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JP2641464B2 - 酵素によるペプチド結合の生成反応 - Google Patents
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JP2641464B2 - 酵素によるペプチド結合の生成反応 - Google Patents

酵素によるペプチド結合の生成反応

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JP2641464B2
JP2641464B2 JP62265501A JP26550187A JP2641464B2 JP 2641464 B2 JP2641464 B2 JP 2641464B2 JP 62265501 A JP62265501 A JP 62265501A JP 26550187 A JP26550187 A JP 26550187A JP 2641464 B2 JP2641464 B2 JP 2641464B2
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Description

【発明の詳細な説明】 酵素によるジペプチドの合成法は周知である。即ち米
国特許第4,165,311号、同第4,436,925号及び同第4,256,
836号には水性媒質中で不溶性の付加化合物、例えば１
モルのフェニルアラニンメチルエステルと１モルのＮ原
子を保護されたアスパルチルフェニルアラニンメチルエ
ステルとの付加化合物を合成する方法が記載されてい
る。米国特許第4,284,721号には、Ｎ原子を保護された
アスパラギン酸とフェニルアラニンの低級アルキルエス
テルとを水と混合しない溶媒の存在下において酵素的に
結合させる方法が記載されている。この溶媒は水と混合
し得る共溶媒を含むことができるが、水と混合し得る溶
媒の量は酵素を不活性化または抑制することを避けるた
めに一定限度に制限しなければならない。米国特許第4,
116,768号及び同第4,119,493号においては、水性媒質中
の共溶媒として水と混合し得る溶媒を使用することが記
載されている。同様にアンゲヴァンテ・ヘミー・インタ
ーナショナル・エディション、英語版（Angew.Chem.In
t.Ed.Engl.）24巻、（1985年）、第２号、87頁には、水
と混合し得る溶媒を水と混合して共溶媒として使用する
ことができるが、プロテアーゼ酵素の触媒活性は共溶媒
の濃度が増加するにつれて減少し、50％以上では、酵素
としてキモトリプシンを使用した場合、合成ができない
ことが示されている。可能な例外としてはポリオール
（例えば1,4−ブタンジオール）を使用すると、或る場
合には酵素を安定させることもある。
Ｎ−フォルミルジペプチド（例えばＮ−フォルミルア
スパルテーム）及びポリペプチドをつくるための酵素的
結合反応に対し水性媒質または水性−有機媒質を使用す
ることはWO 8604924及びヨーロッパ特許第0149594号に
記載されている。
種々の科学的な学術雑誌には酵素を水及び水混和性有
機溶媒と組み合わせて使用することが多くの論文に記載
されているが、その際の収率は溶媒の選択、水、酵素及
び基質の量に依存して変化するように思われる。また酵
素が固定化されているかどうかも一つの因子になるよう
に思われる。アセトニトリル／水の50/50溶媒系を使用
することは、バイオテクノロジー・アンド・バイオエン
ジニアリング（Biotech.Bioeng.）誌、26巻1146頁（198
4年）のニルソン（Nilsson）とモスバッハ（Mosbach）
の論文に記載されている。この論文にはまたブタンジオ
ール／水（90/10）混合物を使用することも記載されて
いる。溶媒としてアセトニトリルを使用することは米国
ニューヨーク、ジェー・ウィリー（J.Wiley）社、1976
年発行、ジェー・ビー・ジョーンズ（J.B.Jones）、シ
ー・ジェー・サイ（C.J.Sih）及びディー・パールマン
（D.Perlman）編「アプリケーション・オヴ・バイオケ
ミカル・システムズ・イン・オーガニック・ケミストリ
ー（Application of Biochemical Systems in Organic
Chemistry）」第１部107頁以降のジェー・ビー・ジョー
ンズ及びジェー・エフ・ベック（J.F.Beck）の論文、及
びカナディアン・ジャーナル・オヴ・ケミストリー（Ca
