ES2381289B2

ES2381289B2 - Composicion sintetica con efecto xeroprotector

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Publication number: ES2381289B2
Application number: ES201100030A
Authority: ES
Inventors: Maximino Manzanera Ruiz; Jesus Juan Gonzalez Lopez; Juan Jesus Narvaez Reinaldo; Lucia Santa Cruz Calvo
Original assignee: Universidad de Granada
Current assignee: Universidad de Granada
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2009-12-04
Publication date: 2012-12-10
Anticipated expiration: 2029-12-04
Also published as: ES2381289A1; ES2381660B2; WO2011067439A2; ES2381660A1; ES2362026B2; WO2011067439A3; ES2362026A1

Abstract

Composición sintética con efecto xeroprotector#La presente invención se refiere a una composición xeroprotectora sintética, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623, que comprende glutamina, glucosa y trehalosa. La presente invención también se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%.

Description

Composición sintética con efecto xeroprotector.

La presente invención se reﬁere a una composición xeroprotectora sintética, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623, que comprende glutamina, glucosa y trehalosa.

La presente invención también se reﬁere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado, una célula

o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa. Además, la presente invención se reﬁere a un método para la conservación de dicho material biológico.

Estado de la técnica anterior

La conservación de materiales biológicos mediante deshidratación y osmoconcentración es una tecnología conocida. Cuando la tarea de conservar biomoléculas sensibles se hizo necesaria, el simple secado mediante deshidratación fracasó, ya que se eliminaba el agua estructural, produciendo la desnaturalización posterior y la pérdida de actividad vital. La lioﬁlización se ha convertido en el método más aceptado para la conservación a largo plazo de biomoléculas sensibles, usándose por ejemplo de forma muy extendida para la conservación de vacunas atenuadas vivas.

Los métodos actuales de conservación requieren de gran costo en energía y generalmente necesitan de almacenaje a bajas temperaturas. En ocasiones, después de su conservación el material biológico tiene una actividad y/o viabilidad que no alcanza los niveles satisfactorios. Los métodos de conservación, tales como el secado a temperatura ambiente, formulaciones en líquido, el congelado con crioprotectores o la lioﬁlización producen reducciones signiﬁcativas en la actividad/viabilidad del material conservado.

Los procesos usados actualmente son lentos e implican un elevado consumo de energía. Además, la lioﬁlización conﬁere sólo un nivel modesto de termotolerancia en el producto ﬁnal, y se requiere aún refrigeración para reducir eldeterioro durante el almacenamiento. Éste es un problema particular para vacunas vivas destinadas a usarse en climas tropicales, ya que éstas pierden actividad, con el desafortunado resultado de que los programas de vacunación realizados en el campo en países tropicales, donde el control de la “cadena de frío” es difícil, pueden conducir ﬁnalmente a la vacunación de pacientes con vacuna inferior a la estándar o, en algunos casos, inservible.

Durante la selección natural evolutiva, ciertas especies de microorganismos, plantas y animales adquirieron la notable y elegante capacidad de tolerar la deshidratación extrema, permaneciendo latentes en medios hostiles durante períodos muy largos de tiempo y aún capaces de adquirir una actividad vital completa una vez hidratadas nuevamente. Ejemplos incluyen la “planta de la resurrección” Selaginella lepidophyla, el camarón de mar Artemia salina,lalevadura Saccharomyces cerevisiae o el tardígrado Macrobiotus hufelandi. Estos organismos se denominan criptiobióticos y el procedimiento por el que sobreviven se conoce como anhidrobiosis. Todas las especies de animales y plantas que presentan esta capacidad, contienen moléculas protectoras formadoras de cristales amorfos como el disacárido trehalosa (α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranósido).

La formación y uso de los cristales amorfos está bien documentada (Manzanera et al., 2002. Appl Environ Microbiol, 68: 4328-4333). Algunos de los conservantes que forman estos cristales son adecuados para este tipo de conservación e incluyen hidratos de carbono no reductores como la trehalosa, hidroxiectoina, maltitol, lactitol (4O-α-D-glucopyranosyl-D-glucitol), palatinit [mezcla de GPS (α-D-glucopiranosil-1-6-sorbitol) y GPM (α-D-glucopiranosil-1-6-manitol)] y sus componentes individuales GPS y GPM. Los glicósidos no reductores de compuestos polihidroxilados tales como neotrehalosa, laconeotrehalosa, galactosil-trehalosa, sacarosa, lactosacarosa, raﬁnosa, etc. Otros conservantes formadores de cristales amorfos incluyen aminoácidos tales como la hidroxiectoina.

