JP2898064B2 - ヒトｇｐ１３０蛋白質 - Google Patents
ヒトｇｐ１３０蛋白質Info
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、IL−６のシグナル伝達に関与する蛋白質で
あるヒトgp130蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、さら
には該蛋白質を遺伝子光学的に生産するための手段およ
び方法に関するものである。
あるヒトgp130蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、さら
には該蛋白質を遺伝子光学的に生産するための手段およ
び方法に関するものである。
IL−６は、免疫、造血、炎症という生体防御系におい
て重要な役割を果たしていることを特徴とする、生体の
増殖分化に広く関与する蛋白質である（岸本、Blood,7
4,p1,1989年参照）。さらにIL−６の異常産生が種々の
自己免疫疾患の病因因子である可能性が報告されている
（岸本、平野、Ann.Rev.Immunol.,6,p485,1988年参
照）。
て重要な役割を果たしていることを特徴とする、生体の
増殖分化に広く関与する蛋白質である（岸本、Blood,7
4,p1,1989年参照）。さらにIL−６の異常産生が種々の
自己免疫疾患の病因因子である可能性が報告されている
（岸本、平野、Ann.Rev.Immunol.,6,p485,1988年参
照）。
本発明者はヒトIL−６と特異的に結合する細胞膜上の
ヒトIL−６レセプターの遺伝子を単離し、一次構造を決
定した（特願昭63−194885号明細書参照）。次にマウス
IL−６と特異的に結合する細胞膜上のマウスIL−６レセ
プターの遺伝子を単離し、一次構造を決定した（特願平
１−292230明細書参照）。またヒトIL−６レセプター遺
伝子を出発材料として、治療薬、診断薬として期待され
る、可溶性IL−６レセプター（IL−６レセプターの細胞
外部分）を作製した（特願平１−9774号明細書参照）。
ヒトIL−６レセプターの遺伝子を単離し、一次構造を決
定した（特願昭63−194885号明細書参照）。次にマウス
IL−６と特異的に結合する細胞膜上のマウスIL−６レセ
プターの遺伝子を単離し、一次構造を決定した（特願平
１−292230明細書参照）。またヒトIL−６レセプター遺
伝子を出発材料として、治療薬、診断薬として期待され
る、可溶性IL−６レセプター（IL−６レセプターの細胞
外部分）を作製した（特願平１−9774号明細書参照）。
生体内で生理活性を強く発揮するIL−６の作用を人為
的に調節することは、各種疾患の新しい治療のメカニズ
ムとして期待されている。IL−６の作用を増強あるいは
阻害する治療薬を開発するためには、IL−６のシグナル
伝達の経路に関する知見が重要である。
的に調節することは、各種疾患の新しい治療のメカニズ
ムとして期待されている。IL−６の作用を増強あるいは
阻害する治療薬を開発するためには、IL−６のシグナル
伝達の経路に関する知見が重要である。
本発明者は、IL−６のシグナル伝達の機作を種々研究
した結果、IL−６及びIL−６レセプターのほかに、第三
の因子としてIL−６のシグナル伝達に関与する蛋白質が
存在することを見出し、これがおよそ130kaの見かけ分
子量を有することからヒトgp130と命名した。IL−６の
シグナル伝達をさらに解析するためには、あるいは可溶
性gp130（gp130蛋白質の細胞外部分）をIL−６の阻害剤
として開発するためには、大量の可溶性gp130精製品を
得る必要があるが、gp130の生体内での生産量は極めて
微量である。gp130を遺伝子光学を用いて大量に生産す
るにはgp130をコードするDNA配列に必須である。
