ES2362026B2

ES2362026B2 - Cepa bacteriana cect7623, usos y producto xeroprotector producido por la misma.

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Publication number: ES2362026B2
Application number: ES200931116A
Authority: ES
Inventors: Maximo Manzanera Ruiz; Jesus Juan Gonzalez Lopez; Juan Jesus Narvaez Reinaldo; Lucia Santa Cruz Calvo
Original assignee: Universidad de Granada
Current assignee: Universidad de Granada
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2009-12-04
Publication date: 2011-11-15
Anticipated expiration: 2029-12-04
Also published as: ES2381289A1; ES2381289B2; ES2381660B2; WO2011067439A2; ES2381660A1; WO2011067439A3; ES2362026A1

Abstract

Cepa bacteriana CECT7623, usos y producto xeroprotector producido por la misma.#Microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623. La presente invención también se refiere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para la producción de una composición xeroprotectora, donde dicha composición comprende {be}-hidroxibutirato, ácido glucurónico, ácido glutámico, glutamina y glucosa, o comprende glutamina, glucosa y trehalosa. Además, se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado, una célula o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa. La presente invención también se refiere a un método de obtención de la composición xeroprotectora o a un método para la conservación de dicho material biológico.

Description

Cepa bacteriana CECT7623,usosyproductoxeroprotector producidoporla misma.

La presente invención se reﬁere a un microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623. Asimismo la presente invención se reﬁere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo paralaproducciónde una composiciónxeroprotectora, donde dicha composición comprende β-hidroxibutirato, ácido glucurónico, ácido glutámico, glutaminayglucosa,o comprende glutamina, glucosaytrehalosa.La presente invención tambiénse reﬁerealusodela composiciónxeroprotectoraparala conservaciónde material biológicoconun contenidode humedad residualigualoinferioral10%,dondeel material biológicoesunesunorganismoinvertebrado, una semilla,una plántula,un microorganismo,unórgano aislado,untejido biológico aislado,una célulaouna molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa. Además, la presente invención se reﬁere a un método de obtención de la composición xeroprotectora o a un método para la conservación de dicho material biológico.

Estado de la técnica anterior

La conservaciónde materiales biológicos mediante deshidrataciónyosmoconcentraciónes una tecnología conocida. Cuando la tarea de conservar biomoléculas sensibles se hizo necesaria, el simple secado mediante deshidratación fracasó,yaquese eliminabaelagua estructural, produciendola desnaturalización posteriorylapérdidadeactividad vital. La lioﬁlización se ha convertido en el método más aceptado para la conservación a largo plazo de biomoléculas sensibles, usándose por ejemplo de forma muy extendida para la conservación de vacunas atenuadas vivas.

Los métodos actualesde conservación requierende gran costo en energíaygeneralmente necesitande almacenaje abajas temperaturas.En ocasiones,despuésdesuconservaciónelmaterial biológicotieneunaactividady/o viabilidad que no alcanza los niveles satisfactorios. Los métodos de conservación, tales como el secado a temperatura ambiente, formulaciones en líquido, el congelado con crioprotectores o la lioﬁlización producen reducciones signiﬁcativas en la actividad/viabilidad del material conservado.

Los procesos usados actualmente son lentos e implican un elevado consumo de energía. Además, la lioﬁlización conﬁere sólo unnivel modestode termotolerancia enel producto ﬁnal,y se requiere aún refrigeración para reducireldeterioro durante elalmacenamiento. Éste es un problema particular para vacunas vivas destinadas a usarse en climas tropicales, ya que éstas pierden actividad, con el desafortunado resultado de que los programas de vacunación realizados en el campo en países tropicales, donde el control de la “cadena de frío” es difícil, pueden conducir ﬁnalmente a la vacunación de pacientes con vacuna inferior a la estándar o, en algunos casos, inservible.

Durantela selección naturalevolutiva, ciertas especiesde microorganismos, plantasyanimales adquirieronla notableyelegante capacidadde tolerarla deshidratación extrema, permaneciendo latentes en medios hostiles durante períodosmuylargosde tiempoyaún capacesde adquirir una actividad vital completa unavez hidratadas nuevamente. Ejemplos incluyen la “planta de la resurrección” Selaginella lepidophyla, el camarón de mar Artemia salina, la levadura Saccharomyces cerevisiae o el tardígrado Macrobiotus hufelandi. Estos organismos se denominan criptiobióticos yel procedimientoporelque sobrevivense conoce como anhidrobiosis.Todaslas especiesdeanimalesy plantas que presentan esta capacidad, contienen moléculas protectoras formadoras de cristales amorfos como el disacárido trehalosa(α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranósido).

La formacióny uso de los cristales amorfos está bien documentada (Manzanera et al., 2002. Appl Environ Microbiol, 68: 4328-4333). Algunos de los conservantes que forman estos cristales son adecuados para este tipo de conservación e incluyen hidratos de carbono no reductores como la trehalosa, hidroxiectoina, maltitol, lactitol (4O-α-D-glucopyranosyl-D-glucitol), palatinit [mezcla de GPS(α-D-glucopiranosil-1-6-sorbitol)yGPM(α-D-glucopiranosil-1-6-manitol)]y sus componentes individuales GPSy GPM. Los glicósidos no reductores de compuestos polihidroxilados tales como neotrehalosa, laconeotrehalosa,galactosil-trehalosa, sacarosa, lactosacarosa, raﬁnosa, etc. Otros conservantes formadores de cristales amorfos incluyen aminoácidos tales como la hidroxiectoina.

La presencia de agua en el estado seco es generalmente inferior a 0,2 g/g de peso celular seco en la mayoría de los criptobiontes. Estos niveles de agua son suﬁcientes para que estos organismos invertebrados o microorganismos resistan la deshidratación extrema, temperaturas elevadas, radiaciones ionizantes o también, en algunas especies de tardígrados, presiones de hasta 600 MPa.

Es conocido que las biopelículas(subaerial bioﬁlms), formadas por bacterias del género Rhodococcus sp. entre otras, son capaces de producir compuestos osmoprotectores, es decir, sustancias extracelulares poliméricas (EPS) (Gorbushina, 2007. Environmental Microbiology, 9(7): 1613-1631). Asimismo, Ortega-Morales et al. (2007) (Ortega-Morales et al.2007. JournalofApplied Microbiology,102:254-264), describen bacteriasdelas biopelículasdelaszonas intermareales tropicales, donde se han aislado bacterias que pertenecen al género Microbacterium sp. como fuente denuevosexopolímeros protectoresdelas célulascontraladesecación.Porotraparte, LeBlanc(2008)(LeBlanc,2008. Applied and environmental microbiology, 74(9): 2627-2636), se reﬁere al microorganismo Rhodococcus jostii RHA1, un actinomiceto con capacidades metabólicasfavorables para la biorremediación de suelos contaminados, capaz de secretar los osmoprotectores ectoinaytrehalosa.

