTEN

5.	PFLAUMENECHT (GALLO BLAU E) 21 - 40° C	Spektralkurve 5 DI 51040 (Chroma)	BRAUNE Körnchen	GRÜNE Körnchen	PURPURFAR BENE Körn chen	(nicht an gefärbt)	. PURPURFAR BENER Kern
6·.-	HOFMANNS VIOLETT 21 - 40° C	Spektralkurve 6 CI 42530 (Chroma)	GRÜNE Körnchen	PURPURFAR BENE Körn chen	ROTE Körnchen	(nicht an gefärbt)	PURPURFAR BENER Kern ROTE Körn chen
7.	BASISCH ORANGE 21 21 - 40° C	Spektralkurve 7 CI 48035 (Bayer)	DUNKELGELBE Körnchen (reif) ORANGEFARBENE Körnchen (unreif)	BRAUNE Körnchen	ROTE Körnchen	(nicht anr gefärbt)	ORANGEROTE zytoplas- mische Körn chen

3T09Z52"

oder klassifiziert werden, und manchmal Carbocyaninfarbstoff e genannt werden. Die Methin- oder Polymethin-Bezeichnung oder -Klasse dürfte in Beziehung stehen zu der Brücke zwischen den komplexen aromatischen Ringstrukturen, die wenigstens ein quaternäres Stickstoffatom in ihren Ringstrukturen aufweisen. Die chromophoren Gruppen sind kationisch. Diese aromatischen stickstoffhaltigen Ringstrukturen dürften die Ursache für die "Carboncyanin"-Nomenklatur sein. In der US-PS 2 126 852 wird eine Gruppe der Methinbrücken

"-<· 10 aufweisenden, komplexen basischen quaternären kationischen FarbstoffStrukturen der Carbocyanin-Gruppe geschildert.

Der letzte Farbstoff in Tabelle I, der als basisches Orange 21 bezeichnet wird, ist ebenfalls einzigartig, da er es dem geübten Beobachter ermöglicht, spektral zwischen reifen und unreifen Körnchen polymorphonukearer Leukozyten oder Neutrophile zu unterscheiden. Auch ist das deutliche spektrale Ansprechen zur Identifizierung von Monozyten von Vorteil bei zytologischen Untersuchungen, worauf nachstehend >, 20 nochmals eingegangen werden wird.

Sämtliche organischen Farbstoffe im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in wässriger Lösung eingesetzt. Die Konzentration kann sich je nach den besonderen Bedingungen einer bestimmten Untersuchung ändern, jedoch hat es sich im allgemeinen als brauchbar erwiesen, frisch hergestellte gefilterte Lösungen der reinen Farbstoffe in destilliertem Wasser mit einer Farbstoffkonzentration von etwa 1% zu verwenden.

30

Bei der Herstellung der mikroskopischen Blättchen für die visuelle oder die automatische Differentialleukozytenanalyse ist es von Bedeutung, die präparierte Blutprobe ohne Zusatz

von Fixiermitteln zu verwenden, wobei in fast allen Fällen es vorgezogen wird, eine Temperatur zwischen 36 und 4O° C oder Körpertemperatur bei Anfärbungsberührung zu verwenden. Ein Überblick über die Veröffentlichungen hat gezeigt, daß Sabin und andere hervorragende Forscher auf dem Gebiet der Blutchemie es vorziehen, in diesem Bereich zu arbeiten.

Abgesehen von dem ungewöhnlichen Verhalten von Borrel-Blau (vgl. Beispiel 2 und Spektralkurve 2), liegt der vorteilhafteste Einsatz im allgemeinen bei etwa 37° C. Sämtliche Farbstoffe, einschließlich Borrel-Blau führen, wenn sie bei etwa 37 C verwendet werden, zu einer schärferen, intensiveren spektralen Differenzierung der Identifizierung der Farbspektren mit einer spektralscharfen Metachromasie.

Sämtliche Farbstoffe der Erfindung stellten sich jedoch bei Raumtemperatur von etwa 21 bis 23° C als wirksam heraus. Wie vorstehend erwähnt, erweist sich Borrel-Blau im unteren Temperaturbereich als einzigartig. Es bewirkt dann lediglieh eine blaugrüne Anfärbung der Lymphozyten und zeigt nicht die außergewöhnliche völlig metachromatische Qualität, wie sie in Tabelle I dargestellt ist, in diesem kälteren Temperaturbereich.

Borrel-Blau ist damit der einzige bekannte Farbstoff unter den Farbstoffen dieser Erfindung, der ausschließlich zur Anfärbung von Lymphozyten verwendet werden kann. Lymphozyten können ausschließlich in einer fxxiermittelfreien wässrigen Umgebung bei beispielsweise 22° C angefärbt werden, und es sind ausschließlich Lymphozyten, die dann differentiell mit einem charakteristischen Spektrum entwickelt und ausschließlich studiert werden können.

Wie Tabelle I zu entnehmen, ist jedoch die mit Borrel-Blau angefärbte Blutprobe bei normaler Bluttemperatur universal, wodurch eine differentielle Anfärbung und spektrale Differenzierung jedes der fünf Leukozytenarten möglich ist, wie es bei Greifswalder Blau, Rhodanil-Blau und Toluylen-Blau auch der Fall ist.

Es ist jedoch zu betonen, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Fixiermittel vermieden werden. Es ist auch klar, daß die Bezeichnung "supravital" als eine einschränkende Bezeichnung gebraucht wird, die in engem Zusammenhang steht mit dem fixiermittelfreien Blut. Damit eine supravitale Probe vorliegt, die die Blutzellen enthält, werden die Blutzellen dem lebenden Organismus oder einem frisch getöteten Organismus·oder dergleichen entnommen. Die Zellen sollten während ihrer Entnahme lebende Zellen sein und während der Präparation des mikroskopischen Blättchens unter möglichst normalen Lebensbedingungen vorliegen, sofern es möglich ist, auch hinsichtlich der Temperatur.

Ohne daß dies theoretisch erhärtet ist, ist es bekannt, daß fast alle fremden Zusätze die Tendenz besitzen, proteinhaltige Materialien zu denaturieren. Bisher war die Verwendung von Fixiermitteln bei der Präparierung der Blutproben zur Anfärbung die weltweite Praxis. Die Erfahrung hat gezeigt, daß das Fixieren die Wechselwirkung zwischen der Metachromatie der Zellen und der metachromatischen Eigenschaft der Farbstoffe der Erfindung stört. Störende Artifakte werden dadurch auf dem Gebiet ebenfalls ver-

30 mieden.

Es ist Praxis, Antikoagulantien in der frisch gezogenen Blutprobe zu verwenden, beispielsweise Heparin und E.D.T.A.

Je geringer jedoch die Beeinträchtigung der lebenden Natur der Leukozytenzellen, die nach dem Anfärben untersucht werden sollen, ist, umso größer ist die zu erwartende Genauigkeit der Analyse.
5

Die Leukozytenfarbstoffe der Erfindung färben metachromatisch und supravital in der Mehrzahl der Fälle alle fünf Arten von weißen Blutzellen an, wenn die ausgewählte Praxis diese ^. Methode bevorzugt. Das Anfärben ist hinreichend schnell,

ν IO so daß bei normaler Bluttemperatur (37° C) der Zytologe nicht zu warten braucht oder sich auf die feinere Zytochemie zurückziehen muß, bevor die Parbentwicklung der Zellen erfolgt, wobei die spektrale Differenzierung zwischen den fünf Mitgliedern der Familie der Leukozytenzellen durchgeführt werden kann, bevor die mikroskopischen Untersuchungen entweder manuell oder mittels automatischer Differentialleukozytenzähleinrichtungen beginnen.

Es können folgende Arten fixiermittelfreier Blutproben verwendet werden:

^" 1. Antikoaguliertes (E.D.T.A., Citrat, Heparin) Ge

samtblut .

2. Suspensionen von Leukozyten, die mittels Dextran und/oder Schwerkraftsedimentierung des antikoagu-

lierten Gesamtblutes erhalten worden sind.

3. Proben des Gesamtblutes, das mit einer hypotonischen Lösung behandelt worden ist, um eine Auflösung der roten Blutzellen zu bewirken, wobei primär weiße Blutzellen und Plättchen zurückbleiben.

4. Proben anderer Körperflüssigkeiten, wie Rückenmarkflüssigkeit oder Rippenfellflüssigkeit oder Bauchwasserflüssigkeit, sowie Proben vereinigter Flüssigkeiten, sofern die weißen Blutzellen von Interesse sind.

3Ί 09252

Obgleich die Erfindung nicht spezifisch auf eine automatische Differentialleukozytenzähleinrichtung abgestellt ist, sind derartige Einrichtungen einer genauen Überprüfung unterzogen worden.
5

Das Kolleg der amerikanischen pathologischen Konferenz in Aspen, Colorado, August 1975 hat eine Reihe von Druckschriften veröffentlicht, die zu dieser Zeit in Form einer Sammlung herausgegeben wurden, die den Titel "Differentialleukozytenzählung" trägt. Diese Berichte geben Auskunft über die Entwicklung und den Stand der Technik auf dem Gebiet der automatischen Differentialblutzellenzählcomputer. Auch ist auf die US-PS 3 916 205 sowie die US-PS 4 146 604 (Kleinerman) hinzuweisen, wonach bestimmte fluoreszierende Farbstoffe in bestimmten Kombinationen zur automatischen Differenzierung bestimmter Leukozyten und anderer Blutzellen aufgrund des Ansprechends des fluoreszierenden Lichtes verwendet werden. Diese Literaturstellen sind hinsichtlich des Gegenstandes und der Aufgabe dieser Lehre relevant. Es ist darauf hinzuweisen, daß Kleinenerman nicht von der bei der mikroskopischen Untersuchung von Leukozyten üblichen Fixierung der Zellen abgeht.

Nach dem Stand der Technik werden verschiedene Grade der Diskriminierung in dem Verhalten bei der Leukozytendifferentialzählung getroffen. Grundlegend oder primär ist die Differenzierung zwischen polymorphonuklearen Zellen und mononuklearen Zellen. Dazwischen liegt die Differenzierung der Polymorphen in Neutrophile, Eosinophile und Basophile sowie die Trennung der Mononuklearen in Monozyten und Lymphozyten, was im Prinzip als möglich bezeichnet wird.

Bei dem anscheinend dritten Grad der Schwierigkeit, der

die Differenzierung der Neutrophilen in Unreife und Reife betrifft sowie die Aufteilung der Lymphozyten in normale und reaktive Typen, ist jedoch eine Kontroverse festzustellen.
5

Der gegenwärtige Stand der Technik bei den automatischen Differentialleukozytenzählern befindet sich deutlich in einem Entwicklungsstadium. Manuelle Differentiale scheinen die zu sein, auf die man sich hauptsächlich verläßt. Die automatischen Differentialzähler werden in zwei Hauptklassen oder Gruppen eingeteilt: 1. Bilderkennungssysteme und 2. zytochemische Differenzierungssysteme. Es ist darauf hinzuweisen, daß nach dem Stand der Technik Anfärbemethoden mit mehr oder weniger großem Erfolg angewendet wurden, wobei die Bedienungsperson des Geräts den Betrieb Zelle für Zelle überwachen kann. Im allgemeinen werden lediglich 100 Zellendifferentialzählungen durchgeführt. Obgleich sie genau sind, müssen für die zytochemischen Systeme noch zufriedenstellende Kalibratoren entwickelt werden, desgleichen

20 erfordern sie hochqualifizierte Bedienungspersonen.

Bei dem "LARC'-System wird eine konventionelle Lichtmikroskopie durchgeführt. Anfragen deuten jedoch an, daß das "LARC'-System nicht länger zur Verfügung steht.

Wie vorstehend erwähnt, gehen aus den Kleinerman-Patenten Zusammensetzungen sowie ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Differentialzähung und Klassifizierung von Leukozytenarten hervor, wodurch bestimmte Leukozyten unterschieden werden, nämlich Eosinophile, Monozyten, Lymphozyten, reife und nicht reife Neutrophile (jedoch sind keine Einzelheiten ober Basophile genannt), indem allen (!) Leukozyten eine charakteristische Fluoreszenz verliehen wird.

Das durch Bestrahlung mit Fluoreszenzlicht emittierte Licht wird gemessen und die Leukozytenarten werden nach der relativen Intensität des emittierten Lichtes in den charakteristischen Wellenlängenbereichen jedes Fluoreszenzfarbstoffes klassifiziert. Es wird ein System beschrieben, durch das eine automatische Differentialzählung der genannten spezifischen Leukozyten möglich ist.

Folgende Punkte sind bei dem patentierten Verfahren festzuhalten. 1. Es sind wenigstens zwei Lichtquellen wesentlich, enschließlich violettem und ultraviolettem Licht;

2. eine dritte Lichtquelle wird offenbar auch gebraucht.

