JP2518862B2 - 新規プラスミドベクタ― - Google Patents
新規プラスミドベクタ―Info
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- JP2518862B2 JP2518862B2 JP62218973A JP21897387A JP2518862B2 JP 2518862 B2 JP2518862 B2 JP 2518862B2 JP 62218973 A JP62218973 A JP 62218973A JP 21897387 A JP21897387 A JP 21897387A JP 2518862 B2 JP2518862 B2 JP 2518862B2
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- escherichia coli
- plasmid vector
- protease iii
- iii
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、大腸菌プロテアーゼIIIを効率よく製造す
る方法に関する。更に本発明は、大腸菌における遺伝子
産物の分泌または菌体内生産を可能とする新規プラスミ
ドベクターに関する。
る方法に関する。更に本発明は、大腸菌における遺伝子
産物の分泌または菌体内生産を可能とする新規プラスミ
ドベクターに関する。
大腸菌プロテアーゼIIIは、プロテアーゼPiとも呼ば
れており（Swamy,K.H.＆Goldberg,A.L.（1981）Nature,
292,652〜654）、ChengおよびZipserにより、はじめて
大腸菌のペリプラズムより単離、精製された（Cheng,Y
−S.E.＆Zipser,D.（1979）J.Biol.Chem,254,4698〜470
6）。その後、本酵素の遺伝子（Ｐ′tr）がクローニン
グされ（Dykstra,C.C.＆Kushner,S.R.（1985）,J.Bacte
riol.,163,1055〜1059）、その全塩基配列が決定された
（Finch,P.W.et al（1986）NAR,14,7695〜7703）。その
結果、本酵素は939アミノ酸残基の１本鎖ポリペプチド
よりなる分子量110Kのタンパク質であること、Ｎ末端に
23アミノ酸残基よりなるシグナルペプチドを有する前駆
体として合成されること等が明らかになった。このシグ
ナルペプチドは、プロテアーゼIIIの細胞質膜からの分
泌に必須の役割を果たしているものと考えられる。さら
にプロテアーゼIIIは、量こそ多くはないが非常に安定
な形で菌体内に存在しており、この性質を利用して菌体
から容易に精製することのできる酵素である。
れており（Swamy,K.H.＆Goldberg,A.L.（1981）Nature,
292,652〜654）、ChengおよびZipserにより、はじめて
大腸菌のペリプラズムより単離、精製された（Cheng,Y
−S.E.＆Zipser,D.（1979）J.Biol.Chem,254,4698〜470
6）。その後、本酵素の遺伝子（Ｐ′tr）がクローニン
グされ（Dykstra,C.C.＆Kushner,S.R.（1985）,J.Bacte
riol.,163,1055〜1059）、その全塩基配列が決定された
（Finch,P.W.et al（1986）NAR,14,7695〜7703）。その
結果、本酵素は939アミノ酸残基の１本鎖ポリペプチド
よりなる分子量110Kのタンパク質であること、Ｎ末端に
23アミノ酸残基よりなるシグナルペプチドを有する前駆
体として合成されること等が明らかになった。このシグ
ナルペプチドは、プロテアーゼIIIの細胞質膜からの分
泌に必須の役割を果たしているものと考えられる。さら
にプロテアーゼIIIは、量こそ多くはないが非常に安定
な形で菌体内に存在しており、この性質を利用して菌体
から容易に精製することのできる酵素である。
プロテアーゼIIIの基質特異性として、本酵素が6500
前後のペプチドのみを分解することが報告されているが
（Cheng,Y−S.E.＆Zipser,D.（1979）J.Biol.Chem.,25
4,4698〜4706）その切断部位は、インシュリンＢ鎖のTy
r−Leu（16−17）結合およびPhe−Tyr（25−26）結合を
切断するという以外は不明であった。本発明者らは、種
々のペプチドホルモンを基質として用い、プロテアーゼ
IIIによる切断部位を調べた結果、本酵素はヒトβ−エ
ンドルフィンのLys−Asn（19−20）、ヒトリューモルフ
ィンのArg−Arg（６−７）およびThr−Arg（13−14）、
