JP2838800B2

JP2838800B2 - 減感作剤

Info

Publication number: JP2838800B2
Application number: JP1228085A
Authority: JP
Inventors: 直松橋; 美津子臼井; 正和三橋; 駿作安藤
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1989-09-02
Filing date: 1989-09-02
Publication date: 1998-12-16
Anticipated expiration: 2013-12-16
Also published as: KR910005881A; EP0416816A1; CA2024167A1; JPH0393730A; DE69014498T2; EP0416816B1; US5073628A; DE69014498D1; KR0155383B1

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は、減感作剤に関する。更に詳細には、新規ス
ギ花粉アレルゲン、とりわけ、部分アミノ酸配列として
そのＮ末端から順に、Ala−Ile−Asn−Ile−Phe−Asn−
の配列を有している花粉アレルゲンと糖質とを共有結合
せしめた減感作剤に関する。

〈従来の技術〉スギ花粉症は、スギの開花時に飛散する花粉によって
引き起こされるアレルギー症である。

近年、我国においては、スギの植林面積の増大につれ
て、スギ花粉症患者数は漸増しており、季節的な発症と
はいえ公衆衛生上無視できない状態になっている。

従来、スギ花粉症の治療法としては、ステロイドホル
モンやクロモグリク酸ナトリウムなどの投与が行なわれ
てきたが、これらはいずれも対症療法であって、単に患
者の症状を一時的に和げるにすぎない。

一方、スギ花粉症の原因物質であるスギ花粉アレルゲ
ンを投与して減感作し、スギ花粉症を根治しようとする
試みが行なわれている。

しかしながら、、この減感作療法では、スギ花粉アレ
ルゲンによるアナフィラキシーの危険が伴うだけでな
く、この危険を回避しようとしてアレルゲンを少量ずつ
投与することを必須とし、その治療期間は約３年もの長
期に亙る欠点がある。

また、スギ花粉アレルゲンは、ガラス容器、金属器具
などに極めて吸着され易く、減感作に際して、スギ花粉
アレルゲンを一定量ずつ投与することが極めて困難であ
り、その取扱いに細心の注意を必要としている。

〈発明が解決しようとする課題〉本発明者等は、スギ花粉症の予防または治療を目的と
して、スギ花粉アルレゲンの改質に着目し、新しい減感
作剤の確立をめざして鋭意研究し、既に、特開平１−15
6926号公報でスギ花粉アレルゲンと糖質とを共有結合せ
しめた減感作剤を出願した。

しかしながら、この減感作剤は、大部分の患者の症状
を和らげることが判明したものの、一部になおこの減感
作剤で減感作し難い患者のいることが判明した。

そこで、スギ花粉に含まれるアレルゲン自体について
更に研究を続け、新規アレルゲンの検索と、このアレル
ゲンと糖質とを結合せしめた減感作剤の確立をめざして
鋭意研究を続けてきた。

〈課題を解決するための手段〉本発明は上記課題を解決するためになされたものであ
って、新規スギ花粉アレルゲン、とりわけ、部分アミノ
酸配列としてそのＮ末端から順に、Ala−Ile−Asn−Ile
−Phe−Asn−の配列を有している花粉アレルゲンが花粉
中に少量存在することを見いだし、この新規花粉アレル
ゲンが、特開平１−156926号公報で開示した部分アミノ
酸配列としてそのＮ末端から順に、Asp−Asn−Pro−Ile
−Asp−Ser−の配列を有している花粉アレルゲンの約1/
50乃至1/5量混在していることを見いだし、更に、この
新規アレルゲンと糖質とを共有結合しせけた減感作剤が
本目的を満足することを見いだし、本発明を完成した。

本発明で言うスギ花粉アレルゲンは、ニッポンスギ
（オモテスギ、ウラスギ）の花粉から調製されるアレル
ゲンで、その構造が、部分アミノ酸配列として、そのＮ
末端から順に、Ala−Ile−Asn−Ile−Phe−Asn−の配列
を有し、更に望ましくは、Ｎ末端から順に、Ala−Ile−
Asn−Ile−Phe−Asn−Val−Glu−Lys−Tyr−の配列を有
しているアレルゲンが好適である。

