ES2415516B2 - Quimera multicomponente para su uso como vacuna frente a la infeccion por leishmania spp. en mamiferos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con una quimera multicomponente, HISA70, que comprende 6 genes procedentes de Leishmania infantum: H2A, H2B, H3, H4, A2 y HSP70. Así mismo, se relaciona con una composición inmunogénica que comprende dicha quimera multicomponente y con el uso de dicha composición en la elaboración de una vacuna frente a Leishmania spp., para conferir protección frente a la leishmaniosis, incluidas la leishmaniosis cutánea y la leishmaniosis visceral, a mamíferos.

Description

Quimera multicomponente para su uso como vacuna frente a la infección por

Leishmania spp. en mamíferos

CAMPO T~CNICO

La presenle invención se encuadra dentro del campo de la Sanidad Animal.

De forma más concreta, la invención se refiere a una construcción genética,

denominada HISA70, que contiene 6 genes que codifican 6 antígenos de

Leishmania infanlum implicados en la aparición de los síntomas clfnicos de la

leishmaniosis, y al empleo de dicha construcción en la elaboración de una

vacuna para su uso frente a la infección por Leishmania spp.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las leishmaniosis constituyen un grupo de enfermedades con distribución mundial y causadas por parásilos protozoos intracelulares del género

Leishmania, que son transmitidos por un insecto vector conocido como

flebótomo. Esta enfermedad presenta cuadros cHnicos y epidemiológicos diversos. Según datos procedentes de la OMS, la prevalencia de la enfermedad es de 12 millones de casos y actualmente amenaza a 350 míllones de personas en 88 países diferentes (hllp://www.who.inVtopics/leishmaniasis/en/index.hlmll.principalmente en países subdesarrollados de zonas tropicales y sublropicales (Sudán, India, Bangladesh, Nepal y Brasil), pero también en el área mediterránea (700 casos al año en el sur de Europa). Atendiendo a los síntomas clínicos de la enfermedad, las leishmaniosis han sido clasificadas en varios tipos: leishmaniosis visceral (LV) Y el resto de leishmaniosis con manifestaciones cutáneas: leishmaniosis cutánea (Le), cutáneo-difusa (LCD) y muco-cutánea (LMC o espundia). Leishmania infanlum es el principal agente causal de la LV en la región Mediterránea donde, además, el perro doméstico está considerado como el principal reservorio, jugando un papel clave en la transmisión del parásito a seres humanos. Por otro lado, L. major es una de

las especies con mayor repercusión en el Viejo Mundo causando Le

(Gramiccia M., Gradoni L. , The current status of zoonotic leishmaniases and approaches to disease control. Int J Parasitol. 2005. 35: 1169-1180).

En la actualidad, no existe ningún método profiláctico completamente eficaz contra la leishmaniosis. El tratamiento quimioterapéutico, en concreto la terapia con compuestos antimoniales pentavalentes (Glucantime® y Pentostam®) que interfieren con las rutas metabólicas del parásito, es la más ampliamente utilizada por su capacidad de acelerar la curación, disminuir el tamaño de las cicatrices y prevenir posibles recaldas en pacientes con LC. En

el caso de la LV, la terapia antimonial alcanza una tasa de curación clínica del 90%. Pero el uso de compuestos antimoniales no está exento de efectos

secundarios. La anfotericina B ha demostrado que tiene una alta eficacia, y

sus efectos adversos pueden evitarse mediante su administración en

liposomas, sin embargo su elevado coste limita su empleo en paises en desarrollo.