Explicación de la invención

La presente invención se reﬁere a un microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623. Asimismo la presente invención se reﬁere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo parala producciónde una composiciónxeroprotectora, donde dicha composición comprende β-hidroxibutirato, ácido glucurónico, ácido glutámico, glutaminayglucosa,o comprende glutamina, glucosaytrehalosa.La presente invención también se reﬁere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula,unmicroorganismo,unórgano aislado,un tejido biológico islado, una célulaouna molécula con actividad biológicacomopor ejemplo una enzima con actividad lipasa. Además,la presenteinvenciónse reﬁere a un método de obtención de la composición xeroprotectora o a un método para la conservación de dicho material biológico.

La capacidadpara conservar material biológico sensiblepor periodosdetiempo indeﬁnidoen formaactivao viable es de importancia en aplicaciones para los sectores médico, agrícola e industrial. En la presente invención se ofrecen herramientas para solucionarla conservacióndematerial biológicoque presenta diﬁcultades parasu estabilización.El material biológico preservado con la composición xeroprotectora producida por el microorganismo con nº de acceso CECT7623es establepor periodoslargosde tiempo.Tal comose muestraenlos ejemplosdela presenteinvención,el uso de una composición que contiene cada uno de los componentes por separado para la conservación de la actividad de una enzima lipasa, es decir,la suma del efecto en la conservación de la actividad enzimática de una composición que contiene β-hidroxibutirato,ácido glucurónico, ácidoglutámico, glutaminayglucosa,o glutamina, glucosaytrehalosa, es menor que el efecto de conservación que produce una composición que contiene todos los componentes, es decir, la composición xeroprotectora tiene un efecto sinérgico en su capacidad de conservar material biológico.

Por tanto, un aspecto de la presente invención se reﬁere a un microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623. Dicho microorganismo es tolerante a la desecación. Dicha cepa ha sido depositada en la colección española de cultivos tipo (CECT) el 10 de noviembre de 2009yle correspondió el nº de depósito CECT7623.La direccióndedicha Autoridad Internacionalde depósito es: UniversidaddeValencia/Ediﬁcio deinvestigación/CampusdeBurjassot/46100 Burjassot(Valencia).

En adelante se podrá hacer referencia al microorganismo CECT7623 con el término “4J27”.

La clasiﬁcación cientíﬁca de la cepa CECT7623 de la presente invención es: Reino: Bacteria/Filo: Actinobacteria/Orden: Actinomycetales/Familia: Micrococcineae/Género: Arthrobacter.

Las características de dicha cepa son:

-: Los sustratos que la bacteria CECT7623 oxida o fermenta son: Dextrina, inulina, tween 80, N-acetil-D-glucosamina, N-acetil-D-manosamina, D-arbulina, L-arabinosa, D-galactosa, alfa-D-glucosa, maltosa, maltotriosa, Dmanitol,D-manosa,D-melezitosa,D-melibiosa, beta-metilD-glucosida, palatinosa,D-psicosa,D-raﬁnosa,L-ramnosa,D-ribosa, salicina, sedoheptulosa,D-sorbitol, sucrosa, turanosa, xilitol,D-xilosa, ácido alfa-hidroxibutírico, ácido beta-hidroxibutírico, ácidoganma-hidroxibutírico, ácidop-hidroxifenil ácetico, ácido alfa-cetovalérico, metil piruvato, ácido propiónico,D-alanina,L-alanina,ácidoL-glutamico, ácidoL-piroglutamico,L-serina, adenosina, inosina, timidina, uridina, adenosina-5’-monofosfato.

-: La temperatura máxima tolerada para el crecimiento de esta cepa son 40ºC. La temperatura mínima para detectar crecimientose encontró entre10ºCy15ºC, mientrasquesu temperaturaóptimade crecimientofuede entornoa35ºC. Fue incapazde crecerapH por encimade12 aunquesíapH9.

-: ElpHmínimo toleradoparael crecimientodeestacepase encontró entrepH5ypH7, considerándoseeste como pH óptimo para el crecimiento de esta cepa.

-: Igualmente fue incapaz de proliferar en medio LB con una concentración de NaCl igual o superior a 2 M, quedandola concentración máxima tolerada entre0,8My2Mde NaCl. Esta cepa mostróun crecimiento óptimoa una concentraciónde0,2Mde NaCl.

-: Ensayos de sensibilidad a antibióticos mostraron halos de inhibición del crecimiento en los cinco antibióticos ensayados en disco: rifampicina30 (3,47 cm); estreptomicina25 (1,57 cm); tetraciclina20 (1,50 cm); cloramfenicol50 (3,40 cm); kanamicina30 (1,50 cm).

Asimismo,lapresenteinvención también se reﬁerea un microorganismo derivado del microorganismo depositado con nº de acceso CECT7623. El microorganismo derivado puede producirse de forma intencionada, por métodos mutagénicos conocidos en el estado de la técnica como por ejemplo, el crecimiento de dicho microorganismo original en exposición con conocidos agentes capaces de forzar mutagénesis.

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere a una población bacteriana que comprende el microorganismo depositado con nº de acceso CECT7623. La población bacteriana puede estar formada por otras cepas de microorganismos de cualquier especie. La población bacteriana es un conjunto de células de microorganismos donde al menos hay una célula de dicho microorganismo depositado con nº de acceso CECT7623, en cualquier fase del estado de desarrolloy en cualquierfasede crecimiento, estacional o estacionaria, independientementedela morfologíaque presente, en forma de coco, bacilo o morfologías intermediarias de las anteriores.

En adelante se podrá hacer referencia al microorganismo o a la población bacteriana como el “microorganismo de la presente invención” o el “microorganismo de la invención”.

Otro aspectomásdelapresenteinvenciónse reﬁerealusodel microorganismodelainvenciónparala producción de una composición xeroprotectora.

Un aspecto más de la presente invención se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismodelainvención.Para referirseala composiciónxeroprotectoradela presenteinvención se puede emplearel términoProductode Ordeñado Bacteriano (POB).El término “composiciónxeroprotectora”tal comose entiendeen la presente invención, se reﬁere a una composición que previene los efectos adversos de la desecación total o parcial de material de origen biológico o material de origen sintético. El materialbiológico se reﬁere a cualquier compuesto producido directamente por un organismo vivo en cualquier estado de desarrollo, en cualquier compartimento celular, sea cual sea la naturaleza, composición o estructura del mismo, o que procede de un organismo que ya no está vivo. Dicho material biológico puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una célula, ácido nucleico, proteína, enzima, polisacárido, lípido, fosfolípido, liposomas,virus, partículas viraleso cualquier moléculaque comprenda cualquieradelos elementosanterioreso cualquier moléculaorgánicaquetengaun efectofarmacológico, inmunogénicoy/o ﬁsiológico de acción local y/o sistémica. El material biológico puede comprender agentes terapéuticos; agentes anti-infectivos como antibióticos, antivirales; analgésicos o combinaciones de analgésicos; antiartríticos, antiasmáticos, antiinﬂamatorios, antioplásticos, antipruríticos, antipsicóticos, antipiréticos, antiespasmódicos, preparaciones cardiovasculares (incluyendo bloqueantes de canales de calcio, bloqueadores beta, o antiarrítmicos), agentes contra la hipertensión, diuréticos, vasodilatadores, estimuladores del sistema nervioso central, antitusivos, preparaciones anti resfriados, descongestionantes, agentes de diagnóstico, hormonas, estimuladores del crecimiento óseo, inhibidores de la resorción de la médula ósea, inmunosupresores, relajantes musculares, psicoestimulantes, sedantes, tranquilizantes, proteínas, péptidoso fragmentosde los mismos (tanto naturales, como sintéticos, como productos recombinantes), moléculasde ácidos nucleicos (tanto en forma polimérica de dos o más nucleótidos de ADN o ARN, incluyendo tanto moléculas de cadena doble como de cadena sencilla, construcciones genéticas, vectores de expresión, ARN antisentido, sentido