本発明で言う糖質とは、例えば、澱粉、アミロース、
デキストラアン、ポリシュクロース、プルラン、エルシ
ナン、カードラン、アラビアガム、トラガントガム、グ
アーガム、ザンタンガム、カラギーナン、ペクチン、セ
ルロース、グルコマンナン、キトーサン、リポポリサッ
カライドなどの各種単純若しくは複合多糖類、これら多
糖類誘導体、またはこれら多糖類の部分加水分解物など
が自由に利用でき、その平均分子量は、通常500〜10,00
0,000、とりわけ、10,000〜1,000,000の範囲のものが望
ましい。

なかでも、プルラン、エルシナンまたはこれらの部分
加水分解物などのマルトトリオース残基を繰り返し単位
とする水溶性中性多糖類の使用は、スギ花粉アレルゲン
と共有重結させることにより、スギ花粉アレルゲンによ
るアナフィラキシーを防止できるとともに、より効果の
高いスギ花粉症減感作剤を容易に製造できるので好都合
である。

また、大腸菌、サルモネラ菌、セラチア菌などの微生
物由来のリポポリサッカライドなどの複合多糖類または
これらの部分加水分解物の使用は、スギ花粉アレルゲン
と共有結合させることにより、粘膜などへの結合性が優
れていることから、経皮、経粘皮型減感作剤として好都
合である。

本発明で言う共有結合方法は、スギ花粉アレルゲンと
糖質とが共有結合し得る各種の方法を採用でき、例えば
ジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋法、アミド
結合法、過沃素酸酸化法、Ｓ−Ｓ結合法などがある。

ジアゾ法としては、例えばｐ−アミノベンジル基、ｐ
−アミノベンゾイル基、ｍ−アミノベンジル基、ｍ−ア
ミノベンゾイル基、ｍ−アミノアニソール基、ｍ−アミ
ノベンジルオキシメチル基、３−（ｐ−アミノフェノキ
シ）−２−ヒドロキシプロピオニル基、３−（ｐ−アミ
ノ−ｍ−メチルアニリノ）−５−クロロトリアジニル基
などの芳香族アミノ基を公知の方法によって導入して得
た活性化糖質とスギ花粉アレルゲンとを反応させればよ
い。

ペプチド法としては、例えば、カルボキシル基を有す
る糖質を例えばアジド、酸クロリド、カルボジイミド、
イソシアナートなどの誘導体とした糖質カルボナート、
臭化シアン活性化糖質などの活性化糖質とスギ花粉アレ
ルゲンとを反応させればよい。

アルキル化法としては、例えば、クロロアセチル基、
ブロモアセチル基、ヨードアセチル基、ハロゲン化トリ
アジニル基などを導入した糖質ハロゲン化アルキル誘導
体とスギ花粉アレルゲンとを反応させればよい。

架橋法としては、スギ花粉アレルゲンと糖質との共存
下に、例えば、グルタルアルデヒド、グリオキザール、
サクシンアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアナー
ト、トルエン−2,4−ジイソシアナート、ビスアゾベン
ジジン、N,N′−エチレンビスマレインイミドなどの架
橋試薬を反応させればよい。

アミド結合法としては、例えば、アミノ基を有する糖
質を、例えば、ブロモアセチルブロマイド、クロロブチ
リルクロライド、フルオロプロピオニルフルオライド、
ヨードバレリルアオダイドなどのハロアシルハライドと
反応せて得られる活性化糖質とスギ花粉アレルゲンとを
反応させればよい。

反応時のスギ花粉アレルゲンと糖質との重量比は、通
常は1:0.001〜1,000、望ましくは、1:0.01〜100から選
ばれる。

反応条件は、生成するスギ花粉アレルゲン糖質結合物
がスギ花粉アレルゲン本来のイムノグロブリンＧおよび
イムノグロブリンＭ抗体産生能を実質的に低下せしめる
ことなく、アナフィラキシーおよびアレルキーを惹起す
るイムノグロブリンＥ抗体産生能を著減し得る条件であ
ればよく、通常は温度約０〜100℃、pH約３〜12で約0.1
〜50時間の範囲が選ばれる。

