ES2402308B2

ES2402308B2 - PROCEDURE FOR OBTAINING A PURE CULTURE OF MULTICILED EPENDIMAR CELLS.

Info

Publication number: ES2402308B2
Application number: ES201131556A
Authority: ES
Inventors: Jesús MATEOS GRONDONA; Pablo GRANADOS DURÁN; Manuel Cifuentes Rueda; Margarita PÉREZ MARTÍN; Juan PÉREZ RODRÍGUEZ; Pedro FERNÁNDEZ-LLEBREZ Y DEL REY; María Dolores LÓPEZ ÁVALOS
Original assignee: Universidad de Malaga
Current assignee: Universidad de Malaga
Priority date: 2011-09-27
Filing date: 2011-09-27
Publication date: 2013-12-27
Anticipated expiration: 2031-09-27
Also published as: WO2013045722A1; ES2402308A1

Abstract

La presente invención describe un procedimiento de obtención de un cultivo puro de células ependimarias multiciliadas a partir de explantes de la pared ventricular de cerebros de roedores adultos. Las células ependimarias se separan del explante mediante la incubación en un medio de cultivo a baja temperatura seguida por una digestión proteolítica. Tras 24 horas de cultivo del explante se desprenden la mayoría de las células ependimarias y un 7% de otros tipos celulares. Las células ependimarias se purifican tras 48 horas de cultivo en un medio esencial sin aditivos ni factores de crecimiento y a una baja densidad celular. En estas condiciones sólo sobreviven las células ependimarias y las escasas células contaminantes mueren, de tal forma que se obtiene una suspensión pura de células ependimarias.The present invention describes a method of obtaining a pure culture of multicill ependymal cells from explants of the ventricular wall of brains of adult rodents. Ependymal cells are separated from the explant by incubation in a low temperature culture medium followed by proteolytic digestion. After 24 hours of explant culture, most ependymal cells and 7% of other cell types are released. Ependymal cells are purified after 48 hours of culture in an essential medium without additives or growth factors and at a low cell density. Under these conditions, only ependymal cells survive and the few contaminant cells die, so that a pure suspension of ependymal cells is obtained.

Description

PROCEDIMIENTO DE OBTENCiÓN DE UN CULTIVO PURO DE CÉLULAS EPENDIMARIAS MUL TlCILlADAS PROCEDURE FOR OBTAINING A PURE CULTURE CULTURE MUL TlCILlATED EPENDIMARIES

5 CAMPO DE LA INVENCiÓN 5 FIELD OF THE INVENTION

Los cultivos puros representan un modelo de estudio necesario para la investigación de células ependimarias multiciliadas, y de forma más general para el estudio de las células ciliadas. La invención queda comprendida en el campo de los cultivos celulares Pure cultures represent a study model necessary for the investigation of multicill cell ependymal cells, and more generally for the study of hair cells. The invention falls within the field of cell cultures

10 en biología celular, en biomedicina y farmacología. 10 in cell biology, in biomedicine and pharmacology.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN BACKGROUND OF THE INVENTION

Las células ependimarias son células epiteliales que tapizan las cavidades ventriculares del cerebro y el canal central de la médula espinal de los vertebrados. Ependymal cells are epithelial cells that cover the ventricular cavities of the brain and the central canal of the spinal cord of vertebrates.

El epitelio ependimario multiciliado ocupa y tapiza la interfase entre el líquido The multiciliate ependymal epithelium occupies and upholsters the interface between the liquid

20 cefalorraquídeo (LCR) y el parénquima nervioso. Por su localización y sus uniones intercelulares se ha propuesto su función como barrera ante determinadas sustancias nocivas para el sistema nervioso que pudieran llegar hasta el LCR, en la formación del propio LCR o participando en el transporte de ciertas sustancias entre ambos compartimentos. Asimismo, las células ependimarias son responsables de la movilidad 20 cerebrospinal (CSF) and nerve parenchyma. Due to its location and its intercellular junctions, its function has been proposed as a barrier to certain substances harmful to the nervous system that could reach the CSF, in the formation of the CSF itself or participating in the transport of certain substances between both compartments. Likewise, ependymal cells are responsible for mobility

25 del líquido cefalorraquídeo gracias a la presencia de un penacho de cilios móviles en su porción apical. 25 of the cerebrospinal fluid thanks to the presence of a tuft of mobile cilia in its apical portion.

Además de estas funciones, destaca su más que probable participación en la formación y el desarrollo del sistema nervioso central y un papel de soporte trófico y 30 metabólico de la neurogénesis que tiene lugar en regiones muy concretas del sistema nervioso adulto. También se ha probado la importancia de este epitelio en el mantenimiento de la integridad del sistema ventricular, ya que tanto su destrucción In addition to these functions, it highlights its more than likely participation in the formation and development of the central nervous system and a role of trophic and metabolic support of neurogenesis that takes place in very specific regions of the adult nervous system. The importance of this epithelium in maintaining the integrity of the ventricular system has also been proven, since both its destruction

como alteraciones en su adhesión a la membrana basal o en su motilidad ciliar generan patologías muy variadas, entre las que destaca la hidrocefalia. as alterations in its adhesion to the basement membrane or in its ciliary motility generate very varied pathologies, among which hydrocephalus stands out.

Con respecto a la producción de nuevas neuronas en el cerebro adulto, se ha 5 demostrado la presencia de células madre neurales en la zona subventricular de los ventriculos laterales de cerebros de roedores adultos. With regard to the production of new neurons in the adult brain, it has been 5 demonstrated the presence of neural stem cells in the subventricular area of the lateral ventricles of brains of adult rodents.

En la pared estriatal, los nichos neurogénicos están formados por un tipo especial de astrocitos subependimarios, su progenie o células de amplificación, los neuroblastos 10 procedentes de las anteriores, las células endoteliales de los vasos locales y las células ependimarias locales. Además de estos tipos celulares, la matriz extracelular representa el soporte sobre el que se presentan moléculas señalizadoras o donde tienen lugar interacciones entre los distintos tipos celulares, incluida la membrana basal. En este modelo las células endoteliales de los vasos y, sobre todo, las células In the striatal wall, the neurogenic niches are formed by a special type of subependymal astrocytes, their progeny or amplification cells, the neuroblasts 10 from the previous ones, the endothelial cells of the local vessels and the local ependymal cells. In addition to these cell types, the extracellular matrix represents the support on which signal molecules occur or where interactions between different cell types, including the basement membrane, occur. In this model the endothelial cells of the vessels and, above all, the cells

15 ependimarias locales juegan un papel esencial en el proceso de neurogénesis y en la determinación de los linajes de las células producidas. 15 local ependymarians play an essential role in the neurogenesis process and in determining the lineages of the cells produced.

En cuanto a la naturaleza de las células madre del sistema nervioso central, algunos autores consideran que las células ependimarias multiciliadas son las verdaderas y Regarding the nature of the central nervous system stem cells, some authors consider that multicilliated ependymal cells are the true and

20 más primitivas células madre del sistema nervioso central de adultos. Sin embargo, aún hoy en día sigue siendo tema de debate si las células ependimarias multiciliadas cuboidales actúan como células madre neurales en determinadas circunstancias. 20 most primitive stem cells of the central nervous system of adults. However, even today it is still a matter of debate whether cubicidal multicill ependymal cells act as neural stem cells under certain circumstances.

