JPS5837840B2 - ペプチドの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はペプチドの製造方法に関し、特に酵素を触媒と
するペプチドの合成方法に関する。

従来のペプチドを合成する代表的な方法としてはカルボ
キシル活性法に基づくアジド法、混合酸無水物法、カル
ボジイミド法、活性エステル法、酸塩化物法を挙げるこ
とができる。

しかし、これらの従来法ではカルボキシル末端アミノ酸
残基におげるラセミ化および副反応の生起、温度制御、
溶媒の選択をはじめアミノ保護基およびカルボキシル保
護基の性質、アミノ酸側鎖の官能基に及ぼす影響等を考
慮しなげればならず工業的には種々の問題がある。

フラグメント縮合法はペプチド合成反応をフラグメント
ごとに分割でき不慮の失敗による損失を最小限に《いと
めることができるばかりでなく工業的には有利な点が多
い。

しかし、★★フラングメント縮合法ではラセミ化を起こ
す可能性のない唯一のアミノ酸であるグリシンがカルボ
キシル末端に在る場合はよいが、それ以外のアミノ酸の
場合にはラセミ化の生起が避けられないという重大な欠
点を有するものである。

ペプチドの製造においてラセミ化を避けることは最も重
要な問題であり、反応中にラセミ化が起った場合には生
成物を不純にし、不必要な異性体の除去を要し工業的に
は不利となる。

前述のペプチド結合形成に関する従来法のうち、アジド
法はラセミ化を起こしにくい唯一の方法である点で利用
価値が高いが他の方法に比較して操作が煩雑であり、ヒ
ドラジド生成工程において副反応が生起し、そのため収
率では必ずしも優れているとはいえない。

前述の純有機化学的方法とは別にパパインおよびキモト
リブシンによるペブチド結合の生成が報告されている。

（たとえばＪ． Ｓ， Ｆｒｕｔｏｎ／／Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ″
ｖｏｌ ５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｊｎ
ｃ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ． Ｙ．１９４９） この方法を反応式で示すと次ぎのとおりである。

前記（１）−｛３）の従来法において共通している事項
は（ｎ）のいわゆるアミン戒分の末端に結合しているフ
エニルアミノ基は容易には脱離しえない基であり、一旦
形成したペプチドから脱離するには激しい条件下での加
水分解が要求され、結局ペプチド鎖の開裂が生起すると
いう重大な欠陥があり、したがって、これらの方法をペ
プチド合成に利用することは不可能と考えられていた。

また、（４）の方法はトランスアミデーションおよびト
ランスペプチデーションという副反応を伴い、実用的で
ないことが報告されている。

〔たとえばＲ，Ｂ，Ｊ ｏｈｎｓｔｏｎ等：Ｊ． Ｂｉ
ｏｌ， Ｃｈｅｍ， １８５、６２９（１９５０）お
よびＪ．Ｓ． Ｆｒｕｔｏｎ等：Ｊ，Ｂｉｏｌ ．Ｃ
ｈｅｍ， ２ ０ ４、８９１（１９５３））すなわ
ち（４）の方法ではアミン或分の末端に結合している酸
アミド体の第１級アミノ基がパパインによるアミダーゼ
作用を促進させるものである。

したがって前記の方法は、いずれもアミン成分の末端カ
ルボキシル基の保護基がアニリドまたは第１級アミドの
結合を形成する場合においてもパパインまたはキモトリ
プシンがペプチド結合形成の触媒作用を有することを示
す学術的意義を有するに止り、オリゴペプチド、ポリペ
プチドの合成に対する可能性を示すものではなかった。

本発明はこのような現状に鑑みてなされたものであり、
その目的は所望のオリゴペプチドまたはポリペプチドを
簡単な操作で高純度かつ高収率で製造する方法を提供す
ることである。