o moléculas ARNi)o nucleótidos (como por ejemplo, pero sin limitarse,eldATP, dCTP, dGTP, dTTPo dUTP,de utilidad en la técnica de PCR, secuenciación, etc). El material de origen sintético se reﬁere a un tipo de material que no ha sido producido o sintetizado por un organismo vivo directamente sino que ha sido creado por el ser humano como por ejemplo, pero sin limitarse, una secuencia de ADN ampliﬁcada por PCR, o una proteína o enzima modiﬁcada intencionadamente o no. Asimismo, el material biológico se reﬁere también a un organismo invertebrado, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido aislado o una célula.

Una realización preferida de la presente invención se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismodelainvenciónoa una composiciónxeroprotectora sintética,que comprende β-hidroxibutirato, ácido glucurónico, ácido glutámico, glutaminayglucosa.

El β-hidroxibutirato (o beta-hidroxibutirato) es el anión que deriva de la disolución del ácido β-hidroxibutírico. El ácido glucurónicoesunácido carboxílico similaralaglucosaperoque presentaungrupo carboxiloenel carbono6,su fórmula químicaesC6H10O7.La composicióndela presenteinvenciónpuede comprenderlasalde este ácido,es decir glucuronatos.El ácido glutámicoesa unodelos20 aminoácidosque forman partedelas proteínas.La composiciónde la presente invención también puede comprender glutamato. La glutamina es otro de los 20 aminoácidos que forman parte de las proteínas, derivado del ácido glutámico, donde una cadena lateral de una amida del ácido glutámico se forma mediante el reemplazo del hidroxilo del ácido glutámico con un grupo funcional amina.

Una realización más preferida se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invenciónoala composiciónxeroprotectora sintéticaque comprende una proporciónde entre0,5y1,5de β-hidroxibutirato:1y2de ácido glucurónico:1y3de ácido glutámico:3y5deglutamina:5y9de glucosa.Es decir, una proporción(β-hidroxibutirato):(ácido glucurónico):(ácido glutámico):(glutamina):(glucosa), de (0,5 a 1,5) : (1 a 2) : (1a3):(3a5):(5a9), respectivamente.Unarealizaciónaúnmáspreferidase reﬁereala composiciónxeroprotectora donde la proporción de(β-hidroxibutirato):(ácido glucurónico):(ácido glutámico):(glutamina):(glucosa), es de (0,7y 1,3):(1,1y1,7):(1,5y2,5):(3,5y4,5):(6y8). Preferiblementela composición xeroprotectora tiene unaproporción de(β-hidroxibutirato):(ácido glucurónico):(ácido glutámico):(glutamina):(glucosa) de (1):(1,3):(2):(4):(6,8), respectivamente.

Otra realización preferida de la presente invención se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismodelainvención,oa unacomposiciónxeroprotectora sintética,que comprende glutamina, glucosay trehalosa.

Una realización más preferida se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invenciónoala composiciónxeroprotectorasintéticaque comprendeuna proporciónde entre0,5y1,5de glutamina, 2 y 4 de glucosa, y 4 y 8 de trehalosa. Es decir, una proporción (glutamina):(glucosa):(trehalosa), de (0,5 a 1,5) : (2 a 4) : (4 a 8), respectivamente. Una realización aún más preferida se reﬁere a la composición xeroprotectora dondela proporciónde(glutamina):(glucosa):(trehalosa), esde(0,7y1,3):(2,5y3,5):(5y7), respectivamente.

Preferiblemente la composición xeroprotectora tiene una proporción de (glutamina):(glucosa):(trehalosa), de (1) : (2,8):(5,8), respectivamente.

El término “proporción” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a la correspondencia debida de los elementosde la composición(β-hidroxibutirato, ácido glucurónico, ácido glutámico, glutaminayglucosa;o glutamina, glucosaytrehalosa) relacionados entre sí.Es decir, se reﬁerea una relación matemática que vinculalos elementosdela composición.Paraque sirvade ejemplo,la composiciónxeroprotectoraque tiene una proporciónde (β-hidroxibutirato):(ácido glucurónico):(ácido glutámico):(glutamina):(glucosa) de (1):(1,3):(2):(4):(6,8), respectivamente, puede tener por ejemplo, concentraciones de (2):(2,6):(4):(8):(13,6) mg de cada elemento respectivamente/ ml.

En adelante se podrá hacer referencia a cualquier composición descrita en los párrafos anteriores como “composición de la presente invención” o “composición de la invención”.

Otro aspecto de la presente invención es el uso de la composición de la invención para la conservación de material biológicoconun contenidoenhumedadresidualigualoinferioral10%.El contenidode humedad residualdel material biológico puede ser igual o inferior al 9, 8, 7, 6 5, 4, 3, 2 ó 1% de humedad residual. La conservación de dicho material puede llevarse a cabo mediante la estabilización del mismo. En la presente invención, para referirse a este tipo de material biológico se puede emplear la expresión “material biológico en estado seco”. En estas condiciones, el conservanteo estabilizador coalesce para alcanzar un estado no-cristalino, vítreo,ysólido (por ejemplo un cristal amorfo). Las partículas de cristal orgánico que están formadas al secar el material biológico con el estabilizador están cubiertas por el estabilizador que produce una alta estabilidad al reducir drásticamente las reacciones químicas.De esta forma el material biológico seco está incrustado en el cristal amorfo formado por el estabilizador.

El material biológico seco en presencia del estabilizador que forma el cristal amorfo es resistente a plásticos en estado líquido, mientras que el material que no está seco en presencia de estos estabilizadores no es resistente a plásticos en estado líquido.

El material biológico seco en estas formas puede encontrarseen estado no particuladoypuede suministrarse en formas por ejemplo,pero sin limitarse, molduraso sólidos en3dimensiones como por ejemplo, pero sin limitarse, bloques, pastillas, parches,hojas, bolas,o pepitasde material biológico seco.

El término “humedad residual” tal como se emplea en la presente invención se reﬁere a la cantidad de humedad que contieneunproductodespuésdepasadoporalgúntipodeprocesocapazdeeliminaraguadelmismo.Lahumedad residual es el porcentaje de masa del producto que corresponde a agua respecto del totalde la masa. Es decir un valor de humedadresidualdeun productoigualaun10% signiﬁcaque10gdecada100gdel producto correspondenaagua. La humedad residual puede ser medida mediante métodos conocidos en el estado de la técnica como por ejemplo, pero sin limitarse, mediante el método titrimétrico, el método azeotrópico o el método gravimétrico.

El término “conservaciónde material biológico”hace referenciaal mantenimientoo cuidadodela permanenciade las características intrínsecas del material biológico.