3. Das System erfordert eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen, um die Leukozytenarten zu identifizieren und zu differenzieren. 4. Das System erfordert alkoholfixierte Blutabstriche. 5. Die erforderliche Anfärbezeit liegt in der Größenordnung von 10 Minuten, wobei ein Abspülen von einer Minute, das von einem Trocken gefolgt wird, erforderlich ist. 6. Es scheint eine Abnahme der Fluoreszenz zu geben in der Reihenfolge von a) Eosinophilen zu b) Neutrophilen zu c) Monozyten zu d) Lymphozyten. (Die Identifizierung der Basophile wird nicht beschrieben.) 7. In einem Strömungsrohrsystem werden die Blutzellen mit Formaldehyd fixiert und mit drei verschiedenen Farbstoffen angefärbt.

8. Die festgestellten Leukozytenfluoreszenzen werden differential gezählt und mittels Fluoreszenzlichtverhältnissen klassifiziert. 9. Das Beispiel 11 des Patentes zeigt die Identifizierung von lediglich vier der fünf Leukozytenarten. 10. Es werden drei Fluoreszenzfarbstoffe genannt, die kombiniert werden müssen, um eine einzige Farbstoffzusammensetzung zu ergeben, welche Kombination von Farbstoffen für die Arbeitsweise oder das Verfahren wesentlich, also nicht lediglich vorteilhaft, zu sein scheint.

Nach der vorliegenden Erfindung wird lediglich gewöhnliches weißes Licht benötigt. Es ist keine Änderung von dessen Intensität erforderlich. Der Einsatz eines spezifischen der erfindungsgemäßen Farbstoffe oder Färbemittel erfolgt wirklich mit einem einzigen reinen Farbstoff in brauchbarer Form. Jedoch ist festgestellt worden, daß die reinen Farbstoffe auch sowohl kombiniert wie allein verwendet werden können, um die spektrale Differenzierung zu verbessern oder zu erhöhen, falls dies erforderlich ist, und zwar bei jeder der fünf Arten oder einzelnen Mitglieder der Leukozytenzellen, wobei die Kombinationen einen beträchtlichen Fortschritt gegenüber der offensichtlichen Einschränkung der Mehrfach-Fluoreszenzfarbstoffmethode von Kleinermann bringen, was zu einem vereinfachten individuellen Grundspektrum der Intensität des weißen Lichtes führt, was wesentlich dazu beiträgt, daß automatische Differentialleukozytenzähleinrichtungen produktiver und bei der Identifizierung, Differenzierung und Aufzählung der einzelnen Leukozytenzellen wie bei den Gesamtmengen genauer sind. Aufgrund der supravitalen Technik ist auch ein kontinuierliches Überwachungssystem bei der Krankenhausdiagnose und -behandlung möglich, wo eine kritische kontinuierliche Leukozytenüberwachung ein erwünschtes Ziel wäre.

Der Ausdruck supravitaler Farbstoff oder Färbemittel und supravitales Anfärben schließt die Möglichkeit einer kontinuierlichen Perfusion durch die Blutgefäße eines lebenden Organismuses und die kontinuierliche Überwachung sämtlicher fünf Arten von weißen Blutzellen nicht aus, wenn dieselben durch ein entsprechendes Rohr zur Beobachtung und zum Zählen hindurchtreten.

Es ist bekannt, daß die meisten Farbstoffe toxisch sind, wenn sie unter supravitalen Bedingungen eingesetzt werden.

Es ist festgestellt worden, daß die weißen Zellen sehr leicht beschädigt werden, wenn sämtliche rote Zellen in einer Wärmebox bei 37° C angefärbt werden. Aus dem Stand der Technik ist es auch bekannt, daß, wenn eine Gruppe von Zellen stimuliert oder beschädigt wird, die Reaktion gegenüber den Farbstoffen sich deutlich ändert. Es ist nicht ungewöhnlich, daß das Anfärben mit einigen Farbstof- < fen relativ lange Zeit in Anspruch nimmt, in der Größenordnung von einer halben Stunde, um eine maximale Farbintensität zu erreichen. Die Leukozytenfarbstoffe dieser Erfindung färben beinahe augenblicklich an, d. h. es ist keine weitere Zeit nach dem Kontakt nötig. Die Zellen werden daher der Überprüfung in der am wenigsten denaturierten Form, die bisher bekannt ist, unterzogen.
15

Im Hinblick auf die Spektralkurven 1 bis 10 der Beschreibung ist festzustellen, daß es zwei getrennte Kurven gibt, die durch das gleiche Gerät in das Diagramm eingezeichnet werden. Die oberen Kurven, die im allgemeinen die niedrigeren Peaks «. 20 und die häufigeren Änderungen des Anstiegs aufweisen, geben

das Ansprechen auf ultraviolettes Licht wieder, während die w ursprünglichen unteren Kurven, die im allgemeinen weniger

und höhere Peaks aufweisen,die Ansprechkurven des sichtbaren Lichts wiedergeben.
25

Eine positive Identifizierung der Farbstoffe durch eine genaue chemische Strukturformel ist meistens nur dem Hersteller möglich, wenn überhaupt. Sogar die Namen der Farbstoffe sind mit einer Unsicherheit behaftet. Eine systematische Nomenklatur ist nicht die Stärke der Färberei. Die Verwendung von "Colour Index"-Nummern dürfte eine verläßliche Identifizierung darstellen, soweit dieselben bekannt sind. Es bestehen andere Farbindexsysteme (Miochrom Nummern),

die zur weiteren Identifizierung benutzt worden sind, sofern sie bekannt sind.

Die Namen, die hier benutzt werden, sollen der Identifizierung im Zusammenhang der Spektralkurven dienen, die den Farbnamen tragen. Soweit erhältlich wurden die "Colour-Index" -Zahl und der Hersteller (Quelle) des Farbstoffs angegeben (vgl. Tabelle I). Die chemische Struktur, soweit sie bekannt ist, ist in den Beispielen angegeben. Sämtliehe hier benutzten Farbstoffe wurden in der reinsten Form, in der sie erhältlich sind, benutzt. Eine Überprüfung der Spektralkurven zeigte in der Hauptsache relativ reine Farbstoffe. Wenn die tatsächliche chemische Struktur bekannt und angegeben ist, dann gibt es einen herausragenden relativ scharfen Peak in der Ansprechkurve des sichtbaren Lichts, was die Wahrscheinlichkeit und die Tatsache der vermuteten Farbstoffreinheit anzeigt.

Definitionsgemäß geben im vorliegenden Zusammenhang bei Zweifeln über die verwendete Identität der Namen der Farbstoffe die Farbspektralkurven 1 bis 11, die diesen Namen zugeordnet sind, den Ausschlag. Diese Kurven sind leicht zugänglich und relativ reproduzierbar, und gelten hier als "Fingerabdruck" für die letztendliche Identifikation der erfindungsgemäß verwendeten geeigneten Farbstoffe zum differentiellen Zytoanfärben- von fünf Arten von Leukozyten, nämlich polymorphonukleare Leukozyten oder Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Lymphozyten und Monozyten, welche alle von Interesse in der Zytologie weißer Blutzellen und bei der Diagnose unterschiedlicher Krankheiten sind.

Die Farbstoffe der Tabelle I sind sehr unüblich, da sie eine spektrale Differenzierung der großen Klasse weißer

Blutzellen oder Leukozyten zulassen, so daß eine Zytoabsorptionsfarbstofftechnik zur Differenzierung der fünf Arten von Leukozyten möglich wird. Es ist darauf hinzuweisen, daß jeder einzelne Farbstoff in Tabelle I nicht nur ein metachromatisches Anfärben von wenigstens vier Arten von weißen Blutzellen zuläßt, sondern eine Differenzierung der einzelnen angefärbten Leukozytenarten oder -klassen aufgrund unterschiedlicher Spektralfarben erlaubt.

Im Hinblick auf die drei Farbstoffe, die in Tabelle II angegeben sind, ist festzustellen, daß sie nicht die intensive Breite und ungewöhnlich vielfältige metachromatische Qualität der Farbstoffe der Tabelle I besitzen.

Obgleich sie metachromatisch in einem beschränkteren oder geringeren Ausmaß sind, sind sie, wenn sie auf eine Art der Leukozyten einwirken, spezifisch und von ungewöhnlicher Natur, da jeder ein spezifischer Farbstoff für nur eine Art, nämlich die Monozyten, darstellt. Aufgrund der sofortigen Kernanfärbung dieser Zellen und von nichts anderem, ermöglichen diese Farbstoffe eine einfache, schnelle und genaue Identifizierung und Differenzierung der Monozyten allein.

Nach dem Stand der Technik erfolgt die Identifizierung und Differenzierung der Monozyten durch eine zeitraubende und verwickelte zytochemische Behandlung der Zellen, die eine Nicht-Esterase-Reaktion, eine Präparation fixierter Zellen, eine Hexazotisation, eine pH-Einstellung und ein Anfärben mit einer Vielzahl von Farbstoffen umfaßt, und etwa 60 min dauert, was mit irgendeinem dieser drei Farbstoffe allein oder in Kombination, falls erwünscht in weniger als 1 min durch einfachen Kontakt des Farbstoffs und der Blutprobe in einem wässrigen System erreicht werden kann. Nach dem

SPEZIFISCHE FARBSTOFFE

POLYMORPHONUKLEARE

LEUKOZYTEN

(NEUTROPHILE)

Tabelle II

EOSINOPHILE

BASOPHILE LYMPHOZYTEN

MONOZYTEN

8.	BASISCH ROT 13 Spektralkurve 8 (General Analine)	(nicht angefärbt)	(nicht angefärbt)	(nicht angefärbt)	(nicht angefärbt)	ROTER Kern ROTES Zyto- plasma
9.	BASISCH VIOLETT 16 Spektralkurve 9 (DuPont)	(nicht angefärbt)	(nicht angefärbt)	(nicht angefärbt)	(nicht angefärbt)	ROSA Kern ROSA Zyto- plasma
10.	CARBOCYANIN K-5 Spektralkurve 10 (Kodak)	(nicht angefärbt)	(nicht angefärbt)	(nicht angefärbt)	(nicht angefärbt)	ROTER Kern ROSA Zyto- plasma

TABELLE III

FARBSTOFFZUSAMMENSTELLUNGEN

POLYMORPHONUKLEARE

LEUKOZYTEN

(NEUTROPHILE)

EOSINOPHILE

BASOPHILE

LYMPHOZYTEN

MONOZYTEN

11:	CARBOCYANIN K-5 + RHODANIL- BLAU (21 - 40° C)	BLAUE Körnchen	PURPURFARBENE Körnchen	ROTE Körnchen	BLAUGRÜN	ROTBRAUCHER Kern ROTBRAUNES Zyto- plasma
12.	BASISCH VIOLETT 16 + BORREL-BLAU (37 - 40° C)	BLAUE Körnchen	PURPURFARBENE Körnchen	ROTE Körnchen	blaugrUner Kern	(kräftigerer) ROSA Kern ROSAROTES Zyto- plasma
13.	BASISCH VIOLETT 16 + BASISCH ORAGNE 21 (37 - 40° C)	DUNKELGELBE Körnchen , '..ν. i:. λ:	BRAUNE Körnchen	ROTE Körnchen	(nicht angefärbt)	ROTER Kern ROTE Zytoplasma- körnchen
14.	CARBOCYANIN K-5 + BASISCH ORANGE 21 (37 - 40° C)	Farbe wie bei 7 intensiver kontrastreich	Farbe wie bei 7 intensiver	Farbe wie bei 7 besser defi nierbar	(nicht angefärbt)	Synergistisch 7 und 10 intensivere Farben hervorragend
15.	NACHTBLAU + BORREL-BLAU (37 - 40° C)	GRÜNE Körnchen	BLAUE Körnchen	PURPURFARBEN Körnchen	blaugrUner Kern	PURPURFARBENER Kern GRÜNES Zytolasma

cn .,ο

TABELLE III (Fortsetzung)

FARBSTOFF ZUSAMMENSTELLUNGEN	POLYMORPHONUKLEARE LEUKOZYTEN (NEUTROPHILE)	EOSINOPHILE	BASOPHILE	LYMPHOZYTEN	MONOZYTEN
ie. PFLAUMENECHT BORREL-BLAU (37 - 40° C)	BRAUNE Körnchen	GRÜNE Körnchen	PURPURFARBENE Körnchen	BLAUGRÜNER Kern	PURPURFARBENER Kern HELLROTE Körnchen intensivere Farben
17. BASISCH ORANGE 21 BORREL-BLAU (37 - 40° C)	GRÜNE Körnchen	GELBE Körnchen	ROTE Körnchen	BLAUGRÜNER Kern	BLAUES Zytoplasma

NJ Cn NJ

vorliegenden, hier beschriebenen Verfahren erfolgt eine sofortige bevorzugte Anfärbung des Kerns der Monozyten. Nachdem der Farbstoffkontakt etwa IO min erfolgt ist, kann man die schwache Metachromasie des Farbstoffs in den Zellen, die keine Monozyten sind, beobachten. Dies erfolgt jedoch mit Verzögerung, ist nicht stark, führt nicht zu Irrtümern und die Monozytenanalyse kann mit hinreichender Genauigkeit und Reproduzierbarkeit mit den Farbstoffen der Tabelle II vollständig durchgeführt werden.

