JP2553058B2 - 真核性のバラスト部分を有する融合タンパク質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン−２の最初の100個のアミノ酸と実
質的に一致するＣ−又はＮ−末端部分を有する融合タン
パク質は既に提案されている（西独特許出願第P3,541,8
56,7号明細書）。これらのうちインターロイキン−２部
分は、哺乳類インターロイキン−２、例えば公開第0,09
1,539号の欧州特許出願（以下、“EP−A"と略する）明
細書に開示されているマウス又はラットのインターロイ
キン−２に由来してもよいが、ヒトインターロイキン−
２に由来していることが好ましい。これらの融合タンパ
ク質は驚くべきことに宿主細胞中で安定であって、しか
もそれらの溶解性が低いため、宿主に固有の可溶性タン
パク質から容易に分離することができる。

この発明概念を更に発展させたものとして、インター
ロイキン−２分子の著しく小さな部分がこのタイプの融
合タンパク質の“バラスト（ballast）”部分として適
していることは、驚くべきことに今ここに見出されたの
である。本発明は特許請求の範囲に規定されている。好
ましい態様は以下詳細に説明されている。

EP−Ａ第0,163,249号明細書で開示されかつ表中に記
載されたヒトインターロイキン−２（以下、“IL−2"と
略する）の合成遺伝子から始めることが特に好都合であ
る。この合成遺伝子は、IL−２をコードするDNAを分解
して“扱いやすい（manageable）”セグメントにするた
めのいくつかの独特な制限切断部位を有している。これ
らのセグメントを用い、モジュラー原理（modular prin
ciple）により融合タンパク質のバラスト部分を調節す
ることができるが、得られる融合タンパク質の溶解性が
高いか低いかは、セグメントの組合せと所望のタンパク
質の性質とにかかっている。

このように、本発明では、産物の可能な又は望ましい
生産のために最も有利となるように溶解性を調節するこ
とができ、即ち産物がクロマトグラフィー、例えば抗体
カラムにより精製されるべき場合には高溶解性に、又は
予備精製として宿主に固有の可溶性タンパク質が例えば
遠心分離によって除去されるべき場合には低溶融性に調
節することができる。

本発明の特に有利な点は、非常に小さい“バラスト部
分”を有する融合タンパク質を生産することができるこ
とであって、それにより所望のタンパク質の相対的収率
が著しく増大するようになる。

本発明のもう一つの利点は、“バラスト部分”が、所
望のタンパク質の空間構造をできる限り阻害せず、その
結果例えば折り重なり（folding up）を阻害することの
ないような方法で構成され得る、ということである。

融合タンパク質の切断により、所望のタンパク質ばか
りではなく、所謂IL−２誘導体たる“バラスト部分”も
得られる。これはIL−２活性（Ｔ−細胞増殖試験）を有
していても又はIL−２レセプターに結合していてもよ
い。本発明の“モジュラー原理”は、したがって、多か
れ少なかれある程度のIL−２生物活性を有するIL−２誘
導体を“副産物”として産生することためにも利用する
ことができる。

本発明による融合タンパク質は、第１表のヒトインタ
ーロイキン−２（IL−２）遺伝子のセグメントであっ
て、任意の配列で場合によりアダプター又はリンカー配
列を介して結合した、IL−２遺伝子： （EcoR I）−Ａ−Pst I−Ｂ−Mlu I−Ｃ−Xba I−Ｄ−S
ac I−Ｅ−Pvu I−Ｆ−（Sal I） のセグメントＡおよび更に所望によりセグメントＢ〜Ｆ
のうちの１又は２個の更なるセグメントに対応するＣ−
又はＮ−末端部分を含有することを特徴とするものであ
る。

本発明の特に有利な点は、EP−Ａ第0,163,249号明細
書に記載された合成遺伝子に関して以下に説明されてい
る。この遺伝子は、制限エンドヌクレアーゼEccR Iによ
り５′未満で、Sa1 Iにより３′未満で切断される。こ
のような遺伝子を構成するために使用された酵素Pst
I、Xba I及びSac I用の三つの独特な制限切断部位の他
に、Mlu I及びPvu I用の独特な切断部位が存在している
ことも好ましい。これら切断部位間に存在する配列がＡ
〜Ｆである場合には、合成遺伝子は概略的に （EcoR I）−Ａ−Pst I−Ｂ−Mlu I−Ｃ−Xba I−Ｄ−S
ac I−Ｅ−Pvu I−Ｆ−（Sal I） で示される。