La presencia de agua en el estado seco es generalmente inferior a 0,2 g/g de peso celular seco en la mayoría de los criptobiontes. Estos niveles de agua son suﬁcientes para que estos organismos invertebrados o microorganismos resistan la deshidratación extrema, temperaturas elevadas, radiaciones ionizantes o también, en algunas especies de tardígrados, presiones de hasta 600 MPa.

Explicación de la invención

La presente invención se reﬁere a una composición sintética con efecto xeroprotector que comprende glutamina, glucosa y trehalosa, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623, según se describe en la patente P200931116.

o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa.

La capacidad para conservar material biológico sensible por períodos de tiempo indeﬁnido en forma activa o viable es de importancia en aplicaciones para los sectores médico, agrícola e industrial. En la presente invención se ofrecen herramientas para solucionar la conservación de material biológico que presenta diﬁcultades para su estabilización. El material biológico preservado con la composición es estable por períodos largos de tiempo.

Tal como se muestra en los ejemplos de la presente invención, el uso de una composición que contiene cada uno de los componentes por separado para la conservación de la actividad de una enzima lipasa, es decir, la suma del efecto en la conservación de la actividad enzimática de una composición que contiene glutamina, glucosa o trehalosa, es menor que el efecto de conservación que produce una composición que contiene todos los componentes, es decir, la composición xeroprotectora tiene un efecto sinérgico en su capacidad de conservar material biológico.

En adelante se podrá hacer referencia al microorganismo CECT7623, depositado en la colección española de cultivos tipo (CECT) el 10 de noviembre de 2009 al que le correspondió el nº de depósito CECT7623, con el término “4J27”, o como “microorganismo de la presente invención” o el “microorganismo de la invención”. La dirección de dicha Autoridad Internacional de depósito es: Universidad de Valencia/Ediﬁcio de investigación/Campus de Burjassot/46100 Burjassot (Valencia).

La composición sintética objeto de esta invención es equivalentes a la que conforman los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J27 tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J27D), según se describe en la patente P20093116.

El término “composición xeroprotectora” tal como se entiende en la presente invención, se reﬁere a una composición que previene los efectos adversos de la desecación total o parcial de material de origen biológico o material de origen sintético.

El material biológico se reﬁere a cualquier compuesto producido directamente por un organismo vivo en cualquier estado de desarrollo, en cualquier compartimento celular, sea cual sea la naturaleza, composición o estructura del mismo, o que procede de un organismo que ya no está vivo. Dicho material biológico puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una célula, ácido nucleico, proteína, enzima, polisacárido, lípido, fosfolípido, liposomas, virus, partículas virales o cualquier molécula que comprenda cualquiera de los elementos anteriores o cualquier molécula orgánica que tenga un efecto farmacológico, inmunogénico y/o ﬁsiológico de acción local y/o sistémica. El material biológico puede comprender agentes terapéuticos; agentes anti-infectivos como antibióticos, antivirales; analgésicos o combinaciones de analgésicos; antiartríticos, antiasmáticos, antiinﬂamatorios, antioplásticos, antipruríticos, antipsicóticos, antipiréticos, antiespasmódicos, preparaciones cardiovasculares (incluyendo bloqueantes de canales de calcio, bloqueadores beta, o antiarrítmicos), agentes contra la hipertensión, diuréticos, vasodilatadores, estimuladores del sistema nervioso central, antitusivos, preparaciones anti resfriados, descongestionantes, agentes de diagnóstico, hormonas, estimuladores del crecimiento óseo, inhibidores de la resorción de la médula ósea, inmunosupresores, relajantes musculares, psicoestimulantes, sedantes, tranquilizantes, proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos (tanto naturales, como sintéticos, como productos recombinantes), moléculas de ácidos nucleicos (tanto en forma polimérica de dos o más nucleótidos de ADN o ARN, incluyendo tanto moléculas de cadena doble como de cadena sencilla, construcciones genéticas, vectores de expresión, ARN antisentido, sentido o moléculas ARNi) o nucleótidos (como por ejemplo, pero sin limitarse, el dATP, dCTP, dGTP, dTTP o dUTP, de utilidad en la técnica de PCR, secuenciación, etc).

