ES2268854T3 - Inhibidores de la vascularizacion. - Google Patents
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Abstract
REIVINDICACIONES 1. Uso de una sustancia que inhibe la acción debida al CXCR4 en la fabricación de un medicamento para inhibir la vascularización, en el que la sustancia se selecciona del grupo constituido por (1) una sustancia que inhibe la unión entre el SDF-1 y el CXCR4; (2) una sustancia que inhibe la señalización desde el CXCR4 hacia el núcleo; (3) una sustancia que inhibe la expresión del CXCR4; y (4) una sustancia que inhibe la expresión del SDF-l.
Description
Inhibidores de la vascularización.
Esta invención se refiere al uso de un inhibidor
del CXCR4 como ingrediente eficaz como un nuevo inhibidor de la
vascularización, un agente anti tumores sólidos y un agente
terapéutico para una enfermedad causada patológicamente por una
neovascularización.
En el pasado se sabía que cuando las células
tumorales salen fuera de los vasos sanguíneos, las células
endoteliales vasculares se rompen. También se sabe que la
neovascularización está profundamente implicada en la proliferación
y la migración del cáncer, y que las células tumorales producen y
liberan una variedad de factores de neovascularización.
Especialmente, la neovascularización está considerada como crucial
para la proliferación de tumores sólidos.
Por lo tanto, una sustancia que inhiba la
neovascularización tiene el potencial de ser un agente anticanceroso
que es proporcionado con un nuevo modo de acción. Por esta razón, ya
se ha probado el uso de varios tipos de sustancias inhibidoras de la
neovascularización tales como esteroides y productos metabólicos de
microorganismos. ("Manual for Studies on Cancer Invasion and
Metastasis," The Cancer Metastasis Society Ed., Kinhodo
Publisher, 159-182 (1994)). Sin embargo, se desea
fuertemente descubrir nuevas sustancias inhibidoras de la
neovascularización con la acción de inhibir más eficazmente la
proliferación y la metástasis de cánceres.
Esta invención proporciona el uso de una
sustancia que inhibe la acción debida al CXCR4 en la fabricación de
un medicamento como un inhibidor de la vascularización, un agente
antineoplásico o un agente terapéutico para una enfermedad causada
patológicamente por una neovascularización, comprendiendo cada uno
un inhibidor de un receptor de quimiocinas, con la acción de inhibir
más eficazmente la proliferación, invasión y metástasis de un
cáncer, en el que la sustancia se selecciona del grupo constituido
por (1) una sustancia que inhibe la unión entre el
SDF-1 y el CXCR4; (2) una sustancia que inhibe la
señalización desde el CXCR4 hacia el núcleo; (3) una sustancia que
inhibe la expresión del CXCR4; y (4) una sustancia que inhibe la
expresión del SDF-1.
Específicamente, los presentes inventores
llevaron a cabo extensas investigaciones con objeto de resolver los
problemas identificados anteriormente; y como resultado han
descubierto que cuando se crean ratones con genes inactivados que
carecen del factor estimulante del crecimiento de células
pre-B/factor derivado de células estromales
(denominado en lo sucesivo "PBSF/SDF-l" o
"SDF-1"), que es una quimiocina de CXC, así
como de CXCR4, que es un receptor de quimiocinas, se suprime la
vascularización en los ratones, y concretamente, la supresión de
CXCR4 da como resultado una supresión de la vascularización. Dicho
descubrimiento significa que el receptor de quimiocinas CXCR4 es
esencial para la neovascularización.
La neovascularización de tejidos vivos se
produce generalmente a través de un remodelado del sistema vascular
previamente existente cuando crecen para realizar sus funciones
específicas durante el desarrollo. Los análisis de los ratones
mutantes han determinado que las moléculas requeridas por los
sistemas vasculares tempranos son en su mayoría receptores de
cinasas de tirosina y sus ligandos. (Risau, W. Nature 386,
671-674 (1997); Folkman, J. & D'Amore, P. A.
Cell 87, 1158-1155 (1996); y Lindahl, P., y col.,
science 277, 242-245 (1997)). Sin embargo, las
sustancias responsables de la vascularización durante la
organogénesis todavía no han sido identificadas, porque la mayoría
de estos ratones muere durante la gestación temprana antes del
desarrollo de sus tejidos.
La estructura del receptor de quimiocinas CXCR4
según esta invención ya se conocía. (Bleul, C. C. y col., Nature
382, 829-883 (1996); Oberlin, E. y col., Nature 382,
888-835 (1996); y Nagasawa, T. y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU. 93, 14726-14729 (1996)). El CXCR4
es una proteína acoplada a proteína G que abarca siete dominios
transmembrana y un receptor de PBSF/SDF-1, que es
una quimiocina CXC. Se cree que el factor mencionado anteriormente
es responsable de la linfopoyesis de los linfocitos B, de la
mielopoyesis en la médula ósea y de la formación del tabique
ventricular cardiaco (Nagasawa, T. y col., Nature 382,
685-688 (1996)). El CXCR4 también funciona como un
co-receptor para el VIH-1 trófico de
los linfocitos T (Feng, Y. y col., Science 272,
872-877 (1996)). Adicionalmente se ha informado de
que el CXCR4 se expresa en células endoteliales cultivadas (Volin,
M. V. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 242,
46-53 (1998)).
Además, los presentes inventores han descubierto
que el anteriormente mencionado CXCR4 se expresa en células
endoteliales vasculares en desarrollo, y que los ratones que carecen
del CXCR4 o de su ligando PBSF/SDF-1, muestran una
formación defectuosa de los grandes vasos sanguíneos que abastecen
el tracto gastrointestinal. Dicho descubrimiento significa que los
sistemas de señalización CXCR4 y PBSF/SDF-1 son
esenciales para la formación de las arterias y venas medianas que
aportan nutrientes al tracto gastrointestinal. Adicionalmente, los
presentes inventores han descubierto que los ratones que carecen del
CXCR4 tienden a morir en el útero, tal como se observa en los
ratones que carecen de PGSF/SDF-1. Dicho
descubrimiento sugiere que el CXCR4 es el receptor fisiológico
primario más crítico de PBSF/SDF-1.
Basándonos en las anteriores observaciones de
los presentes inventores, se contempla que las sustancias capaces de
inhibir la acción debida al CXCR4 puedan inhibir la vascularización,
y por tanto puedan ser eficaces agentes anticancerosos, dado que la
vascularización es esencial para el mantenimiento y la expansión de
los tejidos cancerosos.
Asimismo, se contempla que las sustancias
capaces de inhibir el CXCR4 podrán ser agentes terapéuticos para el
tratamiento de enfermedades que implican una neovascularización.
Adicionalmente se contempla que la promoción de
la acción debida al CXCR4 acelere la vascularización, y por lo tanto
pueda ser un remedio para una enfermedad en la que se desea una
vascularización.
Más específicamente, como se resumirá a
continuación, esta invención proporciona un inhibidor de la
vascularización, un agente antineoplásico o un agente terapéutico
para una enfermedad causada patológicamente por una
neovascularización, comprendiendo cada uno como ingrediente eficaz
una sustancia que inhibe la acción debida al CXCR4.
Es decir, esta invención proporciona el uso de
un inhibidor del CXCR4 como el ingrediente eficaz de un inhibidor de
la vascularización.
También, esta invención proporciona el uso de un
inhibidor del CXCR4 como el ingrediente eficaz de un agente
antineoplásico.
Además, esta invención proporciona el uso de un
inhibidor del CXCR4 como el ingrediente eficaz como un agente
terapéutico para una enfermedad causada patológicamente por una
neovascularización.
Debido a que la formación de arterias y venas
medianas o grandes es esencial para el mantenimiento y la expansión
de un tejido canceroso que supera un cierto tamaño, el inhibidor de
la vascularización de esta invención bloquea el sistema de
señalización del CXCR4 o del PBSF/SDF-l, suprimiendo
así el mantenimiento y la expansión del tejido canceroso.
El descubrimiento obtenido en esta invención
sugiere la posibilidad de que los sistemas de señalización del CXCR4
y del PBSF/SDF-1 contribuyan a la vascularización
universal. Por lo tanto, en las enfermedades en las que la principal
causa patológica es un tipo de cáncer o de neovascularización en
particular, es probable que el CXCR4 o el PBSF/SDF-l
esté profundamente implicado en la causa patológica; en este caso,
existe la posibilidad de que estas enfermedades puedan ser
suprimidas bloqueando el CXCR4 o el PBSF/SDF-1
individual o simultáneamente con otras moléculas.
En la presente memoria descriptiva y dibujos,
las abreviaturas de las bases o aminoácidos siguen la comisión sobre
nomenclatura bioquímica (Commission on Biochemistry Nomenclatura) de
la IUPAC-IUB, o se basan en lo que es habitual en la
técnica. A continuación se ilustran sus ejemplos. Cuando se habla de
aminoácidos y pueden estar presentes sus isómeros ópticos, aquéllos
representan las formas L salvo que se indique lo contrario.
ADN: ácido desoxirribonucleico
ADNc: ácido desoxirribonucleico
complementario
A: adenina
T: timina
G: guanina
C: citosina
ARN: ácido ribonucleico
ARNm: ácido ribonucleico mensajero
G o Gly: glicina
A o Ala: alanina
V o Val: valina
L o Leu: leucina
I o Ile: isoleucina
S o Ser: serina
T o Thr: treonina
C o Cys: cisteína
M o Met: metionina
E o Glu: ácido glutámico
D o Asp: ácido aspártico
K o Lys: lisina
R o Arg: arginina
H o His: histidina
F o Phe: fenilalanina
Y o Tyr: tirosina
W o Trp: triptófano
P o Pro: prolina
N o Asn: asparagina
Q o Gln: glutamina
BSA: albúmina de suero bovino
FBS: suero bovino fetal
PBS: disolución salina tamponada con fosfato
SDS: dodecilsulfato sódico
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 es un gráfico que muestra una
estrategia de marcaje para el gen del CXCR4. En la figura se
muestran el alelo natural de CXCR4 en la parte superior, un vector
de marcaje en el centro y un alelo mutante predicho en la parte
inferior. Las regiones codificantes de los genes están indicadas en
recuadros negros. Los recuadros vacíos indican las regiones no
traducidas 5' y 3'. Las líneas punteadas indican fragmentos
homólogos usados en el vector de marcaje. La sonda A es una sonda
externa para la hibridación Southern. Los sitios de restricción son
E (EcoRI), Sh (SphI), y X (XhoI), respectivamente.