セグメントＡ〜Ｆは、このように本発明のモジュラー
系にとって特に適切な“単位”である。上記表示におい
て、西独特許出願第P3,541,856.7号明細書に記載された
融合タンパク質についての“バラスト部分”はセグメン
トＡ〜Ｅと一致し、同上出願に記載された完全IL−２遺
伝子を含有する２官能性タンパク質についての“バラス
ト部分”はすべてのセグメントＡ〜Ｆと一致する。一
方、本発明の遺伝子構造は、セグメントＡ〜Ｆ、好まし
くはこれらセグメントのうちの４個未満のセグメントか
らなる別の組合せに関するものであるが、ここでセグメ
ントＡは融合タンパク質のＮ−末端をコードしている。
他のセグメント配列は任意的であって、場合により適切
なアダプター又はリンカーが使用される。適切なアダプ
ター又はリンカー配列も“バラスト部分”のＣ−末端に
導入することができるが、この場合において、それらは
酵素的又は化学的に所望のタンパク質からの“バラスト
部分”の切除を可能ならしめ又は促進させるようなアミ
ノ酸又は短鎖アミノ酸配列をコードすることができる。
アダプター又はリンカー配列は、特定の融合タンパク質
についての“バラスト部分”を調節するために、例えば
所望の溶解性を達成するためにも当然利用することがで
きる。これと関連するが、融合タンパク質の溶解性は分
子の大きさとは無関係であり、逆に比較的小さな分子で
あっても低溶融性であることが驚くべきことに判明した
のである。下記諸例中に詳細に説明されているこれらの
関連性から明らかなように、当業者であればさほど実験
上の労苦をすることがなく、小さな“バラスト部分”を
有しかつ特定の望ましい性質を有する本発明の融合タン
パク質を得ることができる。

したがって、所望のタンパク質が真核細胞タンパク質
である場合には、本発明により得られる融合タンパク質
は全面的には又は事実上全面的に真核細胞タンパク質配
列からなる。しかしながら、驚くべきことに、タンパク
質は原核宿主細胞おいて外来タンパク質として認識され
ないため、宿主に固有のプロテアーゼにより急速に分解
されることはない。このような分解は、宿主にとって外
来でありかつ細菌中で発現すべきcDNA配列によってコー
ドされるタンパク質の場合に特に頻発する。cDNA配列が
本発明のセグメント中に“埋め込まれ”ている場合にこ
のcDNA配列は極めて効果的に発現し得ることが今ここに
判明したのである。cDNA配列に関していくつかのクロー
ニング部位を有するポリリンカー配列を本発明の配列中
に含有する特定のベクターを上記目的のために製造する
ことができる。複製されたcDNAが停止コードンを有して
いない場合には、cDNA配列によりコードされるポリペプ
チド配列はＣ−末端セグメントがコードするポリペプチ
ドによって付加的に保護される。

融合タンパク質は化学的又は酵素的に自体公知の方法
により切断することができる。適切な方法をいかに選択
するかは、特に所望のタンパク質のアミノ酸配列にかか
っている。後者が例えばメチオニンを有していない場合
には、結合要素はMetを表わすことができ、このときに
は塩化もしくは臭化シアンによる化学的切断が行なわれ
る。結合要素のカルボキシル末端にシステインが存在す
る場合、即ち結合要素がCysを表わす場合には、例えば
特異的Ｓ−シアニル化後にシスティン特異性の酵素的切
断又は化学的切断を行なうことができる。結合要素のカ
ルボキシル末端にトリプトファンが存在する場合、即ち
結合要素がTrpを表わす場合には、Ｎ−プロモスクシン
イミドによる化学的切断が行われる。

自己のアミノ酸配列中にちAsp−Proを有せず、かつ酸
に対して十分に安定である所望のタンパク質は、融合タ
ンパク質が上記結合要素を有する場合に、自体公知の方
法によってタンパク質分解により切断することができ
る。その結果、Ｎ−末端にプロリンを有するか又はＣ−
末端にアスパラギン酸を有するタンパク質が得られる。
したがって、この方法により改変タンパク質を合成する
こともできる。

この結合要素（Asp）_ｎ−Pro又はGlu−（Asp）_ｎ−Pr
oであり、ｎが１〜３を表わす場合には、Asp−Pro結合
は酸に対する安定が低くなることがある。

酵素的切断の例も同様に公知であり、改善された特異
性をもつ改変酵素を使用することもできる〔C.S.Craik
et al.,Science 228（1985）291−297参照〕。所望の真
核細胞ペプチドがプロインシュリンである場合に選択さ
れる配列は、トリプシンによる切断が可能なアミノ酸
（Arg、Lys）がプロインシュリンのＮ−末端アミノ酸
（Phe）結合しているペプチド配列、例えばAla−Ser−M
et−Thr−Argであることが有利であるが、その理由はこ
の場合においてアルギニン特異的切断がトリプシンプロ
テアーゼによって行ない得るからである。

