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JP2587969B2 - ウイルス抗体検出用試薬 - Google Patents
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JP2587969B2 - ウイルス抗体検出用試薬 - Google Patents

ウイルス抗体検出用試薬

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JP2587969B2
JP2587969B2 JP62326774A JP32677487A JP2587969B2 JP 2587969 B2 JP2587969 B2 JP 2587969B2 JP 62326774 A JP62326774 A JP 62326774A JP 32677487 A JP32677487 A JP 32677487A JP 2587969 B2 JP2587969 B2 JP 2587969B2
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Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は後天性免疫不全症候群関連ウイルス抗体検出
用試薬に関し、さらに詳しくは、遺伝子組み換えHIV抗
原を用いた後天性免疫不全症候群関連ウイルス抗体検出
用間接凝集反応試薬に関する。
[従来の技術] 後天性免疫不全症候群(Acquired Immunodeficiency
Syndrome−通常AIDSと呼ばれている)は、1981年に初め
て認められた新しい病気である。[M.S.Gottilb et a
l.,N.Eng,J.Med.,305、1425(1981)]。その後、フラ
ンスでリンパ節疾患症候群(Lymphadenopathy Syndrom
e)患者からLAVとなずけられたレトロウイルスが[F.Ba
rrs−Sinoussi et al.,Science、220、868(1983)]、
そして、アメリカでAIDS患者やpre−AIDS患者からTHLV
−III[M.Popovic etal.,Science、224、497(1984)]
及びARV[J.A.Levy et al.,Science、225、840(198
4)]となずけられたレトロウイルスが相次いで発見さ
れた。最近、これらのLAV、HTLV−III及びARVはその遺
伝子の塩基配列が完全に解析され、これらのレトロウイ
ルスは同じウイルスの変異株であることが明らかになっ
た[L.Ratner et al.,Nature、313、277(1985)、R.Sa
nchez Pescaoor et al.,Science、227、484(1985),S.
Wain Hobson et al.,Cell,40,(1985)]。
このAIDSの病因ウイルスは一般にHIV(Human Immunod
eficiency Virus)と総称されているが、HIVはヒトとヒ
トとの接触、輸血等により感染し、発病する。この際、
感染したヒトの血液中にAIDS関連ウイルスと特異的に反
応する抗体が生ずることも知られている。従ってこの抗
体を検出することによって、HIV感染の有無を調べれ
ば、AIDSの予防につながるものと考えられる。
そこで、本発明者らは先に、HIVの抗原成分を感作し
た担体粒子からなるAIDS関連ウイルス抗体検出用間接凝
集反応試薬を提案した(特開昭62−182662号公報参
照)。
一方、HIVはRNAを核として持ち、これと逆転写酵素を
包む核タンパク(coreタンパク)と、さらにこれを包み
込む外殻糖タンパク(envタンパク)から構成されてい
る。
HIVの感染によって生体内ではこれらウイルスの構成
タンパクに対する抗体が産生されるが、これまでの研究
によれば、HIVには感染しているが発病していないいわ
ゆるキヤリア群とAIDSを発病した群との間で、p24に代