本発明は金属プロティナーゼに属する酵素がペプチド結
合を生成する脱水縮合反応に媒触作用を有することの知
見に基くもので、本発明は、金属プロテイナーゼに属す
る酵素の存在下に一般式Ｘ−Ａ−ＯＨ（式中Ｘは末端ア
ミノ基の保護基であり、Ａはアミノ酸残基またはペプチ
ド残基である）で示されるＮ末端に保護基を有するアミ
ノ酸またはペプチドと一般式Ｈ−Ｂ−Ｙ（式中Ｙは末端
カルボキシル基の保護基であり、ＢはＡと同一のまたは
異なるアミノ酸残基またはペプチド残基である）で示さ
れるＣ末端に保護基を有するアミノ酸またはペプチドと
を、反応液のｐＨを検出する手段と、反応液のｐＨを調
節するために酸又は塩基を反応液に添加する手段を備え
た反応装置中で、水性溶液中金属プロティナーゼが酵素
活性を示すｐＨの範囲内において反応させることを特徴
とする一般式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｙ（式中Ｘ，Ａ，Ｂ、Ｙは前
記定義と同一である）で示されるペプチドの製造方法で
ある。

本発明について概説すると、本発明で使用される金属プ
ロテイナーゼ（Ｍｅｔａｌｌｏ ｐｒｏｔｅｉｎａｓ
ｅ ）に属する酵素としてはストレプトミセス （ Ｓ ｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ）起源の中性プロティ
ナーゼ、バチルス・ズブチリス・バリエタス・アミ口リ
クイファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ ｖａｒ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
起源）、バチルス・サーモプロテオリテイカス（ Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｉｔｉｃ
ｕｓ起源）サーモライシン（ ’Ｉ’ ｈｅｒｍｏｌｙ
ｓ ｉｎ ）、コラゲナーゼ（ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓ
ｅ ）およびクロタルスアトロックスプロテイナーゼ（
Ｃｒｏｔｕｌｕｓ ａｔｒｏｘｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
） が例示される。

これらの酵素は加水分解においてアミノ側のアミノ酸残
基すなわち、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニ
ン、バリンなどにおける疎水性残基で規則性を有し、カ
ルボキシル側のそれらに規則性のないことが報告されて
いる。

Ｃ Ｈ， Ｍａｔｓｕｂａｒａ ｅｔ ａｌ ；Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ， Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
， ２ １、２４２（１９６５）） 出発物質として使用される一般弐Ｘ−ｔ−ＯＨ（式中Ｘ
は末端アミノ基の保護基であり、Ａはアミ４残基または
ペプチド残基である）で示されるアミノ酸またはペプチ
ドは前記（１）−｛４）の既知方法に示される（Ｉ）に
相当する化合物であり、本明細書では以下この化合物を
酸成分という。

酸成分においてＡはアミノ酸又はそのペプチドの残基を
意味し、アミノ酸としてはペプチド合或の分野で使用さ
れるグリシン、アラニン、パリン、ノルバリン、ロイシ
ン、イソロイシン、ノルロイシンのようなモノアミノモ
ノカノレボン酸、セリ冫′、スレオニン、ホモセリンの
ようなオキシアミノ酸、メチオニン、側鎖官能基の保護
されたシスチン又はシステインのようなイオウを含むア
ミノ酸、側鎖カルボキシル基の保護されたアスパラギン
酸又はグルタミン酸のようなモノアミノジカルボン酸、
（測鎖アミノ基の保護された）オルニチン、リジンまた
はアルギニンのようなジアミノモノカルボン酸ナどの脂
肪族アミノ酸並にフエニルアラニンチロシンのような芳
香族核またはヒスチジン、トリプトファンのような複素
環をもつアミノ酸が例示され、本明細書ではこの分野で
通常使用される略号により表示され、ペプチドについて
も同様である。

