JP2530966B2 - 機能的ｔ細胞亜群の高純度大量培養方法 - Google Patents
機能的ｔ細胞亜群の高純度大量培養方法Info
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- JP2530966B2 JP2530966B2 JP4054433A JP5443392A JP2530966B2 JP 2530966 B2 JP2530966 B2 JP 2530966B2 JP 4054433 A JP4054433 A JP 4054433A JP 5443392 A JP5443392 A JP 5443392A JP 2530966 B2 JP2530966 B2 JP 2530966B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、目的とする機能的Ｔ細
胞亜群が少量しか含まれない血液、骨髄等のソ−スから
該機能的Ｔ細胞亜群を高純度にかつ大量に増殖培養する
方法および当該方法により得られた機能的Ｔ細胞に関す
るものである。
胞亜群が少量しか含まれない血液、骨髄等のソ−スから
該機能的Ｔ細胞亜群を高純度にかつ大量に増殖培養する
方法および当該方法により得られた機能的Ｔ細胞に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来、
例えば、癌の免疫療法の一つである養子免疫療法では、
大量の白血球を含む癌患者末梢血等を採取し、該血液よ
りＴ細胞亜集団を比重液にて分離し、インタ−ロイキン
２（以下ＩＬ−２という）と共に培養し、癌細胞破壊機
能を持つＴ細胞を活性化し、再び、患者に戻す。当該方
法は、大量の白血球を採取する必要があり、該作業は患
者に大きな負担をかけるものであった。更に、従来の比
重液を使用する分離方法ではＴ細胞のみを分離すること
はできなかった。また更には、当該方法で分離したＴ細
胞は亜集団として分離されているため、様々な機能を持
つＴ細胞が混在している。このため、癌細胞破壊に対し
抑制的に働くＴ細胞をも活性化させる可能性があった。
例えば、癌の免疫療法の一つである養子免疫療法では、
大量の白血球を含む癌患者末梢血等を採取し、該血液よ
りＴ細胞亜集団を比重液にて分離し、インタ−ロイキン
２（以下ＩＬ−２という）と共に培養し、癌細胞破壊機
能を持つＴ細胞を活性化し、再び、患者に戻す。当該方
法は、大量の白血球を採取する必要があり、該作業は患
者に大きな負担をかけるものであった。更に、従来の比
重液を使用する分離方法ではＴ細胞のみを分離すること
はできなかった。また更には、当該方法で分離したＴ細
胞は亜集団として分離されているため、様々な機能を持
つＴ細胞が混在している。このため、癌細胞破壊に対し
抑制的に働くＴ細胞をも活性化させる可能性があった。
【０００３】癌患者の負担を軽減し、Ｔ細胞の亜集団の
みを分離する方法として、少量の患者末梢血等を採取
し、比重液を用いてＴ細胞亜集団を採取し、該Ｔ細胞亜
集団を抗ＣＤ３抗体固相化プレ−ト中で刺激後培養する
ことで大量のＴ細胞亜集団のみを培養することが可能と
なった。しかし、該方法においても前記の方法と同様癌
細胞破壊に対し抑制的に働くＴ細胞をも活性化させる可
能性があった。
みを分離する方法として、少量の患者末梢血等を採取
し、比重液を用いてＴ細胞亜集団を採取し、該Ｔ細胞亜
集団を抗ＣＤ３抗体固相化プレ−ト中で刺激後培養する
ことで大量のＴ細胞亜集団のみを培養することが可能と
なった。しかし、該方法においても前記の方法と同様癌
細胞破壊に対し抑制的に働くＴ細胞をも活性化させる可
能性があった。
【０００４】このため、我々は、鋭意検討を重ねた結
果、目的の機能的Ｔ細胞亜群が少量しか含まれないソ−
スから、該機能的Ｔ細胞亜群を高純度にかつ大量に増殖
培養する方法および当該方法で得られる機能的Ｔ細胞亜
群を発明するに至った。
果、目的の機能的Ｔ細胞亜群が少量しか含まれないソ−
スから、該機能的Ｔ細胞亜群を高純度にかつ大量に増殖
培養する方法および当該方法で得られる機能的Ｔ細胞亜
群を発明するに至った。
【０００５】本発明により得られる機能的Ｔ細胞亜群
は、前記の養子免疫療法に限らず、Ｔ細胞抗原の基礎的
解析の研究等広く応用できるものである。