La Fig. 2A es una fotografía que muestra el
análisis por inmunotransferencia Southern de colas de ADN de ratones
de tipo natural (+/+) y mutantes heterocigotos (+/-). En la figura
se muestran los fragmentos EcoRI-EcoRI del alelo de
11,8-kb de tipo natural y del de
8,2-kb de marcaje que fueron identificados por la
sonda A.
La Fig. 2B es una fotografía que muestra el
análisis de amplificación mediante RT-PCR de la
expresión del CXCR4. Se prepararon ARN totales a partir de embriones
mutantes de E18.5 de tipo natural y homocigotos, y se amplificaron
con cebadores específicos para CXCR4. La amplificación mediante
RT-PCR empleo ARNm de G3PDH, que era expresado
universalmente, como control de la presencia de cualquier ARN
amplificable.
La Fig. 3 es una fotografía que muestra los
defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales del mesenterio y
de la región del asa intestinal media de un embrión de tipo natural
para CXCR4^{-/-} en E13.5, resultante de la inmunohistotinción del
mesenterio y el intestino con un anticuerpo
anti-PECAM-1. La flecha indica una
gran ramificación de la arteria mesentérica superior o de la vena
mesentérica superior que abastece al intestino delgado en el
mesenterio del tipo natural. "du" representa duodeno; "p,"
la parte proximal del asa intestinal media; y "dm," la parte
distal del asa intestinal media.
La Fig. 4 es una fotografía que muestra los
defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en los cortes
transversales del mesenterio del embrión de tipo natural
CXCR4^{-/-} en E13.5, resultante de la inmunohistotinción del
mesenterio y el intestino con el anticuerpo
anti-PECAM-1. "a" representa
arteria y "v" vena.
La Fig. 5 es una fotografía que muestra los
defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en el yeyuno de
un embrión de tipo natural CXCR4^{-/-} en E17.5, resultante de la
inmunohistotinción del mesenterio y el intestino con el anticuerpo
anti-PECAM-1. La flecha indica una
gran ramificación de la arteria mesentérica superior o de la vena
mesentérica superior que abastece al intestino delgado en el
mesenterio de tipo natural.
La Fig. 6 es una fotografía que muestra los
defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en la parte más
distal del yeyuno del embrión de tipo natural CXCR4^{-/-} en
E17.5, resultante de la inmunohistotinción del mesenterio y el
intestino con el anticuerpo
anti-PECAM-1. La flecha indica una
gran ramificación de la arteria mesentérica superior o de la vena
mesentérica superior que abastece al intestino delgado en el
mesenterio de tipo natural.
La Fig. 7 es una fotografía que muestra los
defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en el mesenterio
y en las regiones del asa intestinal media de un embrión mutante
CXCR4^{-/-} en E13.5, resultante de la inmunohistotinción del
mesenterio y el intestino del mutante con el anticuerpo
anti-PECAM-1. "p" representa la
parte proximal del asa intestinal media; y "dm" la parte distal
del asa intestinal media.
La Fig. 8 es una fotografía que muestra los
defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en los cortes
transversales del mesenterio del embrión mutante CXCR4^{-/-} en
E13.5, resultante de la inmunohistotinción del mesenterio y el
intestino del mutante con el anticuerpo
anti-PECAM-l.
La Fig. 9 es una fotografía que muestra los
defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en el yeyuno de
un embrión mutante CXCR4^{-/-} en E17.5, resultante de la
inmunohistotinción del mesenterio y el intestino del mutante con el
anticuerpo anti-PECAM-1.
La Fig. 10 es una fotografía que muestra los
defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en la parte más
distal del yeyuno del embrión mutante CXCR4^{-/-} en 17.5,
resultante de la inmunohistotinción del mesenterio y el intestino
del mutante con el anticuerpo
anti-PECAM-1.
La Fig. 11 es una fotografía que muestra
defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales, que son una
lesión hemorrágica del intestino sin teñir de un ratón mutante, un
embrión CXCR4^{-/-} mutante E16.5, resultante de la
inmunohistotinción del mesenterio y el intestino del mutante con el
anticuerpo anti-PECAM-1.
La Fig. 12A es una fotografía que muestra el
resultado de la inmunohistotinción del estómago de un E13.5 de tipo
natural con el anticuerpo
anti-PECAM-1. La flecha indica un
gran vaso observado sólo en el tipo natural.
La Fig. 12B es una fotografía que muestra el
resultado de la inmunohistotinción del estómago de un E13.5 mutante
con el anticuerpo anti-PECAM-1.
La Fig. 12C es una fotografía que muestra el
resultado de la inmunohistotinción del estómago de un E15.5 de tipo
natural con el anticuerpo
anti-PECAM-1. El inserto de la
fotografía muestra cortes teñidos con hematoxilina y eosina de
grandes vasos en la pared del estómago teñido en E15.5. La flecha
indica un gran vaso observado sólo en el tipo natural.
La Fig. 12D es una fotografía que muestra el
resultado de la inmunohistotinción del estómago de un E15.5 mutante
con el anticuerpo anti-PECAM-1.
La Fig. 13A es una fotografía que muestra la
expresión de CXCR4 y PBSF/SDF-1 en un tejido del
tracto gastrointestinal mediante una hibridación in situ. Los
cortes sucesivos del mesenterio de tipo natural que conecta con el
asa intestinal media se tiñeron con hematoxilina y eosina. "m"
representa mesenterio, "i" intestino, "a" arteria
mesentérica superior, y "v" vena mesentérica superior.
La Fig. 13B es una fotografía que muestra la
expresión de CXCR4 y PBSF/SDF-1 en un tejido del
tracto gastrointestinal mediante una hibridación in situ. La
hibridación se realizó con una sonda específica para CXCR4. Las
flechas indican las células endoteliales teñidas de los vasos
mesentéricos.
La Fig. 13C es una fotografía que muestra la
expresión de CXCR4 y PBSF/SDF-1 en un tejido del
tracto gastrointestinal mediante una hibridación in situ. La
hibridación se realizó con una sonda específica para
PBSF/SDF-1. El PBSF/SDF-1 era
expresado en las células mesenquimatosas que rodean a las células
endoteliales en el mesenterio.
La Fig. 13D es una fotografía que muestra la
expresión de CXCR4 y PBSF/SDF-1 en un tejido del
tracto gastrointestinal mediante una hibridación in situ. Los
cortes sucesivos del mesenterio de tipo natural que conecta con el
asa intestinal media se tiñeron con hematoxilina y eosina. La Fig.
13D es una ampliación de los vasos sanguíneos que surgen desde la
arteria mesentérica superior mostrada en la Fig. 13A, en la que se
observó una fuerte expresión del CXCR4 en las células endoteliales
vasculares.
La Fig. 13E es una fotografía que muestra la
expresión de CXCR4 y PBSF/SDF-1 en un tejido del
tracto gastrointestinal mediante una hibridación in situ. La
hibridación se realizó con la sonda específica para CXCR4-. La Fig.
13E es una ampliación de los vasos sanguíneos que surgen desde la
arteria mesentérica superior mostrada en la Fig. 13B, en la que se
observó una fuerte expresión del CXCR4 en las células endoteliales
vasculares. La flecha indica las células endoteliales teñidas de los
vasos mesentéricos.
La Fig. 13F es una fotografía que muestra la
expresión de CXCR4 y PBSF/SDF-1 en un tejido del
tracto gastrointestinal mediante una hibridación in situ. Es
una sección de una médula ósea embrionaria de un E18.5 de tipo
natural, que muestra la expresión del CXCR4 en células
hematopoyéticas, pero ninguna expresión en células estromales
fusiformes.
El inhibidor de la vascularización, el agente
antineoplásico o el agente terapéutico para una enfermedad causada
patológicamente por una neovascularización según esta invención
comprende como ingrediente eficaz una sustancia que inhibe la acción
del CXCR4, que es un receptor de quimiocinas.
La secuencia de aminoácidos del CXCR4 ya se
conocía. Específicamente, la secuencia de aminoácidos del CXCR4
humano y la secuencia de aminoácidos del CXCR4 murino se establecen
en las ID. SEC. N^{os}: 1 y 3, respectivamente. La secuencia de
basess del CXCR4 y la secuencia de bases del CXCR4 murino se
establecen en la ID. SEC. Nº: 2 (posiciones de bases
1-1056) y en la ID. SEC. Nº: 4 (posiciones de bases
1-1077), respectivamente.
También se conocía ya la secuencia de
aminoácidos del SDF-1, que es un ligando que se une
al CXCR4. Existen dos tipos de SDF-1 que difieren en
la longitud de la secuencia de aminoácidos, es decir,
SDF-1-\alpha y
SDF-1-\beta. Específicamente, la
secuencia de aminoácidos del
SDF-1-\alpha humano se establece
en la ID. SEC. Nº: 5 y su secuencia de bases en la ID. SEC. Nº: 6
(posiciones de base 474-740). El
SDF-1-\beta humano (ID. SEC. Nº:
9) deriva del SDF-1-\alpha humano
mediante la adición de cuatro restos de aminoácidos, Arg Phe Lys
Met, a un C-terminal del mismo.
La secuencia de aminoácidos del
SDF-1-\alpha murino se establece
en la ID. SEC. Nº: 7 y su secuencia de bases en la ID. SEC. Nº: 8
(posiciones de base 82-348). El
SDF-1-\beta murino (ID. SEC. Nº:
10) deriva del SDF-1-\alpha murino
mediante la adición de cuatro restos de aminoácidos, Arg Leu Lys
Met, a un C-terminal del mismo. Para los
SDF-l humano y murino, la secuencia de desde el
primer aminoácido (Met) hasta el vigésimo primer aminoácido (Gly) es
una secuencia señal.
