ES2361308B2

ES2361308B2 - Cepa bacteriana cect7625, usos y producto xeroprotector producido por la misma.

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Publication number: ES2361308B2
Application number: ES200931117A
Authority: ES
Inventors: Maximo Manzanera Ruiz; Jesús Juan González López; Juan Jesús Naváez Reinaldo
Original assignee: Universidad de Granada
Current assignee: Universidad de Granada
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2009-12-04
Publication date: 2011-11-15
Anticipated expiration: 2029-12-04
Also published as: ES2389367B2; ES2389367A1; ES2361308A1; WO2011067441A2; WO2011067441A3

Abstract

Cepa bacteriana CECT7625, usos y producto xeroprotector producido por la misma.#Microorganismo de la especie bacteriana Rhodococcus sp. con número de acceso CECT7625. La presente invención también se refiere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para la producción de una composición xeroprotectora, donde dicha composición comprende acetato, lactato, ácido glutámico, {be}hidroxibutirato y fructosa. Además, la presente invención se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula, o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa. Y, la presente invención también se refiere a un método de obtención de la composición xeroprotectora o a un método para la conservación de dicho material biológico.

Description

Cepa bacteriana CECT7625,usosyproductoxeroprotector producidoporla misma.

La presente invención se reﬁere a un microorganismo de la especie bacteriana Rhodococcus sp. con número de acceso CECT7625. Asimismo la presente invención se reﬁere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para la producción de una composición xeroprotectora, donde dicha composición comprende acetato, lactato, ácido glutámico, β-hidroxibutirato y fructosa. La presente invención también se reﬁere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aisladoo una célula,o una molécula con actividad biológica como por ejemplouna enzima con actividad lipasa. Además, la presente invención se reﬁere a un método de obtención de la composición xeroprotectoraoa un métodoparala conservaciónde dicho material biológico.

Estado de la técnica anterior

La conservaciónde materiales biológicos mediante deshidrataciónyosmoconcentraciónes una tecnología conocida. Cuando la tarea de conservar biomoléculas sensibles se hizo necesaria, el simple secado mediante deshidratación fracasó,yaquese eliminabaelagua estructural, produciendola desnaturalización posteriorylapérdidadeactividad vital. La lioﬁlización se ha convertido en el método más aceptado para la conservación a largo plazo de biomoléculas sensibles, usándose por ejemplo de forma muy extendida para la conservación de vacunas atenuadas vivas.

Los métodos actualesde conservación requierende gran costo en energíaygeneralmente necesitande almacenaje abajas temperaturas.En ocasiones,despuésdesuconservaciónelmaterial biológicotieneunaactividady/o viabilidad que no alcanza los niveles satisfactorios. Los métodos de conservación, tales como el secado a temperatura ambiente, formulaciones en líquido, el congelado con crioprotectores o la lioﬁlización producen reducciones signiﬁcativas en la actividad/viabilidad del material conservado.

Los procesos usados actualmente son lentos e implican un elevado consumo de energía. Además, la lioﬁlización conﬁere sólo unnivel modestode termotolerancia enel producto ﬁnal,y se requiere aún refrigeración para reducireldeterioro durante el almacenamiento. Éste es un problema particular para vacunas vivas destinadas a usarse en climas tropicales, ya que éstas pierden actividad, con el desafortunado resultado de que los programas de vacunación realizados en el campo en países tropicales, donde el control de la “cadena de frío” es difícil, pueden conducir ﬁnalmente a la vacunación de pacientes con vacuna inferior a la estándar o, en algunos casos, inservible.

Durantela selección naturalevolutiva, ciertas especiesde microorganismos, plantasyanimales adquirieronla notableyelegante capacidadde tolerarla deshidratación extrema, permaneciendo latentes en medios hostiles durante períodosmuylargosde tiempoyaún capacesde adquirir una actividad vital completa unavez hidratadas nuevamente. Ejemplos incluyen la “planta de la resurrección” Selaginella lepidophyla, el camarón de mar Artemia salina, la levadura Saccharomyces cerevisiae o el tardígrado Macrobiotus hufelandi. Estos organismos se denominan criptiobióticos yel procedimientoporelque sobrevivense conoce como anhidrobiosis.Todaslas especiesdeanimalesyplantas que presentan esta capacidad, contienen moléculas protectoras formadoras de cristales amorfos como el disacárido trehalosa(α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranósido).

La formacióny uso de los cristales amorfos está bien documentada (Manzanera et al., 2002. Appl Environ Microbiol, 68: 4328-4333). Algunos de los conservantes que forman estos cristales son adecuados para este tipo de conservación e incluyen hidratos de carbono no reductores como la trehalosa, hidroxiectoina, maltitol, lactitol (4O-α-D-glucopyranosyl-D-glucitol), palatinit [mezcla de GPS(α-D-glucopiranosil-1-6-sorbitol)yGPM(α-D-glucopiranosil-1-6-manitol)]y sus componentes individuales GPSy GPM. Los glicósidos no reductores de compuestos polihidroxilados tales como neotrehalosa, laconeotrehalosa,galactosil-trehalosa, sacarosa, lactosacarosa, raﬁnosa, etc. Otros conservantes formadores de cristales amorfos incluyen aminoácidos tales como la hidroxiectoina.

La presenciadeaguaenel estado secoes generalmente inferiora0,2g/gdepeso celular secoenlamayoríadelos criptobiontes.Estosnivelesdeaguasonsuﬁcientesparaqueestos microorganismos resistanla deshidrataciónextrema, temperaturas elevadas, radiaciones ionizantes o también, en algunas especies de tardígrados, presiones de hasta 600 MPa.

Es conocido que las biopelículas(Subaerial bioﬁlms), formadas por bacterias del género Rhodococcus sp entre otras, son capaces de producir compuestos osmoprotectores, es decir, sustancias extracelulares poliméricas (EPS) (Gorbushina, 2007. Environmental Microbiology, 9(7): 1613-1631). Asimismo, Ortega-Morales et al. (2007) (Ortega-Morales et al.2007. JournalofApplied Microbiology,102:254-264), describen bacteriasdelas biopelículasdelaszonas intermareales tropicales, donde se han aislado bacterias que pertenecen al género Microbacterium sp. como fuente denuevosexopolímeros protectoresdelas células contraladesecación.Porotraparte, LeBlanc(2008)(LeBlanc,2008. Applied and environmental microbiology, 74(9): 2627-2636), se reﬁere al microorganismo Rhodococcus jostii RHA1, un actinomiceto con capacidades metabólicasfavorables para la biorremediación de suelos contaminados, capaz de secretar los osmoprotectores ectoinaytrehalosa.

Explicación de la invención

La presente invención se reﬁere a un microorganismo de la especie bacteriana Rhodococcus sp. con número de acceso CECT7625. Asimismo la presente invención se reﬁere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para la producción de una composición xeroprotectora, donde dicha composición comprende acetato, lactato, ácido glutámico, β-hidroxibutirato y fructosa. La presente invención también se reﬁere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aisladoo una célula,o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa. Además, la presente invención se reﬁere a un método de obtención de la composición xeroprotectora o a un método para la conservación de dicho material biológico.

