ES2941288B2

ES2941288B2 - Peribacillus aracenensis bbb004 estimulante del metabolismo adaptativo de plantas frente a estres hidrico, mejoradora de la nutricion vegetal y del contenido de polifenoles

Info

Publication number: ES2941288B2
Application number: ES202231072A
Authority: ES
Inventors: Albanchez Enrique Gutierrez; Trueba Ignacio Horche; Garcia Jose Antonio Lucas; Solano Beatriz Ramos; Manero Francisco Javier Gutierrez; Velasco Ana Garcia-Villaraco
Original assignee: Biobab R&D SL
Current assignee: Biobab R&D SL
Priority date: 2022-12-15
Filing date: 2022-12-15
Publication date: 2025-01-31
Anticipated expiration: 2042-12-15
Also published as: IL321868A; EP4636073A1; CN121605182A; AU2023395081A1; PY23102923A; CL2025001740A1; WO2024126879A1; WO2024126879A8; WO2024126879A9; ES2941288A1; MX2025006773A

Description

DESCRIPCIÓN

Peribacillus aracenensisBBB004 estimulante del metabolismo adaptativo de plantas frente a estrés hídrico, mejoradora de la nutrición vegetal y del contenido de polifenoles

La presente invención se refiere a una cepa dePeribacillus aracenensis(BBB004, código interno del laboratorio), como nueva especie del generoPeribacillus, para su uso en el tratamiento de plantas con el objeto de mejorar la producción en condiciones de estrés hídrico, aumentando la fijación de CO2y la transpiración, optimizando la captación de energía mediante fotosíntesis y disminuyendo el estrés oxidativo, con el consiguiente aumento del crecimiento y la producción. Además, es capaz de estimular la absorción de diversos nutrientes e incrementar el contenido en polifenoles, tanto en condiciones normales como en dichas condiciones de estrés, por lo que también resulta de interés como biofertilizante para agricultura ecológica y convencional, y para incrementar el contenido en polifenoles en especies vegetales de interés farmacológico y alimentario, para mejorar la calidad y perdurabilidad de los alimentos.

Esta cepa ha sido depositada con fines de patente en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con fecha 27 de junio de 2022, donde se le ha asignado el número de depósito 30655. La CECT tiene su sede en el edificio de investigación de la Universidad de Valencia, sito en el campus de Burjassot (DP 46100 - Valencia, España).

CAMPO DE APLICACIÓN. -

La invención se encuadra dentro de los campos de la biotecnología agroalimentaria, concretamente dentro de las bacterias reguladoras del crecimiento vegetal, ya que la cepa bacteriana puede servir de base para la preparación de diferentes tipos de productos destinados al aumento de la producción en condiciones de estrés hídrico, sobre todo por falta de agua o estrés osmótico, mejorando la adaptación al estrés sostenido o puntual, aumentando la fijación de CO2, optimizando la captación de energía mediante fotosíntesis y disminuyendo el estrés oxidativo. Estos productos mejorarán la adaptación de las plantas a distintas condiciones de estrés abiótico como pueden ser el déficit hídrico o el exceso de salinidad edáfica, mejorando la producción en condiciones de bajo aporte hídrico.

También se encuadra dentro del campo de los biofertilizantes orgánicos, ya que la cepa puede utilizarse para mejorar la nutrición de la planta en general tanto en cualquier formulado bacteriano como con metabolitos bacterianos obtenidos en determinadas condiciones.

ESTADO DE LA TÉCNICA.-

Las plantas disponen de diversos mecanismos para adaptarse a situaciones de estrés hídrico y salinidad.

La fotosíntesis es un proceso fisiológico que consiste en transformar la energía de la luz en energía química según la siguiente ecuación: H2O+CO2+ E (Av) para producir C6H12O6+ O2, donde el agua se absorbe por las raíces y el CO2por las hojas. Se desarrolla en dos grandes etapas, i) la absorción de la energía de la luz y su transformación en energía química (ATP y NADPH), y ii) su posterior uso para fijación del CO2, que se utiliza para construir los esqueletos carbonados orgánicos. Es un proceso que requiere de los pigmentos fotosintéticos para la captación de energía y que genera un gran estrés oxidativo (radicales libres- ROS). La planta dispone de sistemas de eliminación de radicales libres para mantenerlos en límites fisiológicos, ya que, a su vez, determinados radicales libres, como el H2O2, son señales fisiológicas necesarias para el buen funcionamiento de la planta, para todo este proceso es absolutamente fundamental una adecuada disponibilidad de agua y una buena hidratación de la planta de. La captación de CO2a través de estomas, es vital para el buen funcionamiento de la fotosíntesis, lo que genera un problema en contradicción con los requerimientos establecidos para una buena fotosíntesis puesto que es la vía de salida del agua (transpiración), proceso que se acelera en condiciones adversas de temperatura y humedad.

