JP6621171B2 - Ｔ細胞活性化剤、ｔ細胞の活性化方法、および、ｔ細胞培養用培地 - Google Patents

Description

本発明は、Ｔ細胞活性化剤、Ｔ細胞の活性化方法、および、Ｔ細胞培養用培地に関する。

近年、免疫において重要な役割を担うＴ細胞の機能を制御することによって、様々な疾患（例えば、癌、または、アレルギーなど）を治療しようとする試みがなされている。例えば、機能が制御されたＴ細胞を患者に投与することによって、当該患者内の癌を治療しようとする試みがなされている。

このような治療を行うには、まず、Ｔ細胞を活性化させる必要がある。Ｔ細胞を活性化させる方法としては、（ｉ）Ｔ細胞に抗原を作用させる方法、および、（ｉｉ）Ｔ細胞にサイトカインを作用させる方法、等を挙げることができる。例えば、非特許文献１〜４には、Ｔ細胞にサイトカイン（具体的には、インターロイキン−２）を作用させることによってＴ細胞を活性化させる技術が開示されている。

Timothy J. Eberlein et al., "Regression of a disseminated syngeneic solid tumor by systemic transfer of lymphoid cells expanded in interleukin 2" Journal of Experimental Medicine, Vol.156, August 1982, 385-397 Steven A. Rosenberg et al., "Cancer immunotherapy using interleukin-2 and interleukin-2-activated lymphocytes" Annu. Rev. Immunol., 1986, 4:681-709 Andreas Mackensen et al., "Phase I study of adoptive T-cell therapy using antigen-specific CD8+ T cells for the treatment of patients with metastatic melanoma" Journal of clinical oncology, Vol.24, No.31, November 1 2006 Heidi Ledford, "T-cell therapy extends cancer survival to years" Nature, Vol.516, 156, December 11 2015

しかしながら、Ｔ細胞を活性化させるための従来の技術は、コストが高く、かつ、煩雑な処理を必要とするという問題点を有している。

例えば、上述した（ｉ）の方法では、抗原を作用させた抗原提示細胞を用いて、Ｔ細胞を活性化させる。それ故に、上述した（ｉ）の方法は、抗原提示細胞の調製、および、抗原提示細胞の活性化などの、煩雑な処理を必要とするという問題点がある。

上述した（ｉｉ）の方法では、サイトカインを用いてＴ細胞を活性化させる。サイトカインは高価であるので、上述した（ｉｉ）の方法は、多額のコストを要するという問題点がある。

また、上述した（ｉ）および（ｉｉ）の方法では、抗原、抗原提示細胞、および、サイトカインが患者に何らかの影響を与える可能性がある。それ故に、上述した（ｉ）および（ｉｉ）の方法は、活性化されたＴ細胞を患者に投与する前に、活性化されたＴ細胞を含む製剤から抗原、抗原提示細胞、および、サイトカインを除去するための、煩雑な処理を必要とするという問題点がある。

本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、コストが低く、かつ、煩雑な処理を必要としない、Ｔ細胞活性化剤、Ｔ細胞の活性化方法、および、Ｔ細胞培養用培地を提供することにある。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、様々な種類の細胞が存在する免疫細胞（例えば、抗原提示細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、および、Ｔ細胞）の中でも、特にＴ細胞がポリリン酸によって活性化されることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明のＴ細胞活性化剤は、上記課題を解決するために、抗ＴＣＲ抗体と、ポリリン酸と、を含有していることを特徴としている。

本発明のＴ細胞活性化剤では、上記抗ＴＣＲ抗体は、抗ＣＤ３抗体であることが好ましい。

本発明のＴ細胞活性化剤では、上記ポリリン酸は、直鎖状ポリリン酸であることが好ましい。

本発明のＴ細胞活性化剤は、Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン生産を促進させるためのものであることが好ましい。

本発明のＴ細胞活性化剤では、上記サイトカインは、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、および、インターフェロン−γからなる群より選択される少なくとも１つのサイトカインであることが好ましい。

本発明のＴ細胞培養用培地は、上記課題を解決するために、本発明のＴ細胞活性化剤を含有していることを特徴としている。

本発明のＴ細胞の活性化方法は、上記課題を解決するために、抗ＴＣＲ抗体およびポリリン酸を接触させる工程を有することを特徴としている。

ポリリン酸は、安価に入手可能な物質である。それ故に、本発明は、安価なＴ細胞活性化剤を実現できるという効果を奏する。

ポリリン酸は、簡単に合成および精製可能である。それ故に、本発明は、簡単にＴ細胞活性化剤を製造できるという効果を奏する。

ポリリン酸は、食品添加物としても使用されている、安全な物質である。それ故に、本発明は、ポリリン酸の除去等の煩雑な処理を必要としない、安全なＴ細胞活性化剤を実現できるという効果を奏する。