La capacidadpara conservar material biológico sensiblepor periodosdetiempo indeﬁnidoen formaactivao viable es de importancia en aplicaciones para los sectores médico, agrícola e industrial. En la presente invención se ofrecen herramientas para solucionarla conservacióndematerial biológicoque presenta diﬁcultades parasu estabilización.El material biológico preservado con la composición xeroprotectora producida por el microorganismo con nº de acceso CECT7625es establepor periodoslargosde tiempo.Tal comose muestraenlos ejemplosdela presenteinvención,el uso de una composición que contiene cada uno de los componentes por separado para la conservación de la actividad de una enzima lipasa, es decir,la suma del efecto en la conservación de la actividad enzimática de una composición que contiene acetato,o lactato,o ácidoglutámico,o β-hidroxibutirato o fructosa, es menor que el efecto de conservación que produce una composición que contiene todos los componentes, es decir, la composición xeroprotectora tiene un efecto sinérgico en su capacidad de conservar material biológico.

Por tanto, un aspecto de la presente invención se reﬁere a un microorganismo de la especie bacteriana Rhodococcus sp. con número de acceso CECT7625. Dicho microorganismo es tolerante a la desecación. Dicha cepa ha sido depositada enla Colección EspañoladeCultivosTipo (CECT)el10de noviembrede 2009yle correspondióelnºde depósito CECT7625.La direccióndedicha Autoridad Internacionalde depósito es: UniversidaddeValencia/Ediﬁcio deinvestigación/CampusdeBurjassot/46100 Burjassot(Valencia).

En adelante, para hacer referencia a dicha cepa se puede emplear el término “4J2A2”.

La clasiﬁcación cientíﬁca de la cepa CECT7625 de la presente invención es: Reino: Bacteria/Filo: Actinobacteria/Orden: Actinomycetales/Familia: Nocardiaceae/Género: Rhodococcus.

Las características de dicha cepa son:

-: Metabolismo caracterizado por oxidación/fermentación, Dextrina, tween 40, tween 80,N-acetil-D-glucosamina,D-arabitol,D-fructosa, ácidoD-glucónico, α-D-glucosa,D-manitol,D-manosa,D-psicosa,D-ribosa,D-sorbitol, ácido α-cetovalérico, ácidoL-láctico, ácidoL-málico, metil piruvato, mono-metil succinato, ácido propiónico, ácido pirúvico, L-alanil-glicina, glicerol, 2’-deoxiadenosina.

-: La temperatura máxima tolerada para el crecimiento de esta cepa son 40ºC. La temperatura mínima para detectar crecimientose encontró entre15ºCy20ºC, mientrasquesu temperaturaóptimade crecimientofuede entornoa35ºC. Fue incapazde crecerapH12 aunquesiapH9.

-: ElpHmínimo toleradoparael crecimientodeestacepase encontró entrepH5ypH7, considerándoseéste como pH óptimo para el crecimiento de esta cepa.

-: Igualmente fue incapaz de proliferar en medio LB con una concentración de NaCl igual o superior a 2 M, quedandola concentración máxima tolerada entre0,8My2Mde NaCl. Esta cepa mostróun crecimiento óptimoa una concentraciónde0,2MdeNaCl, aunque tambiénfuecapazde proliferarenestemedioen ausenciadeNaCl.

-: Ensayos de sensibilidad a antibióticos mostraron halos de inhibición del crecimiento en los cinco antibióticos ensayados en disco: rifampicina30 (2,83 cm); estreptomicina25 (2,20 cm); tetraciclina20 (0,87 cm); cloramfenicol50 (4,12 cm); kanamicina30 (1,93 cm).

Asimismo,lapresenteinvención también se reﬁerea un microorganismo derivado del microorganismo depositado con nº de acceso CECT7625. El microorganismo derivado puede producirse de forma intencionada, por métodos mutagénicos conocidos en el estado de la técnica como por ejemplo, el crecimiento de dicho microorganismo original en exposición con conocidos agentes capaces de forzar mutagénesis.

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere a una población bacteriana que comprende el microorganismo depositado con nº de acceso CECT7625. La población bacteriana puede estar formada por otras cepas de microorganismos de cualquier especie. La población bacteriana es un conjunto de células de microorganismos donde al menos hay una célula de dicho microorganismo depositado con nº de acceso CECT7625, en cualquierfase del estadode desarrolloy en cualquierfasede crecimiento, estacional o estacionaria, independientementedela morfologíaque presente, en forma de coco, bacilo o morfologías intermediarias de las anteriores.

En adelante se podrá hacer referencia al microorganismo o a la población bacteriana como el “microorganismo de la presente invención” o el “microorganismo de la invención”.

Otro aspectomásdelapresenteinvenciónse reﬁerealusodel microorganismodelainvenciónparala producción de una composición xeroprotectora.

Un aspecto más de la presente invención se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismodelainvención.Para referirseala composiciónxeroprotectoradela presenteinvención se puede emplearel términoProductode Ordeñado Bacteriano (POB).El término “composiciónxeroprotectora”tal comose entiendeen la presente invención, se reﬁere a una composición que previene los efectos adversos de la desecación total o parcial de material de origen biológico o material de origen sintético. El materialbiológico se reﬁere a cualquier compuesto producido directamente por un organismo vivo en cualquier estado de desarrollo, en cualquier compartimento celular, sea cual sea la naturaleza, composición o estructura del mismo, o que procede de un organismo que ya no está vivo. Dicho material biológico puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una célula, ácido nucleico, proteína, enzima, polisacárido, lípido, fosfolípido, liposomas, virus, partículas virales o cualquier molécula que comprenda cualquiera delos elementos anteriores,ocualquier moléculaorgánicaquetengaun efectofarmacológico, inmunogénicoy/oﬁsiológico de acción local y/o sistémica. El material biológico puede comprender agentes terapéuticos; agentes antiinfectivos como antibióticos, antivirales; analgésicos o combinaciones de analgésicos; agentes antiartríticos, antiasmáticos, antiinﬂamatorios, antioplásticos, antipruríticos, antipsicóticos, antipiréticos, antiespasmódicos, preparaciones cardiovasculares (incluyendo bloqueantes de canales de calcio, bloqueadores beta, o antiarrítmicos), agentes contra la hipertensión, diuréticos, vasodilatadores, estimuladores del sistema nervioso central, antitusivos, preparaciones anti resfriados, descongestionantes, agentes de diagnóstico, hormonas, estimuladores del crecimiento óseo, inhibidores de la resorción de la médula ósea, inmunosupresores, relajantes musculares, psicoestimulantes, sedantes, tranquilizantes, proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos (tanto naturales, como sintéticos, como productos recombinantes), moléculasdeácidos nucleicos(tantoenforma poliméricadedosomás nucleótidosdeADNoARN, incluyendotanto moléculas de cadena doble como de cadena sencilla, construcciones genéticas, vectores de expresión, ARN antisentido, sentido o moléculas ARNi) o nucleótidos (como por ejemplo, pero sin limitarse, el dATP, dCTP, dGTP, dTTP

o dUTP, de utilidad en la técnica de PCR, secuenciación, etc). El material de origen sintético se reﬁere a un tipo de materialquenohasido producidoo sintetizadoporunorganismovivo directamentesinoquehasido creadoporelser humano como por ejemplo, pero sin limitarse, una secuencia de ADN ampliﬁcada por PCR, o una proteína o enzima modiﬁcada intencionadamente o no.