Una realización preferida se reﬁere al uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo,unórganoaislado,untejidobiológicoaisladoounacélula.Lacélulapuedeserprocariotaoeucariota. La célulapuedeseruna céluladeun microorganismoen cualquier estadode desarrollo.Lacélulapuedeser somáticao germinal,vegetaloanimal.Dichacélulapuedeprocederdecualquierorganismoomicroorganismoypuedepresentarse en cualquier estado de diferenciación, como por ejemplo,pero sin limitarse, procedente de un cultivo de un tejido celular o de órganos, esperma, óvulos o embriones. La célula puede ser una célula madre totipotente, multipotente

o unipotente. El microorganismo puede ser unicelular o multicelular. El microorganismo unicelular se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, E. coli, S. typhimurium, P. putida., Salmonella spp, Rhizobium spp, Pseudomonas spp, Rhodococcus spp, Lactobacillus spp.o Biﬁdobacteríum spp. El microorganismo pluricelular puede ser por ejemplo, pero sin limitarse, un nematodo.

La célula conservada por la composición de la presente invención es una célula viable es decir, es capaz de realizar las funciones normales de la célula incluyendo la replicaciónydivisión celular. Por otra parte la célula puede haber sidotratada,manipuladaomutadaantesdesu conservación.Porejemplo,perosinlimitarse,unacélulapuedehaberse hecho competente para transformaciones o transfecciones, o puede contener ácidos nucleicos recombinantes. Las célulasquese conservanpuedenformarunapoblaciónhomogéneao heterogénea,porejemplo,perosin limitarse,una librería de células en la que cada una contiene una variación de algún ácido nucleico. Preferentemente las células son células no anhidrobióticas (células sensibles a desecación) como por ejemplo, pero sin limitarse, células procedentes de microorganismos procariotas no anhidrobiontes que generalmente no sean esporulantes.

La conservación del microorganismo puede mejorarse mediante cultivo bajo condiciones que aumenten la concentración intracelular de trehalosa o de otros estabilizadores formadores de cristales amorfos. Por ejemplo, pero sin limitarse,encondicionesdealta osmolaridad(alta concentracióndesales)que estimulenla producción intracelularde trehalosa o de otros estabilizantes formadores de cristales amorfos.

El organismo invertebrado es pero sin limitarse, una larva de insecto o un crustáceo. Dichos organismos invertebrados pueden ser preservados en condiciones de desecación, permitiendo la actividad vital del mismo, de modo que, cuando se rehidratan, dichos organismos presentan la capacidad de movimiento. La plántula es una planta en sus primeros estadios de desarrollo, desde que germina hasta que se desarrolla.

La composición de la invención puede usarse para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológicoesunorganismovertebrado pertenecienteala SuperclaseTetrapoda(con cuatroextremidades), Clase Amphibia (anﬁbios)o Clase Reptilia (reptiles),o cualquierade sus partes(VernonyJackson, 1931. The biologicalbulletin,60:80-93).VernonyJacksonllevaronacabounestudiosobrela ranaLeopardo(Rana pipiens), enel quedeformanaturalsesecasupiel,lengua,bazo,ehígadoconunapérdidadeaguadeentreun43-81%del contenido de agua total.

Un órgano aislado o un tejido biológico aislado (incluida la sangre) pueden conservarse mediante la composición de la presente invención. En Serrato et al. (2009) pueden observarse resultados de protocolos de crioperservación de tejidos biológicos (Serrato et al., 2009. Histology and histopathology, 24: 1531-1540).

Una realización más preferida se reﬁere al uso de la composición de la invención, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. El término “molécula con actividad biológica” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a una molécula biológica cuyo origen sea un organismo vivo o que haya estado vivo, o derivados o análogos de dicha molécula. El término “derivados” se reﬁere a moléculas obtenidas por la modiﬁcación de una molécula con actividad biológica, que presentan una funcionalidad similar. Por otra parte, el término “análogos” se reﬁerea moléculas quepresentan una función similarala molécula con actividadbiológica.

Según otra realización aún más preferida de la composición de la presente invención la molécula con actividad biológica es una enzima. Una realización todavía más preferida de la presente invención se reﬁere al uso de la composición de la invención, donde la enzima es una enzima con actividad lipasa. La enzima con actividad lipasa se selecciona de la lista de enzimas con números EC(Enzyme Commission numbers)que comprende las hidrolasas de éster carboxílico(EC 3.1.1)EC 3.1.1.1 (Carboxilesterasa),EC 3.1.1.2 (Arilesterasa),EC 3.1.1.3(Triacilglicerollipasa),EC 3.1.1.4(FosfolipasaA(2)),EC 3.1.1.5 (Lisofosfolipasa),EC 3.1.1.23 (Acilglicerol lipasa),EC 3.1.1.24(3oxoadipato enol-lactonasa),EC 3.1.1.25 (1,4-lactonasa),EC 3.1.1.26 (Galactolipasa),EC 3.1.1.32(FosfolipasaA(1)), EC3.1.1.33(6-acetilglucosa deacetilasa),EC 3.1.1.34 (Lipoproteína lipasa). Preferiblementelaenzima lipasa tiene actividadTriacilglicerollipasa (EC 3.1.1.3).

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere a un método de obtención de la composición xeroprotectora de la invención que comprende:

a) cultivar el microorganismo de la invención en un medio de cultivo con glucosa como fuente de carbono,

b) deshidratar los microorganismos obtenidos en el cultivo del paso (a) hasta que tengan una humedad residual igual o inferior al 10%,

c) rehidratar los microorganismos deshidratados del paso (b) en un medio hipotónicoy

d) seleccionar la fracción líquida del producto obtenido en elpaso (c) que comprende la composición xeroprotectora.

El medio de cultivo es cualquier medio de cultivo conocido en el estado de la técnica para el crecimiento de un microorganismo de la presente invención, por ejemplo pero sin limitarse, el medio mineral M9. Medios ricos como el medio Luria Bertani(LB)enlosquehay presentesxeroprotectores,u osmolitos naturalesno sirven, porquela bacteria preferiría tomarlos del exterior a sintentizarlos.

Una realización preferida de la presente invención se reﬁere al método de obtención de la composición xeroprotectora, donde el medio de cultivo del paso (a) es sólido. El término “sólido” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a un mediode cultivo geliﬁcado en mayoro menor grado,es decir, que comprendeagarpara facilitar su geliﬁcación o cualquier compuesto geliﬁcante.

La deshidratación de los microorganismos del paso (b) se lleva a cabo por medio de cualquier técnica conocida en el estado de la técnica. Otra realización preferida de la presente invención se reﬁere al método, donde la deshidratación de los microorganismos según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire. Preferiblemente la solución hipertónica o la corriente de aire tienen condiciones de esterilidad. La solución hipertónica es una solución que tiene mayor concentración de soluto en el medio externo que en el citoplasmadela célulasdel microorganismodelapresenteinvención,portanto,lacélulaliberaagua,esdecir,sedeshidrata.