ポリリン酸は、タンパク質（例えば、抗原およびサイトカインなど）と比較して、安定な物質である。それ故に、本発明は、様々な状況下（例えば、長期保存した後のＴ細胞活性化剤を用いる状況下、室温保存した後のＴ細胞活性化剤を用いる状況下、温度が高い条件下でＴ細胞活性化剤を用いる状況下、または、長時間にわたってＴ細胞活性化剤とＴ細胞とを接触させる状況下）であっても効果的にＴ細胞を活性化させることができる、安定なＴ細胞活性化剤を実現できるという効果を奏する。

ポリリン酸を用いれば、様々なサイトカイン（例えば、インターロイキン−４、インターフェロン−γ、および、インターフェロン−１０）を生産する、様々なＴ細胞（例えば、Ｔｈ２、Ｔｈ１、および、抑制型Ｔ細胞）を活性化させることができる。それ故に、本発明は、活性化された様々なＴ細胞（換言すれば、活性化された様々な免疫システム）によって、疾患（例えば、癌およびアレルギーなど）を多面的に治療することができるという効果を奏する。つまり、本発明は、疾患自体を様々な免疫システムによって治療することができるのみならず、当該疾患に伴って合併症が発症した場合や、治療に伴う副作用が発症した場合であっても、活性化された様々な免疫システムが、これらに対応し得るという効果を奏する。

本発明の実施例における、Ｔ細胞の増殖に及ぼすポリリン酸の影響を示すグラフである。 本発明の実施例における、Ｔ細胞のインターロイキン−４の生産能に及ぼすポリリン酸の影響を示すグラフである。 本発明の実施例における、Ｔ細胞のインターロイキン−１０の生産能に及ぼすポリリン酸の影響を示すグラフである。 本発明の実施例における、Ｔ細胞のインターフェロン−γの生産能に及ぼすポリリン酸の影響を示すグラフである。

本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。

〔１．Ｔ細胞活性化剤、および、Ｔ細胞培養用培地〕
本実施の形態のＴ細胞活性化剤は、抗ＴＣＲ（T Cell Receptor）抗体と、ポリリン酸と、を含有していることを特徴としている。抗ＴＣＲ抗体は、ＴＣＲを、活性化状態に近い疑似活性化状態へと移行させることができる。そして、ポリリン酸は、疑似活性化状態にあるＴ細胞を、更に、特定の活性化状態（増殖し、かつ、特定のサイトカインを生産し得る活性化状態）へと移行させることができる。なお、本明細書においてＴ細胞の活性化とは、Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン生産の両方が促進している状態を意図する。それ故に、本実施の形態のＴ細胞活性化剤は、Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン生産を促進させるためのものであり得る。

本実施の形態のＴ細胞活性化剤は、例えば、生体から採取されたＴ細胞に対して投与されてもよいし、生体（例えば、疾患を患っている患者）に直接投与されてもよい。

生産が促進されるサイトカインの種類は、特に限定されないが、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、および、インターフェロン−γからなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは３つ、のサイトカインである。勿論、例示した３つのサイトカインとは別のサイトカインが、例示した３つのサイトカインと共に生産、または、生産促進されてもよい。

抗ＴＣＲ抗体は、ＴＣＲ（T Cell Receptor）を認識する抗体であればよく、抗ＴＣＲ抗体の具体的な構成は、特に限定されない。

例えば、抗ＴＣＲ抗体は、ＴＣＲを構成するユニット（例えば、ＣＤ３、α鎖、β鎖、γ鎖、および、δ鎖）の１つを認識する抗体であってもよい。

また、抗ＴＣＲ抗体は、当該抗ＴＣＲ抗体を単独でＴ細胞に投与した場合に（換言すれば、ポリリン酸をＴ細胞に投与することなく、抗ＴＣＲ抗体のみをＴ細胞に投与した場合に）、Ｔ細胞の増殖能、および／または、Ｔ細胞のサイトカイン生産能を投与前の１．１〜２．０倍、好ましくは１．２〜２．０倍、更に好ましくは１．３〜２．０倍、更に好ましくは１．４〜２．０倍、更に好ましくは１．５〜２．０倍にまで促進する抗体であってもよい。なお、各数値範囲の上限値は、「２．０倍」に限定されず、例えば「３．０倍」、「４．０倍」または「５．０倍」であってもよいし、「５．０倍」よりも大きな値であってもよい。