Una realización preferida de la presente invención se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismodelainvención,oa una composiciónxeroprotectora sintética,que comprende fructosa, ácido glutámico, β-hidroxibutirato, acetatoylactato.

El término “acetato” se reﬁere al anión acetato presente en una solución, es decir el anión acetato (C2H3O2)−, es un carboxilatoy es base conjugadadel ácido acético.El término “lactato”se reﬁereal anión lactato presenteenuna solución, es decir el anión lactato (C3H5O3)−,esun carboxilatoy esbaseconjugadadelácido láctico.Elglutamato, formaionizadadelácido glutámico,se reﬁereaunodelos20aminoácidos esencialesqueformanpartedelasproteínas. El β-hidroxibutirato(o beta-hidroxibutirato) esel anión que derivadela disolución delácido3-hidroxibutírico.La fructosa(olevulosa) es una cetohexosa(6 átomosde carbono) con formula químicaC6H12O6, monosacárido conla misma fórmula empíricaquela glucosa pero con diferente estructura.

Una realización más preferida se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invención,oala composiciónxeroprotectora sintética,que comprende una proporciónde entre35y45de fructosa: 1,4y3,4 de ácido glutámico: 0,5y1,5 de acetato. Es decir, una proporción (fructosa):(ácido glutámico):(acetato) de (35 a 45):(1,4 a 3,4):(0,5 a 1,5), respectivamente. Una realización aún más preferida se reﬁere a la composición xeroprotectora donde la proporción de (fructosa):(ácido glutámico):(acetato) es de (38 a 44):(2 a 3):(0,7 a 1,3), respectivamente. Preferiblemente la composición xeroprotectora tiene una proporción de (fructosa):(ácido glutámico):(acetato) de (41):(2,4):(1), respectivamente.

Una realización más preferida se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invención,oala composiciónxeroprotectora sintética,que comprende una proporciónde entre14y18de fructosa: 3y5 de ácido glutámico: 0,6y1deβ-hidroxibutirato: 0,5y1,5 de acetato:1y2 de lactato. Es decir, una proporción (fructosa):(ácido glutámico):(β-hidroxibutirato):(acetato):(lactato) de (14 a 18):(3 a 5):(0,6 a 1):(0,5 a 1,5):(1 a 2). Una realización aún más preferida se reﬁere a la composición xeroprotectora donde la proporción de (fructosa):(ácido glutámico):(β-hidroxibutirato):(acetato):(lactato) es de (15 a 17):(3,5 a 4,5):(0,7 a 0,9):(0,7 a 1,2):(1,2 a 1,6).Preferiblementela composiciónxeroprotectora tiene una proporciónde (fructosa):(ácido glutámico):(β-hidroxibutirato):(acetato):(lactato) de (16):(4):(0,8):(1):(1,4), respectivamente.

El término “proporción” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a la correspondencia debida de los elementos de la composición (fructosa, ácido glutámico, β-hidroxibutirato, acetato y lactato) relacionados entre sí.Es decir, se reﬁere a una relación matemática que vincula los elementosdela composición.Para quesirva de ejemplo, la composición xeroprotectora que tiene una proporción de (fructosa):(ácido glutámico):(β-hidroxibutirato):(acetato):(lactato) de (16):(4):(0,8):(1):(1,4),respectivamente, puede tener por ejemplo, concentraciones de (32):(8):(1,6):(2):(2,8) mg de cada elemento respectivamente/ml.

En adelante se podrá hacer referencia a cualquiera de las composiciones anteriores como la “composición de la presente invención” o “composición de la invención”.

Otro aspecto de la presente invención es el uso de la composición de la invención para la conservación de material biológicoconun contenidoenhumedadresidualigualoinferioral10%.El contenidode humedad residualdel material biológico puede ser igual o inferior al 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1% de humedad residual. La conservación de dicho material puede llevarse a cabo mediante la estabilización del mismo. En la presente invención, para referirse a este tipo de material biológico se puede emplear la expresión “material biológico en estado seco”. En estas condiciones, el conservanteo estabilizador coalesce para alcanzar un estado no-cristalino, vítreo,ysólido (por ejemplo un cristal amorfo). Las partículas de cristal orgánico que están formadas al secar el material biológico con el estabilizador están cubiertas por el estabilizador que produce una alta estabilidad al reducir drásticamente las reacciones químicas.De esta forma el material biológico seco está incrustado en el cristal amorfo formado por el estabilizador.

El material biológico seco en presencia del estabilizador que forma el cristal amorfo es resistente a plásticos en estado líquido, mientras que el material que no está seco en presencia de estos estabilizadores no es resistente a plásticos en estado líquido.

El material biológico seco en estas formas puede encontrarseen estado no particuladoypuede suministrarse en formas por ejemplo,pero sin limitarse, molduraso sólidos en3dimensiones como por ejemplo, pero sin limitarse, bloques, pastillas, parches,hojas, bolas,o pepitasde material biológico seco.

El término “humedad residual” tal como se emplea en la presente invención se reﬁere a la cantidad de humedad que contieneunproductodespuésdepasadoporalgúntipodeprocesocapazdeeliminaraguadelmismo.Lahumedad residual es el porcentaje de masa del producto que corresponde a agua respecto del total de la masa. Es decir, un valor de humedadresidualdeun productoigualaun10% signiﬁcaque10gdecada100gdel producto correspondenaagua. La humedad residualpuede ser medida mediante métodos conocidosenel estadodela técnica comopor ejemplo,pero sin limitarse, mediante el método titrimétrico, el método azeotrópico o el método gravimétrico.

El término “conservaciónde material biológico”hace referenciaal mantenimientoo cuidadodela permanenciade las características intrínsecas del material biológico.

Una realización preferida se reﬁere al uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo,unórganoaislado,untejidobiológicoaisladoounacélula.Lacélulapuedeserprocariotaoeucariota. La célulapuedeseruna céluladeun microorganismoen cualquier estadode desarrollo.Lacélulapuedeser somáticao germinal,vegetaloanimal.Dichacélulapuedeprocederdecualquierorganismoomicroorganismoypuedepresentarse en cualquier estado de diferenciación, como por ejemplo,pero sin limitarse, procedente de un cultivo de un tejido celular o de órganos, esperma, óvulos o embriones. La célula puede ser una célula madre totipotente, multipotente o unipotente. El microorganismo puede ser unicelular o multicelular. El organismo unicelular se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, E. coli, S. typhimurium, P. putida., Salmonella spp, Rhizobium spp, Pseudomonas spp, Rhodococcus spp, Lactobacillus spp. o Biﬁdobacterium spp. El organismo pluricelular puede ser por ejemplo, pero sin limitarse, un nematodo.