Las quimiocinas CXC conocidas hasta ahora
incluían, además del PBSF/SDF-1 mencionado
anteriormente, IL-8 (Yoshimura., T. y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU., 84, 9233-9237 (1987)),
NAP-2 (Walz. A., y col., Biochem. Biophys. Res.
Comun., 159, 969-975 (1989)), NAP-4,
GRO \alpha (Richmondo, A. y col., J. Cell. Biochem., 36,
185-198 (1988)), GRO \beta (Haskill, S. y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87, 77732-7736
(1990)), GRO \gamma (Haskill, S. y col., ibid. (1990)),
GCP-2 (Proost, P. y col., J. Immunol., 150,
1000-1010 (1993)), ENA-78 (Wayz, A.
y col., J. Exp. Med., 174, 1355-1362 (1991)),
PF-4 (Deuel, T. F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 74, 2256-2258 (1977)) e IP-10
(Dewald, B. y col., Immunol. Lett., 32, 81-84
(1992)).
Específicamente, las sustancias de la presente
invención son: (1) una sustancia basada en la inhibición de la
propia unión entre el ligando (SDF-1) y el receptor
(CXCR4); (2) una sustancia basada en la inhibición de la
señalización desde el CXCR4 hacia el núcleo; (3) una sustancia que
inhibe la expresión del propio CXCR4; y (4) una sustancia que inhibe
la expresión del propio SDF-1.
(1) Para la sustancia que inhibe la propia unión
entre el SDF-1 y el CXCR4, hay una sustancia que
inhibe el SDF-1 y una sustancia que inhibe el
CXCR4.
Más específicamente, la sustancia que inhibe el
SDF-1 se clasifica en una sustancia que inhibe el
CXCR4 en competición antagonista con el SDF-1 y una
sustancia que inhibe la unión del SDF-1 al CXCR4
uniéndose al SDF-1. Para la sustancia que inhibe el
CXCR4 en competición antagonista con el SDF-1,
concretamente se menciona una proteína con una estructura similar al
SDF-1, una proteína fusionada de la proteína
anterior con otro péptido o polipéptido, o un péptido parcial del
SDF-1.
Para la sustancia que inhibe la unión del
SDF-1 al CXCR4 uniéndose al SDF-1,
concretamente se menciona un anticuerpo
anti-SDF-1, un fragmento del mismo
que posee una actividad de unión, una proteína fusionada que posee
actividad de unión al SDF-1.
Más específicamente, la sustancia que inhibe el
CXCR4 se clasifica en una sustancia que inhibe el CXCR4 en
competición antagonista con el CXCR4 por la unión al
SDF-1 y una sustancia que inhibe la unión del
SDF-1 al CXCR4 uniéndose al CXCR4. Para la sustancia
que inhibe el CXCR4 en competición antagonista con el CXCR4 por la
unión al SDF-1, concretamente se menciona un CXCR4
soluble que antagoniza al CXCR4 en la inhibición, una proteína con
una estructura similar al CXCR4, una proteína fusionada de la
proteína anterior con otro péptido o polipéptido, o un péptido
parcial del CXCR4.
Para la sustancia que inhibe la unión del
SDF-1 al CXCR4 uniéndose al CXCR4, concretamente se
menciona un anticuerpo anti-CXCR4, un fragmento del
mismo que posee su actividad de unión y una proteína fusionada que
posee actividad de unión al CXCR40.
Algunos ejemplos de la sustancia que inhibe la
propia unión entre el CXCR4 y el SDF-1 incluyen T22
(T. Murakami, y col., J. Exp. Med., 186, 1389-1393
(1997)), ALX40-4C (J. Exp. Med., 186,
1395-1400 (1997)), AMD3100 (J. Exp. Med., 186,
1383-1388 (1997); Nat. Med., 4,
72-77 (1998)), y similares. Respecto a los
procedimientos de preparación de estas sustancias, puedan
realizarse, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en J.
Exp. Med., 186, 1189-1191 (1997) con cualquier
modificación posible.
(2) No hay ninguna limitación en particular para
la sustancia basada en la inhibición de la señalización desde el
CXCR4 hacia el núcleo, siempre que sea una sustancia que tenga dicha
acción. Para la sustancia basada en la inhibición de la señalización
desde el CXCR4 hacia el núcleo, se mencionan inhibidores del sistema
de señalización que existen posteriores a una proteína acoplada a
proteína G, tal como un inhibidor de la cascada MAK, un inhibidor de
la fosfolipasa C (PLC) y un inhibidor de cinasa para la cinasa
PI3.
(3) Para la sustancia que inhibe la expresión
del propio CXCR4, se menciona una sustancia que inhibe la expresión
del propio CXCR4.
Para la sustancia que inhibe la expresión del
propio CXCR4, se menciona concretamente un antigen, un antisentido
(un oligonucleótido antisentido y un ARN antisentido expresado
mediante un vector antisentido), una ribozima y una sustancia que
inhibe el sitio de control de la expresión del CXCR4, tal como un
promotor o un potenciador.
A partir de los ejemplos que se describirán más
adelante, se ha hecho evidente que cuando se usa un vector que
contiene una parte del gen del CXCR4 para provocar la deficiencia en
CXCR4, la vascularización se suprime. Por lo tanto, la inhibición
del CXCR4 mediante el antigen, el antisentido o la ribozima de CXCR4
suprimirá la vascularización.
Los oligonucleótidos antisentidos que pueden
usarse preferiblemente en esta invención incluyen genes del CXCR4,
genes del SDF-1 contra CXCR4, nucleótidos (ADN o
ARN) hibridables selectivamente con los genes de las sustancias que
están implicadas en el sistema de señalización basado en el CXCR4, y
derivados de los mismos (tales como oligonucleótidos antisentidos).
Esta invención abarca, por ejemplo, los oligonucleótidos
antisentidos que hibridan con cualquier sitio de la secuencia de
bases del gen del CXCR4 humano, según se establece en la ID. SEC.
Nº: 2.
Preferiblemente, el oligonucleótido antisentido
es un oligonucleótido antisentido con al menos 20 nucleótidos
consecutivos de la secuencia de bases establecida en la ID. SEC. Nº:
2. Más preferiblemente, el oligonucleótido antisentido es al menos
20 nucleótidos consecutivos que contienen un codón de inicio de la
traducción.
Según se usa en este documento,
"oligonucleótido antisentido" no es sólo aquel que tiene
nucleótidos que se corresponden con los nucleótidos que constituyen
la región predeterminada del ADN o del ARN y que son todos
complementarios de éstos, sino que también pueden permitir uno o más
desaparejamientos de los nucleótidos presentes en los mismos,
siempre que el oligonucleótido y el ADN o el ARN sean capaces de
hibridar selectivamente y de forma estable con la secuencia de bases
establecida en la ID. SEC. Nº: 2. Por "hibridar selectivamente y
de forma estable" se entiende aquellos que tienen al menos un
70%, preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos
un 90%, muy preferiblemente un 95% o más de homología en la
secuencia de bases con la región de la secuencia de nucleótidos de
al menos 20, y preferiblemente 30 nucleótidos consecutivos. En la
presente memoria descriptiva, "homología" significa
"identidad".
Cuando el derivado de oligonucleótido usado en
esta invención es un desoxirribonucléotido, la estructura de cada
derivado está representada por la fórmula 1:
En la fórmula, X puede ser independientemente
cualquiera de oxígeno (O), azufre (S), un grupo alquilo inferior,
una amina primaria y una amina secundaria. Y puede ser
independientemente bien oxígeno (O) o bien azufre (S). B se
selecciona entre adenina, guanina, timina o citosina, y es
principalmente un oligonucleótido complementario del ADN o del ARN
del gen del CXCR4 humano. R es independientemente hidrógeno (H), un
grupo dimetoxitritilo o un grupo alquilo inferior. n es de 7 hasta
28.
Los derivados de oligonucleótidos preferibles no
se limitan a los oligonucleótidos que no han sido modificados, sino
que pueden ser oligonucleótidos modificados, como se ilustrará a
continuación. Estas formas modificadas incluyen derivados fosfonato
de un alquilo inferior de tipos tales como fosfonato de metilo o
fosfonato de etilo, derivados de fosforotioato, fosforoamidatos y
similares.
Estos derivados de oligonucleótidos pueden
obtenerse mediante procedimientos convencionales según se describe a
continuación. Los oligonucleótidos de fórmula (1) en la que X e Y
son ambos O pueden prepararse fácilmente con un sintetizador de ADN
comercial, tal como el disponible de Applied Biosystems; para su
procedimiento de preparación puede usarse para obtenerlos una
síntesis en fase sólida empleando fosforoamiditos, una síntesis en
fase sólida empleando fosfonatos de hidrógeno y similares.
Las formas de triéster fosfórico modificadas en
las que X es un grupo alcoxi inferior pueden obtenerse mediante
procedimientos convencionales: por ejemplo, los oligonucleótidos
obtenidos mediante síntesis química se tratan con una disolución de
cloruro de tosilo en DMF/metanol/2,6-lutidina. Las
formas de fosfonato de alquilo modificadas en las que X es un grupo
alquilo pueden obtenerse según procedimientos convencionales, por
ejemplo, usando fosfoamiditos. Las formas de fosforotioato
modificadas en las que X es S pueden obtenerse según procedimientos
convencionales, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida usando
azufre, o alternativamente, mediante síntesis en fase sólida usando
disulfuro de tetraetiltiuramo. Las formas de fosforoditioato
modificadas en las que X e Y son ambos S pueden obtenerse según una
síntesis en fase sólida, por ejemplo, convirtiendo bisamiditos en
tioamiditos y permitiendo que el azufre actúe sobre los tioamiditos.
Las formas de fosforoamidato modificadas en las que X es una amina
primaria o secundaria pueden obtenerse según una síntesis en fase
sólida, por ejemplo, tratando hidrogenofosfonatos con una amina
primaria o secundaria; alternativamente, pueden obtenerse oxidando
amiditos con peróxido de terc-butilhidrógeno.
La purificación y la garantía de la pureza
pueden llevarse a cabo mediante una cromatografía líquida de alta
velocidad o una electroforesis en gel de poliacrilamida. La
confirmación de los pesos moleculares puede llevarse a cabo mediante
espectrometría de masas de ionización por electropulverización o
espectrometría de masas de bombardeo rápido de átomos.