また、抗ＴＣＲ抗体は、ＴＣＲを構成するユニットの１つを認識する抗体であって、かつ、当該抗ＴＣＲ抗体を単独でＴ細胞に投与した場合に（換言すれば、ポリリン酸をＴ細胞に投与することなく、抗ＴＣＲ抗体のみをＴ細胞に投与した場合に）、Ｔ細胞の増殖能、および／または、Ｔ細胞のサイトカイン生産能を投与前の１．１〜２．０倍、好ましくは１．２〜２．０倍、更に好ましくは１．３〜２．０倍、更に好ましくは１．４〜２．０倍、更に好ましくは１．５〜２．０倍にまで促進する抗体であってもよい。

例えば抗体Ａが、ＴＣＲを認識する抗体であるか否かは、抗体Ａを用いたウエスタンブロット法によって判定することができる。

具体的には、電気泳動によって分離したＴＣＲ（または、抗原であるＴＣＲの部分ポリペプチド）をニトロセルロース膜に転写する。次いで、当該ニトロセルロース膜に、一次抗体として抗体Ａを接触させ、かつ、当該抗体Ａを認識する市販の二次抗体を接触させる。最後に、ニトロセルロース膜上で、二次抗体に結合しているマーカー（例えば、アルカリフォスファターゼ）の活性を検出する。ニトロセルロース膜上でマーカーの活性が検出されれば、抗体Ａは、ＴＣＲを認識する抗体であると判定され、ニトロセルロース膜上でマーカーの活性が検出されなければ、抗体Ａは、ＴＣＲを認識する抗体ではないと判定される。

一方、例えば抗体Ａが、当該抗体Ａを単独でＴ細胞に投与した場合に、Ｔ細胞の増殖能、および／または、Ｔ細胞のサイトカイン生産能を投与前の１．１〜２．０倍、好ましくは１．２〜２．０倍、更に好ましくは１．３〜２．０倍、更に好ましくは１．４〜２．０倍、更に好ましくは１．５〜２．０倍にまで促進する抗体であるか否かは、実施例に記載の方法によって判定することができる。

具体的には、表面に抗体Ａが固定化された培養皿（ｗｅｌｌの直径は６．４ｍｍ）と、表面に抗体Ａが固定化されていない培養皿（ｗｅｌｌの直径は６．４ｍｍ）と、を準備する。次いで、各培養皿に、Ｔ細胞を２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ〜４．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度にて播く。Ｔ細胞を、３７℃にて３０〜７２時間培養する。Ｔ細胞の増殖能については、Ｔ細胞によるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込み試験にしたがって判定し、Ｔ細胞のサイトカイン生産能については、ＥＬＩＳＡ法にしたがって判定する。表面に抗体Ａが固定化された培養皿における試験結果の値Ａ（例えば、ＯＤ４５０の測定値、または、培地１ｍＬあたりのサイトカインの量）と、表面に抗体Ａが固定化されていない培養皿における試験結果の値Ｂ（例えば、ＯＤ４５０の測定値、または、培地１ｍＬあたりのサイトカインの量）とが、Ａ／Ｂ＝１．１〜２．０、好ましくはＡ／Ｂ＝１．２〜２．０、更に好ましくはＡ／Ｂ＝１．３〜２．０、更に好ましくはＡ／Ｂ＝１．４〜２．０、更に好ましくはＡ／Ｂ＝１．５〜２．０であれば、当該抗体Ａを、本実施の形態のＴ細胞活性化剤に用いることができる抗体であると判定できる。なお、各数値範囲の上限値は、「２．０」に限定されず、例えば「３．０」、「４．０」または「５．０」であってもよいし、「５．０」よりも大きな値であってもよい。

抗ＴＣＲ抗体は、ＴＣＲを構成する様々なユニット（例えば、ＣＤ３、α鎖、β鎖、γ鎖、または、δ鎖）のうちの何れのユニットを認識する抗体であってもよいが、Ｔ細胞をより良く活性化させるという観点から、ＣＤ３を認識する抗体（抗ＣＤ３抗体）であることが好ましい。

ＣＤ３は、４つのポリペプチド（γポリペプチド、δポリペプチド、εポリペプチド、および、ζポリペプチド）によって構成されている。抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３を構成する４つのポリペプチドのうちの何れのポリペプチドを認識する抗体であってもよいが、Ｔ細胞をより良く活性化させるという観点から、εポリペプチドを認識する抗体であることが好ましい。

抗ＴＣＲ抗体としては、市販の抗体を用いることも可能であるし、周知の方法に基づいて作製された抗体を用いることも可能である。

市販の抗ＴＣＲ抗体としては、ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ製の抗ＣＤ３抗体、アブカム製の抗ＣＤ３抗体、および、メルク・ミリポア製の抗ＣＤ３抗体を挙げることができるが、勿論、本発明は、これらの抗体に限定されない。