した結果、IL−６及びIL−６レセプターのほかに、第三
の因子としてIL−６のシグナル伝達に関与する蛋白質が
存在することを見出し、これがおよそ130kaの見かけ分
子量を有することからヒトgp130と命名した。IL−６の
シグナル伝達をさらに解析するためには、あるいは可溶
性gp130（gp130蛋白質の細胞外部分）をIL−６の阻害剤
として開発するためには、大量の可溶性gp130精製品を
得る必要があるが、gp130の生体内での生産量は極めて
微量である。gp130を遺伝子光学を用いて大量に生産す
るにはgp130をコードするDNA配列に必須である。
従って、本発明はヒトgp130、及びそれをコードするD
NA、並びに該DNAを用いるgp130の製造方法を提供しよう
とするものである。
NA、並びに該DNAを用いるgp130の製造方法を提供しよう
とするものである。
本発明者は、IL−６のシグナル伝達について鋭意研究
を行った結果、IL−６のシグナル伝達に関与する細胞膜
上の蛋白質を発見した。さらに、細胞膜上のIL−６レセ
プターが、IL−６と結合することによりこの膜蛋白質と
結合すること、および、この膜蛋白質がIL−６のシグナ
ル伝達を担っており、IL−６レセプターの細胞内領域は
IL−６のシグナル伝達には関与しないことを証明した。
を行った結果、IL−６のシグナル伝達に関与する細胞膜
上の蛋白質を発見した。さらに、細胞膜上のIL−６レセ
プターが、IL−６と結合することによりこの膜蛋白質と
結合すること、および、この膜蛋白質がIL−６のシグナ
ル伝達を担っており、IL−６レセプターの細胞内領域は
IL−６のシグナル伝達には関与しないことを証明した。
本発明者はさらに、ヒトgp130をコードするDNAをクロ
ーニングすることに成功し、そしてその塩基配列を決定
した。
ーニングすることに成功し、そしてその塩基配列を決定
した。
本発明は上記の成果を基礎とするものであって、IL−
６のシグナル伝達に関与するgp130;ヒトgp130をコード
するDNA配列；組換微生物または培養細胞中で前記DNA配
列を発現し得る複製可能な発現ベクター；前記発現ベク
ターにより形質転換された微生物または培養細胞；及び
前記微生物または培養細胞においてgp130をコードするD
NA配列を発現させることを特徴とするヒトgp130の生産
方法、を提供するものであり、以下詳細に説明する。
６のシグナル伝達に関与するgp130;ヒトgp130をコード
するDNA配列；組換微生物または培養細胞中で前記DNA配
列を発現し得る複製可能な発現ベクター；前記発現ベク
ターにより形質転換された微生物または培養細胞；及び
前記微生物または培養細胞においてgp130をコードするD
NA配列を発現させることを特徴とするヒトgp130の生産
方法、を提供するものであり、以下詳細に説明する。
1.gp130蛋白質 本発明のIL−６のシグナル伝達に関与する細胞膜由来
の蛋白質、すなわちヒトgp130は、IL−６がIL−６レセ
プターと結合して最終的に種々の細胞に増殖分化等の生
物活性を発揮させる際に重要な働きを担っており、天然
状態においては細胞膜に局在している蛋白質である。こ
こで、IL−６とは生体内で作られたIL−６、遺伝子工学
的に作られたIL−６、およびその誘導体等を例示するこ
とができる。またIL−６レセプターとは、生体内で、あ
るいは遺伝子工学的に作られた細胞膜上に存在、あるい
は細胞膜から離脱した可溶性のIL−６レセプター、およ
びその誘導体等を例示することができる。
の蛋白質、すなわちヒトgp130は、IL−６がIL−６レセ
プターと結合して最終的に種々の細胞に増殖分化等の生
物活性を発揮させる際に重要な働きを担っており、天然
状態においては細胞膜に局在している蛋白質である。こ
こで、IL−６とは生体内で作られたIL−６、遺伝子工学
的に作られたIL−６、およびその誘導体等を例示するこ