は、前記の養子免疫療法に限らず、Ｔ細胞抗原の基礎的
解析の研究等広く応用できるものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
の本発明の手段は、目的の抗Ｔ細胞抗原抗体に反応する
Ｔ細胞亜群を分離させ、抗ＣＤ３抗体固相化プレ−ト中
で刺激させたのち増殖培養することを特徴とする機能的
Ｔ細胞亜群の高純度大量培養方法、および、当該方法で
得られる機能的Ｔ細胞亜群を提供することである。
の本発明の手段は、目的の抗Ｔ細胞抗原抗体に反応する
Ｔ細胞亜群を分離させ、抗ＣＤ３抗体固相化プレ−ト中
で刺激させたのち増殖培養することを特徴とする機能的
Ｔ細胞亜群の高純度大量培養方法、および、当該方法で
得られる機能的Ｔ細胞亜群を提供することである。
【０００７】機能的Ｔ細胞亜群を分離する方法として
は、セルソ−タ−を用いる方法、吸着分離材を用いる方
法等がある。
は、セルソ−タ−を用いる方法、吸着分離材を用いる方
法等がある。
【０００８】前記吸着分離材とは、担体に目的とするＴ
細胞上の抗原と特異的に反応する抗Ｔ細胞抗原抗体を担
持させたものを用いることができる。
細胞上の抗原と特異的に反応する抗Ｔ細胞抗原抗体を担
持させたものを用いることができる。
【０００９】前記担体としては、例えばキチン・キトサ
ン、セルロ−ス、アガロ−ス、ポリビニルアルコ−ル、
ポリメチルメタアクリレ−ト、ポリスチレン、アクリロ
ニトリル・ブタジエン・スチレン樹脂、ガラス、シリカ
等を用いることができる。また、市販されている吸着用
ビ−ズを用いてもよい。更には、吸着分離後抗ＣＤ３抗
体固相化プレ−ト中で刺激するため吸着分離材は目的と
するＴ細胞よりも小さいものが望ましい。
ン、セルロ−ス、アガロ−ス、ポリビニルアルコ−ル、
ポリメチルメタアクリレ−ト、ポリスチレン、アクリロ
ニトリル・ブタジエン・スチレン樹脂、ガラス、シリカ
等を用いることができる。また、市販されている吸着用
ビ−ズを用いてもよい。更には、吸着分離後抗ＣＤ３抗
体固相化プレ−ト中で刺激するため吸着分離材は目的と
するＴ細胞よりも小さいものが望ましい。
【００１０】前記担体に担持させる抗Ｔ細胞抗原抗体と
しては、例えば抗ＣＤ１ａ抗体、抗ＣＤ１ｂ抗体、抗Ｃ
Ｄ１ｃ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ２Ｒ抗体、抗ＣＤ４
抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ６抗体、抗ＣＤ７抗体、抗
ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ
２９抗体、抗ＣＤｗ６０抗体、抗γδ抗体等目的とする
Ｔ細胞抗原に反応する抗体であればよい。
しては、例えば抗ＣＤ１ａ抗体、抗ＣＤ１ｂ抗体、抗Ｃ
Ｄ１ｃ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ２Ｒ抗体、抗ＣＤ４
抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ６抗体、抗ＣＤ７抗体、抗
ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ
２９抗体、抗ＣＤｗ６０抗体、抗γδ抗体等目的とする
Ｔ細胞抗原に反応する抗体であればよい。
【００１１】実施例 次に本発明の実施例について具体的に説明する。
【００１２】実施例１ 健常者より末梢血を２０ｍｌ採血し、比重液によりリン
パ球層を分離し、次にナイロンウ−ルを通し、単球およ
びＢ細胞を除去したＴ細胞高純度液を得た。フィコエリ
シンでラベリングした抗ＣＤ４抗体を用意し、該Ｔ細胞
高純度液を反応させた後セルソ−タ−（ＦＡＣＳｔｅ
ｒ：ベクトンデッキンソン社製）にて該抗ＣＤ４抗体と
反応したＴ細胞を１×１０6 個分離した。
パ球層を分離し、次にナイロンウ−ルを通し、単球およ
びＢ細胞を除去したＴ細胞高純度液を得た。フィコエリ
シンでラベリングした抗ＣＤ４抗体を用意し、該Ｔ細胞
高純度液を反応させた後セルソ−タ−（ＦＡＣＳｔｅ
ｒ：ベクトンデッキンソン社製）にて該抗ＣＤ４抗体と
反応したＴ細胞を１×１０6 個分離した。