Además de las células ependimarias, otro tipo celular posee las características propias In addition to ependymal cells, another cell type has its own characteristics

25 de células madre del sistema nervioso: los astrocitos subependimarios de los nichos neurogénicos. Tanto las células ependimarias como los astrocitos subependimarios de los nichos neurogénicos comparten algunas características: i) derivan de la glía radial presente en etapas fetales y primeras etapas postnatales; ii) son células ciliadas, aunque en el caso de los astrocitos únicamente poseen un único cilio primario 25 stem cells of the nervous system: subependymal astrocytes of neurogenic niches. Both ependymal cells and subependymal astrocytes of neurogenic niches share some characteristics: i) they derive from the radial glia present in fetal stages and early postnatal stages; ii) they are hair cells, although in the case of astrocytes they only have a single primary cilia

30 localizado en una prolongación apical que contacta con el LCR, y; iii) están en contacto, por tanto, con el LCR y con una membrana basal derivada de los vasos sanguíneos locales. 30 located in an apical extension that contacts the CSF, and; iii) are therefore in contact with the CSF and with a basement membrane derived from local blood vessels.

Lo que esencialmente está en discusión en la técnica es la capacidad proliferativa de 35 las células ependimarias multiciliadas adultas: mientras que para algunos autores estas células se consideran células postmitóticas y diferenciadas, otros han demostrado que pueden adquirir características de glía radial bajo ciertas condiciones y proliferar en respuesta a determinados estímulos, entre ellos a factores de crecimiento, isquemia cerebral y lesiones del tejido nervioso especialmente de la What is essentially under discussion in the art is the proliferative capacity of adult multicill ependymal cells: while for some authors these cells are considered postmitotic and differentiated cells, others have shown that they can acquire radial glia characteristics under certain conditions and proliferate. in response to certain stimuli, including growth factors, cerebral ischemia and nerve tissue lesions especially of the

5 médula espinal. 5 spinal cord

En este sentido, células ependimarias aisladas mediante anticuerpos contra ciertos marcadores de superficie ("magnetic activated cell sorting") de la médula espinal de ratón han mostrado capacidad proliferativa y de diferenciación in vitro, mientras que In this sense, ependymal cells isolated by antibodies against certain surface markers ("magnetic activated cell sorting") of the mouse spinal cord have shown proliferative and differentiation capacity in vitro, while

10 las obtenidas de las paredes ventriculares no han manifestado estas propiedades . 10 those obtained from the ventricular walls have not manifested these properties.

Para estudiar éstos y otros diversos aspectos de la biolog ía celular, el metabolismo, la fisiología y la capacidad de diferenciación de las células ependimarias se han utilizado los cultivos de estas células aisladas. Sin embargo, en la mayoría de los casos estos 15 cultivos primarios se obtuvieron utilizando ependimocitos procedentes de animales recién nacidos (Weibel et al. , 1986. "Primary culture of rat ependymal cells in serumfree defined medium". Brain Res 390, 199-209), yen los casos en los que se usaron células ependimarias de animales adultos nunca se consiguieron cultivos puros mediante el uso exclusivo del cultivo de las células (Hirst et aL, 2000. "Effect of 20 pneumolysin on rat brain ciliary function: comparison of brain slices with cultured ependymal cells". Pediatr Res. 47, 381-384; Manthorpe et al., 1977, "Purification of viable ciliated cuboidal ependymal cells from rat brain". Brain Res. 134, 407-415). El grupo del Prof. van der Kooy llegó a cultivar células ependimarias de la pared septal para realizar ensayos de neuroesferas, aunque no del lado estriatal pues se obtenían To study these and other various aspects of cell biology, metabolism, physiology and the ability to differentiate ependymal cells, cultures of these isolated cells have been used. However, in most cases these 15 primary cultures were obtained using ependymocytes from newborn animals (Weibel et al., 1986. "Primary culture of rat ependymal cells in serumfree defined medium". Brain Res 390, 199-209 ), and in cases where ependymal cells from adult animals were used, pure cultures were never achieved through the exclusive use of cell culture (Hirst et al., 2000. "Effect of 20 pneumolysin on rat brain ciliary function: comparison of brain slices with cultured ependymal cells ". Pediatr Res. 47, 381-384; Manthorpe et al., 1977," Purification of viable ciliated cuboidal ependymal cells from rat brain. "Brain Res. 134, 407-415). Prof. van der Kooy's group came to cultivate ependymal cells of the septal wall to perform neurosphere tests, although not from the striatal side as they were obtained

25 con células contaminantes del subepéndimo (Chiasson et al.,1999. "Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics". J Neurosci. 19, 44624471 ). 25 with polluting cells of the subendimal (Chiasson et al., 1999. "Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics". J Neurosci. 19, 44624471).

30 En la técnica actual, los cultivos de células ependimarias se obtienen mediante una digestión enzimática de la pared ventricular, de forma que sólo se consiguen poblaciones heterogéneas de células neurales (Monkkonen et al., 2008. "PACAP27 regulates ciliary function in primary cultures of rat brain ependymal cells". Neuropeptides. 42, 633-640). Por otro lado, muchos de los métodos descritos se refieren a la obtención de cultivos de células madre del sistema nervioso en su sentido más amplio, y no de células ependimarias en particular. 30 In the current technique, ependymal cell cultures are obtained by enzymatic digestion of the ventricular wall, so that only heterogeneous populations of neural cells are achieved (Monkkonen et al., 2008. "PACAP27 regulates ciliary function in primary cultures of rat brain ependymal cells ". Neuropeptides. 42, 633-640). On the other hand, many of the methods described refer to obtaining cultures of stem cells of the nervous system in its broadest sense, and not of ependymal cells in particular.

La pureza del cultivo es esencial cuando se quieren hacer experimentos en donde se The purity of the crop is essential when you want to do experiments where

5 pretende hacer cambiar la potencialidad de la célula. Como se ha mencionado antes las células ependimarias pueden participar en fenómenos de regeneración y reparación tisular en el sistema nervioso dañado o en proceso de neurodegeneración, en los que actúan como células madre. Sería imposible obtener resultados fiables de experimentos en los que se partiera de cultivos heterogéneos de células ependimarias 5 aims to change the potential of the cell. As mentioned before Ependymal cells can participate in regeneration phenomena and tissue repair in the damaged nervous system or in the process of neurodegeneration, in those that act as stem cells. It would be impossible to obtain reliable results from experiments that started with heterogeneous cultures of ependymal cells

10 Y otras células neurales. 10 And other neural cells.

De forma adicional, en caso de terapias celulares es aconsejable aplicar poblaciones homogéneas de células en las que se ha probado el comportamiento de las mismas. Additionally, in the case of cell therapies, it is advisable to apply homogeneous populations of cells in which their behavior has been tested.