De esta manera, la planta necesita estar hidratada; el parámetro que define el estado hídrico de la planta es el potencial hídrico que en resumen expone el balance entre el contenido en agua (potencial de presión) y solutos (potencial osmótico). Para ello, es capaz de generar un potencial osmótico negativo con respecto al suelo, de tal forma que el agua entra arrastrada por los solutos (iones) que se absorben del suelo; estos iones se acumulan en las vacuolas, forzando a su vez la entrada de agua en la vacuola, lo que mantiene un reservorio de agua y la planta turgente. La absorción de nutrientes ocurre a través de bombas específicas y una vez absorbidos se acumulan en vacuolas y/o se translocan a la parte aérea gracias a la corriente de transpiración, y allí se incorporan a esqueletos orgánicos. Por lo tanto, la nutrición mineral requiere de pérdida de agua por transpiración.

El estrés hídrico puede deberse a falta de agua (sequía) o a exceso de sales (salinidad). Cuando se debe a falta de agua, la planta aumenta la síntesis de solutos compatibles (moléculas orgánicas) para generar el potencial osmótico negativo y mantenerse hidratada, manteniendo estomas abiertos más tiempo; si la situación de sequía es muy acusada, los cierra. Cuando las plantas se encuentran en suelos salinos, tienden a acumular iones Na+, que, en elevadas concentraciones, son tóxicos para la planta. Uno de los mecanismos de adaptación es bombear los iones Na+ al exterior para evitar su acumulación. Esta respuesta implica la generación de ROS, que activa la respuesta hormonal de estrés (activación de síntesis de proteínas específicas e incremento de Etileno (Et), Jasmónico (JA) y Ácido abscísico (ABA); el ABA es responsable del cierre de estomas.

Así, la planta debe mantener un equilibrio entre la apertura y cierre de estomas, para permitir el intercambio de CO2y agua, priorizando el cierre de estomas cuando el agua es limitante. Además del cierre de estomas, la planta, como ya se ha comentado antes, también dispone de mecanismos para retener agua, aumentando la concentración de solutos interna (osmolitos, iones y otras moléculas orgánicas), y sistemas antioxidantes para asegurar un buen estado general con una fotosíntesis eficiente, manteniendo los radicales libres en niveles fisiológicos.

Esta sucinta descripción de los mecanismos de la planta para adaptarse a situaciones de estrés hídrico y por salinidad pone de manifiesto los numerosos puntos de mejora posibles para incrementar la producción agrícola; en particular, el empleo de PGPB (siglas del inglés, Plant Growth Promoting Bacteria) para mejorar la capacidad de adaptación de la planta a dichas condiciones adversas.

Cada vez existe un cuerpo de evidencias científicas que muestran que las bacterias beneficiosas son capaces de modificar varias dianas vegetales de forma simultánea, es decir, utilizan más de un mecanismo de acción, que además varían según las necesidades de la planta y está siempre dirigido a mejorar la adaptación de la planta (Ilagunamaran y Smith, 2017, doi: 10.3389/fpls.2017.01768). Los mecanismos de acción de las bacterias promotoras del crecimiento vegetal se pueden resumir en dos tipos: directos, cuando las bacterias o sus metabolitos alteran el metabolismo de la planta (actividad hormonal, estimulación de los mecanismos adaptativos), e indirectos, cuando sintetizan compuestos que facilitan la captación o movilización de nutrientes o evitan el crecimiento de microorganismos patógenos sobre la planta, sin alterar el metabolismo de la planta; esta no es una lista exhaustiva. En el caso de esta patente, ambos resultan de interés. La planta posee un metabolismo adaptativo, altamente inducible, relacionado con la adaptación de la planta a situaciones adversas a las que tiene que hacer frente durante su vida y es susceptible de modificación por las PGPB.

El géneroBacillusengloba a un grupo de microorganismos extraordinariamente diverso y actualmente comprendido por 239 especies/subespecies, que incluyen desde patógenos hasta cepas extremadamente útiles en agricultura (Patel and Gupta, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020; 70:40^438, DOI 10.1099/ijsem.0.003775). Siguiendo la taxonomía del Manual Bergeys, edición de 2009, esta bacteria se encuadra dentro del DominioBacteria,PhylumFirmicutes,ClaseBacilli,OrdenBacillales,FamiliaBacillaceae(Logan NA, De Vos P. GenusBacillusCohn 1872. In: De Vos P, Garrity M, Jones D, Krieg R and Ludwig W (editors). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. New York: Springer; 2009. pp.21-128). Recientemente, a partir de un exhaustivo análisis de genomas deBacillusse ha descrito la existencia de seis nuevos géneros:Peribacillusgen. nov.,Cytobacillusgen. nov.,Mesobacillusgen. nov.,Neobacillusgen. nov.,Metabacillusgen. nov. andAlkalihalobacillusgen. Nov, que permiten una clasificación más adecuada de las especies adscritas al géneroBacillusanteriormente (Patel and Gupta, 2020, doi 10.1099/ijsem.0.003775). El géneroPeribacillusagrupa a células en forma de bastón, Gram-positivas o Gram-variable, aeróbicas o aeróbicas facultativas, capaces de formar endosporas en condiciones de estrés ambiental o nutricional; la mayoría han sido aisladas del suelo o de intestinos animales. La cepa tipo esPeribacillus simplex.