このようにして生成したスギ花粉アレルゲン糖質結合
物を、通常、例えば濾過、洗浄、遠心分離、塩析、透
析、吸脱着、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動などの
方法で分離精製した後、濃縮して溶液状またはシラップ
状で採取するか、更に乾燥し粉末状で採取してスギ花粉
症に対する減感作剤を得る。

本減感作剤は、そのままで、または必要に応じて、例
えば安定剤、防腐剤、アジュバント、賦形剤などを添加
し、スギ花粉症の予防剤、治療剤などとして有利に利用
できる。

このようにして製造される減感作剤は、従来使用され
ているスギ花粉アレルゲンの場合と比較して、該アレル
ゲンに特異的なイムノグロブリンＧ、イムノグロブリン
Ｍ抗体産生を著しく増大し、一方、アレルギーやアナフ
ィラキシーを惹起する該アレルゲンに特異的なイムノグ
ロブリンＥ抗体産生を著しく低減できる。また、スギ花
粉症患者に投与して、該アレルゲンに特異的なイムノグ
ロブリンＥ抗体量を著減させることもできる。

更に、本発明の減感作剤は、スギ花粉アレルゲンと比
較してガラス容器、金属器具などへの吸着損失もなく、
安定性良好であり、また、アナフィラキシーの恐れなく
投与でき、更に、減感作に要する時間も約1/3〜1/200に
短縮できるなどの長所を有している。

本発明の減感作剤は、例えば、凍結乾燥注射剤、溶液
注射剤などの注射剤として製造され、皮内、皮下、筋肉
内、腹腔内などに成人１回当り約0.01〜100,000ngの範
囲から選ばれる量を、毎週１〜２回程度約１〜12ヶ月間
投与することによって減感作の目的を達成することがで
きる。

更に、本発明の減感作剤は、例えば、トローチ、舌下
錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ロ
ーション剤などの経皮、経粘皮薬としても製造され、そ
の投与量、投与頻度などを適宜選択することにより、そ
の減感作の目的を有利に達成することができる。

この局所投与方法の場合には、本発明の減感作剤がス
ギ花粉症患者の組織に結合しているイムノグロブリンＥ
とアレルゲンとの結合を阻止することもできることか
ら、その作用は、投与された局所で即効性であり、患者
の苦痛を直ちに和らげることができる。

また、本発明の減感作剤は、スギ花粉症の予防剤、治
療剤のみならず、ヒノキ花粉症の予防剤、治療剤として
も有利に使用できる。

更に、本減感作剤は、先願特開平１−156926号公報で
開示されている減感作剤と併用することにより、適応患
者を広げることも有利に実施できる。

以下、本発明を実験により詳細に説明する。

実験Ｉ−１スギ花粉アレルゲンの調製千葉県産のスギ（オモテスギ）から採取したスギ花粉
に、重量で約15倍量の0.125Mの炭酸水素ナトリウム水溶
液（pH8.0）を加え、４℃でゆっくり１時間撹拌抽出し
た後、遠心分離して上清を得た。残渣を同様に再度抽出
し遠心分離した。これらの上清を硫安塩析（80％飽和）
し、塩析物を透析、濾過し、濾液をDEAE−セファデック
スカラムにかけ、非吸着画分を採取し、これを、CM−セ
ファデックスカラムにかけ、リン酸塩緩衝液（pH7.0）
で溶出し、次いで、Mono Sカラムにかけ、トリス塩酸緩
衝液（pH7.0）存在下、塩化ナトリウム濃度勾配で分離
溶出してヒト花粉症患者のイムノグロブリンＥ抗体およ
び抗スギ花粉アレルゲンマウス抗体と強い親和性を示す
精製スギ花粉アレルゲン液を、原料のスギ花粉に対し
て、固形物当り約0.001％の収率で得た。