El material de origen sintético se reﬁere a un tipo de material que no ha sido producido o sintetizado por un organismo vivo directamente sino que ha sido creado por el ser humano como por ejemplo, pero sin limitarse, una secuencia de ADN ampliﬁcada por PCR, o una proteína o enzima modiﬁcada intencionadamente o no. Asimismo, el material biológico se reﬁere también a un organismo invertebrado, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido aislado o una célula.

Así, la presente invención se reﬁere a la una composición xeroprotectora sintética, que comprende glutamina, glucosa y trehalosa.

Una realización más preferida se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invención o a la composición xeroprotectora sintética que comprende una proporción de entre 0,5 y 1,5 de glutamina, 2 y 4 de glucosa, y 4y8de trehalosa. Es decir, una proporción (glutamina):(glucosa):(trehalosa), de (0,5 a 1,5):(2 a 4):(4 a 8), respectivamente. Una realización aún más preferida se reﬁere a la composición xeroprotectora donde la proporción de (glutamina):(glucosa):(trehalosa), es de (0,7 y 1,3):(2,5 y 3,5):(5 y 7), respectivamente. Preferiblemente la composición xeroprotectora tiene una proporción de (glutamina):(glucosa):(trehalosa), de (1):(2,8):(5,8), respectivamente.

El término “proporción” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a la correspondencia debida de los elementos de la composición (β-hidroxibutirato, ácido glucurónico, ácido glutámico, glutamina y glucosa; o glutamina, glucosa y trehalosa) relacionados entre sí. Es decir, se reﬁere a una relación matemática que vincula los elementos de la composición.

En adelante se podrá hacer referencia a cualquier composición descrita en los párrafos anteriores como “composición de la presente invención” o “composición de la invención”.

Otro aspecto de la presente invención es el uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico con un contenido en humedad residual igual o inferior al 10%. El contenido de humedad residual del material biológico puede ser igual o inferior al 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1% de humedad residual. La conservación de dicho material puede llevarse a cabo mediante la estabilización del mismo. En la presente invención, para referirse a este tipo de material biológico se puede emplear la expresión “material biológico en estado seco”. En estas condiciones, el conservante o estabilizador coalesce para alcanzar un estado no-cristalino, vítreo, y sólido (por ejemplo un cristal amorfo). Las partículas de cristal orgánico que están formadas al secar el material biológico con el estabilizador están cubiertas por el estabilizador que produce una alta estabilidad al reducir drásticamente las reacciones químicas. De esta forma el material biológico seco está incrustado en el cristal amorfo formado por el estabilizador.

El material biológico seco en presencia del estabilizador que forma el cristal amorfo es resistente a plásticos en estado líquido, mientras que el material que no está seco en presencia de estos estabilizadores no es resistente a plásticos en estado líquido.

El material biológico seco en estas formas puede encontrarse en estado no particulado y puede suministrarse en formas por ejemplo, pero sin limitarse, molduras o sólidos en 3 dimensiones como por ejemplo, pero sin limitarse, bloques, pastillas, parches, hojas, bolas, o pepitas de material biológico seco.

El término “humedad residual” tal como se emplea en la presente invención se reﬁere a la cantidad de humedad que contiene un producto después de pasado por algún tipo de proceso capaz de eliminar agua del mismo. La humedad residual es el porcentaje de masa del producto que corresponde a agua respecto del total de la masa. Es decir un valor de humedad residual de un producto igual a un 10% signiﬁca que 10 g de cada 100 g del producto corresponden a agua. La humedad residual puede ser medida mediante métodos conocidos en el estado de la técnica como por ejemplo, pero sin limitarse, mediante el método titrimétrico, el método azeotrópico o el método gravimétrico.