Desde que Patel y Gupta describieran el géneroPeribacillusen 2020, se han descrito 8 nuevas especies dentro de este género,P. simplex, P. muralis, P. butanilovorans, P. louselieroae, P. gossypii, P. asahii, P. psychrosaccharolyticus y P. castrensis.Esta última (Rodríguez et al. 2022, doi: 10.3389/fpls.2022.896728), con efectos beneficiosos para agricultura por su capacidad para estimular el crecimiento y su capacidad de biocontrol, es decir, implicando mecanismos externos a la planta.

En el caso de la presente solicitud de patente las nuevas tecnologías han permitido dirimir una nueva especie,Peribacillus aracenensis(BBB004, código interno del laboratorio), en base a sus características genéticas únicas, que la diferencian de otras cepas dePeríbacilluscuando se compara el genoma deP. aracenensisBBB004 con los respecto a los genomas actualmente disponibles dePeribacillusyBacillus.

Los parámetros que permiten identificar una nueva especie son alguno de los siguientes: i) identidad nucleotídica promedio (ANI) e identidad aminoacídica promedio (AAI), siendo los valores límite para definir una nueva especie menor del 95%; ii) hibridación digital DNA-DNA (dDDH), con valores por debajo del 70%; iii) Contenido guanina-citosina (G+C), valores por encima del 1%; iv) índice de correlación de las frecuencias de uso de tetranucleótidos (TETRA), con valores por debajo de 0.99; v) análisis de secuencias multilocus (MLSA), con valores por debajo del 97%.

El genoma de la cepaP. aracenensisBBB004 se analizó en primer lugar usando herramientas disponibles en EzBioCloud. En primer lugar, el servicio de identificación de EzBioCloud proporciona búsquedas comprobadas basadas en similitudes en bases de datos de calidad controlada de secuencias de ARNr 16S. Después de eso, se realizaron los análisis ANI (identidad promedio de nucleótidos), AAI (identidad promedio de aminoácidos), dDDH y TETRA. Se usó Type (Strain) Genome Server (TYGS) para analizar el genoma completo.

En primer lugar, se analizó el gen 16s deP. aracenensisBBB004 en el EzBiocloud, detectando las especies más parecidas dentro del géneroPeribacillus: Brevibacterium frigotolerans(reclasificado comoP. frigotoleransen 2020. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.005389,);P. simplex, P. muralisyP. butanolivoranscon valores menores de 99,99% de similitud por pares. Los valores más altos de similitud se encontraron con los dos primeros (99,93 y 99,65%, respectivamente).

Al comparar el genoma deP. aracenensisBBB004 con los genomas de las 4 especies más parecidas según 16s, se obtuvieron los siguientes resultados: ConP. simplex,los valores de ANI y AAI fueron 93.54% y 94%, respectivamente, ambos por debajo del umbral del 95%, los valores de hibridación digital DNA-DNA (dDDH) 60.6%, por debajo del umbral del 70% y el contenido de guanina-citosina (G+C) 0.12%, por debajo del umbral del 1%. Los valores del índice de correlación de las frecuencias de uso de tetranucleótidos (TETRA) fue de 0.99822, por debajo del valor umbral 0.99. ConP. Frigoritoleransse obtienen los siguientes valores: ANI y AAI 93.96 y 93.26%, respectivamente, ambos por debajo del 95%; hibridación digital DNADNA (dDDH) 59.2%, por debajo del 70%; y la diferencia en el contenido de guanina-citosina (G+C) 0.62, por debajo del 1%; por último, los valores del índice de correlación de las frecuencias de uso de tetranucleótidos (TETRA) fue de 0.99704, igual o mayor al 0.99% de referencia. En base a los resultados obtenidos de ANI, AAI y dDDH, podemos afirmar queP. aracenensisBBB004 es diferente a las dos cepas más próximas en el árbol filogenético.

Por tanto, en base a la aproximación polifásica, se ha descrito una nueva especie para la cual se ha propuesto el nombre dePeribacillus aracenensissp. nov (N.° Depósito CECT 30655). Las características fisiológicas y el análisis genético de esta cepa permiten identificarla inequívocamente, diferenciándola de otras especies del géneroPeribacillus.

La cepaP. aracenensisBBB004 se caracteriza por sus efectos beneficiosos sobre las plantas en condiciones de estrés hídrico, mejorando la producción: mejora la fijación de CO2, manteniendo los estomas abiertos durante más tiempo, reflejo de una estimulación del metabolismo implicado en la adaptación. Previene la formación de radicales libres y facilita su eliminación, mejorando la adaptación de la planta a dichas condiciones mediante un mecanismo de homeostasis del metabolismo redox. También aumenta el potencial hídrico de la planta en estas condiciones, claro indicador de la capacidad de esta cepa para inducir un equilibrio hídrico, dando como resultado una mayor capacidad de la planta para resistir condiciones estrés hídrico. Por otra parte, es capaz de mejorar la nutrición de las plantas, mejorando su crecimiento y la producción.