なお、本発明のアレルゲンの調製方法において、Mono
Sカラムからの分離溶出に際し、先頭の特開平１−1569
26号公報で開示したスギ花粉アレルゲンが塩化ナトリウ
ム濃度約0.25Mで溶出されたのに対し、本発明のアレル
ゲンは、塩化ナトリウム濃度約0.40Mで溶出され、その
収量は先願アレルゲンの約1/20であった。

本品を、SDS−PAGEで測定したところ、分子量約40,00
0±5,000で、等電点は約9.5附近であった。

本品を用いて、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemis
try）、第256巻、第7990〜7997頁（1981年）の記載に準
じて、気相プロテインシークエンサーにより分解し、
高速液体クロマトグラフィーで同定して、部分アミノ酸
配列を調べたところ、そのＮ末端から順に、アラニン−
イソロイシン−アスパラギン−イソロイシン−フェニル
アラニン−アスパラギン−バリン−グルタミン酸−リジ
ン−チロシン−の配列を有していることが判明した。こ
の配列を構成するアミノ酸残基はいずれも光学異性体Ｌ
体であって、本明細書では、Ala−Ile−Asn−Ile−Phe
−Asn−Val−Glu−Lys−Tyr−と省略記号で示すことも
ある。

実験Ｉ−２スギ花粉アレルゲンとプルランとの共有結
合物の調製プルラン（平均分子量200,000）の2w/v％水溶液100mL
に1.7w/v％塩化シアヌルアセトン溶液2mLを加え、氷水
中で５℃以下に保つと共に５％炭酸ナトリウム水溶液で
pHを7.0に保ちつつ２時間反応させた後、そのpHを保ち
つつ４℃の水で一夜透析して活性化プルラン液を得た。
この活性化プルラン液30mLに実験Ｉ−１の方法で得た精
製スギ花粉アレルゲン液40mL（mL当り約1mgのアレルゲ
ンを含む）を加え、撹拌しつつpH7.0、37℃に５時間保
ち、次いで、５℃で一夜放置し、これにグリシン6gを加
えて撹拌しつつ10時間保った。これを0.01M酢酸緩衝液
（pH5.0）で透析し、次いでCM−セファデックスカラム
にかけ、その非吸着画分を精密濾過してアレルゲンプル
ラン共有結合物を得た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約60％であった。

本品は、スギ花粉アレルゲンの場合とは違って、ガラ
ス容器、金属器具への吸着損失もなく、安定性良好で取
扱い容易である。

実験Ｉ−３動物への投与テスト実験Ｉ−３−１予防剤テストマウス（BALB/C、10〜12週令、メス、１群６匹）を用
いて、実験Ｉ−２の方法で得たアレルゲンプルラン共有
結合物をアレルゲンとして１μｇ含有した生理食塩水0.
2mLを毎週１回、３週に亙って腹腔内投与し、その１週
間後に、実験Ｉ−１の方法で得たスギ花粉アレルゲン１
μｇとアジュバントとして水酸化アルミニウム4mgとの
混合物を含有する生理食塩水0.2mLと同様に投与した。

スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンG,イ
ムノグロブリンＭ抗体量およびイムノグロブリンＥ抗体
量は、アレルゲンと水酸化アルミニウム混合物の投与直
前と投与終了１週間経過後に採血して測定した。

対照として、アレルゲンプルラン共有結合物の代り
に、実験Ｉ−１の方法で調製したスギ花粉アレルゲン１
μｇと実験Ｉ−２で用いたプルラン40μｇとの混合物を
使用した以外は同様に行った。

なお、イムノグロブリンＧ、イムノグロブリンＭ抗体
量は、ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Th
e Journal of Biochemistry）、第92巻、第1413〜1424
頁（1982年）に報告されている酵素免疫吸着測定法（EI
A）による抗体価で、イムノグロブリンＥ抗体量は、ラ
イフ・サイエンス（Life Science）、第８巻、パートI
I、第813〜820頁（1969年）に報告されているPCA反応に
よる抗体価で比較した。結果は第１表に示す。