La rehidratación de los microorganismos, descrita en el paso (c), se lleva a cabo en un medio hipotónico. El medio hipotónico o solución hipotónica es una solución que tiene menor concentración de soluto en el medio externo que en el citoplasma de la célula delmicroorganismo de la presente invención, por tanto, la célula recupera agua, es decir, se rehidrata. Una realización preferida más se reﬁere al método, donde el medio hipotónico para la rehidratación de los microorganismos según el paso (c) es agua, parcial o totalmente destilada, parcial o totalmente desionizada o parcial

o totalmente desmineralizada.

Las célulasyel medio hipotónicohande estaren contactoal menos5minutos. Preferiblemente estaránen contacto al menos 20 minutos en agitación. La obtención del medio que contiene las sustancias estabilizantes se realizarápor cualquier métodoquegaranticela separaciónde célulasdel contenido líquido, preferiblemente mediante centrifugado suave, seguido de un paso de ﬁltración. Preferiblemente se utilizarán ﬁltros de 0,4 micrómetros de diámetro de poro.

Otra realización preferida se reﬁere al método, donde además, la fracción líquida del paso (d) se deshidrata hasta queel productoxeroprotectortenga una humedad residual igualo inferioral 10%.

El producto xeroprotector de la invención se puede separar del medio de cultivo por cualquier método de concentración. Preferiblemente se utilizarán secadores de tipo lioﬁlizador que produzcan el estabilizador en estado seco. Las moléculas estabilizadoras se podrán disolvero dispersar en una proporciónde entreel10yel 30%. Esta disolucióno dispersión se añadeal material biológico que se desee conservary se someteráa desecación.

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere al método para la conservación de material biológico que comprende:

a) mezclarla composicióndelainvención con una muestrade material biológico aislado,y

b) deshidratar el producto obtenido en el paso (a) hasta una humedad residual igual o inferior al 10%.

Una realización preferida se reﬁere al método para la conservación de material biológico, donde el material biológico del paso (a) es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula.

Otra realización preferida se reﬁere al método para la conservación de material biológico, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.

Una realización más preferida de la presente invención se reﬁere al método, donde la molécula con actividad biológica es una enzima.Según una realización más preferidadela presenteinvenciónla enzima es una lipasa.

Otrarealizaciónaúnmás preferidase reﬁereacualquieradelos métodosparala conservacióndematerial biológico, dondela deshidratacióndela mezcladela composiciónxeroprotectoraydel materialbiológicosegúnel paso(b)se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire.

Cualquier método para la conservación de material biológico de la presente invención permite el empleo de dicho material en procesos de manufacturación en los cuales el material biológico sería demasiado inestable si no estuviera conservado medianteelusodela composicióndela presenteinvención.Lainvención incluyeextrusioneso moldesen losquese incluyeel material conservadopor cualquier métododela presenteinvención.Un métodode producciónde una moldura que contengabiomaterial activomediante estabilizadores puede incluir soluciones de materiales plásticos. Por ejemplo una moldura de material plástico con biomaterial activo encapsulado puede ser útil como componentes de biosensores. Por ejemplo un biosensor puede incluir bacterias que sean capaces de detectar sustancias tóxicas, patógenos o toxicidad en general.

Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otras características técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos,ventajas ycaracterísticas de la invención se desprenderán en parte de la descripciónyen parte de la práctica de la invención. Las siguientesﬁgurasyejemplosse proporcionana modode ilustración,y nosepretendeque sean limitativosdela presente invención.

Descripción de las ﬁguras

Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativoy no limitante, las siguientes ﬁguras:

Fig. 1. Muestrala viabilidaddelosdistintos aislados bacterianos seleccionados medianteexposiciónacloroformo tras 24 horas de secado al aire.

Las barrasde error muestranla desviación estándardeal menos tres réplicas.

Las cepas de microorganismos representadas en esta ﬁgura son:

1J3A, 1J14, 2J2, 2J8A, 2J12B, 2J16A, 2J30, 3J18, 6J30, Acitenobacter calcoaceticus, Pseudomonas putida, además de la cepa 4J27.

Fig. 2. Muestrala actividadlipasa(enporcentajerelativoaun100%de actividaddel control positivo)tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos componentes de productos del ordeñado bacteriano al 10% (p/v).

El controlpositivoes trehalosaal 10%.El controlnegativo(-)secorresponde conla ausenciade compuesto alguno como aditivo previo a la desecación de la enzima. 4J27 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secadoyposterior reconstitucióndela enzima en presenciadePOBextraídosdela cepa 4J27 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 4J27D es la actividad lipasa registrada tras la estabilización por secadoyposterior reconstitución de la enzima en presencia de POBSIA (Producto de Ordeñado Bacteriano extraído por Secado mediante Incubaciónal Aire) extraídosdela cepa 4J27 mediante tratamientode secadoyposterior hidratación.

Fig. 3. Muestraelporcentajede estabilizacióndela actividaddela enzima lipasapor mediode algunas mezclas de solutos contra la desecación, respecto de la estabilización por trehalosa (100%).

Fig. 4. Muestra la evolución de la supervivencia de Escherichia coli MC4100 frente a desecación mediante el empleo del producto de ordeñado bacteriano (POB) así como los extraídos por Secado mediante Incubación al Aire (POBSIAs).

4J27 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secadoy posterior reconstitución de la enzima en presencia de POB extraídos de la cepa 4J27 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 4J27D es la actividad lipasa registrada tras la estabilización por secadoyposterior reconstitución de la enzima en presencia de POBSIA.

PVP indica que además se ha adicionado 1,5% de polivinilpirrolidona (PVP).

SIN es sintético.

Tes trehalosa.

Ejemplos

Acontinuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativosyde carácter no limitante, realizados por los inventores que describen el aislamiento de las cepas dela presenteinvención así como la capacidad deproducción de compuestos xeroprotectores. En adelante se puede hacer referencia a la cepa CECT7623 con el término “4J27”

Ejemplo1

Aislamiento del microorganismopertenecienteala cepa 4J27 (CECT7623),extracciónde POB(Productos delOrdeñado Bacteriano)yensayode xeroprotecciónde enzimas

1.2. Aislamiento de la cepa 4J27 (CECT7623)

Se homogeneizó1gde suelo seco, procedentede Granada (37.182 LatitudNy3.624 LongitudO),noexpuestoa lluvia, ni riego, por un periodo superior a tres meses. El suelo se tomó del área circundante a raíces de adelfa(Nerium oleandei). Las muestras fueron homogeneizadas para obtener un grano de tierra ﬁno quegarantizara su contacto con el cloroformo.La tierrase depositóen vialesde vidrioalosqueseles añadió3mlde cloroformo puro.Trasla adición del cloroformo se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación esporádica para maximizar el contactodela muestra conel disolvente.Para eliminarel cloroformodelas muestras unavez transcurridoel tiempo de contacto, las muestras de suelo fueron depositadas en placa petri de vidrio estéril sin tapadera hasta completar la evaporación del cloroformo. Una vez secas las muestras de suelo se resuspendieron en 10 ml de TSB. Con las suspensionesde suelo se realizaron diluciones seriadasy se sembraron en placasde TSA que se incubaron48 horasa 30ºC.Trascurridoestetiempose cuantiﬁcóelnúmerode unidades formadorasdecolonias(UFC)por mililitrodecada muestra. Así, se detectaron2·105 UFC/g de suelo en las muestras sin tratar, mientras que estas se redujeron a 1,3·105 UFC/g de suelo tras 30 minutos de tratamiento.