15 Dos artículos publicados recientemente (Coskun V. et al., 2008. "CD133+ neural stem celis in the ependyma of mammalian postnatal forebrain". Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1026-1031 ; Pfenninger et al. , 2011 . "Prospectively isolated CD133/CD24-positive ependymal celis from the adult spinal cord and lateral ventricle wall differ in their longterm in vitro self-renewal and in vivo gene expression". Glia. 59, 68-81 2011) Y la 15 Two recently published articles (Coskun V. et al., 2008. "CD133 + neural stem celis in the ependyma of mammalian postnatal forebrain". Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1026-1031; Pfenninger et al., 2011. "Prospectively isolated CD133 / CD24-positive ependymal celis from the adult spinal cord and lateral ventricle wall differ in their longterm in vitro self-renewal and in vivo gene expression ". Glia. 59, 68-81 2011) And the

20 patente US 20030092176 describen métodos para la obtención de cultivos puros de células ependimarias. Sin embargo, los autores tuvieron que clasificar las células utilizando como marcadores anticuerpos fluorescentes ("fluorescent celi sorting"). Este método tiene dos inconvenientes: en primer lugar, es costoso desde el punto de vista económico y complejo en el procedimiento, consumiendo varias horas de trabajo; y en US Patent 20030092176 describes methods for obtaining pure cultures of ependymal cells. However, the authors had to classify the cells using fluorescent antibodies ("fluorescent celi sorting") as markers. This method has two drawbacks: first, it is economically expensive and complex in the procedure, consuming several hours of work; and in

25 segundo lugar, no existen anticuerpos exclusivos de las células ependimarias (Morest and Silver, 2003. "Precursors of neurons, neuroglia, and ependymal celis in the CNS; what are they? Where are they from? How do they get where they are going?" Glia. 43, 6-18) de tal forma que se pueden estar marcando y purificando otros tipos celulares, además del inconveniente adicional de que las células sometidas al reconocimiento Secondly, there are no antibodies exclusive to ependymal cells (Morest and Silver, 2003. "Precursors of neurons, neuroglia, and ependymal celis in the CNS; what are they? Where are they from? How do they get where they are going ? "Glia. 43, 6-18) in such a way that other cell types may be labeled and purified, in addition to the additional disadvantage that the cells subjected to recognition

30 inmunológico previo necesario para el "cell sorting" podrían sufrir modificaciones fisiológicas. El método de la presente invención evita estos inconvenientes y presenta por tanto una gran ventaja tecnológica sobre estos procedimientos de la técnica. 30 previous immunological necessary for cell sorting could undergo physiological modifications. The method of the present invention avoids these inconveniences and therefore has a great technological advantage over these techniques procedures.

La patente US 6,541 ,247 81 divulga un método para aislar células madre neurales 35 ependimarias del sistema nervioso central que son marcadas en vivo con Di!. El método incluye la necesidad de una purificación por el método de selección magnética US 6,541, 247 81 discloses a method for isolating ependymal neural stem cells from the central nervous system that are labeled live with Di !. The method includes the need for purification by the magnetic selection method

o "magnetic sorting". Este método utiliza una partícula magnétíca para marcar anticuerpos que se unirán a las células ependimarias, y reproduce por tanto los inconvenientes señalados del marcaje inmunológico. or "magnetic sorting." This method uses a magnetic particle to label antibodies that will bind to the ependymal cells, and therefore reproduces the noted drawbacks of the immunological labeling.

De forma similar, la solicitud WO 2004/018655 A2 divulga un método para aislar células madre ependimarias de las paredes laterales de los ventrículos laterales y de la médula espinal. Después de sucesivas digestiones y centrifugaciones, las células son resuspendidas en un antisuero anti-Notch1 y posteriormente en un medio de Similarly, the application WO 2004/018655 A2 discloses a method for isolating ependymal stem cells from the lateral walls of the lateral ventricles and the spinal cord. After successive digestions and centrifugations, the cells are resuspended in an anti-Notch1 antiserum and subsequently in a medium of

10 cultivo que contiene partículas magnéticas para su separación por medio de un separador magnético. Este procedimiento repite inconvenientes similares a la referencia anterior y tampoco debe afectar a la patentabilidad de la invención. 10 culture containing magnetic particles for separation by means of a magnetic separator. This procedure repeats similar drawbacks to the previous reference and should not affect the patentability of the invention.

El problema entonces de la técnica es disponer de un procedimiento de obtención de The problem then of the technique is to have a procedure for obtaining

15 cultivos puros de células ependimarias, en el que no existan células contaminantes de ningún otro tipo, que asegure la homogeneidad de los resultados obtenidos en los cultivos celulares. La solución que propone la presente invención es la obtención de dicho cultivo puro por un método que incluye como etapas determinantes una incubación del tejido en frío previa a la digestión proteolítica a temperatura corporal, y 15 pure cultures of ependymal cells, in which there are no contaminating cells of any other type, to ensure the homogeneity of the results obtained in cell cultures. The solution proposed by the present invention is to obtain said pure culture by a method that includes as a determining step a cold tissue incubation prior to proteolytic digestion at body temperature, and

20 el mantenimiento posterior del cultivo en un medio básico donde no sobrevive ninguna célula neural con excepción de dichas células ependimarias. 20 the subsequent maintenance of the culture in a basic environment where no neural cells survive except for said ependymal cells.

25 DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN 25 DESCRIPTION OF THE INVENTION

La presente invención describe un procedimiento de obtención de un cultivo puro de células ependimarias multiciliadas, que comprende: The present invention describes a method of obtaining a pure culture of multicill ependymal cells, comprising:

30 incubación en frío de un explante de pared ventricular de cerebro o del canal central de la médula espinal de un sujeto preferiblemente durante al menos 10 min; 30 cold incubation of a explant of the ventricular wall of the brain or the central canal of the spinal cord of a subject, preferably for at least 10 min;

digestión enzimática de dicho explante en presencia de al menos una enzima proteolítica, preferiblemente un cóctel de enzimas proteolíticas, y un quelante de calcio preferiblemente durante al menos 20 min; enzymatic digestion of said explant in the presence of at least one proteolytic enzyme, preferably a cocktail of proteolytic enzymes, and a calcium chelator preferably for at least 20 min;

5 lavado del explante resultado de dicha digestión con un medio de cultivo celular, preferiblemente un medio básico de cultivo celular y más preferiblemente aMEM-Glucosa; y 5 explant washing resulting from said digestion with a culture medium cell, preferably a basic cell culture medium and more preferably aMEM-Glucose; Y

purificación de las células ependimarias desprendidas al medio resultado de la purification of ependymal cells detached from the environment resulting from the

10 etapa anterior en medio básico de cultivo celular preferiblemente aMEMGlucosa. En una realización preferible, esta purificación se lleva a cabo durante 24 h, más preferiblemente durante al menos 36 h Y más preferiblemente aún durante al menos 48 h. En otra realización preferible de la invención, el medio básico de cultivo celular comprende un surfactante no iÓnico. 10 above stage in basic cell culture medium preferably aMEMGlucose. In a preferable embodiment, this purification is carried out for 24 h, more preferably for at least 36 h and more preferably even for at least 48 h. In another preferred embodiment of the invention, the basic cell culture medium comprises a non-unique surfactant.

La realización más preferible de la invención es que el procedimiento comprenda una incubación del explante una vez lavado en presencia de al menos una enzima capaz de digerir DNA, preferiblemente DNAsa I o DNAsa 11. Tras la correspondiente eliminación de la enzima y recuperación de las células ependimarias, la cantidad The most preferable embodiment of the invention is that the process comprises incubation of the explant once washed in the presence of at least one enzyme capable of digesting DNA, preferably DNAse I or DNAse 11. After the corresponding removal of the enzyme and recovery of the cells ependimarias, the amount

20 obtenida al purificarlas se incrementa en cerca de dos órdenes de magnitud. 20 obtained by purifying them increases by about two orders of magnitude.