【００１３】あらかじめ、抗ＣＤ３抗体をプレ−トに固
相化させた抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トを準備してお
き、該プレ−トに上記抗ＣＤ４抗体反応Ｔ細胞を一昼夜
刺激培養した。
相化させた抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トを準備してお
き、該プレ−トに上記抗ＣＤ４抗体反応Ｔ細胞を一昼夜
刺激培養した。
【００１４】該ＣＤ３刺激Ｔ細胞をプレ−トを用いて３
７℃でＩＬ−２および牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４
０培地で３５日間培養を行った。培養は１×１０6 個／
ｍｌに調整し培養を開始し、７日後に増殖した細胞密度
を測定し、再度１×１０6 個／ｍｌに調整し継代を行っ
た。
７℃でＩＬ−２および牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４
０培地で３５日間培養を行った。培養は１×１０6 個／
ｍｌに調整し培養を開始し、７日後に増殖した細胞密度
を測定し、再度１×１０6 個／ｍｌに調整し継代を行っ
た。
【００１５】上記の方法による細胞密度および該細胞の
ＣＤ４陽性率の結果を表１に示す。
ＣＤ４陽性率の結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】培養期間を通じてＣＤ４陽性率は９９．２
％以上を示した。今回の実験は培養７日目で継代を行っ
たが、全ての該細胞を培養した場合、培養開始時１×１
０6個の細胞が、計算上３５日間で１．１×１０14個に
増殖することになる。
％以上を示した。今回の実験は培養７日目で継代を行っ
たが、全ての該細胞を培養した場合、培養開始時１×１
０6個の細胞が、計算上３５日間で１．１×１０14個に
増殖することになる。
【００１８】実施例２ 実施例１と同様に健常者より末梢血２０ｍｌを採血し、
Ｔ細胞高純度液を得た。フィコエリシンでラベリングし
た抗ＣＤ８抗体を用意し、該抗ＣＤ８抗体と該Ｔ細胞高
純度液を反応させた後セルソ−タ−（ＦＡＣＳｔｅｒ：
ベクトンデッキンソン社製）にて該抗ＣＤ８抗体と反応
したＴ細胞を１×１０6 個分離した。
Ｔ細胞高純度液を得た。フィコエリシンでラベリングし
た抗ＣＤ８抗体を用意し、該抗ＣＤ８抗体と該Ｔ細胞高
純度液を反応させた後セルソ−タ−（ＦＡＣＳｔｅｒ：
ベクトンデッキンソン社製）にて該抗ＣＤ８抗体と反応
したＴ細胞を１×１０6 個分離した。
【００１９】あらかじめ、抗ＣＤ３抗体をプレ−トに固
相化させた抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トを準備してお
き、該プレ−トに上記該抗ＣＤ８抗体反応Ｔ細胞を一昼
夜刺激培養した。
相化させた抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トを準備してお
き、該プレ−トに上記該抗ＣＤ８抗体反応Ｔ細胞を一昼
夜刺激培養した。
【００２０】該ＣＤ３刺激Ｔ細胞をプレ−トを用いて３
７℃でＩＬ−２および牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４
０培地で３５日間培養を行った。培養は１×１０6 個／
ｍｌに調整し培養を開始し、７日後に増殖した細胞密度
を測定し、再度１×１０6 個／ｍｌに調整し継代を行っ
た。
７℃でＩＬ−２および牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４
０培地で３５日間培養を行った。培養は１×１０6 個／
ｍｌに調整し培養を開始し、７日後に増殖した細胞密度
を測定し、再度１×１０6 個／ｍｌに調整し継代を行っ
た。
【００２１】上記の方法による細胞密度および該細胞の
ＣＤ８陽性率の結果を表２に示す。
ＣＤ８陽性率の結果を表２に示す。
【００２２】
【表２】
【００２３】培養期間を通じてＣＤ８陽性率は９９．５
％以上を示した。今回の実験は培養７日目で継代を行っ
たが、全ての該細胞を培養した場合、培養開始時１×１
０6個の細胞が、計算上３５日間で４．５×１０13個に