Los derivados de oligonucleótidos antisentidos
usados en esta invención actúan sobre un receptor CXCR4 o un ligando
del mismo, así como sobre las células que producen una sustancia
señalizadora basada en el CXCR4, y se unen al ADN o al ARN que
codifica para el péptido, inhibiendo así su transcripción o su
traducción, o promoviendo la descomposición del ARNm; como
resultado, poseen un efecto inhibidor sobre la acción debida al
CXCR4 suprimiendo la expresión del péptido.
Consecuentemente, los oligonucleótidos
antisentido usados en esta invención tienen utilidad para inhibir la
neovascularización. Los inhibidores de la neovascularización que
comprenden los oligonucleótidos antisentidos de esta invención son
útiles como agentes terapéuticos para cánceres, particularmente
cánceres sólidos.
La preparación de vectores antisentidos para el
CXCR4 puede seguir los procedimientos que se usan habitualmente.
Específicamente, el ADNc que codifica para el
CXCR4 se conecta a un vector de AAV (vector de virus adenoasociado),
un vector de MLV (vector de virus de la leucemia murina), un vector
de VIH, o similares, en la dirección antisentido. Por "dirección
antisentido" se entiende la conexión al lado 3' del ADNc que se
va a introducir hacia 3' del promotor. Los ARN antisentidos
sintetizados a partir de los ADNc contenidos en estos vectores
suprimen constitutivamente la expresión del CXCR4 en los
húespedes.
Los ADN o los ARN antisentidos pueden
introducirse en las células usando medios tales como el
procedimiento del liposoma, el procedimiento del liposoma HVJ o el
procedimiento del liposoma cargado positivamente. La introducción de
un ADN o ARN antisentido del CXCR4 permite la inhibición
constitutiva de la expresión del CXCR4.
(4) Para la sustancia que inhibe la expresión
del propio SDF-1 frente al CXCR4, se menciona una
sustancia antisentido que inhibe la expresión del
SDF-l y una sustancia que inhibe el sitio de control
de la expresión, tal como un promotor.
Los anticuerpos descritos anteriormente que
pueden usarse en esta invención, tales como los anticuerpos
anti-SDF-1 y los anticuerpos
anti-CXCR4, pueden prepararse como anticuerpos
policlonales o monoclonales usando técnicas que son conocidas en la
materia. Especialmente se prefieren los anticuerpos monoclonales
derivados de mamíferos como los anticuerpos que se usan en la
invención. Los anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos
incluyen aquellos producidos por hibridomas y aquellos producidos
por los huéspedes que han sido transformados con vectores de
expresión que contienen los genes del anticuerpo mediante técnicas
de ingeniería genética. Estos anticuerpos son aquellos que poseen
las propiedades mencionadas anteriormente.
Los hibridomas productores de anticuerpos pueden
prepararse principalmente usando técnicas conocidas en la materia de
la siguiente forma. Es decir, se usa un antígeno deseado como el
antígeno sensibilizante para llevar a cabo la inmunización según un
procedimiento de inmunización convencional; y las células
inmunizadas resultantes se fusionan con células parentales conocidas
en la técnica mediante un procedimiento de fusión celular
convencional, y las células productoras de anticuerpos monoclonales
se someten a una clonación mediante un procedimiento de clonación
convencional.
Los mamíferos que se van a inmunizar con el
antígeno sensibilizante no están particularmente limitados, pero
deberían seleccionarse preferiblemente teniendo en cuenta su
compatibilidad con las células parentales que se van a usar en la
fusión celular. Generalmente se usan animales pertenecientes a la
familia de los roedores, tales como ratones, ratas y hámsteres. La
inmunización de los animales con el antígeno sensibilizante se lleva
a cabo mediante un procedimiento conocido en la técnica.
Para las células de mieloma de mamífero usadas
como las otras células parentales para la fusión con los
immunocitos, puede emplearse apropiadamente una variedad de líneas
celulares ya conocidas en la materia. La fusión celular entre los
immunocitos y las células de mieloma puede llevarse a cabo
básicamente según un procedimiento convencional, tal como el
procedimiento de Milstein y col. (Kohler, G. y Milstein, C., Methods
Enzymol., 73, 3-46 (1981)) con cualquier
modificación posible.
Los hibridomas obtenidos se eligen cultivando en
un medio de selección común, tal como medio HAT (un medio que
contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en el
medio HAT continúa durante un tiempo suficiente para permitir la
destrucción de todas las células diferentes a los hibridomas
objetivo (las células no fusionadas), que es habitualmente desde
unos pocos días hasta unas pocas semanas. Entonces se realiza el
procedimiento de dilución limitante habitual para cribar y clonar
los hibridomas productores de los anticuerpos objetivo. Los
anticuerpos pueden obtenerse a partir de los hibridomas así
obtenidos siguiendo un procedimiento que se emplea
habitualmente.
Además de la adquisición de los hibridomas
mediante la inmunización de un animal distinto a un ser humano con
el antígeno según se describió anteriormente, los linfocitos humanos
son sensibilizados in vitro con una proteína de antígeno o
una célula que expresa el antígeno deseadas, y los linfocitos B
sensibilizados se fusionan con las células de mieloma humano, tales
como U266, mediante lo cual pueden obtenerse los anticuerpos
humanizados deseados que poseen la actividad de unión hacia el
antígeno o la célula que expresa el antígeno deseados.
Adicionalmente, los anticuerpos humanizados deseados pueden
obtenerse según el procedimiento mencionado anteriormente
administrando el antígeno o la célula que expresa el antígeno a un
animal transgénico con un repertorio de genes de anticuerpos
humanos.
Se clona un gen del antígeno como un anticuerpo
monoclonal a partir del hibridoma y se incorpora en un vector
adecuado; y éste se introduce en un hospedador, y se usa la
tecnología de manipulación génica para producir un anticuerpo
recombinante, que puede ser usado entonces en esta invención. Véase,
por ejemplo, Carl, A. K. Borrenbaeck, James, W. Larrick, Therapeutic
Monoclonal Antibodies, publicado en el Reino Unido por Macmillan
Publishers Ltd. 1990.
En esta invención pueden usarse los anticuerpos
recombinantes que han sido modificados artificialmente con el
propósito de reducir la antigenicidad heterogénea frente al ser
humano, tales como anticuerpos quiméricos (publicación de patente
europea EP125023) y anticuerpos humanizados (publicación de patente
europea EP125023). Estos anticuerpos pueden producirse mediante
procedimientos conocidos.
El anticuerpo quimérico comprende la región
variable de un anticuerpo procedente de un mamífero distinto a un
ser humano, y la región constante (región C) procedente de un
anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado comprende una región
determinante de la complementariedad de un anticuerpo procedente de
un mamífero distinto a un ser humano, una región marco (FR)
procedente de un anticuerpo humano y una región C. Son útiles como
los ingredientes eficaces en esta invención debido a la
antigenicidad disminuida en el cuerpo humano.
Los anticuerpos usados en esta invención pueden
ser fragmentos de un anticuerpo o sustancias modificadas del mismo,
siempre que puedan usarse de forma deseable en la invención. Los
fragmentos del anticuerpo incluyen, por ejemplo Fab,
F(ab')_{2}, Fv, y una cadena simple Fv (scFv) obtenible
mediante la conexión del Fv de la cadena H y el Fv de la cadena L
mediante un conector adecuado. Específicamente, se trata un
anticuerpo con una enzima, tal como papaína o pepsina, para producir
fragmentos del anticuerpo. Alternativamente se construyen genes que
codifican para estos fragmentos de anticuerpo, y se introducen en un
vector de expresión, tras lo cual son expresados en células huésped
adecuadas.
Puede utilizarse el procedimiento de la
biblioteca de fagos para obtener los anticuerpos que se usan en esta
invención. (Marks, C. y col., The New England Journal Medicine 335,
730-733). Por ejemplo, se obtiene una biblioteca de
ADNc a partir de linfocitos B humanos que comprende una región V de
un anticuerpo humano, tal como el gen que codifica para el scFv.
Esta biblioteca de ADNc se introduce en un vector fago, tal como el
vector presentador de superficie del fago M13, y se deja que infecte
a E. coli. La biblioteca de ADNc es expresada en E.
coli, y la región V del anticuerpo es producida en las
superficies de la célula. Si se realiza unaselección en una placa
recubierta con el antígeno deseado basada en la actividad de unión
del antígeno, puede obtenerse un gen que codifique para el
anticuerpo deseado.
Pueden obtenerse anticuerpos que posean una
actividad de unión más fuerte a los antígenos mediante el
procedimiento de intercambio de cadenas con la aplicación del
procedimiento de la biblioteca de fagos. (Akamatsu, Y. y Tsurushita,
N. Medical Immunology 27, 273-286 (1994)).
Específicamente, se fija un miembro de la región V de un gen de un
anticuerpo que ha sido separado (tal como VH); y se construye una
nueva biblioteca a partir de la mezcla del primer miembro y del otro
miembro preparada a partir de linfocitos B (tal como VL).
Los clones que se unen al antígeno más
fuertemente que los demás pueden ser separados de la biblioteca.
También es posible obtener anticuerpos que
posean una actividad de unión más fuerte a los antígenos
introduciendo mutaciones artificiales en las secuencias de
aminoácidos de los anticuerpos. (Akamatsu, Y. y Tsurushita, N.
Medical Immunology 27, 273-286 (1994)).
Más específicamente, la mutación es introducida
en un gen que codifica para la región V del anticuerpo clonado, y
este gen es expresado mediante el procedimiento de la biblioteca de
fagos descrito anteriormente. Como consecuencia, resulta posible
obtener un gen que codifica para el anticuerpo que posee una
actividad de unión más fuerte al antígeno.
Estos fragmentos de anticuerpo pueden ser
producidos por hospedadores después de que sus genes sean obtenidos
y expresados de la misma forma a la descrita previamente,
anteriormente. Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"anticuerpo" engloba estos fragmentos de anticuerpo.