表されるcoreタンパクとgp41に代表されるenvタンパク
のそれぞれのタンパクに対する抗体量に差異が見られた
という報告がいくつか発表されている。そしてHIVへの
感染により通常coreタンパク及びenvタンパクの両方に
対する抗体が産生されるが、感染後ある程度の期間が経
過すると、それらの産生量に差異が生じ、coreタンパク
に対する抗体価が低下しはじめる頃からARC(AIDS rela
bed couplex)の症状がではじめ、AIDSへと移行してい
くとの報告もされている(Joepet al.,British Med.J.,
1986)。
従って、抗HIV−core(p24)クンパク抗体及び抗HIV
−env(gp41あるいはp41)タンパク抗体の検出はHIVへ
の感染からキヤリアを経てARC、AIDS発症へと移行する
過程を追跡する上で臨床的意義が極めて大きいといえ
る。
従来よりこれら抗HIV−core(p24)タンパク抗体、HI
V−env(gp41あるいはp41)タンパク抗体をウエスター
ン・ブロット法(Western blot法)又はEIA法で測定す
ることが提案されている[LANCET、1986年11月29日号12
33〜1237頁参照]。しかし、前者のウエスターン・ブロ
ット法はHIV抗原タンパク成分をSDS電気泳動後ニトロセ
ルロース膜に転写し、この膜を被検血清とEIA法やRIA法
で反応させるものであるが、操作が煩雑で結果が出るま
でに2日以上もの時間がかかるという欠点がある。また
後者のEIA法(Abbot社法)においても、検体との反応に
十数時間を要し、反応の工程数も多く手段的にも煩雑で
ある。
[発明が解決しようとする問題点] 本発明は、上記従来法における欠点を克服し、簡便で
迅速に抗HIV−core(p24)タンパク抗体及び抗HIV−env
(p41)タンパク抗体を検出することのできる検出用試
薬を提供することを目的とするものであり、本発明者ら
はこれを目的に鋭意検討を行った結果、今回、HIV−cor
e(p24)タンパク及び/又はHIV−env(p41)タンパク
を成る特定のpH条件下で感作した担体粒子を用いると、
間接凝集反応により、簡便かつ迅速に検体中の抗HIV−c
ore(p24)タンパク抗体、抗HIV−env(p41)タンパク
抗体を検出しうることを見い出し本発明を完成するに至
った。
[問題点を解決するための手段] しかして、本発明によれば、HIV−p24及び/又はHIV
−p41をp7.3〜8.5において感作いたゼラチン粒子からな
ることを特徴とする後天性免疫不全症候群(AIDS)関連
ウイルス抗体検出用間接凝集反応試薬が提供される。
HIV−p24はHIVの核に存在するRNAをとり囲む分子量が
約2400のcoreタンパクの一種であり、またHIV−p41はHI
Vの包被を構成する糖タンパクの一種であるgp−41(分
子量約4100)から糖を除いた成分であり、これらタンパ
クはいずれも既知であり、例えば、ANALYTICAL BIOCHE
MISTRY 1613、370〜379(1987)に記載の方法に従い、
大腸菌等の菌を用いた遺伝子組換え法によりHIV−p24及
びHIV−p41を得ることができる。これらHIV−p24及びHI
V−p41はそれぞれ単独で用いてもよく、或いは両者を併
用してもよい。
上記HIV−p24及び/又はHIV−p41で感作するためのゼ
ラチン粒子(この粒子の製造法について特開昭57−1536
58号公報参照)は非特異反応が少なく、用途に応じた性
質を付加できる等、AIDS関連ウイルス抗体検出のための
間接凝集反応用担体として優れた長所を有している。
ゼラチン粒子へのHIV−p24及び/又はHIV−p41の感作
は、それ自体既知の方法を用いて行うことができ、例え
ばタンニン酸、グリタールアルデヒド、ビスジアジベン
ジジン、トリレンジイソシアネート、ジフロロジニトロ
ベンゼン、カルボジイミド類、キノン類、塩化クロム等
のいわゆるカップリング剤を使用して化学的に結合させ