El término “conservación de material biológico” hace referencia al mantenimiento o cuidado de la permanencia de las características intrínsecas del material biológico.

Una realización preferida se reﬁere al uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula. La célula puede ser procariota o eucariota. La célula puede ser una célula de un microorganismo en cualquier estado de desarrollo. La célula puede ser somática o germinal, vegetal o animal. Dicha célula puede proceder de cualquier organismo o microorganismo y puede presentarse en cualquier estado de diferenciación, como por ejemplo, pero sin limitarse, procedente de un cultivo de un tejido celular o de órganos, esperma, óvulos o embriones. La célula puede ser una célula madre totipotente, multipotente o unipotente. El microorganismo puede ser unicelular o multicelular. El microorganismo unicelular se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse Escherichia coli, Salmonella. typhimurium, Pseudomonas putida., Salmonella spp, Rhizobium spp, Pseudomonas spp, Rhodococcus spp, Lactobacillus spp. o Biﬁdobacterium spp.. El microorganismo pluricelular puede ser por ejemplo, pero sin limitarse, un nematodo.

La célula conservada por la composición de la presente invención es una célula viable es decir, es capaz de realizar las funciones normales de la célula incluyendo la replicación y división celular. Por otra parte la célula puede haber sido tratada, manipulada o mutada antes de su conservación. Por ejemplo, pero sin limitarse, una célula puede haberse hecho competente para transformaciones o transfecciones, o puede contener ácidos nucleicos recombinantes. Las células que se conservan pueden formar una población homogénea o heterogénea, por ejemplo, pero sin limitarse, una librería de células en la que cada una contiene una variación de algún ácido nucleico. Preferentemente las células son células no anhidrobióticas (células sensibles a desecación) como por ejemplo, pero sin limitarse, células procedentes de microorganismos procariotas no anhidrobiontes que generalmente no sean esporulantes.

La conservación del microorganismo puede mejorarse mediante cultivo bajo condiciones que aumenten la concentración intracelular de trehalosa o de otros estabilizadores formadores de cristales amorfos. Por ejemplo, pero sin limitarse, en condiciones de alta osmolaridad (alta concentración de sales) que estimulen la producción intracelular de trehalosa o de otros estabilizantes formadores de cristales amorfos.

El organismo invertebrado es pero sin limitarse, una larva de insecto o un crustáceo. Dichos organismos invertebrados pueden ser preservados en condiciones de desecación, permitiendo la actividad vital del mismo, de modo que, cuando se rehidratan, dichos organismos presentan la capacidad de movimiento. La plántula es una planta en sus primeros estadios de desarrollo, desde que germina hasta que se desarrolla.

La composición de la invención puede usarse para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo vertebrado perteneciente a la Superclase Tetrapoda (con cuatro extremidades), Clase Amphibia (anﬁbios) o Clase Reptilia (reptiles), o cualquiera de sus partes (Vernon y Jackson, 1931. The biological bulletin, 60: 80-93). Vernon y Jackson llevaron a cabo un estudio sobre la rana Leopardo (Rana pipiens), en el que de forma natural se seca su piel, lengua, bazo, e hígado con una pérdida de agua de entre un 43-81% del contenido de agua total.

Un órgano aislado o un tejido biológico aislado (incluida la sangre) pueden conservarse mediante la composición de la presente invención. En Serrato et al. (2009) pueden observarse resultados de protocolos de criopreservación de tejidos biológicos (Serrato et al., 2009. Histology and histopathology, 24: 1531-1540).

Una realización más preferida se reﬁere al uso de la composición de la invención, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. El término “molécula con actividad biológica” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a una molécula biológica cuyo origen sea un organismo vivo o que haya estado vivo, o derivados o análogos de dicha molécula. El término “derivados” se reﬁere a moléculas obtenidas por la modiﬁcación de una molécula con actividad biológica, que presentan una funcionalidad similar. Por otra parte, el término “análogos” se reﬁere a moléculas que presentan una función similar a la molécula con actividad biológica.