ｈ−VIPのArg−Lys（14−15）、ヒトカルシトニンのHis
−Thr（20−21）、サブスタンスＰのPhe−Gly（８−
９）およびGly−Leu（９−10）、ヒトグルカゴンのPhe
−Thr（６−７）およびLys−Tyr（12−13）、ｈ−ACTH
のTyr−Ser（２−３）結合を特異的に分解することを見
出した。また、本発明者らは、β−カゼインの各種プロ
テアーゼ消化物を基質として用いることにより、本酵素
は分子量3000前後のペプチドをある特定の部位で分解す
ることを明らかにすることができた。このように基質の
サイズを認識するというプロテアーゼIIIの基質特異性
は、ペプチド・タンパク質の構造機能相関を調べる際の
道具（試薬）として産業上極めて有用である。しかし、
プロテアーゼIIIの大腸菌における生産量は非常に低
く、そのために、それを単離、精製することが極めて困
難であった。
前後のペプチドのみを分解することが報告されているが
（Cheng,Y−S.E.＆Zipser,D.（1979）J.Biol.Chem.,25
4,4698〜4706）その切断部位は、インシュリンＢ鎖のTy
r−Leu（16−17）結合およびPhe−Tyr（25−26）結合を
切断するという以外は不明であった。本発明者らは、種
々のペプチドホルモンを基質として用い、プロテアーゼ
IIIによる切断部位を調べた結果、本酵素はヒトβ−エ
ンドルフィンのLys−Asn（19−20）、ヒトリューモルフ
ィンのArg−Arg（６−７）およびThr−Arg（13−14）、
ｈ−VIPのArg−Lys（14−15）、ヒトカルシトニンのHis
−Thr（20−21）、サブスタンスＰのPhe−Gly（８−
９）およびGly−Leu（９−10）、ヒトグルカゴンのPhe
−Thr（６−７）およびLys−Tyr（12−13）、ｈ−ACTH
のTyr−Ser（２−３）結合を特異的に分解することを見
出した。また、本発明者らは、β−カゼインの各種プロ
テアーゼ消化物を基質として用いることにより、本酵素
は分子量3000前後のペプチドをある特定の部位で分解す
ることを明らかにすることができた。このように基質の
サイズを認識するというプロテアーゼIIIの基質特異性
は、ペプチド・タンパク質の構造機能相関を調べる際の
道具（試薬）として産業上極めて有用である。しかし、
プロテアーゼIIIの大腸菌における生産量は非常に低
く、そのために、それを単離、精製することが極めて困
難であった。
本発明者らは、大腸菌プロテアーゼIIIを大腸菌に大
量に作らせ、その単離、精製を容易にするという目的
で、このプロテアーゼIII遺伝子（ptr）を含むプラスミ
ドについて種々検討を行なった結果、ptrプロモーター
をtacプロモーターで置き換えることにより、多量のプ
ロテアーゼIIIが発現されることを見い出し、本発明を
完成するに至った。
量に作らせ、その単離、精製を容易にするという目的
で、このプロテアーゼIII遺伝子（ptr）を含むプラスミ
ドについて種々検討を行なった結果、ptrプロモーター
をtacプロモーターで置き換えることにより、多量のプ
ロテアーゼIIIが発現されることを見い出し、本発明を
完成するに至った。
すなわち、本発明は、大腸菌由来のプラスミドにptr
遺伝子を含むフラグメントを挿入し、次いで、ptrプロ
モーターをtacプロモーターに置き換えることにより得
たプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、この形質
転換菌を誘導物質の存在下または非存在下で培養するこ
とからなるプロテアーゼIIIの製造法を提供するもので
ある。
遺伝子を含むフラグメントを挿入し、次いで、ptrプロ
モーターをtacプロモーターに置き換えることにより得
たプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、この形質
転換菌を誘導物質の存在下または非存在下で培養するこ
とからなるプロテアーゼIIIの製造法を提供するもので
ある。
以下、本発明を詳細に説明する。
プラスミドベクターpDR42Sの構築 ptr遺伝子は、19Kb BamH Iフラグメントとして大腸菌
染色体からクローン化されている（Dykstra,C.C.＆Kush
ner,S.R.（1985）J.Bacteriol.,163,1055〜1059）。こ
のクローンされたプラスミドはpCDK3と呼ばれており、
これをptr遺伝子源として使用する（本発明に於いて
は、pCDK3と全く同等であるpG185を使用した）。プロテ
アーゼIIIを発源するプラスミド、pDR42Sの構築は、第