所望のタンパク質がアミノ酸配列： Ile−Glu−Gly−Arg を有していない場合には、適切な結合要素を有する融合
タンパク質はXa因子により切断することができる（EP−
Ａ第0,025,190号及び第0,161,973号明細書）。

融合タンパク質は、自体公知の方法により適切な発現
系で発現させることによって得られる。すべての公知の
宿主−ベクター系、即ち、例えば哺乳類細胞及び、酵
母、好ましくは細菌、特に大腸菌等の微生物はかかる目
的のために適している。

所望のタンパク質についてコードするDNA配列は、選
択された発現系での満足すべき発現を確実化するベクタ
ー中に公知の方法で組込まれる。

細胞宿主においては、lac、tac、trp、ファージλのP
_LもしくはP_R、hsp、omp又は例えば西独特許公開第3,43
0,683号（EP−Ａ第0,173,149号）明細書で開示されてい
るような合成プロモーターからなる群よりプロモーター
及びオペレーターを選択することが有利である。tacプ
ロモーター−オペレーター配列が有利であり、現在市販
されている〔例えば、発現ベクターpKK233−３、ファル
マシア（Pharmacia）、“Molecular Biologicals,Chemi
cals and Equipment for Molecular Biology"1984年、
第63頁〕。

本発明による融合タンパク質の発現に際し、mRNAレベ
ルでの塩基の対合を阻止するために、ATG開始コードン
下流の最初の数個のアミノ酸に関して個々のトリプレッ
トを改変することが有利のようである。このタイプの改
変は、IL−２タンパク質部分における個々のアミノ酸の
改変、削除又は付加と同様に、当業者にとって周知であ
り、本発明は同様にそれらにも関する。望ましくないジ
スルフィド結合の形成を防止するためのシスティンの削
除又は他のアミノ酸によるシスティンの置換は、例えば
EP−Ａ第109,748号明細書に開示されているように、例
示として述べられている。

第１〜13図は、同一番号の例中に記載された合成方法
を工程図により説明するものである。理解を容易化させ
るために、出発物質及び中間体の製造法は第14A〜14C図
に示されている。明確化のため、第１〜13図の参照番号
はそれぞれ別の新しい10位から始まり、第１図では（1
1）から始まる。本発明では言及していない出発物質の
参照番号は０で終わり、したがって例えば第２図では
（20）となる。図は縮尺通りでは描かれておらず、特に
尺度はポリリカー配列領域において適度に拡大されてい
る。IL−２配列は太線で示されており、所望のタンパク
質についての構造遺伝子は他の方法で強調されている。

本発明は下記諸例中で詳細に説明されており、その例
の番号は図の番号と一致する。他に記載のない限り、％
は重量に関する。

例Ａ（第14A図参照） 出発プラスミドp159/6はEP−Ａ第0,163,249号明細書
（第５図）に記載されている。そこで“IL−2"として又
は本明細書中“DNA配列L"として記載されている配列
は、酵素EcoR I、Pst I、Mlu I、Xba I、Sac I、Pvu I
及びSal Iの切断部位を介して結合したセグメントＡ〜
Ｆとして第14A図では分けられている。適切な酵素で二
重切断すると、セグメント（Ａ）〜（Ｆ）又は隣接セグ
メントが得られ、例えばEcoR I及びMlu Iによるとセグ
メント（A,B）が得られる。

例Ｂ（第14B図参照） 発現プラスミドpEW1000の製造法は（公開前の）西独
特許出願第P3,541,856.5号明細書（第１図）に開示され
ている。このプラスミドはプラスミドptac11〔Amann et
al.,Gene 25（1983）167−178〕の誘導体であり、その
EcoR I認識部位にSal I切断部位含有合成配列が組込ま
れたものである。このようにして発現プラスミドpKK17
7.3が得られる。1acリプレッサー〔Farabaugh,Nature 2
74（1978）765−769〕の挿入によりプラスミドpJF118が
得られる。これをAva Iの唯一の制限切断部位で開環
し、公知の方法でエキソヌクレアーゼ処理して約1000bp
短縮して、縮合させる。それによってプラスミドpEW100
0を得る。酵素EcoR I及びHind III、Sal I、Pst Iもし
くはSma Iによりポリリンカー中でこのプラスミドを開
環し、直鎖発現プラスミド（Ex1）、（Ex2）、（Ex3）
及び（Ex4）を得る。