Por otro lado, existen evidencias cllnicas y experimentales que demuestran que la vacunación puede prevenir la leishmaniosis. De hecho, en los últimos años, los esfuerzos de los laboratorios se centran en la búsqueda de nuevos

antígenos y adyuvantes, vacunas vivas-atenuadas, antígenos recombinantes

en forma de proteina o en forma de ONA, bacterias que expresan antlgenos leishmaniales y estrategias vacuna les con células dendríticas (CO). Entre los antlgenos que se han ensayado se encuentran: la proteína A2 especifica de amastigote, la esterol-24-c-metiltransferasa (SMT), varías histonas, la proteína ribosomal PO, la proteína inducible por estrés LmSTI1 y la proteína homóloga al receptor de la kinasa C activada de mamíferos (LACK) (de Oliveira C.I., Nascimento I.P., Barral A. , Soto M., Barral-Netto M., Challenges and perspectives in vaccination against leishmaniasis, Parasitol Int. 2009.

58:319-324). En referencia a la leishmaniosis canina, en Brasil se ha empezado a comercializar una vacuna, Leishmune®, compuesta por el

ligando Fucosa-Manosa que es administrado en presencia o ausencia del

adyuvante QuilA (W02006122382A2). También en Brasil, ya registrada, se

encuentra otra vacuna, LeishTeC®, compuesta por el antígeno recombinante

A2 procedente de L. donovani (W02009089605A1). Sin embargo, en el caso de las vacunas desarrolladas en Brasil, no superan el 43-75% de protección

5 y, además, los mecanismos inmunológicos todavia no se conocen en detalle. Finalmente, cabe destacar otra vacuna (CaniLesh) compuesta por anligenos secretados y excretados de promastigotes de L. infanfum (ES2260440T3), cuya comercialización ha sido autorizada por la Comisión Europea en toda la Unión Europea el 14 de marzo de 2011.

De hecho, el desarrollo de vacunas frente a enfermedades parasitarias, no

sólo frente a leishmaniosis, tiene que superar grandes obstáculos debido a

distintos motivos. Entre ellos, se pueden mencionar los siguientes: se trata de

infecciones que tienden a convertirse en crónicas dependiendo del estado

15 inmunitario del hospedador y de la especie de parásito implicada; los

parásitos despliegan una enorme variedad de mecanismos de evasión de la

respuesta inmunológica; y la localización intracelular del parásito muchas veces dificulta el grado de efectividad de las respuestas efectoras por parte del hospedador.

20 Existe, por tanto, la necesidad de seguir trabajando en el desarrollo de nuevas estrategias de vacunación enfocadas hacia el ámbito mediterráneo de distribución de L. infanfum. Se trata de inducir un equilibrio adecuado entre las respuestas inmunitarias Leishmania-específicas de tipo celular y humoral,

asi como la generación de células de memoria efectivas frente a posibles

25 reinfecciones. Entre las diversas metodologías de ínmunización, la vacunación genética (vacunas de tercera generación) es una de la más eficientes. Es capaz de inducir la síntesis de la proteina que codifica y de generar una respuesta inmunitaria especifica en el hospedador de larga duración y, además, no genera reacciones adversas en el sitio de inoculación,

30 a diferencia de las administraciones proteicas. Otra alternativa de gran interés que se ha empezado a analizar recientemente es la vacunación basada en CD para inducir respuestas inmunitarias protectivas frente a leishmaniosis.

Muchas de estas estrategias se basan en la transferencia adoptiva en ratones

BALB/c de CD cargadas con antigenos leishmaniales. Otra alternativa que ha

demostrado su eficacia es el empleo de diversos vehículos vacunales

recombinantes de carácter atenuado o no patogénico en seres humanos; por 5 ejemplo, Salmonefla atenuada frente a LC o una especie recombinante de

Le;shman;a no patogénica en seres humanos en la que se había integrado el

antígeno A2 de L. donovani (Costa CH, Peters NC, Maruyama SR, de Brito EC Jr,Santos IK. Vaccines for the leishmaniases: proposals for a research agenda. PLoS Negl Trap Dis. 2011 Mar 29;5(3):e943.).