La célula conservada por la composición de la presente invención es una célula viable es decir, es capaz de realizar las funciones normales de la célula incluyendo la replicaciónydivisión celular. Por otra parte la célula puede haber sidotratada,manipuladaomutadaantesdesu conservación.Porejemplo,perosinlimitarse,unacélulapuedehaberse hecho competente para transformaciones o transfecciones, o puede contener ácidos nucleicos recombinantes. Las célulasquese conservanpuedenformarunapoblaciónhomogéneao heterogénea,porejemplo,perosin limitarse,una librería de células en la que cada una contiene una variación de algún ácido nucleico. Preferentemente, las células son células no anhidrobióticas (células sensibles a desecación) como por ejemplo, pero sin limitarse, células procedentes de microorganismos procariotas no anhidrobiontes que generalmente no sean esporulantes.

La conservación del microorganismo puede mejorarse mediante cultivo bajo condiciones que aumenten la concentración intracelular de trehalosa o de otros estabilizadores formadores de cristales amorfos. Por ejemplo, pero sin limitarse,encondicionesdealta osmolaridad(alta concentracióndesales)que estimulenla producción intracelularde trehalosa o de otros estabilizantes formadores de cristales amorfos.

El organismoinvertebrado es pero sin limitarse, una larvadeinsecto o un crustáceo. Dichos organismosinvertebrados pueden ser preservados en condiciones de desecación, permitiendo la actividad vital del mismo, de modo que, cuando se rehidratan, dichos organismos presentan la capacidad de movimiento. La plántula es una planta en sus primeros estadios de desarrollo, desde que germina hasta que se desarrollan las primeras hojas verdaderas.

La composición de la invención puede usarse para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológicoesunorganismovertebrado pertenecienteala SuperclaseTetrapoda(con cuatroextremidades), Clase Amphibia(anﬁbios)o Clase Reptilia (reptiles),o cualquierade sus partes(VernonyJackson, 1931. The biologicalbulletin,60:80-93).VernonyJacksonllevaronacaboun estudiosobrela ranaLeopardo(Rana pipiens), enel quedeformanaturalsesecasupiel,lengua,bazo,ehígadoconunapérdidadeaguadeentreun43-81%del contenido de agua total.

Unórgano aislado,o un tejido biológico aislado (incluidala sangre) pueden conservarse mediantela composición de la presente invención. En Serrato et al. (2009) pueden observarse resultados de protocolos de crioperservación de tejidos biológicos (Serrato et al., 2009. Histology and histopathology, 24: 1531-1540).

Una realización más preferida se reﬁere al uso de la composición de la invención, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. El término “molécula con actividad biológica” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a una molécula biológica cuyo origen sea un organismo vivo o que haya estado vivo, o derivados o análogos de dicha molécula. El término “derivados” se reﬁere a moléculas obtenidas por la modiﬁcación de una molécula con actividad biológica, que presentan una funcionalidad similar. Por otra parte, el término “análogos” se reﬁerea moléculas quepresentan una función similarala molécula con actividadbiológica.

Según otra realización aún más preferida de la composición de la presente invención la molécula con actividad biológica es una enzima. Una realización todavía más preferida de la presente invención se reﬁere al uso de la composición de la invención, donde la enzima es una enzima con actividad lipasa. La enzima con actividad lipasa se selecciona de la lista de enzimas con números EC(Enzyme Commission numbers)que comprende las hidrolasas de éster carboxílico(EC 3.1.1)EC 3.1.1.1 (Carboxilesterasa),EC 3.1.1.2 (Arilesterasa),EC 3.1.1.3(Triacilglicerollipasa),EC 3.1.1.4(FosfolipasaA(2)),EC 3.1.1.5 (Lisofosfolipasa),EC 3.1.1.23 (Acilglicerol lipasa),EC 3.1.1.24(3oxoadipato enol-lactonasa),EC 3.1.1.25 (1,4-lactonasa),EC 3.1.1.26 (Galactolipasa),EC 3.1.1.32(FosfolipasaA(1)), EC3.1.1.33(6-acetilglucosa deacetilasa),EC 3.1.1.34 (Lipoproteína lipasa). Preferiblementelaenzima lipasa tiene actividadTriacilglicerollipasa (EC 3.1.1.3).

Otro aspectodelapresenteinvenciónse reﬁereaun métodode obtencióndela composiciónxeroprotectoradela invención que comprende:

a) cultivarel microorganismodelainvención en un mediode cultivo con fructosa comofuentede carbono,

b) deshidratar los microorganismos obtenidos en el cultivo del paso (a) hasta que tengan una humedad residual igual o inferior al 10%,

c) rehidratar los microorganismos deshidratados del paso (b) en un medio hipotónicoy

d) seleccionar la fracción líquida del producto obtenido en elpaso (c) que comprende la composición xeroprotectora.

El medio de cultivo es cualquier medio de cultivo conocido en el estado de la técnica para el crecimiento de un microorganismo de la presente invención, por ejemplo pero sin limitarse, el medio mineral M9. Medios ricos como el medio Luria Bertani(LB)enlosquehay presentesxeroprotectores,u osmolitos naturalesno sirven, porquela bacteria preferiría tomarlos del exterior a sintentizarlos.

Una realización preferida de la presente invención se reﬁere al método de obtención de la composición xeroprotectora, donde el medio de cultivo del paso (a) es sólido. El término “sólido” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a un mediode cultivo geliﬁcado en mayoro menor grado,es decir, que comprendeagarpara facilitar su geliﬁcación o cualquier compuesto geliﬁcante.

La deshidratación de los microorganismos del paso (b) se lleva a cabo por medio de cualquier técnica conocida en el estado de la técnica. Otra realización preferida de la presente invención se reﬁere al método, donde la deshidratación de los microorganismos según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire. Preferiblemente la solución hipertónica o la corriente de aire tienen condiciones de esterilidad. La solución hipertónicaes una soluciónque tiene mayor concentraciónde solutoenel medioexternoqueenel citoplasma de la células del microorganismo de la presente invención, por tanto, la célula libera agua, es decir, se deshidrata.

La deshidratación de los microorganismos, descrita en el paso (b), se lleva a cabo en un medio hipotónico. El medio hipotónico o solución hipotónica es una solución que tiene menor concentración de soluto en el medio externo que en el citoplasma de la célula delmicroorganismo de la presente invención, por tanto, la célula recupera agua, es decir,se rehidrata.Una realización preferidamásse reﬁereal método, dondeelmedio hipotónicoparala rehidratación de los microorganismos según el paso (c) es agua parcial o totalmente destilada, parcial o totalmente desionizada o parcial o totalmente desmineralizada.

Las célulasyel medio hipotónicohande estaren contactoal menos5minutos. Preferiblemente estaránen contacto al menos 20 minutos en agitación. La obtención del medio que contiene las sustancias estabilizantes se realizará por cualquier métodoquegaranticela separaciónde célulasdel contenido líquido, preferiblemente mediante centrifugado suave, seguido de un paso de ﬁltración. Preferiblemente se utilizarán ﬁltros de 0,4 micrómetros de diámetro de poro.

Otra realización preferida se reﬁere al método, donde además, la fracción líquida del paso (d) se deshidrata hasta que el producto xeroprotector tenga una humedad residual igual o inferior al 10%.