周知の方法に基づいて作製された抗ＴＣＲ抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。周知の方法にしたがって抗体を作製した後、作製された抗体が上述した抗体Ａに対応する抗体であるか否かを判定することが好ましい。そして、作製された抗体が、上述した抗体Ａに対応する抗体であると判定された場合には、当該作製された抗体を、本実施の形態のＴ細胞活性化剤に用いればよい。

本実施の形態のＴ細胞活性化剤に含まれる抗ＴＣＲ抗体の量は、特に限定されず、投与対象（例えば、Ｔ細胞を含む水溶液、または、生体）の体積または体重に合わせて設定すればよい。

例えば、投与対象が水溶液である場合、投与対象の単位体積あたりの抗ＴＣＲ抗体の投与量が、好ましくは０．０１〜１００．０μｇ／ｍＬ、より好ましくは１．０〜１０μｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．５〜２．０μｇ／ｍＬになるように、Ｔ細胞活性化剤に含まれる抗ＴＣＲ抗体の量を調節すればよい。当該構成であれば、投与対象内のＴ細胞を、効果的に活性化させることができる。

例えば、投与対象が生体（例えば、患者）である場合、当該生体の体重Ｗ（ｋｇ）、および、生体の体重に占める水分の量Ｍ（Ｌ／ｋｇ）などに基づいて、Ｔ細胞活性化剤に含まれる抗ＴＣＲ抗体の量を設定することができる。

Ｍ（Ｌ／ｋｇ）については、現在までに多くのデータが蓄積されており、当該Ｍの値は周知である。例えば、ヒトの場合、胎児におけるＭの値は略０．９０、新生児におけるＭの値は略０．７５、子供におけるＭの値は略０．７０、成人におけるＭの値は略０．６０〜略０．６５、老人におけるＭの値は略０．５０〜略０．５５％である（Ｍの値は、略０．９０〜０．５０）。体重Ｗ（ｋｇ）の生体の場合、当該生体に含まれる水分の量は、Ｗ×Ｍ（Ｌ）と見積もることができる。

投与対象が体重Ｗ（ｋｇ）の生体（例えば、患者）である場合、Ｔ細胞活性化剤に含まれる抗ＴＣＲ抗体の量は、好ましくは０．０１×Ｗ×Ｍ〜１００．０×Ｗ×Ｍ（ｍｇ）、より好ましくは１．０×Ｗ×Ｍ〜１０×Ｗ×Ｍ（ｍｇ）、最も好ましくは０．５×Ｗ×Ｍ〜２．０×Ｗ×Ｍ（ｍｇ）である（Ｍの値は、例えば、略０．９０〜０．５０）。当該構成であれば、投与対象内のＴ細胞を、効果的に活性化させることができる。

また、本実施の形態のＴ細胞活性化剤に含まれる抗ＴＣＲ抗体の量は、特に限定されず、例えば、Ｔ細胞活性化剤の全重量のうちの、０．００１〜５０重量％であってもよいし、０．０１〜５０重量％であってもよいし、０．１〜５０重量％であってもよいし、１〜５０重量％であってもよい。なお、各数値範囲の上限値は、「５０重量％」に限定されず、例えば「４０重量％」、「３０重量％」、「２０重量％」または「１０重量％」であってもよいし、「５０重量％」よりも大きな値であってもよい。

本実施の形態のＴ細胞活性化剤に用いられるポリリン酸の具体的な構成は、特に限定されず、例えば、以下の（ａ）〜（ｄ）の何れかのポリリン酸、または、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも２つのポリリン酸の混合物、であり得る。つまり、
（ａ）複数のＰＯ_４が酸素原子を介して直鎖状に連なっている、直鎖状ポリリン酸；
（ｂ）複数のＰＯ_４が酸素原子を介して環状に連なっている、環状ポリリン酸；
（ｃ）複数のＰＯ_４が酸素原子を介して、枝分かれしながら連なっている、分岐状ポリリン酸；
（ｄ）上述した（ａ）〜（ｃ）の何れかのポリリン酸の側鎖に有機基が導入されている、有機基含有ポリリン酸。

本実施の形態のＴ細胞活性化剤に用いられるポリリン酸は、上述したポリリン酸のうち、直鎖状ポリリン酸が好ましい。その理由は、直鎖状ポリリン酸は、同一リン酸残基数の環状ポリリン酸または分岐状ポリリン酸に比べて分子長が長くなり、効率よくＴ細胞を活性化できるという有利な効果を奏するからである。

直鎖状ポリリン酸は、以下の一般式（１）にて示され得る。つまり、
Ｈ_ｎ＋２（Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１） ・・・・・・・（１）。