En el proceso de infección, diversos componentes parasitarios de Leishmania pueden desencadenar una respuesta inmunológica como determinantes de

superficie o como determinantes intracelulares. Los primeros consiguen ser

invisibles para el sistema inmunológico del hospedador para establecer la 15 infección. Los determinantes intracelulares, inicialmente, tampoco son visibles para el sistema inmunitario, y asi, logran entrar en el hospedador, sin

embargo, quedan expuestos en el momento en el que se produce la lisis de

los parásitos. Estos determinantes están muy conservados a lo largo de la evolución y contienen epitopos especlficos de células T y células B. Su

20 localización intracelular les hace inaccesibles a los anticuerpos producidos y, además, generan un fenotipo virulento causante de patologla, por lo que se denominan "patoantígenos" (Chan9 KP, Reed SG, McGwire BS, Soon9 L. Leishmania model for microbial virulence: the relevance of parasite multiplication and pathoantigenicily. Acta Trop. 2003 Mar;85(3):375-90.)

Existe una necesidad urgente de desarrollar estrategias de vacunación

genética o bien empleando CD o usando bacterias vivas atenuadas como

vehlculo vacunal, que se constituyan como herramientas potenciales de primer orden en la lucha contra las diferentes formas de leishmaniosis.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La invención se enfrenta con el problema de desarrollar nuevos elementos y

estrategias con los que elaborar vacunas capaces de conferir protección

frente a la infección causada por Leishmania spp.

La solución proporcionada por esta invención se basa en una quimera,

HISA70, que se puede insertar en un plásmido de expresión eucariota o en

un plásmido de expresión procariota, y cuya administración confiere

protección frente a una posterior infección con Leishmania spp. En

experimentos realizados con ratones inmunizados con esta quimera, tras una

infección con L. major, causante de le, los animales desarrollan la capacidad de controlar la aparición de las lesiones en el punto de infección (almohadilla

plantar), mantienen una baja carga parasitaria en nódulo linfático poplíteo e

impiden la visceralización parasitaria. Este último hecho es de una gran

relevancia considerando la extrapolación de su capacidad protectiva frente a

la forma visceral de leishmaniosis, donde los órganos diana son bazo, hígado y médula ósea. De hecho, otros ensayos llevados a cabo en ratones vacunados de la misma forma pero infectados con L. infantum, responsable de l V, muestran cómo la mitad de los animales son capaces de reducir la carga parasitaria visceral (tanto en higado como en bazo).

En la presente invención, se entiende por "quimera multicomponente" una

molécula recombinante de ADN que comprende la fusión de distintos genes que codifican los patoantígenos de interés. En el mismo sentido, la expresión de dicha molécula recombinante da lugar a lo que, en la presente invención, se denomina "proteina quimérica". Por "genes en fase" se entiende la disposición de los genes de manera que se garantiza la continuidad en la fase de lectura de la secuencia genética lo que garantiza, a su vez, su

funcionalidad, es decir la traducción proteica esperada.

30 Un aspecto de la presente invención se refiere, por lo tanto, a una quimera

multicomponente, que hemos denominado HISA70, que comprende la fusión en fase de los genes procedentes de L. infantum que codifican 6

patoantígenos implicados en el fenotipo de virulencia parasitaria y, como consecuencia, en la aparición de los síntomas clínicos de la leishmaniosis. En concreto, la quimera multicomponente HISA70, comprende los genes que

codifican las proteínas histonas nucleosomales (H2A, H2B, H3, H4), el antígeno A2 y la proteina de choque térmico HSP70, procedentes de L. infantum, tal y como se describen en SEQ ID NO: 1. La invención también se

refiere a un plásmido, de expresión eucariota o de expresión procariota, en el

que se inserta HISA70 para vehiculizarla. En este sentido, si es necesario, se

incluyen el los extremos de la quimera multicomponente secuencias diana de

las enzimas de restricción que faciliten el clonaje de dicha quimera en el

vector seleccionado.