El producto xeroprotector de la invención se puede separar del medio de cultivo por cualquier método de concentración. Preferiblemente se utilizarán secadoresde tipo lioﬁlizador que produzcanel estabilizador en estadoseco.Las moléculas estabilizadoras se podrán disolvero dispersar en una proporciónde entreel10yel 30%. Esta disolucióno dispersión se añadeal material biológico que se desee conservary se someteráa desecación.

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere al método para la conservación de material biológico que comprende:

a) mezclarla composicióndelainvención con una muestrade material biológico,y

b) deshidratar el producto obtenido en el paso (a) hasta una humedad residual igual o inferior al 10%.

Una realización preferida se reﬁere al método para la conservación de material biológico, donde el material biológico del paso (a) es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula.

Otra realización preferida se reﬁere al método para la conservación de material biológico, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.

Una realización más preferida de la presente invención se reﬁere al método, donde la molécula con actividad biológica es una enzima.Según una realización más preferidadela presenteinvenciónla enzima es una lipasa.

Otrarealizaciónaúnmás preferidase reﬁereacualquieradelos métodosparala conservacióndematerial biológico, dondela deshidratacióndela mezcladela composiciónxeroprotectoraydel materialbiológicosegúnel paso(b)se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire.

Cualquier método para la conservación de material biológico de la presente invención permite el empleo de dicho material en procesos de manufacturación en los cuales el material biológico sería demasiado inestable si no estuviera conservado medianteelusodela composicióndela presenteinvención.Lainvención incluyeextrusioneso moldesen losquese incluyeel material conservadopor cualquier métododela presenteinvención.Un métodode producciónde una moldura que contengabiomaterial activomediante estabilizadores puede incluir soluciones de materiales plásticos. Por ejemplo una moldura de material plástico con biomaterial activo encapsulado puede ser útil como componentes de biosensores. Por ejemplo un biosensor puede incluir bacterias que sean capaces de detectar sustancias tóxicas, patógenos o toxicidad en general.

Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otras características técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos,ventajas ycaracterísticas de la invención se desprenderán en parte de la descripciónyen parte de la práctica de la invención. Las siguientes ﬁgurasyejemplosse proporcionana modode ilustración,y nosepretendeque sean limitativosdela presente invención.

Descripción de las ﬁguras

Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativoy no limitante, las siguientes ﬁguras:

Fig. 1. Muestrala viabilidaddelosdistintos aislados bacterianos seleccionados medianteexposiciónacloroformo tras 24 horas de secado al aire.

Las barrasde error muestranla desviación estándardeal menos tres réplicas.

Los microorganismos representados en la ﬁgura son:

1J3A, 1J14, 2J2, 2J8A, 2J12B, 2J15B, 2J16A, 2J30, 3J18, 6J30, Acitenobacter calcoaceticus,Pseudomonas putida, además de la cepa 4J2A2.

Fig. 2. Muestrala actividadlipasa(enporcentajerelativoaun100%de actividaddel control positivo)tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos componentes de productos del ordeñado bacteriano al 10% (p/v).

El controlpositivoes trehalosaal 10%.El controlnegativo(-)secorresponde conla ausenciade compuesto alguno como aditivo previo a la desecación de la enzima. 4J2A2 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secadoyposterior reconstitucióndela enzima en presenciade POBextraídosdela cepa 4J2A2 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 4J2A2D es la actividad lipasa registrada tras la estabilizaciónpor secadoy posterior reconstitucióndela enzima en presenciade POBSIA (Productode Ordeñado Bacteriano extraído por Secado mediante Incubación al Aire) extraídos de la cepa 4J2A2 mediante tratamiento de secado y posterior hidratación.

Fig. 3. Muestrala actividadlipasa(enporcentajerelativoaun100%de actividaddel control positivo)tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos compuestos químicos (fructosa, ácido glutámico, beta-hidroxibutirato, acetatoylactatoal 10%).

El control positivo (C+) es trehalosa al 10%. El control negativo (C-) se corresponde con la ausencia de compuesto alguno como aditivo previo a la desecación de la enzima. 4J2A2D sintético es la mezcla de fructosa, ácido glutámico, beta-hidroxibutirato, acetatoy lactato al 10% en la misma proporción encontrada en el POBSIA de la cepa 4J2A2 mediante tratamientode secadoyposterior hidratación siendola proporciónde 16:4:0,8:1:1,4 respectivamente.

Fig. 4. Muestra la evolución de la supervivencia de Escherichia coli MC4100 frente a desecación mediante el empleo del producto de ordeñado bacteriano (POB) así como los extraídos por Secado mediante Incubación al Aire (POBSIAs).

4J2A2 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POB extraídos de la cepa4J2A2 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 4J2A2D es la actividad lipasa registrada tras la estabilización por secadoyposterior reconstitución de la enzima en presencia de POBSIA.

PVP indica que además se ha adicionado 1,5% de polivinilpirrolidona (PVP).

SIN es sintético.

Tes trehalosa.

Ejemplos

Acontinuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativosyde carácter no limitante, realizados por los inventores que describen el aislamiento de la cepa de la presente invención así como la capacidad de producción de compuestos xeroprotectores. En adelante se puede hacer referencia a la cepa CECT7625 con el término “4J2A2”.

Ejemplo1

Aislamiento del microorganismo 4J2A2 (CECT7625), extracción de POB (Productos del Ordeñado Bacteriano) y ensayo de xeroprotección de enzimas

1.2. Aislamiento de la cepa 4J2A2(CECT7625)

Se homogeneizó1gde suelo seco, procedentede Granada (37.182 LatitudNy3.624 LongitudO),noexpuestoa lluvia, ni riego, por un periodo superior a tres meses. El suelo se tomó del área circundante a raíces de adelfa(Nerium oleander). Las muestras fueron homogeneizadas para obtener un granode tierra ﬁno quegarantizara su contacto con el cloroformo.La tierrase depositóen vialesde vidrioalosqueseles añadió3mlde cloroformo puro.Trasla adición del cloroformo se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación esporádica para maximizar el contactodela muestra conel disolvente.Para eliminarel cloroformodelas muestras unavez transcurridoel tiempo de contacto, las muestras de suelo fueron depositadas en placa petri de vidrio estéril sin tapadera hasta completar la evaporación del cloroformo. Una vez secas las muestras de suelo se resuspendieron en 10 ml de TSB. Con las suspensiones de suelo se realizaron diluciones seriadasy se sembraron en placas de TSA que se incubaron 48 horas a 30ºC.Trascurrido este tiempo se cuantiﬁcó el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro de cada muestra. Así, se detectaron2·105 UFC/g de suelo en las muestras sin tratar, mientras que estas se redujeron a 1,3·105 UFC/g de suelo tras 30 minutos de tratamiento.