El quePeribacillussea un género de bacterias descubierto recientemente, en el año 2020, puede ser la explicación de que no se conozcan patentes publicadas de las especies descritas de este género sobre ninguno de los efectos reportados, por lo que la presente solicitud constituye, a priori, la primera invención de una cepa bacteriana del géneroPeribacilluscomo PGPB.

LA INVENCIÓN.-

El objeto de la invención que aquí se describe y que, a la vista del estado de la técnica anterior, se entiende cumple con las condiciones de novedad y actividad inventiva necesarias para poder ser merecedora del derecho de patente, es el aislamiento y caracterización de la cepa bacterianaPeribacillus aracenensisBBB004, con número de depósito CECT 30655, que es un microorganismo del grupo de las bacterias Gram , géneroPeribacillus,con capacidad demostrada de estimular el metabolismo de adaptación a estrés hídrico de las plantas, disminuyendo el estrés oxidativo, permitiendo una mayor fijación del CO2atmosférico y mayor transpiración, optimizando la captación de energía y aumentado el crecimiento y producción vegetal en dichas condiciones. También es capaz de potenciar la absorción de nutrientes, en particular nitrógeno, fósforo, potasio, azufre, calcio, magnesio, boro, manganeso y zinc, mejorando la nutrición mineral, y de aumentar la concentración de polifenoles, mejorando la capacidad antioxidante y conservante de los alimentos, tanto en condiciones normales como de estrés.

Las características fisiológicas y el análisis genético de esta cepa, con un genoma secuenciado conforme a la norma OMPI ST.26 que se aporta anexo a la presente memoria descriptiva mediante fichero XML, permiten identificarla inequívocamente, diferenciándola de otras especies del géneroPeríbacillus.

En un screening de bacterias realizado en la rizosfera dePinus pinasterse aisló una cepa perteneciente al géneroPeribacilluscuyo análisis genético no permitió situarla en ninguna de las especies conocidas de este género.

Una vez aislada se realizó una caracterización del repertorio de genes únicos deP. aracenensisBBB004. En el análisis comparativo contra los genomas dePeribacillusyBacillusel programa BPGA identificó un total de 389 genes presentes exclusivamente enP. aracenensisBBB004, de los cuales 324 genes fueron asociados a un subsistema concreto. De entre los 133 genes únicos deP. aracenensisBBB004 destacan, por su abundancia los involucrados en el transporte de cobre, y la síntesis y degradación de poliaminas (que participan en procesos como el empaquetamiento de ácidos nucleicos, modulación de receptores de membrana y canales iónicos, regulación de la expresión génica y señalización celular) y bombas de absorción de nutrientes. Estos 324 genes correspondientes a la SEQ ID NO: 1 a 324 de la lista de secuencias.

Después de su caracterización se realizaron diversas pruebas para poner de manifiesto actividades bioquímicas indicadoras de su potencial capacidad de movilización de nutrientes y promoción del crecimiento vegetal. Estas fueron, producción de auxinas, degradación de 1-aminociclopropano-1-carboxilato, movilización de nitrógeno, solubilización de fosfato, calcio, y producción de sideróforos y quitinasas, resultando positivo para la producción de sideróforos. Se realizó un API 50 CHB/E Medium, resultando positivo para la degradación de fuentes de carbono, L-Arabinosa, Beta-Metil-D-Xilosa, Glucosa, y L-Fucosa.

Inicialmente se han realizado realizaron experimentos consistentes en la inoculación directa de la cepa en planta modelo(Arabidopsis thaliana)donde ha inducido una estimulación del metabolismo de adaptación de la planta que implica la ruta de transducción de señal mediada por ABA, JA y ET, activando la transcripción de los genes PR1 y LOX2. Se encontró un aumento en la fijación de CO2, y un aumento en la transpiración en ambos casos.

Se ha realizado otro experimento en invernadero en tomate, induciendo la planta con la bacteria y sometiéndola a un choque de estrés osmótico. Se ha detectado una mejora en la fotosíntesis, disminuyendo la concentración de pigmentos fotosintéticos y el estrés oxidativo.

Se realizó otro experimento en tomate, a cielo abierto, manteniendo un fuerte estrés hídrico, limitando el aporte de agua (sequía). Este experimento reveló la capacidad deP. aracenensisBBB004 para aumentar la fijación de CO2y la transpiración, disminuir el estrés oxidativo generado por la fotosíntesis, disminuyendo pigmentos fotosintéticos y la producción de radicales libres sin comprometer la eficiencia fotosintética, y aumentando los antioxidantes no enzimáticos (polifenoles) y osmolitos (azúcares solubles). Cuando no se limita el aporte de agua, se detecta un adelanto de la floración, aumento de la fijación de CO2. Se detectó un aumento la producción cuando las condiciones de agua fueron limitantes y una mejora en la absorción de nutrientes.