Se seleccionaron aleatoriamente 36 cepasypara identiﬁcar las cepas que producían esporas se realizó un ensayo basadoenla diferente sensibilidaddelas célulasvegetativas con respectoalas esporasal tratamiento con calory en basealmétodo descritoporVilchezycolaboradores(Vilchez et al., 2008. Extremophiles, 12: 297-299). De esta forma se tomaron colonias independientes procedentes de placas de TSA de al menos 24 horas de crecimiento. Estas colonias se resuspendieronen1mlde soluciónM9en microtubos estérilesde1,5ml.Seguidamentese sembraron10 µlde esta suspensión en TSA. Acto seguido se incubó el resto de la suspensión en termobloque Mixing Block MB-102 a 72ºC durante 30 minutos. Nuevamente se tomaron 10 µlde cada muestrayse sembraron en placade TSA. Aquellas cepas con capacidad para tolerar el tratamiento con calor se consideraron como esporulantes, mientras que aquellas que no toleraronel tratamiento por calor se consideraron no esporulantes. Como controles positivosy negativos se utilizaron colonias de Bacillus pumilus ydeBurkholderia cepacia respectivamente. La proporción de cepas esporulantes pasó deniveles inferioresal 40% para muestras no tratadasaniveles superioresal 50% tras30 mindeexposicióndelas muestras de suelo al cloroformo.

Con el ﬁn de analizar la capacidad de tolerar la desecación de las cepas aisladas no esporulantes se realizó un estudiode desecaciónal aire.Eneste ensayose incluyó una cepade Acinetobacter calcoaceticus (PADD68) aislada del desierto de Tabernas (Almería) identiﬁcada como tolerante a la desecación en un estudio previo y que se utilizó como control positivo. Además también se incluyó en el estudio células de Pseudomonas putida KT2440 que se utilizaron como controles negativos al ser una cepa sensible a la desecación (Antheunisse et al., 1981. Antonie Leeuwnhoek, 47: 539-545; Manzanera et al., 2002. Appl. Environ. Microbiol., 68: 4328-4333).Para este ensayo se utilizaron colonias independientesde las17 cepas identiﬁcadas como no esporulantes aisladas enel estudio anteriory procedentesde placasdeTSAde72 horas para calcularsunivelde toleranciaala desecacióntaly comose indicaa continuación.

Para calcular la tolerancia a la desecación se partió de colonias aisladas procedentes de placas de TSA de 48 horas de crecimiento. Utilizando un asa estéril se tomó una única colonia que se resuspendió en1 ml de solución M9 estéril.Partiendode esta suspensión celular se realizaron diluciones seriadas que se sembraron en placasdeTSA con objeto de identiﬁcar el número de UFC/ml de partida. Por otra parte se tomaron 100 µlde cada suspensiónyse depositaron en gotas de5-10 µlsobre microplacasde petri estériles sin medio. Las microplacas se situaron bajo una corriente de aire estéril en una campana de ﬂujo laminar durante 24 horas. Las placas quedaron secas tras2-3horas de incubación. Transcurridas 24 horas de incubación se resuspendieron en 1 ml de solución M9 estéril. Partiendo de esta solución se realizaron diluciones seriadas que se sembraron en placas de TSA. Del recuento de UFC/mlde esta segunda siembra se calcularon las proporciones de supervivencia en referencia alprimer conteo. Estos ensayos se realizaron por triplicado. Los resultados se expresaron como la media de los tres ensayos en porcentaje, tomando como referenciadel 100%los datos húmedos.La desviación estándarala media permitióel cálculodelaTde student para estudiar si las diferencias en supervivencia fueron signiﬁcativas. Se aislaron 17 cepas en estas condiciones con niveles de tolerancia signiﬁcativamente superiores a los del control positivo Acinetobacter calcoaceticus (PADD68). Unadelas cepas aisladasse nombró como 4J27ypertenecealgénero Arthrobacter sp. Estos resultados supusieron un 17% de aislados tolerantes a la desecación frente a un 0,5% de los aislados de las mismas muestras de suelo sin tratar con cloroformo.Estacepasecaracterizó mediante secuenciacióndelADNr16Sycomparacióndela secuenciacon los presentes en la bases de datos, así como mediante estudios metabólicos BIOLOG e hibridación del ADN-ADN conla especie más cercana.La Fig.1muestra losvaloresde toleranciade las cepas aisladas.

1.2. Extracción de productos del ordeñado bacteriano

Paralaextracciónde los productos del ordeñadobacterianoyconel ﬁnde identiﬁcar las moléculas acumuladas con capacidad para proteger biomoléculas sensibles a la desecación se recurrió a una estrategia basada en tres pasos. En un primer paso se realizó una extracción de las moléculas acumuladas mediante una variación de la técnica conocida como “ordeñado bacteriano” generada por los inventores. En un segundo paso se realizó un ensayo de xeroprotección con las sustancias obtenidas para identiﬁcar la capacidad de las mismas para proteger enzimas frente a la desecación.

Dado quela producciónyacúmulode sustanciasxeroprotectoras se realizó en medio con minerales, se procedióa identiﬁcarlas fuentesde carbonomás apropiadasparael cultivodelas cepasen medio mineralM9.Paralaobtenciónde sustancias con capacidad xeroprotectora se cultivaron en medio mineral con la fuente de carbono apropiada (glucosa) las célulasde dicha cepa hastala obtenciónde una biomasa suﬁciente.Tras este acúmulo,lascélulasse depositaron sobreplacasdelmismomedioconagarparala produccióndemedio sólido.Entrelas célulasyelmediosedepositó un ﬁltro estérilde0,4micraspara permitirelpasode nutrientesalas célulasy su posterior recogidaymanipulación. Las placas con ﬁltrosycélulas se sometierona un secado por corrientede aire estéril durante24 horas. Como control positivo se incluyó Halomononas elongata, dado que es una cepa reconocida como halotolerante (SaueryGalinski, 1998. Biotechnol. Bioeng., 57: 306-313)y a P. putidaKT2440 como cepa halosensible (De Castro et al., 2000. Appl. Environ. Microbiol. 66:4142-4144).

Con este ﬁn se inoculó la cepa seleccionada (4J27), hipertolerante a desecación. Además se incluyó a H. elongata como control positivo dado que ya había sido empleada por SaueryGalinski para la obtención de hidroxiectoina,y como control negativo se incluyó E. coli como ejemplode cepa haloy xerosensible. Dichos inóculos se incubaron en agitación durante48 horas.Acontinuación,se centrifugaronlas muestras durante10 minutosa 10.000rpmenuna centrifuga BeckmanAvanti-J25yseretiróla fracción sobrenadante,resuspendiendoel sedimento bacterianoen20ml de soluciónM9 estérily se depositaron sobreﬁltros.Tras24 horas,los ﬁltros, sometidosa desecación medianteuna corrientedeaire estéril,se separarondelmedioyse depositaronentubosconagua destilada estérildejando incubar20 minutosa30ºCy150rpm. Consecutivamentese repitióelmismo procesode centrifugado,se desechóel precipitado bacterianoy se ﬁltróel sobrenadante (utilizando un ﬁltrode 0,22 µm). El producto ﬁltrado de cada muestra se dividió en dos fracciones, una de las cuales se utilizó para determinar la actividad xeroprotectora del sobrenadante (fracción de ordeñado)yla otra para la identiﬁcaciónycaracterización de los compuestos presentes en esta fracción. Ambas fracciones se sometierona un procesode secado utilizando un lioﬁlizador(LabconcoFreezone6)durante 48 horas obteniéndose un sedimento que fue resuspendido en 100 µlde agua milliQ estéril. Unavezlioﬁlizado,el Producto de Ordeñado Bacteriano (POB) se solubilizó en 100 microlitros de agua. Estas soluciones de POBs se utilizaron en estudios de xeroprotección.