Otra realización del procedimiento de la invención es que dicha enzima proteolítica y dicho quelante de calcio que se utilizan en la digestión se adicionen en la incubación en frío de la etapa anterior. Sin embargo, el resultado de esta realización no mejora Another embodiment of the process of the invention is that said proteolytic enzyme and said calcium chelator that are used in digestion are added in the cold incubation of the previous stage. However, the result of this embodiment does not improve

25 significativamente la cantidad final de células purificadas. Significantly the final amount of purified cells.

El alcance de la presente invención refiere siempre a células ependimarias multiciliadas, ya ellas se referirá cuando haga mención a "células ependimarias". The scope of the present invention always refers to multicill ependymal cells, and they will be referred to when mentioning "ependymal cells".

30 En el ámbito de la presente invención se entiende por "cultivo puro" de células ependimarias un cultivo de dichas células ependimarias esencialmente del 100% de pureza, y la ausencia de cualquier otro tipo de células del parénquima. Within the scope of the present invention, "pure culture" of ependymal cells is understood as a culture of said ependymal cells essentially of 100% purity, and the absence of any other type of parenchyma cells.

En el ámbito de la presente invención se entiende por una "incubación en frío H una 35 incubación entre Oy 6°C, típicamente a 4°C en baño de hielo. Within the scope of the present invention, "cold incubation H" means incubation between 0 and 6 ° C, typically at 4 ° C in an ice bath.

En el ámbito de la presente invención se entiende por un "quelante de calcio" aquel compuesto capaz de separar el calcio de la superficie celular o de inhabilitarlo en su función, tipicamente reaccionando de forma química con él. Varias sustancias pueden Within the scope of the present invention, a "calcium chelator" means a compound capable of separating calcium from the cell surface or disabling it in its function, typically reacting chemically with it. Several substances can

5 actuar como quelantes de calcio en cultivos celulares, por ejemplo y sin intención de resultar restrictivos, el EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), el EGTA (etilenglicol bis-(p-aminoetil)-N,N,N",N'-ácido tetraacético), y el SAPTA (ácido 1,2-bis(2aminofenoxi}etano-N ,N ,N' ,N' -tetraacético). 5 act as calcium chelators in cell cultures, for example and with no intention of be restrictive, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), EGTA (ethylene glycol bis- (p-aminoethyl) -N, N, N ", N'-tetraacetic acid), and SAPTA (1,2-bis (2-aminophenoxy} ethane-N, N, N ', N'-tetraacetic acid).

10 El procedimiento de la invención resulta mucho más sencillo que los descritos en la técnica, además de su alto rendimiento. Un aspecto determinante de su inventividad es la primera etapa de incubación en frío que aumenta enormemente el rendimiento del número de células ependimarias a obtener y, mas importante aún, evita el marcaje con anticuerpos con todas las ventajas que esto conlleva, desarrolladas en el capítulo The process of the invention is much simpler than those described in the art, in addition to its high performance. A determining aspect of its inventiveness is the first stage of cold incubation that greatly increases the yield of the number of ependymal cells to be obtained and, more importantly, avoids labeling with antibodies with all the advantages that this entails, developed in the chapter

15 anteríor. 15 above.

Por otra parte, está ampliamente aceptado que las células del sistema nervioso necesitan factores de crecimiento para su supervivencia en cultivos celulares. Sin embargo, los inventores han descubierto que sorprendentemente las células 20 ependimarias aisladas in vitro no necesitan de tales factores para mantenerse, lo cual es excepcional con respecto al resto de células neurales. Así, las células ependimarias pueden sobrevivir en medio de cultivo simple aMEM-glucosa sin suplementar con factores de crecimiento por un periodo de hasta 2 semanas mientras que el resto de las células neurales mueren, lo cual supone un segundo aspecto determinante de la On the other hand, it is widely accepted that nervous system cells need growth factors for their survival in cell cultures. However, the inventors have discovered that surprisingly isolated ependymal cells in vitro do not need such factors to be maintained, which is exceptional with respect to the rest of neural cells. Thus, the ependymal cells can survive in a simple culture medium aMEM-glucose without supplementing with growth factors for a period of up to 2 weeks while the rest of the neural cells die, which is a second determining aspect of the

25 inventividad del procedimiento de la invención . The inventiveness of the process of the invention.

La mayoría de las células en cultivo producen factores de crecimiento que son liberados al medio. Las células cultivadas a una cierta densidad generan una concentración de factores que podría potenciar la supervivencia de células neurales. Most cells in culture produce growth factors that are released into the environment. Cells grown at a certain density generate a concentration of factors that could enhance the survival of neural cells.

30 De forma coherente con este hecho, el alcance de la presente invención comprende la aplicación de cualquier método que evite la presencia de factores de crecimiento en el medio básico utilizado en la etapa final de purificación de las células ependimarias. Entre ellos, un método sencillo es cultivar las células a baja densidad según el procedimiento ejemplificado en la presente solicitud. In a manner consistent with this fact, the scope of the present invention comprises the application of any method that prevents the presence of growth factors in the basic medium used in the final stage of purification of ependymal cells. Among them, a simple method is to grow the cells at low density according to the procedure exemplified in the present application.

Una realización preferible de la invención, por tanto, es que la purificación de la etapa d) se lleve a cabo a una baja densidad celular, preferiblemente inferior a 2 célulasl microlitro y más preferiblemente de 1 célula/microlitro. A preferable embodiment of the invention, therefore, is that the purification of step d) is carried out at a low cell density, preferably less than 2 microliter cells and more preferably 1 cell / microliter.

5 Otra realización preferible del procedimiento de la invención es que el sujeto de quien procede el explante es un vertebrado, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un roedor. 5 Another preferable embodiment of the process of the invention is that the subject of whom proceed the explant is a vertebrate, preferably a mammal and more preferably a rodent.

Otra realización muy preferible de la invención es el cultivo puro de células 10 ependimarias . Y otra realización preferible más es el uso de dicho cultivo puro de células ependimarias en biomedicina o farmacología. Another very preferable embodiment of the invention is the pure culture of ependymal cells. And yet another preferable embodiment is the use of said pure culture of ependymal cells in biomedicine or pharmacology.

La posibilidad de tener un cultivo puro de células ependimarias servirá para abordar el estudio de estas células in vitro, con la posibilidad de controlar un gran número de 15 parámetros que no pueden ser manipulados in vivo. Los conocimientos de la biología celular y especialmente de la fisiologia de las células ependimarias son muy limitados, entre otras razones por la imposibilidad de tener cultivos celulares puros de las células procedentes de adultos. El estudio de las células ependimarias in vitro posibilitaría evaluar el potencial de dichas células para cambiar su fenotipo y transformarse en The possibility of having a pure culture of ependymal cells will serve to address the study of these cells in vitro, with the possibility of controlling a large number of 15 parameters that cannot be manipulated in vivo. The knowledge of cell biology and especially the physiology of ependymal cells is very limited, among other reasons due to the impossibility of having pure cell cultures of cells from adults. The study of ependymal cells in vitro would make it possible to evaluate the potential of these cells to change their phenotype and transform into

20 células con características de glía radial o de astrocito, fenómeno que ocurre de forma natural en situaciones de lesión del sistema nervioso. 20 cells with characteristics of radial glia or astrocyte, a phenomenon that occurs naturally in situations of nervous system injury.