n.J.Chem.）誌、57巻、2245頁（1979年）のジェー・ビ
ー・ジョーンズ及びエム・エム・メーヘス（M.M.Mehe
s）の論文に記載されている。Ｌ−フェニルアラニンメ
チルエステル（即ちＬ−pheOMe）とＮ原子を保護された
Ｎ−カーボベンジロキシアスパラギン酸（即ちＺ−as
p）とを水−不混和性溶媒／水混和性溶媒の混合物を使
用して結合させることはバイオテクノロジー・レターズ
（Biotech.Lett.）誌、７巻789頁（1985年）に記載され
ている。モナートシュリフツ・フュール・ヘミー（Mona
tshrifts fur Chemie）誌、112巻469〜481頁（1981年）
のコンネッケ（Konnecke）等の論文にはその475頁にア
セトニトリルを溶媒として使用することが記載されてい
る。他の関連する論文としては、ジャーナル・オヴ・バ
イオケミストリー（J.Biochem.）誌、89巻、385頁（198
1年）、ジャーナル・オヴ・オーガニック・ケミストリ
ー（J.Org.Chem.）誌51巻2728頁（1986年）、コッレク
ション・オヴ・チェッコスロバック・ケミカル・コンミ
ュニケーション（Coll.Cze chos.Chem.Comm.）誌、49
巻、231頁（1984年）、及びプロシーティング・オヴ・
ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンス（Proc.Nat
l.Acad.Sci.）誌、80巻、3241頁（1983年）がある。
文献には一般に酵素、特にプロテアーゼは水に混合し
得る有機溶媒及び水と混合しない有機溶媒の両方で使用
されることが記載されているが、水に混合し得る溶媒の
方が幾分劣っているというのが一般的な見解のように思
われる。従って「大部分の酵素は親水性の、水と混合し
得る溶媒の中では不活性であり、このことは実質的に水
が酵素から溶媒の方へ分配されることによって容易に理
解される」ということができる。［ケムテック（Chemte
ch）誌、1986年６月号、354頁のエー・ケー・クリバァ
ノフ（A.K.Klibanov）の論文参照］。
本発明はプロテアーゼを水と混合し得る有機溶媒中で
使用することに関する。
本発明によれば酵素を使用してＮ置換アスパラギン酸
及びフェニルアラニン低級アルキルエステルから成る群
から選ばれた二種の基質の間のペプチド結合生成の触媒
作用を行わせる方法が提供される。該エステルのベンジ
ル炭素原子は水素と容易に置換り得る動き易い一個また
はそれ以上の基で置換されていることができる。本発明
方法には上記方法を水と混合し得る溶媒中で行う方法が
含まれる。
水混和性溶媒を使用すると多くの利点が得られる。予
想に反してこの溶媒は酵素から不可欠の水を奪うことな
く使用することができる。例えば連続法を実施する場
合、酵素活性に必要な水は溶媒系の中で２〜10重量％が
水で残りが水混和性有機溶媒または該溶媒と他の溶媒と
の混合物であるようにすることで提供される。閉じた系
（例えば連続法ではなくて実質的なバッチ法の場合）に
おいては、酵素とその担体は上記の２〜10重量％の水を
与えるのに十分な水を失うであろう。しかし酵素が十分
に大量の実質的に無水の水混和性溶媒と接触すると、十
分な水が抽出され、溶媒中の水含量は約２％以下に落
ち、酵素は変性される。10％以上、例えば最高50％の量
の水を使用することもできるが、その場合には水混和性
溶媒を使用する利点が減少するであろう。
多くの反応において、水混和性溶媒を唯一の溶媒とし
て或いは共溶媒として使用すると、単一の液相が生じ、
溶媒が水と混合しない場合に起る相変化による制限が避
けられる。例えば、水混和性溶媒を使用するとしばしば
反応速度が増加する。また大部分の有用な水混和性溶媒
の誘電定数は、５〜60（好ましくは30〜60）であり、こ
のことは単一の液相の生成に寄与する。何故ならば大部
分のアミノ酸誘導体は比較的極性があり、ことような溶
媒に可溶であるからである。例えばフェニルアラニンの
メチルエステルはヘキサンまたは酢酸エチルに対してよ
りもアセトニトリルに遥かに多く溶解する。
水混和性溶媒を使用すると反応の平衡を移動させるこ
とができる。例えば酢酸エチル中においてＮ−フォルミ
ルアスパラギン酸とフェニルアラニンメチルエステルと
の反応で約10％の収率が得られるが、アセトニトリル中
ではこの収率は約80％になる。
酵素は固定化されていても「遊離」の形をとっていて
も、水非混和性溶媒に比べ水混和性溶媒中では遥かに安