１図に示したチャートに従い、以下の要領で行なう。
染色体からクローン化されている（Dykstra,C.C.＆Kush
ner,S.R.（1985）J.Bacteriol.,163,1055〜1059）。こ
のクローンされたプラスミドはpCDK3と呼ばれており、
これをptr遺伝子源として使用する（本発明に於いて
は、pCDK3と全く同等であるpG185を使用した）。プロテ
アーゼIIIを発源するプラスミド、pDR42Sの構築は、第
１図に示したチャートに従い、以下の要領で行なう。
プラスミドpV185を制限酵素Hind IIIで切断してptr遺
伝子を含む6.7Kb Hind IIIフラグメントを得、これを市
販のプラスミドpUC19へ挿入する。それにはpUC19をHind
III消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼ（BA
P）で処理して脱リン酸化しておき、これをプラスミドp
V185から切り出した6.7Kb Hind IIIフラグメントと混合
し、ライゲーションする。ここでptr遺伝子の挿入方向
は二通りあるが、pUC19のlacプロモーターとptr遺伝子
の向きが同じものを選択する（このプラスミドをpUC67
と命名）。次いで、pUC67からptr遺伝子の５′側に存在
する大腸菌染色体由来2.5Kb Sal I−Hpa I領域（プロモ
ーター領域の全部または一部を含んでいると考えられ
る）を削除する。この方法としては、まず、pUC67をSal
Iで消化したあと、Klenowフラグメントによりフィルア
ップして、Sal I部位をブラントエンド（平滑末端）と
する。次いでHpa Iで消化し、消化物をアガロースゲル
電気泳動にかける。7.1Kb DNAフラグメントをエレクト
ロエリューションすることにより単離、精製し、T4 DNA
リガーゼによりライゲーションしたあと、E.coli JM109
を形質転換する。アンピシリン耐性の形質転換体からプ
ラスミドを単離し、制限酵素による切断様式で目的のプ
ラスミドであることを確認する（このプラスミドをpUC4
2と命名）。得られたプラスミドは、ptr遺伝子の３′下
流にユニークなHind III部位を持っているが、Sal Iリ
ンカーを用いてこの部位をSal I部位に変換する（この
プラスミドをpUC42Sと命名）。次いで、pUC42Sの約20bp
からなるEcoR I−BamH I DNAフラグメントを、tacプロ
モーターを持つ発現ベクターpDR540から切り出した400b
p EcoR I−BamH I DNAフラグメントと置き換えることに
よりpDR42Sを構築する。
伝子を含む6.7Kb Hind IIIフラグメントを得、これを市
販のプラスミドpUC19へ挿入する。それにはpUC19をHind
III消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼ（BA
P）で処理して脱リン酸化しておき、これをプラスミドp
V185から切り出した6.7Kb Hind IIIフラグメントと混合
し、ライゲーションする。ここでptr遺伝子の挿入方向
は二通りあるが、pUC19のlacプロモーターとptr遺伝子
の向きが同じものを選択する（このプラスミドをpUC67
と命名）。次いで、pUC67からptr遺伝子の５′側に存在
する大腸菌染色体由来2.5Kb Sal I−Hpa I領域（プロモ
ーター領域の全部または一部を含んでいると考えられ
る）を削除する。この方法としては、まず、pUC67をSal
Iで消化したあと、Klenowフラグメントによりフィルア
ップして、Sal I部位をブラントエンド（平滑末端）と
する。次いでHpa Iで消化し、消化物をアガロースゲル
電気泳動にかける。7.1Kb DNAフラグメントをエレクト
ロエリューションすることにより単離、精製し、T4 DNA
リガーゼによりライゲーションしたあと、E.coli JM109
を形質転換する。アンピシリン耐性の形質転換体からプ
ラスミドを単離し、制限酵素による切断様式で目的のプ
ラスミドであることを確認する（このプラスミドをpUC4
2と命名）。得られたプラスミドは、ptr遺伝子の３′下
流にユニークなHind III部位を持っているが、Sal Iリ
ンカーを用いてこの部位をSal I部位に変換する（この
プラスミドをpUC42Sと命名）。次いで、pUC42Sの約20bp
からなるEcoR I−BamH I DNAフラグメントを、tacプロ
モーターを持つ発現ベクターpDR540から切り出した400b
p EcoR I−BamH I DNAフラグメントと置き換えることに
よりpDR42Sを構築する。