例Ｃ（第14図Ｃ図参照） 市販プラスミドpUC12をEcoR I及びSal Iで置換し、直
鎖プラスミド（１）を分離する。（１）をセグメント
（Ａ）、合成リンカー配列（２）及びセグメント（Ｆ）
と結合して、プラスミドpW226（３）を得る。

大腸菌79/02株を公知の方法により結合混合体由来プ
ラスミドDNAで形質転換する。細胞をイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドミル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（Ｘ−gal）及びアンピシリン（Ap）20μg/ml含有
寒天プレート上で培養する。プラスミドDNAを白色クロ
ーンから得、プラスミド（３）の形成を制限分析及びDN
A配列分析により確認する。

小さなEcoR I−Hind IIIフラグメント（４）をプラス
ミド（３）から切断し、分離する。このフラグメントを
T4DNAリガーゼ反応により直鎖発現プラスミド（Ex1）と
結合する。得たプラスミドpW226−１（５）を制限分析
により確認する。

大腸菌Mc1061株のコンピテント細胞をプラスミドpW22
6−１由来DNAで形質転換する。アンピシリン耐性クロー
ンをAp含有寒天プレート上で分離する。プラスミドDNA
をMc1061細胞から再分離し、しかる後制限分析により再
度確認する。大腸菌W3110株コンピテント細胞を大腸菌M
c1061細胞から分離したプラスミドDNAで形質転換する。
大腸菌W3110細胞を以後常に発現用とし使用する。以後
の諸例中でのすべての発現実験は下記条件で行なわれ
る。

プラスミド（５）含有大腸菌細胞の一夜培養物をアン
ピシリン50μg/ml含有LB培地〔J.H.Miller,Experments
in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laborator
y,1972〕で約1:100の比に希釈し、増殖を吸光度測定に
より追跡する。吸光度が0.5のときに培養物をIPTG中1mM
に調整し、150〜180分間後細菌を沈降させる。細菌を５
分間混合緩衝液（7M尿素、0.1％SDS、0.1Mリン酸ナトリ
ウム、pH7.0）中で沸騰させ、試料をSDSゲル電気泳動プ
レートに塗布する。電気泳動後、プラスミド（５）含有
細菌は予期されたタンパク質の大きさ（6KD）に相当す
るタンパク質バンドを生じる。

以上の誘導条件は、培養物を振盪する場合に妥当す
る。大規模発酵の場合では、吸光度を適度に変更しかつ
適切であればIPTG濃度をわずかに変更することが有利で
ある。

得られたタンパク質はIL−２依存細胞系（CTLL2）で
の細胞増殖試験において生物活性を示されない。

例 １ プラスミド（３）をMlu I及びSal Iで開環し、得られ
た二つのフラグメントをゲル電気泳動により分離する。
大きなフラグメント（11）を分離する。

合成オリゴヌクレチオド（12）をプロインシュリンを
コードするブラント末端DNA（13）〔Wetekam el al.,Ge
ne 19（1982）179−183〕と結合して、DNA配列（14）を
得る。後者をMlu I及びSal Iで切断し、これによりDNA
配列（15）を得る。後者をフラグメント（11）と結合し
て、プラスミドpKH40（16）を形成する。後者を制限分
析により確認する。

プラスミド（16）をEcoR I及びHind IIIで消化し、小
さなフラグメント（17）をゲル電気泳動により分離す
る。直鎖状とした発現プラスミド（Ex1）と結合して、
発現プラスミドpK40（18）を得る。例Ｃで示す発現によ
り、細胞破壊後の細胞性タンパク質の可溶性画分に存在
するタンパク質を得る。プロインシュリン配列が完全で
あることを証明するために、ウェスターンブロット法を
利用する。

例 ２ 出発物質はプラスミドpPH30であるが、これは（未公
開の）西独特許出願第P3,541,856.7号明細書中の第3c図
に示されている。本発明での意味の範囲内において、第
２図のIL−２部分配列は“Ａ−E"（20）として示されて
いる。この配列の末端から結合要素及びプロインシュリ
ン配列までは第２図中（20a）として示されている。

プラスミド（20）をPvu I及びHind IIIで消化し、小
さなフラグメント（22）を分離する。更に、プラスミド
（３）をEcoR I及びPvu Iで開環し、小さなフラグメン
ト（23）を分離する。しかもベクターpUC12をEcoR I及
びHind IIIで切断し、大きなフラグメント（21）を分離
する。フラグメント（21）、（23）及び（22）を結合し
て、プラスミドpSL11（24）を得る。