とができる。またIL−６レセプターとは、生体内で、あ
るいは遺伝子工学的に作られた細胞膜上に存在、あるい
は細胞膜から離脱した可溶性のIL−６レセプター、およ
びその誘導体等を例示することができる。
上記蛋白質は次の性質： （１）IL−６（インターロイキン−６）とIL−６レセプ
ター（インターロイキン−６レセプター）との複合体と
結合し； （２）IL−６単独又はIL−６レセプター単独とは結合せ
ず；そして （３）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において1
30kDaの見かけの分子量を示す； を有する、IL−６のシグナル伝達に関与する蛋白質であ
って、その天然の形質においては第７図中１位のMetか
ら918位のGlnまでのアミノ酸配列を有する。本発明では
前記アミノ酸配列を有する蛋白質の他、前記アミノ酸配
列中の、IL−６とIL−６レセプターの複合体への特異的
な結合に寄与する部分を含有する蛋白質またはポリペプ
チドであれば良い。すなわち前記アミノ酸配列中の１個
または複数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基により
置換されているかまたは欠失もしくは付加されているア
ミノ酸配列を有し、かつIL−６とIL−６レセプターの複
合体と特異的に結合する能力を保持している蛋白質また
はポリペプチドはすべて本発明のgp130の範囲に含まれ
る。例えば、このような蛋白質として、前記アミノ酸配
列中のIL−６とIL−６レセプターの複合体との結合に寄
与するアミノ酸配列および／またはアミノ酸残基部分以
外のアミノ酸配列および／またはアミノ酸残基が置換、
欠損、挿入等により変化したもの、さらには前記アミノ
酸配列のＮ末端側および／またはＣ末端側にアミノ酸配
列および／またはアミノ酸残基が追加された蛋白質、あ
るいは例えばヒト成長ホルモン等の他の蛋白質等が融合
したものであってもよい。なお、本発明において、１個
又は複数個のアミノ酸の欠失もしくは欠損、付加もしく
は挿入、又は置換とは、本件の出願前に周知であった手
法、例えば部位特定変異誘発法、PCR法等により可能な
程度のアミノ酸の欠失、付加又は置換を意味する。
ター（インターロイキン−６レセプター）との複合体と
結合し； （２）IL−６単独又はIL−６レセプター単独とは結合せ
ず；そして （３）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において1
30kDaの見かけの分子量を示す； を有する、IL−６のシグナル伝達に関与する蛋白質であ
って、その天然の形質においては第７図中１位のMetか
ら918位のGlnまでのアミノ酸配列を有する。本発明では
前記アミノ酸配列を有する蛋白質の他、前記アミノ酸配
列中の、IL−６とIL−６レセプターの複合体への特異的
な結合に寄与する部分を含有する蛋白質またはポリペプ
チドであれば良い。すなわち前記アミノ酸配列中の１個
または複数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基により
置換されているかまたは欠失もしくは付加されているア
ミノ酸配列を有し、かつIL−６とIL−６レセプターの複
合体と特異的に結合する能力を保持している蛋白質また
はポリペプチドはすべて本発明のgp130の範囲に含まれ
る。例えば、このような蛋白質として、前記アミノ酸配
列中のIL−６とIL−６レセプターの複合体との結合に寄
与するアミノ酸配列および／またはアミノ酸残基部分以
外のアミノ酸配列および／またはアミノ酸残基が置換、
欠損、挿入等により変化したもの、さらには前記アミノ
酸配列のＮ末端側および／またはＣ末端側にアミノ酸配
列および／またはアミノ酸残基が追加された蛋白質、あ
るいは例えばヒト成長ホルモン等の他の蛋白質等が融合