プロテアーゼIIIの製造 上記の方法で得たプラスミドベクターpDR42Sを常法に
より大腸菌に導入し、得られた形質転換菌をイソプロピ
ルβ−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）の存在下または非
存在下で培養してプロテアーゼIIIを発現させ、常法に
より培養液からプロテアーゼIIIを回収する。
より大腸菌に導入し、得られた形質転換菌をイソプロピ
ルβ−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）の存在下または非
存在下で培養してプロテアーゼIIIを発現させ、常法に
より培養液からプロテアーゼIIIを回収する。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
実施例 プラスミドpDR42Sの構築 ptr遺伝子源として知られているpCDK3と全く同等のプ
ラスミドpV185を三菱化成生命研究所板谷研究員により
入手した。このプラスミドpV185 10μｇを、100μの
反応溶液中、50ユニットのHind IIIにより37℃で１時間
消化した。次いで消化物を0.7％アガロース電気泳動に
かけた。ptr遺伝子を含む6.7Kb Hind III断片をエレク
トロエリューションによりアガロースゲルから抽出した
あと、DE−52カラムクロマトグラフィーにより精製し
た。エタノール沈澱により回収された6.7Kb Hind III断
片の量は約２μｇであった。一方、ベクタープラスミド
pUC19（TOYOBO製）（２μｇ）を50μの反応溶液中、1
0ユニットのHind IIIにより37℃で１時間完全に消化
し、次いで、１ユニットの大腸菌アルカリ性フォスファ
ターゼを加え、更に30分間37℃で反応させた。フェノー
ル−クロロホルム抽出法により反応を停止したあと、DN
Aをエタノール沈澱により回収した。回収量は２μｇで
あった。以上のようにして得られた6.7Kb Hind III断片
と、Hind III消化後大腸菌アルカリ性フォスファターゼ
処理したpUC19、それぞれ0.1μｇを混合し、20μの反
応溶液中、５ユニットのT4 DNAリガーゼ（TOYOBO製）と
共に16℃で30分間反応させ、プラスミドの環化を行なっ
た。次いで環化したプラスミドで大腸菌JM109を形質転
換し、形質転換株よりpUC67を得た。
ラスミドpV185を三菱化成生命研究所板谷研究員により
入手した。このプラスミドpV185 10μｇを、100μの
反応溶液中、50ユニットのHind IIIにより37℃で１時間
消化した。次いで消化物を0.7％アガロース電気泳動に
かけた。ptr遺伝子を含む6.7Kb Hind III断片をエレク
トロエリューションによりアガロースゲルから抽出した
あと、DE−52カラムクロマトグラフィーにより精製し
た。エタノール沈澱により回収された6.7Kb Hind III断
片の量は約２μｇであった。一方、ベクタープラスミド
pUC19（TOYOBO製）（２μｇ）を50μの反応溶液中、1
0ユニットのHind IIIにより37℃で１時間完全に消化
し、次いで、１ユニットの大腸菌アルカリ性フォスファ
ターゼを加え、更に30分間37℃で反応させた。フェノー
ル−クロロホルム抽出法により反応を停止したあと、DN
Aをエタノール沈澱により回収した。回収量は２μｇで
あった。以上のようにして得られた6.7Kb Hind III断片
と、Hind III消化後大腸菌アルカリ性フォスファターゼ
処理したpUC19、それぞれ0.1μｇを混合し、20μの反
応溶液中、５ユニットのT4 DNAリガーゼ（TOYOBO製）と
共に16℃で30分間反応させ、プラスミドの環化を行なっ
た。次いで環化したプラスミドで大腸菌JM109を形質転
換し、形質転換株よりpUC67を得た。
次いで、このpUC67 10μｇを、100μ反応溶液中、1
00ユニットのSal Iにより37℃で１時間完全に消化し
た。エタノール沈澱によりDNAを回収したあと、50μ
の反応溶液中、５ユニットのDNAポリメラーゼ（クレノ
ウ）を加えて37℃で30分間反応させ、次いで65℃で10分
間処理した。エタノール沈澱によりDNAを回収したあ
と、100μの反応溶液中、50ユニットのHpa Iにより37
℃で１時間完全消化し、消化物を0.7％アガロースゲル
電気泳動にかけた。7.1Kb DNA断片を切り出し、6.7Kb H
ind III断片の場合と同様に溶出精製を行なった。DNAの
回収量は５μｇであった。この7.1Kb DNA断片0.1μｇを
20μ反応溶液中、５ユニットのT4 DNAリガーゼによ
り、16℃で30分間環化した。環化したプラスミドで大腸