定である。例えばシリカまたはイオン交換樹脂（例えば
アンバライト）上で固定化されたサーモリジンは、酢酸
エチル中よりもアセトニトリル中の方が安定である。こ
こで「安定性」という言葉は、酵素が水の抽出または他
の手段による変性に抵抗性をもっていることを意味す
る。また「溶媒系」という言葉は、液相の溶媒部分を指
すのに用いられ、水混和性溶媒及びそれと併用される任
意の共溶媒、例えば水または水混和性溶媒を含む。
「水混和性有機溶媒」という言葉は、任意の割合で水
と混和し単一相をつくる有機液体を意味する。適当な有
機溶媒と例としては、アルコール（例えばエタノール、
１−プロパノール及び２−プロパノール）、ポリオール
（例えば1,4−ブタンジオール及びジエチレングリコー
ル）、ニトリル（例えばアセトニトリル）、及びエーテ
ル（例えばジオキサン及びテトラヒドロフラン）、並び
に他の溶媒、例えばジメチルフォルムアミド、ジメチル
スルフォキシド及びアセトンがある。
アセトニトリルは好適な水混和性溶媒である。本発明
の具体化例においては、アセトニトリルを広範囲のアミ
ノ酸及び酵素と共に使用して酵素的結合反応によりジペ
プチド及びポリペプチドをつくることができる。この反
応に使用される適当なアミノ酸の例としては、脂肪族ア
ミノ酸、例えばグリシン（Gly）、アラニン（Ala）、ヴ
ァリン（Val）、ノルヴァリン（nor−Val）、ロイシン
（Leu）、イソロイシン（iso−Leu）、ノルロイシン（n
or−Leu）のようなモノアミノモノカルボン酸；セリン
（Ser）、スレオニン（Thr）、ホモセリン（homo−Se
r）のようなオキシアミノ酸、メチオニン（Met）、シス
チン（CysS）、及びシステイン（CysH）のような含硫ア
ミノ酸；アスパラギン酸（Asp）及びグルタミン酸（Gl
u）のようなモノアミノジカルボン酸；オルニチン（Or
n）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）のようなジア
ミノジカルボン酸；フェニルアラニン（Phe）、チロシ
ン（Tyr）のような芳香族アミノ酸；ヒスチジン（His）
及びトリプトファン（Trp）のような複素環式アミノ酸
が含まれる。（アミノ酸はこの分野で普通使用されてい
る記号で表される。） 溶媒の選択には注意が必要である。例えば、酵素が金
属を含んでいる場合には、溶媒はこの金属と錯体を形成
してはいけない。DMF及びDMSOはメタロプロテナーゼの
金属成分と錯体をつくると思われるので、溶媒系の50％
以下（モル基準）に制限し、残りは例えば水または他の
溶媒にすることが好適である。溶媒はまた酵素または基
質と化学的に反応しないという意味で不活性でなければ
ならない。例えば、アセトンが溶媒である場合、基質ま
たは酵素のアミノ基との反応を最低限度に抑制する条件
下で使用しなければならない。
アシル供与体として使用するアミノ酸は、一般にＮの
位置に保護基を有している。適当なＮの保護基は、ペプ
チド合成に通常使用されるもので、例えばｔ−ブチロキ
シカルボニル（BOC−）、ｔ−アミロキシカルボニル
（ｔ−AOC）のようなｔ−アルコキシカルボニル基、ベ
ンジロキシカルボニル（Ｚ−）、ｐ−メトキシベンジロ
キシカルボニル（PMZ−）、3,5−ジメトキシベンジロキ
シカルボニル（Ｚ（OMe）２−）、2,4,6−トリメチルベ
ンジロキシカルボニル（TMZ−）、ｐ−フェニルアゾベ
ンジロキシカルボニル（PZ−）、ｐ−トルエンスルフォ
ニル（tosyl−）のような随時不活性置換基を有し得る
ベンジロキシカルボニル基;o−ニトロフェニルスルフェ
ニル（Nps−）等である。フォルミル基も使用すること
ができる。
アミノ部分を供与してジペプチドまたはポリペプチド
をつくるのに適したアミノ酸の例には、上記の任意のも
のが含まれる。フェニルアラニンが好適であり、特にベ
ンジル炭素に置換基をもつ誘導体、例えば接触水素化分
解または電解還元による開裂のような方法によって容易
に置換し得る少なくとも１個の基をベンジル炭素に置換
基として有する誘導体を使用することができる。適当な
置換フェニルアラニンの例としては、式 但し式中Phはフェニル基（置換または非置換の）であ
り、ｘは−OH、−SH、−Cl、−Br、−Ｉ、−OCOCH3、−
OCOOCH3、−NH2または−SCH3であり、 Ｒは炭素数１〜４の低級アルキル基である、に対応す
るものが含まれる。
アミノ基供与アミノ酸は適当なＣ末端保護基によって
保護される。アミン成分のガルボキシル基保護基（Ｃ末
端保護基）には、メトキシ（−OMe）、エトキシ（−OE
