JP2525664B2

JP2525664B2 - コレステロ―ル誘導体およびそれを用いるリポソ―ムの製造方法

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Publication number: JP2525664B2
Application number: JP1020355A
Authority: JP
Inventors: 光則小野
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1989-01-30
Filing date: 1989-01-30
Publication date: 1996-08-21
Anticipated expiration: 2011-08-21
Also published as: JPH02200699A

Description

【発明の詳細な説明】（発明の分野）本発明は、安定なリポソームの製造に有用な、コレス
テロール誘導体およびそれを用いるリポソームの製造方
法に関する。

（従来の技術）リポソームは通常水性物質により相互に一定の間隔を
保った多数のリン脂質二層からなる（小胞と言われる）
ことが知られている。近年かようなリポソームを薬剤の
運搬体として応用しようとする試みが多数報告されてい
る。（例えば、G.Gregoviadis,New Engl.J.Med.,295,76
5（1976））。

しかし薬剤の運搬体として利用するに際し、大きな欠
点が指摘されてきた。即ち、非共有結合性相互作用によ
る分子集合体であるという宿命ゆえの構造の不安定性、
薬剤のもれ現象である。

従来、この点を改良する目的で、たとえば多糖で被覆
したリポソームの製法（特開昭61−69801号）や、水素
結合によって構造強化されたリン脂質（日本化学会誌、
569頁、1987年）が開発されている。また従来から天然
のステロール類を脂質膜に混合すると、膜が強化される
ということは、よく知られている事実である。

しかし未だ充分とは言いがたく、効果的な方法の開発
が強く望まれているのである。

（発明の目的）本発明の目的は、内包する薬物のもれが少なく、かつ
凝集を起こさない安定なリポソームの製造を可能にする
コレステロール誘導体とそれを用いたリポソームの製造
方法を提供することである。

（発明の構成）本発明の目的は、下記１で表わされるコルステロール
誘導体およびリポソーム膜を脂質および式１で示される
コレステロール誘導体より構成することを特徴とするリ
ポソーム膜の製造方法によって達成された。

式１において、ｎは１〜４の整数を表わす。好ましく
は、１〜２である。

Ｘは連結基を表わす。好ましい連結基としては、−CH
₂−基、が挙げられる。特にが好ましい。

Ｙはカルボキシ基、スルホ基、あるいはそれらの塩を
表わす。

次に式１で示される具体例を列挙するが、本発明の範
囲はこれらに限定されるものではない。

なお、以下においてリポソームを形成させるために用いるリン脂質として
は、卵黄、大豆あるいはその他の動・植物に由来するホ
スフアチジルコリン、ホスフアチジルエタノールアミ
ン、ホスフアチジルイノシトール、ホスフアチジルセリ
ン、スフィンゴミエリンや、合成によって得られるジパ
ルミトイルレシチン、ジステアロイルレシチン、ジミリ
ストイルレシチン等を挙げることができる。

次にリポソームに取りこませる親水性薬物としては例
えばアドリアマイシン、アクチノマイシン、マイトマイ
シン、１−β−アラビノフラシルシトシン、ブレオマイ
シン、シスプラチン等の抗がん剤、インターフェロン等
の抗ウィルス剤、アミノ配糖体（例えば、ゲンタマイシ
ン）、β−ラクタム系（例えばスルペニシリン、セフォ
チアム、セフメノキシム）糖の抗生物質、TRH、リュウ
ブロライド、インスリン等のペプチドホルモン剤、リゾ
チーム、アスパラギナーゼ、グリコシダーゼ等の酵素
剤、ムラミルジペプチド、ムラミルトリペプチド等の免
疫賦活剤、イムノグロブリン、各種トキシン等の蛋白質
が挙げられる。

本発明に係るリポソーム製剤中の式１で表わされる化
合物の配合量は特に限定はないが、好ましくは、リポソ
ームを形成し得る複合リン脂質１に対し0.1〜1.0（重量
比）の配合比である。

また天然のステロール等の添加物を混合してもよい
（例えば、コルステロール、β−シトステロール、スチ
グマステロール、カンベステロールなど）。

式１で表わされる化合物とリン脂質を用いてリポソー
ムを形成させるには通常のリポソーム形成法すなわちボ
ルテクスイング法〔A.D.Bangham,J.Mol.Biol.,13、238
（1965）、ソニケーション法（C.Huang,Biochem.,８、3
44（1969）〕、プレベシクル法〔H.Trauble,Neurosci.R
es.Prog.Bull.,９、273（1971）〕、エタノール注入法
〔S.Batzri,Biochem.Biophys.Acta.,298、1015（197
3）〕、フレンチプレス押出法〔Y.Barenhollz.,FEBS.Le
tt.,99、210（1979）〕、コール酸除去法〔Y.Kagawa,J.
Biol.Chem.,246、5477（1971）〕、トリトンＸ−100バ
ッチ法〔W.J.Gerritsen,Eur.J.Biochem.,85、255（197
8）〕、Ca²⁺融合法〔D.PaPahadjopoulos,Biochem.Bioph
ys.Acta.394、483（1975）〕、エーテル注入法〔D.Deam
er,Biochem.Biophys.Acta.,443、629（1976）〕、アニ
ーリング法〔R.Lawaczeck,Biochem.Biophys.Acta,443、
313（1976）〕、凍結融解融合法〔M.Kasahara.J.Biol.C
hem.,252、7384（1977）〕、W/O/Wエマルジョン法〔S.M
atsumoto,J.Colloid Interface Sci.,62、149（197
7）〕、逆相蒸発法〔F.Szoka,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
75、4194（1978）〕など多くの方法が知られているが、
本発明では上記いずれの調製法を用いてもよくまたこれ
らに限定されるものではない。