菌JM109を形質転換し、形質転換株よりpUC42を得た。
00ユニットのSal Iにより37℃で１時間完全に消化し
た。エタノール沈澱によりDNAを回収したあと、50μ
の反応溶液中、５ユニットのDNAポリメラーゼ（クレノ
ウ）を加えて37℃で30分間反応させ、次いで65℃で10分
間処理した。エタノール沈澱によりDNAを回収したあ
と、100μの反応溶液中、50ユニットのHpa Iにより37
℃で１時間完全消化し、消化物を0.7％アガロースゲル
電気泳動にかけた。7.1Kb DNA断片を切り出し、6.7Kb H
ind III断片の場合と同様に溶出精製を行なった。DNAの
回収量は５μｇであった。この7.1Kb DNA断片0.1μｇを
20μ反応溶液中、５ユニットのT4 DNAリガーゼによ
り、16℃で30分間環化した。環化したプラスミドで大腸
菌JM109を形質転換し、形質転換株よりpUC42を得た。
次に、pUC42（２μｇ）を、50μ反応溶液中、10ユ
ニットのHind IIIにより37℃で１時間完全消化した。エ
タノール沈澱によりDNAを回収したあと、50μの反応
溶液中、２ユニットのDNAポリメラーゼ（クレノウ）を
加えて37℃で30分間反応させ、次いで65℃で10分間イン
キュベートした。エタノール沈澱により回収したDNA
を、50μの反応溶液中、１ユニットの大腸菌アルカリ
性フォスファターゼを加えて37℃で30分間処理したあ
と、フェノール−クロロホルム抽出した。エタノール沈
澱により、約1.5μｇのDNAが回収された。得られたDNA
0.1μｇを、Sal Iリンカー（宝酒造製）0.01μｇと混合
し（モル比1:100）、20μ反応溶液中、５ユニットのT
4 DNAリガーゼを加えて16℃で30分間処理した。このよ
うにして環化したプラスミドで大腸菌JM109を形質転換
し、形質転換株よりpUC42Sを得た。
ニットのHind IIIにより37℃で１時間完全消化した。エ
タノール沈澱によりDNAを回収したあと、50μの反応
溶液中、２ユニットのDNAポリメラーゼ（クレノウ）を
加えて37℃で30分間反応させ、次いで65℃で10分間イン
キュベートした。エタノール沈澱により回収したDNA
を、50μの反応溶液中、１ユニットの大腸菌アルカリ
性フォスファターゼを加えて37℃で30分間処理したあ
と、フェノール−クロロホルム抽出した。エタノール沈
澱により、約1.5μｇのDNAが回収された。得られたDNA
0.1μｇを、Sal Iリンカー（宝酒造製）0.01μｇと混合
し（モル比1:100）、20μ反応溶液中、５ユニットのT
4 DNAリガーゼを加えて16℃で30分間処理した。このよ
うにして環化したプラスミドで大腸菌JM109を形質転換
し、形質転換株よりpUC42Sを得た。
最後に、tacプロモーターとptr遺伝子の連結を以下の
ように行なった。まず、pUC42S（４μｇ）を、100μ
の反応溶液中、20ユニットのEcoR Iと20ユニットのBamH
Iを用いて37℃で１時間完全消化し、0.7％アガロース
電気泳動にかけた。7Kb EcoR I−BamH I断片を切り出
し、6.7Kb Hind III断片の場合と同様に溶出精製を行な
った。エタノール沈澱により回収されたDNAの量は約３
μｇであった。
ように行なった。まず、pUC42S（４μｇ）を、100μ
の反応溶液中、20ユニットのEcoR Iと20ユニットのBamH
Iを用いて37℃で１時間完全消化し、0.7％アガロース
電気泳動にかけた。7Kb EcoR I−BamH I断片を切り出
し、6.7Kb Hind III断片の場合と同様に溶出精製を行な
った。エタノール沈澱により回収されたDNAの量は約３
μｇであった。
一方、pDR540（ファルマシア製）10μｇを、100μ
反応溶液中、50ユニットのEcoR Iと50ユニットのBamH I
を用いて37℃で１時間消化し、1.5％アガロース電気泳
動にかけた。tacプロモーターを含む400bp EcoR I−Bam
H I断片を切り出し、6.7Kb Hind III断片の場合と同様
に溶出精製を行なった。エタノール沈澱により回収され
たDNAの量は約0.5μｇであった。
反応溶液中、50ユニットのEcoR Iと50ユニットのBamH I
を用いて37℃で１時間消化し、1.5％アガロース電気泳
動にかけた。tacプロモーターを含む400bp EcoR I−Bam
H I断片を切り出し、6.7Kb Hind III断片の場合と同様
に溶出精製を行なった。エタノール沈澱により回収され
たDNAの量は約0.5μｇであった。
以上のようにして得られた7Kb EcoR I−BamH I断片0.