Por otro lado, se han realizado experimentos de elicitación conP. aracenensisBBB004 en olivo, limitando el aporte de agua durante el ciclo de producción de la planta con el objeto de incrementar la producción en cultivo intensivo bien establecido y en plena producción (sequía). En particular, se ha ensayado la aplicación de la referida cepa bacteriana en olivo limitando el aporte de agua durante los meses de verano con el objeto de incrementar la producción. Se ha encontrado queP. aracenensisBBB004 aumenta la producción, estimulando la transpiración, disminuye el estrés oxidativo, disminuyendo pigmentos fotosintéticos y aumentando los osmolitos (prolina).

En otro experimento conP. aracenensisBBB004 limitando el aporte de agua durante el ciclo de producción de la planta con el objeto de incrementar la producción en arándano, en cultivo intensivo (sequía). Se ha encontrado queP. aracenensisBBB004 aumenta la producción de arándano, estimulando la fijación de CO2, la transpiración, disminuye el estrés oxidativo, los pigmentos fotosintéticos y aumentando los osmolitos (prolina y azúcares solubles) y fenoles en hojas.

Por último, se realizó un experimento en olivo, aplicandoP. aracenensisBBB004 sobre ramas recién podadas, encontrando incrementos en fenoles de interés para la salud humana, concretamente oleuropeina y su precursor secologanina en los extractos de hojas, con potencial efecto protector sobre el sistema cardiovascular.

Los referidos experimentos sobre el usoP. aracenensisBBB004 como mejorador de la producción en condiciones de estrés hídrico (osmótico y sequía), mejorador de la adaptación a estrés y de la nutrición, se exponen en la presente memoria dentro del apartado forma de realización.

La finalidad que se persigue con esta invención y que constituye la ventaja técnica aportada con la misma, es disponer de una bacteria que mejore la producción agrícola en condiciones de estrés hídrico (osmótico y/o sequía), mejorando su nutrición, mejorando la producción vegetal por su capacidad para optimizar la absorción de energía, e incrementando la eficiencia del proceso fotosintético mediante la mejora de fijación de carbono, asociado a una disminución de estrés oxidativo.

En consecuencia, con la presente solicitud de patente se reivindica el uso de la cepaP. aracenensisBBB004, para su aplicación en cualquier tipo de especie vegetal, formando parte de cualquier preparado, ya sea individualmente o en combinación con otros organismos, con el fin de mejorar la nutrición vegetal, incrementando la producción agrícola en condiciones de estrés hídrico (osmótico y/o sequía), mejorando la adaptación de las plantas a situaciones de estrés. Sobre la base de estos efectos sobre las plantas,P.BBB004 mejora la nutrición y la producción vegetal (kg/ha) en condiciones de estrés hídrico.

FORMA DE REALIZACIÓN.-

La cepa del géneroPeribacillusque aquí se reseña se aisló estudiando la rizosfera de poblaciones naturales dePinus pinasteren un transecto de la sierra de Aracena, en la provincia de Sevilla. Esta especie vegetal(Pinus pinaster)se seleccionó por crecer en suelos pobres en nutrientes y tener una baja pluviosidad, repartida en fuertes tormentas puntuales.

Los muestreos de rizosfera para el aislamiento de la cepa bacteriana se realizaron en poblaciones naturales dePinus pinasteren octubre de 2019. Como resultado de dicho muestreo se encontróP. aracenensis(BBB004, código interno del laboratorio). El aislamiento de dicha cepa se realizó en agar nutritivo (PCA).

En el laboratorio este microorganismo se mantiene con una elevada tasa de supervivencia en glicerol al 20% en caldo nutritivo (Pronadisa) a -80°C o en glicerol al 15% en agua a -20°C y se recuperan con facilidad en el medio de cultivo utilizado para el aislamiento tanto en fase sólida como en fase liquida a 28°C.

I. Características morfológicas, bioquímicas y genéticas dePeribacillus P.

aracenensisBBB004.-

Para la caracterización de las cepas se consideraron diferentes caracteres fenotípicos que se pormenorizan en esta memoria: (i) morfología de las colonias (ii) morfología de las células, (iii) perfil metabólico, iv) análisis comparativo del genoma de la cepaP. aracenensisBBB004 y los genomas completos disponibles del géneroBacillus y Peribacillus.

i) La morfología de las colonias a las 24 h de incubación a 28° en agar para métodos estándar (PCA) se especifica en la Tabla 1:

TABLA 1

Creciendo en medio líquido (LB LURIA BROTH) el color del medio cambia a amarillo desde la fase exponencial de crecimiento a la fase estacionaria de crecimiento.

ii) Los caracteres morfológicos deP. aracenensisBBB004 a las 24 h de incubación a 28° en agar para métodos estándar (PCA) corresponden a un bacilo Gram positivo.

iii) Una vez aislada y caracterizada, con código de referencia interno BBB004, se realizaron diversas pruebas para poner de manifiesto el potencial PGPB de esta bacteria. Estas fueron, producción de auxinas (Brick et al., 1991 Appl. Environ. Microbiol., 57(2), 535; Sergeeva et al., 2007, Plant Soil, http://doi.org/10.1007/s11104-007-9314-5), degradación de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (Glick et al., 1995. http://doi.org/10.1139/m95-070), movilización de nitrógeno, solubilización de fosfato (De Freitas et al., 1997. Biol. Fertil. Soils, 24(4), 358-364), calcio (Tamilselvi et al., 2016. Front. plant sci, 7, 1828), y producción de sideróforos (Alexander and Zuberer, 1991. Biol.Fertil.Soils, 12(1), 39-45) y quitinasas (Frandberg y Shunürer, 1998 Can.J. Microbiol. 44: 121-127).