（発明の効果）本発明の化合物は、脂質を水中に分散させた時に形成
されるリポソームの内包物のもれを少なくするのに有効
な化合物である。本発明の化合物の基本骨格であるコレ
ステロールそれ自体も脂質に適当量混合することで、リ
ポソームのくさびとして働らき（いわゆるcondensing e
ffect）リポソーム膜を強固にする作用があることは、
よく知られている事実である。本発明の誘導体は特定の
官能基を導入したことにより、このcondensing effetに
加え、安定化の重要な要因となるリポソーム膜表面の水
素結合体に作用し、分子間で水素結合をより強固に行な
わせることができる。

実施例１例示化合物Ｃ−１の合成グリシンメチルエステル塩酸塩2.5g（0.02モル）をテ
トラヒドロフラン100mlに加え、その中にトリエチルア
ミンを6g（0.06モル）を加え室温で10分間かくはんし
た。その中にコレステリルクロロホルメート（市販品）
8.9g（0.02モル）を少しづつ加え、室温にて２時間かく
はんした。テトラヒドロフランを減圧留去後酢酸エチル
と水を加え、酢酸エチルにて、水層をくり返し抽出し
た。酢エチ層を塩水にて洗い、Na₂SO₄にて乾燥した。溶
媒を留去後、粗結晶をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーにて精製（溶離液：クロロホルム：ヘキサン＝1:1
6）し得られた結晶をエタノールから再結晶すると、目
的とするエステル体３が8.7g得られた。

エステル体３（5.0g;0.01モル）をメタノール100mlに
加熱して溶解し、その中にKOH（1.2g;0.02モル）水溶液
50mlを入れ40℃に加温し６時間かくはんした。希塩酸で
注意深く酸性化した後、酢エチにてくり返し抽出した。

酢エチ層をNa₂SO₄にて乾燥後溶媒を留去して得られた
白色結晶をメタノール／酢酸エチルにて再結晶すると例
示化合物Ｃ−１（m.p.210℃分解）を3.4g得た。

実施例２例示化合物Ｃ−２の合成 β−アラニン8.9g（0.1モル）とNaHCO₃16.8g（0.2モ
ル）を水20ml中に溶解するエタノール200mlを加え、そ
の中にコレステロールクロロホルメート45gをエタノー
ルとテトラヒドロフラン（2:1）の混合溶媒300mlに溶か
した溶液を滴下する。

１時間かくはんした後希塩酸で酸性化し溶媒を減圧留
去する。残さにクロロホルムを加えて不溶物を濾去し、
クロロホルム層を減圧留去する。得られた結晶をヘキサ
ン／エタノールから２回再結晶すると目的とする例示化
合物Ｃ−２が28g得られた。m.p.134℃。

実施例４例示化合物Ｃ−４の合成コレステロール3.9g（0.01モル）のエーテル溶液150m
l中に、NaH（60％含量油中分散物）400mg（0.01モル）
を加え、室温にて30分間かくはんする。その中に無水コ
ハク酸1.0g（0.01モル）のエーテル溶液20mlを滴下す
る。滴下後１時間室温にてかくはんする。希塩酸で酸性
化後、エーテルを減圧留去し、残さをヘキサン／エタノ
ールにし再結晶すると目的の例示化合物Ｃ−４が3.5g得
られた。m.p.95℃ 実施例５例示化合物Ｃ−５の合成化合物２（1.03g:0.01モル）をテトラヒドロフランEt
OH（3:1）の混合溶媒系に溶解しトリエチルアミン（3g;
0.03モル）を加え、10分間、室温にてかくはんした。こ
の中に１を4.5g（0.01モル）加え、室温にて３時間かく
はんした。反応終了後、溶媒を減圧留去し、希塩酸と酢
酸エチルを加えて酢酸エチルにてくり返し抽出した。有
機層をNa₂SO₄にて乾燥し、溶媒を留去後得られた粗結晶
をカラムクロマトグラフィーにて分離精製（溶離液、ク
ロロホルム：メタノール＝12:1）した。得られた白色結
晶をメタノール／酢酸エチルにて再結晶すると目的とす
る例示化合物Ｃ−５が4.1g白色結晶として得られた。
（m.p.128℃）実施例６例示化合物Ｃ−６の合成タウリン2.5g（0.02モル）とNaOH800mg（0.02モル）
を水（10ml）に溶解した。これに、メタノール80mlを加
え、コレステリルクロロホルメート4.5g（0.01モル）の
テトラヒドロフラン溶液40mlをさらに添加した。反応混
合物を３時間室温にてかくはんした。溶媒を留去し得ら
れた粗生成物に40mlの水を加え超音波処理し、沈殿を濾
取した。沈殿を乾燥後、メタノールに溶解しエーテルに
加えるという再沈法を２回くり返すことにより、目的と
する例示化合物を3.9g白色粉末として得た。