1μｇと400bp EcoR I−BamH I断片0.1μｇを混合し、20
μ反応溶液中、５ユニットのT4 DNAリガーゼにより16
℃で30分間処理し、プラスミドを環化させた。環化した
プラスミドで大腸菌JM109を形質転換し、形質転換株よ
りpDR42Sを得た。
1μｇと400bp EcoR I−BamH I断片0.1μｇを混合し、20
μ反応溶液中、５ユニットのT4 DNAリガーゼにより16
℃で30分間処理し、プラスミドを環化させた。環化した
プラスミドで大腸菌JM109を形質転換し、形質転換株よ
りpDR42Sを得た。
上記のようにして得た、目的とするプラスミドpDR42S
の詳細な制限酵素部位を第２図に示した。図中、下線を
施した制限部位は、本プラスミド上、単独に存在するこ
とを示す。尚、形質転換菌、エシェリシア・コリJM109/
pDR42Sは、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている（FERM P−9520、寄託日：昭和62年８月14日）。
の詳細な制限酵素部位を第２図に示した。図中、下線を
施した制限部位は、本プラスミド上、単独に存在するこ
とを示す。尚、形質転換菌、エシェリシア・コリJM109/
pDR42Sは、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている（FERM P−9520、寄託日：昭和62年８月14日）。
このプラスミドpDR42SではpUC19由来のlacプロモータ
ーと、pDR540由来のtacプロモーターが、この順にタン
デムに位置し、その３′−下流に位置するptr遺伝子を
支配している。ptr遺伝子の５′上流に残存している大
腸菌染色体由来のDNA領域はわずかに48bpであり、ptr遺
伝子のプロモーターを含むには短かすぎるので、pDR42S
においては、ptr遺伝子のプロモーターはその一部また
は全部が欠失していると思われる。
ーと、pDR540由来のtacプロモーターが、この順にタン
デムに位置し、その３′−下流に位置するptr遺伝子を
支配している。ptr遺伝子の５′上流に残存している大
腸菌染色体由来のDNA領域はわずかに48bpであり、ptr遺
伝子のプロモーターを含むには短かすぎるので、pDR42S
においては、ptr遺伝子のプロモーターはその一部また
は全部が欠失していると思われる。
形質転換大腸菌JM109/pDR42Sの培養 プラスミドpDR42Sで形質転換した大腸菌Ｋ−12株JM10
9を40μＭアンピシリンを含むLB培地（またはM9−0.2％
カザミノ酸培地）中、37℃で振盪培養した。プロテアー
ゼIIIの生産量が最も高くなる時期を、IPTGによる誘導
の時期、および誘導後の集菌の時期をかえて調べた。そ
の結果、培養液の濁度がクレット値で50〜100まで生育
した時点で0.4mM IPTGを添加し、さらに培養を続け、IP
TG添加後４〜6hr後に集菌すると、最もプロテアーゼIII
の生産量が高くなることがわかった。この様にして得た
菌体は−20℃で凍結保存した。
9を40μＭアンピシリンを含むLB培地（またはM9−0.2％
カザミノ酸培地）中、37℃で振盪培養した。プロテアー
ゼIIIの生産量が最も高くなる時期を、IPTGによる誘導
の時期、および誘導後の集菌の時期をかえて調べた。そ
の結果、培養液の濁度がクレット値で50〜100まで生育
した時点で0.4mM IPTGを添加し、さらに培養を続け、IP
TG添加後４〜6hr後に集菌すると、最もプロテアーゼIII
の生産量が高くなることがわかった。この様にして得た
菌体は−20℃で凍結保存した。
菌の粉砕とプロテアーゼIIIの精製 凍結してあった菌体を室温で融解した後、培養液の1/
50容量の10mMトリス塩酸緩衝液（pH8）に懸濁し、超音
波処理により菌を破砕した。プロテアーゼIIIは極めて
安定性が高く、37℃で一晩放置してもほとんど活性を失
わないので、超音波処理をできるだけ念入りに行なう方
が回収がよい。調音波処理後、15000rpmで30分間４℃で
遠心し、遠心上清を10mMトリス塩酸緩衝液（pH8）に透
析した。次いで、同緩衝液で平衡化したDE−52カラムに
アプライした。プロテアーゼIIIはこの条件でDE−52に
吸着する。カラム容量は菌の培養液の容量の1/50程度が
適している。カラム容量の約10倍量の10mMトリス塩酸緩
衝液（pH8）でカラムを洗浄したあと、0.1M NaClを含む
同緩衝液でプロテアーゼIIIを溶出した。溶出画分をPM
−10を用いた限外過で濃縮後、セファクリルＳ−300
Superfineのカラムクロマトグラフィーにかけることに
より、プロテアーゼIIIがSDS−PAGEでシングルバンドを