Esta cepa puede crecer en medio con un 6% de NaCl, y tolera valores de pH entre 5 y 7, no detectando crecimiento a pH4 ni por encima de pH8. Puede crecer en un rango de temperatura que oscila entre 22°C y 40°C, perdiendo viabilidad por encima de este valor.

El perfil metabólico (API 50 CHB/E Medium, https://us.vwr.com/store/product/29016242/api-50-chb-e-medium-biomerieux) de la cepa indica que es capaz de degradar de fuentes de carbono, L-Arabinosa, (3-Metil-D-Xilosa, Glucosa, y L-Fucosa.

iv) La comparación con el genoma completo más próximo,P. simplexlos valores de ANI y AAI fueron 93,54% y 94%, respectivamente, ambos por debajo del umbral del 95%; los valores de hibridación digital DNADNA (dDDH), 60,6%, por debajo del umbral del 70% y el contenido de guanina-citosina (G+C) 0,12%, por encima del umbral (1%). Los valores del índice de correlación de las frecuencias de uso de tetranucleótidos (TETRA) fue de 0,99822, por encima del umbral de referencia (0,99). En base a los resultados de ANI, AAI, dDDH y TETRA, podemos afirmar que cumple con los requisitos de nueva especie.

II. Experimentos demostrativos de la capacidad deP. aracenensisBBB004 como mejoradora de la nutrición y producción vegetal en condiciones de estrés hídrico. -

1°. Experimento demostrativo de la capacidad de la cepa para activar el metabolismo adaptativo de la planta a condiciones de estrés abiótico (salinidad). Experimento de inoculación directa deP. aracenensisBBB004 en planta modelo(Arabidopsis thaliana).Experimento realizado en cámara de experimentación en condiciones controladas de luz, humedad y temperatura sobre un total de 42 plantas y un N = 3, con un modelo de bloques aleatorios. Se inoculó una suspensión celular de la cepa en plántulas pregerminadas deA.thalianaa las 2 y 5 semanas de la germinación. A las 6 semanas se midieron los parámetros fotosintéticos registrando un incremento significativo en la fijación de CO2y transpiración; se cosecharon las plantas, y se analizó la expresión de los genes implicados en la activación del metabolismo de adaptación mediante RT-qPCR, vía ácido salicílico (SA) y vía etileno/jasmónico (Et/JA). Se registró un ligero incremento en la expresión de LOX, revelando una activación del sistema de adaptación(príming-pre challenge),que se manifestará en una respuesta más rápida e intensa cuando se enfrente a un factor de estrés.

En un experimento similar, sometiendo a las plantas deA.thalianaestimuladas conP. aracenensisBBB004 a un choque de estrés salino a las 5 semanas de la germinación, se registró un incremento significativo en la expresión de PR1, pdf1 y LOX revelando una activación simultanea del sistema de adaptación vía SA y Et/JA. Se registró un incremento significativo en la fijación de CO2y transpiración.

2°. Experimento de protección frente a un choque de estrés osmótico en tomate. Experimento de elicitación en plantas deSolanum lycopersicumvar. Casillas mediante aplicación directa de suspensiones bacterianas en la raíz, en condiciones controladas cuyo objetivo es demostrar la protección frente a un choque de estrés osmótico. Se inoculó una suspensión bacteriana de la cepaP. aracenensisBBB004 en la raíz de plántulas de tomate dos veces, la primera cuando presentaban los cotiledones y un par de hojas, y la segunda, una semana después; a los 7 días, se aplicó un riego con PEG 10% para aplicar un choque osmótico, cosechando tres días después. Se observó una respuesta similar en el perfil e intensidad de modificaciones bioquímicas en fotosíntesis, pigmentos, estrés oxidativo y osmolitos. Además de un aumento significativo en la fijación de CO2y transpiración.