Según otra realización aún más preferida de la composición de la presente invención la molécula con actividad biológica es una enzima. Una realización todavía más preferida de la presente invención se reﬁere al uso de la composición de la invención, donde la enzima es una enzima con actividad lipasa. La enzima con actividad lipasa se selecciona de la lista de enzimas con números EC (Enzyme Commission numbers) que comprende las hidrolasas de éster carboxílico (EC 3.1.1) EC 3.1.1.1 (Carboxilesterasa), EC 3.1.1.2 (Arilesterasa), EC 3.1.1.3 (Triacilglicerol lipasa), EC 3.1.1.4 (Fosfolipasa A(2)), EC 3.1.1.5 (Lisofosfolipasa), EC 3.1.1.23 (Acilglicerol lipasa), EC 3.1.1.24 (3oxoadipato enol-lactonasa), EC 3.1.1.25 (1,4-lactonasa), EC 3.1.1.26 (Galactolipasa), EC 3.1.1.32 (Fosfolipasa A(1)), EC 3.1.1.33 (6-acetilglucosa deacetilasa), EC 3.1.1.34 (Lipoproteína lipasa). Preferiblemente la enzima lipasa tiene actividad Triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3).

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere al método para la conservación de material biológico que comprende:

a) mezclar la composición de la invención con una muestra de material biológico aislado, y

b) deshidratar el producto obtenido en el paso (a) hasta una humedad residual igual o inferior al 10%.

Una realización preferida se reﬁere al método para la conservación de material biológico, donde el material biológico del paso (a) es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula.

Otra realización preferida se reﬁere al método para la conservación de material biológico, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.

Una realización más preferida de la presente invención se reﬁere al método, donde la molécula con actividad biológica es una enzima. Según una realización más preferida de la presente invención la enzima es una lipasa.

Otra realización aún más preferida se reﬁere a cualquiera de los métodos para la conservación de material biológico, donde la deshidratación de la mezcla de la composición xeroprotectora y del material biológico según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire.

Cualquier método para la conservación de material biológico de la presente invención permite el empleo de dicho material en procesos de manufacturación en los cuales el material biológico sería demasiado inestable si no estuviera conservado mediante el uso de la composición de la presente invención. La invención incluye extrusiones o moldes en los que se incluye el material conservado por cualquier método de la presente invención. Un método de producción de una moldura que contenga biomaterial activo mediante estabilizadores puede incluir soluciones de materiales plásticos. Por ejemplo una moldura de material plástico con biomaterial activo encapsulado puede ser útil como componentes de biosensores. Por ejemplo un biosensor puede incluir bacterias que sean capaces de detectar sustancias tóxicas, patógenos o toxicidad en general.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes ﬁguras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Descripción de las ﬁguras

Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes ﬁguras:

Fig. 1. Muestra la actividad lipasa (en porcentaje relativo a un 100% de actividad del control positivo) tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos componentes de productos del ordeñado bacteriano al 10% (p/v).

El control positivo es trehalosa al 10%. El control negativo (-) se corresponde con la ausencia de compuesto alguno como aditivo previo a la desecación de la enzima. 4J27 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POB extraídos de la cepa 4J27 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 4J27D es la actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POBSIA (Producto de Ordeñado Bacteriano extraído por Secado mediante Incubación al Aire) extraídos de la cepa 4J27 mediante tratamiento de secado y posterior hidratación, que comprende los mismos componentes que la composición sintética objeto de esta invención.

Fig. 2. Muestra el porcentaje de estabilización de la actividad de la enzima lipasa por medio de algunas mezclas de solutos contra la desecación, respecto de la estabilización por trehalosa (100%).

Fig. 3. Muestra la evolución de la supervivencia de Escherichia coli MC4100 frente a desecación mediante el empleo del producto de ordeñado bacteriano (POB), los extraídos por Secado mediante Incubación al Aire (POBSIAs), así como de la composición sintética objeto de la invención.

4J27 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POB extraídos de la cepa 4J27 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 4J27D es la actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POBSIA, que comprende los mismos componentes que la composición sintética objeto de esta invención.

PVP indica que además se ha adicionado 1,5% de polivinilpirrolidona (PVP).

SIN es sintético.

T es trehalosa.

Ejemplos

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante que muestran la capacidad xeroprotectora de la composición objeto de esta invención así como del método de xeroprotección descrito.

En la tabla 1 se pueden observar las composiciones de los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J27 tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J27D).