Se seleccionaron aleatoriamente 36 cepasypara identiﬁcar las cepas que producían esporas se realizó un ensayo basadoenla diferente sensibilidaddelas célulasvegetativas con respectoalas esporasal tratamiento con calory en basealmétodo descritoporVilchezycolaboradores(Vilchez et al., 2008. Extremophiles, 12: 297-299). De esta forma se tomaron colonias independientes procedentes de placas de TSA de al menos 24 horas de crecimiento. Estas colonias se resuspendieronen1mlde soluciónM9en microtubos estérilesde1,5ml.Seguidamentese sembraron10 µlde esta suspensión en TSA. Acto seguido se incubó el resto de la suspensión en termobloque Mixing Block MB-102 a 72ºC durante 30 minutos. Nuevamente se tomaron 10 µlde cadamuestrayse sembraron en placade TSA. Aquellas cepas con capacidad para tolerar el tratamiento con calor se consideraron como esporulantes, mientras que aquellas que no toleraronel tratamiento por calor se consideraron no esporulantes. Como controles positivosy negativos se utilizaron colonias de Bacillus pumilus ydeBurkholderia cepacia respectivamente. La proporción de cepas esporulantes pasó deniveles inferioresal 40% para muestras no tratadasaniveles superioresal 50% tras30 mindeexposicióndelas muestras de suelo al cloroformo.

Con el ﬁn de analizar la capacidad de tolerar la desecación de las cepas aisladas no esporulantes se realizó un estudiode desecaciónalaire.Enesteensayoseincluyóunacepade Acinetobacter calcoaceticus (PADD68) aislada del desiertodeTabernas(Almería) identiﬁcada como toleranteala desecaciónenun estudioprevioyquese utilizó como control positivo. Además también se incluyó en el estudio células de Pseudomonas putida KT2440 que se utilizaron como controles negativosal ser unacepa sensibleala desecación (Antheunisse et al., 1981. Antonie Leeuwnhoek, 47: 539-545; Manzanera et al.,2002.Appl.Environ. Microbiol.,68:4328-4333).Paraeste ensayose utilizaron colonias independientes de las 17 cepas identiﬁcadas como no esporulantes aisladas en el estudio anteriory procedentes de placasde TSAde72 horas para calcular sunivelde toleranciaala desecación taly como se indicaa continuación.

Para calcular la tolerancia a la desecación se partió de colonias aisladas procedentes de placas de TSA de 48 horas de crecimiento. Utilizando un asa estéril se tomó una única colonia que se resuspendió en1 ml de solución M9 estéril.Partiendode esta suspensión celular se realizaron diluciones seriadas que se sembraron en placasde TSA con objeto de identiﬁcar el número de UFC/ml de partida. Por otra parte se tomaron 100 µlde cada suspensiónyse depositaron en gotas de5-10 µlsobre microplacas de petri estériles sin medio. Las microplacas se situaron bajo una corriente de aire estéril en una campana de ﬂujo laminar durante 24 horas. Las placas quedaron secas tras2-3horas de incubación. Transcurridas 24 horas de incubación se resuspendieron en 1 ml de solución M9 estéril. Partiendo de esta solución se realizaron diluciones seriadas que se sembraron en placas de TSA. Del recuento de UFC/ml de esta segunda siembra se calcularon las proporciones de supervivencia en referencia alprimer conteo. Estos ensayos se realizaron por triplicado. Los resultados se expresaron como la media de los tres ensayos en porcentaje, tomando como referenciadel 100%los datos húmedos.La desviación estándarala media permitióel cálculodelaTde student para estudiar si las diferencias en supervivencia fueron signiﬁcativas. De las 17 cepas aisladas en estas condiciones se identiﬁcó el microorganismo 4J2A2por ser una cepa con niveles de tolerancia a la desecación signiﬁcativamente superioresalas del control positivo Acinetobacter calcoaceticus (PADD68). Dicha cepa 4J2A2 pertenece algénero Rhodococcus sp. Estos resultados supusieron un 17% de aislados tolerantes a la desecación frente a un 0,5% de los aislados de las mismas muestras de suelo sin tratar con cloroformo. Esta cepa se caracterizó mediante secuenciación del ADNr 16Sy comparación de la secuencia con los presentes en la bases de datos, así como mediante estudios metabólicos BIOLOG e hibridación del ADN-ADN con la especie más cercana. La Fig. 1 muestra los valores de tolerancia de las cepas aisladas.

1.2. Extracción de productos del ordeñado bacteriano

Paralaextraccióndelosproductosdel ordeñado bacterianoyconelﬁnde identiﬁcarlas moléculas acumuladas con capacidadparaproteger biomoléculas sensiblesala desecaciónse recurrióaunaestrategia basadaentres pasos.En un primer paso se realizó una extracción de las moléculas acumuladas mediante una variación de la técnica conocida como “ordeñado bacteriano” generada por los inventores. En un segundo paso se realizó un ensayo de xeroprotección con las sustancias obtenidas para identiﬁcar la capacidad de las mismas para proteger enzimas frente a la desecación.

Dado quela producciónyacúmulode sustanciasxeroprotectoras se realizó en medio con minerales, se procedióa identiﬁcarlas fuentesde carbonomás apropiadasparael cultivodelas cepasen medio mineralM9.Paralaobtenciónde sustancias con capacidadxeroprotectora se cultivaron enmedio mineral conla fuentede carbono apropiada (fructosa) las célulasde dicha cepa hastala obtenciónde una biomasa suﬁciente.Tras este acúmulo,lascélulasse depositaron sobreplacasdelmismomedioconagarparala produccióndemedio sólido.Entrelas célulasyelmediosedepositó un ﬁltro estérilde0,4micraspara permitirelpasode nutrientesalas célulasy su posterior recogidaymanipulación. Las placas con ﬁltrosycélulas se sometierona un secado por corrientede aire estéril durante24 horas. Como control positivo se incluyó Halomononas elongata, dado que es una cepa reconocida como halotolerante (SaberyGalinski, 1998. Biotechnol. Bioeng., 57: 306-313)y a P. putidaKT2440 como cepa halosensible (De Castro et al., 2000. Appl. Environ. Microbiol., 66:4142-4144).

Con este ﬁn se inocularon la cepa seleccionada como hipertolerantes a desecación 4J2A2. Además se incluyó a H. elongata como control positivo dado que ya había sido empleada por Sauery Galinski para la obtención de hidroxiectoína,ycomo control negativo se incluyó E. coli como ejemplode cepa haloyxerosensible. Dichos inóculos se incubaron en agitación durante 48 horas. A continuación, se centrifugaron las muestras durante 10 minutos a

10.000 rpm enuna centrifuga BeckmanAvanti-J25y se retiróla fracción sobrenadante, resuspendiendoel sedimento bacteriano en 20 ml de solución M9 estéril y se depositaron sobre ﬁltros. Tras 24 horas, los ﬁltros, sometidos a desecación mediante una corrientede aire estéril, se separaron del medioyse depositaron en tubos con agua destilada estéril dejando incubar20 minutosa 30ºCy150 rpm. Consecutivamente se repitióel mismo procesode centrifugado, se desechóel precipitado bacterianoyse ﬁltróel sobrenadante(utilizandoun ﬁltrode0,22 µm). El producto ﬁltrado de cada muestra se dividió en dos fracciones, una de las cuales se utilizó para determinar la actividad xeroprotectora del sobrenadante (fracciónde ordeñado)yla otraparala identiﬁcaciónycaracterizacióndelos compuestos presentesen esta fracción. Ambas fraccionesse sometieronaun procesode secado utilizandoun lioﬁlizador(LabconcoFreezone 6)durante 48 horas obteniéndose un sedimento que fue resuspendido en 100 µl de agua milliQ estéril. Una vez lioﬁlizado, el Producto de Ordeñado Bacteriano (POB) se solubilizó en 100 microlitros de agua. Estas solucionesde POBs se utilizaron en estudios de xeroprotección.