Bei den Arbeiten, die zu der Erfindung geführt haben, wurde eine sehr große Zahl eines breiten Spektrums von Farbstoffklassen in Betracht gezogen. Die einzige allgemeine Klasse, die aufgrund ihrer Chemie sich für den erfindungsgemäßen Zweck als geeignet erwies, waren die basischen quaternären kationischen Farbstoffe. Von sämtlichen erhältlichen Farbstoffen dieser untersuchten Klasse stellten sich jedoch lediglich jene, die in Tabelle I angegeben sind, als stark metachromatisch heraus, wobei das differentielle spektrale Ansprechen sich bei wenigstens vier verschiedenen Leukozytenarten schnell entwickelt. Die in Tabelle II angegebenen Farbstoffe werden durch ihre Spektralkurven (Spektralkurve 8, 9 und 10) identifiziert. Obgleich diese drei Farbstoffe bei sämtlichen Leukozytenarten nur einen beschränkten metachromatischen Synergismus gezeigt haben, ist die festgestellte Spezifität dieser spezifischen Farbstoffe gegenüber Monozyten von einzigartiger Bedeutung.

Die Identifizierung und Aufzählung der Monozyten wird durch diesen Satz ungewöhnlicher Farbstoffe vereinfacht. Die übliche fluoridempfindliche" unspezifische Esterase-Reaktion,. die zytochemisch zur Monozytenidentifizierung benutzt wird, dauert oft eine Stunde und mehr, bis sie fertig ist, und

"3*10 9 752

erfordert ein genaues zytochemisches Arbeiten, damit sie zum Erfolg führt. Mit einem der vorstehend angegebenen Farbstoffe kann das Färben einer Speckhautsuspension oder von Gesamtblut sowie die Untersuchung auf einfache Weise durchgeführt werden, ohne chemische Einstellungen in der Größenordnung von Minuten. Das Anfärben der Monozyten durch das vorliegende Verfahren erfolgt sofort, und zwar bis zum Kern.

( 10 Bei Beginn des Einsatzes der Farbstoffe der Tabelle II werden die Monozyten sofort durch eine charakteristische Anfärbung des Kerns identifiziert. Soweit festgestellt werden konnte, ist bisher kein sofortiges Anfärbeverfahren bekannt, durch das der Kern der Monozyten spezifisch angefärbt wird.

Der Farbstoff der Spektralkurve 10, der hier Carbocyanin K-5 genannt wird, war der einzige basische Carbocyaninfarbstoff unter 18 Farbstoffen dieser Klasse, die vom Hersteller (Kodak) zu Untersuchungszwecken angeboten wurden, der sich als wirksam herausstellte, irgendeine der Leukozyten anzufärben. Die zunehmende Intensität der Kernanfärbung ^- während einer kurzen Kontaktzeit, läßt eine ungewöhnliche

Affinität des Carbocyanin K-5-Farbstoffs gegenüber Substan-

" zen des Kerns von Monozyten vermuten.

Die Identifizierung, Differenzierung und Aufzählung der Monozyten ist von großer diagnostischer Bedeutung. Eine Zunahme der Zahl der Monozyten im Blut kann die Gegenwart -*° von offener Tuberkulose, Septicämie oder einer Blutvergiftung oder eines Lymphomas, wie die Hodgkinsche Krankheit, bei der Diagnose anzeigen. Die erhöhte Anzahl von Monozyten im Blut von Personen, die von.einer hypoplastischen

oder aplastischen Anämie genesen, kann eine günstige Prognose für den Patienten anzeigen. Schnelle und genaue mikroskopische Analysen von Monozyten nach diesem Verfahren begünstigen einen weiten Anwendungsbereich einer wertvollen Technik.

Die Ermittlung, Identifizierung und Aufzähung der polymorphonuklearen Leukozyten (Neutrophile) stellt einen kritischen Parameter bei sämtlichen Blutuntersuchungen dar. Sie sind besonders wichtig bei der Diagnose akuter Infektionen, wie der Lungenentzündung oder der Bauchfellentzündung, wo die Anzahl der Neutrophilenerhöht ist. Sie sind wichtig, um Patienten zu überwachen, die einer Chemotherapie oder einer Bestrahlungstherapie unterworfen sind.

Eine verminderte Anzahl kann bei einer starken Infektion auftreten sowie eine Arzneimittelvergiftung, Hyperaktivität der Bauchspeicheldrüse und eine akute Leukämie anzeigen.

Wenn die absolute Neutrophilenzählung unter 1000 mm abfällt, erhöht sich das Infektionsrisiko beträchtlich. Die Farbstoffe dieser Erfindung färben im allgemeinen sofort die Körnchen oder Lyosome an, welche die charakteristische Identifizierungsstruktur der polymorphonuklearen Leukozyten oder Neutrophilen sind.
25

Eosinophile spielen bei allergischen Reaktionen eine Rolle, desgleichen die Basophile. Lymphozyten spielen bei Entzündungen eine Rolle, und in einem größeren Ausmaß bei Immunreaktionen und als Reaktion auf Antigene (Fremdkörper) . 30

Die Zählungen der Eosinophile werden dazu benutzt, die medizinische Verabreichung des adrenocorticotropen Hormons (ACTH) bei der Behandlung unter klinischen Bedingungen zu

verfolgen.

Die bisher eingeführten Methoden führten zu Verwechslungen von Artifakten und nicht definierbaren Formen, die Eosinophilen zum Verwechseln ähnlich sind. Die Genauigkeit der Blutzellenzählung nach dem Stand der Technik nimmt mit der Zeit zwischen der Präparation der Blutprobe und der Beendigung der Zählung ab. Vielfachfarbstoffe werden im wesentlichen benutzt. Ein Säure- oder Base-Anfärben ist häufig erforderlich. Die Farbstoffe neigen dazu, aus der Lösung beim Stehen auszukristallisieren.

Lymphozyten, die mit Borrel-Blau spezifisch identifizierbar sind, hängen bekanntlich mit Entzündungen und der Immunitat zusammen. Ihre Zahl erhöht sich im Blut von Personen mit chronischer lymphatischer Leukämie und bei Personen mit Pertusis (Keuchhusten). Die Zählrate kann bei Patienten herabgesetzt sein, die einer Chemotherapie oder Radiotherapie unterzogen werden, bei Patienten mit Lymphoma und bei verschiedenen Arten von vererbbaren immunologischen Störungen.

Basophile haben ein Zytoplasma, das große Körnchen enthält, die reich an kationischen Substanzen, wie Heparin, Serotonin und Histamin sind. Sie spielen beispielsweise bei allergischen Reaktionen eine Rolle.

Der Hauptvorteil der Erfindung ist darin zu sehen, herausgefunden zu haben, daß es sehr wenige einzigartige Farbstoffe gibt, die Leukozyten differentiell anfärben, sowie die Identität dieser wenigen Farbstoffe, und daß sie einzeln in reiner Form sowohl bei der manuellen wie der automatischen Identifizierung und Untersuchung jeder Art

von Leukozyten verwendbar sind. Es ist klar, daß potentielle Vorteile auffindbar sind, wenn Kombinationen dieser einzigartigen brauchbaren Farbstoffe für zytologische Zwecke verwendet werden. Tabelle III veranschaulicht das Ergebnis der Vewendung von Kombinationen der spezifischen Farbstoffe der Tabelle I und II. Die Verwendung von Carbocyanin K-5 und Basisch Orange 21 ermöglicht bei Bluttemperatur eine merklich bessere Identifizierung und spektrale Bestimmung zwischen Neutrophilen, Eosinophilen, /*~ 10 Basophilen und Monozyten, als bei Basisch Orange 21 allein.

Die Tabelle III gibt fünf Kombinationen von grundsätzlich brauchbaren und universellen Farbstoffen der Erfindung in Kombinationen wieder, insbesondere von Pflaumenecht und Borrel-Blau, welche Kombination zu einer synergetischen Aktivität führen dürfte, die die spektrale Bestimmung der einzelnen Farbstoffe der ersten Reihe der basischen quaternären kationischen metachromatischen Farbstoffe bei fünf Migliedern der angegebenen Leukozyten intensiviert. Die Mitglieder der Tabelle II erweisen sich ebenfalls als nützlich zu diesem Zweck, wie durch die Kombinationen der Tabelle III veranschaulicht.

Die acht Farbstoffe, die in Tabelle I angegeben und durch ihre Spektralkurven genau identifizierbar sind, sind ungewöhnlich stark metachromatisch. Sie färben nicht nur in klassischer Weise die Zellen mit einer anderen Spektralfarbe als ihrer eigenen Farbe an, vielmehr färben alle in Tabelle I angegebenen Farbstoffe jeweils eine der fünf Leukozytenarten an, und zwar in spektral unterscheidbaren unterschiedlichen Farben bei den ersten fünf Farbstoffen, wobei jede Art der fünf Leukozyten mit dem zweiten Satz

" von vier metachromatischen Farbstoffen der Tabelle I angefärbt wird. Aus einem nicht bekannten Grund bleiben

' "3Ί09Ζ52"

die Lymphozyten bei dem zweiten Satz von vier Farbstoffen unangefärbt. Die Lymphozyten können allein mit Borrel-Blau bei 25° C für eine spezifische Untersuchung angefärbt werden, was eine sehr interessante und nützliche Abweichung dieses spezifischen Farbstoffs darstellt.

Die Untersuchung der acht Farbstoffe in Tabelle I, deren chemische Identität bekannt ist und die eine ungewöhnliche Metachromasie zeigen, wenn sie bei fixiermittelfreien Blutproben verwendet werden, zeigt an, daß diese Farbstoffe gattungsmäßig als basische, metachromatisehe, kationische Farbstoffe klassifizierbar sind, die durch die Gegenwart eines quaternären Stickstoffatoms in ihrer Struktur charakterisiert werden, wobei ihr anionischer Teil ein farbloses Ion darstellt, zweckmäßigerweise ein Halogenion, und zwar am häufigsten das Chloridion.

Eine weitere Eigenschaft der wirksamen Farbstoffe der Tabelle I und der Tabelle II der Erfindung besteht darin, daß sie innerhalb eines Temperaturbereichs zwischen etwa 21 und etwa 4O° C wirksam sind. Innerhalb dieses Temperaturbereichs ist ihre Anfärbequalität hinsichtlich der spektralen Differenz, wenn Leukozytenarten angefärbt werden, aufgrund der Morphologie der Zellen keinen Änderungen unterworfen (anderen als denen der Farbe). Soweit bekannt, ist das Ausmaß des Synergismus zwischen jeder der Leukozytenarten und den Farbstoffen der Tabelle I der Erfindung in deren metachromatischem Ansprechen durch Kombination des Farbstoffs mit deren zellulären Bestandteilen außerordent-

30 lieh einzigartig.

BEISPIEL 1
(Greifswalder Blau - Spektralkurve 1)

Sechs Patienten mit typischer chronischer lymphozytischer Leukämie wurden 50 ml Proben peripheren venösen Blutes (heparinisiert) entnommen. Die Spender hatten Lymphadenopathie, Hepatomegalie,Splenomegalie, Knochenmark, das einen virtuellen Ersatz durch reif erscheinende Lympho-, zyten zeigte, sowie weiße Blutzellenzählraten zwischen 50.000 und lOO.OOO/mm³.

Zehn als normal angesehenenPersonen wurden Blutproben entnommen, desgleichen zwei Patienten mit viralen Syndromen, die eine weiße Blutzellenzählrate zwischen 11.000 und 15.000 mm und 7O bis 80% atypische Lymphozyten in ihrem peripheralen Blut aufwiesen. Diese Proben wurden zum Vergleich und zur Kontrolle verwendet.

In ein 10 χ 75 mm Reagenzglas, das fünf Tropfen Gesamtblut enthielt, wurde ein Tropfen einer frisch hergestellten gefilterten wässrigen Lösung von Greifswalder Blau (Chroma) mit pH 2,1 gegeben. Das Gemisch wurde vorsichtig bewegt und es wurde ein Tropfen der Mischung sofort als nasse Auftragung unter einem Lichtmikroskop untersucht, und danach in 60 see Abständen bis zu 15 min nach der Farbstoffzugabe zu der Blutprobe mit dem Antikoagulanz (heparinisiert) . (Ansonsten mit keinem anderen denaturierenden Zusatz fixiert).