Por otro lado, en humanos, varios tipos celulares poseen cilios: el epitelio de las vías respiratorias superiores e inferiores, el epitelio de los oviductos y de los conductos 25 espermáticos, el órgano de Corti en el oído interno y las células ependimarias del sistema nervioso central. Un cierto número de patologías denominadas ciliopatías afectan a estos sistemas y tienen su etiología en una disfunción del aparato ciliar de las células ciliadas. Disponer de un tipo celular multiciliado que se pueda cultivar in vitro permitiría abordar el estudio de los cilios móviles (9+2) presentes en las células On the other hand, in humans, several cell types have cilia: the epithelium of the upper and lower respiratory tract, the epithelium of the oviducts and the spermatic ducts, the Corti organ in the inner ear and the ependymal cells of the nervous system central. A certain number of pathologies called ciliopathies affect these systems and have their etiology in a dysfunction of the ciliary apparatus of the hair cells. Having a multiciliate cell type that can be grown in vitro would allow the study of mobile cilia (9 + 2) present in cells

30 ciliadas. Los cultivos puros de células ependimarias pueden constituir un modelo de estudio de las mencionadas ciliopatías. 30 ciliates Pure cultures of ependymal cells may constitute a study model of the mentioned ciliopathies.

Por otra parte , algunos fármacos interactúan de forma indeseable con el funcionamiento del aparato ciliar, lo cual conlleva consecuencias muy graves. 35 Disponer de un modelo in vitro de célula ciliada en donde poder probar la acción de On the other hand, some drugs interact undesirably with the functioning of the ciliary apparatus, which has very serious consequences. 35 Have an in vitro model of a hair cell in which to test the action of

nuevos fármacos será de gran interés para la industria farmacéutica. En concreto para investigar la acción de nuevos drogas terapéuticas sobre el funcionamiento del aparato ciliar. New drugs will be of great interest to the pharmaceutical industry. Specifically to investigate the action of new therapeutic drugs on the functioning of the ciliary apparatus.

5 Teniendo en cuenta los importantes avances que se están produciendo en el campo de la inducción de células madre pluripotenciales, el posible cambio de potencialidad de las células ependimarias bajo condiciones controladas apunta a la utilidad de los cultivos puros primarios de células ependimarias para su aplicación en experimentos dirigidos a futuras terapias para la reparación del sistema nervioso, especialmente en 5 Taking into account the important advances that are taking place in the field of the induction of pluripotential stem cells, the possible change in potential of ependymal cells under controlled conditions points to the usefulness of pure primary cultures of ependymal cells for application in experiments aimed at future therapies for nervous system repair, especially in

10 situaciones de envejecimiento, donde el número de células madre neurales convencionales disminuye de forma significativa. El estudio de las células ependimarias en modelos in vitro podrá aportar nueva información sobre los factores que pudieran desencadenar la transformación de células ependimarias en células madre neurales. 10 aging situations, where the number of conventional neural stem cells decreases significantly. The study of ependymal cells in in vitro models may provide new information on the factors that could trigger the transformation of ependymal cells into neural stem cells.

Disponer de un cultivo puro de células ependimarias permitirá desarrollar modelos de transformación de este tipo celular en células con características tumorales, y en concreto en ependimomas. Los ependimomas son tumores que se desarrollan a partir de las células ependimarias y que suponen un 9% de los tumores cerebrales. El hecho Having a pure culture of ependymal cells will allow to develop models of transformation of this cell type in cells with tumor characteristics, and specifically in ependymomas. Ependymomas are tumors that develop from ependymal cells and make up 9% of brain tumors. The fact

20 de disponer de un modelo in vitro de células ependimarias permitirá también estudiar la fisiología de dichas células desde un punto de vista general. 20 having an in vitro model of ependymal cells will also allow to study the physiology of said cells from a general point of view.

25 BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS 25 BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1. Disección del cerebro de la rata para la obtención de los explantes de pared ventricular. A: Vista ventral del cerebro de la rata adulta. La línea discontinua marca el nivel por el que se realiza el corte transversal del cerebro. Este plano de corte pasa 30 por el quiasma óptico (flecha). Las letras "r" y "c" significan rostral y caudal respectivamente. B: Imagen del plano de corte indicado en A (fragmento rostral). Las líneas punteadas indican los lugares de corte para obtener la imagen en C. Las letras "d" y "v" significan dorsal y ventral respectivamente. C: El mismo fragmento que en B con los cortes a nivel dorsal (telencéfalo) y ventral. D: Imagen de la región dorsal del 35 fragmento mostrado en C. A través del corte realizado se puede observar parte de la Figure 1. Dissection of the rat brain to obtain ventricular wall explants. A: Ventral view of the brain of the adult rat. The dashed line marks the level by which the brain's cross section is performed. This cutting plane passes through the optic chiasma (arrow). The letters "r" and "c" mean rostral and caudal respectively. B: Image of the cut plane indicated in A (rostral fragment). Dotted lines indicate the cut places to obtain the image in C. The letters "d" and "v" mean dorsal and ventral respectively. C: The same fragment as in B with the dorsal (telencephalon) and ventral cuts. D: Image of the dorsal region of the fragment shown in C. Through the cut made, part of the

pared ventricular estriatal. E: Este fragmento lateral que se observa en esta imagen se ha obtenido cortando por la parte rostral y ventral el fragmento observado en D. En dicho fragmento están marcados con línea discontinua los límites por donde se corta para obtener un explante de la pared estriatal. F: Explante de la pared estriatal striatal ventricular wall. E: This lateral fragment that is observed in this image has been obtained by cutting through the rostral and ventral part the fragment observed in D. In said fragment, the boundaries through which it is cut are marked with a broken line to obtain an explant of the striatal wall. F: Striatal Wall Explant

5 obtenido del fragmento mostrado en la figura E. Barras en A, B, e, o y E, 500 ~m; Barra en F, 100 ~m. 5 obtained from the fragment shown in Figure E. Bars in A, B, e, o and E, 500 µm; F-bar, 100 ~ m.

Figura 2. Explante de pared ventricular de rata en cultivo después del tratamiento enzimático y células ependimarias desprendidas del mismo. A: Fragmento de explante 10 de la pared estriatal del ventrículo lateral inmediatamente después del tratamiento enzimático. Se pueden apreciar varios grupos de células parcialmente separadas del explante (flechas). A partir de estos grupos se irán desprendiendo células ependimarias individuales. B: Células desprendidas de un explante in vitro 24 horas después del tratamiento enzimático. La mayor parte de las células tienen una Figure 2. Ventricular wall implant of rat in culture after enzymatic treatment and ependymal cells detached therefrom. A: Explant fragment 10 of the striatal wall of the lateral ventricle immediately after enzymatic treatment. Several groups of cells partially separated from the explant (arrows) can be seen. From these groups, individual ependymal cells will detach. B: Cells detached from an explant in vitro 24 hours after enzyme treatment. Most cells have a

15 morfología esférica y están en movimiento. C: Células ependimarias in vitro 72 horas después del tratamiento enzimático y 48 horas después de permanecer en un medio mínimo a baja densidad. Las únicas células vivas están en movimiento rotatorio. D: Células similares a las mostradas en la imagen C pero a mayores aumentos. Barra en A, 100 ~m; barras en B y e, 40 ~m; barra en D, 20 ~m. 15 spherical morphology and are in motion. C: Ependymal cells in vitro 72 hours after enzymatic treatment and 48 hours after remaining in a minimal medium at low density. The only living cells are in rotary motion. D: Cells similar to those shown in image C but at higher magnifications. A-bar, 100 ~ m; bars in B and e, 40 ~ m; D-bar, 20 ~ m.