このとき、ｎの値は２以上の整数であればよいが、より効果的にＴ細胞を活性化させるという観点から、ｎの値は大きいほど好ましく、好ましくは１０以上の整数、より好ましくは１５以上の整数、より好ましくは２０以上の整数、より好ましくは３０以上の整数、より好ましくは４０以上の整数、より好ましくは５０以上の整数、より好ましくは６０以上の整数、より好ましくは６５以上の整数、より好ましくは７０以上の整数、より好ましくは８０以上の整数、より好ましくは９０以上の整数、より好ましくは１００以上の整数、より好ましくは２００以上の整数、より好ましくは３００以上の整数、より好ましくは４００以上の整数、より好ましくは５００以上の整数、より好ましくは６００以上の整数、最も好ましくは７００以上の整数である。

ｎの値の上限値は、特に限定されないが、水溶液に対するポリリン酸の溶解性を高めて、これによってより効果的にＴ細胞を活性化させるという観点から、好ましくは１０００、より好ましくは９００、最も好ましくは８００である。

なお、上述した好ましいｎの値（換言すれば、ポリリン酸に含まれるリン元素の数）は、直鎖状ポリリン酸のみならず、環状ポリリン酸、分岐状ポリリン酸、および、有機基含有ポリリン酸の場合にもあてはまる、好ましいｎの値である。

本実施の形態のＴ細胞活性化剤に用いられるポリリン酸は、ポリリン酸を構成する水酸基の水素の少なくとも一部が金属に置換されている、ポリリン酸塩であってもよい。上記金属は、特に限定されず、ナトリウム、カリウム、カルシウム、または、マグネシウムであり得る。水溶液に対するポリリン酸の溶解度を高めるという観点から、ポリリン酸塩を用いることが好ましい。

本実施の形態のＴ細胞活性化剤に含まれるポリリン酸は、１種類のポリリン酸であってもよいし、複数種類のポリリン酸であってもよい。例えば、本実施の形態のＴ細胞活性化剤に含まれるポリリン酸は、異なる数のリン酸によって形成されている、長さの異なる複数種類のポリリン酸の混合物であってもよい。この場合には、最も含有量の多いポリリン酸のｎの値が、上述した好ましいｎの値であり得る。

ポリリン酸としては、市販のものを使用してもよいし、周知の方法（例えば、リン酸を加熱する方法、または、リン酸に五酸化リンを溶解させる方法）で合成したものを使用してもよい。なお、上述したｎの値が２０以上のポリリン酸の作製方法の一例を以下に説明するが、本発明は、当該作製方法に限定されない。

まず、ヘキサメタリン酸塩を、含有量が０．１〜１０重量％（好ましくは、１０重量％）になるように、水に溶解する。当該水溶液Ａと、８７〜１００％エタノール（好ましくは、９６％エタノール）とを混合する。なお、混合するエタノールの量は、水溶液Ａおよびエタノールの全量の１／１０〜１／３の量である。換言すれば、水溶液Ａの体積：エタノールの体積＝２：１〜９：１となるように、水溶液Ａとエタノールとを混合すればよい。当該混合物を十分に撹拌することによってポリリン酸を析出させ、遠心分離またはフィルター濾過などによって、ポリリン酸を精製する。精製したポリリン酸を、７０％エタノールにて洗浄した後、乾燥させる。これによって、ｎの平均値が略６０〜７０であるポリリン酸を作製することができる。

本実施の形態のＴ細胞活性化剤に含まれるポリリン酸の量は、特に限定されず、投与対象（例えば、Ｔ細胞を含む水溶液、または、生体）内におけるポリリン酸の濃度が所望の濃度になるように設定すればよい。

例えば、投与対象が水溶液である場合、投与対象内におけるポリリン酸の濃度が、好ましくは１０〜２００μＭ、より好ましくは１０〜１５０μＭ、より好ましくは５０〜１００μＭ、最も好ましくは７５〜１００μＭになるように、Ｔ細胞活性化剤に含まれるポリリン酸の量を調節すればよい。投与対象内におけるポリリン酸の濃度が２００μＭを超えると、ポリリン酸の溶解性が低下する傾向を示し、これによって、Ｔ細胞を活性化させる効果が低くなる傾向を示す。それ故に、上述したポリリン酸の量であれば、投与対象内のＴ細胞を効果的に活性化させることができる。

例えば、投与対象が生体（例えば、患者）である場合、当該生体の体重Ｗ（ｋｇ）、および、生体の体重に占める水分の量Ｍ（Ｌ／ｋｇ）などに基づいて、Ｔ細胞活性化剤に含まれる抗ＴＣＲ抗体の量を調節することができる。