プラスミド（24）をHind IIIで及び部分的にEcoR Iで
切断し、セグメントＡ及びプロインシュリン遺伝子含有
フラグメント（25）を分離する。（25）を直鎖状とした
発現プラスミド（Ex1）に結合して、発現プラスミドpSL
12（26）を得る。

例Ｃで示される発現及びその後の操作により、可溶性
融合タンパク質を得る。インシュリン抗体でのウェスタ
ーンブロット分析により、このタンパク質が完全なイン
シュリン配列を有していることを確認する。

例 ３ プラスミドptrpED5−１（30）〔Hallewell et al.,Ge
ne 9（1980）27−47〕をプロインシュリン遺伝子の増幅
用に使用するプラスミドをHind III及びSal Iで開環し
て、大きなフラグメント（31）を分離する。フラグメン
ト（31）をDNA配列（14）と結合して、プラスミドpH106
/4（32）を得る。

プラスミド（32）をSal I及びMlu Iで消化して、小さ
なフラグメント（15）を分離する。直鎖状として発現プ
ラスミド（Ex2）、セグメント（A,B）及びフラグメント
（15）を結合して、発現プラスミドpK50（33）を得る。

コードされた融合タンパク質の発現を例Ｃで示したよ
うに行なう。細胞を培養ブイヨン中から沈降させ、フレ
ンチプレス（French press）で破壊する。タンパク質懸
濁物を遠心分離し、その可溶性及び不溶性の漁タンパク
質成分に分離する。二つの画分を公知の方法で17.5％SD
Sポリアクリルアミドゲルのゲル電気泳動に対し、しか
る後タンパク質をクマシー（Coomassie）ブルー染料で
染色することにより分析する。驚くべきことに、融合タ
ンパク質は不溶性沈降物中に存在していることが判明し
た。インシュリン抗体でのウェスターンブロット法分析
により、完全プロインシュリンが融合タンパク質中に存
在していることを確認する。

フレンチプレス破壊による沈降物は更にプロインシュ
リン分離用として直ちに使用することができる。

例 ４ 出発物質はプラスミドpPH20（40）であり、これは西
独特許出願第P3,541,856.7号明細書の第3c図に記載され
ている。このプラスミドをEcoR Iで切断し、突出端を埋
填し、Hind IIIで切断してフラグメント（41）を得る
が、そこには本発明において重要な（40）の一部のDNA
配列が存在している。

直鎖状として発現プラスミド（Ex4）をセグメント
（A,B）、合成オリゴヌクレオチド（42）及びフラグメ
ント（41）と結合して、プラスミドpK51（43）を得る。

例 ５ 直鎖状にした発現プラスミド（Ex2）をセグメント
（A,B）、合成オリゴヌクレオチド（51）及びDNA配列
（15）と結合して、プラスミドpK52（52）を得る。オリ
ゴヌクレオチド（51）の正確な配向性を配列分析により
確認する。このプラスミドは、オリゴヌクレオチド（5
1）に対向するアミノ酸配列を含有する融合タンパク質
をコードしており、このため活性因子Xaで切断すること
ができる。

プラスミド（52）は、下記方法によっても得ることが
できる。

プラスミド（33）をMlu Iで部分的に切断し、得られ
た開環プラスミド（53）をDNA配列（51）と結合して、
同様にプラスミドpK52を得る。

例 ６ プラスミド（43）をMlu Iで部分的に切断し、得られ
た直鎖状プラスミド（61）を合成DNA配列（51）と結合
して、プラスミドpK53（62）を得る。後者は、活性因子
Xaで切断することができる融合タンパク質を同様にコー
ドしている。配列（51）の正確な配向性を例５のように
DNA配列分析により確認する。

例 ７ プラスミド（26）をXba Iで及び部分的にMlu Iで切断
して、大きなフラグメント（71）を分離する。セグメン
ト（Ｃ）と結合させてプラスミドpSL14（72）を得る。
発現及び細胞破壊後、融合タンパク質は細胞性タンパク
質の可溶性画分中に存在する。

例 ８ プラスミド（20）をXba Iで部分的に及びEcoR Iで切
断し、突出端を埋填して、DNA配列（81）を得る。ブラ
ント末端条件下で結合させてプラスミドpPH31（82）を
得る。融合タンパク質は、細胞性タンパク質の不溶性画
分中に存在する。