t）のようなアルコキシ基;t−ブトキシ（Ｏ−ｔ−Bu）
のようなｔ−アルコキシ基；及びベンジロキシ（−OBz
l）、ｐ−ニトロベンジロキシ（−OBZL（ｐ−NO2））、
ベンズヒドリロキシ（−OBzh）、ベンジルアミノ（−NH
Bzl）、2,4−ジメトキシベンジルアミノ（−NHDBM）、
ベンジルヒドリルアミノ（−NHBzh）のような置換基を
有することもあるベンジロキシ基；または非置換のアミ
ノ基（−NH2）等が含まれる。またアミド及びヒドラジ
ット基もＣ末端保護基とし用いることができる。
使用できる酵素は、ペプチド結合の生成を媒介し得る
公知のものであり、アミノペプチダーゼ（例えばロイシ
ンアミノペプチダーゼ）、カルボキシペプチダーゼ（例
えばカルボキシペプチダーゼｙ）、セリンプロテイナー
ゼ（例えばキモトリプシン、スブチリシン）、チオール
プロテイナーゼ（例えばパパイン、ブロメイン）、酸プ
ロテイナーゼ（例えばペプシン）、及びメタロプロテイ
ナーゼ（例えばサーモリシン、及びビブリオ・プロテオ
リティクス（Vibrio Proteolyticus）から得られるメタ
ロエンドプロテイナーゼ（実施例６参照））が含まれ
る。酵素は純粋な形で使用する必要はなく、一種の酵素
または多数の酵素を含む多少とも粗製の製品（例えば部
分的に生成した醗酵ブィヨン濃縮物）であることができ
る。
水混和性有機溶媒は実質的に無水の「割らない」形ま
たは水及び／又は他の有機溶媒（水非混和性溶媒及び水
混和性溶媒の両方）と組み合わせて使用することができ
る。水を使用する場合、その量は一般に全溶媒系（例え
ば水足す水混和性溶媒）に関し50重量％より少ない。し
かし、或種の溶媒は金属イオンと錯体をつくり種々のメ
タロプロテイナーゼ酵素を不活性化するようなので、こ
のような溶媒と共に使用する水の量は溶媒系の50％に等
しいかまたはそれ以上でなければならない。錯体をつく
る溶媒の例としてはDMF及びDMSOが含まれる。溶媒が乾
燥したまたは割らない形である場合、溶媒は酵素を固定
化するのに用いられた担体から与えられる若干の水（溶
媒の約10重量％までの）を含んでいよう。好適なアセト
ニトリル溶媒の場合、一般に水の量は最低限度に保た
れ、「割らない」アセトニトリルは良好な溶媒であるこ
とが見だされている。この場合、含まれた水は担体から
来るものだけである。しかし連続法を行う場合、アセト
ニトリル溶媒中の水の量は少なくとも10重量％の水準に
保たれなければならず、一般に５〜50重量％の範囲に入
る。この水の量は酵素の脱水を避けるに有利であり、基
質を溶解する助けとなることができる。連続法を行う場
合には、必要ならば基質流を介して水を加えることがで
きる。さらに詳細には、Ｎを保護されたアスパラギン酸
をフェニルアラニン低級エステル及びそのベンジル置換
誘導体と結合させる場合（連続法でもバッチ法でも）、
アセトニトリルを種々の量の水と用いることができる
が、水の量は50重量％より少ないことが好適である。即
ちCH3CN/H2Oの重量比は１を、好ましくは約2.5を越えて
いなければならない。
当業界の専門家に公知の方法を用い、各結合反応に対
して選ばれた有機溶媒は、該溶媒に対する基質及び生成
するジペプチドまたはパリペプチドの溶解度、水または
他の共溶媒の存在量、酵素に対する共溶媒の効果及び他
の因子のようないくつかの因子に関して最適化すること
ができる。
周知のように、多くのプロテアーゼ酵素はエステラー
ゼ活性をも示す。この活性は水混和性有機溶媒を適当に
選択することにより時により減少させることができる。
例えばアクリロニトリルはエステラーゼ活性を減少させ
る若干の効果を示す。またエステラーゼ活性が別の酵素
によって与えられるか、または同じ分子上にあるエステ
ラーゼ活性部位がプロテアーゼ活性部位と異なっている
場合には、エステラーゼ活性をさらに減少させる阻害剤
を使用することもできる。適当な阻害剤は、えん麦、そ
ら豆、いんげん豆及び馬鈴薯から抽出することができ
る。この抽出法は日本農芸化学会誌、31巻、38頁、（19
57年）に記載されている。阻害剤は純粋な物質の必要は
なく、粗抽出物でよい。
「結合した」という言葉は酵素が適当な不溶性担体上
に固定化され、回収及び再使用し得る錯体を形成してい
ることを意味する。適当な固定化の方法には、物理的吸
着、イオン結合、共有結合、吸着に続く交叉結合または
後酵素を反応媒質に実質的に不溶な担体材料に包含させ
るその他の方法が含まれる。適当な基質としては、珪酸