Asimismo, en la Fig. 2 se muestra la actividad lipasa (en porcentaje relativo a un 100% de actividad del control positivo) tras secado de la enzima lipasa en presencia de glucosa y glutamina, compuestos químicos presentes en la composición sintética objeto de la invención. Las mezclas descritas se combinaron en la misma relación descrita en la mezcla de la presente invención y de esa mezcla se tomaron 10gyse disolvieron en 100 ml de agua. El control positivo es trehalosa al 10%. El control negativo se corresponde con la ausencia de compuestos como aditivo previo a la desecación de la enzima (agua).

Tal como puede observarse en dicha Fig. 2, la combinación de los compuestos glucosa+glutamina, no presenta un efecto de conservación de la actividad de la enzima ni siquiera similar al que se muestra en la Fig. 1. En dicha Fig. 1 se muestra cómo las composiciones de los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J27 tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J2A2D), presentan un efecto de protección de la enzima lipasa frente a la desecación mayor que en el caso de composiciones de conocida capacidad xeroprotectora.

TABLA 1

Composición del producto de ordeñado bacteriano (POB) de la cepa 4J27 tras su extracción por secado mediante incubación al aire

Ejemplo 1

Ensayo de xeroprotección de enzimas

El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad de la fracción producto del ordeñado bacteriano para proteger enzimas frente a la desecación. Para ello se utilizó la enzima lipasa. Partiendo de 1 μl que contenía 0,00554 unidades de lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) se adicionaron 15 μl de la fracción producto del ordeñado bacteriano a estudiar. Como control positivo se adicionaron 15 μl de una solución al 10% de trehalosa a 1 μl (0,00554 U) de solución de lipasa y como control negativo se añadió 15 μl de agua a 1 μl (0,00554 U) de solución de lipasa. Las mezclas de 16 μl con lipasa se depositaron en un microtubo de 2 ml de capacidad y se secaron a 50ºC durante 120 minutos. Una vez secas se incubaron a 100ºC durante 5 minutos. Finalmente fueron almacenadas en un desecador a temperatura ambiente durante 24 horas. Pasado el tiempo de incubación, las reacciones se resuspendieron en 50 μl de una solución de TrisHCl (50 mM) y se transﬁrieron a un microtubo junto con 950 μl de Tris HCl (50 mM) pH8 y 1 ml de Solución de Sustrato. La determinación de la capacidad xeroprotectora de cada fracción producto de ordeñado bacteriano (POB) se determinó por el ensayo de medición de la actividad lipasa.

Para la medida de la actividad lipasa se utilizó una variación del método descrito por Gupta y colaboradores (2002) consistente en la cuantiﬁcación espectrofotométrica del p-nitrofenol liberado por la enzima lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) a partir del sustrato p-nitrofenol palmitato (pNPP) (Gupta et al., 2002. Analytical Biochemistry, 311: 98-99). Para ello se utilizó 1 ml de medio libre de células (985 μl de Tris-HCl 0,05 M junto a15 μl de POB obtenido por el método del “ordeñado bacteriano”) mezclado con 1 ml de solución sustrato de un cultivo en fase estacionaria. Esta mezcla de ensayo se incubó a 30ºC durante 30 minutos en microtubos estériles de 2 ml. La reacción se paró mediante incubación a 100ºC durante 4 minutos en termobloque y 2 minutos a -20ºC. La absorbancia se midió en un espectrofotómetro Hitachi U-2000 a una longitud de onda de 410 nm. La solución sustrato (SS) se preparó mezclando 10 ml de solución A (30 mg de pNPP en 10 ml de isopropanol) con 90 ml de solución B (0,1 g de goma arábiga y 0,4 ml de Tritón X-100 en 90 ml tampón Tris-HCl 50 mM pH8). La mezcla de solución A y B se agitó suavemente hasta su total disolución. La Fig. 1 muestra los valores de protección de la enzima lipasa al secado generados por los POBs y POBSIAs producidos por la cepa que comprenden los mismos componentes que la composición sintética objeto de la invención.