Bei den normalen Blutproben färbt das Greifswalder Blau den Kern und das Zytoplasma der normalen Lymphozyten mit blaugrüner Farbe an. Die Neutrophile zeigten gelbe Körner, die Eosinophile grüne Körner, die Basophile blaue Körner

f * ψ Λ * Λ _ »»

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und die Monozyten einen purpurfarbenen Kern. Damit ermöglicht ein Farbstoff eine eindeutige Identifizierung sämtlicher normaler weißen Zellenklassen, und zwar jede mit einem unterscheidbaren identifizierbaren Spektralwert. 5

Es hat sich auch herausgestellt, daß die Farbstoff-Blutproben gegenüber einem Erwärmen auf eine Temperatur von 37 C (Bluttemperatur) stabil sind, ohne daß die charakteristische Differenzierung der in den Proben vorhandenen Leukozyten geändert wurde.

Bei einem Vergleich der normalen Blutproben mit jenen der Patienten mit chronischer lymphozytischer Leukämie zeigte es sich, daß der Kern und das Zytoplasma der leukämischen Lymphozyten tief rotbraun angefärbt war. Auf diese Weise können normale Lymphozyten von leukämischen Lymphozyten aufgrund der verschiedenen Anfärbung unterschieden werden.

Es wird angenommen, daß die Anwendungen dieser Technik der Zytoabsorption des vitalen Blutes mit sehr ausgewählten metachromat!sehen Farbstoffen, die entweder sämtliche der weißen Blutzellenleukozyten mit identifizierbaren unterschiedlichen Spektralfarben anfärben oder eine Klasse nicht anfärben, die Zytochemie der Blutanalyse verbessert. Die Aufzählung der verschiedenen Zellen sowohl manuell wie durch automatische Differentialleukozytenzählung und der Beitrag der Bestätigung von Krankheiten durch positive Identifikation wird erhöht.

Greifswalder Blau ist der einzigartigste Farbstoff, da er bei Temperaturen, die normalerweise in der Zytochemie von Interesse sind, also bei Umgebungstemperatur (25° C)

31 Ü9252"

•bis Bluttemperatur (37° C) , jede der fünf hier erörterten Leukozytenklassen anfärbt, und zwar charakterisiert durch eine verschiedene identifizierbare unterscheidbare Spektralfarbe. Dies ist als ungewöhnlich und einzigartig metachromatisch zu betrachten.

Greifswalder Blau wird ohne "Colour Index"-Nummer angegeben. Der Farbstoff ist von der Firma Chroma Gesellschaft Schmid & Company, Stuttgart, Untertürkheim, Deutschland, erhältlieh. Andere biologische Farbstoffe der Erfindung, die Chroma als Quelle angeben, können ebenfalls von dieser Firma erhalten werden.

Die dunnschichtchromatographische Analyse von Greifwalder Blau bestätigt, daß dieser Farbstoff ein Gemisch von vorwiegend drei basischen quaternären kationischen Farbstoffen ist. Angaben, die nicht vollständig sind, zeigen an, daß diese drei Farbstoffe wahrscheinlich Safranin "0" (CI 5O24O), Methylenblau (CI 52015) und Methylviolett (CI 42535) oder ähnliches sind.

Obgleich Greifwalder Blau nachweislich kein reiner Farbstoff ist, ist jeder der vorstehend genannten Bestandteile richtig als basischer quaternärer kationischer Farbstoff klassifiziert. Es ist deshalb richtig, den betreffenden Farbstoff in dieser Klasse zu definieren.

BEISPIEL 2 (Borrel-Blau - Spektralkurve 2)

Heparinisierte peripherale venöse Blutproben wurden während der Diagnose oder vor der Behandlung sechs Patienten entnommen, die akute lymphoplastische Leukämie hatten, desgleichen acht Patienten mit akuter myeloplastischer Leukämie, zehn Patienten mit akuter myelomonozytischer Leukämie und zehn anscheinendnormalen Probanden.

Bei den 24 bekannten Krankheitsfällen wurden routinemäßige zytochemische Untersuchungen durchgeführt. Im Falle der akuten lymphoplastisehen Leukämie zeigten immunologische Untersuchungen, daß ein Fall ein B-Zellentyp war, drei Fälle T-Zellentypen waren und zwei Fälle NUli-Zellentypen. Der B-Zellentyp-Fall erwies sich gegenüber der terminalen Deoxynukleotidyl-Transferase als positiv. Sämtliche akuten Leukämiefälle wurden als typisch sowohl in morphologischer wie in zytochemischer Hinsicht angesehen.

Ein leukozytenreiches Plasma wurde aus heparinisierten Proben durch Sedimentation der Erytrozyten bei 4C innerhalb sechzig (60) Minuten erhalten.

Zu fünf Tropfen des auf diese Weise von jeder Probe erhaltenen leukozytenreichen Plasmas in einem 10 χ 75 mm Reagenzglas wurde ein Tropfen einer frisch hergestellten gefilterten wässrigen Lösung von Borrel-Blau gegeben, worauf die Reagenzgläser leicht wenige Sekunden bewegt wurden.

In Intervallen zwischen 1 und 10 Minuten wurden bei einer Temperatur von etwa 21° C Proben des Gemischs aus Zellen und Farbstoff entnommen und mikroskopisch bei nasser Aufbringung untersucht. Wegen der mutmaßlichen Ähnlichkeit

von Methylenblau und Borrel-Blau wurde ein Versuch durchgeführt, bei dem eine l%ige wässrige Lösung von Methylenblau-Farbstoff zu separaten Proben von normalen und leukämischen Leukozyten gegeben wurde. Sämtliche Proben wurden ähnlich behandelt und untersucht. Zum Aufbringen des Mediums wurde Immersionsöl benutzt, da zuvor ein Verblassen mit "Permount" festgestellt worden war.

Unmittelbar nach der Farbstoffzugabe wurde die Adhäsion kleiner Farbstoffteilchen im mikroskopischen Feld entlang der Zellmembranen der normalen Lymphozyten und der leukämischen Lymphoplasten aller Patienten mit akuter lymphoplastischer Leukämie beobachtet. Bei allen normalen und anderen zytologischen Typen leukämischer Zerstörung trat die Adhäsion von Farbstoff an der Zellmembran nicht sichtbar auf.

Bei Glasplättchen, die die Adhäsion der Farbstoffteilchen zeigten, schien die Zellmembran mit kleinen Auswüchsen aufgerauht zu sein. In diesen Zellen trat eine hellblaue Kernanfärbung nach wenigen Minuten auf, die innerhalb von fünf Minuten dunkelblau wurde. Zu diesem Zeitpunkt sahen die normalen Lymphozyten und leukämischen Lymphoplasten zerstört aus, und zwar mit zerissenem Kern und Zytoplasma.

Die dunkelblaue Kernanfärbung, die bei den leukämischen Lymphoplasten festgestellt wurde, wurde bei den leukämischen Monozyten und leukämischen Myeloplasten nicht beobachtet. Die lymphoiden Zellen waren dunkelblaugrün. Nach lediglich IO Minuten wurde eine hellgelbe Kernanfärbung und eine hellgrüne Körnchenanfärbung bei den Neutrophilen, den Eosinophilen und Basophilen festgestellt. Bei Monozyten wurden blau angefärbte stäbchenförmige Strukturen (vermutlich Mytochondria) festgestellt.

Der Methylenblau-Vergleich ergab eine schwache aber feststellbare Kernanfärbung bei normalen Lymphozyten und leukämischen Lymphoplasten, jedoch von wesentlich geringerer definierbarer Spektralintensität als bei Borrel-Blau. 5

Bei einem separaten Versuch, der mit ähnlich sedimentierten normalen menschlichen Blutproben durchgeführt wurde, wurde bei einer Temperatur von etwa 37° C (Bluttemperatur) eine sehr interessante Abweichung beim Anfärben der Leukozyten festgestellt. Bei dieser Temperatur wurden alle Leukozyten angefärbt (so wie alle Leukozyten mit Greifswalder Blau nach dem Beispiel 1 bei etwa 22° C). Die Neutrophilen zeigten hier blaue Körner, die Eosinophilen purpurfarbene Körner, die Basophilen rote Körner, die Lymphozyten blaugrünes Zytoplasma nebst Kern und die Monozyten ein purpurfarbenes Zytoplasma mit rot bis rosanen Körnern.

Bei Borrel-Blau besitzen also bei niedriger Raumtemperatur (unterhalb etwa 25° C) nur die Lymphozyten eine starke spektrale Farbstoffabsorption, während bei Bluttemperatur (37° C) alle Lymphozyten differentiell durch eine einzige charakteristische Spektralfarbenabsorption identifizierbar sind.

Die Temperaturempfindlichkeit dieses ungewöhnlichen basischen quaternären kationischen metachromatisehen Farbstoffs ermöglicht eine eindeutige Differenzierung der Lymphozyten, wobei er den Kern der Lymphozyten bei etwa 21 bis 25 C blaugrün anfärbt.

Alle andere Leukozyten werden nicht angefärbt und jene mikroskopischen zytologischen Studien, die vollzogen werden sollen, können bei der tieferen Temperatur durchgeführt werden. Bei der Temperatur des normalen warmen Blutes

(37 C) unterscheiden sich jedoch alle übrigen Leukozyten durch den Einsatz dieses einzigen metachromat!sehen Farbstoffs, nämlich Neutrophile, Eosinophile, Basophile und Monozyten.
5

Gemische von Borrel-Blau mit Basisch Violett 16, die bei 37 - 40° C (Tabelle III) untersucht worden sind, ergaben nur eine geringe Änderung, außer daß sämtliche Farben etwas lebhafter und kräftiger erschienen, was die Monozyten anbelangt, die außerdem einen rosa Kern zeigten.

Es ist wahrscheinlich, daß die Computerzählung bei der geräteoptischen Differenzierung mit Farbstoffgemischen genauer gemacht werden kann, insbesondere was die Monozyten-Untersuchungen angeht. Beispielsweise zeigte Borrel-Blau zusammen mit Basisch Violett 16 (Tabelle III), wenn es bei warmem Blut (37° C) angewendet wurde, daß alle Farben der angefärbten Leukozyten etwas dunkler und schärfer waren, als wenn Borrel-Blau-Farbstoff allein bei dieser

20 Temperatur benutzt wurde.

Die genaue Struktur von Borrel-Blau konnte durch umfangreiche Untersuchungen nicht ermittelt werden. Jedoch wurden Anleitungen zu seiner Herstellung in "Microtomists Formulary and Guide", herausgegeben von Blaikston & Company, New York (1956) gefunden, worin einer, nämlich Peter Gray, die Herstellung beschreibt, und zwar indem zuerst eine alkalische Lösung von Silbernitrat hergestellt wird, indem eine 3%ige wässrige Lösung von Natriumhydroxid zu loo ml einer 1/2% Silbernitratlösung gegeben wird, bis kein weiterer Niederschlag mehr auftritt. Der Niederschlag wird gewaschen und durch Dekantieren gereinigt. Zu dem Niederschlag wird eine l%ige wässrige Lösung von Methylenblau gegeben. Nach fünfminütigem Kochen, Kühlen und Filtrieren wird Borrel-Blau erhalten.

Damit ist klar, daß der erzeugte Farbstoff ein basischer quaternärer, kationischer metachromatischer Farbstoff ist, bei dem wahrscheinlich das ursprüngliche Halogenanion durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist, oder mit einer Silbergruppe komplexiert ist.

Der Farbstoff wird als Borrel-Blau, Michrome Nr. 376 in dem letzten (Ed. Gurr) E. Merck Katalog angegeben.

BEISPIEL 3 (Rhodanil-Blau - Spektralkurve 3)

Mehrere Proben von peripheralem venösen Blut wurden sowohl von normalen wie leukämischen Probanden erhalten. Lederhautleukozyten wurden daraus entweder durch Zentrifugieren von heparinisierten 5O ml Aliquots und Entfernung der Lederhautschicht durch Resuspension in autologem Plasma erhalten, oder durch Sedimentation des Gesamtblutes, das 5 ml 6%iges Dextran in physiologischer Kochsalzlösung enthielt, wonach die Leukozyten von der Plasmaschicht abgetrennt wurden. Bei einer entsprechenden Serie wurde Gesamtblut verwendet.

Zu den Probanden gehörten Patienten mit akuter monozytischer Leukämie, akuter myeloplastischer Leukämie, akuter lymphoplastischer Leukämie, chronischer granulozytischer Leukämie, chronischer lymphozytischer Leukämie und Plasmazellenleukämie sowie Patienten mit I

30 mit Septicämie zusammenhängt.

leukämie sowie Patienten mit Monozytosis(500/mm ), die

Zu Proben normalen und leukämischen Blutes, die 6 χ 1,0 ml Leukozyten pro ml aufwiesen, wurden zwei Tropfen einer

frisch hergestellten gefilterten l%igen wässrigen Lösung von Rhodanil-Blau (Gurr - vgl. Spektralkurve 3) bei pH 3,1 in einem 10 χ 75 nun Reagenzglas gegeben. Die das Gemisch enthaltenden Reagenzgläser wurden einige Sekunden bewegt und dann fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. In Abständen von einer Minute nach der Zugabe wurde ein Tropfen des Gemischs durch feuchte Aufbringung unter einem sauberen Glasdeckstreifen untersucht, wobei die herkömmliche Lichtmikroskopie angewandt wurde.