与えるまでに精製した。このようにして精製されたプロ
テアーゼIIIの精製収率は約30％であった。また、プロ
テアーゼIIIの生産量は、菌をまるごとつぶしてSDS−PA
GEにかけ、プロテアーゼIIIのバンドをタンパク濃度既
知のマーカーのバンドの染まり具合と比較することによ
り、約60mg/と推定された。精製標品の収量は約15mg/
であり、これはこれまで報告されている収量0.5mg/
（Dykstra,C.C.＆Kushner,S.K.（1985）,J.Bacteriol.,
163,1055〜1059）と比べると、約30倍であった。また、
pDR42Sで形質転換し、培養の際にIPTG誘導をかけた大腸
菌JM109のプロテアーゼIII生産量は、pDR42Sを持たない
JM109の約1000倍に上昇した。以上の結果を以下の表１
に示す。
50容量の10mMトリス塩酸緩衝液（pH8）に懸濁し、超音
波処理により菌を破砕した。プロテアーゼIIIは極めて
安定性が高く、37℃で一晩放置してもほとんど活性を失
わないので、超音波処理をできるだけ念入りに行なう方
が回収がよい。調音波処理後、15000rpmで30分間４℃で
遠心し、遠心上清を10mMトリス塩酸緩衝液（pH8）に透
析した。次いで、同緩衝液で平衡化したDE−52カラムに
アプライした。プロテアーゼIIIはこの条件でDE−52に
吸着する。カラム容量は菌の培養液の容量の1/50程度が
適している。カラム容量の約10倍量の10mMトリス塩酸緩
衝液（pH8）でカラムを洗浄したあと、0.1M NaClを含む
同緩衝液でプロテアーゼIIIを溶出した。溶出画分をPM
−10を用いた限外過で濃縮後、セファクリルＳ−300
Superfineのカラムクロマトグラフィーにかけることに
より、プロテアーゼIIIがSDS−PAGEでシングルバンドを
与えるまでに精製した。このようにして精製されたプロ
テアーゼIIIの精製収率は約30％であった。また、プロ
テアーゼIIIの生産量は、菌をまるごとつぶしてSDS−PA
GEにかけ、プロテアーゼIIIのバンドをタンパク濃度既
知のマーカーのバンドの染まり具合と比較することによ
り、約60mg/と推定された。精製標品の収量は約15mg/
であり、これはこれまで報告されている収量0.5mg/
（Dykstra,C.C.＆Kushner,S.K.（1985）,J.Bacteriol.,
163,1055〜1059）と比べると、約30倍であった。また、
pDR42Sで形質転換し、培養の際にIPTG誘導をかけた大腸
菌JM109のプロテアーゼIII生産量は、pDR42Sを持たない
JM109の約1000倍に上昇した。以上の結果を以下の表１
に示す。
以上の実施例から明らかな様に、本発明方法により、
極めて効率良くプロテアーゼIIIを製造することができ
る。しかし、本発明方法で使用したプラスミドpDR42S
は、プロテアーゼIIIだけではなく、それ以外のタンパ
ク質の発現にも使用することができる。従って、本発明
はまた、遺伝子産物の効率的な菌体内発現および分泌を
可能とする発現用ベクター、pDR42Sを提供するものであ
る。
極めて効率良くプロテアーゼIIIを製造することができ
る。しかし、本発明方法で使用したプラスミドpDR42S
は、プロテアーゼIIIだけではなく、それ以外のタンパ
ク質の発現にも使用することができる。従って、本発明
はまた、遺伝子産物の効率的な菌体内発現および分泌を
可能とする発現用ベクター、pDR42Sを提供するものであ
る。
本発明に係る発現用ベクターは、制御可能で発現効率
の高い分泌ベクターとして有用である。この発現用ベク
ターは、tacプロモーターの下流にユニークなBamH I,Xb
a I,Sal I siteをもつので、異種タンパク質をコードす
る遺伝子をBamH I−Sal I断片、Xba I−Sal I断片とし
て挿入することが可能である。また、プロテアーゼIII
のシグナルペプチドをコードする遺伝子を利用して、異
種タンパク質を大腸菌において分泌発現させるには、第
３図に示すように、tacプロモーターの下流に位置するA
fl IIサイトを利用すればよい。この場合、異種タンパ
ク質のアミノ末端と、プロテアーゼIIIのシグナルペプ
チドは、化学合成したオリゴDNAリンカーで連結するこ
とができる。このような方法で、本発明者らは、既にリ
ボヌクレアーゼＨの発現に成功している。
の高い分泌ベクターとして有用である。この発現用ベク
ターは、tacプロモーターの下流にユニークなBamH I,Xb
a I,Sal I siteをもつので、異種タンパク質をコードす
る遺伝子をBamH I−Sal I断片、Xba I−Sal I断片とし