る方法或いは物理的に吸着させる方法などによって行う
ことができる。
感作は弱アルカリ性の条件下で行えばよく、pH7.5〜
8.0の範囲内で行うのがよく、このpH範囲外で感作した
場合には一般に検出感度に優れた試薬は得られない。例
えば、後記実施例1又は2に記載の方法でゼラチン粒子
に各種pH条件下においてHIV−gp24又は参考としてHIV−
gp41を感作させた場合の感度を試験した結果を示せば下
記第1表のとおりである。
第1表 感作pH 対照試験 力価試験 6.0 − − 7.0 − + 7.5 − + 8.0 − + 9.0 − + 10.0 + 測定不能 上記第1表において、−は凝集反応が生じなかったこ
とを、そして+は凝集反応が生じたことを示す。また、
対照試験とは、AIDS関連ウイルス抗体を全く含まない血
清希釈溶液を検体として用いた試験であり、この試験で
+の結果を示すのは偽反応である。一方、力価試験は抗
HIV−env(p41)タンパク抗体又は抗HIV−core(p24)
タンパク抗体を含む血清溶液を検体として用いた試験で
あり、十の数が多い程、の感度が高いことを示す。
以上述べた如くして得られるHIV−p24及び/又はHIV
−p41で感作したゼラチン粒子は通常、凍結乾燥した状
態で保存され、使用時に復元後、間接凝集反応に供せら
れる。
本発明の感作ゼラチン粒子を用いる間接凝集反応によ
るAIDS関連ウイルス抗体の検出はそれ自体既知の間接凝
集反応法と全く同様にして行うことができ、例えばマイ
クロプレートのウエルに被検血清を入れてその希釈列を
作り、各ウエルに本発明の感作ゼラチン粒子を加えて混
合し、通常1〜2時間程度静置し、この感作ゼラチン粒
子の凝集像を観察して凝集の有無を判定することにより
行われる。
より具体的に述べれば、感作ゼラチン粒子浮遊液をAI
DS患者血清(検体)の二倍段階希釈液に96穴マイクロプ
レートのウエルに等量ずつ加え、混合し、室温に静置す
る。1〜3時間後、各穴を観察すると、希釈倍数の低い
穴には感作ゼラチン粒子が底一面に広がって、凝集像が
見られ、希釈倍数の高い所では、ボタン状となり凝集像
が認められない。一方、未感作ゼラチン粒子を用いた場
合には低希釈から高希釈の血清中いずれにも凝集像は見
られない。また、HIV抗体陰性ヒト血清について同様に
検査した場合には、感作ゼラチン粒子及び未感作ゼラチ
ン粒子のいずれを用いた場合にも凝集像は見られない。
これにより、検体中に、感作ゼラチン粒子上にHIV−p
24又はHIV−gp41あるいはp41と特異的に反応するHIV抗
体[抗HIV−core(p24)タンパク抗体、抗HIV−env(gp
41あるいはp41)タンパク抗体など]が存在することが
確認できる。
本発明の感作ゼラチン粒子は、AIDS関連ウイルス抗体
検出用試薬として、通常行なわれているように、未感作
ゼラチン粒子、標準血清(対照用陽性血清)、検体希釈
用溶液及び必要に応じて感作ゼラチン粒子の凍結乾燥品
溶解用溶液等と組合わせることによりキット化して実用
に供することができる。
尚、本発明においてはp41をgp41に対して便宜上使用
したものであるが、正確にはgp41から糖の脱落したタン
パクを指すものである。
[実 施 例] 次に実施例により、本発明の感作ゼラチン粒子の調製
法及びそれを用いた間接凝集反応テストについてさらに
具体的に説明する。
参考例 1 (1) HIV−env(gp41)タンパク抗原感作ゼラチン粒
子の調製 特開昭58−113754号公報の実施例1に記載された方法
に従って製造したゼラチン粒子を5ppmのタンニン酸を含
むpH7.2の0.15Mリン酸塩緩衝生理食塩液(以下0.15M P
BS(pH7.2)と略記する)中に粒子濃度が2.5%になるよ
うに分散させ、37℃で10分間加温した。この粒子を遠心
分離して回収し、生理食塩液で3回遠心分離法で洗浄し
てから0.15M PBS(pH8.0)に5%になるように分散さ
せた。
HIV−env(gp41)タンパク抗原を0.15M PBS(pH8.