第１表の結果から明らかなように、本発明のスギ花粉ア
レルゲンとプルランとの共有結合物は、それらの単なる
混合物とは違って、スギ花粉症を予防する減感作剤とし
て好適である。

実験Ｉ−３−２治療剤テストマウス（BALB/C、10〜12週令、メス、１群６匹）を用
いて、実験Ｉ−１の方法で得たスギ花粉アレルゲン１μ
ｇとアジュバントとして水酸化アルミニウム4mgとの混
合物を含有する生理食塩水0.2mLを毎週１回、３週に亙
って腹腔内投与し、その２週間後に、実験Ｉ−２の方法
で得たアレルゲンプルラン共有結合物をアレルゲンとし
て１μｇ含有した生理食塩水0.2mLを毎週３回、３週に
亙って同様に投与した。

更に、イムノグロブリンＥ抗体産生の再誘導をアレル
ゲン水酸化アルミニウム混合物で同様に行った。

イムノグロブリンＧ、イムノグロブリンＭ抗体量およ
びイムノグロブリンＥ抗体量は、アレルゲンプルラン共
有結合物投与直前と投与終了１週間経過後、更にイムノ
グロブリンＥ抗体再誘導１週間経過後に採血して測定し
た。

対照実験は、実験Ｉ−３−１の場合と同様に、アレル
ゲンプルラン共有結合物の代りにスギ花粉アレルゲンと
プルランとの混合物を使用した。結果は第２表に示す。

第２表の結果から明らかなように、本発明のスギ花粉
アレルゲンとプルランとの共有結合物は、それらの単な
る混合物とは違って、スギ花粉症を治療する減感作剤と
して好適である。

また、アレルゲン水酸化アルミニウム混合物の投与に
より予め感作させ、イムノグロブリンＥ産生の認められ
たモルモット、ラットまたはマウスを用いて、上記のア
レルゲンプルラン共有結合物を含有する生理食塩水を口
腔内、鼻腔内、皮内または皮下に投与し、その１時間後
にスギ花粉アレルゲンを口腔内、鼻腔内、皮内または皮
下に投与したところ、本来起こるべきアレルギー反応は
観察されなかった。

以上述べてきたように、本発明のスギ花粉アレルゲン
と糖質との共有結合物は、アナフィラキシーの恐れもな
く、高い減感作効果を発揮するので、スギ花粉症を予防
または治療するための減感作剤として好適である。

実験II−１スギ花粉アレルゲンとリポポリサッカライ
ドとの共有結合物の調製大腸菌由来のリポポリサッカライド10mgを含む10mMリ
ン酸カルシウム溶液1mLに、100mM過沃素酸ナトリウム60
μＬを加え、室温で20分間反応させリポポリサッカライ
ドの糖鎖を開裂させた後、４℃の1M−グリシン塩酸緩衝
液（pH4.4）で一夜透析し、過剰量の過沃素酸ナトリウ
ムを除去し、これに0.1M−炭酸水素ナトリウム緩衝液を
加えてpHを約9.5に調整した。

又、リン酸緩衝液（pH9.5）1mLに、実験Ｉ−１の方法
で得た精製スギ花粉アレルゲン10mgを溶解し、これに上
記のリポポリサッカライド溶液を混合し、シッフ塩基
（Schiff base）を形成させた。

更に、水素化硼素ナトリウムを加えて複合体の形成反
応を完了させ、次いでセファデックスＧ−100カラムに
かけ、アレルゲンリポポリサッカライド共有結合物を含
有する画分を採取し、その画分を精密濾過してアレルゲ
ンリポポリサッカライド共有結合物を得た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約40％であった。