て挿入することが可能である。また、プロテアーゼIII
のシグナルペプチドをコードする遺伝子を利用して、異
種タンパク質を大腸菌において分泌発現させるには、第
３図に示すように、tacプロモーターの下流に位置するA
fl IIサイトを利用すればよい。この場合、異種タンパ
ク質のアミノ末端と、プロテアーゼIIIのシグナルペプ
チドは、化学合成したオリゴDNAリンカーで連結するこ
とができる。このような方法で、本発明者らは、既にリ
ボヌクレアーゼＨの発現に成功している。
第１図は、新規プラスミドベクターpDR42Sの構築過程の
一例を示す概略図である。第２図はpDR42Sの制限酵素切
断地図である。第３図はpDR42Sを利用して異種タンパク
質を分泌発現させるためのプラスミドベクターの構築例
を示す概略図である。
一例を示す概略図である。第２図はpDR42Sの制限酵素切
断地図である。第３図はpDR42Sを利用して異種タンパク
質を分泌発現させるためのプラスミドベクターの構築例
を示す概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (4)
- 【請求項１】tacプロモーター領域、大腸菌プロテアー
ゼIIIのシグナルペプチドをコードしている遺伝子、お
よび大腸菌プロテアーゼIIIの構造遺伝子をこの順序で
含有している大腸菌で複製および発現可能なpUC系のプ
ラスミドベクター。 - 【請求項２】プラスミドpUC18またはpUC19由来の複製起
点を含んでいる第（１）項記載のプラスミドベクター。 - 【請求項３】選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝
子を含んでいる第（１）項または第（２）項に記載のプ
ラスミドベクター。 - 【請求項４】以下に示す制限酵素切断地図で特徴づけら
れる第（１）項に記載のプラスミドベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62218973A JP2518862B2 (ja) | 1987-08-31 | 1987-08-31 | 新規プラスミドベクタ― |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62218973A JP2518862B2 (ja) | 1987-08-31 | 1987-08-31 | 新規プラスミドベクタ― |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6460385A JPS6460385A (en) | 1989-03-07 |
| JP2518862B2 true JP2518862B2 (ja) | 1996-07-31 |
Family
ID=16728262
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62218973A Expired - Lifetime JP2518862B2 (ja) | 1987-08-31 | 1987-08-31 | 新規プラスミドベクタ― |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2518862B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2093717T3 (es) * | 1990-11-08 | 1997-01-01 | Japan Energy Corp | Mutante de hirudina, su produccion, anticoagulante, vector secretor, microorganismo transformado por el indicado vector y produccion de un producto a partir de dicho microorganismo. |
-
1987
- 1987-08-31 JP JP62218973A patent/JP2518862B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５７（１）（１９８４）Ｐ．２１−２７ |
| Ｊ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６３（３）（１９８５）Ｐ．１０５５−１０５９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6460385A (en) | 1989-03-07 |
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