En otra realización de la invención, la quimera multicomponente comprende una secuencia con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO:1 de, al menos, el 75%, entendiéndose por porcentaje de identidad de la secuencia el

porcentaje de coincidencias de los mismos nucleótidos entre dos secuencias

alineadas, a lo largo de toda la longitud de ambas secuencias.

A lo largo de la secuencia de la quimera multicomponente, se pueden introducir tripletes nucleotídicos que codifiquen glicinas, para dar más flexibilidad estructural a la proteína resultante de la expresión de la quimera. En comparación con cualquier otro aminoácido, la glicina tiene la estructura más sencilla (gracias a su grupoRlcadena lateral apolar alifática de carácter hidrofóbico que se une a los grupos -NH2 y -COOH, repectivamente) que impone el mlnimo impedimento esté rico, por lo que resulta el aminoácido de elección para conseguir este efecto. Pueden introducirse entre 1 y 7 tripletes nucleotídicos que codifican glicinas, colocándolos al inicio y/o al final de la

quimera multicomponente y/o al inicio de cada uno de los genes que la

componen de tal modo que, en la proteína quimérica resultante, las glicinas

30 se localizarán al principio y/o al final de la proteina quimérica, y/o al inicio del péptido resultante de la traducción de cada gen.

La invención también se refiere a una composición inmunogénica que comprende una quimera multicomponente según se describe en esta memoria descriptiva, o bien un plásmido de expresión eucariota o de expresión procariota que contiene una quimera multicomponente según se describe en esta memoria descriptiva.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición inmunogénica que

comprende la proteína químéríca HISA70, caracterizada por SEO ID NO: 2, o bien una proteína con un porcentaje de identidad con SEO ID NO: 2 de, al

menos, el 85%, para su uso en la elaboración de una vacuna frente a

Leishmania spp. Se entiende por porcentaje de identidad de la secuencia

aminoacídica el porcentaje de coincidencias de los mismos aminoácidos entre

las dos secuencias alineadas, a lo largo de la longitud completa de ambas

secuencias.

En este sentido, la vacuna elaborada con cualquiera de las composiciones inmunogénicas de la invención se emplea en la protección de mamíferos, más concretamente de perros y seres humanos, frente a cualquiera de las

formas de leishmaniosis (cutánea O visceral).

Una ventaja de la invención es el carácter antigénico y de alta especificidad de cada uno de sus componentes (herramienta de gran valor diagnóstico), de manera que los anticuerpos específicos generados están dirigidos hacia los determinantes antigénicos de las regiones divergentes de las histonas nUcleosomales, del factor de virulencia A2, y de la protelna HSP70 del parásito, evitando de esta manera una reactividad cruzada con microorganismos causantes de otras enfermedades, así como procesos de autoinmunidad.

DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS Para facilitar la comprensión de las principales características de la invención y formando parte integrante de esta memoria descriptiva, se acompaña una

serie de figuras. Con carácter ilustrativo se ha representado lo siguiente:

5 Figura 1. Representación esquemática de la quimera multicomponente

HISA70, con indicación de las secuencias diana de las enzimas de inserción

utilizadas para el clonaje descrito en el Ejemplo 1, Y de los tripletes que codifican glicinas introducidos a lo largo de la secuencia, según el Ejemplo 1.

10 Figura 2. Progresión de la lesión plantar en los 3 grupos de ratones tras la infección con L. majar (Fig. 2A). Aspecto de las lesiones después de 7 semanas de infección (Fig. 2B). Los asteriscos indican la existencia de diferencias significativas con respecto a los grupos control (PBS y plásmido vacio) (p < 0.05).

15 Figura 3. Carga parasitaria en nódulo linfático poplíteo ( 0 ) y en bazo (e) después de 7 semanas de infección con L. majar. Los valores promedia se representan con un trazo horizontal. Los asteriscos indican la existencia de diferencias significativas con respecto a los grupos control (PBS y plásmido 20 vaclo) (p < 0.05).