増殖することになる。
％以上を示した。今回の実験は培養７日目で継代を行っ
たが、全ての該細胞を培養した場合、培養開始時１×１
０6個の細胞が、計算上３５日間で４．５×１０13個に
増殖することになる。
【００２４】実施例３ 市販のダイナビ−ズＭ−４５０ Ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ
- ＭｏｕｓｅＩｇＧ（ＤＹＮＡＬ社）に抗ＣＤ４抗体を
担持させた吸着分離材を準備しておく。
- ＭｏｕｓｅＩｇＧ（ＤＹＮＡＬ社）に抗ＣＤ４抗体を
担持させた吸着分離材を準備しておく。
【００２５】実施例１と同様の方法で癌患者４人（乳癌
２人、大腸癌２人）より末梢血２０ｍｌを採血し、Ｔ細
胞高純度液を得た。該Ｔ細胞高純度液と上記抗ＣＤ４抗
体担持吸着分離材を反応させ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離
した。
２人、大腸癌２人）より末梢血２０ｍｌを採血し、Ｔ細
胞高純度液を得た。該Ｔ細胞高純度液と上記抗ＣＤ４抗
体担持吸着分離材を反応させ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離
した。
【００２６】あらかじめ、抗ＣＤ３抗体をプレ−トに固
相化させた抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トを準備してお
き、該プレ−トに上記の吸着分離したＣＤ４陽性Ｔ細胞
を一昼夜刺激培養した。
相化させた抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トを準備してお
き、該プレ−トに上記の吸着分離したＣＤ４陽性Ｔ細胞
を一昼夜刺激培養した。
【００２７】抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トで刺激後Ｔ細
胞を取り出し、細胞数を確認した。細胞数は１〜２×１
０6 個であった。該細胞をプレ−トでＩＬ−２と共に７
日間培養を行い、細胞数が２×１０8 個に達したことを
確認後、濃縮回転培養法にて９日間培養を行った。
胞を取り出し、細胞数を確認した。細胞数は１〜２×１
０6 個であった。該細胞をプレ−トでＩＬ−２と共に７
日間培養を行い、細胞数が２×１０8 個に達したことを
確認後、濃縮回転培養法にて９日間培養を行った。
【００２８】末梢血２０ｍｌから１６日間の培養で得ら
れた細胞数と、該細胞のＣＤ４陽性率の結果を表３に示
す。
れた細胞数と、該細胞のＣＤ４陽性率の結果を表３に示
す。
【００２９】
【表３】
【００３０】本方法によりＣＤ４陽性Ｔ細胞が純度９５
％以上で、しかも、培養後１６日間で吸着分離後に得ら
れたリンパ球数の少なくとも１６００倍以上の３．２×
１０9 個以上のＣＤ４陽性Ｔ細胞を得ることができた。
％以上で、しかも、培養後１６日間で吸着分離後に得ら
れたリンパ球数の少なくとも１６００倍以上の３．２×
１０9 個以上のＣＤ４陽性Ｔ細胞を得ることができた。
【００３１】一般的に、長期に渡り維持されたＣＤ４陽
性クロ−ンの解析結果では、化学物質であるホルボ−ル
ミリステ−トアセテ−ト（以下ＰＭＡ）とカルシウムイ
オノホアＡ２３１８７（以下Ａ２３１８７）で刺激した
場合、ＩＬ−２の産生能が認められるものの、Ｔ細胞レ
セプタ−を介した刺激ではＩＬ−２産生能が低下する傾
向があると言われている。これは、長期に渡る培養によ
り該刺激に対する反応性が失われていくものと考えられ
る。
性クロ−ンの解析結果では、化学物質であるホルボ−ル
ミリステ−トアセテ−ト（以下ＰＭＡ）とカルシウムイ
オノホアＡ２３１８７（以下Ａ２３１８７）で刺激した
場合、ＩＬ−２の産生能が認められるものの、Ｔ細胞レ
セプタ−を介した刺激ではＩＬ−２産生能が低下する傾
向があると言われている。これは、長期に渡る培養によ
り該刺激に対する反応性が失われていくものと考えられ
る。
【００３２】当該方法で得られた細胞及び長期に渡り維
持された２種類のＣＤ４陽性クロ−ンのＩＬ−２産生能
を測定した。該ＣＤ４陽性クロ−ンはＲａｊｉ細胞を特
異的に認識する細胞であり、２カ月に渡り培養を行った
ものである。当該方法で得られた細胞及び該ＣＤ４陽性