Bei Proben von normalem Blut und von Blut von Patienten mit Septizämie und Monozytis, enthielten die Neutrophilen zahlreiche magenta·angefärbte Körnchen, die der Größe, der Anordnung und der Zahl nach den Körnern entsprachen, die bei den konventionellen panoptischen Anfärbungen sichtbar werden. Das Zytoplasma der Neutrophilen wurde rot angefärbt. Die Lymphozyten und Monozyten enthielten lediglich einige kleine blaue Körner sowie staubähnliche Strukturen. Die Eosinophilen enthielten dunkelviolette oder purpurfarbene Körner, und die Basophilen enthielten rote Körner. Die Kerne der Lymphozyten wurden intensiv blaugrün angefärbt. Es wurde eine blaßlila zytoplasmische Anfärbung der Monozyten beobachtet. Die Kerne sämtlicher peripheraler Blutleukozyten wurden blaßgrün angefärbt.

In den Proben des Blutes von Patienten mit akuter myeloplastischer Leukämie und akuter lymphoplastischer Leukämie konnten wenige kleine blaue Körnerstrukturen in dem leukämisch zerstörten Zytoplasma beobachtet werden. Sie scheinen bei leukämischen Myeloplasten häufiger zu sein.

Ein Anfärben des Zytoplasma unter den Versuchsbedingungen konnte nicht festgestellt werden,

Bei den leukämischen Monozyten von Patienten mit akuter

monozytischer Leukämie wurden blaue punktförmige Strukturen im Zytoplasma der meisten Blast-Zellen festgestellt. Innerhalb einer Minute nach der Zugabe des Farbstoffs zeigten die Blast-Zellen sämtlicher Patienten mit akuter monozytischer Leukämie eine einzigartige tief rosarote Anfärbung des Zytoplasmas. In einigen Fällen nahm diese Anfärbung eine laminare gestreifte Konfiguration an. In anderen Fällen war die Anfärbung dunkel und diffus. Die Kerne dieser und anderer Arten leukämischer Blast-Zellen zeigten eine schwach violette Anfärbung.

Beim Blut von Patienten mit chronischer granulozytischer Leukämie, chronischer lymphοzytiseher Leukämie sowie Plasmazellenleukämie, zeigten die Monozyten keine rosarote zytoplasmatische Anfärbung. Desgleichen zeigten leukämische Lymphozyten und neoplastische Plasmazellen keine unterscheidbare zytoplasmatische Anfäbung mit Rhodanil-Blau.

Rhodanil-Blau ist ein obskurer Farbstoff, der durch Kondensation von Rhodamin B mit Nilblau gebildet wird (vgl. Spektralkurve 3). Bis heute ist die Verwendung dieses Farbstoffs in der Zytochemie begrenzt. Untersuchungen haben eine einzigartige rosarote metachromatische Anfärbung des zytoplasmas von leukämischen Monozyten durch Rhodanil-Blau gezeigt, einem Farbstoff, der normalerweise eine blaue Farbe aufweist. Diese Spektralfarbe wurde bei normalen Monozyten nicht beobachtet. Die Anfärbung von monozytischen Zellen mit Rhodanil-Blau dürfte sich als nützlich erweisen, um normale Monozyten,die eine schwach purpurfarbene oder lila metachromatische Anfärbung zeigen, von leukämischen Monozyten, die eine intensive positive rosarote metachromatische Reaktion zeigen, zu unterscheiden. Wenn ein konventioneller Farbstoff für metachromatische Substanzen ver-

'· - "TTU 9 2 52

wendet wurde, konnten diese Materialien bei Untersuchungen nicht gezeigt werden, wenn sie bei fixierten Zellen verwendet wurden. Blaue punktförmig erscheinende Strukturen in dem Zytoplasma von leukamischen Blast-Zellen, die mit Rhodanil-Blau vital angefärbt sind, können als Lyosome und/oder Mitochondria interpretiert werden. Die Substanz oder die Substanzen in dem Zytoplasma, die mit Rhodanil-Blau bei lebenden Zellen im Zytoplasma für die beobachtete rote Metachromasie verantwortlich sind, konnten nicht identifiziert werden. Die rote Metachromasie mit Rhodanil-Blau vervollständigt den bereits bestehenden Test für monozytischen Eigenschaften, wobei Fluorid verwendet wird, das gegenüber Esterase unspezifisch ist. Obgleich er als Markierung der Zellen von monozytischem Ursprung wertvoll ist, ist dieser zytochemische Test in seiner Spezifität beschränkt, da viele Arten von Zellen eine unspezifische Esteraseaktivität zeigen. Die Empfindlichkeit des Fluorids dürfte auf eine Erhöhung der Spezifität der nicht-spezifischen Esterase vom monozytischen Typ zurückzuführen sein.

Es wird gegenwärtig berichtet, daß der zytochemische Test für nicht-spezifische Esterase häufig schwierig durchzuführen ist, da er abhängt von einer genauen pH-Einstellung sowie von frischen Substraten und komplexen Wechselwirkungen zwischen Farbstoff und Kupplern.

Verglichen mit der nicht-spezifischen Esterasereaktion bei normalen und leukamischen Monozyten besitzt die metachromatische Reaktion mit Rhodanil-Blau einige Vorteile. Sie ist vorteilhaft bei der Identifizierung von leukämischen Blast-Zellen. Die Selektivität hinsichtlich leukämischer Monozyten läßt das Vorhandensein einer einzigartigen und bisher nicht identifizierten Anomalie dieser Zellen vermuten, verglichen mit normalen Monozyten. Der

Farbstoff ist auch dadurch vorteilhaft, daß er bei lebenden akut leukämischen Zellen angewandt werden kann, die nicht den verschiedenen Arten der Fixierung unterworfen worden sind, wie es bei den konventionellen zytochemischen Verfahren der Fall ist. Es ist darauf hinzuweisen, daß dieses supravitale Anfärbeverfahren die Probleme herabsetzt, die durch das Anfärben und Fixieren der Artefakte auftreten, was bei Proben erfolgen kann, die in üblicher Art und Weise behandelt werden.

Der Rhodanil-Blau-Test verläuft schnell (in weniger als einer Minute zwischen Anfang und Ende) verglichen mit einer Stunde oder mehr bei der üblichen zytochemischen Anfärbung für nicht-spezifische Esterase. Darüber hinaus erfordert die rosarote Metachromasie mit Rhodanil-Blau nicht den Einsatz eines Inhibitors, wie Natriumfluorid, da bisher kein anderer Typ von leukämischen Blutzellen die rosarote metachromatische Reaktion zeigt. Die Erfahrung hat gezeigt, daß insbesondere bei anderen Arten von Leukämie einschließlich der Haarzellenleukämie und der leukämischen Phase der histiozytischen Lymphomie, die rosarote metachromatische Reaktion, die mit Rhodanil-Blau erzeugt wird, verspricht, ein wichtiger Beitrag zur Zytochemie von akuten leukämischen Zellen zu werden.

In der Tabelle I ist die normale Leukozytenanfärbung mit Rhodanil-Blau wiedergegeben. Rhodanil-Blau hat die nachstehend angegebene Struktur:

N(C₁HA !

: mol. WL 780.402

Die exakte zytotopische Diagnose ist von Bedeutung, da heuzutage eine spezifische Behandlung für jeden zytotopischen Typ von akuter Leukämie vorhanden ist. Borrel-Blau, Rhodanil-Blau und Carbocyanin K-5 haben sich alle als erfolgreich bei den hier beschriebenen Untersuchungen erwiesen, um eine Art von akuter leukämischer Zelle von einer anderen zu unterscheiden.

BEISPIEL 4
(Nachtblau - Spektralkurve 3)

Lederhautleukozyten (5 χ 16 ml Endkonzentration) wurden aus 60 ml heparinisiertem venösen Blut von jedem von zehn normalen Probanden hergestellt. Diese wurden sowohl durch Zentrifugieren von 50 ml heparinisiertem peripheralem Blut und Entfernung der Lederhautschicht sowie durch

r~ Resuspension in autologem Plasma oder durch Sedimentation

erhalten. In getrennten Untersuchungen wurde auch Gesamtblut eingesetzt.

Ein Tropfen einer l%igen filtrierten wässrigen Lösung von Nachtblau (Chroma), die frisch hergestellt worden war,' wurde 5 Tropfen der vorstehend angegebenen Blutprobe einverleibt. Die Leukozyten- und Farbstoffgemische wurden leicht bewegt und ein Tropfen des Gemisches wurde sofort durch feuchte Aufbringung unter einem Lichtmikroskop untersucht, ferner in 60 Sekundenabständen bis zu 15 Minuten nach der Zugabe des Farbstoffs zu der Blutprobe. Wenn die konventionelle zytochemische Technik für Myeloperoxidase (9), spezifische Esterase (11), unspezifische Esterase mit Fluorid (2, 11) und PAS (9) verwendet wurde:., zeigten die peripheralen Blutleukozyten typische Reaktionen.

25

Um die lyosomalen Anfärbeeigenschaften des Farbstoffs sicherzustellen, wurden Lyosome (Körner) aus den granulolytischen Zellen (polymorphonukleare Leukozyten, Eosinophile, Basophile) aus 100 ml peripheralem venösen Blut abgetrennt, das von jedem der fünf anscheinend normalen Probanden erhalten wurde, und zwar nach etablierten Methoden,

30 Sekunden nach der Zugabe von Nachtblau zu einer her-

gestellten Leukozytensuspension der vorstehend angegebenen Blutproben oder zu dem Gesamtblut waren die Körner der polymorphonuklearen Leukozyten gelbbraun gefärbt. Innerhalb einer Minute waren die Körner dunkelgrün gefärbt. Die Kerne der polymorphonuklearen Leukozyten waren blaßgrün gefärbt. Nach einer Minute waren die Kerne der Lymphozyten nicht angefärbt (oder schwach lavendelfarbig). Einige der Lymphozyten enthielten grün aussehende stabförmige Strukturen, die ihrer Größe und ihrer Form nach Mytochondrien entsprachen, wie sie mit Janusgrün B sichtbar werden. Das Zytoplasma der Lymphozyten war nicht angefärbt .

Nach einer Minute sahen die Kerne der Monozyten blaß lavendelfarbig aus, und nach zwei Minuten sahen die Kerne der Monozyten tief purpurfarben aus. Das Zytoplasma der Monozyten sah intensiv grün aus und enthielt blaue körnig aussehende Strukturen sowie grüne faserförmig aussehende Strukturen. Bei voll entwickelter Färbung konnten die Monozyten leicht von anderen peripheralen Blutleukozyten unterschieden werden. Innerhalb einer Minute nach der Zugabe des Farbstoffs zu den Zellpräparationen färbten sich die Körner der Eosinophile blau und die Körner der Basophile metachromatisch purpurfarben. Die Kerne dieser Zellen sahen praktisch ungefärbt aus (sehr schwach lavendelfarben).

Aufgrund der Beschränkungen, die den panoptisch angefärbten Proben eigen ist, wurden in den zurückliegenden Dekaden zytochemische Verfahren entwickelt, um einen Blutzellentyp von einem anderen genauer zu unterscheiden. Im allgemeinen sind diese Versuche darauf ausgelegt, die Zunahme eines Typs einer Substanz in einer bestimmten Zelle festzustellen, verglichen mit einer anderen oder eine Substanz oder Sub-

stanzen innerhalb einer charakteristischen zellulären Organelle in einer Zelle gegenüber einer anderen festzustellen. Beispielsweise ist die Aktivität der unspezifischen Esterase in Monozyten ungewöhnlich hoch, und diese Aktivität scheint besonders empfindlich gegenüber der Inhibierung durch Natriumfluorid zu sein. Desgleichen hängt die Identifizierung von granulolytischen Zellen im wesentlichen von der Demonstration der Eigenschaften der Lyosome ab. Aus diesen Gründen haben sich die Bestimmung der Myeloperoxidase- und der spezifischen Esteraseaktivitäten als zytochemische Verfahren als nützlich erwiesen. Die lyosomalen Körner der Eosinophile enthalten Myeloperoxidase, die gegenüber der Inhibierung durch Natriumcyanid resistent ist, und die Körner der Basophilen werden metachromatisch durch eine Vielzahl von Farbstoffen angefärbt, und zwar zum Teil wegen ihres hohen Gehaltes an kationischen Substanzen, wie Heparin. Bis jetzt ist jedoch noch kein allgemein akzeptiertes zytochemisches Verfahren für lymphoide Zellen beschrieben worden.

Bei den hier zur Diskussion stehenden Untersuchungen ist die schnelle supravitale Anfärbung der peripheralen Blutleukozyten durch Nachtblau zu nennen. Nachtblau ist ein obskurer basischer Farbstoff (vgl. die Struktur, die dem Beispiel folgt). Es wird bei biologischen Anfärbungen selten verwendet. Die Vitalänfärbung von normalen menschlichen granulozytischen Zellen mit Nachtblau zeigt schnell, daß diese Zellen voneinander anfgrund der Anfärbeeigenschaften und der Größe der Lyosome unterschieden werden können, desgleichen von anderen Blutzellen, die nicht diese Art von Lyosome enthalten. Weiterhin erleichtert das praktische Nichtvorhandensein einer Anfärbung der Lymphozyten mit dem Farbstoff die Identifizierung der Lymphozyten.