Figura 4. Actividad arginasa (mU) en la lesión plantar a las 7 semanas de infección con L. majar. Los valores promedio se representan con un trazo horizontal. Los asteriscos indican la existencia de diferencias significativas

25 con respecto a los grupos control (PBS y plásmido vacío) (p < 0.05).

Figura 5. Título humoral anti-Leishmania a las 7 semanas de infección con L. majar. Isotipos IgGl []) e IgG2a (11). Los asteriscos indican la existencia de diferencias significativas con respecto a los grupos control (PBS y plásmido

30 vaclo) (p < 0.05).

Figura 6. Carga parasitaria en bazo (O ), en hígado (. ), y sus respectivas medias estadísticas (-) a las 8 semanas de infección con L. infantum.

MODO DE REALIZACiÓN DE LA INVENCiÓN.

Habiendo descrito la presente invención, se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1. Clonaje de los genes. Las secuencias codificantes de H2A, H2B, H3, H4, A2 Y HSP70 de L. infanlum se obtuvieron de las bases de datos de secuencias del GeneDB y del GenBank con los siguientes números de acceso: H2A (Un J21.v3.1160), H2B (Un.J09.v3.1410), H3 (UnJl0.v3.0920), H4 (Un J31.v3.3320), A2 (GenBank S69693) y HSP70 (GenBank CAA69282.1). Las correspondientes regiones codificantes fueron optimizadas para la expresión en células de ratón empleando el GeneOptimizer® expert software system (Geneart AG). Se eliminaron los codones de stop de los genes situados en la primera posición y en las posiciones intermedias de la quimera, y se introdujeron varios tripletes nucleotidicos codificantes glicinas: al comienzo de H2A, de H3 y de A2, y al final de HSP70, justo delante del codón de stop de la quimera multicomponente (Fig. 1). Finalmente, las secuencias fueron sintetizadas quimicamente por GeneArt (http://www.geneart.com) dando lugar a H/SA70, caracterizada por SEO ID NO: 1, que codifica la quimera multicomponente HISA70, caracterizada por SEO ID NO: 2. Además, se incluyeron los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción Xhol y Nofi para posibilitar las posteriores construcciones plasmidicas. La secuencia HISA70 se incluyó en un plásmido de expresión eucariota modelo, que en este ejemplo fue pCMVpm2A.

Ejemplo 2. Análisis de la capacidad protectiva de HISA70. La capacidad protectiva de HISA70 se ensayó en grupos de ratones hembra BALB/c de 8 semanas de edad (n =6) que fueron inmunizados tres veces, en intervalos de 2 semanas, por via subcutánea en la almohadilla plantar izquierda, con 100 ~g del plásmido de expresión eucariota utilizado para el clonaje en el ejemplo 1 como control (pControl o control plasmidico) o con la quimera

clonada en el plásmido de expresión eucariota (pHISA70). Otro grupo control fue inoculado con PBS siguiendo el mismo esquema. Después de 4 semanas

desde la última inmunización, todos los grupos fueron infectados en la

almohadilla plantar derecha con 1 x 10' promastigotes metaclclicos de 5 L. majar (clan V1 : MHOM/IU80/Friedlin). Las formas metacíclicas, infectivas,

fueron previamente aisladas a partir de cultivos parasitarios en fase

estacionaria empleando aglutinina de cacahuete PNA (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Siguiendo la normativa ética vigente relativa a animales de

experimentación, en el momento en el que aparecieron lesiones plantares

10 necrosadas (a la 7' semana de infección) en los animales no protegidos, todos los grupos fueron eutanasiados. En el momento del sacrificio, se

obtuvieron sueros, nódulos linfáticos poplíteos y bazos con el fin de realizar

los cultivos parasitarios y las correspondientes determinaciones

inmunológicas. Todos los ensayos con ratones siguieron las condiciones

15 convencionales aprobadas por el comité ético de experimentación animal de la Universidad Complutense de Madrid.