クロ−ンをそれぞれ２×１０6 個／ｍｌに調製し、それ
ぞれの細胞上清及び細胞をＰＭＡ単独、Ａ２３１８７単
独及びＰＭＡとＡ２３１８７で刺激したのちの上清、更
に、当該方法で得られた細胞については抗ＣＤ３抗体、
該ＣＤ４陽性クロ−ンについてはＲａｊｉ細胞で刺激し
たのちの上清中のＩＬ−２濃度を測定した。ＩＬ−２の
単位は塩野義製薬株式会社の単位を用いた。当該方法で
得られた細胞のＩＬ−２産生能の結果を表４に、該ＣＤ
４陽性クロ−ンのＩＬ−２産生能の結果を表５に示す。
持された２種類のＣＤ４陽性クロ−ンのＩＬ−２産生能
を測定した。該ＣＤ４陽性クロ−ンはＲａｊｉ細胞を特
異的に認識する細胞であり、２カ月に渡り培養を行った
ものである。当該方法で得られた細胞及び該ＣＤ４陽性
クロ−ンをそれぞれ２×１０6 個／ｍｌに調製し、それ
ぞれの細胞上清及び細胞をＰＭＡ単独、Ａ２３１８７単
独及びＰＭＡとＡ２３１８７で刺激したのちの上清、更
に、当該方法で得られた細胞については抗ＣＤ３抗体、
該ＣＤ４陽性クロ−ンについてはＲａｊｉ細胞で刺激し
たのちの上清中のＩＬ−２濃度を測定した。ＩＬ−２の
単位は塩野義製薬株式会社の単位を用いた。当該方法で
得られた細胞のＩＬ−２産生能の結果を表４に、該ＣＤ
４陽性クロ−ンのＩＬ−２産生能の結果を表５に示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】
【表５】
【００３５】該ＣＤ４陽性クロ−ンはＴ細胞レセプタ−
を介した刺激であるＲａｊｉ細胞での刺激に対しＩＬ−
２の産生能は認められなかった。これに対し、当該方法
で得られた細胞をＴ細胞レセプタ−を介した刺激である
抗ＣＤ３抗体での刺激に対しＩＬ−２産生能が認められ
た。
を介した刺激であるＲａｊｉ細胞での刺激に対しＩＬ−
２の産生能は認められなかった。これに対し、当該方法
で得られた細胞をＴ細胞レセプタ−を介した刺激である
抗ＣＤ３抗体での刺激に対しＩＬ−２産生能が認められ
た。
【００３６】更に当該方法で得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞
を抗パ−フォリン抗体で反応させ免疫染色を行った結
果、５０〜６０％が抗パ−フォリン陽性Ｔ細胞であっ
た。つまり、当該方法で得られれた細胞の５０〜６０％
はＣＤ４陽性かつパ−フォリン陽性細胞であった。
を抗パ−フォリン抗体で反応させ免疫染色を行った結
果、５０〜６０％が抗パ−フォリン陽性Ｔ細胞であっ
た。つまり、当該方法で得られれた細胞の５０〜６０％
はＣＤ４陽性かつパ−フォリン陽性細胞であった。
【００３７】パ−フォリン陽性Ｔ細胞はキラ−Ｔ細胞と
呼ばれ、抗腫瘍活性を持つ。このため、当該方法で得ら
れた細胞の樹立細胞への抗腫瘍活性を測定した。該樹立
細胞には、抗ＣＤ３抗体産生細胞であるＯＫＴ−３と、
Ｋ５６２、Ｄａｕｄｉ及びＵ９３７の４種類を用いた。
Ｋ５６２、Ｄａｕｄｉ及びＵ９３７については、抗ＣＤ
３抗体存在下での抗腫瘍活性を測定した。測定は、該細
胞数と該樹立細胞数の割合（以下Ｅ／Ｔ比という）を２
０：１で反応させた。結果を表６に示す。
呼ばれ、抗腫瘍活性を持つ。このため、当該方法で得ら
れた細胞の樹立細胞への抗腫瘍活性を測定した。該樹立
細胞には、抗ＣＤ３抗体産生細胞であるＯＫＴ−３と、
Ｋ５６２、Ｄａｕｄｉ及びＵ９３７の４種類を用いた。
Ｋ５６２、Ｄａｕｄｉ及びＵ９３７については、抗ＣＤ
３抗体存在下での抗腫瘍活性を測定した。測定は、該細
胞数と該樹立細胞数の割合（以下Ｅ／Ｔ比という）を２
０：１で反応させた。結果を表６に示す。
【００３８】
【表６】
【００３９】当該方法で得られた細胞はＯＫＴ−３、Ｋ
５６２、Ｄａｕｄｉ及びＵ９３７に対し高い抗腫瘍活性
を示した。
５６２、Ｄａｕｄｉ及びＵ９３７に対し高い抗腫瘍活性
を示した。
【００４０】以上、実験例３により得られた細胞はＣＤ
４陽性率が９５％以上であり、大量培養を行ったにもか
かわらず生理的刺激条件下でＩＬ−２を産生し、更に、
その５０〜６０％がパ−フォリン陽性で高い抗腫瘍活性
が認められた。
４陽性率が９５％以上であり、大量培養を行ったにもか
かわらず生理的刺激条件下でＩＬ−２を産生し、更に、
その５０〜６０％がパ−フォリン陽性で高い抗腫瘍活性
が認められた。