Ｍ（Ｌ／ｋｇ）については、現在までに多くのデータが蓄積されており、当該Ｍの値は周知である。例えば、ヒトの場合、胎児におけるＭの値は略０．９０、新生児におけるＭの値は略０．７５、子供におけるＭの値は略０．７０、成人におけるＭの値は略０．６０〜略０．６５、老人におけるＭの値は略０．５０〜略０．５５％である（Ｍの値は、略０．９０〜０．５０）。体重Ｗ（ｋｇ）の生体の場合、当該生体に含まれる水分の量は、Ｗ×Ｍ（Ｌ）と見積もることができる。

投与対象が体重Ｗ（ｋｇ）の生体（例えば、患者）である場合、Ｔ細胞活性化剤に含まれるポリリン酸の量は、好ましくは１０×Ｗ×Ｍ〜２００×Ｗ×Ｍ（μｍｏｌ）、より好ましくは１０×Ｗ×Ｍ〜１５０×Ｗ×Ｍ（μｍｏｌ）、より好ましくは５０×Ｗ×Ｍ〜１００×Ｗ×Ｍ（μｍｏｌ）、最も好ましくは７５×Ｗ×Ｍ〜１００×Ｗ×Ｍ（μｍｏｌ）である（Ｍの値は、例えば、略０．９０〜０．５０）。当該ポリリン酸の量であれば、投与対象内のＴ細胞を効果的に活性化させることができる。

また、本実施の形態のＴ細胞活性化剤に含まれるポリリン酸の量は、特に限定されず、例えば、Ｔ細胞活性化剤の全重量のうちの、０．００１〜５０重量％であってもよいし、０．０１〜５０重量％であってもよいし、０．１〜５０重量％であってもよいし、１〜５０重量％であってもよい。なお、各数値範囲の上限値は、「５０重量％」に限定されず、例えば「４０重量％」、「３０重量％」、「２０重量％」または「１０重量％」であってもよいし、「５０重量％」よりも大きな値であってもよい。

本実施の形態のＴ細胞活性化剤は、抗ＴＣＲ抗体およびポリリン酸以外の添加物を含んでいてもよい。添加物の例としては、ｐＨ調節剤、安定化剤、および、等張化剤などを挙げることができるが、これらに限定されない。

本実施の形態のＴ細胞活性化剤を直接生体へ投与する場合、Ｔ細胞活性化剤は、様々な形態の製剤であり得る。例えば、Ｔ細胞活性化剤は、注射剤、点滴剤、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、内服用液剤、または、外用液剤の形態の製剤であり得るが、本発明は、これらに限定されない。

本実施の形態のＴ細胞活性化剤は、培地中に含有（または、溶解）された状態であってもよい。本実施の形態のＴ細胞活性化剤と培地との混合物を、Ｔ細胞培養用培地と呼ぶ。

本実施の形態のＴ細胞活性化剤と混合される培地は、特に限定されず、適宜、所望の培地を用いることができる。例えば、上記培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、および、ＤＭＥ培地などを挙げることができる。また、上記培地には、血清が添加されていてもよいし、添加されていなくてもよい。

〔２．Ｔ細胞の活性化方法〕
本実施の形態のＴ細胞の活性化方法は、採取されたＴ細胞に、抗ＴＣＲ抗体およびポリリン酸を接触させる工程を有している。換言すれば、本実施の形態のＴ細胞の活性化方法は、採取されたＴ細胞に、本発明のＴ細胞活性化剤を接触させる工程を有している。

本実施の形態の方法にて活性化されたＴ細胞は、例えば、医薬品（例えば、抗癌剤、細胞製剤）若しくは医療材料の中間段階の生産物、サイトカインの生産源、または、各種実験の材料、などとして利用することができる。

Ｔ細胞活性化剤、抗ＴＣＲ抗体、および、ポリリン酸については既に説明したので、ここでは、これらの説明を省略する。

Ｔ細胞の由来は、特に限定されず、哺乳類（例えば、ヒト、ブタ、ヒツジ、ウシ、マウス、ラット、または、マウスなど）などから周知の方法にて採取されたＴ細胞であってもよいし、採取の前または後に株化されたＴ細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ、または、ＭＯＬＴなど）であってもよい。

本実施の形態のＴ細胞の活性化方法では、水溶液（例えば、生理食塩水、または、細胞培養用の培地など）中で、Ｔ細胞に、抗ＴＣＲ抗体およびポリリン酸を接触させてもよい。なお、細胞培養用の培地は、特に限定されず、例えば、Ｔ細胞の培養に用いられる一般的な培地であり得る。Ｔ細胞が受けるダメージを軽減するという観点、および、Ｔ細胞をより良く活性化させるという観点から、水溶液として細胞培養用の培地を用いることが好ましい。