20 Figura 3. Frotis de células ependimarias de ratón (72 horas en cultivo) fijadas e inmunoteñidas con distintos marcadores. A y B: Células ependimarias marcadas con un anticuerpo contra la beta-IV-tubulina. Este marcador se localiza tanto en el cuerpo celular como en los cilios. C y O: Células ependimarias inmunoteñidas con anti20 Figure 3. Smears of mouse ependymal cells (72 hours in culture) fixed and immunostained with different markers. A and B: Ependymal cells labeled with an antibody against beta-IV-tubulin. This marker is located both in the cell body and in the cilia. C and O: Ependymal cells immunostained with anti

25 tubulina acetilada. El patrón de tinción es similar al de la beta-IV-tubulina. E y F: Tinción de ependimocitos con beta-III-tubulina. En este caso las células ependimarias no se tiñeron con este anticuerpo, que es un marcador de neuroblastos. G y H: Tinción con anticuerpos contra la gamma-tubulina. Este marcador se localiza en los centriolos y, por tanto, en los cuerpos basales de los cilios. Como se puede apreciar en la 25 acetylated tubulin. The staining pattern is similar to that of beta-IV-tubulin. E and F: Staining of ependymocytes with beta-III-tubulin. In this case the ependymal cells were not stained with this antibody, which is a marker of neuroblasts. G and H: Staining with antibodies against gamma-tubulin. This marker is located in the centrioles and, therefore, in the basal bodies of the cilia. As you can see in the

30 imagen a mayores aumentos la marca se localiza en la base de los cilios. Barras en A, e, E y G, 20 ~m; barras en B, D, F Y H, 1 O ~m. 30 image at higher magnifications the brand is located at the base of the cilia. Bars in A, e, E and G, 20 ~ m; bars in B, D, F and H, 1 O ~ m.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN Con la intención de mostrar la presente invención de un modo ilustrativo aunque en ningún modo limitante, se aportan los siguientes ejemplos. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION With the intention of showing the present invention in an illustrative way but in no way limiting, the following examples are provided.

5 Ejemplo 1: Separación de las células ependimarias de los explantes Se utilizaron explantes de 2,5 mm2 de la pared estriatal y septal de los ventrículos laterales del cerebro de ratas adultas (Wistar, peso de 250-300 g) Y de ratones adultos (Cepa CD1 , peso de 20-25 g). Se situaron los explantes tanto de rata como de ratón en tubos de ensayo tipo Falcon de 15 mi con un volumen de HBSS de 2 mi por 5 Example 1: Separation of ependymal cells from explants 2.5 mm2 explants of the striatal and septal wall of the ventricles were used Lateral brains of adult rats (Wistar, weight 250-300 g) And adult mice (Strain CD1, weight 20-25 g). The explants of both rat and mouse were placed in 15 ml Falcon test tubes with an HBSS volume of 2 ml per

10 explante, a 4°C durante 10 minutos. Después de ese tiempo se llevó a cabo una digestión enzimática muy suave con solución enzimática TrypLE TM Express (Invitrogen, ref. 12605-010), a razón de 2 mi por explante. Esta solución enzimática está formada por una enzima recombinante obtenida mediante fermentación bacteriana y un quelante de calcio (EDTA 1 mM). La incubación con la solución 10 explant, at 4 ° C for 10 minutes. After that time a very mild enzymatic digestion was carried out with TrypLE TM Express enzyme solution (Invitrogen, ref. 12605-010), at a rate of 2 ml per explant. This enzymatic solution is formed by a recombinant enzyme obtained by bacterial fermentation and a calcium chelator (1 mM EDTA). The incubation with the solution

15 enzimática se realizó en un tubo Falcon de 15 mi, a 37° e sin agitación y durante 20 minutos. Se retiró entonces la solución enzimática, se le añadió medio de cultivo aaMEM (Invitrogen ref. A10490-01) y se dejó en baño de hielo durante otros 5 minutos. Luego se sustituyó el medio fria por aMEM a temperatura ambiente en el que permanecieron los explantes durante 5 minutos mas. A continuación se situaron en 15 enzymatic was performed in a 15 ml Falcon tube, at 37 ° e without stirring and for 20 minutes. The enzyme solution was then removed, aaMEM culture medium (Invitrogen ref. A10490-01) was added and left in an ice bath for another 5 minutes. Then the cold medium was replaced by aMEM at room temperature in which the explants remained for another 5 minutes. They were then placed in

20 placas de 6 pocillos (superficie del pocillo 962 mm), en cada uno de los cuales se suplementaron 3 mi de aMEM con los siguientes aditivos: glucosa al 0,3% y Pluronic F-127 al 0,2% (Sigma ref. P-2443). Después de 24 horas en este medio, el resultado fue el desprendimiento de muy pocas células ependimarias, que se cuantificaron en 2,3 x 102 células por explante de pared estriatal y 1,8 x 102 por explante de pared 20 6-well plates (962 mm well surface), in each of which 3 ml of aMEM was supplemented with the following additives: 0.3% glucose and 0.2% Pluronic F-127 (Sigma ref. P-2443). After 24 hours in this medium, the result was the shedding of very few ependymal cells, which were quantified in 2.3 x 102 cells per striatal wall explant and 1.8 x 102 per wall explant

25 septal. Septal 25

Ejemplo 2: Separación de las células ependimarias de los explantes y digestión posterior con DNAsa Se utilizaron explantes de 2,5 mm2 de la pared estriatal y septal de los ventrículos Example 2: Separation of the ependymal cells from the explants and subsequent digestion with DNAse. 2.5 mm2 explants of the striatal and septal wall of the ventricles were used.

30 laterales del cerebro de ratas adultas (Wistar, peso de 250-300 g) Y de ratones adultos (Cepa COI , peso de 20-25 g). Estos explantes se situaron en tubos de ensayo tipo Falcon de 15 mi con un volumen de HBSS de 2 mi por explante, a 4'C durante 10 minutos. Después de ese tiempo se llevó a cabo una digestión enzimática muy suave con solución enzimática TrypLETM Express (Invitrogen, ref. 12605-010), a razón de 2 30 lateral of the brain of adult rats (Wistar, weight of 250-300 g) And of adult mice (IOC strain, weight of 20-25 g). These explants were placed in 15 ml Falcon test tubes with an HBSS volume of 2 ml per explant, at 4'C for 10 minutes. After that time a very mild enzymatic digestion was carried out with TrypLETM Express enzyme solution (Invitrogen, ref. 12605-010), at the rate of 2

35 mi por explante. La incubación con la solución enzimatica se realizó en un tubo Falcon de 15 mi, a 37° e sin agitación y durante 20 minutos. Se retiró entonces la solución enzimática, se le añadió medio de cultivo aMEM (Invitrogen ref. A 10490-01) Y se dejó en baño de hielo durante otros 5 minutos. Luego se sustituyó el medio frío por aMEM a temperatura ambiente en el que permanecieron los explantes durante 5 minutos más. 35 mi per explant. Incubation with the enzymatic solution was performed in a 15 ml Falcon tube, at 37 ° e without stirring and for 20 minutes. The enzyme solution was then removed, aMEM culture medium (Invitrogen ref. A 10490-01) was added and left in an ice bath for another 5 minutes. Then the cold medium was replaced by aMEM at room temperature in which the explants remained for an additional 5 minutes.