Las formas modificadas de anticuerpo pueden
emplear anticuerpos que estén unidos a diversas moléculas tales como
polietilenglicol (PEG). Según se usa en la presente memoria
descriptiva, el "anticuerpo" engloba estas formas modificadas
de anticuerpo. La obtención de estas formas modificadas de
anticuerpo puede realizarse sometiendo los anticuerpos obtenidos a
una modificación química.
Estos procedimientos ya han sido establecidos en
la técnica.
Los anticuerpos que son expresados y producidos
según se describió anteriormente pueden ser separados de las células
huésped intracelular o extracelularmente, y pueden ser purificados
hasta la homogeneidad según los procedimientos que se usan
habitualmente. La medida de la concentración puede llevarse a cabo
mediante la medida de la absorbancia, ELISA o similares.
Para el inhibidor del CXCR4 usado en esta
invención, se menciona una proteína con una estructura similar al
SDF-1 o al CXCR4 (proteína de semejanza
estructural). Esta sustancia es aquella que posee actividad de unión
al SDF-1 o al CXCR4 y que no transmite su actividad
biológica. Esto es, bloquea la señalización del
SDF-1 porque se une al CXCR4 de una forma
competitiva con el SDF-1, pero no transmite la
actividad biológica del SDF-1.
Las proteínas de semejanza estructural con el
SDF-1 pueden prepararse introduciendo mutaciones en
la secuencia de aminoácidos del SDF-1 mediante la
sustitución de restos de aminoácidos en la misma. Para el
SDF-1 sobre el que se basan las proteínas de
semejanza estructural con el SDF-1, su origen no
importa; sin embargo, se prefiere que sea SDF-1
humano teniendo en cuenta su antigenicidad o similares.
Específicamente, la secuencia de aminoácidos del
SDF-1 se usa para predecir su estructura secundaria
usando un programa de modelado molecular conocido en la técnica, tal
como WHATIF (Vriend y col., J. Mol. Graphics 8,
52-56 (1990)); y además, para llevar a cabo la
preparación se evalúa la influencia sobre el todo del resto de
aminoácido que es sustituido.
Después de que se haya determinado un resto de
aminoácido adecuado que se va a sustituir, se usa un vector que
contiene la secuencia de bases que codifica para el gen del
SDF-1 humano como plantilla, y la introducción de la
mutación se lleva a cabo mediante el procedimiento de la PCR
(reacción en cadena de la polimerasa), que se realiza habitualmente,
de forma que el aminoácido pueda ser sustituido. Esto permite
obtener un gen que codifica para la proteína de semejanza
estructural con el SDF-1. Este gen es incorporado en
un vector de expresión adecuado según corresponda, y la proteína de
semejanza estructural con el SDF-l puede obtenerse
según los procedimientos de expresión, producción y purificación de
los anticuerpos recombinantes según se describió previamente. El
SDF-1 cuyo N terminal ha sido delecionado se conoce
como una proteína de semejanza estructural con el
SDF-l (EMBO J. 16, 6996-7007
(1997)).
El péptido parcial del SDF-1 o
el péptido parcial del CXCR4 que se usa en esta invención es una
sustancia que posee una actividad de unión al CXCR4 o al
SDF-1 y que no transmite la actividad biológica del
SDF-1. Esto es, el péptido parcial del
SDF-1 o el péptido parcial del CXCR4 inhibe
específicamente la unión del SDF-1 al CXCR4, porque
cada uno se une al CXCR4 o al SDF-1 y captura a
cualquiera de ellos.
Consecuentemente, bloquean la señalización del
SDF-l porque no transmiten la actividad biológica
del SDF-1.
El péptido parcial del SDF-1 o
el péptido parcial del CXCR4 es un péptido que comprende una parte o
la totalidad de la secuencia de aminoácidos de la región, que es
responsable de la unión entre el SDF-1 y el CXCR4,
de la secuencia de aminoácidos del SDF-1 o del
CXCR4. Dicho péptido comprende habitualmente 10-80
restos de aminoácidos, preferiblemente 20-50 restos
de aminoácidos, y más preferiblemente 20-40 restos
de aminoácidos.
El péptido parcial del SDF-1 o
el péptido parcial del CXCR4 puede prepararse identificando, en la
secuencia de aminoácidos del SDF-1 o del CXCR4, la
región que es responsable de la unión entre el SDF-1
y el CXCR4, y preparando una parte o la totalidad de la secuencia de
aminoácidos de dicha región según un procedimiento que se conoce
habitualmente, tal como una técnica de ingeniería genética o de
síntesis de péptidos.
Para preparar el péptido parcial del
SDF-1 o el péptido parcial del CXCR4 mediante la
técnica de ingeniería genética, se incorpora en un vector de
expresión una secuencia de ADN que codifica para el péptido deseado,
y se siguen los procedimientos para la expresión, la producción y la
purificación de los anticuerpos recombinantes según se describió
previamente con cualquier modificación posible, permitiendo así la
preparación.
Para preparar el péptido parcial del
SDF-1 o el péptido parcial del CXCR4 mediante una
síntesis peptídica, pueden emplearse procedimientos que se usan
habitualmente en la síntesis peptídica, tales como la síntesis en
fase sólida o la síntesis en fase líquida. Concretamente, puede
seguirse el procedimiento según se describe en ``Development of
Drugs, Peptide Synthesis Vol. 14, Ed. por Nariaki Yajima, Hirokawa
Publisher (1991), con cualquier modificación posible. Para la
síntesis en fase sólida se emplea, por ejemplo, el siguiente
procedimiento: se deja que un aminoácido correspondiente al C
terminal del péptido que se va a sintetizar se una a un soporte
insoluble en un disolvente orgánico; y la reacción en la que un
aminoácido protegido con grupos protectores adecuados en su grupo
amino \alpha y el grupo funcional de la cadena lateral está
condensado con el aminoácido anterior, un aminoácido cada vez en la
dirección desde el C terminal hacia el N terminal, y la reacción
para desprender el grupo protector del grupo amino \alpha del
aminoácido o del péptido unido a la resina se repiten
alternativamente para prolongar la cadena peptídica. La síntesis
peptídica en fase sólida se clasifica ampliamente en el
procedimiento Boc y el procedimiento Fmoc, dependiendo del tipo de
grupos protectores que se vaya a usar.
Después de que el péptido objetivo se haya
sintetizado de esta forma, se realiza la reacción de desprotección,
y el péptido es liberado del soporte por la cadena peptídica. En la
reacción de liberación de la cadena peptídica, el procedimiento Boc
puede emplear habitualmente fluoruro de hidrógeno o ácido
trifluorometanosulfónico, y el procedimiento Fmoc puede emplear
habitualmente TFA. En el procedimiento Boc, la resina peptídica
protegida mencionada anteriormente se trata, por ejemplo, con
fluoruro de hidrógeno en presencia de anisol. Seguidamente, la
desprotección del grupo protector y la liberación del soporte
recuperan el péptido.
El producto se liofiliza para dar un péptido en
bruto. En el procedimiento Fmoc, la reacción de desprotección y la
reacción de liberación del soporte por la cadena peptídica también
pueden llevarse a cabo en TFA usando unas manipulaciones similares a
las mencionadas anteriormente.
El péptido en bruto resultante puede separarse y
purificarse aplicándolo a una HPLC. La elución puede llevarse a cabo
entonces en condiciones óptimas con un disolvente del sistema
agua-acetonitrilo, que se usa habitualmente para
purificar proteínas. Las fracciones correspondientes a los picos del
perfil de cromatografía obtenido se separan de forma fraccionada y
se liofilizan. Las fracciones peptídicas así purificadas se
identifican mediante un análisis del peso molecular a través de una
espectrometría de masas, un análisis de la composición de
aminoácidos, una secuenciación de aminoácidos o similares.
Para el péptido parcial del
SDF-1 o el péptido parcial del CXCR4 que se usa en
esta invención, su secuencia no es importante siempre que cada uno
se una al CXCR4 o al SDF-1 y no posea actividad
señalizadora.
Pueden usarse secuencias de aminoácidos ya
conocidas tanto para el péptido parcial del SDF-1
como el péptido parcial del CXCR4. Por ejemplo, cuando el ligando es
SDF-1, son utilizables las secuencias de aminoácidos
que se establecen en la ID. SEC. Nº: 5 (hombre) y la ID. SEC. Nº: 7
(ratón).
Según se explicó anteriormente, el uso del
inhibidor de la vascularización según esta invención comprende el
inhibidor del CXCR4 como el ingrediente eficaz que permite la
inhibición de la vascularización; por lo tanto, ejercerá un efecto
antitumoral (inhibición de la neovascularización) sobre cánceres
sólidos, además de efectos antitumorales sobre elangiosarcoma
(cáncer de los propios vasos sanguíneos) y el sarcoma de Kaposi.
También ejercerá efectos terapéuticos contra enfermedades causadas
patológicamente por una neovascularización, tales como artritis
reumatoide, psoriasis y retinopatía diabética.
Si se usa el agente terapéutico que comprende la
sustancia que potencia la acción del CXCR4 para una enfermedad
causada patológicamente por una neovascularización, será posible
promover la neovascularización. El uso ejercerá efectos terapéuticos
sobre el infarto de miocardio y enfermedades que implican una
neovascularización tras una cirugía, tales como la cicatrización de
heridas, la reparación y el remodelado de huesos, la reparación del
cartílago, el crecimiento del pelo, el infarto de miocardio, el
infarto cerebral y el traumatismo cerebral.
Para los procedimientos de prueba de inhibición
y promoción de la neovascularización que pueden usarse en esta
invención puede emplearse un ensayo de neovascularización. No hay
ninguna limitación en particular para este ensayo, y puede usarse
preferiblemente un procedimiento que es habitualmente conocido.