質材料（例えば多孔性シリカ）、非珪酸質セラミックス
（例えばアルミナ）、または天然または合成有機重合体
材料（例えばアンバライトXAD−７、ポリアクリルアミ
ド共重合体、アガロース及びアルギネートのような樹
脂）がある。これに対し「遊離」の酵素は結合しておら
ず、溶媒系中に溶解または懸濁させることができる。
基質アミノ酸の濃度を高くし適切な反応速度で工程を
行うようにすることが好ましい。結合反応に与える各基
質は、溶媒に対するその溶解度範囲内の濃度で使用され
る。しかし反応の進行と共に原料が消費されるから、基
質の一部を懸濁状態に保つことができる。溶液中におい
て基質材料は夫々約0.001〜約２モル、好ましくは約0.1
〜約１モルの範囲の濃度で存在しなければならない。
Ｎ−置換アスパラギン酸／フェニルアラニン低級アル
キルエステルの結合反応に関しては、酸／エステルのモ
ル比は両方の基質がＬ配置を有する場合には1:1である
ことができる。実際には10:1〜１〜1:10の範囲で使用す
ることができ、3;1〜1:5が好適である。両基質がDL配置
をもっている場合には、Ｌ−異性体の割合が上記範囲に
入るような量で使用することができる。
本発明は、例えば水を含んだ固定化された酵素を、両
方の原料を含む水と混和し得る有機溶媒中に懸濁させ、
撹拌しながら反応を進行させることにより実施すること
ができる。反応が完結したら、固定化された酵素と反応
生成物を含む溶液または懸濁液とを瀘過または他の分離
方法により互いに分離することができる。
本発明はまた水を含んだ固定化した酵素を充填したカ
ラム中に、二種の原料を含む水混和性有機溶媒を流すこ
とによっても行うことができる。この方法によれば、反
応を連続的に行うことができ、本発明を工業的に応用す
る際に有利である。
反応温度は通常約10〜約80℃、好ましくは約20〜約50
℃である。
反応時間は二つの基質の濃度、固定化した酵素の量、
予め決められた転化率等に依存する。しかし、通常反応
時間は約0.5〜約200時間であり、好ましくは約２〜約24
時間で十分である。
所望の生成物がアスパルテームとして知られているジ
ペプチドである場合には、反応生成物、即ちＮ−置換−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ルは通常の方法、例えば反応生成物を濃縮した後再結
晶、抽出等を行う方法により分離することができる。ま
た反応混合物は当業界に公知の適当な方法により固定化
された酵素から分離することができる。分離後、固定化
された酵素は再使用できる。
本発明を実施する場合、アミノ酸基質はDLまたはＬの
配置をもっていることができる。酵素がＬ異性体に対し
選択性をもっている時には、DL異性体を使用してもＬ異
性体だけが反応に関与し、Ｄ異性体は反応せずに反応媒
質中に残る。酵素が立体選択性をもたない場合には、Ｄ
異性体を例えばD,L選択性をもたないセリンプロテアー
ゼのような酵素と一緒に使用することができ、アミノ供
与体（例えばアラニンまたはフェニルアラニン）はＤで
あることができる。
実施例１ サーモアーゼの固定化 アンバライトXAD−７樹脂のビーズをエタノールで洗
浄し、次いで水を洗浄して微細物を除去する。洗浄した
ビーズを0.05モルMes/0.02モルCaCl2溶液の中に再懸濁
させる。アンバライトXAD−７を真空瀘過して過剰の水
を除去した後、ビーズ（100g）を４℃において9gのサー
モアーゼを含む0.05モルMes/0.02モルCaCl2緩衝溶液100
mlに懸濁させる。一晩振盪した後、固定化したサーモア
ーゼを上記混合緩衝溶液で十分に洗浄した後真空瀘過し
た。
実施例２ 遊離酵素を使用した 「割らない」水混和性溶媒中での結合反応25mlのフラ
スコ中においてＺ−Ｌ−アスパラギン酸（0.192g、80ミ
リモル）及びD,L−エリスロ−フェニルセリンメチルエ
ステル（0.42g、240ミリモル）を割らない有機溶媒（ア
セトニトリル、ジオキサン、THFまたはDMF）に溶解し、
最終容積を9mlにする。粗製のサーモアーゼ粉末（120m
g）を上記反応混合物に加え、反応フラスコを40℃で振
盪する。10時間後、反応混合物中のＺ−アスパルチル−
Ｌ−エリスロフェニルセリンメチルエステル（Ｚ−OH−
アスパルテーム）の濃度をHPLCによって決定する。結果
を次の表に示す。
実施例３ 固定化した酵素を用いる結合反応 実施例２と及び同じ実験を繰返したが、固定化したサ
ーモアーゼ（サーモアーゼを固定化する方法は実施例１
記載の通り）1gを120mgの粗製サーモアーゼ粉末の代り