5 A continuación se situaron en placas de 6 pocillos (superficie del pocillo 962 mm ), en cada uno de los cuales se suplementaron 3 mi de aMEM con los siguientes aditivos: glucosa al 0,3% y Pluronic F-127 al 0,2% (Sigma rel. P-2443), Dnasa I al 0,01% (Sigma ref. DN-25). Se incubaron entonces 24 horas en una estufa a 37° e en atmósfera del 5% de CO2 para conseguir desprender la mayoría de las células 5 Next, they were placed in 6-well plates (962 mm well surface), in each of which 3 ml of aMEM was supplemented with the following additives: 0.3% glucose and 0.2 F-127 Pluronic % (Sigma rel. P-2443), Dnasa I 0.01% (Sigma ref. DN-25). They were then incubated 24 hours in an oven at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO2 to get rid of most cells

10 ependimarias y muy pocas células de cualquier otro tipo (Figura 2b). Tras las 24 horas de cultivo del explante la mayor parte de las células ependimarias se desprenden y quedan en el fondo de las placas de cultivo. Para recoger estas células se dejó decantar el medio de cultivo durante 10 minutos quedando las células ependimarias en suspensión. El sobrenadante se centrifugó entonces a 1500 rpm durante 5 minutos. El 10 ependymal and very few cells of any other type (Figure 2b). After 24 hours of explant culture, most ependymal cells break off and remain at the bottom of the culture plates. To collect these cells, the culture medium was allowed to decant for 10 minutes, leaving the ependymal cells in suspension. The supernatant was then centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. He

15 pellet resultante se resuspendió en 1 mi de medio nuevo sin DNasa (aMEM con 0,3% glucosa, 0,2% Pluronic F-127) para hacer un recuento celular mediante una cámara cuenta glóbulos, donde se estimó que de cada explante estriatal se obtuvieron 15 x 103 células ependimarias en movimiento, mientras que de un explante de la pared seplal, 12 x 10' . The resulting pellet was resuspended in 1 ml of new medium without DNase (aMEM with 0.3% glucose, 0.2% Pluronic F-127) to make a cell count by means of a blood cell chamber, where it was estimated that of each striatal explant 15 x 103 ependymal cells in motion were obtained, while from an explant of the seplal wall, 12 x 10 '.

20 Ejemplo 3: Caracterización citológica de las células obtenidas El pellet del cultivo de células ependimarias obtenido en el Ejemplo 2 se resuspendió en 1 mi de medio y se fijó con formaldehído a una concentración final del 2%, durante 20 minutos a 4°C. Con este material se realizaron extensiones celulares sobre Example 3: Cytological characterization of the cells obtained The pellet of the ependymal cell culture obtained in Example 2 was resuspended in 1 ml of medium and fixed with formaldehyde at a final concentration of 2%, for 20 minutes at 4 ° C. With this material cell extensions were made on

25 portaobjetos tratados con poli-L-lisina (Sigma, ref. P-8920) y se sometieron a inmunocitoquímica para determinar la identidad de las células desprendidas. Se utilizaron entonces anticuerpos marcadores de: i) astrocitos y células astrogliales (antiGFAP, Sigma G3893, G9269, dilución 1:1000: anli-GLAST, Abcam dilución 1:1000): ii) neuroblastos (anti-beta-III-tubulina, Promega G7121 , dilución 1:5000); iii) células 25 slides treated with poly-L-lysine (Sigma, ref. P-8920) and subjected to immunocytochemistry to determine the identity of the detached cells. Marker antibodies of: i) astrocytes and astroglial cells (antiGFAP, Sigma G3893, G9269, 1: 1000 dilution: anli-GLAST, Abcam dilution 1: 1000) were used: ii) neuroblasts (anti-beta-III-tubulin, Promega G7121, dilution 1: 5000); iii) cells

30 ciliadas (anti-gamma tubulina, Sigma T5192, dilución 1:1000, anti-tubulina acetilada Sigma 6793, dilución 1:1000 y anli-bela-IV-Iubulina, Sigma T7941 , dilución 1:1000): iv) oligodendrocitos (anti-SOX10, R&D Systems, rel. MAB2864, dilución 1:100: y anliolig2, R&D Systems, ref. AF2418, dilución 1:100); v) microglia (anti-IBA1, Wako 1919741, 1:1000). La técnica inmunocitoquímica se realizó utilizando anticuerpos secundarios marcados con biolina (anti-lgG de conejo, Pierce, reto31820 y anli-lgG de ratón, Pierce ref. 31800) a una dilución de 1:1000. Posteriormente las células se incubaron con el complejo avidina-biotina (Thermo-Scientific, ABC Peroxidase Staining Kit, ref. 32020) a una dilución de 1 :250 siguiendo las instrucciones del fabricante. El 30 ciliates (anti-gamma tubulin, Sigma T5192, dilution 1: 1000, acetylated anti-tubulin Sigma 6793, dilution 1: 1000 and anli-bela-IV-Iubulin, Sigma T7941, dilution 1: 1000): iv) oligodendrocytes (anti -SOX10, R&D Systems, rel. MAB2864, dilution 1: 100: and anliolig2, R&D Systems, ref. AF2418, dilution 1: 100); v) microglia (anti-IBA1, Wako 1919741, 1: 1000). The immunocytochemical technique was performed using bioline-labeled secondary antibodies (rabbit anti-IgG, Pierce, retort31820 and mouse angl-IgG, Pierce ref. 31800) at a dilution of 1: 1000. The cells were subsequently incubated with the avidin-biotin complex (Thermo-Scientific, ABC Peroxidase Staining Kit, ref. 32020) at a dilution of 1: 250 following the manufacturer's instructions. He

5 revelado de la peroxidasa se realizó con diaminobencidina y perhidrol. Todos los lavados se realizaron con tampón fosfato salino pH 7,4 (PBS). Mediante la inmunotinción de las extensiones celulares con los distintos marcadores de células neurales se llegó a determinar que un 7% de las células desprendidas no eran células ependimarias. The development of peroxidase was performed with diaminobenzidine and perhydrol. All washes were performed with pH 7.4 saline phosphate buffer (PBS). By immunostaining the cell extensions with the different markers of neural cells, it was determined that 7% of the detached cells were not ependymal cells.

10 Ejemplo 4: Purificación de las células ependimarias en cultivo Las células ependimarias obtenidas según el Ejemplo 2 se volvieron a poner en cultivo en el mismo medio pero en un volumen de 15 mi en una placa de Petri de 90 mm de Example 4: Purification of the ependymal cells in culture The ependymal cells obtained according to Example 2 were returned to culture in the same medium but in a volume of 15 ml in a 90 mm Petri dish of

diámetro (63,61 cm). Se mantuvieron en dicha placa con medio aMEM suplementado diameter (63.61 cm). They were kept on said plate with supplemented aMEM medium

15 con 0,3% glucosa durante un periodo de 48 horas para obtener una densidad de cultivo entre 1-2 células por microlitro; en estas condiciones sólo son capaces de sobrevivir las células ependimarias, mientras que las pocas células no ependimarias desprendidas debido a la digestión mueren al cabo de este tiempo (figura 2C y D). Para verificar este hecho, tras 48 horas se analizaron los cultivos de la siguiente 15 with 0.3% glucose over a period of 48 hours to obtain a culture density between 1-2 cells per microliter; under these conditions, only ependymal cells are able to survive, while the few non-ependymal cells detached due to digestion die after this time (Figure 2C and D). To verify this fact, after 48 hours the cultures of the following were analyzed