したものであってもよい。なお、本発明において、１個
又は複数個のアミノ酸の欠失もしくは欠損、付加もしく
は挿入、又は置換とは、本件の出願前に周知であった手
法、例えば部位特定変異誘発法、PCR法等により可能な
程度のアミノ酸の欠失、付加又は置換を意味する。
式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列は918アミノ酸残基
からなり、Ｎ末端側から第２番目に位置するロイシンか
ら第22番目に位置するグリシンにかけてと、第620番目
に位置するアラニンから第641番目に位置するフェニル
アラニンにかけての部分に疎水性アミノ酸残基が位置し
ている。この２つの疎水性領域は、前者がシグナルペプ
チド領域、後者が膜貫通領域であると考えられる。
からなり、Ｎ末端側から第２番目に位置するロイシンか
ら第22番目に位置するグリシンにかけてと、第620番目
に位置するアラニンから第641番目に位置するフェニル
アラニンにかけての部分に疎水性アミノ酸残基が位置し
ている。この２つの疎水性領域は、前者がシグナルペプ
チド領域、後者が膜貫通領域であると考えられる。
2.DAN配列 本発明のヒトgp130蛋白質をコードするDNAは、例えば
第５図中、１位のMetから918位のGlnまでのアミノ酸配
列をコードするものであり、これを代表するcDNAの場
合、第５図中の273位のＡから3026位のＧまでの塩基配
列を有する。本発明のDNA配列は、上記のDNA配列の他、
このDNA配列中の１個または複数個のヌクレオチドが他
のヌクレオチドにより置換されているかまたは欠失もし
くは付加されているDNA配列を有し、かつIL−６とIL−
６レセプターの複合体と特異的に結合する能力を有する
蛋白質をコードしているDNA配列をも含有する。例え
ば、前記１において記載した種々のアミノ酸配列を有す
る蛋白質をコードするDNAが挙げられる。なお、本発明
において１個又は複数個のヌクレオチドの欠失、付加、
又は置換とは、本件の出願前の周知であった手法、例え
ば部位特定変異誘発法、PCR法等により可能な程度のヌ
クレオチドの欠失、付加又は置換を意味する。
第５図中、１位のMetから918位のGlnまでのアミノ酸配
列をコードするものであり、これを代表するcDNAの場
合、第５図中の273位のＡから3026位のＧまでの塩基配
列を有する。本発明のDNA配列は、上記のDNA配列の他、
このDNA配列中の１個または複数個のヌクレオチドが他
のヌクレオチドにより置換されているかまたは欠失もし
くは付加されているDNA配列を有し、かつIL−６とIL−
６レセプターの複合体と特異的に結合する能力を有する
蛋白質をコードしているDNA配列をも含有する。例え
ば、前記１において記載した種々のアミノ酸配列を有す
る蛋白質をコードするDNAが挙げられる。なお、本発明
において１個又は複数個のヌクレオチドの欠失、付加、
又は置換とは、本件の出願前の周知であった手法、例え
ば部位特定変異誘発法、PCR法等により可能な程度のヌ
クレオチドの欠失、付加又は置換を意味する。
3.gp130蛋白質の製造方法 本発明のIL−６のシグナル伝達に関与する細胞膜由来
の蛋白質は、第一の方法として、この蛋白質を産生する
動物細胞から製造することができる。この様な細胞とし
ては、IL−６レセプターを産生する細胞、例えばヒトミ
エローマ細胞U266、マウス白血病細胞株M1、ヒトＢ細胞
株C14等が挙げられる。さらに、本発明のIL−６のシグ
ナル伝達に関与する蛋白質は、IL−６レセプターを産生
しない細胞によっても生産されており、このような細胞
としてマウスＢ細胞株M12、ヒトＴ細胞株Jurkat、マウ
スＴ細胞株CTLL2等を挙げることができる。従って本発
明のIL−６のシグナル伝達に関与する蛋白質は、これら
種々の細胞から得ることができる。