に用いた。20時間の反応後、Ｚ−OH−アスパルテームの
濃度をHPLCで決定した。結果を下記表に示す。
実施例４ Ｚ−Phe−PheOMeを生成するためのアセトニ
トリル中での結合反応 25mlのフラスコ中においてＺ−Ｌ−フェニルアラニン
（0.216g、80ミリモル）及びＬ−フェニルアラニンメチ
ルエステル（0.32g、200ミリモル）を割らないアセトニ
トリルに溶解し、最終容積を9mlにする。固定化したサ
ーモアーゼ（2.5g）を反応混合物に加え、反応フラスコ
を40℃で振盪する。18時間反応させた後、Ｚ−Ｌ−フェ
ニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの
濃度は70ミリモルであった。
実施例５ D,L−エリスロフェニルセリンの結合反応 １のバイオリアクターの中で30gのＺ−asp、65gの
D,L−エリスロフェニルセリンメチルエステル及び80gの
湿った固定化したサーモアーゼを40℃において650mlの
アセトニトリルに混合する。24時間後22gのＺ−Ｌ−ア
スパルチル−フェニルセリンメチルエステルを得た。
実施例６ ビブリオ・プロテオリティクス酵素によるプ
ロテアーゼ（即ち「ビブリオ」）の調製 1.種子培養の調製 A.準備−500mlの目盛付きエルレンマイヤー・フラスコ
の中に100mlの種菌培地を入れ、121℃で20分間オートク
レーブ処理する。
B.接種−微生物の入った単一の−70℃のアンプルを水道
水の下で解かし、種菌フラスコへ無菌的に移す。
C.培養−接種したフラスコを250rpm/27℃で18時間培養
する。
D.640mlで測定された増殖度は、光学密度4.0〜6.0であ
った。ブィヨンのpHは約8.0であった。
2.規模を拡大した醗酵−1.5の醗酵容器中で容積1.0
で行う。
A.準備−容器に培地のすべての成分（ポリペプトン20
g、食塩20g、MgSO2・7H2O 0.4g、Ｐ−2000 0.2ml）を加
えたが、滅菌前にはpHの調節は行わない。pHは約7.0で
なければならない。オートクレーブ中で滅菌した場合、
1.0の容器を温度121℃で45分間滅菌しなければならな
い。
B.接種 （１）設定及び二重チェック操作パラメータ a.6NのNaOHでpHを約8.6にする。
b.温度75℃ c.RPM 1000 d.空気1.0LPMにおいて溶存酸素の読み 100％ （２）10mlの種菌ブィヨンを接種した。
C.操作 （１）上記パラメータを維持する。
（２）溶存酸素は最高要求量の約75〜80％に低下する。
（３）次の量を監視する。
a.光学濃度−640nmにおける吸光度の読み。約12〜14時
間で光学濃度は10〜12のピークに達する。
b.メタロエンドペプチダーゼの生成−毎秒約0.1単位。
3.ビブリオ酵素の収得及び濃縮 醗酵開始後約14〜16時間で生成酵素は、ファグラ（FA
GLA）試験法で測定して約0.10単位／秒活性の力価に達
する。ブィヨンは細胞が進んだ段階に分裂する前に収得
する（約10〜25％）。
先ずブィヨン全体を遠心分離にかけ細胞部分を分離す
る。次に上澄液をアミコン（Amicon）社製のSIOYIO及び
SIYIO限外瀘過カートリッジを用いて70〜100倍に濃縮す
る。最後に濃縮液を３回0.01モルのhepes及び0.01モル
のCaCl2緩衝溶液（pH7.2）で洗浄する。
上記方法を用いるビブリオ・プロテオリティクスを米
国メリーランド州ロックヴィル（Rockville）パーク・
ローン・ドライヴ（Park Lawn Drive）12301所在のアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American
Type Culture Collection）番号ATCC53559として寄託
した。
実施例７ Ｎ−フォルミルアスパラギン酸の結合反応 実施例６と同様にしてつくったビブリオ・プロテオリ
ティクスの醗酵ブィヨンを濃縮し洗浄した。醗酵ブィヨ
ン中の中性のプロテアーゼを実施例１と同様な方法でア
ンバライトXAD−７上で固定化した。Ｎ−フォルミルア
スパラギン酸（1.93g）及びＬ−フェニルアラニンメチ
ルエステル（6.2g）をアセトニトリルに溶解し最終容積
を150mlにする。湿った固定化中性プロテアーゼ14.5gを
加えた後、反応を室温で24時間行う。最終生成物（Ｎ−
フォルミルアスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチル
エステル）の濃度はHPLCで測定して11.7g/であった。