水溶液中における抗ＴＣＲ抗体の濃度は、特に限定されないが、効果的にＴ細胞を活性化させるという観点から、好ましくは０．０１〜１００．０μｇ／ｍＬ、より好ましくは１．０〜１０μｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．５〜２．０μｇ／ｍＬである。

水溶液中におけるポリリン酸の濃度は、特に限定されないが、効果的にＴ細胞を活性化させるという観点から、好ましくは１０μＭ以上２００μＭ以下、より好ましくは１０μＭ以上１５０μＭ以下、より好ましくは５０μＭ以上１００μＭ以下、最も好ましくは７５μＭ以上１００μＭ以下である。水溶液中におけるポリリン酸の濃度が２００μＭを超えると、水溶液に対するポリリン酸の溶解性が低下する傾向を示し、これによって、Ｔ細胞を活性化させる効果が低くなる傾向を示す。

Ｔ細胞に抗ＴＣＲ抗体およびポリリン酸を接触させる時間は、特に限定されず、例えば、１０〜１００時間であってもよいし、２０〜１００時間であってもよいし、３０〜７０時間であってもよい。

＜１．Ｔ細胞の増殖に対するポリリン酸の影響＞
様々な種類の細胞を含む免疫細胞からＴ細胞を精製し、当該Ｔ細胞にポリリン酸を与えて、Ｔ細胞の増殖に対するポリリン酸の影響を試験した。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。

Ｔ細胞の精製方法について説明する。まず、生理食塩水中でＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓をすりつぶして、様々な種類の免疫細胞（例えば、抗原提示細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、および、Ｔ細胞など）を含む、免疫細胞群を取得した。次いで、当該免疫細胞群を、Ｔ細胞を精製するための市販のキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ）に供し、Ｔ細胞のみを取得した。

表面上に抗ＴＣＲ抗体が固定化された培養皿（ｗｅｌｌの直径は６．４ｍｍ）の作製方法について説明する。抗ＴＣＲ抗体としては、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製の抗ＣＤ３抗体を用いた。まず、抗ＴＣＲ抗体を含む水溶液（２．０μｇ−抗ＣＤ３抗体／ｍＬ−生理食塩水）を調製した。次いで、当該抗ＴＣＲ抗体を含む水溶液を用いて培養皿の表面をリンスした後、当該培養皿をラップで包み１２時間静置することによって、表面上に抗ＴＣＲ抗体が固定化された培養皿を作製した。なお、対照試験に用いる培養皿として、表面上に抗ＴＣＲ抗体が固定化されていない培養皿も準備した。

表面上に抗ＴＣＲ抗体が固定化された培養皿（複数枚）、および、表面上に抗ＴＣＲ抗体が固定化されていない培養皿の各々に、白血球培養用の培地（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製のＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ血清（ＦＢＳ）を含む））を加え、更に、各培養皿に対して、上述したＴ細胞を２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度にて播いた。

更に、表面上に抗ＴＣＲ抗体が固定化された培養皿の各々には、培地中の最終濃度が０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、または、２００μＭとなるように、平均１５個のリン酸によって構成されている直鎖状ポリリン酸（ｐ１５：シグマアルドリッチ株式会社製のメタリン酸ナトリウム）、または、平均７００個のリン酸によって構成されている直鎖状ポリリン酸（ｐ７００：バイオエネックス製の長鎖ポリリン酸）を加えた。なお、表面上に抗ＴＣＲ抗体が固定化されていない培養皿には、ポリリン酸を加えなかった。

ポリリン酸を加えた後、Ｔ細胞を、３７℃にて３０時間培養した。

３０時間の培養の後、Ｔ細胞によるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込み試験を行った。具体的には、ロシュ・ライフサイエンス製のＣｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ＢｒｄＵを用い、当該商品に添付のプロトコールにしたがって、ＢｒｄＵを取り込んだＴ細胞（換言すれば、Ｓ期にあるＴ細胞）を検出した。まず、３０時間の培養の後、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１００倍に希釈した上記商品に同梱されているＢｒｄＵラベリング試薬をＴ細胞に加え、更に、当該Ｔ細胞を、３７℃にて１８時間培養した。１８時間の培養の後、ＯＤ４５０を測定することによって、ＢｒｄＵを取り込んだＴ細胞（換言すれば、Ｓ期にあるＴ細胞）を検出した。

上述した一連の試験を３回行い、試験結果の平均値を算出した。試験結果を図１に示す。本試験から、ポリリン酸がＴ細胞の増殖を促進し得ることが明らかになった。更に、本試験から、ポリリン酸が長いほど（換言すれば、ポリリン酸を構成するリン酸の数が多いほど）、Ｔ細胞の増殖をより良く促進し得ることが明らかになった。