酸或分の遊離末端アミノ基に対する保護基としては第３
級アルコキシ力ルボニル、たとえば第３級プチルオキシ
カルボニル（Ｂｏｃ−）、第３級アミルオキシカルボニ
ル（ｔ−Ａｏｃ−）など置換または非置換ペンジルオキ
シヵルボニル、たとえばペンジルオキシカルボニル（Ｚ
−）、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（ＰＭＺ
−）、３・５ジメトキシベンジルオキシカルボニル Ｃ Ｚ （ＯＭｅ ）２ ”’Ｊ、２−４・６−｝リ
メチルヘンジルオキシカルボニル（ＴＭＺ−） 、ｐ−
フェニルアソヘンジルオキシヵルポニル（ＰＺ−）、ｐ
トルエンスルホニル（Ｔｏｓ−）、ｏ−ニトロフエニル
スルフエニル（Ｎｐｓ−）などカ代表的ナ例として挙げ
られる。

酸成分は遊離酸として反応系に添加されるが、反応系の
ｐＨ条件において電離しうる塩として添加されてもよい
。

一方の出発物質として使用される一般式 Ｈ−Ｂ−Ｙで示されるアミノ酸またはペプチドは前記（
１）−｛４）の既知方法で示される（Ｉｆ）の化合物に
相当する化合物であり、本明細書では以下アミン成分と
いい、ＢはＡと同一のまたは異なるアミノ酸またはペプ
チドの残基を示す。

アミン成分におけるカルボキシル基の保護基としてはエ
ステルのアルコキシ残基、たとえばメトキシ（ ＯＭ
ｅ）、エトキシ（−０Ｅｔ）、第３級アルコキシ基、た
とえば第３級プトキシ（−０Ｂｕｔ）、置換または非置
換ペンジルオキシ基たとえばペンジルオキシ（ −０Ｂ
ｚｌ ） 、置換または非置換ペンズヒドリルオキシ基
たとえばベンズヒドリルオキシ（−０Ｂｈ） 、アミド
基、置換または非置換ペンジルアミノ基たとえば２・４
−ジメトキシベンジルアミノ（−ＮＨＤＭＢ） 、置換
または非置換ペンズヒドリルアミノ基たとえばペンズヒ
ドリルアミノ（−ＮＨＢｈ ）等が挙げられる。

本発明で用いる酸成分及びアミン成分はすでに述べたこ
とから明らかな様にアミノ酸又はペプチド残基の側鎖に
官能基のある場合を含むものである。

この場合これらの官能基を保護するのが望ましいことが
多く、その保護基としてはω一アミノ基（Ｎ（Ｉ））の
保護にはＮω−ペンジルオキシカルボニル（Ｎω一Ｚ）
、ｔ−プトキシカルボニル（Ｎω一Ｂｏｃ）及びトシル
（Ｅω−ＴＯＳ）などを、アルギニンのＮ−グアニジノ
基（ＮＧ）の保護にはニトロ基のほかＮＧ−ベンジルオ
キシカルボニル（ＮＧ−Ｚ）およびＮ０・ＮＧ−ジベン
ジルオキシカルボニル（Ｎ’ −Ｚ −Ｚ ）などを、
イミダゾール核（Ｎｌｍ） の保護にはＮｌｍ −
ベンジル（Ｎｌｍ−ＢＺｌ）及びトシル（Ｎｌｍ一Ｔｏ
ｓ ）などを、ω一カルボキシル基の保護にはωベンジ
ルオキシ（ −０Ｂｚｌ ）などをまたオキシアミノ酸
の水酸基が保護される必要のある場合には脂肪族、芳香
族アミノ酸の別なく、０−エーテル型、たとえば０−ベ
ンジル基（ＯＢｚｌ）などを使用することができ、シス
テインのメルカプト基のＳ一保護基としてはＳ−ベンジ
ル基（ＳＢｚｌ ）などが使用できる。

本明細書でいう保護基は少なくとも導入された基が反応
に際して安定であることおよび生成物から容易に脱離で
き、その脱離の際に副反応を生起しないことの条件を満
すことを意味する。

出発物質の酸成分およびアミン成分は前記の保護基を有
するほか、アミン或分のＮα−アミノ基は遊離の場合は
勿論、塩酸基、臭化水素酸塩、しゆう酸塩、ｐ−トルエ
ンスルホン酸塩および酢酸塩などの無機または有機酸塩
の形態のいずれのものを使用してもよい。