例 ９ 使用する出発物質はEP−Ａ第0,171,024号明細書（第
３図）に記載されたプラスミド（90）である。このプラ
スミドをSal Iしかる後Acc Iと反応させて、小さなフラ
グメント（91）を分離する。後者を合成オリゴヌクレオ
チド（92）と結合して、DNA配列（93）を得る。後者をM
lu Iで切断して、DNAフラグメント（94）を得る。

プラスミド（33）をMlu Iで部分的に及びSal Iで消化
して、大きなフラグメント（95）を分離する。後者をDN
A配列（94）と結合して、発現プラスミドpK192（96）を
得る。後者は、IL−２の最初の38個のアミノ酸の後にメ
チオニン次いでヒルジンアミノ酸配列が続く融合タンパ
ク質をコードするものである。融合タンパク質は、細胞
性タンパク質の可溶性画分中に存在する。

例10 使用する出発物質はプラスミドpHG23（100）であり、
これはEP−Ａ第0,183,350号明細書に記載されており、
アメリカン・タイプ・カルチァー・コレクション（Amer
ican Type Culture Collection）の寄託番号ATCC39000
号として一般的に入手できる。このプラスミドをSfaN I
で切断し、突出端を埋填し、しかる後Pst Iとの反応を
行ない、小さなフラグメント（101）を分離する。直鎖
状発現プラスミド（Ex3）をセグメント（A,B）、合成オ
リゴヌクレオチド（102）及びフラグメント（101）を結
合して、発現プラスミドpW214（108）を得る。このプラ
スミドは、IL−２の最初の38個のアミノ酸の後に、オリ
ゴヌクレオチド（102）由来であってかつXa因子で分子
を切断させ得る配列、次いでCSFアミノ酸配列が続く融
合タンパク質をコードするものである。細胞破壊後、融
合タンパク質は細胞性タンパク質の不溶性画分中に存在
する。

例11 出発物質pW216（110）は、西独特許出願第P3,545,56
8.3号明細書（第2b図）に開示されている。このプラス
ミドでは、セグメントＡ〜Ｅ（Pvu I切断部位）に相当
するIL−２配列の後に、アミノ酸Asp−Asp−Proをコー
ドするリンカー、すぐその後にCSFアミノ酸配列、が続
いている。IL−２及びCSF間の結合配列により、融合タ
ンパク質をタンパク質分解によって切断することができ
る。

配列（111）を、Pvu I及びHind IIIで切断することに
より、プラスミド（110）から分離する。

プラスミド（３）をMlu I及びXba Iで切断して、大き
なフラグメント（112）を分離する。後者をセグメント
（Ｃ）と結合して、プラスミドpW227（113）を得る。こ
のプラスミドをEcoR I及びHind IIIと反応させ、短鎖フ
ラグメント（114）を分離する。このフラグメントが直
鎖状発現プラスミド（Ex1）と結合している場合には、
プラスミドpW227−１（115）が得られる。プラスミド
は、IL−２由来ではあるもののIL−２活性を有していな
いタンパク質をコードするものである。

プラスミド（113）を更にEcoR I及びPvu Iで切断し、
短鎖フラグメント（116）を分離する。直鎖状発現フラ
グメント（Ex1）をフラグメント（116）及び（111）と
結合して、発現プラスミドpW233（117）を得る。後者は
不溶性融合タンパク質をコードしているが、この融合タ
ンパク質は上記リンカーの存在によりタンパク質分解に
よって切断することができる。

例12 プラスミド（３）をXba I及びSac Iで切断し、大きな
フラグメント（121）を単離する。セグメント（Ｄ）と
結合させてプラスミドpW228（122）を得る。後者をEcoR
I及びHind IIIで切断して、小さなフラグメント（12
3）を分離する。直鎖状発現プラスミド（Ex1）をフラグ
メント（123）と結合させて発現プラスミドpW228−１
（124）を得る。このプラスミドは生物学的に不活性のI
L−２誘導体をコードしている。プラスミドをEcoR I及
びPvu Iで消化して、短鎖フラグメント（125）を分離す
る。直鎖状発現プラスミド（Ex1）をフラグメント（12
5）および（111）と結合させて、発現プラスミドpW234
（126）を得る。後者は難溶性融合タンパク質をコード
しており、この融合タンパク質も同様にタンパク質分解
によって切断することができる。

例13 適切なプラスミドの製造のために、特にcDNA配列の発
現のために、まずポリリンカー配列（131）を合成す
る。

直鎖状プラスミド（１）をセグメント（Ａ）、ポリリ
ンカー配列（131）及びセグメント（Ｆ）と結合させ
て、プラスミドpH200（132）を得る。

プラスミド（132）をEcoR I及びMlu Iと反応させて、
大きなフラグメント（133）を分離する。後者をセグメ
ント（A,B）と結合して、プラスミドpH201（134）を得
る。