＜２．Ｔ細胞のサイトカイン生産能に対するポリリン酸の影響＞
様々な種類の細胞を含む免疫細胞からＴ細胞を精製し、当該Ｔ細胞にポリリン酸を与えて、Ｔ細胞のサイトカイン生産能に対するポリリン酸の影響を試験した。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。

Ｔ細胞の精製方法、および、培養皿の作製方法は、上述した＜１．Ｔ細胞の増殖に対するポリリン酸の影響＞に記載の方法にしたがった。ここでは、これらの方法の説明を省略する。

表面上に抗ＴＣＲ抗体が固定化された培養皿（複数枚）、および、表面上に抗ＴＣＲ抗体が固定化されていない培養皿の各々に、白血球培養用の培地（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製のＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ血清（ＦＢＳ）を含む））を加え、更に、各培養皿に対して、上述したＴ細胞を４．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度にて播いた。

更に、表面上に抗ＴＣＲ抗体が固定化された培養皿の各々には、培地中の最終濃度が０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、または、２００μＭとなるように、平均１５個のリン酸によって構成されている直鎖状ポリリン酸（ｐ１５：バイオエネックス製の短鎖ポリリン酸）、または、平均７００個のリン酸によって構成されている直鎖状ポリリン酸（ｐ７００：バイオエネックス製の長鎖ポリリン酸）を加えた。なお、表面上に抗ＴＣＲ抗体が固定化されていない培養皿には、ポリリン酸を加えなかった。

ポリリン酸を加えた後、Ｔ細胞を、３７℃にて７２時間培養した。

７２時間の培養の後、ＥＬＩＳＡ法にしたがって、培地中に分泌されたサイトカイン（例えば、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、および、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ））の濃度を測定した。

具体的には、インターロイキン−４の濃度の測定には、Ｒ＆Ｄシステムズ製のＭｏｕｓｅ ＩＬ−４ ＤｕｏＳｅｔを用い、インターロイキン−１０の濃度の測定には、Ｒ＆Ｄシステムズ製のＭｏｕｓｅ ＩＬ−１０ ＤｕｏＳｅｔを用い、インターフェロン−γの濃度の測定には、Ｒ＆Ｄシステムズ製のＭｏｕｓｅ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ ＤｕｏＳｅｔを用い、各キットに添付のプロトコールにしたがって測定を行った。

上述した一連の試験を３回行い、試験結果の平均値を算出した。図２に、インターロイキン−４の試験結果を、図３に、インターロイキン−１０の試験結果を、図４に、インターフェロン−γの試験結果を示す。

本試験から、ポリリン酸がＴ細胞のサイトカイン生産を促進し得ることが明らかになった。更に、本試験から、ポリリン酸が長いほど（換言すれば、ポリリン酸を構成するリン酸の数が多いほど）、Ｔ細胞のサイトカイン生産をより良く促進し得ることが明らかになった。

本発明は、Ｔ細胞活性化剤（例えば、Ｔ細胞の増殖誘導剤、および／または、Ｔ細胞のサイトカイン生産誘導剤）に利用することができる。より具体的に、本発明は、抗癌剤、または、細胞製剤に利用することができる。

Claims (6)

1. 抗ＴＣＲ抗体と、ポリリン酸と、を含有し、
   上記ポリリン酸は、以下の一般式（１）にて示される、直鎖状ポリリン酸であることを特徴とするＴ細胞活性化剤。
   Ｈ _ｎ＋２ （Ｐ _ｎ Ｏ _３ｎ＋１ ） ・・・一般式（１）
   上記一般式（１）のｎの値は、１０以上１０００以下の整数である。
2. 上記抗ＴＣＲ抗体は、抗ＣＤ３抗体であることを特徴とする請求項１に記載のＴ細胞活性化剤。
3. Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン生産を促進させるためのものであることを特徴とする請求項１または２に記載のＴ細胞活性化剤。
4. 上記サイトカインは、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、および、インターフェロン−γからなる群より選択される少なくとも１つのサイトカインであることを特徴とする請求項３に記載のＴ細胞活性化剤。
5. 請求項１〜４の何れか１項に記載のＴ細胞活性化剤を含有していることを特徴とするＴ細胞培養用培地。
6. 採取されたＴ細胞に、抗ＴＣＲ抗体および以下の一般式（１）にて示される、直鎖状ポリリン酸を接触させる工程を有することを特徴とするＴ細胞の活性化方法。
   Ｈ _ｎ＋２ （Ｐ _ｎ Ｏ _３ｎ＋１ ） ・・・一般式（１）
   上記一般式（１）のｎの値は、１０以上１０００以下の整数である。

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