("Research Manual for the Invasion and Metastasis of Cancers"
the Cancer Metastasis Study Group Ed., Kinhodo,
159-182, (1994)). Específicamente se mencionan,
entre otros, (I) el procedimiento para medir la segmentación de los
espacios entre las células endoteliales vasculares (es decir, el
efecto sobre las células endoteliales vasculares), que se basa en el
descubrimiento de que las células endoteliales vasculares se rompen
cuando las células tumorales salen fuera de los vasos sanguíneos (a
partir de la permeabilidad del FITC dextrano); (II) el procedimiento
de la cornea, conocido como un procedimiento de medición in
vivo para identificar un factor candidato que ejerza la función
de un factor inductor de la neovascularización in vivo; (IV)
el procedimiento CAM (membrana corioalantoidea de embrión de pollo);
(V) el procedimiento de la subcutánea dorsal para medir la cantidad
de vasos sanguíneos inducidos a simple vista; y (VI) el
procedimiento para determinar la formación de lumen por parte de las
células endoteliales vasculares.
Para confirmar el efecto antitumoral, pueden
mencionarse experimentos in vivo usando un modelo de
transplante o un modelo de metástasis de transplante y experimentos
in vitro con células cancerosas. Específicamente, puede
usarse el procedimiento descrito en "Research Manual for the
Invasion and Metastasis of Cancers" the Cancer Metastasis Study
Group Ed., Kinhodo, 7-158 (1994).
El inhibidor de la vascularización, el agente
antineoplásico, el agente terapéutico, según esta invención, puede
administrarse sistémicamente (por vía oral) o localmente. Por
ejemplo, puede elegirse una inyección intravenosa (tal como una
infusión intravenosa por goteo), una inyección intramuscular, una
inyección intraperitoneal o una inyección subcutánea: puede elegirse
un procedimiento de administración adecuado dependiendo de la edad o
la gravedad del sujeto.
La dosis unitaria eficaz se elige en el
intervalo de de 0,09 mg hasta 100 mg por kg de peso corporal.
Alternativamente, puede elegirse una dosis de
1-1000 mg, preferiblemente una dosis de
5-50 mg para el sujeto.
El inhibidor de la vascularización, el agente
antineoplásico, el agente terapéutico, según esta invención, puede
contener conjuntamente vehículos o aditivos farmacéuticamente
aceptables, dependiendo de la vía de administración. Algunos
ejemplos de dichos vehículos y aditivos incluyen agua, disolventes
orgánicos que sean farmacéuticamente aceptables, colágeno, alcohol
polivinílico, polivinilopirrolidona, polímero de carboxivinilo,
carboximetilcelulosa sódica, poliacrilato sódico, arginato sódico,
dextrano soluble en agua, carboximetilalmidón sódico, pectina,
metilcelulosa, goma xantana, goma arábiga, caseína, gelatina, agar,
diglicerina, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, parafina,
alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina sérica humana (HSA),
manitol, sorbitol, lactosa, tensioactivos que sean aceptados como
aditivos para fármacos, etc.
Los aditivos que se van a usar pueden
seleccionarse apropiadamente (o en combinación) entre aquellos
mencionados anteriormente dependiendo de la forma de dosificación,
pero no se limitan a los mismos.
Esta invención se ilustrará a continuación con
mayor detalle mediante ejemplos.
Se aisló un ADN genómico que contenía el locus
del CXCR4 a partir de una biblioteca de ADN de la línea celular
murina 129 (STRATAGENE).
Se sustituyó un fragmento genómico de 1,1 kb que
contenía la región codificante 5' del exón 2 por un gen resistente a
la neomicina, y se ligó el gen de la cinasa de timidina del herpes
simple al 5' terminal.
El vector marcador se introdujo en las células
el día 14.1 de la embriogénesis (denominado en lo sucesivo
"E14.1") mediante electroporación, y se seleccionó una
recombinación homóloga usando G418 y ganciclovir, y se identificó
mediante PCR.
La estructura del locus mutante y la presencia
de un único inserto en la colonia de células ES fueron confirmadas
mediante una hibridación Southern. Según el procedimiento descrito
en Nagasawa, T. y col., Nature 382, 685-688 (1996),
se usó la colonia de células ES mutantes para crear un ratón mutante
mediante la inyección de células embrionarias no diferenciadas.
Mediante hibridación Southern se digirió la cola
de ADN con EcoRI, se transfirió a una membrana de nailon y se
hibridó con una sonda A de 550 pb con la región 5' homóloga.
Se realizó una RT-PCR durante 40
ciclos, usando 3 \mug del ARN total aislado del hígado fetal de
los embriones E18.5 como material de partida, según el procedimiento
convencional. Se amplificó un producto de PCR de 630 pb usando
cebadores específicos para CXCR4, es decir, un cebador directo (ID.
SEC. Nº: 11) y un cebador inverso (ID. SEC. Nº: 12). Se llevaron a
cabo un análisis histológico y un análisis por citometría de flujo,
sustancialmente según el procedimiento descrito en Nagasawa, T. y
col., Nature 382, 685-688 (1996).
La inmunohistotinción siguió sustancialmente el
procedimiento de Adachi, S., Yoshida, H., Kataoka, H. Nishikawa,
S.-I. Int. Immunol. 9, 507-514. Las secciones de los
embriones y órganos se fijaron con paraformaldehído al 4%, se
deshidrataron con metanol, se decoloraron con peróxido de hidrógeno
al 30% en metanol, y se hidrataron de nuevo.
Después de incubar en PBSMT (PBS que contiene
leche en polvo desnatada al 1% y un 0,3% v/v de Triton
X-100), la muestra se incubó con anticuerpo
anti-PECAM diluido (1:250) (PharMingen) en PBSMT a
4°C hasta el día siguiente. Entonces la muestra se lavó con PBSMT y
se incubó con anticuerpo Ig anti-rata marcado con
peroxidasa de rábano diluido (1:500) (Biosource) en PBST a 4°C
durante toda la noche.
A continuación la muestra se lavó
exhaustivamente. El embrión se incubó en PBS que contenía 250
\mug/ml de diaminobencidina (Dojin Chemicals) y NiCl_{2} al
0,08% durante 30 min. Se añadió peróxido de hidrógeno a la muestra
para proporcionar una concentración final del 0,01%, tras lo cual se
llevó a cabo la tinción con peroxidasa. La reacción se inactivó
después de aproximadamente 30 min.
Según el procedimiento descrito en Nagasawa, T.
y col., Nature 382, 685-688 (1996), se usó un
fragmento de ADNc de CXCR4 o de PBSF/SDF-1 murino
como sonda para llevar a cabo la transcripción antisentido.
Se crearon ratones carentes de CXCR4 para
determinar la función fisiológica del CXCR4. Específicamente se
construyó un vector marcador, de forma que la mayoría del exón 2 del
gen de CXCR4 que contenía todas las regiones transmembranales
críticas para la función del receptor había sido delecionada, y la
porción delecionada sería sustituida por un gen de resistencia a la
neomicina (neo). Esto daría como resultado que, tras una
recombinación homóloga, todo el gen del CXCR4 había sido
sustancialmente delecionado.
La Fig. 1 es un gráfico que muestra una
estrategia de marcaje para el gen del CXCR4 (denotado como superior,
central e inferior). Se muestran el alelo natural de CXCR4 en la
parte superior, un vector marcador en el centro y un alelo mutante
predicho en la parte inferior. Las regiones codificantes de los
genes están indicadas mediante recuadros negros. Los recuadros
vacíos indican las regiones 5' y 3' no traducidas. Las líneas de
puntos indican fragmentos homólogos usados en el vector marcador. La
sonda A es una sonda externa para la hibridación Southern. Aquí, los
sitios de restricción son E (EcoRI), Sh (SphI) y X (XhoI),
respectivamente.
La Fig. 2A es una fotografía que muestra el
análisis por inmunotransferencia Southern de las colas de ADN de
ratones de tipo natural (+/+) y heterocigotos mutantes (+/-). En la
figura se muestran los fragmentos EcoRI-EcoRI del
alelo de tipo natural de 11,8 kb y marcado de 8,2 kb que fueron
identificados mediante la sonda A. La Fig. 2B es una fotografía que
muestra el análisis de amplificación mediante RT-PCR
de la expresión del CXCR4. Se prepararon ARN totales a partir de
embriones naturales E18.5 y homocigotos mutantes, y se amplificaron
con cebadores específicos para CXCR4. La amplificación mediante
RT-PCR empleó ARNm G3PDH, que se expresaba
universalmente, como control de la presencia de cualquier ARN
amplificable.
Se crearon ratones con una mutación heterocigota
CXCR4^{+/-}. Los ratones estaban sanos y eran fértiles. Los
embriones homocigotos mutantes CXCR44 están presentes en las
proporciones esperadas hasta E15.5 de la embriogénesis. Sin embargo,
aproximadamente la mitad de los embriones CXCR4^{-/-} murieron en
E18.5 y los neonatos CXCR4^{-/-} murieron en una hora, de forma
similar a los ratones que carecían de PBSF/SDF-1,
según se informó previamente (Nagasawa, T. y col., Nature 382,
685-688 (1996)).
Para elucidar las funciones del CXCR4 durante la
embriogénesis, se examinó la expresión del CXCR4 en embriones en
desarrollo mediante una hibridación in situ. Se detectaron
altos niveles de transcritos de CXCR4 en el endotelio de los vasos
sanguíneos en desarrollo durante la embriogénesis.
Basándose en este descubrimiento, se investigó
el efecto de la deficiencia del gen del CXCR4 sobre la
vascularización. En una inspección visual, los vasos vitelinos y
umbilicales eran normales. El examen histológico de los embriones
E18.5 CXCR4^{-/-} mostró la presencia de los principales vasos
sanguíneos, incluyendo la aorta, la vena cava, la arteria carótida,
la vena yugular, la arteria celíaca y la arteria mesentérica
superior y la vena mesentérica superior. Para visualizar el sistema
vascular de los órganos se inmunotiñeron entonces preparaciones
completas de embriones naturales y mutantes con un anticuerpo
anti-PECAM-1. Se sabe que
PECAM-1 se expresa específicamente y de forma
estable en todas las células endoteliales durante el periodo
embrionario. (Vecchi, A. y col. Eur. J. cell Biol. 63,
247-255 (1994); Baldwin, H. S. y col., Development
120, 2539-2558 (1994)).