Ejemplo 3: Evaluación de la capacidad para controlar la aparición de la lesión cutánea. Con el fin de evaluar la capacidad que confiere la vacuna 20 sobre el control de la inflamación plantar en el punto de infección, se hizo una monitorización semanal de la misma. Para ello, se midió con un calibre el grado de inflamación en la almohadilla plantar infectada (izquierda) comparada con la almohadilla plantar sin infectar (derecha). También se evaluaron los signos clínicos de ulceración. En la figura 2A se representa el

25 tamaño de la inflamación plantar a lo largo de las 7 semanas postinfección y se puede observar que los ratones vacunados con pHISA70 no presentaron lesiones, o fueron de muy pequeño tamaño, y, además, no desarrollaron ulceraciones (Fig. 2B) después de 7 semanas de infección, a diferencia de los grupos control (PBS y peontrol).

Ejemplo 4: Valoración de la capacidad de controlar la carga parasitaria

tras una infección con L. major. En el momento del sacrmcio, se obtuvieron

los nódulos linfáticos popllteos, drenantes al punto de infección, y los bazos de todos los ratones con el fin de realizar los cultivos parasitarios en medio Schneider (Gibco, BRL) suplementado con 20% (v/v) de FCS inactivado, estreptomicina 0,1 mg/ml y penicilina 100 U/ml. Este medio fue empleado 5 tanto para el cultivo de los parásitos de Leishmania major hasta su fase estacionaria (2 x 107 parásitos/mi) como para la diferenciación de amastigotes a promastigotes, a 26°C en ambos casos, para determinar la carga parasitaria mediante dilución límite. Para ello se preparó una suspensión celular mediante el macerado de los órganos en 1 mi de medio Schneider. 10 Posteriormente, se realizaron diluciones seriadas 1:4 de la suspensión de tejido homogeneizado en una placa de 96 pocillos y fueron incubadas a 26°C

durante 10 días. Los pocillos fueron examinados para detectar promastigotes.

El número total de parásitos por tejido se calculó a partir del reciproco de la dilución más alta donde se detectaron promastigotes, teniendo en cuenta el

15 peso del órgano completo. En la figura 3 se observa una reducción significativa de la carga parasitaria en nódulo linfático poplíteo y una ausencia de visceralización parasitaria esplénica en los ratones vacunados con pHISA70, a diferencia de los dos grupos control.

20 Ejemplo 5: Determinación de la resistencia inmunitaria de los ratones

mediada por la actividad arginasa en el punto de infección. Como ya se

ha descrito (Iniesta V., Gomez-Nieto L.C., Corraliza l., The inhibition of arginase by N(omega)-hydroxy-I-arginine controls the growth of Leishmania inside macrophages, J Exp Med. 2001. 193:777-784), existe una asociación 25 entre la multiplicación de los parásitos de Leishmania dentro de las células fagociticas infectadas y la actividad arginasa generada en dichas células. La

arginasa es una enzima implicada en la slntesis de poliaminas, nutrientes

esenciales para la proliferación parasitaria. Por tanto, se analizó la actividad

arginasa en las suspensiones celulares resultantes de la maceración de las

30 secciones de las almohadillas plantares de los ratones del ejemplo 2, para determinar el nivel de multiplicación de Leishmania. Se usó el siguiente método: para lisar las membranas celulares se añadió a cada muestra 50 ~I de Tritón X-100 (0,1% v/ven agua), se agitó y se añadieron 50 ~I de Tris-HCI 200 mM pH 7,4. En los lisados se añadieron 5 (JI de MnCI, 1 M (coenzima de la arginasa) y se incubó a 56°C durante 10 mino Luego se añadieron 25 ~I de arginina 0,5 M, pH 9,7 (sustrato de la arginasa) seguido de incubación a 37°C durante 1 h. En paralelo, se hizo una curva patrón usando cantidades crecientes (1,5-30 ~g) de urea. Posteriormente, se añadieron 400 ~I de una mezcla ácida compuesta por H,SO, 18 M, H,PO, 14,7 M Y H,O (en relación