En la tabla1 se pueden observar las composiciones de los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J27 tras suextracción mediante choque hiper/hipoosmótico (4J27),o trassuextracciónpor secado medianteincubaciónalaire (4J27D). Asimismo, enlaFig.3 se muestralaactividadlipasa(en porcentaje relativoaun100%deactividaddel control positivo) tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos compuestos químicos de la composición 4J27 sintética (glucosa+ácido glutámico, glucosa+glutamina,glucosa+beta-hidroxibutirato, fructosa+ácido glutámico, glucosa+beta-hidroxibutirato al 10%). Las mezclas descritas se combinaron en la misma relación descrita en la mezcla POBdela presenteinvenciónyde esa mezcla se tomaron10gyse disolvieron en 100mlde agua.El control positivo es trehalosa al 10%. El control negativo se corresponde con la ausencia de compuestos como aditivo previo a la desecación de la enzima (agua).

Tal como puede observarse en dicha Fig. 3, la combinación de los compuestos glucosa+ácido glutámico, glucosa+glutamina, glucosa+beta-hidroxibutirato, fructosa+ácido glutámico, glucosa+beta-hidroxibutirato no presenta un efectode conservacióndela actividaddela enzimani siquiera similaralquese muestraenlaFig.2.En dichaFig.2se muestracómolas composicionesdelosproductosde ordeñado bacterianodelacepa4J27trassuextracción mediante choque hiper/hipoosmótico (4J2A2) o tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J2A2D), presentan unefectodeproteccióndelaenzimalipasafrenteala desecaciónmayorqueenelcasodecomposicionesdeconocida capacidad xeroprotectora.

TABLA1

Composición del producto de ordeñado bacteriano (POB) de la cepa 4J27

4J27 es la composición del POBde dicha cepa tras su extracción mediante choque hiper/hipoosmótico.

4J27Desla composicióndelPOBdedichacepatrassuextracciónporsecado mediante incubaciónalaire.

1.3. Ensayo de xeroprotección de enzimas

El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad de la fracción producto del ordeñado bacteriano para proteger enzimas frenteala desecación.Para ello se utilizóla enzima lipasa.Partiendode1 µl que contenía 0,00554 unidades de lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) se adicionaron 15 µlde la fracción producto del ordeñado bacteriano a estudiar. Como control positivo se adicionaron 15 µl de una solución al 10% de trehalosa a1 µl(0,00554U)de soluciónde lipasaycomo controlnegativose añadió15 µlde aguaa1µl(0,00554 U) de solución de lipasa. Las mezclas de 16 µlcon lipasa se depositaron en un microtubo de2 ml de capacidady se secaron a 50ºC durante 120 minutos. Unavez secas se incubarona 100ºC durante5minutos. Finalmente fueron almacenadas en un desecador a temperatura ambiente durante24 horas.Pasadoel tiempodeincubación,las reacciones se resuspendieron en 50 µlde una solucióndeTrisHCl(50mM)yse transﬁrieron a un microtubojunto con 950 µldeTrisHCI(50mM)pH8y1mlde Soluciónde Sustrato.La determinacióndela capacidadxeroprotectora de cada fracción producto de ordeñado bacteriano (POB) se determinó por el ensayo de medición de la actividad lipasa.

Parala medidadelaactividadlipasase utilizóunavariacióndel método descritoporGuptaycolaboradores(2002) consistente en la cuantiﬁcación espectrofotométrica del p-nitrofenol liberado por la enzima lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100mg)a partirdel sustrato p-nitrofenol palmitato (pNPP) (Gupta et al., 2002. Analytical Biochemistry,311:98-99).Paraelloseutilizó1mlde mediolibrede células(985 µldeTris-HCl 0,05M juntoa 15 µldePOB obtenidoporel métododel “ordeñado bacteriano”) mezclado con1mlde solución sustratodeun cultivo enfase estacionaria.Esta mezclade ensayoseincubóa30ºC durante30 minutosen microtubos estérilesde2 ml.La reacciónseparó mediante incubacióna 100ºC durante4minutosen termobloquey2minutosa-20ºC.La absorbancia se midió en un espectrofotómetro HitachiU-2000auna longitudde ondade 410 nm.La solución sustrato (SS)se preparó mezclando 10 ml de soluciónA(30 mg de pNPP en 10 ml de isopropanol) con 90 ml de soluciónB(0,1g degomaarábigay0,4mldeTritónX-100en90mltampónTris-HCI50mMpH8).La mezclade soluciónAyB se agitó suavemente hastasu total disolución.LaFig.2muestralosvaloresde proteccióndela enzima lipasaal secado generados por los POBsyPOBSIAs producidos porla cepa.

Ejemplo2

Ensayo de xeroprotección de microorganismos

El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad para proteger células vivas de Escherichia coli MC4100 frentea desecación medianteelempleodelproductode ordeñado bacteriano(POB)así comolosextraídospor Secado mediante IncubaciónalAire(POBSIAs)dediversascepasxerotolerantesdeformaanálogaala descritapor Manzanera et al., (2002) (Manzanera et al., 2002. AppliedandEnvironmental Microbiology 68: 4328-33).Para ello se utilizó un preinóculo de E. coli, a partir del cual se inoculó medio mínimo más glucosa como fuente de carbono adicionados de 0,6Mde NaCl hasta alcanzar una densidad óptica inicialde 0,05.Tras12horasde incubacióna 37ºC en agitación, se centrifugaron alícuotas de1 ml del cultivo crecido. Las células de E. coli se resuspendieron en una solución al 10%de los POBso POBSIAsextraídosde las célulasxerotolerantes(extraídos según se describe anteriormente)y además,1,5%depolivinilpirrolidona(PVP). Igualmentese realizólamismaexperiencia mediantela combinacióny mezclade sustratos comerciales identiﬁcados en POBsy POBSIAs en iguales proporciones, a los que se llamaron POB sintético o POBSIA sintético en contraposición al directamente extraído de células que llamamos natural. En el caso de los POB/POBSIA sintéticos la mezcla se realizó en una solución al 34,2%. La suspensión de células en las distintas solucionesse sometierona condicionesde desecaciónporvacíosin congelación,enun congelador-desecador modiﬁcado (Dura -Stop µ P;FTS Systems, Stone Ridge,NY)a 30ºCde temperatura mediay100mTorr(2Pa; 2x10−5 atmósferas) durante 20 segundos, con una rampa de temperatura de 2,5ºC/min con 15 minutos de pausa después de cada incremento de 2ºC, hasta llegar a la temperatura máxima de 40ºC.