の蛋白質は、第一の方法として、この蛋白質を産生する
動物細胞から製造することができる。この様な細胞とし
ては、IL−６レセプターを産生する細胞、例えばヒトミ
エローマ細胞U266、マウス白血病細胞株M1、ヒトＢ細胞
株C14等が挙げられる。さらに、本発明のIL−６のシグ
ナル伝達に関与する蛋白質は、IL−６レセプターを産生
しない細胞によっても生産されており、このような細胞
としてマウスＢ細胞株M12、ヒトＴ細胞株Jurkat、マウ
スＴ細胞株CTLL2等を挙げることができる。従って本発
明のIL−６のシグナル伝達に関与する蛋白質は、これら
種々の細胞から得ることができる。
本発明の蛋白質は、前記のごとく、IL−６の存在下で
IL−６レセプターと結合し、IL−６の非存在下ではIL−
６レセプターと結合しないから、この性質を利用して単
離することができる。
IL−６レセプターと結合し、IL−６の非存在下ではIL−
６レセプターと結合しないから、この性質を利用して単
離することができる。
例えば、IL−６レセプター及び本発明の蛋白質の両者
を産生する細胞から本細胞の蛋白質を単離するには、ま
ず該生産細胞を培養し、この細胞を、人為的に加えたIL
−６と、生理的条件下で両者間の反応のために十分な時
間、例えばRPMI1640のごとき常用の培地中で約37℃にて
約30分間インキュベートする。次に細胞を常法に従っ
て、例えば１％ジギトニンを含有するトリエタノールア
ミン緩衝液で処理することにより溶解し、IL−６とIL−
６レセプターと本発明の蛋白質とが結合した複合体を含
有する細胞溶解物を得る。あるいは、細胞を常法に従っ
て溶解した後にIL−６を添加し、前記のごとくインキュ
ベートして、前記の複合体を含有する細胞溶解物を得
る。他方、抗IL−６レセプター抗体、例えばMT18抗体
（本明細書の参考例１に従って製造される；なお、特願
昭194885号明細書を参照のこと）を固体キャリアー、例
えばセファロース4Bと、ブロムシアン活性化法により固
定化する。次に、この固定化抗IL−６レセプター抗体と
前記の細胞溶解物とを接触せしめることにより、IL−６
レセプターと抗IL−６レセプター抗体との特異的反応を
介して、本発明の蛋白質を含有する複合体を前記固体キ
ャリアーに固定する。次に、この固体キャリアーを洗浄
して非特異的に結合又は付着している夾雑物を除去した
後、常用の手段、例えば尿素、グアニジン等により複合
体を固体キャリアーから溶出し、本発明の目的蛋白質を
IL−６レセプター含有蛋白質複合体から遊離せしめる。
を産生する細胞から本細胞の蛋白質を単離するには、ま
ず該生産細胞を培養し、この細胞を、人為的に加えたIL
−６と、生理的条件下で両者間の反応のために十分な時
間、例えばRPMI1640のごとき常用の培地中で約37℃にて
約30分間インキュベートする。次に細胞を常法に従っ
て、例えば１％ジギトニンを含有するトリエタノールア
ミン緩衝液で処理することにより溶解し、IL−６とIL−
６レセプターと本発明の蛋白質とが結合した複合体を含
有する細胞溶解物を得る。あるいは、細胞を常法に従っ
て溶解した後にIL−６を添加し、前記のごとくインキュ
ベートして、前記の複合体を含有する細胞溶解物を得
る。他方、抗IL−６レセプター抗体、例えばMT18抗体
（本明細書の参考例１に従って製造される；なお、特願
昭194885号明細書を参照のこと）を固体キャリアー、例
えばセファロース4Bと、ブロムシアン活性化法により固
定化する。次に、この固定化抗IL−６レセプター抗体と
前記の細胞溶解物とを接触せしめることにより、IL−６
レセプターと抗IL−６レセプター抗体との特異的反応を
介して、本発明の蛋白質を含有する複合体を前記固体キ
ャリアーに固定する。次に、この固体キャリアーを洗浄
して非特異的に結合又は付着している夾雑物を除去した
後、常用の手段、例えば尿素、グアニジン等により複合