1: 3: 7). Para cuantificar la urea formada se añadieron 25 ~I de isonitropropiofenona (ISPF 3% en etanol absoluto). Las muestras se hirvieron a 99°C durante 30 mino Finalmente, las muestras se trasladaron a placas de fondo plano de 96 pocillos (Nunc) en duplicados de 200 ~I Y se midió su

absorbancia en el correspondiente lector a 540 nrn. En la figura 4 se muestra

cómo los ratones protegidos pertenecientes al grupo de vacunación con pHISA70 fueron los únicos que tenían unos niveles significativamente bajos de actividad arginasa en el sitio de infección, que se correlacionan con una

menor carga parasitaria en comparación a los grupos control.

Ejemplo 6: Respuesta humoral parásito especifica. Estudios previos de LC en el modelo murino han demostrado que la producción relativa de anticuerpos IgG1 e IgG2a está correlacionada con la inducción de las respuestas Th2-susceptibilidad y Th1-resistencia a Leishmania, respectivamente (Scol! P. The role of TH1 and TH2 cells in experimental cutaneous leishmaniosis. Exp Parasitol. (1989) 68: 369-372). En este contexto, se realizó la detección, en los sueros de los ratones inmunizados con pHISA70 y de los dos grupos control a las 7 semanas postinfección, de anticuerpos Leishmania-especificos mediante ELlSA. Se tapizaron placas de tipo estándar con el antígeno soluble de Leishmania (SLA: 2 ~g/ml) durante 16 h a 4°C en PBS. Todos los periodos de incubación se hicieron en condiciones de agitación a temperatura ambiente. Se realizó una dilución seriada de los sueros para determinar el titulo de anticuerpos, que fue definido como el inverso del factor de la dilución de suero más alta con una absorbancia > 0.2. Como anticuerpos secundarios se emplearon los isotipos

IgGl e IgG2a anti-ratón de cabra con peroxidasa (Nordic Immunology, Tilburg, Holanda) diluidos 1/1000. Después de 1 h de incubación, las placas

fueron lavadas y reveladas añadiendo el sustrato de la peroxidasa (ABTS,

Rache Diagnostics, Spain) y midiendo en el correspondiente lector de placas a 405 nm. Los ratones protegidos que habian sido vacunados con pHISA70 produjeron un bajo titulo humoral Leishmania-especifico, de tipo mixto: IgGl e IgG2a (Fig.5), en comparación con el elevado titulo de IgGl parasito

específico que presentan los grupos control. En su conjunto, estos datos

muestran la capacidad de la vacuna para cambiar en el hospedador un perfil Th2 de susceptibilidad a Leishmania a un equilibrio inmunitario de tipo mixto orientado a un perfil Thl de resistencia frente a la infección por L. majar. Lo que significa que pHISA70 suscita la capacidad de controlar la infección en los ratones vacunados.

Ejemplo 7: Valoración de la capacidad de controlar la carga parasitaria tras una infección con L. infantum. La inmunización de los animales se

realizó tal y como se describe en el ejemplo 2 pero utilizando L. intan/um en

vez de L majaren la infección. En el momento del sacrificio, se obtuvieron los

bazos y los higados de todos los ratones con el fin de realizar los cultivos parasitarios en medio Schneider (Gibco, BRL) suplementado con 20% (v/v) de FCS inactivado, estreptomicina 0,1 mg/ml y penicilina 100 Ulml. Este medio fue empleado tanto para el cultivo de los parásitos de Leishmania intan/um hasta su fase estacionaria (2 x 107 parásitos/ml) como para la diferenciación de amastigotes a promastigotes, a 26°C en ambos casos, para determinar la carga parasitaria mediante dilución límite. Para ello se preparó una suspensión celular mediante el macerado de los órganos en lml de