【００４１】従来ＣＤ４陽性Ｔ細胞はヘルパ−Ｔ細胞と
呼ばれている。一方抗腫瘍活性を持つパ−フォリン陽性
細胞はキラ−細胞と呼ばれている。当該方法で得られた
ＣＤ４陽性細胞はヘルパ−とキラ−の両者の機能を備え
るＣＤ４陽性ヘルパ−／キラ−Ｔ細胞である。当該方法
で得られる細胞はＴ細胞抗原の機能解析の研究を進める
上でも大きな意味を持つものであり、癌の養子免疫療法
へも大いに期待されるものである。
呼ばれている。一方抗腫瘍活性を持つパ−フォリン陽性
細胞はキラ−細胞と呼ばれている。当該方法で得られた
ＣＤ４陽性細胞はヘルパ−とキラ−の両者の機能を備え
るＣＤ４陽性ヘルパ−／キラ−Ｔ細胞である。当該方法
で得られる細胞はＴ細胞抗原の機能解析の研究を進める
上でも大きな意味を持つものであり、癌の養子免疫療法
へも大いに期待されるものである。
【００４２】実施例４ 市販のダイナビ−ズＭ−４５０ Ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ
- ＭｏｕｓｅＩｇＧ（ＤＹＮＡＬ社）に抗ＣＤ８抗体を
担持させた吸着分離材を準備しておく。
- ＭｏｕｓｅＩｇＧ（ＤＹＮＡＬ社）に抗ＣＤ８抗体を
担持させた吸着分離材を準備しておく。
【００４３】実施例１と同様の方法で癌患者４人（乳癌
２人、大腸癌２人）より末梢血２０ｍｌを採血し、Ｔ細
胞高純度液を得た。該Ｔ細胞高純度液と上記抗ＣＤ８抗
体担持吸着分離材を反応させ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離
した。
２人、大腸癌２人）より末梢血２０ｍｌを採血し、Ｔ細
胞高純度液を得た。該Ｔ細胞高純度液と上記抗ＣＤ８抗
体担持吸着分離材を反応させ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離
した。
【００４４】あらかじめ、抗ＣＤ３抗体をプレ−トに固
相化させた抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トを準備してお
き、該プレ−トに上記の吸着分離したＴ細胞を一昼夜刺
激培養した。
相化させた抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トを準備してお
き、該プレ−トに上記の吸着分離したＴ細胞を一昼夜刺
激培養した。
【００４５】抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トで刺激後Ｔ細
胞を取り出し、細胞数を確認した。細胞数は１〜２×１
０6 個であった。該細胞をプレ−トでＩＬ−２と共に７
日間培養を行い、細胞数が２×１０8 個に達したことを
確認後、濃縮回転培養法にて８日間培養を行った。
胞を取り出し、細胞数を確認した。細胞数は１〜２×１
０6 個であった。該細胞をプレ−トでＩＬ−２と共に７
日間培養を行い、細胞数が２×１０8 個に達したことを
確認後、濃縮回転培養法にて８日間培養を行った。
【００４６】末梢血２０ｍｌから１５日間の培養で得ら
れた細胞数と、該細胞のＣＤ８陽性率の結果を表７に示
す。
れた細胞数と、該細胞のＣＤ８陽性率の結果を表７に示
す。
【００４７】
【表７】
【００４８】本方法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が純度９
７．３％以上で、しかも、吸着分離後に得られたリンパ
球数の少なくとも２２５０倍以上の４．５×１０9 個以
上のＣＤ８陽性Ｔ細胞を得ることができた。
７．３％以上で、しかも、吸着分離後に得られたリンパ
球数の少なくとも２２５０倍以上の４．５×１０9 個以
上のＣＤ８陽性Ｔ細胞を得ることができた。
【００４９】実施例５ 市販のダイナビ−ズＭ−４５０ Ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ
- ＭｏｕｓｅＩｇＧ（ＤＹＮＡＬ社）に抗γδ抗体を担
持させた吸着分離材を準備しておく。
- ＭｏｕｓｅＩｇＧ（ＤＹＮＡＬ社）に抗γδ抗体を担
持させた吸着分離材を準備しておく。
【００５０】実施例１と同様に健常者より末梢血２０ｍ
ｌを採血し、Ｔ細胞高純度液を得た。該Ｔ細胞高純度液