プラスミド（134）をEcoR I及びHind IIIと反応さ
せ、短鎖フラグメント（135）を分離する。このフラグ
メントを直鎖発現プラスミド（Ex1）と結合し、発現プ
ラスミドpH202（136）を得る。

プラスミド（136）をBamH Iで閉環し、発現すべきcDN
Aを直鎖プラスミド中に市販BamH Iアダプターを介して
組込む。cDNAの配向性に従い、すべての第三の配列が読
取り枠中で（A,B）と結合している。cDNAB配列が停止コ
ードンを有していない場合には、それがコードするポリ
ペプチド配列はセグメント（Ｆ）に対応するアミノ酸配
列によって付加的に保護されている。

cDNAが正しい読取り枠中に結合していない場合には、
読取り枠の移動は、例えばcDNA含有（最初の又は複製さ
れた）プラスミドをMlu I又はXba Iで切断し（cDNAがこ
れら酵素の切断部位を有していないときに限る）、クレ
ノウポリメラーゼ反応により突出端を埋填することによ
って行なわれる。

【図面の簡単な説明】

第１図はpUC12誘導体たるpKH40及び発現プラスミドpK40
の製造法を示すフローシートである。これらのプラスミ
ドは、セグメントＡに対応するタンパク質配列、即ちIL
−２の最初の22個のアミノ酸の後に、結合要素Thr−Ar
g、次いでプロインシュリンアミノ酸配列が続く融合タ
ンパク質をコードしている。 第２図は、プラスミドpSL11及び発現プラスミドpSL12の
製造を示す説明図である。これらのプラスミドは、セグ
メントＡの後にポリリンカー配列（２）及び（20a）に
相当する結合要素次いでプロインシュリンアミノ酸配列
が続くポリペプチドをコードしている。 第３図は、発現プラスミドpK50の構造を示す説明図であ
る。このプラスミドは、セグメントＡ及びＢ、即ちIL−
２の最初の38個のアミノ酸、に直接プロインシュリンア
ミノ酸配列が続くポリペプチドをコードしている。 第４図は、発現プラスミオpK51の構造を示す説明図であ
る。このプラスミドは、セグメントＡおよびＢの後に配
列（42）及び（41）に相当する結合要素、次いでプロイ
ンシュリンアミノ酸配列、が結合したポリペプチドをコ
ードしている。 第５図は、Mlu Iリンカー（51）が挿入されている点でp
K51と異なる発現プラスミドpK52の構造を示す説明図で
ある。このプラスミドは、Xa因子で切断されるアミノ酸
配列をコードしている。pK52は、Mlu Iで切断しかつ上
記Mlu Iリンカーを組込むことによって、pK50（第３
図）からも得ることができるものである。 第６図は、Mlu Iリンカーの同様の組込みによってpK51
（第４図）から得られる発現プラスミドpK53の構造を示
す説明図である。 第７図は、フラグメントＣのポリリンカーへの組込みに
よってpSL12（第２図）から得られる発現プラスミドpSL
14の構造を示す説明図である。それにより、セグメント
ＣがセグメントＡに直接接合することになる。下記ポリ
リンカーにおいて、最初の２個のアミノ酸（いずれもGl
u）はIL−２の60位及び61位のアミノ酸と一致する。し
たがって、IL−２部分は１〜22位及び37〜61位のアミノ
酸からなる。その後のアミノ酸配列は、プラスミドpSL1
2（第２図）によりコードされたアミノ酸配列と一致す
る。 第８図は、発現プラスミドpPH31の構造を示す説明図で
ある。このプラスミドは、セグメントＡ〜Ｃの後に配列
（81）で示される結合要素、次いでプロインシュリンア
ミノ酸配列、が続く融合タンパク質をコードしている。 第９図は、プラスミドpK192の構造を示す説明図であ
る。このプラスミドは、セグメントＡ及びＢの後にメチ
オニン、次いでヒルジンアミノ酸配列、が続く融合タン
パク質をコードしている。 第10図は、プラスミドpW214の構造を示す説明図であ
る。このプラスミドは、セグメントＡ及びＢの後にXa因
子で切断されるアミノ酸配列、次いで顆粒球／マクロフ
ァージコロニー刺激因子（CSF）アミノ酸配列、が続く
融合タンパク質をコードしている。 第11図は、発現プラスミドpW233の構造に示す説明図で
ある。このプラスミドは、セグメントＡ及びＣ（IL−２
の１〜22位及び37〜61位のアミノ酸と一致する）の後に