3°. Experimento protección frente a estrés por sequía, mejorando la producción y nutrición mineral en tomate. El experimento se realizó con plantas deSolanum lycopersicumvar. Alcolea mediante aplicación directa de suspensiones bacterianas en la raíz de plantas, en parcelas de experimentación a cielo abierto, con limitación del aporte de agua, manteniendo el potencial hídrico del suelo en condiciones límite de hidratación (entre -300 y -400 hPa). El experimento se realizó desde mayo a agosto de 2022, con temperaturas muy altas sostenidas (mínima 22°C, máxima 42°C). Se inoculó una suspensión bacteriana deP. aracenensisBBB004 en la raíz de plantas de tomate 6 veces, la primera al trasplante, y las demás cada 15 días, iniciándose la cosecha a los dos meses de la primera aplicación; se realizó un muestreo intermedio después de la tercera aplicación y se analizaron los parámetros fotosintéticos de fluorescencia (F0, Fv/Fm, c|)PSN, NPQ), fijación de CO2, pigmentos fotosintéticos, malondialdehido (MDA) como marcador de estrés oxidativo celular y H2O2, como representante de especies reactivas de oxígeno (ROS); osmolitos (prolina, azúcares solubles y glicina betaina) y contenido en nutrientes. Se observó una respuesta similar en el perfil e intensidad de modificaciones bioquímicas un aumento significativo en la fijación de CO2(20%) y transpiración (26%), disminución de pigmentos fotosintéticos (42% clorofilas, 64% carotenos), menor estrés oxidativo (13% MDA) y modificación de osmolitos, disminución de prolina (26%) y aumento de azúcares solubles (15%). El contenido en nutrientes aumentó en plantas tratadas conP. aracenensisBBB004 (Tabla 2). La producción aumentó un 91%, basada en aumento en número de frutos (40%) y peso de estos. La Tabla 2 muestra el contenido de nutrientes en hojas de tomate después de 3 aplicaciones en las condiciones de estrés descritas, con limitación de riego. En condiciones normales se observa un incremento en la absorción de nutrientes referida al Nitrógeno, Magnesio y Azufre.

TABLA 2

4°. Experimento mejora de la producción con limitación de riego a cielo abierto en olivo. Se realizó un experimento en olivo superintensivo de regadío, reduciendo el riego un 25% sobre lo habitual (eliminando un riego de cada 4). Se ensayó la cepa deP. aracenensisBBB004 en aplicación radical. Las aplicaciones se realizaron cada 15 días desde abril hasta septiembre (12 aplicaciones). El número de plantas en el ensayo eran 20 por tratamiento más el control, con los dos regímenes de riego, (100% agua y 75% agua). El muestreo de seguimiento (septiembre) previo a la cosecha indicó que la cepaP. aracenensisBBB004 aplicada a nivel radical provocaba un incremento de producción (kg/ha) del 9% sobre el control con reducción de agua, alcanzando el mismo peso las aceitunas tratadas conP. aracenensisBBB004 en los dos regímenes de riego; el incremento en rendimiento graso fue proporcional (9%). Además, se analizaron los parámetros fotosintéticos de fijación de CO2, pigmentos fotosintéticos, malondialdehido (MDA) como marcador de estrés oxidativo celular y osmolitos (prolina, azúcares solubles), encontrando un aumento en fijación de CO2y transpiración (60%), disminución de pigmentos fotosintéticos (40%), aumento de potencial hídrico (13%), junto con un aumento de prolina (87%) y disminución de azúcares solubles (80%).

5°. Experimento mejora de la producción con limitación de riego a cielo abierto en arándano. Experimento de inoculación directa deP. aracenensisBBB004 en arándano(Vaccinium corymbosumvar. Cupla) en invernaderos de producción. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 21 plantas por tratamiento (n=3, 7 plantas por réplica) para cada tratamiento (control y bacteria), con un modelo experimental de bloques aleatorios. Se aplicaron suspensiones celulares de la cepaP. aracenensisBBB004 a nivel radical durante los 10 meses que dura el ciclo de producción, dos veces al mes, de octubre a septiembre; el agua se limitó un 25% durante todo el ciclo. Se recogió la producción total y se determinó un momento de muestreo, después del estrés estival, en septiembre. Se determinaron los parámetros fotosintéticos de fijación de CO2, y potencial hídrico. Se analizaron pigmentos fotosintéticos, malondialdehido (MDA) como marcador de estrés oxidativo celular, compuestos fenólicos como antioxidantes; osmolitos (prolina, azucares solubles). Se registró un aumento en la producción de fruta (+33%), una mejora en la fijación de CO2(+8%) y en la transpiración; en el potencial hídrico (+21%), asociado a un aumento en prolina (85%) y azúcares solubles (120%); una disminución en pigmentos fotosintéticos (40%) y un aumento en polifenoles antioxidantes (+272%), asociado a un menor estrés oxidativo (-37% MDA).

6°. Experimento mejora del contenido en polifenoles en restos de poda de olivo. Se aplicó una suspensión deP. aracenensisBBB004 a ramas de olivo var. Arbequina recién podadas. Se dejaron secar y se prepararon extractos de hojas, para lo cual se pulverizaron las hojas, se añadió etanol 80%, vortex 45s y sonicaron 30 min, seguido de centrifugación 5'; se repitió el proceso 4 veces; se juntaron los sobrenadantes, se llevó a sequedad, tras resuspender en 5 mL de metanol HPLC, se filtró (filtros de 0,2^m nylon), y se analizó el contenido en polifenoles mediante HPLC-MS. Se encontró un aumento de polifenoles con efecto bioactivo oleuropeina (21%), secologanina (96%) e hidroxitirosol (8%).