と上記抗γδ抗体担持吸着分離材を反応させ、γδ陽性
Ｔ細胞を分離した。
ｌを採血し、Ｔ細胞高純度液を得た。該Ｔ細胞高純度液
と上記抗γδ抗体担持吸着分離材を反応させ、γδ陽性
Ｔ細胞を分離した。
【００５１】あらかじめ、抗ＣＤ３抗体をプレ−トに固
相化させた抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トを準備してお
き、該プレ−トに上記の吸着分離したＴ細胞を一昼夜刺
激培養した。
相化させた抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トを準備してお
き、該プレ−トに上記の吸着分離したＴ細胞を一昼夜刺
激培養した。
【００５２】抗ＣＤ３抗体固相化プレ−トで刺激後Ｔ細
胞を取り出し、細胞数を確認した。細胞数は１〜２×１
０6 個であった。該細胞をプレ−トでＩＬ−２と共に１
６日間培養を行い、濃縮回転培養法にて４日間培養を行
った。
胞を取り出し、細胞数を確認した。細胞数は１〜２×１
０6 個であった。該細胞をプレ−トでＩＬ−２と共に１
６日間培養を行い、濃縮回転培養法にて４日間培養を行
った。
【００５３】末梢血２０ｍｌから２０日間の培養で得ら
れた細胞数と、該細胞のγδ陽性率の結果を表８に示
す。
れた細胞数と、該細胞のγδ陽性率の結果を表８に示
す。
【００５４】
【表８】
【００５５】当該方法で得られた細胞のＯＫＴ−３、Ｋ
５６２及びＤａｕｄｉの３種類の樹立細胞への抗腫瘍活
性を測定した。Ｋ５６２及びＤａｕｄｉについては抗Ｃ
Ｄ３抗体存在下での抗腫瘍活性を測定した。また、比較
として本実施例と同一の健常人より得られた末梢血によ
り実施例４と同様の方法で得たＣＤ８陽性Ｔ細胞につい
ても上記３種類の樹立細胞への抗腫瘍活性も測定した。
測定は、γδ陽性Ｔ細胞についてはＥ／Ｔ比を２０：
１、１０：１及び５：１で反応させた。また、ＣＤ８陽
性Ｔ細胞については４０：１、２０：１及び１０：１で
反応させた。結果を表９に示す。
５６２及びＤａｕｄｉの３種類の樹立細胞への抗腫瘍活
性を測定した。Ｋ５６２及びＤａｕｄｉについては抗Ｃ
Ｄ３抗体存在下での抗腫瘍活性を測定した。また、比較
として本実施例と同一の健常人より得られた末梢血によ
り実施例４と同様の方法で得たＣＤ８陽性Ｔ細胞につい
ても上記３種類の樹立細胞への抗腫瘍活性も測定した。
測定は、γδ陽性Ｔ細胞についてはＥ／Ｔ比を２０：
１、１０：１及び５：１で反応させた。また、ＣＤ８陽
性Ｔ細胞については４０：１、２０：１及び１０：１で
反応させた。結果を表９に示す。
【００５６】
【表９】
【００５７】表９でγδ陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞
のＥ／Ｔ比２０：１及び１０：１の抗腫瘍活性値をみる
とγδ陽性Ｔ細胞のほうが高い抗腫瘍活性を示してい
る。更に、γδ陽性Ｔ細胞はＥ／Ｔ比を５：１にしても
抗腫瘍活性値は７５．３から９１．４％と、ＣＤ８陽性
Ｔ細胞のＥ／Ｔ比１０：１より高値を示している。
のＥ／Ｔ比２０：１及び１０：１の抗腫瘍活性値をみる
とγδ陽性Ｔ細胞のほうが高い抗腫瘍活性を示してい
る。更に、γδ陽性Ｔ細胞はＥ／Ｔ比を５：１にしても
抗腫瘍活性値は７５．３から９１．４％と、ＣＤ８陽性
Ｔ細胞のＥ／Ｔ比１０：１より高値を示している。
【００５８】本方法によりγδ陽性Ｔ細胞が純度９６．
８％で、しかも、吸着分離後に得られたリンパ球数の１
５００倍の３．０×１０9 個を得ることができた。更
に、該γδ陽性Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞より抗腫瘍
活性が高いことがわかった。
８％で、しかも、吸着分離後に得られたリンパ球数の１
５００倍の３．０×１０9 個を得ることができた。更
に、該γδ陽性Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞より抗腫瘍
活性が高いことがわかった。
【００５９】
【発明の効果】以上説明した本発明によれば、目的の機
能的Ｔ細胞亜群が少量しか含まれないソ−スから該機能
的Ｔ細胞亜群を高純度にかつ大量に増殖培養することが
可能となった。当該方法で得られる高純度機能的Ｔ細胞