0)で20μg/mlになるように希釈し、前記のタンニン酸
処理粒子分散液に等容のこの希釈液を混合して37℃で90
分間加温し、粒子にHIV−env(gp41)タンパク抗原を感
作させた。この感作ゼラチン粒子を生理食塩液で3回遠
心洗浄してから浮遊分散液(リン酸水素二ナトリウム・
12水塩1.920g、リン酸二水素カリウム0.291g、塩化ナト
リウム0.438g、アラビアゴム0.25g、グリシン1.5g、ア
ジ化ナトリウム0.1g及び正常家兎血清1.0mlを全量100ml
になるように、精製水に溶解した液)に分散させた。こ
の分散液を凍結乾燥し、HIV−env(gp41)タンパク抗原
感作ゼラチン粒子の凍結乾燥品を得た。
(2) 被検血清希釈用溶液の調製 リン酸水素二ナトリウム・12水塩1.920g、リン酸二水
素カリウム0.291g、塩化ナトリウム0.438g、アラビアゴ
ム0.25g、アジ化ナトリウム0.15g、を全量100mlになる
ように精製水に溶解して血清希釈溶液とした。
(3) キットの調製 感作ゼラチン粒子の凍結乾燥品のほかに抗原未感作ゼ
ラチン粒子の凍結乾燥品及び対照用陽性血清の凍結乾燥
品も別途に調製し、感作ゼラチン粒子溶解用溶液及び被
験血清希釈用溶液を組合わせ、抗HIV−env(p41)タン
パク抗体検出用試験キットとした。
実施例 1 (1)HIV−core(p24)タンパク抗原感作ゼラチン粒子
の調製 実施例1で用いたHIV−env(gp41)タンパク抗原の代
わりにHIV−core(p24)タンパク抗原(セントコア社
製)を用い、同様な操作をくり返すことによりHIV−cor
e(p24)タンパク抗体抗原感作ゼラチン粒子を調製し
た。
(2) キットの調製 実施例1と同様に試薬を用いHIV−core(p24)タンパ
ク抗体検出用試薬キットとした。
実施例 2 実施例1及び2で得られた試験キットを用い、各種被
検血清について間接凝集反応テストを行なった。
得られた結果を下記第2表に示す。
上記第2表に示す結果より、本発明に従うHIV−env
(gp41)タンパク抗原感作ゼラチン粒子及びHIV−core
(p24)タンパク抗原感作ゼラチン粒子を用いた間接凝
集反応は、抗HIV−env(gp41)タンパク抗体及び抗HIV
−core(p24)タンパク抗体の検出において、ウエスタ
ンブロット法と比べ同等の検出感度及び特異性を有する
ことがわかる。
[発明の効果] 本発明の試薬を用いれば、間接凝集反応により、多数
の検体を簡便な動作で迅速に測定することができる。例
えば、螢光抗体法あるいは酵素抗体法の場合、検査開始
から結果がでるまで洗浄も加え回数の操作を必要とする
が、本発明の試薬を用いた場合、希釈血清に加えるだけ
で、あとは結果がでるまで静置しておけばよく、非常に
簡便である。また、結果の判定には特殊な器材を何ら必
要とせず肉眼で判定することができる。これらの点は、
多数の検体の検査に適している。
AIDS関連ウイルス抗体が検出された場合、AIDS関連ウ
イルスを体内に保有していると考えられるので、本発明
の試薬を用い、AIDS関連ウイルス抗体の有無を検査する
ことにより、接触及び輸血などによる感染を防止しうる
ので臨床上非常に有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭64−57171(JP,A) 特開 昭63−128260(JP,A) 特開 昭62−182662(JP,A) 特開 昭62−278459(JP,A)

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】HIV核タンパクP24及び/又はHIV外殻タン
    パクp41をpH7.5〜8.0において感作したゼラチン粒子か
    らなることを特徴とする後天性免疫不全症候群関連ウイ
    ルス抗体検出用間接凝集反応試薬。
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