体を固体キャリアーから溶出し、本発明の目的蛋白質を
IL−６レセプター含有蛋白質複合体から遊離せしめる。
こうして得られた溶液から本発明の目的蛋白質を単離
・精製するには、蛋白質の単離・精製に使用されている
常法、例えば硫酸アンモニウムによる沈澱、カラムクロ
マトグラフィー、例えば逆相クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、電気泳動等を用いればよ
い。これらの単離・精製過程における活性画分の選択
は、IL−６の存在下でのIL−６レセプターへの結合、IL
−６非存在下でのIL−６レセプターへの非結合性、分子
量が130kDaであること等を指標として行うことができ
る。
・精製するには、蛋白質の単離・精製に使用されている
常法、例えば硫酸アンモニウムによる沈澱、カラムクロ
マトグラフィー、例えば逆相クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、電気泳動等を用いればよ
い。これらの単離・精製過程における活性画分の選択
は、IL−６の存在下でのIL−６レセプターへの結合、IL
−６非存在下でのIL−６レセプターへの非結合性、分子
量が130kDaであること等を指標として行うことができ
る。
出発材料として、本発明の蛋白質を産生するがIL−６
レセプターを産生しない細胞を使用する場合には、可溶
性IL−６レセプター及びIL−６の存在下でインキュベー
トした後細胞を溶解して、IL−6/IL−６レセプター／目
的蛋白質から成る複合体を含有する細胞溶解物を調製す
る。あるいは前記の本発明の蛋白質を産生する細胞を溶
解した後にIL−６及びIL−６レセプターとのインキュベ
ーションを行い、最終的にIL−6/IL−６レセプター／目
的蛋白質から成る複合体を含有する細胞溶解物を得るこ
とができる。この細胞溶解物からの目的蛋白質の単離・
精製は前記のようにして行うことができる。
レセプターを産生しない細胞を使用する場合には、可溶
性IL−６レセプター及びIL−６の存在下でインキュベー
トした後細胞を溶解して、IL−6/IL−６レセプター／目
的蛋白質から成る複合体を含有する細胞溶解物を調製す
る。あるいは前記の本発明の蛋白質を産生する細胞を溶
解した後にIL−６及びIL−６レセプターとのインキュベ
ーションを行い、最終的にIL−6/IL−６レセプター／目
的蛋白質から成る複合体を含有する細胞溶解物を得るこ
とができる。この細胞溶解物からの目的蛋白質の単離・
精製は前記のようにして行うことができる。
本発明のIL−６のシグナル伝達に関与する蛋白質の製
造のための第二の方法は遺伝子組換による方法である。
この方法において、IL−６のシグナル伝達に関与する細
胞膜上の蛋白質のアミノ酸配列をコードするDNAは種々
の方法で得ることができる。例えば、該蛋白質を発現し
ている細胞、例えば、ヒトミエローマ細胞から常法に従
ってcDNAライブラリーを作成し、これを種々の方法、例
えば、該蛋白質を精製して決定した部分アミノ酸配列に
基づく方法や、cDNAを発現させ該蛋白質の性質、例え
ば、IL−６の係合したIL−６レセプターとの特異的結合
等により検出する方法等により選択することができる。
こうしてクローン化されたDNAを常法に従って発現せし
めることにより、本発明の蛋白質を製造することができ
る。
造のための第二の方法は遺伝子組換による方法である。
この方法において、IL−６のシグナル伝達に関与する細
胞膜上の蛋白質のアミノ酸配列をコードするDNAは種々
の方法で得ることができる。例えば、該蛋白質を発現し
ている細胞、例えば、ヒトミエローマ細胞から常法に従
ってcDNAライブラリーを作成し、これを種々の方法、例
えば、該蛋白質を精製して決定した部分アミノ酸配列に
基づく方法や、cDNAを発現させ該蛋白質の性質、例え