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Monozyten zeigen eine besonders intensive Kernanfärbungsreaktion, desgleichen eine zytoplasmatische Anfärbung. Obgleich der Farbstoff selbst in Lösung blau ist und einen einzigen Absorptionspeak bei 616 nm (vgl. Spektralkurve 4) aufweist, werden die Kerne der Monozyten tief purpurfarben angefärbt und das Zytoplasma der Monozyten wird blaugün bis tief grün angefärbt. Das Zytoplasma der Monozyten enthält grüne gefärbte faserförmige Strukturen, die auf einfache Weise mit der Vitalanfärbungstechnik identifizierbar sind. Diese Strukturen dürften den ähnlichen laminar fadenförmigen Strukturen, die bei ultrastrukturellen Untersuchungen der menschlichen Monozyten beobachtet werden, analog sein. Da sie bei keinem andern Typ von normalen menschlichen Leukozyten gefunden worden sind, können die grünen faserförmigen Strukturen auch dazu benutzt werden, um Monozyten von anderen Arten von Leukozyten zu unterscheiden.

Verglichen mit den konventionellen zytochemischen Anfärbungen zur Identifizierung von Monozyten, Neutrophilen, Leukozyten, Eosinophilen und Basophilen weist die Vitalanfärbung der peripheralen Blutleukozyten mit Nachtblau einige Vorteile auf. Sie ist vorteilhaft, weil sie schnell ist und weniger als zwei Minuten bis zur maximalen Farbentwicklung benötigt. Sie ist auch vorteilhaft, weil sie den Einsatz synthetischer Substrate und von komplexen Azofarbstoffen und Kupplern, die bei den konventionellen zytochemischen Verfahren verwendet werden, vermeidet. Die zytochemischen Verfahren des Standes der Technik sind schwer zu interpretieren, weil eine nicht-spezifische Ausfällung von Farbreagenzien, eine Verschlechterung der Substrate erfolgt und eine verwickelte Anpassung des pH und des Gehalts metallischer Ionen erforderlich ist.

Die vorstehende supravitale Anfärbungstechnik unter Verwendung lebender Blutzellen und deren Differentialaffinität für die supravitale Anfärbung dieser Zellen mit Nachtblau vermeidet Artefakte, die bei konventionellen Fixiermitteln häufig auftreten. Es ist darauf hinzuweisen, daß die Vitalanfärbungstechnik, die hier geschildert wird, eine genauere Beobachtung der zellulären Lokalisation des Farbstoffs (z. B. Lyosome, fibrilläre Strukturen, nukleares Chromatin) ermöglicht, als es bisher bei herkömmlichen Farbstoffen der Fall war. Mitzunehmender Erfahrung und Verbesserungen in der automatisierten Technologie der DifferentialblutZeilenzählung dürfte die supravitale Anfärbung der peripheralen Blutleukozyten mit Nachtblau ein wichtiger Beitrag zur Zytochemie von Blut und von Knochenmarkzellen darstellen.

Nachtblau hat die folgende chemische Formel:

IQ"]

C»H₄₁N,Cl

Molekulargewicht 576 Gewicht des Kations 541

BEISPIEL 5
(Pflaumenecht - Spektralkurve 5)

Ein Tropfen einer l%igen wässrigen Lösung von Pflaumenecht-Farbstoff (das auch als Galloblau E bekannt ist) (Spektralkurve 5), die vor ihrer Verwendung frisch hergestellt worden ist, wurde zu fünf Tropfen einer Lederhautleukozytensuspension (5 χ IO ml/Endkonzentration) gegeben, die aus 60 ml heparinisiertem venösem Blut von jedem von zehn normalen Probanden hergestellt worden ist. In einer getrennten Versuchsserie wurde venöses Gesamtblut anstelle von Lederhaut verwendet. Die Temperatur der Blutprobe und des Farbstoffs wurde auf etwa 37° C (Körpertemperatur) gehalten, wobei vorhergegangene Versuche gezeigt haben, daß der Farbstoff zwischen etwa 21° und etwa 40 C wirksam ist.

Nach etwa zwei Minuten war das Nukleoplasma der Monozyten intensiv purpurfarben angefärbt, insbesondere die Bereiche des Heterochromatins. Das Zytoplasma der Monozyten sah purpurfarben aus. Die Kerne der Lymphozyten waren sehr schwach lavendelfarben angefärbt (wenn überhaupt). Die polymorphonuklearen Leukozyten zeigten braune Körner, die Eosinophilen grüne Körner und die Basophilen wurden durch purpurfarbene Körner identifiziert. Die Erytrozyten und die Plättchen zeigten keine sichtbare Anfärbung.

Es wurde eine unerwartete neue Anwendung für einen obskuren Farbstoff gefunden, der bisher hauptsächlich in der Textilfärberei verwendet wurde. Die Anfärbung der Kerne und des Zytoplasmas erfolgte rasch und erlaubte eine einfache Unterscheidung zwischen vier Klassen von Leukozyten, die den Farbstoff annahmen, sowie eines restlichen Mitglieds

der Gruppe der weißen Zellen, der Lymphozyten, die sich einer metachromatischen Anfärbung dieses basischen quaternären kationischen Farbstoffs widersetzten, der folgende Strukturformel aufweist:

Pflaumenecht

_N COOCH, ° OH

Molekulargewicht 350, 761

BEISPIEL 6
(Hofmanns Violett - Spektralkureve 6)

Es wurde eine Serie von 60 ml heparinisierten venösen Blutproben eines jeden von zehn normalen Probanden benutzt, um einen Satz von IO χ 75 mm Reagenzgläser mit Proben, die Lederhautleukozyten enthielten,zu präparieren, sowie einen Satz, der Gesamtblut (fünf Tropfen) enthielt.

Es wurde eine Lösung, die 1% Hofmanns Violett-enthielt, einen basischen metachromatischen quaternären kationischen Farbstoff mit der "Colour Index"-Nummer CI4253O, hergestellt. Es ist davon auszugehen, daß die nachstehende Strukturformel Hofmanns Violett wiedergibt. Die angegebene Spektralkurve stellt jedoch einen "Fingerabdruck" des Farbstoffs dar und diese soll im Zweifel gelten, wenn hier dieser Name benutzt wird.

Es ist davon auszugehen, daß Hofmanns Violett die nachstehende Strukturformel besitzt. Die Bedeutung der Zahl und die Auswirkung der Alkyl-(Methyl- und Äthyl-)Substituenten wurde bisher nicht untersucht.

ία"]

CH₃

Molekulargewicht 576; Gewicht des Kations

Es wurde ein Tropfen einer l%igen wässrigen frisch hergestellten Lösung des basischen metachromatischen kationischen Farbstoffs, der durch die Spektralkurve 6 wiedergegeben wird, in jedes der Reagenzgläser bei der Temperatur des normalen Blutes (37° C) gegeben. Es wurden Tropfen der Proben als nasse Aufbringung unter dem Lichtmikroskop in Abständen von einer Minute bis zu 15 Minuten nach der Zugabe des Farbstoffs zu der Blutprobe untersucht.

Die Monozyten zeigten eine intensive purpurfarbene Anfärbung des Kerns und des Zytoplasmas, wobei die Körner rot angefärbt waren. Nach zwei Minuten waren sämtliche peripheralen Blutleukozyten mit Ausnahme der Lymphozyten spektral differenziert. Die Neutrophilen zeigten grüne Körner, die Eosinophilen purpurfarbene Körner und die Basophilen rote Körner, während die Lymphozyten praktisch nicht angefärbt wurden und die Monozyten durch einen purpurfarbenen Kern und rote Körner gekennzeichnet waren. Die Metachromasie des Farbstoffs trat deutlich hervor. Der Einsatz der vorstehend angegebenen supravitalen Anfärbung verringerte einige der Probleme, die bei der Fixierung auftreten, sowie durch den Einsatz synthetischer Substrate wie durch verwickelte Zwischenreaktionen zwischen den Produkten der enzymatischen Katalyse und nicht stabilen Azofarbstoffen. Durch die Verwendung der normalen Lichtmikroskopie , die durch die metachromatischen Eigenschaften dieses spezifischen Farbstoffs möglich'ist, neben den anderen Farbstoffen, die, wie hier ausgeführt, eine ausserordentliche Metachromasie bei der Differenzierung der vorstehend erwähnten Leukozyten zeigen, dürfte der Einsatz automatischer Differentialleukozytenzähleinrichtungen leichter möglich sein.

BEISPIEL 7
(Basisch Orange 21 - Spektralkurve 7)

Es wurde eine Serie von Methin- und Polymethinfarbstoffen, die chemisch spezifisch identifiziert wurde, in einer Konzentration von 1% in einem wässrigen Medium hergestellt. Von dieser großen Gruppe erwies sich nur ein einziger unter den basisch quaternären kationischen Farbstoffen als metachromatisch. Dieser einzige metachromatische Farbstoff färbte die Körner der Eosinophilen (braun), Basophile (rot) und Monozyten (zytoplasmische Körner orange), so daß sich spektraldifferenzierte Mitglieder der Leukozytengruppe ergaben. Sehr bemerkenswert ist, daß festgestellt wurde, daß die Differentxalanfärbung sowohl der reifen wie der nicht reifen Neutrophile spezifischer war als bei irgendeinem anderen Farbstoff, der die metachromatische Eigenschaft des differentiellen Anfärbens einer Vielzahl von Leukozyten besitzt. Es. stellte sich heraus, daß die reifen Neutrophilen durch dunkelgelbe Körner spektral identifizierbar waren, während die unreifen Körner durch ihre orangefarbene Spektralreflexion identifiziarbarwaren. Lediglich die Lymphozyten zeigten keine Absorption des Farbstoffs, d. h. sie wurden nicht in Form eines identifizierbaren Spektrums angefärbt. In Kombination mit Borrel-Blau waren jedoch sämtliehe fünf spezifischen Leukozyten spektralidentifizierbar (vgl. Tabelle III).

Der Polymethinfarbstoff stellt einen basischen quaternären kationischen metachromatischen Farbstoff dar, der die Spektralkurve 7 aufweist. Der Farbstoff wurde spezifisch als Basisch Orange 21 identifiziert (ebenso als Albright-Orange und Astrazon-Orange G (200) bekannt). Die chemische Struktur ist nachstehend wiedergegeben, wobei er weiterhin

als CI 48035 identifiziert wird.

Wie in Tabelle III angegeben, hat sich herausgestellt, daß Kombinationen von Carbocyanin K-5 und Basisch Orange 21 eine verbesserte Spektraldifferenzierung bei der Unterscheidung und der Identifizierung zur Aufzählung der Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen und Monozyten einer einzigen Blutprobe aufweisen. Die Monozytenbestimmung erfolgt erheblich genauer als bei Verwendung eines anderen Farbstoffs allein, was einen synergetischen Effekt andeutet .

Basisch Orange 21
CI 48035

CH,

BEISPIEL 8

Basisch Rot 13 - Spektralkurve 8 - CI 48015 Basisch Violett 16 - Spektralkurve 9 - CI 48013

Es wurden 22 im Handel erhältliche Farbstoffe überprüft. Von diesen erwies sich lediglich einer als herausragend metachromatisch. Dies ist Basisch Orange 21 (Spektralkurve 7) des Beispiels 7. Zwei weitere dieser Serie erwiesen sich als sehr ungewöhnlich, da sie, wie Carbocyanin K-5 _w ίο des Beispiels 10 (Spektralkurve 10), lediglich Monozyten spezifisch anfärbten, und zwar sofort.

Diese beiden letzteren Farbstoffe sind, wie sämtliche für diese Erfindung geeignete Farbstoffe, deren Struktur bekannt ist, basische quaternäre, kationische organische Farbstoffe, die in der Lage sind, Leukozyten anzufärben, wobei diese Einzelgruppe nur Monozyten spezifisch anfärbt. Die zuletzt genannten beiden Farbstoffe sind vorstehend identifiziert.