本品は、スギ花粉アレルゲンの場合とは違って、ガラ
ス容器などへの吸着損失などもなく、安定性良好で取扱
い容易である。

実験II−２動物への投与テスト治療剤テストマウス（BALB/C、10〜12週令、メス、１群６匹）を用
いて、実験II−１の方法で得たアレルゲンリポポリサッ
カライド共有結合物をアレルゲンとして10μｇ含有した
生理食塩水1mLをマウスに毎週３回、３週に亙って経口
投与し、次いでその投与１週間経過後に採血してスギ花
粉アレルゲンに特異なイムノグロブリンＡ、イムノグロ
ブリンＧ抗体量およびイムノグロブリンＥ抗体量を測定
した。

対照実験は、アレルゲンリポポリサッカライド共有結
合物の代わりに、アレルゲンとリポポリサッカライドと
の混合物を使用した以外は、同様に行った。なお、イム
ノグロブリンＡおよびイムノグロブリンＧ抗体量は、ジ
ャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Journal
of Immunological Methods）、第６巻、第355〜362頁
（1975年）に報告されているEIA法による抗体価で、イ
ムノグロブリンＥ抗体量は、実験Ｉ−３−１で用いたPC
A反応による抗体価で比較した。結果は、第３表に示
す。

第３表の結果から明らかなように、本発明のアレルゲ
ンリポポリサッカライド共有結合物は、それらの単なる
混合物とは違って、スギ花粉症を予防または治療する減
感作剤として好適である。

また、アレルゲン水酸化アルミニウム混合物の投与に
より予め感作させ、イムノグロブリンＥ産生の認められ
たマウスを用いて、上記のアレルゲンリポポリサッカラ
イド共有結合物を含有する生理食塩水を口腔内および鼻
腔内に噴霧し、その30分後にスギ花粉アレルゲンを口腔
内および鼻腔内の噴霧したところ、本来起こるべきアレ
ルギー反応は観察されなかった。

一般に、アレルゲンリポポリサッカライド共有結合物
などのスギ花粉アレルゲンと複合多糖類との共有結合物
は、アレルゲンプルラン共有結合物などのスギ花粉アレ
ルゲンと単純多糖類との共有結合物の場合と比較して、
粘膜結合性に優れ、局所に止どまる時間が長いことか
ら、粘膜での吸収率が高く経口、経鼻腔など経皮、経粘
皮型の減感作剤としてより優れた効果を発揮する。

以下、本発明の実施例を述べる。

実施例１（１）スギ花粉アレルゲンの調製秋田県産のスギ（ウラスギ）から採取したスギ花粉を
用いて、実験Ｉ−１の方法に準じて、精製スギ花粉アレ
ルゲン液を調製し、原料のスギ花粉に対して、固形物当
り約0.001％の収率で得た。本品をSDS−PAGEで測定した
ところ、分子量約40,000±5,000で、等電点は約9.5付近
であった。

また、本品を用いて、実験Ｉ−１の方法に準じて、部
分アミノ酸配列を調べたところ、そのＮ末端から10番目
までのアミノ酸配列が、実験Ｉ−１で述べたオモテスギ
由来の花粉アレルゲンの部分アミノ酸配列と同一結果を
得た。

（２）減感作剤プルラン（平均分子量約140,000）5gを水400mLに溶解
し、1N−水酸化ナトリウム液でpHを10.7とした後、この
pHを保ちつつ臭化シアン3gを徐々に加え、１時間反応さ
せた。次いで1N−塩酸でpHを5.0にした後、このpHを保
ちつつ冷水で透析して活性化プルラン液を調製した。

この活性化プルラン液に、（１）の方法で調製したウ
ラスギ由来の花粉アレルゲン液200mLを加えて室温下で2
4時間反応させた。反応後、反応液の３倍量のアセトン
を加えて沈澱物を採取し、これを0.01M酢酸緩衝液（pH
5.0）に溶解し、遠心分離して不溶物を除去し、上清をC
M−セファデックスカラムにかけその非吸着画分を精密
濾過し、アンプル詰めして、アレルゲンプルラン共有結
合物を含有する液状減感作剤を得た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約70％であった。