溶媒を真空蒸発させ、残渣を酢酸エチルに溶解し、1Nの
HClで２回洗浄する。水性相を酢酸エチルで処理する。
一緒にした有機相を塩水で洗浄し、一晩MgSO2上で乾燥
する。溶媒を蒸発させると無色の固体が得られ、これを
ジクロロエタンから再結晶しＮ−フォルミルアスパルテ
ームと同定した。
実施例８ 水／水混和性溶媒系の使用 水／水混和性有機溶媒をジペプチドの酵素的合成反応
の有機媒質として試験した。各反応混合物中の基質の濃
度はＺ−アスパラギン酸が80ミリモル、D,L−エリスロ
フェニルセリンメチルエステルが240ミリモルであっ
た。サーモアーゼ酵素及びシリカを使用して得た固定化
した触媒は、ウィートール（Weetall）のカルボニル−
アルキルアミン共有結合法［メソッズ・イン・エンザイ
モロジー（Methods in Enzymology）64巻、134〜148頁
（1976年）のエイチ・エイチ・ウィートールの論文参
照］を使用して調製した。
Ｚ−アスパルチル−Ｌ−エリスロフェニルセリンメチ
ルエステルの合成は、シリカで固定化した酵素を用いた
場合、溶媒が90％以上を占める濃度のエタノール、ジメ
チルスルフォキシド、N,N−ジメチルフォルムアミドま
たはアセトン中では認められなかった。シリカで固定化
した酵素を用いた場合、割らない1,2−ジメトキシエタ
ン及び1,4−ブタンジオール中におけるジペプチドの収
率は共に理論値の25％であった。シリカではなくアンバ
ライトを使用した実施例３とこの結果を比較すると、担
体の選択が酵素反応に影響を及ぼし得ることが示され
る。アンバライトで固定化した酵素を用いた場合、95％
エタノール及び1,4−ブタンジオール中でのジペプチド
の収率は夫々20％及び40％であった。すべたの反応は40
℃で行った。
実施例９ 水／アセトニトリル溶媒系の使用 固定化したまたは遊離のサーモアーゼ酵素を使用し、
ジペプチドの酵素的合成に対する水／水混和性有機溶媒
としてアセトニトリルを試験した。この合成反応に使用
した基質の濃度はＺ−アスパラギン酸が80ミリモル、D,
L−エリスロフェニルセリンメチルエステルまたはＬ−
フェニルアラニンメチルエステルが240ミリモルであっ
た。実施例１記載の吸着法によりサーモアーゼ酵素をア
ンバライト上に固定化した。合成反応は100％アセトニ
トリル、75％アセトニトリル/25％水、50％アセトニト
リル/50％水及び25％アセトニトリル/75％水系中で試験
した。24時間反応を監視し、反応速度及び収率を決定し
た。遊離の酵素を高アセトニトリル濃度で使用した場
合、ジペプチドの反応速度は遅いことが認められた。ア
セトニトリル濃度が25及び50％の場合にはジペプチド合
成反応は著しくは認められなかった。しかし、アセトニ
トリル濃度が75％以上の場合は反応速度は同様であり、
共に24時間で約70％の収率を示した。アセトニトリル濃
度90％以上でさらに長く培養すると、ジペプチドの収率
は90％を越えた。すべての反応は40℃で行った。
実施例10 結合反応の大規模化 固定化したプロテアーゼ酵素を含む１撹拌器付タン
ク反応器を使用して、Ｚ−アスパルチル−Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステルジペプチドの連続製造法を示
す。80gのアンバライト触媒をＺ−アスパラギン酸160ミ
リモル及びＬ−フェニルアラニンメチルエステル480ミ
リモルを含む700mlの割らないアセトニトリル中に加え
る。触媒は実施例１の方法で調製した。一定に撹拌しな
がら反応温度を40℃に保つ。26時間後90％のジペプチド
収率が得られた。３回の別々の操作中同じ酵素触媒を使
用して新しい反応原料とアセトニトリルとを反応器に装
入したが、活性の低下は見られなかった。
実施例11 アセトニトリル中における固定化したプロナ
ーゼによるＺ−Asp−Ｌ−エリスロPhserOMeの合成 Ｚ−アスパラギン酸（192mg）及びD,L−エリスロフェ
ニルセリン（411mg）をアセトニトリル（9ml）中に含む
溶液に、アンバライト上で固定化したプロナーゼＥ［シ
グマ・ケミカルズ（Sigma Chemicals）社製］（湿った
重量1.5g）を加えた。この混合物を23℃で19時間振盪す
る。HPLC分析の結果182mgのＺ−Asp−Ｌ−エリスロPhse
rOMeが得られた。
実施例12 アセトニトリル中における固定化したキモト
リプシンによるＺ−Ｌ−Tyr−Ｄ−AlaOMeの合成 Ｎ−Ｚ−Ｌ−チロシン（102mg、0.32ミリモル）及び