（m.p.220℃以上） IRスペクトル（Nujol） 3300cm^-1（NH） 1705cm^-1（ウレタンのカルボニル）実施例７例示化合物７の合成Ｎ−メチルタウリン（Na塩）1.6g（0.01モル）とコレ
ステリルクロロホルメート2.2g（0.05モル）を用い、溶
媒、反応温度、再沈条件は、実施例６と同じ方法で目的
とする例示化合物Ｃ−７を2.1g得た。

m.p.210℃。

実施例８例示化合物８の合成４−アミノ酪酸（市販品）2.3g（0.02モル）、コレス
テリルクロロホルメート9.0g（0.02モル）、トリエチル
アミン4g（0.04モル）を用いて、溶媒反応条件後処理、
再結晶溶媒は、すべて実施例５の場合と同様にして目的
の例示化合物Ｃ−８を7.1g得た。

m.p.125℃。

実施例９卵黄レシチン30mg、例示化合物Ｃ−１、6.3mgをクロ
ロホルム（4ml）に溶解し、減圧留去して、薄膜を作っ
た。充分に乾燥後、カルボキシフルオレセインのBuffer
溶液（200mM:Tris−HCl Buffer pH＝7.4;200mM NaCl含
有）3mlを加え、15分間ボルテクシングを行い、その後
プローブ型の超音波発生装置で15分間ソニケーションを
行った（ブランソン社製ソニファイヤー250型使用）。
セファロース4Bでゲル濾過後、各フラクションについて
平均粒径（株式会社日科機製：コールターＮ−４サブミ
クロン粒子アナライザー使用）を測定した。

実施例10 卵黄レシチン30mg、例示化合物Ｃ−６を7.2mgクロロ
ホルムに溶解し、減圧留去して薄膜をつくり、以下、実
施例９と同様の操作でリポソームを調製した。

実施例11 卵黄レシチン30mg、例示化合物Ｃ−３を6.5mgをクロ
ロホルム／メタノール＝3:1（4ml）に溶解し、減圧留去
して薄膜を作り、以下、実施例９と同様の操作で、リポ
ソームを調製した。

実施例12 卵黄レシチン30mg、コレステロール4.99mgをクロロホ
ルム4mlに溶解し、減圧留去して、薄膜を作り、以下、
実施例９と同様の操作で、リポソームを調製した。

実施例13 卵黄レシチン30mgをクロロホルム4mlに溶解し、減圧
留去して薄膜を作り、以下、実施例９と同様の操作で、
リポソームを調製した。

次に実施例９〜13において調製したリポソームの各平
均粒径0.2〜0.3μのフラクションを選び、pH＝7.4のTri
s−HCl Bufferを用いて各フラクションの脂質濃度を２
×10^-4Mに調節し、36℃でカルボキシフルオレセインの
漏出をけい光測定で追跡した。

その結果を第１図に示した。

＊実施例９〜13と同じ方法で、（ただしpH＝8.6）調製
したリポソームを用いて50℃にてカルボキシフルオレセ
インの漏出をけい光測定で追跡した。その結果を第２図
に示す。

第１図、第２図において、縦軸は漏出したカルボキシ
フルオレセインの割合を示し、横軸は時間を示す。第１
図、第２図において線９は、卵黄レシチンと例示化合物
Ｃ−１を3:1の割合で用いて作ったリポソーム、10は卵
黄レシチンと例示化合物Ｃ−６を3:1の割合で用いて作
ったリポソーム、11は、卵黄レシチンと例示化合物Ｃ−
３を3:1の割合で用いて作ったリポソーム、12は卵黄レ
シチンとコレステロールを3:1の割合で用いて作ったリ
ポソーム、13は卵黄レシチンのみで作ったリポソームで
ある。

第１図、第２図から、本発明の化合物を用いることに
よりリポソーム内容物の漏出が少なくなることがわか
る。

本発明の化合物の種類や量を変えても同様の傾向が得
られた。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図は、５種のリポソームの内容物（カルボ
キシフルオレセイン）の漏出度の２つのpH条件による時
間変化を示したグラフである。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式〔１〕で表わされるコレステロール誘導
体。式中、ｎは１〜４の整数を表わし、Ｘは連結基を表わ
し、Ｙは、カルボキシ基、スルホ基、あるいはそれらの
塩を表わす。
【請求項２】請求項（１）のコレステロール誘導体と脂
質を用いることを特徴とするリポソームの製造方法。