本品は、アナフィラキシーの恐れもなく、高い減感作
効果を発揮するのでスギ花粉症の予防剤、治療剤として
好適である。

また、本品は、スギ花粉アレルゲンの場合とは違っ
て、ガラス容器、金属器具への吸着損失もなく、安定性
良好で取扱い容易である。

実施例２プルラン部分加水分解物（平均分子量約10,000）52g
をジメチルホルムアミド110mLに加温しつつ溶解し、次
いで室温に冷却してこれに10mLのピリジンを加え、撹拌
しつつ、４−ニトロベンゾイルクロリド1.0gを添加し、
室温下で17時間保った。これに２倍容量のｎ−プロピル
アルコールを加え沈澱物を採取し、ジメチルホルムアミ
トに溶解した。この操作を３回繰り返して得た沈澱を5w
/v％ハイドロサルファイトナトリウム水溶液100mLに溶
解して80℃に30分間保った後、活性炭で脱色し、２倍容
量のｎ−プロピルアルコールで沈澱したものを水に溶解
して、一夜水道水で透析した。この溶液を２℃以下に冷
却し、撹拌しつつ塩酸を最終濃度約0.1Nになるように加
えて、次に亜硝酸ナトリウムを約1w/v％になるように加
え、その後30分間反応させ、次いで２℃以下の蒸留水で
２時間透析して活性化プルラン部分加水分解物を得た。

この活性化プルラン部分加水分解物溶液に実験Ｉ−１
の方法で得たオモテスギ由来の花粉アレルゲン液20mLを
加え、炭酸ナトリウム水溶液でpH8.5として４℃に保
ち、撹拌しつつ２時間結合反応させた後、実施例１と同
様に精製し、アンプル詰めしてアレルゲンプルラン部分
加水分解物共有結合物を含有する液状減感作剤を得た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約60％であった。

本品は、実施例１の場合と同様にスギ花粉症の予防
剤、治療剤として好適であり、カラス容器、金属器具へ
の吸着損失もなく、安定性良好でその取扱いも容易であ
る。

実施例３エルシナン（平均分子量約200,000）10gを200mL蒸留
水中に加温しつつ溶解し、次いで室温まで冷却して、こ
れにヘキサメチレンジアミン5gを添加し、1N−水酸化ナ
トリウム液でpHを11.0とした。これを氷水中20℃以下に
保つとともにpHを維持しつつ臭化シアン5gを添加し、撹
拌しながら30分間反応させ、続いて４℃の蒸留水で１時
間透析して活性化エルシナン溶液とした。

この活性化エルシナン溶液に25w/v％グルタルアルデ
ヒド液2mLと実験Ｉ−１の方法で調製したオモテスギ由
来のスギ花粉アレルゲン液60mLを加え、更に1M酢酸緩衝
液（pH5.0）を10mL添加し、４℃で24時間撹拌しつつ結
合反応させ、次いでグリシンを濃度1Mになるように添加
し、室温で24時間保ち、更に遠心分離し、上清をゲル濾
過してアルゲンエルシナン共有結合物の画分を採取し
た。これを濃縮し、精密濾過し、ビン詰、凍結乾燥し、
キャップシールしてアレルゲンエルシナン共有結合物を
含有する固状減感作剤を得た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約50％であった。

本品は、実施例１の場合と同様にスギ花粉症の予防
剤、治療剤として好適であり、その取扱いも容易であ
る。

実施例４ 1w/v％カルボキシメチルセルロース（平均分子量約2
0,000）水溶液200mLに１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド−メチオジド2gを添加
し、1N−塩酸でpHを4.0に維持して撹拌しつつ室温下で
２時間反応させた後、蒸留水で一夜透析し、活性化カル
ボシメチルセルロース溶液を調製した。

この活性化カルボキシメチルセルロース溶液に、実施
例１（１）の方法で調製したウラスギ由来の花粉アレル
ゲン液50mLを添加し、pHを4.5に維持して撹拌しつつ室
温下で一夜反応させた後、実施例３と同様に精製し、ア
ンプル詰めしてアレルゲンカルボキシメチルセルロース
共有結合物を含有する液状減感作剤を得た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約30％であった。