結合要素Leu−Thr−Ile−Asp−Asp−Pro、次いでCSFの
アミノ酸配列、が続く融合タンパク質をコードしてい
る。 第12図は、発現プラスミドpW234の構造を示す説明図で
ある。このプラスミドは、次のアミノ酸配列：即ち、セ
グメントＡ（１〜22位のアミノ酸）の後に結合要素Thr
−Arg、次いでセグメントＤ（IL−２の59〜96位のアミ
ノ酸）、もう一つの結合要素Thr−Asp−Asp−Pro、及び
最後にCSF、が続く融合タンパク質をコードしている。 第13図は、プラスミドpH200及びpH201、並びに発現プラ
スミドpH202の構造を示す説明図である。これらのプラ
スミドは、セグメントＡ−Ｆ間又はA,B−Ｆ間にポリリ
ンカーを有しており、その多数の切断部位に外来DNAを
組込んでこれを複製することができる。これらのプラス
ミドは、cDNA配列を複製するために特に適している。 第14A図は、本発明のセグメントＡ〜Ｆ並びにセグメン
トＡ及びＢの組合せについての概略図である。出発物質
はプラスミドp159/6であって、その製造法はEP−Ａ第0,
163,249号明細書で詳細に記載されており、しかもその
プラスミドは該公報の第５図で規定されている。 第14B図は発現プラスミドpEW1000を示す説明図である。
このプラスミドの製造法は西独特許出願第P3,541,856.7
号明細書に記載されかつその第１図に示されている。こ
のプラスミドは適切な二重切断によってポリリンカー配
列中で開環され、それにより直鎖プラスミド（Ex1）〜
（Ex4）が得られる。 第14C図はpUC12誘導体たるpW226及び発現プラスミドpW2
26−１の製造法を示す説明図である。いずれのプラスミ
ドもポリリンカー配列から分離されたセグメントＡ及び
Ｆを有している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】第１表のヒトインターロイキン−２（IL−
   ２）遺伝子のセグメントであって、任意の配列で場合に
   よりアダプター又はリンカー配列を介して結合した、IL
   −２遺伝子： （EcoR I）−Ａ−Pst I−Ｂ−Mlu I−Ｃ−Xba I−Ｄ−S
   ac I−Ｅ−Pvu I−Ｆ−（Sal I） のセグメントＡおよび更に所望によりセグメントＢ〜Ｆ
   のうちの１又は２個の更なるセグメントに対応するＣ−
   又はＮ−末端部分を含有する融合タンパク質。
2. 【請求項２】IL−２配列と所望のタンパク質アミノ酸配
   列との間に、化学的又は酵素的にIL−２部分から所望の
   タンパク質を切除し得るアミノ酸又はアミノ酸配列が存
   在している、特許請求の範囲第１項に記載の融合タンパ
   ク質。
3. 【請求項３】アミノ酸がMet、Cys、Trp、LysもしくはAr
   gであるか、又はアミノ酸配列がＣ−末端にこれらアミ
   ノ酸を有している、特許請求の範囲第２項記載の融合タ
   ンパク質。
4. 【請求項４】アミノ酸配列がAsp−Proであるか、又はＣ
   末端にこのアミノ酸配列を有する、特許請求の範囲第３
   項記載の融合タンパク質。
5. 【請求項５】アミノ酸配列がIle−Glu−Gly−Argである
   か、又はＣ−末端にこのアミノ酸配列を有する、特許請
   求の範囲第３項記載の融合タンパク質。
6. 【請求項６】宿主細胞中で下記の融合タンパク質をコー
   ドする遺伝子を発現させることからなる、融合タンパク
   質の生産法。 第１表のヒトインターロイキン−２（IL−２）遺伝子の
   セグメントであって、任意の配列で場合によりアダプタ
   ー又はリンカー配列を介して結合した、IL−２遺伝子： （EcoR I）−Ａ−Pst I−Ｂ−Mlu I−Ｃ−Xba I−Ｄ−S
   ac I−Ｅ−Pvu I−Ｆ−（Sal I） のセグメントＡおよび更に所望によりセグメントＢ〜Ｆ
   のうちの１又は２個の更なるセグメントに対応するＣ−
   又はＮ−末端部分を含有する融合タンパク質。
7. 【請求項７】遺伝子を発現ベクター中に組込んで、細菌
   細胞中で発現させる、特許請求の範囲第６項記載の方
   法。
8. 【請求項８】使用される細菌細胞が大腸菌である、特許
   請求の範囲第７項記載の方法。