ば、IL−６の係合したIL−６レセプターとの特異的結合
等により検出する方法等により選択することができる。
こうしてクローン化されたDNAを常法に従って発現せし
めることにより、本発明の蛋白質を製造することができ
る。
4.gp130蛋白質をコードするDNA 上記の方法に使用するDNAは、例えば、ヒト胎盤か
ら、公知な方法で抽出した種々のメッセンジャーRNAよ
り、本発明により提供される式（II）DNA配列をもとに
作製したプローブ等を用いて目的とするメッセンジャー
RNAを抽出し、これをもとに作製しても良いし、また例
えば一部あるいは全部を本発明をもとに化学的に合成し
ても良い。
ら、公知な方法で抽出した種々のメッセンジャーRNAよ
り、本発明により提供される式（II）DNA配列をもとに
作製したプローブ等を用いて目的とするメッセンジャー
RNAを抽出し、これをもとに作製しても良いし、また例
えば一部あるいは全部を本発明をもとに化学的に合成し
ても良い。
5.発現ベクター 本発明で提供されるヒトgp130をコードするDNA配列を
発現、すなわち生産し得る複製可能な発現ベクターは、
前記２で説明されたようなDNA配列を発現させ得るDAN配
列と読取り可能に結合しているgp130をコードするDAN配
列および宿主中でベクターDNAを複製するための複製オ
リジン等を有し、選定した宿主を形質転換できるもので
あれば制限なく適宜選定して使用できる。例えば宿主と
して大腸菌等の細胞株を用いる場合は、pBR322,pBR327
等のプラスミドが例示できる。また例えば、宿主として
哺乳動物等の培養細胞を用いる場合には、SV40ウィルス
由来のDAN複製オリジンを有するベクターが例示でき
る。
発現、すなわち生産し得る複製可能な発現ベクターは、
前記２で説明されたようなDNA配列を発現させ得るDAN配
列と読取り可能に結合しているgp130をコードするDAN配
列および宿主中でベクターDNAを複製するための複製オ
リジン等を有し、選定した宿主を形質転換できるもので
あれば制限なく適宜選定して使用できる。例えば宿主と
して大腸菌等の細胞株を用いる場合は、pBR322,pBR327
等のプラスミドが例示できる。また例えば、宿主として
哺乳動物等の培養細胞を用いる場合には、SV40ウィルス
由来のDAN複製オリジンを有するベクターが例示でき
る。
DNA配列を発現させるためのDAN配列の中でも、プロモ
ーター系は重要であり、しかも選定した宿主との関係に
おいて適宜選定する必要がある。宿主として大腸菌を使
用する場合のプロモーター系としては、乳糖プロモータ
ー系、トリプトファンプロモーター系、さらにはこれら
のハイブリッドプロモーター系が例示できる。宿主とし
て哺乳動物由来の培養細胞を使用する場合のプロモータ
ー系としては、SV40プロモーター系、アデノウィルスプ
ロモーター系、サイトメガロウィルス系が例示できる。
ーター系は重要であり、しかも選定した宿主との関係に
おいて適宜選定する必要がある。宿主として大腸菌を使
用する場合のプロモーター系としては、乳糖プロモータ
ー系、トリプトファンプロモーター系、さらにはこれら
のハイブリッドプロモーター系が例示できる。宿主とし
て哺乳動物由来の培養細胞を使用する場合のプロモータ
ー系としては、SV40プロモーター系、アデノウィルスプ
ロモーター系、サイトメガロウィルス系が例示できる。
6.宿主 本発明では、特別の制限なしに通常の遺伝子工学的に
蛋白質を生産するために用いられる微生物または培養細
胞が使用できる。微生物としては、Ｋ−12,W−3110等の
大腸菌類、枯草菌類、酵母等を例示できる。培養細胞と
しては、COS細胞（猿の腎臓繊維芽細胞）、CHO細胞（チ
ャイニーズハムスターの卵巣細胞）、ミエローマ細胞等
が例示できる。
蛋白質を生産するために用いられる微生物または培養細
胞が使用できる。微生物としては、Ｋ−12,W−3110等の