En la tabla1 se pueden observar las composiciones de los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J2A2 tras su extracción mediante choque hiper/hipoosmótico (4J2A2), o tras su extracción por secado mediante incubación alaire (4J2A2D). Asimismo,enlaFig.3 se muestralaactividadlipasa(en porcentaje relativoaun100%deactividad del control positivo) tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos compuestos químicos dela composición 4J2A2D sintética (fructosa, ácido glutámico, beta-hidroxibutirato, acetatoylactato al 10%). El control positivo es trehalosaal 10%.Elcontrol negativo se corresponde conla ausenciade compuestos como aditivo previoa la desecación de la enzima. 4J2A2D sintético es la mezcla de fructosa, ácido glutámico, beta-hidroxibutirato, acetato ylactato al 10% en la misma proporción encontrada en el POBSIA de la cepa 4J2A2 mediante tratamiento de secado por incubaciónal aireyposterior hidratación siendola proporciónde fructosa, ácido glutámico, beta-hidroxibutirato, acetatoylactato,de 16:4:0,8:1:1,4 respectivamente.

Tal como puede observarse en dicha Fig. 3, la combinación de los compuestos fructosa,ácido glutámico, betahidroxibutirato, acetato y lactato (en igual proporción que la mostrada en la tabla 1 (4J2A2D) presenta un efecto sinérgicoenla conservacióndela actividad lipasayaquela sumadela actividad lipasa mostradapor composiciones que contienen los compuestos de forma aislada es menor que el resultado obtenido con dicha mezcla.

TABLA1

Composición del producto de ordeñado bacteriano (POB) de la cepa 4J2A2

1.3. Ensayo de xeroprotección de enzimas

El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad de la fracción producto del ordeñado bacteriano para proteger enzimas frenteala desecación.Para ello se utilizóla enzima lipasa.Partiendode1 µl que contenía 0,00554 unidades de lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) se adicionaron 15 µlde la fracción producto del ordeñado bacteriano a estudiar. Como control positivo se adicionaron 15 µl de una solución al 10% de trehalosa a1 µl(0,00554U)de soluciónde lipasaycomo controlnegativose añadió15 µlde aguaa1µl(0,00554 U) de solución de lipasa. Las mezclas de 16 µlcon lipasa se depositaron en un microtubo de2 ml de capacidady se secaron a 50ºC durante 120 minutos. Unavez secas se incubarona 100ºC durante5minutos. Finalmente fueron almacenadasenun desecadoratemperatura ambiente durante24 horas.Pasadoel tiempode incubación,las reacciones se resuspendieron en 50 µlde una solucióndeTrisHCl(50mM)yse transﬁrierona un microtubo junto con 950 µl deTrisHCl(50mM)pH8y1mlde Soluciónde Sustrato.La determinacióndela capacidadxeroprotectoradecada fracción producto de ordeñado bacteriano (POB) se determinó por el ensayo de medición de la actividad lipasa.

Parala medidadelaactividadlipasase utilizóunavariacióndel método descritoporGuptaycolaboradores(2002) consistente en la cuantiﬁcación espectrofotométrica del p-nitrofenol liberado por la enzima lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100mg)a partirdel sustrato p-nitrofenol palmitato (pNPP) (Gupta et al., 2002. Analytical Biochemistry,311:98-99).Paraelloseutilizó1mlde mediolibrede células(985 µldeTris-HCl 0,05M juntoa 15 µldePOB obtenidoporel métododel “ordeñado bacteriano”) mezclado con1mlde solución sustratodeun cultivo enfase estacionaria.Esta mezclade ensayoseincubóa30ºC durante30 minutosen microtubos estérilesde2 ml.La reacciónseparó mediante incubacióna 100ºC durante4minutosen termobloquey2minutosa-20ºC.La absorbancia se midió en un espectrofotómetro HitachiU-2000a una longitudde ondade 410 nm.La solución sustrato (SS)se preparó mezclando10mlde soluciónA(30mgdepNPPen10mlde isopropanol) con90mlde soluciónB(0,1gde gomaarábigay0,4mldeTritónX-100en90mltampónTris-HCl50mMpH8).Lamezclade soluciónAyBseagitó suavemente hasta su totaldisolución.La Fig.2muestra losvaloresde toleranciade las cepas aisladas.

Ejemplo2

Ensayo de xeroprotección de microorganismos

El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad para proteger células vivas de Escherichia coli MC4100 frentea desecación medianteelempleodelproductode ordeñado bacteriano(POB)asícomolosextraídosporSecado mediante IncubaciónalAire(POBSIAs)dediversascepasxerotolerantesdeformaanálogaala descritapor Manzanera et al., (2002) (Manzanera et al., 2002. Applied andEnvironmental Microbiology 68: 4328-33).Para ello se utilizó un preinóculo de E. coli, a partir del cual se inoculó medio mínimo más glucosa como fuente de carbono adicionados de 0,6Mde NaCl hasta alcanzar una densidad óptica inicialde 0,05.Tras12 horasde incubacióna 37ºC en agitación, se centrifugaron alícuotas de1 ml del cultivo crecido. Las células de E. coli se resuspendieron en una solución al 10%de los POBso POBSIAsextraídosde las célulasxerotolerantes(extraídos según se describe anteriormente)y además,1,5%depolivinilpirrolidona(PVP). Igualmentese realizólamismaexperiencia mediantela combinacióny mezclade sustratos comerciales identiﬁcados en POBsy POBSIAs en iguales proporciones, a los que se llamaron POB sintético o POBSIA sintético en contraposición al directamente extraído de células que llamamos natural. En el caso de los POB/POBSIA sintéticos la mezcla se realizó en una solución al 34,2%. La suspensión de células en las distintas solucionesse sometierona condicionesde desecaciónporvacíosin congelación,enun congelador-desecador modiﬁcado (Dura -Stop µ P;FTS Systems, Stone Ridge,NY)a 30ºCde temperatura mediay100mTorr(2Pa; 2x10−5 atmósferas) durante 20 segundos, con una rampa de temperatura de 2,5ºC/min con 15 minutos de pausa después de cada incremento de 2ºC, hasta llegar a la temperatura máxima de 40ºC.

Las muestras se sellaronalvacíoy se almacenarona 30ºC hasta su ensayode viabilidada tiempo1,15y30 días. Pasado este tiempo las muestras se resuspendieron en1 ml de LBy se realizaron ensayos de viabilidad mediante siembra en placadeLB sólido que se incubaron24 horasa 37ºC, parael conteode UFCycomparación con las UFC antes del secado, para de esta forma poder calcular la supervivencia de las muestras.