medio Schneider. Posteriormente, se realizaron diluciones seriadas 1:4 de la

suspensión de tejido homogeneizado en una placa de 96 pocillos y fueron incubadas a 26°C durante 10 días. Los pocillos fueron examinados para detectar promastigotes. El número total de parásitos por tejido se calculó a partir del recíproco de la dilución más alta donde se detectaron promastigotes, teniendo en cuenta el peso del órgano completo. En la figura 6

se observa una reducción significativa de las cargas parasitarias en el bazo y en el hígado de los ratones vacunados can pHISA70, a diferencia de los dos grupos control.

TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS

El texto libre utilizado en la lista de secuencias se corresponde en espanal a

las siguientes caracterlsticas:

SEO ID NO: 1 Secuencia artificial de ADN; construcción genética que comprende los genes H2A, H2B, H3, H4, A2 Y HSP70 de L. infantum. Nucleótidos del 7 al 402: gen H2A de L. infantum sin codón de stop. Nucleótidos del 403 al 735: gen H2B de L. infantum sin codón de stop. Nucleótidos del 736 al 1125: gen H3 de L. infantum sin codón de stop. Nucleótidos del 1126 a11425: gen H4 de L. infantum sin codón de stop. Nucleótidos del 1426 al 2133: gen A2 de L. infantum sin codón de stop. Nucleótidos del 2134 al 4095: gen HSP70 de L. infantum. Nucleótidos de 1 al 6: sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xhol. Nucleótidos de 4096 al 4103: sitio de reconocimiento de la enzima de

restricción Notl.

SEO ID NO: 2 Secuencia artificial, protelna: nucleótidos del 7 al 4095 de SEO ID NO: 1 REIVINDICACIONES

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Quimera multicomponente que comprende una secuencia con, al menos,

   un 75% de identidad con SEO ID NO: 1.
2. 2. Quimera multicomponente según la reivindicación 1 en que la secuencia es

   SEO ID NO: 1.
3. 3. Ouimera multicomponente según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en

   que los genes comprendidos en la secuencia están en fase.
4. 4. Ouimera multicomponente según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en

   que los genes proceden de Leishmania spp.
5. 5. Quimera multicomponente según la reivindicación 4 en que los genes

   proceden de Leishmania infanlum.
6. 6. Ouimera multicomponente según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que incluye entre 1 y 7 tripletes que codifican glicina, localizados al principio y/o al final de la quimera, y/o al inicio de cada gen.
7. 7. Quimera multicomponente según la reivindicación 6 en que el número de

   tripletes que codifican glicina que se incluyen es de 4.
8. 8. Plásmido de expresión eucariota o de expresión procariota que comprende

   la quimera de las reivindicaciones 1-7.
9. 9. Proteina quimérica que comprende una secuencia con, al menos, un 85% de identidad con SEO ID NO: 2.
10. 10. Proteina quimérica según la reivindicación 9 en que la secuencia es SEO

    IDNO: 2.
11. 11 . Proteína quimérica según la reivindicación 10 que incluye entre 1 y 7

    glicinas al principio y/o al final de la proteína quimérica, y/o al inicio del

    péptido resultante de la traducción de cada gen.
12. 12. Composición inmunogénica que comprende la quimera de las

    reivindicaciones 1-7 o el plásmido de la reivindicación 8 o la proteína quimérica de las reivindicaciones 9-11.

    10 13. Uso de la composición inmunogénica de la reivindicación 12 en la elaboración de una vacuna para su administración a un mamífero para conferirle protección frente a enfermedades causadas por Leishmania spp.
13. 14. Uso según la reivindicación 13 en que la especie de Leishmania es

    15 L. infantum o L. major.
14. 15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13-14 en que la enfermedad

    causada por Leishmania es leishmaniosis visceral o leishmaniosis cutánea.

    20 16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 en que el mamifero es el perro o el hombre.