Consecuentemente, en el tracto gastrointestinal,
incluyendo el estómago, el intestino y el mesenterio, se observó una
red vascular homogénea altamente ramificada, tanto en el de tipo
natural como en el mutante, alrededor de E11.5. Se observó la
formación de vasos sanguíneos grandes y pequeños mediante un
remodelado en el mesenterio, que conectaban con el asa intestinal
media aproximadamente en E12.5. Como muestra la Fig. 3, se formaron
muchas grandes ramificaciones de la arteria y la vena mesentérica
superior que aportaban nutrientes al intestino en los embriones
naturales en E13.5. Por otro lado, estas grandes ramificaciones no
estaban presentes en los mesenterios de los embriones CXCR4^{-/-}
en E13.5; en su lugar sólo se formaron vasos pequeños. El análisis
histológico al microscopio reveló arterias y venas mesentéricas
superiores en los mesenterios de los embriones naturales en E13.5.
Esto demostró que los vasos ramificados estaban duplicados entre la
arteria y la vena (Fig. 4). Por el contrario, la mayoría de los
vasos de los embriones CXCR4^{-/-} no estaban duplicados, sino que
eran simples, como puede observarse en la Fig. 8. Sin embargo, las
arterias y venas mesentéricas superiores de los mesenterios
embriones de tipo natural eran normales. En los embriones de tipo
natural E17.5, los grandes vasos mesentéricos se dividen en varias
ramas y alcanzan el intestino (Figs. 5 y 6). Sin embargo, en los
embriones CXCR4^{-/-} dichos vasos, correspondientes a los grandes
vasos mesentéricos, estaban sustancialmente ausentes (Figs. 6 y 9).
También se observaron unos pocos grandes vasos con ramificaciones
aberrantes en los mesenterios mutantes (Figs. 6 y 9). En la mayoría
de los embriones mutantes E16.5 se observaron múltiples lesiones
hemorrágicas en sus intestinos delgados debidas a dicho sistema
vascular defectuoso. Se cree que esta patogenia es el resultado de
una aberración del sistema circulatorio que domina el
intestino
(Fig. 11).
(Fig. 11).
Los resultados mencionados anteriormente han
demostrado que el CXCR4 es esencial para la normal vascularización
de intestino delgado: se cree que el mecanismo es debido a que el
CXCR4 está implicado en la ramificación y/o el remodelado de los
vasos mesentéricos.
En el estómago se formaron grandes vasos que se
ramificaban desde los vasos mesenquimatosos a lo largo de la
curvatura menor, y se distribuyeron por toda la superficie ventral y
dorsal en los embriones de tipo natural en E13.5 (Figs. 12A y 12C).
El análisis histológico reveló que estos vasos estaban ubicados
entre la arteria y la vena en el ratón de tipo natural E15.5, según
muestra el inserto de la Fig. 12 C. Sin embargo, no se encontraron
los correspondientes vasos en los embriones mutantes (Figs. 12B y
12D). La formación de la red de pequeños vasos que rodea al estómago
parecía ser normal en los embriones mutantes (Fig. 12D).
El análisis histológico de los estómagos y los
intestinos de los embriones mutantes E18.5 no detectó anomalías
evidentes en la organogénesis. Por ejemplo, las capas musculares
lisas (tanto la capa externa como la interna) del tracto
gastrointestinal de los ratones mutantes parecían ser normales en
las direcciones longitudinal y vertical.
Las Figs. 3-6 son fotografías
que muestran los defectos de los vasos gastrointestinales en los
embriones CXCR4^{-/-}, y también fotografías que muestran la
inmunohistotinción de los mesenterios y los intestinos de tipo
natural con el anticuerpo anti-PECAM. La Fig. 3
muestra las regiones del mesenterio y del asa intestinal media en
E13.5. La Fig. 5 muestra un yeyuno en E17.5. La Fig. 6 muestra un
yeyuno en E17.5. La Fig. 7 muestra un corte transversal del
mesenterio teñido en E13.5. Las flechas de las Figs. 3, 5 y 6
indican grandes ramificaciones de la arteria mesentérica superior o
de la vena mesentérica superior que aportan nutrientes al intestino
delgado en los mesenterios de tipo natural.
De forma similar, las Figs. 7-11
son fotografías que muestran los defectos de los vasos
gastrointestinales en los embriones CXCR4^{-/-}, y también
fotografías que muestran la inmunohistotinción de los mesenterios y
los intestinos de los mutantes con el anticuerpo
anti-PECAM. La Fig. 7 muestra las regiones del
mesenterio y del asa intestinal media en E13.5. La Fig. 9 muestra un
yeyuno en E17.5. Fig. 10 muestra un yeyuno en E17.5. La Fig. 7
muestra un corte transversal del mesenterio teñido en E13.5. La Fig.
11 muestra las lesiones hemorrágicas del intestino sin teñir de un
ratón mutante en E16.5. Las flechas de las Figs. 9 y 10 indican
grandes vasos que muestran un recorrido y/o ramificaciones
aberrantes en los ratones mutantes.
Las Figs. 12A-12D son
fotografías que muestran los resultados de la inmunohistotinción de
los estómagos con el anticuerpo anti-PECAM. Las
Figs. 12A y 12B muestran E13.5; las Figs. 12C y 12D muestran E15.5;
las Figs. 12A y 12C muestran los tipos naturales; y las Figs. 12B y
12D muestran los mutantes. El inserto en la fotografía de la Fig.
12C muestra una sección teñida con hematoxilina y eosina de grandes
vasos en la pared de un estómago teñido en E15.5. Las flechas de las
Figs. 12A y 12C indican grandes vasos observados únicamente en el
mutante. "du" representa duodeno; "p" representa la parte
proximal del asa intestinal media; "dm" representa la parte
distal del asa intestinal media; "a" representa arteria; y
"v" representa vena.
Estos descubrimientos indican que las anomalías
en la vascularización de los ratones CXCR4^{-/-} no son una
consecuencia secundaria de las de los propios tractos
gastrointestinales. También se observaron anomalías similares a las
de la vascularización en los ratones que carecían de
PBSF/SDF-l.
El análisis de hibridación in situ indicó
que los transcritos de CXCR4 se expresaban en las células
endoteliales de los vasos sanguíneos en el mesenterio y en la pared
del intestino y el estómago en los embriones de tipo natural E12.5
(Figs. 13B y 13E). Particularmente, se observó una fuerte expresión
en las células endoteliales de las ramificaciones que surgían de las
arterias mesentéricas superiores (Figs. 13B y 13E). Por el
contrario, se expresaban altos niveles de PBSF/SDF-1
en las células mesenquimatosas que rodean a las células endoteliales
del mesenterio, pero no en las células endoteliales o de la pared
del intestino en el estómago (Fig. 13C).
Las Figs. 13A-13F son
fotografías que muestran un análisis de la expresión de CXCR4 y de
PBSF/SDF-1 en el tracto gastrointestinal mediante
una hibridación in situ. Se usaron cortes sucesivos del
mesenterio de tipo natural que conectaba con el asa intestinal
media; una porción se tiñó con hematoxilina y eosina (Figs. 13A y
13D); otra porción se hibridó con la sonda específica para CXCR4
(Figs. 13B y 13E); una porción adicional se hibridó con la sonda
específica para PBSF/SDF-1 (Fig. 13E). Las Figs. 13D
y 13E son ampliaciones de los vasos ramificados que surgen de la
arteria mesentérica superior mostrada en las Figs. 13A y 13B,
indicando una fuerte expresión de CXCR4 en las células endoteliales
del vaso. Las flechas y las cabezas de flecha de las Figs. 13B y 13E
indican las células industriales de los vasos sanguíneos
mesentéricos con la expresión observada del CXCR4. El
PBSF/SDF-1 es expresado en las células
mesenquimatosas que rodean a las células endoteliales del mesenterio
(Fig. 13E). La Fig. 13F es un corte transversal de la médula ósea
del embrión de tipo natural E18.5, que muestra la expresión del
CXCR4 en células hematopoyéticas, pero no en células estromales
fusiformes. "m" representa mesenterio; "i" representa
intestino; "a" representa arteria mesentérica superior; y
"v" representa vena mesentérica superior.
Los patrones de expresión obtenidos indican que
el PBSF/SDF-1 producido por las células
mesenquimatosas actúa sobre el CXCR4 de las células endoteliales; y
esto sugiere fuertemente la presencia de una señal paracrina por
parte de una citocina que juega un papel extremadamente importante
en el mesénquima mesentérico. Por lo tanto, el fenotipo que carece
de los grandes vasos en el estómago CXCR4^{-/-} y
PBSF/SDF-1^{-/-} puede ser el resultado de
anomalías en la ramificación y/o el remodelado vascular en el
mesénquima a lo largo de la curvatura menor del estómago.
Para examinar los sistemas vasculares de otros
órganos, se tiñeron preparaciones completas de saco vitelino,
cerebro y corazón con un anticuerpo monoclonal
anti-PECAM-1. No hubo una diferencia
evidente entre CXCR4^{-/-} y PBSF/SDF-1^{-/-}, y
el tipo natural en la formación de los grandes y pequeños vasos en
la preparación completa de saco vitelino (E12.5, E14.5), la región
de la cabeza (E11.5) y el corazón (E12.5-E14.5).
En resumen, los resultados experimentales
mencionados anteriormente han demostrado que CXCR4 y
PBSF/SDF-1 son esenciales para la formación de un
sistema vascular maduro que abastece al tracto gastrointestinal,
actuando sobre las células endoteliales de los vasos sanguíneos y
regulando la ramificación y/o el remodelado vascular.
Un análisis citométrico de flujo reveló que el
número de progenitores de linfocitos B en hígados fetales de ratones
CXCR4^{-/-} estaba gravemente reducido. El análisis histológico no
detectó mielocitos ni sus progenitores en la cavidad medular.
Además, se encontraron defectos en la porción membranosa del tabique
ventricular cardiaco en los corazones de los ratones mutantes E18.5.
Estas anomalías eran muy similares al fenotipo hallado en los
ratones que carecen de PBSF/SDF-1, lo que apoyaba la
creencia de que el CXCR4 es un receptor fisiológico primario para el
PBSF/SDF-1.