Zehn mutmaßlich normale Personen spendeten venöse Blutproben, jede Probe wurde in Heparin gezogen, als Gesamtblut verwendet und als Lederhautsuspension ohne Fixierung präpariert. Es wurden wässrige Lösungen mit einer Konzentration von etwa 1 X aus jedem der vorstehend angegebenen reinen Farbstoffe frisch in destilliertem Wasser hergestellt und filtriert. Fünf Tropfen des Gesamtblutes oder der leukozytenreichen Suspension in zwei aufeinanderfolgenden Serien von Blutproben jedes der zehn Patienten wurde mit einem Tropfen der Basisch Rot 13-Farbstofflösung versetzt, wobei in der zweiten Serie die Basisch Violett 16-Farbstofflösung gewählt wurde. Bei Versuchen in der ersten und der zweiten Serie (mit beiden vorstehend angegebenen

Farbstoffen) wurden lediglich die Monozyten sofort angefärbt. Im Falle von Basisch Rot wurde sowohl der Kern wie das Zytoplasma rot angefärbt. Bei der Basisch Violett 16-Serie war der Kern rosafarbener und das Zytoplasma wurde ebenfalls allgemein hinsichtlich der Farbe so klassifiziert. Obgleich die Farben spektral unterschiedlich aussahen, war kein Gerät in der Lage, genaue Tristimulus-Werte zu liefern. Obgleich die Anfärbung der Monozyten wiederum einzigartig war, wie mit Carbocyanin K-5 des Beispiels 10, gab jeder der drei Farbstoffe bei der Anfärbung ein ausreichendes Farbdifferential, so daß mit dem Auge festgestellt werden konnte, daß Unterschiede bestanden (Tabelle II).

Diese drei Farbstoffe wurden gleichfalls in Kombinationen mit den Hauptfarbstoffen der Tabelle I verwendet, wie in Tabelle III angegeben.

Es wurde beobachtet, daß, obgleich ein einziger reiner Farbstoff (wie in Tabelle I) ein ausreichend unterschiedliches Spektralansprechen zeigt, um jede der Leukozytenarten eindeutig identifizieren zu können, einige Kombinationen, insbesondere mit diesen drei Farbstoffen, nämlich Carbocyanin K-5, Basisch Rot 13 und Basisch Violett 16, zu einem beobachteten Synergismus bezüglich der Farbintensität in der Lage waren.

Basisch Rot 13 hat die nachstehende chemische Struktur:

Basisch Rot 13 CI 48O15

CH2CH2CI C₂H₅

Cl

Basisch Violett 16 hat die nachstehende chemische Struktur:

Basisch Violett 16 CI 48013

_5iJ__c_==c_

-C₂H₅

C₂H₅

Cl

Aus der US-PS 2 179 895 gehen Farbstoffe hervor,""die der Methinserie zugerechnet werden, einschließlich Basisch Rot 13. Dies ist auch als Genacyl Pink G, Astrazon Rose FG, Astrazon Pink FG, Basisch Rosa 2S, kationisches Rosa usw. bekannt.

Andere Namen für Basisch Violett 16 sind: Astrazon Red Violet 3R, Astraviolet 3R, Sevron brillant red 2-B, usw.

BEISPIEL 9 Toluylen-Blau - Spektralkurve 11

Aus Toluylen-Blau, das durch Kondensation von m-Toluylendiamin mit p-Nitroso-dimethylanilin-hydrochlorid hergestellt worden war, wurde eine l%ige wässrige Lösung hergestellt, die, wie bei den vorstehenden Beispielen, filtriert wurde. Das venöse Blut jedes von zehn normalen Probanden wurde in zwei Serien von Blutproben untersucht, wie in den vorstehenden Beispielen. Aus einer Serie wurde eine Lederhautleukozytensuspension hergestellt. Die zweite Serie wurde als venöses Gesamtblut gehandhabt. Die Proben wurden in einer Wärmebox bei etwa 37° C aufbewahrt.

In der Reihenfolge ihrer Untersuchung wurde jeder der Proben ein Tropfen der Farbstofflösung zugesetzt. In jedem der vorstehend angegebenen Fälle wurde die den Farbstoff enthaltende Probe lichtmikroskopisch untersucht, was das allgemeine Verfahren bei der manuellen Untersuchung von Leukozyten darstellt. In allen Fällen entwickelten innerhalb von fünf Minuten nach dem Zusatz des wässrigen Farbstoffs und ohne Verwendung irgendwelcher Fixiermittel, wie Methylalkohol, Formalin usw., bei der Darstellung der Blutproben die Neutrophilen blaue Kerne und gelbe Körner, während sich die Eosinophilen durch purpurfarbene Körner unterschieden, die Basophilen rote Körner entwickelten, die Lymphozyten grüne Körner zeigten und die Monozyten einen purpurfarbenen Kern und ein purpurfarbenes Zytoplasma entwickelten. Jede Art der weißen Blutzellen wurde durch die Verwendung eines einzigen reinen metachromatischen Farbstoffs voneinander differenziert, der durch seine kationische Natur ein quaternäres Stickstoffatom und ein Halogenanion gekennzeichnet ist. Obgleich es bereits bekannt ist, daß

bestimmte Farben biologische Proben mit einer anderen Farbe als der des Farbstoffs anfärben (Metachromasie), ist bisher nicht beschrieben worden, daß ein einziger basischer Farbstoff ohne äußere pH-Einstellung und andere Präparationen dazu benutzt werden kann, Leukozyten bei Körpertemperatur in einer wässrigen Umgebung anzufärben, und zwar ohne Fixierung, um durch Spektralunterschiede jede der fünf individuellen Leukozytenarten zu unterscheiden.

Toluylen-Blau weist folgende allgemeine Strukturformel auf:

₁₅ ™ W ,. ⁼N(CH₃)₂

Molekulargewicht 291; Gewicht des Kations

BEISPIEL 10

(1,l¹-Diethyl-2_/2¹-cyaninbromid) Spektralkurve 10

18 Carbocyaninfarbstoffe, die die chemische Struktur und die abgestuften Redoxpotentiale aufweisen, die in "Science" April 1974, und "Scientific American",·'Mai 1974 (Kodak-Anzeige) angegeben sind, wurden darauf untersucht, ob sie sich bei vitalen leukämischen Blutuntersuchungen mit Vorteil eignen.

TEIL I

Zweifache Testserien, nämlich Proben von leukozytenreichem Plasma und Gesamtblut von normalen Proben und von Patienten mit akuter Leukämie, wurden mit der gesamten Serie der vorstehend genannten 18 Farbstoffe abgestuften Redoxpotentials angefärbt. Ein Tropfen einer l%igen wässrigen Lösung des reinen Farbstoffs wurde unter leichter Bewegung mit fünf Tropfen der leukozytenhaltigen heparinisierten Blutproben vermischt.

* 1 1

Lediglich das vorstehend angegebene 1,1 -Diäthyl-2,2 cyaninbromid (das hier Carbocyanin K-5 genannt wird) ergab eine sofortige starke spektrale Absorption oder Anfärbung der Leukozyten und dann eine spezifische der Monozyten. Eine zunehmende Rotanfärbung des Kerns dauerte über eine halbe Stunde an. Der Grund für diese eigenartige Selektivität dieses Farbstoffs ausschließlich hinsichtlich des Kerns der Monozyten ist nicht völlig verständlich. Er stellt jedoch einen basischen quaternären kationischen Farbstoff mit einer einzigartigen Eigenschaft dar.

TEIL II %

Supravitale Blutproben der nachstehenden normalen Personen und Patienten, die eine unbehandelte Leukämie besaßen, wurden einer Anfärbung mit Carbocyanin K-5 unterzogen. Es wurden Blutproben sowohl von schwerkraftsedimentiertem leukozytenreichem Plasma wie von venösem Gesamtblut einer Anfärbung unterzogen. Es konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden, wenn die Proben des Gesamtblutes mit den Proben des leukozytenreichen Plasmas bei den Testserien verglichen wurden.
20 normale Personen

8 Personen - akute lymphoplastische Leukämie 6 Personen - akute myeloplastische Leukämie 10 Personen - akute monozytische Leukämie

In allen Fällen wurden die Blutproben routinemäßigen zytochemischen Anfärbungen nach dem Stand der Technik unterworfen, wobei spezifische Esterase, nicht-spezifische Esterase mit Fluoridinhibierung, PAS (periodische Säure Schiff) und Myeloperoxidase eingesetzt wurden, um die morphologische Bestimmung dieser leukämischen Arten zu bestätigen. Alle Fälle erwiesen sich als typisch, und zwar sowohl morphologisch wie zytochemisch.

Ein Tropfen (l%ige wässrige Lösung) des ausgewählten Cyaninfarbstoffes wurde zu fünf Tropfen des Gesamtblutes in einem 10 χ 75 mm Reagenzglas der Vitalblutprobe gegeben. Die Zellenkonzentration wurde auf etwa 5 χ IO Zellen pro ml eingestellt. Der pH war 6,2. Aufgrund laufender zytochemischer Versuche zur Unterscheidung der Zellenarten wurden diese Zellen als 1) polymorphonukleare Leukozyten 2) Lymphozyten, 3) Eosinophile 4) Basophile und 5) Monozyten ermittelt, desgleichen durch die Wrights-Anfärbung.

Etwa eine Minute nach der Zugabe des Farbstoffs zu den Proben des normalen Blutes wurden 5 bis 20 orangefarbene stäbchenförmige Strukturen in dem Zytoplasma der Monozyten und Lymphozyten festgestellt. Innerhalb der nächsten Minuten färbte sich der Kern der normalen und der leukämisehen Leukozyten zunächst blaßrosa. Innerhalb IO Minuten wurde der Kern tief rosa und schliesslich hellorangerot mit etwas Lumineszenz (Glühlichtbeleuchtung).Unter einem Zeiss-Fluoreszenzmikroskop zeigten der Kern und das Zytoplasma der normalen Monozyten Fluoreszenz.

Die Kerne der übrigen normalen peripheralen Blutleukozyten färbten sich, wenn überhaupt, nur schwach an. Die Körner der anderen Leukozyten, nämlich der polymorphonuklearen Eosinophilen und Basophilen, wurden mit einem schwachen unterscheidbaren Blaßgelb bis Grüngelb angefärbt. Die Erytrozyten zeigten keine sichtbare Anfärbung.

Die Blutproben der Patienten mit akuter lymphoplastischer Leukämie zeigten lediglich eine mitochondriale Anfärbung, desgleichen die leukämischen Myeloplasten der Patienten mit myeloplastischer Leukämie. Patienten mit akuter mono-, zytischer Leukämie zeigten dagegen eine rotorangene Kernanfärbung und eine rote Kernfluoreszenz nach fünf bis zehn Minuten, ebenso wie die normalen Monozyten.

Die vorstehenden Beobachtungen und andere zeigen deutlich die ungewöhnliche charakterisitische Affinität dieses einzigen spezifischen Carbocyaninfarbstoffs hinsichtlich der Kernsubstanzen der Monozyten.

Aus Analysen der Humanuntersuchungen geht hervor, daß die automatischen Differentialzellenzähler nützlicher und umfangreicher eingesetzt werden können, um mit Vorteil die

vorstehende Anfärbungstechnik zum Differenzieren, Aufzählen und Klassifizieren verschiedener Leukozyten anzuwenden, und zwar, wie hier, insbesondere der Monozyten, mittels eines einzigen wässrigen Farbstoffs in Kontakt mit einer supravitalen Blutprobe, ohne vorherige Fixierung und Denaturierung, um Artefakte einzuführen.

Der weitere experimentelle Einsatz von Carbocyanin K-5 in Kombination mit metachromatischen Farbstoffen dieser Erfindung zeigte besonders ungewöhnliche Ergebnisse bei einer 1:1-Kombination mit Basisch Orange 21 (Spektralkurve 7). Bei Einsatz der vorstehend genannten Kombination wurden die weißen Blutzellenleukozyten in jedem Falle schärfer und intensiver mit einer besseren spektralen Differenzierung angefärbt, als dies mit Basisch Orange 21 allein der Fall war, jedoch mit im wesentlichen der gleichen sichtbaren Farbe. Es wurden lediglich Lymphozyten angefärbt. Dieses Farbstoffgemisch stellt eine hervorragende Kombination zur deutlichen Differenzierung und Aufzählung von Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen und Monozyten dar.

Carbocyanin K-5 wurde ebenfalls in Kombination mit Rhodanil-Blau eingesetzt. Der Vorteil war deutlich und erkennbar, jedoch war die synergetische Qualität geringer als jene, die mit der Basisch Orange 21-Carbocyanin K-5-Koinbination festgestellt wurde (vgl. Tabelle III).

Die chemische Struktur von Carbocyanin K-5 ist nachstehend wiedergegeben. Das Chlorid kann irgendein anderes Halogen sein.

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In der vorstehenden Beschreibung und den Beispielen ist die Bedeutung der Vorteile der Erfindung im Hinblick auf automatische Differentialleukozytencomputer hervorgehoben. Es ist kein serienmäßiges Gerät bekannt, das gegenwärtig ohne Modifizierung in der Lage wäre, die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, das manuell durchgeführt wurde, zu verwirklichen. Die Fachleute auf dem Gebiet der medizinischen Technologie wissen jedoch um die Bedeutung einer raschen, genauen Bestimmung der verschiedenen Differentialleukozytenzählungen zu verschiedenen Zwecken. Es ist geschätzt worden, daß in den USA jeden Tag eine halbe Million Differentialleukozytenzählungen durchgeführt werden, die meisten manuell mit jährlichen Kosten von 750 Millionen US-Dollar.