Ｄ−アラニンメチルエステル（137mg、0.66ミリモル）
をアセトニトリル（4ml）中に含む溶液に、アバライトX
AD−７上で固定化したキモトリプシン（湿った重量0.5
g）を加えた。この混合物を室温で39時間振盪する。固
定化した酵素を瀘過し、溶媒を蒸発して85mgのＺ−Ｌ−
Tyr−Ｄ−AlaOMeを得た。

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｎ−末端保護基をもったアミノ酸またはペ
    プチド或いはその塩の酸成分を、Ｃ−末端保護基をもっ
    たアミノ酸またはペプチド或いはその塩のアミノ成分と
    を、ペプチド結合を形成するために水を含有するメタロ
    プロテイナーゼ及び水に対するアセトニトリルの重量比
    が1:1を超える溶媒の存在下において反応させることに
    よってジペプチドまたはポリペプチドを製造する方法。
  2. 【請求項２】溶媒が50重量％を超えるアセトニトリルを
    含んでおり、残りが水である特許請求の範囲第１項記載
    の方法。
  3. 【請求項３】溶媒が50重量％を超えるアセトニトリルを
    含んでおり、残りが水、一種またはそれ以上のアセトニ
    トリル以外の水混和性有機溶媒またはそれらの混合物で
    ある特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】メタロプロテイナーゼが固定化された形態
    にある特許請求の範囲１〜３項のいずれかに記載の方
    法。
  5. 【請求項５】酵素がサーモリシンである特許請求の範囲
    第１〜４項のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】Ｎ−末端保護基をもつアミノ酸がアスパラ
    ギン酸またはその塩である特許請求の範囲第１〜５項の
    いずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】Ｃ−末端保護基をもつアミノ酸がフェニル
    アラニンの低級アルキルエステルである特許請求の範囲
    第１〜５項のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】保護されたアミノ酸がフェニルアラニンの
    メチルエステルである特許請求の範囲第７項記載の方
    法。
  9. 【請求項９】Ｎ−原子の保護基がフォルミルまたはベン
    ジロキシカルボニルである特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】Ｎ−保護基がｔ−アルコキシカルボニ
    ル、ベンジロキシカルボニル、ｐ−トルエンスルフォニ
    ル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニルまたはフォルミル
    である特許請求の範囲第１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】フェニルアラニンの低級アルキルエステ
    ルが式 但し式中Phはフェニル基であり、Ｘは−OH、−SH、−O
    l、−Br、−Ｉ、−OCOCH3、−OCOOCH3、−NH2または−S
    CH3であり、Ｒは炭素数１〜４の低級アルキル基であ
    る、 に対応する特許請求の範囲第８項記載の方法。
  12. 【請求項１２】Ｘが−OHであり、Ｒがメチルである特許
    請求の範囲第11項記載の方法。
  13. 【請求項１３】Ｃ−末端保護基をもつアミノ酸がＤ−ア
    ラニンである特許請求の範囲第１項記載の方法。
  14. 【請求項１４】Ｎ−末端保護基をもったアミノ酸または
    その塩及びＣ−末端保護基をもったアミノ酸またはその
    塩が、それぞれＮ−置換アスパラギン酸またはその塩、
    及びベンジル基の炭素原子が一個またはそれ以上の水素
    と容易に置き換り得る動き易い基によって置換されてい
    るフェニルアラニン低級アルキルエステルである特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
  15. 【請求項１５】エステラーゼ阻害剤の存在下において反
    応を行う特許請求の範囲第１〜14項のいずれかに記載の
    方法。
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