亜群は癌の養子免疫療法、Ｔ細胞抗原の機能解析の研究
等幅広い応用が期待される。
能的Ｔ細胞亜群が少量しか含まれないソ−スから該機能
的Ｔ細胞亜群を高純度にかつ大量に増殖培養することが
可能となった。当該方法で得られる高純度機能的Ｔ細胞
亜群は癌の養子免疫療法、Ｔ細胞抗原の機能解析の研究
等幅広い応用が期待される。
Claims (6)
- 【請求項１】 機能的Ｔ細胞亜群を分離させ、抗ＣＤ３
抗体固相化プレ−ト中で刺激させたのち増殖培養するこ
とを特徴とする機能的Ｔ細胞亜群の高純度大量培養方
法。 - 【請求項２】 機能的Ｔ細胞亜群に対する陽性率が９５
％以上であることを特徴とする請求項１記載の方法で得
られる機能的Ｔ細胞亜群。 - 【請求項３】 ＣＤ４陽性率が９５％以上であることを
特徴とする請求項１記載の方法で得られる機能的Ｔ細胞
亜群。 - 【請求項４】 ＣＤ４陽性率が９５％以上でありかつパ
−フォリン陽性率が５０％以上であることを特徴とする
請求項１記載の方法で得られる機能的Ｔ細胞亜群。 - 【請求項５】 ＣＤ８陽性率が９５％以上であることを
特徴とする請求項１記載の方法で得られる機能的Ｔ細胞
亜群。 - 【請求項６】 γδ陽性率が９５％以上であることを特
徴とする請求項１記載の方法で得られる機能的Ｔ細胞亜
群。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4054433A JP2530966B2 (ja) | 1992-02-05 | 1992-02-05 | 機能的ｔ細胞亜群の高純度大量培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4054433A JP2530966B2 (ja) | 1992-02-05 | 1992-02-05 | 機能的ｔ細胞亜群の高純度大量培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05219945A JPH05219945A (ja) | 1993-08-31 |
| JP2530966B2 true JP2530966B2 (ja) | 1996-09-04 |
Family
ID=12970583
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4054433A Expired - Lifetime JP2530966B2 (ja) | 1992-02-05 | 1992-02-05 | 機能的ｔ細胞亜群の高純度大量培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2530966B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999046365A1 (en) * | 1998-03-12 | 1999-09-16 | Emory University | Methods and compositions for the selective expansion of gamma/delta t-cells |
| WO2009060865A1 (ja) * | 2007-11-05 | 2009-05-14 | Tsuneo Kuramochi | 医薬組成物及び医薬組成物の製造方法 |
| JP5561845B2 (ja) * | 2008-09-25 | 2014-07-30 | 株式会社リンフォテック | 内因性ｄｈｅａ−ｓを増加させるための製剤およびその製造方法、ならびに内因性ｄｈｅａ−ｓを増加させるための方法 |
| JP6621171B2 (ja) * | 2015-06-22 | 2019-12-18 | 国立大学法人広島大学 | Ｔ細胞活性化剤、ｔ細胞の活性化方法、および、ｔ細胞培養用培地 |
-
1992
- 1992-02-05 JP JP4054433A patent/JP2530966B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05219945A (ja) | 1993-08-31 |
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