Las muestras se sellaronalvacíoy se almacenaron a 30QC hasta su ensayode viabilidad a tiempo1,15y30 días.Pasadoestetiempolas muestrasse resuspendieronen1mldeLByse realizaron ensayosde viabilidad mediante siembra en placadeLB sólido que se incubaron24 horasa 37ºC, parael conteode UFCycomparación con las UFC antes del secado, para de esta forma poder calcular la supervivencia de las muestras.

EnlaFig.4se observacómolascomposiciones sintéticasPOBsyPOBSIAsdelacepa4J27produjeronun aumento de la supervivencia de los microorganismos respecto de la supervivencia experimentada por dichos microorganismos mediante una soluciónde trehalosa, cuandolas soluciones estabanal 34,2%de dichos compuestosxeroprotectoresy durante el primer día de conservación. Se observa que la aportación del PVP 1,5% a la supervivencia es nula.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623.
2.

Población bacteriana que comprende el microorganismo según la reivindicación 1.
3.

Uso delmicroorganismo segúnla reivindicación1odela población bacteriana segúnla reivindicación2parala producción de una composición xeroprotectora.
4.

Composición xeroprotectora producida por el microorganismo según la reivindicación 1 o por la población bacteriana según la reivindicación 2.
5.

Composición según la reivindicación4que comprende β-hidroxibutirato, ácido glucurónico, ácido glutámico, glutaminayglucosa.
6.

Composición segúnla reivindicación5que comprende una proporciónde β-hidroxibutirato:ácido glucurónico :ácido glutámico:glutamina:glucosa,de entre(0,5y1,5):(1y2):(1y3):(3y5):(5y9), respectivamente.
7.

Composición según la reivindicación 6, donde la proporción de β-hidroxibutirato : ácido glucurónico : ácido glutámico:glutamina:glucosaesde entre(0,7y1,3):(1,1y1,7):(1,5y2,5):(3,5y4,5):(6y8), respectivamente.
8. Composición segúnla reivindicación4que comprende glutamina, glucosaytrehalosa.
9.

Composición segúnla reivindicación8 que comprende una proporciónde glutamina: glucosa: trehalosa,de entre (0,5y1,5):(2y4):(4y8), respectivamente.
10.

Composiciónsegúnlareivindicación9, dondela proporciónde glutamina:glucosa:trehalosaesde entre(0,7 y1,3):(2,5y3,5):(5y7), respectivamente.
11.

Usodela composición según cualquierade las reivindicaciones4 a10 parala conservaciónde material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%.
12. Uso según la reivindicación 11, donde el material biológico es un microorganismo o una célula.
13.

Uso según la reivindicación 11, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un órgano aislado o un tejido biológico aislado.
14.

Uso según la reivindicación 11, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.
15.

Uso según la reivindicación 14, donde la molécula con actividad biológica es una enzima.
16.

Uso según la reivindicación 15, donde la enzima es una lipasa.
17.

Métodode obtencióndela composiciónxeroprotectora según cualquierade las reivindicaciones4 a10 que comprende:

a) cultivarel microorganismodelareivindicación1ola poblacióndelareivindicación2enun mediomineral con glucosa como fuente de carbono,

b) deshidratar los microorganismos obtenidos en el cultivo del paso (a) hasta que tengan una humedad residual igual o inferior al 10%,

c) rehidratar los microorganismos deshidratados del paso (b) en un medio hipotónico,y

d) seleccionar la fracción líquida del producto obtenido en el paso (c) que comprende la composición xeroprotectora.
18. Método según la reivindicación 17, donde el medio mineral del paso (a) es sólido.
19.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 17ó 18, donde la deshidrataciónde los microorganismos según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire.
20.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, donde el medio hipotónico para la rehidratación de los microorganismos según elpaso (c) es agua parcial o totalmente destilada, desionizada o desmineralizada.
21.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, donde además, la fracción líquida del paso (d) se deshidrata hasta que el producto xeroprotector tenga una humedad residual igual o inferior al 10%.
22.

Método para la conservación de material biológico que comprende: a) mezclarla composiciónxeroprotectorasegún cualquieradelasreivindicaciones4a10 con una muestrade

material biológico aislado,y b) deshidratar el producto obtenido en el apartado (a) hasta una humedad residual igual o inferior al 10%.
23.

Método según la reivindicación 22, donde el material biológico es un microorganismo o una célula.
24.

Método según la reivindicación 22, donde el material biológico del paso (a) es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un órgano aislado o un tejido biológico aislado.
25.

Método según la reivindicación 22, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.
26.

Método según la reivindicación 25, donde la molécula con actividad biológica es una enzima.
27.

Método según la reivindicación 26, donde la enzima es una lipasa.
28.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, donde la deshidratación de la mezcla de la composiciónxeroprotectoraydel material biológicosegúnelpaso(b)sellevaacabopormediodeuna solución hipertónicao por medio de una corriente de aire.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 200931116

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 04.12.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12N1/20 (2006.01) C12R1/06 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A

BOYLEN, C.W. Survival of Arthrobacter crystallopoietes during prolonged periods of extreme desiccation. 1973. Journal of Bacteriology. Vol. 113, No. 1, páginas 33-37. 1-28

A

MONGODIN, E.F. Secrets of soil survival revealed by the genome sequence of Arthrobacter aurescens TC1. 2006. Plos Genetics. Vol. 2, No. 12, páginas 2094-2106. 1-28

A

OVERHAGE, J. Identification of large linear plasmids in Arthrobacter spp. encoding the degradation of quinaldine to anthranilate. 2005. Microbiology. Vol. 151, páginas 491-500. 1-28

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 18.05.2011

Examinador I. Rueda Molins Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 200931116

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12N, C12R Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXT

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200931116

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 18.05.2011

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-28 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-28 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200931116

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

BOYLEN, C.W. Survival of Arthrobacter crystallopoietes during prolonged periods of extreme desiccation. Journal of Bacteriology. Vol. 113, No. 1, páginas 33-37. 1973

D02

MONGODIN, E.F. Secrets of soil survival revealed by the genome sequence of Arthrobacter aurescens TC1.Plos Genetics. Vol. 2, No. 12, páginas 2094-2106. 2006

D03

OVERHAGE, J. Identification of large linear plasmids in Arthrobacter spp. encoding the degradation of quinaldine to anthranilate. Microbiology. Vol. 151, páginas 491-500. 2005
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La solicitud de patente divulga un microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623, así como una composición xeroprotectora producida por dicho microorganismo.

Los documentos D01, D02 y D03 divulgan especies del género Arthrobacter sp. que presentan tolerancia frente a condiciones de desecación.

Ninguno de los documentos citados refleja de manera detallada las características de la especie bacteriana Arthrobacter sp. empleada, por lo que, no se puede afirmar que estás tengan similares características a las que presenta Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623. Por tanto, las reivindicaciones 1-28 presentan novedad y actividad inventiva según lo establecido en los Artículos 6 y 8 LP11/1986.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/4