本発明においてペプチド結合を生或する脱水縮合反応は
水性溶液中、本発明で用いる酵素が酵素活性を示すｐＨ
の範囲で実施することが必要である。

この範囲はほぼｐＨ ６乃至８程度の範囲である。

本発明を工業的に実施する際、反応溶液のｐＨをこの範
囲に保つために，反応装置に反応液のｐＨを検出する手
段と酸又は塩基を供給する手段とを設け、検出した反応
液のｐＨに応じて、これに酸又は塩基を供給し、これに
より反応液のｐＨを所望の範囲に保つ。

具体的には検出した反応溶液のｐＨに応じて、これに調
節された量の塩基を供給し、ｐＨが８８度を超えた場合
には酸を供給する。

出発物質は一般にアミン成分１モルに対して酸成分０．
８〜２モル好ましくは１〜１．５モルの割合で用いる。

これらの出発物質が水性溶媒に溶け難い場合にはメタノ
ール、エタノールのようなアルコール、ジメチルホルム
アミド、ジオキサン、テトラヒド口フラン、ジメチルス
ルホキシド等の溶媒を加えてその溶解性を改善すること
ができる。

この場合その添加量は本発明の酵素反応を阻害しない程
度に止める必要があり、通常水１重量部に対して溶媒１
重量部以下を用いる。

本発明の反応は水性溶媒中で進行し、反応生戒物が相対
的にこれに対する溶解度の小さくなる系であることが必
要で、好ましくは反応生成物が難溶または不溶となる系
である。

反応に要する酵素量はアミン成分１ｍｍｏｌに対して１
０〜４００ｒｎ９、望ましくは５０〜３００■である。

反応温度は酵素活性を維持する観点から一般には２０〜
４５゜Ｃである。

前記の条件で反応を実施することにより、反応は円滑に
進行し、通常１〜２４時間で完結する。

生或物は反応系外に析出するので容易に単離することが
できる。

次に本発明を実施例について説明するが、本発明はこれ
によりなんら限定されるものではない。

実施例 Ｉ Ｚ −Ｇｌｎ −ＯＨ ２ ８ ０． ２ｍ９（ １
ｍｍｏｌ ）及びＨ−Ｐｈｅ −Ｐｈｅ −ＯＢｕｔ
２６８．５■（ｌｍｍｏｌ）をフラスコ中に懸濁した
。

これにｐＨメーターのガラス電極を挿入し、水酸化ナト
リウム水溶液（１／１０規定）を滴下してｐＨを６、５
〜７．０に調節しながらサーモアーゼ１００ｍ９を添加
し、フラスコを振盪して固形分を溶解させた。

これを３８℃で２０時間振盪して反応させた。

この間、ガラス電極ｐＨメーターにより反応液のｐＨを
測定し、水酸化ナトリウム水溶液（１／１０規定）を添
加して析出した結晶をＰ別し、水、希塩酸（１規定）、
水、アンモニア水（７％）及び水で洗浄後乾燥した。

これを酢酸エチルより再結晶してｍ，ｐ， １ ９ ７
〜２ ０ ０℃を有するＺ−Ｇ１ｎＰｈｅ −Ｐｈｅ
−ＯＢｕｔ３ ３ ０ｍ９ （ ５ ２．３％）を得た
。

実施例 ２ Ｚ −Ｐｈｅ −Ｖａｌ −ＯＨ ３ ９ ８．５ｍ
９（ １ ｍｍｏｌ）及びＨ −Ｐｈｅ −Ｖａｌ −
ＯＢｕ ｔ３ ２ ０． ４ ｍ９（ １ ｍｍｏｌ
）をフラスコ中で水１０ｒｒｌｌに懸濁した。

次いでこれにｐＨメーターのガラス電極を挿入し、水酸
化ナトリウム水溶液（ １／１ ０規定）を滴下してｐ
Ｈを６．５〜７．５に調節しながらサーモアーゼ１００
Ｉｒｌ９を添加し、フラスコを振盪して固形分を溶解さ
せた。