Diese Zählungen, ob manuell oder automatisch, stellen ein grundlegendes Erfordernis bei der Identifizierung, Spektraldifferenzierung, Aufzählung und ein diagnostisches Hilfsmittel in der Praxis der Medizin dar. Der vorstehende umrissene grundlegende Fortschritt wird zweifellos zu Fortschritten bei automatischen Zusatzeinrichtungen führen, wie angegeben.

Blutzählungen, ob manuell oder automatisch, wie sie hier beschrieben werden, sind lebenswichtige Hilfsmittel bei der Untersuchung und der Bestimmung der Natur einer Krankheit. Fieber unbekannten Ursprungs, ob virulent oder als nicht pyrogene Infektion, Pyrogene, die den Blinddarm, die Gallenblase, die Eileiter betreffen, die Prognose bei Patienten mit verschiedenen Krankheiten unterschiedlicher Stadien, maligne Stadien, einschließlich der Hodgkinschen Krankheit, die Lungenkrankheit, die Überwachung der Behandlung von Patienten mit adrenokortischen Steroiden, un-

terschiedliche Arten akuter und chronischer Leukämie, die Differenzierung der Diagnose zwischen antiseptischer Knocheninfektion und Ostiomyelitis, bakterielle Infektionen und viele andere medizinische Fragen werden bei der Diagnose, Prognose und der Behandlung durch eine genaue Leukozytenzählung, Analyse und zytologisches Studium erleichtert.

Die klinischen Interpretationen und Schlußfolgerungen, die aus angefärbten Leukozytenzellen gezogen werden, ob von venösem Blut, Knochenmark, Urin oder anderen Quellen vitalen Blutes, einschließlich dunkler Blutproben, können angewendet werden, indem die Methoden benutzt werden, die der vorstehend genannten Aufzählung eigen sind.

Die Bezeichnung "metachromatisch", wie sie hier benutzt wird, bezieht sich nicht nur auf die außergewöhnliche und sonderbare Eigenschaft der beschriebenen Farbstoffe, sondern auch auf die Eigenschaft der verschiedenen Bestandteile, beispielsweise des Kerns und des Zytoplasmas, jedes der individuellen Arten der Leukozyten, die metachromatisch in einer einem Synergismus ähnlichen Weise reagieren, um eine Differenzierung hinsichtlich des spektralen Ansprechens zu erzeugen, die zu den beschriebenen zytochemisch möglichen Fortschritten führt. Im wesentlichen absorbiert (oder absorbiert nicht) jede weiße Blutzellenart einen einzigen metachromatischen Farbstoff in etwas ungewöhnlicher und einzigartiger Art und Weise, so daß jede Zelle mit absorbierten Farbstoff ein individuelles und unterschiedliches Lichtspektrum wiedergibt .

Leerseite

Claims

Verfahren und Zusammensetzung zur Bestimmung einzelner Leukozyten durch metachromatische Farbstoffdifferentialabsorption

Patentansprüche:

Mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse, bei dem eine optische Differenzierung, eine Identifikation, ein Vergleich und eine Aufzählung der Leukozyten, einschließlich polymorphonuklearer Leukozyten (Neutrophile), Eosinophile, Basophile, Lymphozyten, und Monozyten, individuell spektraldeterminant durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine supravitale Blutprobe in einem Zustand ohne Fixiermittel durch Kontakt in einer wässrigen Umgebung mit wenigstens einem wässrigen quaternären kationischen organischen Farbstoff angefärbt wird,

der in der Lage ist, Leukozyten bei Bluttemperatur (37° C) anzufärben, wobei die Anfärbung der einzelnen vorstehend genannten Leukozytenarten durch Absorption oder Nicht-Absorption des Farbstoffs durch deren ZeIlstruktur innerhalb des Lichtspektrums differenziert und die chromatische Lichtreflektion jeder einzelnen Farbstoff absorbierenden Leukozytenart sich in ihrer Spektralreflektion in einer Größenordnung unterscheidet, die ausreicht, um jede der auf den Farbstoff ansprechenden Arten zu identifizieren, zu vergleichen und aufzuzählen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nur ein einziger reiner basischer quaternärer metachromatischer kationischer organischer bei Bluttemperatur wirksamer Farbstoff angewendet wird, wodurch jede der fünf genannten Leukozyten mit einer spektral differenzierenden und identifizierenden chromatischen Lichtreflektion im Bereich des Licht-

2O spektrums angefärbt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der einzige reine quaternäre kationische Farbstoff aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Greifswalder Blau (Spektralkurve 1), Borrel-Blau (Spektralkurve 2), Rhodanil-Blau (Spektralkurve 3) und Toluylen-Blau (Spektralkurve 11) besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η -

zeichnet, daß der einzige ausgewählte basische quaternäre metachromatisehe kationische Farbstoff spektral im wesentlichen so anspricht wie Greifswalder

~ ³ ~ 'NAL-i-.^LFiEiCH

Blau (Spektralkurve 1), Toluylen-Blau (Spektralkurve 11), Borrel-Blau (Spektralkurve 2), Rhodanil-Blau (Spektralkurve 3), Nachtblau (Spektralkurve 4),Pflaumenecht (Spektralkurve 5), Hofmann's Violett (Spektralkurve 6) und Basisch Orange Nr. 21 (Spektralkurve 7).

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η nzeichnet, daß mehr als ein reiner basischer quaternärer kationischer organischer bei Bluttemperatur (37 C) ansprechender Farbstoff in wässriger Umgebung

verwendet wird und die reinen Farbstoffe die Kombination von Nachtblau (Spektralkurve 4) und Borrel-Blau (Spektralkurve 2) umfassen.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als ein einziger reiner Farbstoff in einer Kombination verwendet wird, die Borell-Blau (Spektralkurve 2) und Carbocyanin K-5 (Spektralkurve lo) umfaßt.

_t

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η - *"*** zeichnet, daß die in Kombination verwendeten

Farbstoffe Rhodanil-Blau (Spektralkurve 3) und Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 10) umfassen.
25

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als ein einziger reiner Farbstoff in einer Kombination verwendet wird, die Basisch Orange (Spektralkurve 7) und Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 1O) umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß mehr als ein einziger reiner

NACh 3 f:HEOHT

Farbstoff in einer Kombination verwendet wird, die Pflaumenecht (Spektralkurve 5) und Borrel-Blau (Spektralkurve 2) umfaßt.

lo. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als ein einziger reiner basischer quaternärer metachromatischer kationischer organischer bei Bluttemperatur (37° C) wirksamer Farbstoff in wässriger Umgebung verwendet wird, wobei ein erster Farbstoff, der aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Toluylen-Blau (Spektralkurve 11), Borrel-Blau (Spektralkurve 2), Rhodanil-Blau (Spektralkurve 3), Nachtblau (Spektralkurve 4), Pflaumenecht (Spektralkurve 5), Hofmanns Violett (Spektralkurve 6) und Basisch Orange Nr. 21 (Spektralkurve 10) und aus Kombinationen davon besteht und ein zweiter reiner basischer quaternärer kationischer organischer bei Bluttemperatur (37 C) wirksamer Farbstoff, der spezifisch für Monozyten ist und aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Basisch Rot 13 (Spektralkurve 8), Basisch Violett 16 (Spektralkurve 9) und Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 10) in einer wirksamen Leukozytenanfärbungskombination verwendet werden.

11. Mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse, bei dem eine optische Differenzierung, ein Vergleich und eine Aufzählung der Leukozyten individuell spektraldeterminant durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß eine einzige supravitale Blutprobe in einem Zustand ohne Fixiermittel durch Kontakt der Blutprobe in einer wässrigen Umgebung mit Borrel-Blau (Spektralkurve 2) unterhalb normaler Bluttemperatur (37° C) jedoch bei nicht weniger als 21° C

-δ-

angefärbt wird und diese analytischen Bestimmungen an den Leukozyten durchgeführt werden, die dabei selektiv und einzigartig angefärbt werden, falls dies erforderlich ist.
5

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der einzige basische quaternäre metachromatische Farbstoff Borrel-Blau (Spektralkurve 2) ist.

13. Mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse von Monozyten, die mittels eines basischen quaternären kationischen organischen Farbstoffs, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Basisch Rot 13 (Spektralkurve 8), Basisch Violett 16 (Spektralkurve 9) und Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 10) und Gemischen davon besteht, differentiell angefärbt werden, dadurch gekennzei chnet, daß wenigstens eine supravitale Blutprobe in einem Zustand ohne Fixiermittel durch Kontakt in einer wässrigen Umgebung bei einer Temperatur zwischen etwa 21° C und 40° C nach der vorstehend angegebenen Farbstoffauswahl angefärbt wird, wobei die Monozyten selektiv angefärbt und die optische Differenzierung, Vergleich, Aufzählung und Untersuchung der gefärbten Monozyten durchgeführt werden, sofern es erforderlich ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Differenzierung und Aufzählung der normalen weißen Blutzellen mit einer physikalischen auf das Lichtspektrum ansprechenden Einrichtung durchgeführt wird.

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15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Differenzierung, Identifizierung und Aufzählung sowie die Krankheitsdiagnose der aufgeführten weißen Blutzellenelemente erforderlichenfalls durch Humanbeobachtung durchgeführt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß einer der wesentlichen organischen Farbstoffe Greifswalder Blau (Spektralkurve 1)

10 ist.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der organische Farbstoff aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Basisch Orange Nr. 21 (Spektralkurve 7), Hofmanns Violett (Spektralkurve 6), Pflaumenecht (Spektralkurve 5) und Nachtblau (Spektralkurve 4) sowie Kombinationen davon besteht, wobei alle Leukozytenzellen durch metachromatische Anfärbung optisch differenziert werden, mit

20 Ausnahme der Lymphozyten.

18. Mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse, bei dem eine optische Differenzierung, ein Vergleich und eine Aufzählung von zwei ausgewählten und spezifischen Leukozyten erfolgt, nämlich Lymphozyten und Monozyten, welche in einer einzigen Blutprobenuntersuchung spektraldeterminant gemacht werden, dadurch gekennz ei chnet, daß eine einzige supravitale Blutprobe in einem Zustand ohne Fixiermittel durch Kontakt der Blutprobe in einer wässrigen Umgebung mit Borrel-Blau (Spektralkurve 2) in Kombination mit einem zweiten Farbstoff, der aus einer Gruppe ausgewählt

wird, die aus Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 10), Basisch Violett 16 (Spektralkurve 9) und Basisch Rot 13 (Spektralkurve 8) und Gemischen davon besteht, bei Umgebungstemperatur (21 bis 25° C) angefärbt wird. .

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η ζ ei chnet, daß eine einzige Blutprobe einer wässrigen Anfärbung durch Kontakt mit wenigstens

/**■." einem wässrigen basischen quaternären metachromatischen

kationischen organischen Farbstoff, der zur Anfärbung individueller Leukozyten, die in der Probe vorhanden sind, wirksam ist, metachromatisch bei Bluttemperatur (37° C) unterworfen wird, wobei die angefärbten Zellen einer Differenzierung und Aufzählung unterworfen werden mit einer Differenzierung durch Auswahl eines farbempfindlichen Filterteils mit einem einstellbaren Spektralbereich, der empfindlich gegenüber dem Spektrum ist, das von jeder der differentiell gefärbten weißen Blutzellen in der Probe reflektiert wird, und einer Zähleinrichtung, die durch Anregung durch reflektiertes Licht betätigt wird, wobei die Anzahl jeder der einzelnen Arten der Leukozyten, die in der untersuchten Probe vorhanden sind, unter und innerhalb eines vorgegebenen mikroskopischen Feldes differentiell

25 gezählt wird.

20. Zusammensetzung zur differentiellen Anfärbung, Identifizierung und Differenzierung von Leukozytenarten bei einer Temperatur zwischen etwa 21° C und 40° C, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Kombination von wenigstens zwei Farbstoffen umfaßt, wobei wenigstens einer davon ein Farbstoff ist, der aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Greifswalder

Blau (Spektralkurve 1), Borrel-Blau (Spektralkurve 2), Rhodanil-Blau (Spektralkurve 3), Toluylen-Blau (Spektralkurve 11), Nachtblau (Spektralkurve 4), Pflaumenecht (Spektralkurve 5), Hofmanns Violett (Spektralkurve 6), Basisch Orange Nr. 21 (Spektralkurve 7), Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 10), Basisch Rot 13 (Spektralkurve 8) und Basisch Violett 16 (Spektralkurve 9) besteht.

21. Mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse, bei dem die Monozyten gegenüber den übrigen Leukozytenarten individuell spektraldeterminant gemacht werden, dadurch gekennz eichnet, daß wenigstens eine supravitale Blutprobe in einem Zustand ohne Fixiermittel in einer wässrigen Umgebung mit einem oder mehreren wässrigen! basischen quaternären kationischen organischen Farbstoffen angefärbt wird, der bzw. die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die aus Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 10), Basisch Violett 16 (Spektralkurve 9) und Basisch Rot 13 (Spektralkurve 8) besteht .