本品は、アレルゲンプルラン共有結合物、アレルゲン
エルシナン共有結合物の場合よりもスギ花粉アレルゲン
に特異的なイムノグロブリンＧ、イムノグロブリンＭ抗
体産生量がやや劣るものの、該アレルゲンに特異的なイ
ムノグロブリンＥ抗体の産生はなく、スギ花粉症の予防
剤、治療剤として使用しうるものであり、その取扱いも
容易である。

実施例５サルモネラ菌由来のリポポリサッカライド100mgを約
４℃の50％飽和酢酸ナトリウム25mLに加え、0.5N−水酸
化ナトリウムを用いてpH9.0とし、これにブロモアセチ
ルブロマイド20μＬと無水ジオキサン1mLとの混合溶液
（pH約8.5）を徐々に添加した。次いで、6N−塩酸を用
いてpH約4.5に調製し、４℃の水で５日間透析し、活性
化リポポリサッカライド溶液を調製した。

この活性化リポポリサッカライド溶液に、実施例１
（１）の方法で調製したウラスギ由来の花粉アレルゲン
液40mLを添加し、pHを4.5に維持して撹拌しつつ、25℃
で２日間反応させた後、実施例３と同様に精製し、アン
プル詰してアレルゲンリポポリサッカライド共有結合物
を含有する液状減感作剤を得た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約35％であった。

本品は、スギ花粉症の予防剤、治療剤として好適であ
り、その取扱いも容易である。

また、糖質としてリポポリサッカライドを使用する本
品は、粘膜結合性に優れ局所に止どまる時間が長いこと
から、粘膜での吸収が高く経口径鼻腔などの経皮、経粘
皮型減感作剤としてより優れた効果を発揮する。

〈発明の効果〉上記したことから明らかなように、本発明の新規スギ
花粉アレルゲン、とりわけ、部分アミノ酸配列としてそ
のＮ末端から順に、Ala−Ile−Asn−Ile−Phe−Asn−の
配列を有している花粉アレルゲンと糖質とを共有結合せ
しめた減感作剤は、スギ花粉アレルゲンの場合と比較し
て、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリン
Ｇ、イムノグロブリンＭ抗体産生を著しく増大するとと
もに、アレルギーやアナフィラキシーを惹起する該アレ
ルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体産生を著しく
低減できるので、アナフィラキシーの恐れなく投与で
き、減感作に要する期間も約1/3〜1/200に短縮できる。

また、本発明の減感作剤は、スギ花粉症患者の組織に
結合しているイムノグロブリンＥと花粉アレルゲンとの
抗原抗体反応を阻止し、患者の局所での苦痛を即効的に
和らげることができることから、経皮、経粘皮薬などの
局所投与剤としても有利に利用できる。

更に、本発明の減感作剤は、ガラス容器、金属器具な
どへの吸着損失もなく、スギ花粉アレルゲンと比較して
安定性良好であり、取扱いも容易でその工業的意義は大
きい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 39/36 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】部分アミノ酸配列としてそのＮ末端から順
に、Ala−Ile−Asn−Ile−Phe−Asn−の配列を有してい
るスギ花粉アレルゲンと糖質とを共有結合せしめた減感
作剤。
【請求項２】スギ花粉アレルゲンの部分アミノ酸配列
が、そのＮ末端から順に、Ala−Ile−Asn−Ile−Phe−A
sn−Val−Glu−Lys−Tyr−の配列を有していることを特
徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の減感作剤。
【請求項３】スギ花粉アレルゲンが、ニッポンスギの花
粉から調製したものであることを特徴とする特許請求の
範囲第（１）項または第（２）項記載の減感作剤。
【請求項４】糖質が、マルトトリオースを繰り返し単位
とする多糖類またはリポポリサッカライドであることを
特徴とする特許請求の範囲第（１）項、第（２）項また
は第（３）項記載の減感作剤。
【請求項５】減感作剤が、スギ花粉症治療のための減感
作剤であることを特徴とする特許請求の範囲第（１）
項、第（２）項、第（３）項または第（４）項記載の減
感作剤。