NI. Experimento demostrativo de la capacidad dePeribacillus P. aracenensisBBB004 como mejoradora de la nutrición enSolanum lycopersicumen ausencia de condiciones de estrés. -

1°. Experimento de mejora de nutrición mineral en tomate. El experimento se realizó con plantas deSolanum lycopersicumvar. Alcolea mediante aplicación directa de suspensiones bacterianas en la raíz de plantas, en parcelas de experimentación a cielo abierto en ausencia de condiciones de estrés, manteniendo el potencial hídrico del suelo en condiciones óptimas de hidratación (entre -100 y -200 hPa). El experimento se realizó desde mayo a agosto de 2022, con temperaturas muy altas sostenidas (mínima 22°C, máxima 42°C). Se inoculó una suspensión bacteriana deP. aracenensisBBB004 en la raíz de plantas de tomate 6 veces, la primera al trasplante, y las demás cada 15 días. Se realizaron medidas de nutrientes en hojas mejoran la nutrición en nitrógeno, azufre, magnesio, y zinc.

TABLA 3.

APLICACIÓN INDUSTRIAL. -

Dadas las propiedades arriba apuntadas deP. aracenensisBBB004, puede ser utilizada con objeto de aumentar la producción vegetal en condiciones de estrés hídrico por su capacidad para incrementar el proceso fotosintético mediante la mejora de fijación de carbono, aumentando la transpiración, disminuyendo el estrés oxidativo, y mejorando la absorción de nutrientes. Con respecto a la absorción de nutrientes se detecta un aumento tanto en presencia como ausencia de estrés hídrico. También mejora su rendimiento metabólico, disminuyendo pigmentos fotosintéticos y modificando el perfil de osmolitos, mejorando la capacidad de adaptación de las plantas a estrés. También incrementa el contenido en compuestos fenólicos, cuya aplicación sería revalorizar los restos vegetales como fuente de principios activos, además de mejorar calidad y perdurabilidad de los alimentos por su capacidad antioxidante y conservante.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Cepa bacteriana de la especiePeribacillus aracenensis,con número de depósito CECT 30655, microorganismo del grupo de las bacterias Gram , géneroPeribacillus,caracterizada por su capacidad estimulante del metabolismo adaptativo a estrés hídrico en especies vegetales.

2. Cepa bacteriana de la especiePeribacillus aracenensiscon número de depósito CECT 30655, microorganismo del grupo de las bacterias Gram , géneroPeribacillus, caracterizada por su capacidad estimulante de la absorción de nitrógeno, fósforo, potasio, azufre, calcio, magnesio, boro, manganeso y zinc en especies herbáceas y leñosas, en condiciones de estrés hídrico y de ausencia de estrés hídrico.

3. Cepa bacteriana de la especiePeribacillus aracenensiscon número de depósito CECT 30655, microorganismo del grupo de las bacterias Gram , géneroPeribacillus,caracterizada por su capacidad estimulante del metabolismo secundario en condiciones de estrés hídrico, concretamente producción de polifenoles en especies vegetales.

4. Uso de la cepa bacteriana de la especiePeribacillus aracenensiscon número de depósito CECT 30655, según reivindicación 1, en cualquier tipo de cultivo herbáceo y leñoso, para mejorar la adaptación de la planta a cualquier condición de estrés hídrico, ya sea natural, osmótico y/o sequía, o por falta de riego.

5. Uso de la cepa bacteriana de la especiePeribacillus aracenensiscon número de depósito CECT 30655, según reivindicación 2, en cualquier tipo de cultivo herbáceo y leñoso, para mejorar la nutrición mineral en nitrógeno, fósforo, potasio, azufre, calcio, magnesio, boro, manganeso y zinc, frente a estrés hídrico, ya sea natural, osmótico y/o sequía, o por falta de riego.

6. Uso de la cepa bacteriana de la especiePeribacillus aracenensiscon número de depósito CECT 30655, según reivindicación 2, en cualquier tipo de cultivo herbáceo y leñoso, para mejorar la nutrición mineral en nitrógeno, azufre, magnesio y zinc en condiciones de ausencia de estrés hídrico.

7. Uso de la cepa bacteriana de la especiePeribacillus aracenensiscon número de depósito CECT 30655, según reivindicación 3, en especies vegetales de interés farmacológico y alimentario, para mejorar la concentración en polifenoles, mejorando así su capacidad antioxidante y conservante.

8. Uso de la cepa bacteriana de la especiePeribacillus aracenensiscon número de depósito CECT 30655, según reivindicaciones 1 a 3, para su aplicación en composiciones, formando parte de cualquier preparado bacteriano, ya sea individualmente o en combinación con otros organismos, y por cualquier medio disponible que ponga la bacteria en contacto con la semilla, el sistema radical o aéreo de las plantas.