En la médula ósea embrionaria de tipo natural
E18.5, según se determinó mediante una hibridación in situ,
los transcritos de CXCR4 se expresaban en células hematopoyéticas,
mientras que no se expresaban en células estromales fusiformes, en
las se había observado la expresión de los transcritos de
PBSF/SDF-1 (Fig. 3D). Los resultados de estos
patrones de expresión indican la presencia de una señalización
paracrina en la médula ósea.
Los análisis de los receptores de las cinasas de
tirosina (RTC), tales como Flk-1 y
Tie-2, y sus ligandos, tales como VEGF,
angiopoyetina-1 y PDGF-B, de los que
se ha informado hasta la fecha, usando ratones mutantes, han
indicado que juegan un papel importante en el desarrollo del sistema
vascular, y que muchos de ellos son necesarios para la etapa más
temprana de vascularización en la génesis, así como para la
vascularización, de todas las partes del cuerpo, incluyendo el saco
vitelino y la vasculatura extraembrionaria. (Shalaby, F. y col.,
Nature 376, 62-66 (1995); Fong, G. H., Rossant, J.,
Gertsenstein, M. & Breitman, M. L., Nature 376,
66-70 (1995); Dumount, D. H. y col., Genes Dev 8,
1897-1909 (1994); Sato, T. N. y col., Nature, 376,
70-74 (1995); Carmeliet, P. y col., Nature, 880,
435-439 (1996); Ferrara, N. y col., Nature, 380,
439-442 (1996); y Suri, C. y col., Cell 87,
1171-1180 (1996)).
Por el contrario, las funciones de CXCR4 y de
PBSF/SDF-1 operan en etapas más tardías de la
génesis, y son específicas del órgano. Se cree que el
Tie-2 y su ligando, la
angiopoyetina-1, son necesarios para la ramificación
y/o el remodelado en el sistema vascular temprano. (Sato, T. N. y
col., Nature 376, 70-74 (1995); Suri, C. y col.,
Cell 87, 1171-1180 (1996)). Sus papeles en la
formación del sistema vascular maduro del tracto gastrointestinal no
están claros. Las evidentes anomalías encontradas en el sistema
vascular del saco vitelino vascular de ratones Tie-2
o angiopoyetina-l^{-/-} no se apreciaron en los
ratones CXCR4 ni PBSF/SDF-1^{-/-}. Se ha informado
de que las quimiocinas CXC, tales como PF4 (Maione, T. E. y col.,
Science 247, 77-79 (1990)), IL-8
(Koch, A. E. y col., Science 258, 1798-1801 (1992)),
IP-10 (Luster, A. D. y col., J. Exp. Med. 182,
219-231 (1995)), y Gro\beta (Cao, Y. H., y col.,
J. J. Exp. Med. 182, 2069-2077 (1995)), son
reguladores de la de neovascularización. Sin embargo, todavía no se
ha elucidado la expresión de sus receptores en células endoteliales
ni sus papeles fisiológicos. Aunque se ha demostrado que el factor
de coagulación V (Cui, J., y col., Nature, 384,
66-68 (1996)) y el factor tisular (Carmeliet, P. y
col., Nature 883, 75-78 (1996)) son esenciales para
el sistema vascular del saco vitelino, no está claro en cuanto a qué
tipo de aceptor media en estos factores.
Con los antecedentes mencionados anteriormente,
puede decirse que esta invención ha demostrado la presencia de un
nuevo sistema de señalización -quimiocinas y receptores acoplados a
proteínas G que abarcan siete dominios transmembrana- esencial para
la vascularización.
Recientemente se ha demostrado que los ratones
que carecen de la subunidad \alpha de la proteína heterotrimérica
G\alpha13 de unión al GTP presentan anomalías, tales como la no
formación un sistema vascular en el saco vitelino y una expansión de
los pequeños vasos embrionarios. Aunque los fenotipos son diferentes
de los de los ratones que carecen de CXCR4, es necesario examinar la
posibilidad de que los CXCR4 se acoplen a la G\alpha13.
Se sabe que CXCR4 y CCR5 son correceptores
esenciales cuando cepas de VIH-1 tróficas de
linfocitos T y de macrófagos infectan respectivamente a sus células
huésped. (Feng, Y., y col., Science 272, 872-877
{1996); Fauci, A. S., Nature 884, 529-584 (1996)).
Entre los dos han descubierto la población homocigota para la
deleción CCR5; y son resistentes a la infección por
VIH-1 y no tienen problemas de salud evidentes.
(Liu, R. y col., Cell 86, 367-377 (1996); Samson, M.
y col., Nature 382, 722-725 (1996); y Dean, M. y
col., Science 273, 1856-1861).
Con respecto al otro CXCR4, se ha sugerido
fuertemente, sin embargo, que es poco probable que se produzca la
deleción CXCR4 homóloga en seres humanos, dado que los ratones que
carecen de CXCR4 tienden a morir en el útero. Todavía queda la
posibilidad de que puedan existir factores genéticos adicionales o
mutaciones homólogas viables en supervivientes a largo plazo que
sean resistentes al VIH-1 trófico de linfocitos
T.
Basándose en el descubrimiento de esta
invención, de que se suprime la vascularización en ratones con genes
CXCR4 inactivados, puede prepararse un inhibidor de la
vascularización que comprende como ingrediente eficaz una sustancia
que inhibe la acción del CXCR4: dado que la vascularización es
esencial para el mantenimiento y la expansión de los tejidos
cancerosos, el descubrimiento es utilizado en la preparación de un
agente antineoplásico y de un agente terapéutico para una enfermedad
causada patológicamente por una neovascularización, que comprende
como ingrediente eficaz una sustancia que inhibe la acción del
CXCR4.
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSIKI KAISHA
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Angiogénesis
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> CGS 98-06 PCT
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 352
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<212> PRT
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<213> Mus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 1588
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<212> ADN
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<213> Mus
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)...(1059)
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 359
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<212> PRT
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<213> Mus
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 1758
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<212> ADN
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<213> Mus
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)...(1080)
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 89
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Péptido ligando
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<400> 5
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<211> 2244
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<212> ADN
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<213> Mus
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<210> 7
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<211> 89
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Péptido ligando
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1781
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Mua
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(351)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido añadido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipArg Phe Lys Met
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido añadido
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipArg Leu Lys Met
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 11
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\hfill27
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<210> 12
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgtcgactt tgcataaggg ttagctg
\hfill27
Claims (16)
1. Uso de una sustancia que inhibe la acción
debida al CXCR4 en la fabricación de un medicamento para inhibir la
vascularización, en el que la sustancia se selecciona del grupo
constituido por (1) una sustancia que inhibe la unión entre el
SDF-1 y el CXCR4; (2) una sustancia que inhibe la
señalización desde el CXCR4 hacia el núcleo; (3) una sustancia que
inhibe la expresión del CXCR4; y (4) una sustancia que inhibe la
expresión del SDF-l.
2. Uso de una sustancia que inhibe la acción
debida al CXCR4 en la fabricación de un medicamento para un cáncer
sólido, en el que la sustancia se selecciona del grupo constituido
por (1) una sustancia que inhibe la unión entre el
SDF-1 y el CXCR4; (2) una sustancia que inhibe la
señalización desde el CXCR4 hacia el núcleo; (3) una sustancia que
inhibe la expresión del CXCR4; y (4) una sustancia que inhibe la
expresión del SDF-l.
3. Uso de una sustancia que inhibe la acción
debida al CXCR4 en la fabricación de un medicamento para una
enfermedad causada patológicamente por una neovascularización, en el
que la sustancia se selecciona del grupo constituido por (1) una
sustancia que inhibe la unión entre el SDF-1 y el
CXCR4; (2) una sustancia que inhibe la señalización desde el CXCR4
hacia el núcleo; (3) una sustancia que inhibe la expresión del
CXCR4; y (4) una sustancia que inhibe la expresión del
SDF-l.
4. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la sustancia inhibe el
SDF-l.
5. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la sustancia inhibe el CXCR4.
6. El uso según la reivindicación 4, en el que
la sustancia inhibe el CXCR4 en competición antagonista con el
SDF-l.
7. El uso según la reivindicación 4, en el que
la sustancia inhibe la unión del SDF-1 al CXCR4
uniéndose al SDF-1.
8. El uso según la reivindicación 6, en el que
la sustancia es una seleccionada del grupo constituido por una
proteína similar al SDF-1, una proteína fusionada de
la proteína anterior con otro péptido o polipéptido, y un péptido
parcial del SDF-1.
9. El uso según la reivindicación 7, en el que
la sustancia es una seleccionada del grupo constituido por un
anticuerpo anti-SDF-1, un fragmento
de dicho anticuerpo que posee la actividad del anticuerpo
anti-SDF-1 y una proteína fusionada
que posee actividad de unión al SDF-1.
10. El uso según la reivindicación 5, en el que
la sustancia inhibe el CXCR4 en competición antagonista con el CXCR4
por la unión al SDF-1.
11. El uso según la reivindicación 5, en el que
la sustancia inhibe la unión del SDF-1 al CXCR4
uniéndose al CXCR4.
12. El uso según la reivindicación 10, en el que
la sustancia es una seleccionada del grupo constituido por un CXCR4
soluble que antagoniza al CXCR4 en la inhibición, una proteína con
una estructura similar al CXCR4, una proteína fusionada de la
proteína anterior con otro péptido o polipéptido, y un péptido
parcial del CXCR4.
13. El uso según la reivindicación 11, en el que
la sustancia es una seleccionada del grupo constituido por un
anticuerpo anti-CXCR4, un fragmento de dicho
anticuerpo que posee la actividad del anticuerpo
anti-CXCR4 y una proteína fusionada que posee
actividad de unión al CXCR4.
14. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la sustancia es una sustancia que
inhibe la propia expresión del CXCR4 y es una seleccionada del grupo
constituido por un antigen, un polinucleótido antisentido, un ARN
antisentido expresado mediante un vector antisentido, una ribozima y
un inhibidor del sitio de control de la expresión del CXCR4.
15. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la sustancia es un antisentido
para la inhibición de la expresión del SDF-l.
16. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la sustancia muestra una
inhibición del sitio de control de la expresión del
SDF-1.
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