これを３８℃で２０時間振盪して反応させた。

この間ガラス電極ｐＨメーターにより反応後のｐＨを測
定し、塩酸（１／１０規定）を添加して反応液のｐＨを
６．５〜７．５に保持した。

析出した結晶を口刑し、水、希塩酸（１規定）、水、ア
ンモニア水（７％）及び水で順次洗浄後乾燥した。

これを酢酸エチル；石油エーテルより再結晶してｍ，ｐ
， １ ３ ０ 〜１ ４ ５’Ｃを有するＺ −Ｐｈ
ｅ−Ｖａｌ −Ｐｈｅ −Ｖａｌ −ＯＢｕ ｔ２ ４
０ｍ９を得た。

収率３４．２％。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 金属プロティナーゼに属する酵素の存在下に一般式
   Ｘ−Ａ−ＯＨ（式中Ｘは末端アミノ基の保護基であり、
   Ａはアミノ酸残基またはペプチド残基である）で示され
   るＮ末端に保護基を有するアミノ酸またはペプチドと『
   般式Ｈ−Ｂ−Ｙ（式中Ｙは末端カルボキシル基の保護基
   であり、ＢはＡと同一のまたは異なるアミノ酸残基また
   はペプチド残基である）で示されるＣ末端に保護基を有
   するアミノ酸またはペプチドとを、反応液のｐＨを検出
   する手段と、反応液のｐＨを調節するために酸又は塩基
   を反応液に添加する手段を備えた反応装置中で、水性溶
   液中金属プロティナーゼが酵素活性を示すｐＨの範囲内
   において反応させることを特徴とする一般式Ｘ−Ａ−Ｂ
   −Ｙ（式中Ｘ，Ａ、Ｂ，Ｙは前記定義と同一である）で
   示されるペプチドの製造方法。 ２ 反応をｐＨ ６〜８で行う特許請求の範囲第１項記
   載の製造方法。 ３ 金属プロティナーゼが放線菌起源の中性プロテイナ
   ーゼ、バチルス・ズブチリス・バリエタス・アミ口リク
   イファシエンス、バチルス・サーモプロテオリテイカス
   、サーモライシン、コラゲナーゼ、クルタルスアトロッ
   クスプロテイナーゼ又はこれらの混合物である特許請求
   の範囲第１項又は第２項記載の製造方法。 ４ アミノ酸残基またはペプチド残基を示すＡ及びＢが
   それぞれ同一の又は異なる、脂肪族のαモノアミノモノ
   カルボン酸、オキシアミノ酸、イオウを含むアミノ酸、
   モノアミノジヵルボン酸若しくはジアミノモノカルボン
   酸の残基、芳香環を有するアミノ酸の残基、複素環を有
   するアミノ酸の残基又はこれらのアミノ酸残基からなる
   オリゴ若しくはポリペプチド残基である特許請求の範囲
   第１項乃至第３項のいずれかの項記載の製造方法。 ５ 脂肪族モノアミノモノカルボン酸がグリシン、アラ
   二ン、パリン、ノルバリン、ロイシン、インロイシン又
   はノルロイシンであり、脂肪族オキシアミノ酸がセリン
   、スレオニン又はホモセリンであり、脂肪族のイオウを
   含むアミノ酸がメチオニン、側鎖官能基の保護されたシ
   スチン又はシステインであり、脂肪族モノアミノジカル
   ボン酸が側鎖力ルボキシル基の保護されたアスパラギン
   酸又はグルタミン酸であり、脂肪族ジアミノヵルボン酸
   が側鎖アミノ基の保護されたオルニチン、リジン又はア
   ルギニンであり、芳香環を有するアミノ酸が７エニルア
   ラニン又はチロシンであり、かつ複素環を有するアミノ
   酸がヒスチジン又はトリプトファンである特許請求の範
   囲第４項記載の製造法。