En la Fig.4 se observa cómo las composiciones sintéticas POBsy POBSIAs de la cepa 4J2A2 produjeron un aumento de la supervivencia de los microorganismos respecto de la supervivencia experimentada por dichos microorganismos mediante una solución de trehalosa, cuando las soluciones estaban al 34,2% de dichos compuestos xeroprotectoresyduranteel primerdíade conservaciónasí comoalasdos semanas.Seobservaquela aportacióndelPVP 1,5% a la supervivencia es nula.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Microorganismo de la especie bacteriana Rhodococcus sp. con número de acceso CECT7625.
2.

Población bacteriana que comprende el microorganismo según la reivindicación 1.
3.

Uso delmicroorganismo segúnla reivindicación1odela población bacteriana segúnla reivindicación2parala producción de una composición xeroprotectora.
4.

Composición xeroprotectora producida por el microorganismo según la reivindicación 1 o por la población bacteriana según la reivindicación 2.
5.Composición según la reivindicación4que comprende fructosa, ácido glutámico, β-hidroxibutirato, acetatoy lactato.
6.

Composiciónsegúnlareivindicación5que comprende una proporciónde fructosa:ácido glutámico:acetato,de entre (35y45):(1,4y3,4):(0,5y1,5) respectivamente.
7.

Composición según la reivindicación 6, donde la proporción de fructosa:ácido glutámico:acetato es de entre (38 y44):(2y3):(0,7y1,3), respectivamente.
8.

Composición según la reivindicación5que comprende una proporción defructosa:ácido glutámico:β-hidroxibutirato:acetato:lactato,de entre (14y18):(3y5):(0,6y1):(0,5y1,5):(1y2), respectivamente.
9.

Composición segúnla reivindicación8, dondela proporciónde fructosa:ácidoglutámico:β-hidroxibutirato:acetato:lactatoesde entre(15y17):(3,5y4,5):(0,7y0,9):(0,7y1,2):(1,2y1,6), respectivamente.
10.Usodela composiciónsegún cualquieradelasreivindicaciones4a9parala conservaciónde materialbiológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%.
11.

Uso de la composición según la reivindicación 10, donde el material biológico es un microorganismo o una célula.
12.

Uso de la composición según la reivindicación 10, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un órgano aislado o un tejido biológico aislado.
13.

Uso de la composición según la reivindicación 10, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.
14.

Uso de la composición según la reivindicación 13, donde la molécula con actividad biológica es una enzima.
15.

Uso de la composición según la reivindicación 14, donde la enzima es una lipasa.
16. Método de obtención de la composición xeroprotectora según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9 que comprende:

a) cultivarel microorganismodelareivindicación1 ola poblacióndelareivindicación2 enun medio mineral con fructosa como fuente de carbono,

b) deshidratar los microorganismos obtenidos en el cultivo del paso (a) hasta que tengan una humedad residual igual o inferior al 10%,

c) rehidratar los microorganismos deshidratados del paso (b) en un medio hipotónico,y

d) seleccionar la fracción líquida del producto obtenido en el paso (c) que comprende la composición xeroprotectora.
17. Método según la reivindicación 16, donde el medio mineral del paso (a) es sólido.
18.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 16ó 17, donde la deshidrataciónde los microorganismos según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire.
19.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde el medio hipotónico para la rehidratación de los microorganismos según elpaso (c) es agua parcial o totalmente destilada, desionizada o desmineralizada.
20.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde además, la fracción líquida del paso (d) se deshidrata hasta que el producto xeroprotector tenga una humedad residual igual o inferior al 10%.
21.

Método para la conservación de material biológico que comprende: a) mezclarla composiciónxeroprotectorasegún cualquieradelasreivindicaciones4 a9 con una muestra

de material biológico,y b) deshidratar el producto obtenido en el apartado (a) hasta una humedad residual igual o inferior al 10%.
22.

Método según la reivindicación 21, donde el material biológico es un microorganismo o una célula.
23.

Método según la reivindicación 21, donde el material biológico del paso (a) es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un órgano aislado o un tejido biológico aislado.
24.

Método según la reivindicación 21, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.
25.

Método según la reivindicación 24, donde la molécula con actividad biológica es una enzima.
26.

Método según la reivindicación 25, donde la enzima es una lipasa.
27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, donde la deshidratación de la mezcla de la composiciónxeroprotectoraydel material biológicosegúnelpaso(b)sellevaacabopormediodeuna solución hipertónicao por medio de una corriente de aire.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 200931117

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 04.12.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12N1/20 (2006.01) C12R1/01 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A

LEBLANC J.C., et al. Global response to desiccation stress in the soil actinomycete Rhodococcus jostii RHA1. 2008. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 74, No. 9, páginas 2627-2636. 1-27

A

SHUKLA M., et al. Multiple-stress tolerance of ionizing radiation-resistant bacterial isolates obtained from various habitats: correlation between stresses. 2007. Current Microbiology. Vol. 54, páginas 142-148. 1-27

A

ALVAREZ H.M., et al. Physiological and morphological responses of the soil bacterium Rhodococcus opacus strain PD630 to water stress.2004. FEMS Microbiology Ecology. Vol. 50, páginas 75-86. 1-27

A

WANG Y., et al. Sequence and expression of the bpdC1C2BADE genes involved in the initial steps of biphenyl/chlorobiphenyl degradation by Rhodococcus sp. M5. 1995. Gene. Vol. 164, páginas 117-122. 1-27

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 09.05.2011

Examinador I. Rueda Molins Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 200931117

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12N, C12R Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXT

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200931117

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 09.05.2011

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-27 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-27 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200931117

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

LEBLANC J.C., et al. Global response to desiccation stress in the soil actinomycete Rhodococcus jostii RHA1. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 74, No. 9, páginas 2627-2636. 2008

D02

SHUKLA M., et al. Multiple-stress tolerance of ionizing radiationresistant bacterial isolates obtained from various habitats: correlation between stresses. Current Microbiology. Vol. 54, páginas 142-148. 2007

D03

ALVAREZ H.M., et al. Physiological and morphological responses of the soil bacterium Rhodococcus opacus strain PD630 to water stress.2004. FEMS Microbiology Ecology. Vol. 50, páginas 75-86. 2004

D04

WANG Y., et al. Sequence and expression of the bpdC1C2BADE genes involved in the initial steps of biphenyl/chlorobiphenyl degradation by Rhodococcus sp. M5. Gene. Vol. 164, páginas 117-122. 1995
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La solicitud de patente divulga un microorganismo de la especie bacteriana Rhodococcus sp. con número de acceso CECT7625, así como una composición xeroprotectora producida por dicho microorganismo.

Los documentos D01, D02 y D03 divulgan especies del género Rhodococcus sp. que presentan tolerancia frente a condiciones de desecación.

Ninguno de los documentos citados refleja de manera detallada las características de la especie bacteriana Rhodococcus sp. empleada, por lo que, no se puede afirmar que estás tengan similares características a las que presenta Rhodococcus sp. con número de acceso CECT7625. Por tanto, las reivindicaciones 1-27 presentan novedad y actividad inventiva según lo establecido en los Artículos 6 y 8 LP11/1986.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/4