Ejemplo 2

Ensayo de xeroprotección de microorganismos

El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad para proteger células vivas de Escherichia coli MC4100 frente a desecación mediante el empleo del producto de ordeñado bacteriano (POB) así como los extraídos por Secado mediante Incubación al Aire (POBSIAs) de diversas cepas xerotolerantes de forma análoga a la descrita por Manzanera et al., (2002) (Manzanera et al., 2002. Applied and Environmental Microbiology 68: 4328-33). Para ello se utilizó un preinóculo de E. coli, a partir del cual se inoculó medio mínimo más glucosa como fuente de carbono adicionados de 0,6 M de NaCl hasta alcanzar una densidad óptica inicial de 0,05. Tras 12 horas de incubación a 37ºC en agitación, se centrifugaron alícuotas de 1ml del cultivo crecido. Las células de E. coli se resuspendieron en una solución al 10% de los POBs o POBSIAs extraídos de las células xerotolerantes (extraídos según se describe anteriormente) y además, 1,5% de polivinilpirrolidona (PVP). Igualmente se realizó la misma experiencia mediante la combinación y mezcla de sustratos comerciales identiﬁcados en POBs y POBSIAs en iguales proporciones, a los que se llamaron POB sintético o POBSIA sintético en contraposición al directamente extraído de células que llamamos natural.Enel caso de los POB/POBSIA sintéticos la mezcla se realizó en una solución al 34,2%. La suspensión de células en las distintas soluciones se sometieron a condiciones de desecación por vacío sin congelación, en un congelador-desecador modiﬁcado (Dura -Stop μ P; FTS Systems, Stone Ridge, NY) a 30ºC de temperatura media y 100 mTorr (2Pa; 2x10−5 atmósferas) durante 20 segundos, con una rampa de temperatura de 2,5ºC/min con 15 minutos de pausa después de cada incremento de 2ºC, hasta llegar a la temperatura máxima de 40ºC.

Las muestras se sellaron al vacío y se almacenaron a 30ºC hasta su ensayo de viabilidad a tiempo 1, 15 y 30 días. Pasado este tiempo las muestras se resuspendieron en 1 ml de LB y se realizaron ensayos de viabilidad mediante siembra en placa de LB sólido que se incubaron 24 horas a 37ºC, para el conteo de UFC y comparación con las UFC antes del secado, para de esta forma poder calcular la supervivencia de las muestras.

En la Fig. 3 se observa cómo las composiciones sintéticas POBs y POBSIAs de la cepa 4J27 produjeron un aumento de la supervivencia de los microorganismos respecto de la supervivencia experimentada por dichos microorganismos mediante una solución de trehalosa, cuando las soluciones estaban al 34,2% de dichos compuestos xeroprotectores y durante el primer día de conservación. Se observa que la aportación del PVP 1,5% a la supervivencia es nula.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición xeroprotectora sintética que comprende glutamina, glucosa y trehalosa.
2.

Composición según reivindicación 1 que comprende una proporción de glutamina:glucosa:trehalosa, de entre (0,5 y 1,5):(2 y 4):(4 y 8), respectivamente.
3.

Composición según la reivindicación 2, donde la proporción de glutamina:glucosa:trehalosa es de entre (0,7 y 1,3):(2,5 y 3,5):(5 y 7), respectivamente.
4.

Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%.
5. Uso de la composición según la reivindicación 4, donde el material biológico es un microorganismo o una célula.
6.

Uso según la reivindicación 4, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un órgano aislado o un tejido biológico aislado.
7.

Uso según la reivindicación 4, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.
8.

Uso según la reivindicación 7, donde la molécula con actividad biológica es una enzima.
9.

Uso según la reivindicación 8, donde la enzima es una lipasa.
10.

Método para la conservación de material biológico que comprende: a) mezclar la composición xeroprotectora según cualquiera de las reivindicaciones1a3con una muestra de

material biológico aislado, y b) deshidratar el producto obtenido en el apartado (a) hasta una humedad residual igual o inferior al 10%.
11.

Método según la reivindicación 10, donde el material biológico es un microorganismo o una célula.
12.

Método según la reivindicación 10, donde el material biológico del paso (a) es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un órgano aislado o un tejido biológico aislado.
13.

Método según la reivindicación 10, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.
14.