20 forma: los 15 mi de medio se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos, yel pellet se resuspendió en 1 mi de medio aMEM. Estas células se fijaron mediante la adición de 1 mi de formaldehído al 4%, durante 20 minutos a 4°C. Las células fijadas se caracterizaron citológicamente según el procedimiento descrito en el Ejemplo 3. Tras 48 horas en cultivo el 100% de las 2093 células fueron positivas a los marcadores 20 form: the 15 ml of medium was centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes, and the pellet was resuspended in 1 ml of aEMEM medium. These cells were fixed by adding 1 ml of 4% formaldehyde, for 20 minutes at 4 ° C. The fixed cells were cytologically characterized according to the procedure described in Example 3. After 48 hours in culture 100% of the 2093 cells were positive for the markers

25 ependimarios (figura 3) y además todas presentaban el penacho de cilios caracteristico. Para separar las células ependimarias de las células muertas se centrifugó el medio de cultivo a 750 rpm durante 5 minutos y se eliminó el sobrenadante con la totalidad de las células muertas y restos celulares. 25 ependimarios (figure 3) and also all presented the characteristic cilia plume. To separate the ependymal cells from the dead cells, the culture medium was centrifuged at 750 rpm for 5 minutes and the supernatant was removed with all the dead cells and cell debris.

30 Ejemplo 5: Esquema de la mejor realización del método de la invención Example 5: Scheme of the best embodiment of the method of the invention

paredes de los ventrículos ventricular walls

t=O t = O

t = 24h t = 72h

Se fijaron en formol al 2%, se realizó frotis e inmunocitoquimica con distintos marcadores They were fixed in 2% formalin, smear and immunocytochemistry were performed with different markers

Disección del cerebro de la Brain dissection of the

Obtención de explantes de la pared Obtaining wall explants

rata/ratón: exposición de las rat / mouse: exposure of

ventricular de rata/ratón rat / mouse ventricular

laterales lateral

Incubación secuencial de los explantes en: Medio H BSS a 40 C, 10 minutos Triple™ Express (Invitrogen) a 370 C, 20 minutos MEM (Invitrogen) a 40 C, 5 minutos Sequential incubation of explants in: Medium H BSS at 40 C, 10 minutes Triple ™ Express (Invitrogen) at 370 C, 20 minutes MEM (Invitrogen) at 40 C, 5 minutes

MEM (Invitrogen) a 200 C, 5 minutos MEM (Invitrogen) at 200 C, 5 minutes

Incubación de los explantes en MEM conteniendo los aditivos: Incubation of explants in MEM containing additives:

• •: 0,3% glucosa, · 0,2% Pluronic F1 27 y 0.3% glucose, 0.2% Pluronic F1 27 and

• •: 0,01 % DNasa I 0.01% DNase I

Incubación a 370 C con 5% de CO2 en placas de 6 pocillos, 3 mi de medio por pocillo. Incubation at 370 C with 5% CO2 in 6-well plates, 3 ml of medium per well.

En las primeras horas se fueron desprendiendo las células ependimarias de los explantes In the first hours the ependymal cells were detached from the explants

Tras 24 horas de incubación se obtuvieron un gran número de células, la mayoría son ependimarias (7% no ependimarias) After 24 hours of incubation a large number of cells were obtained, the majority are ependymal (7% not ependymal)

Estas células se diluyeron a una densidad de 1 célula/microlitro y se incubaron 48 horas en MEM con 0,3% glucosa y 0,2% Pluronic F127 a 370 C con 5% de CO2 These cells were diluted to a density of 1 cell / microliter and incubated 48 hours in MEM with 0.3% glucose and 0.2% Pluronic F127 at 370 C with 5% CO2

<7 <7

En estas condiciones y durante este tiempo sólo sobrevivieron las células ependimarias In these conditions and during this time only ependymal cells survived

N° solicitud F.Efecth·a F.OEPM P201 13 1556 30/07/2013 01108/2013 Application No. F.Effect · OEPM P201 13 1556 07/30/2013 01108/2013

Claims

1. Procedure for obtaining a pure culture of multicill ependymal cells, comprising:

a) cold incubation of an explant of the ventricular wall of the brain or of the central channel 5 of the spinal cord of a subject.

b) enzymatic digestion of said explant in the presence of at least one proteolytic enzyme and a calcium chelator,

c) washing the explant resulting from the digestion of stage b) with a cell culture medium. Y

D) purification of the ependymal cells detached from the medium resulting from the previous stage, in a basic cell culture medium.

2. A method according to claim 1, comprising incubation of the explant resulting from step c) in the presence of at least one enzyme capable of digesting DNA.

3. A method according to claim 2, wherein said enzyme capable of digesting ONA is ONAse 1.

4. Four.: Un procedimiento según la reivindicación 2, en que dicha enzima capaz de digerir DNA es la DNAsa 11. A method according to claim 2, wherein said enzyme capable of digesting DNA is DNAse 11.

5. 5.: Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que dicha A method according to any one of claims 1 to 4, wherein said

Proteolytic enzyme and said calcium chelator of stage b) are added in stage al.

6. A method according to any one of claims 1 to 5, wherein said enzymatic digestion of step b) is performed in the presence of a cocktail of proteolytic enzymes and at least one calcium chelator.

: 25 7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en que dicha incubación en frio de la etapa a) se realiza al menos durante 10 mino A method according to any one of claims 1 to 6, wherein said cold incubation of step a) is carried out for at least 10 min.

8. 8.: Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en que dicha digestión enzimática de la etapa b) se realiza al menos durante 20 min o A method according to any one of claims 1 to 7, wherein said enzymatic digestion of step b) is carried out for at least 20 min or

9. 9.: Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en que dicho medio de cultivo celular de la etapa c) es un medio básico. A method according to any one of claims 1 to 8, wherein said cell culture medium of step c) is a basic medium.

: 5 10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en que dicha purificación de la etapa d) comprende el mantenimiento de las células ependimarias en dicho medio básico durante 48 h. A method according to any one of claims 1 to 9, wherein said purification of step d) comprises maintaining the ependymal cells in said basic medium for 48 h.

Application No. F. Effect FEP P201 13 1556 07/30/2013 01108/2013

11. A method according to any one of claims 1 to 10, wherein said basic cell culture medium is aMEM-Glucose.

A method according to any one of claims 1 to 11, wherein said basic cell culture medium of step d) comprises a non-ionic surfactant.

13. A method according to any of claims 1 to 12, wherein said purification of step d) is carried out at a cell density of less than 2 cells / micro liter.

14. A method according to claim 12, wherein said purification of step d) is carried out at a cell density of 1 cell / microliter.

15. A method according to any of the preceding claims, wherein said subject is a vertebrate.

16. A method according to claim 15, wherein said vertebrate is a mammal.

17. 17.: Un procedimiento según la reivindicación 16, en que dicho mamífero es un roedor. A method according to claim 16, wherein said mammal is a rodent.

18. 18.: Cultivo puro de células ependimarias obtenido mediante un procedimiento conforme cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 17. Pure culture of ependymal cells obtained by a method according to any one of the preceding claims 1 to 17.

19. 19.: Uso de un cultivo segun la reivindicación 18 en biomedicina. Use of a culture according to claim 18 in biomedicine.

20. Use of a culture according to claim 18 in pharmacology.