Método según la reivindicación 13, donde la molécula con actividad biológica es una enzima.
15.

Método según la reivindicación 14, donde la enzima es una lipasa.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, donde la deshidratación de la mezcla de la composición xeroprotectora y del material biológico según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire.

OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C07H3102 (2006.01) C07H3104 (2006.01)

21 N.O solicitud: 2011000@0 22 Fecha de presentaci6n de la solicitud: 04.12.2009 @2 Fecha de prioridad:

INFORME DEL ESTADO DE LA TECNICA

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoria

@ Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A

LI A. ET AL. Ethylene response factor TERF1 enhances glucose sensitivity in tobacco through 1-16

activating the expression of sugar-related genes. 2008. Journal of Integrative Plant Biology. Vol.

51, No.2, paginas 184-19@.

A

CAI Z. ET AL. Trehalose-6-phosphate synthase 1from Metarhizium anisopliae: clone, expression 1-16

and properties of the recombinant. 22.04.2009. Journal of Bioscience and Bioengineering. Vol.107,

No.5, paginas 499-505.

A

MX PA06014490 A (GABRIEL ITURRIAGA DE LA FUENTE) 10.10.2008. 1-16

Categoria de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoria A: refleja el estado de la tecnica O: referido a divulgaci6n no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci6n de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despues de la fecha de presentaci6n de la solicitud

El presente informe ha sido realizado � para todas las reivindicaciones � para las reivindicaciones nO:

Fecha de realizaci6n del informe 10.05.2012

Examinador I. Rueda Molins Pagina 1/4

NO de solicitud: 2011000@0

Documentaci6n minima buscada (sistema de clasificaci6n seguido de los simbolos de clasificaci6n) C07H Bases de datos electr6nicas consultadas durante la busqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, terminos de

busqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXT

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 2/4

OPINION ESCRITA

NO de solicitud: 2011000@0

Fecha de Realizaci6n de la Opini6n Escrita: 10.05.2012

Declaraci6n

Novedad (Art. .1 LP 11/198 )

Reivindicaciones 1-16 SI

Reivindicaciones

NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/198 )

Reivindicaciones 1-16 SI

Reivindicaciones

NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicaci6n industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tecnico de la solicitud (Articulo @1.2 Ley 11/1986).

Base de la Opini6n.-

La presente opini6n se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Tecnica Pagina @/4

OPINION ESCRITA

NO de solicitud: 2011000@0

1. Documentos considerados.-

A continuaci6n se relacionanlos documentos pertenecientes al estado de la tecnica tomados en consideraci6n para la realizaci6n de esta opini6n.

Documento

Numero Publicaci6n o Identificaci6n Fecha Publicaci6n

D01

LI A. ET AL. Ethylene response factor TERF1 enhances glucose sensitivity in tobacco through activating the expression of sugarrelated genes. 2008. Journal of Integrative Plant Biology. Vol. 51, No.2, paginas 184-19@. 2008

D02

CAI Z. ET AL. Trehalose-6-phosphate synthase 1 from Metarhizium a nisopliae: clone, expression and properties of the recombinant. Journal of B ioscience and B ioengineering. Vol.107, No.5, paginas 499-505. 22.04.2009

D0@

MX PA06014490 A (GABRIEL ITURRIAGA DE LA FUENTE) 10.10.2008
2. Declaraci6n motivada segun los articulos 29. y 29.7 del Reglamento de ejecuci6n de la Ley 11/198 , de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraci6n

En la invenci6n de la solicitud de patente se reivindica una composici6n xeroprotectora sintetica que comprende glutamina, glucosa y thehalosa.

El documento D01 muestra una relaci6n entre la glucosa y la tolerancia a la sequia. Los documentos D02 y D0@ divulgan como la trehalosa aumenta la tolerancia frente a la desecaci6n.

Ninguno de los documentos citados divulga una composici6n xeroprotectora sintetica que comprende glutamina, glucosa y thehalosa. Por tanto, teniendo en cuenta la informaci6n divulgada en los documentos D01, D02 y D0@ las reivindicaciones 116 presentan novedad y actividad inventiva segun lo establecido en los Articulos 6 y 8 LP 11/1986.

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 4/4