大腸菌類、枯草菌類、酵母等を例示できる。培養細胞と
しては、COS細胞（猿の腎臓繊維芽細胞）、CHO細胞（チ
ャイニーズハムスターの卵巣細胞）、ミエローマ細胞等
が例示できる。
前記５で説明したベクターにより形質転換された前記
４で説明された様な宿主を培養し、ベクターDNA中のヒ
トgp130をコードするDNA配列を発現させることでヒトgp
130を生産することができる。これはヒトgp130をコード
するDNA配列と結合した該DNA配列を発現させ得るDNA配
列中のプロモーター系の活性化により実現される。
４で説明された様な宿主を培養し、ベクターDNA中のヒ
トgp130をコードするDNA配列を発現させることでヒトgp
130を生産することができる。これはヒトgp130をコード
するDNA配列と結合した該DNA配列を発現させ得るDNA配
列中のプロモーター系の活性化により実現される。
上記の種々の方法により製造される本発明の蛋白質又
は該蛋白質を産生する細胞を免疫原として用いて、該蛋
白質に対するポリクローナル抗体、又はモノクローナル
抗体を常法に従って調製することができる。これらの調
製法に用いる細胞源又は動物としてヒト、マウス、ウサ
ギ、ヒツジ、ヤギなど種々の生物種を例示することがで
きる。
は該蛋白質を産生する細胞を免疫原として用いて、該蛋
白質に対するポリクローナル抗体、又はモノクローナル
抗体を常法に従って調製することができる。これらの調
製法に用いる細胞源又は動物としてヒト、マウス、ウサ
ギ、ヒツジ、ヤギなど種々の生物種を例示することがで
きる。
本発明により提供されるIL−６のシグナル伝達に関与
する細胞膜由来の蛋白質は、IL−６のシグナル伝達機作
を解明するため、及びIL−６作用を調節する治療薬等の
有用物質を開発するのに有用な試薬として使用すること
ができる。例えばIL−６と結合したIL−６レセプターと
特異的に結合してシグナルを伝達する性質等を検出の指
標として用いることにより、IL−６の作用を調節する物
質をスクリーニングすることができる。スクリーニング
の対象となる物質としては、天然物質、合成化合物、遺
伝子工学的に生産されたIL−６あるいはIL−６レセプタ
ー、及びその誘導体、さらにはIL−6,IL−６レセプタ
ー、該蛋白質の抗体等を例示することができる。
する細胞膜由来の蛋白質は、IL−６のシグナル伝達機作
を解明するため、及びIL−６作用を調節する治療薬等の
有用物質を開発するのに有用な試薬として使用すること
ができる。例えばIL−６と結合したIL−６レセプターと
特異的に結合してシグナルを伝達する性質等を検出の指
標として用いることにより、IL−６の作用を調節する物
質をスクリーニングすることができる。スクリーニング
の対象となる物質としては、天然物質、合成化合物、遺
伝子工学的に生産されたIL−６あるいはIL−６レセプタ
ー、及びその誘導体、さらにはIL−6,IL−６レセプタ
ー、該蛋白質の抗体等を例示することができる。
また本発明により提供される蛋白質に、IL−６に結合
した細胞表層から離脱した可溶性IL−６レセプターを結
合させることにより、IL−６作用を増強させるだけでな
く、IL−６レセプターを細胞表層に有しない細胞にもIL
−６を作用させることができよう。一方、該蛋白質と、
IL−６と結合したIL−６レセプターとの結合を、IL−6,
IL−６レセプターあるいは該蛋白質に対する抗体等で阻
害すれば、IL−６の生物活性を阻害することができよ
う。従って本発明の蛋白質は、医薬の活性成分としても
期待される。
した細胞表層から離脱した可溶性IL−６レセプターを結
合させることにより、IL−６作用を増強させるだけでな
く、IL−６レセプターを細胞表層に有しない細胞にもIL
−６を作用させることができよう。一方、該蛋白質と、
IL−６と結合したIL−６レセプターとの結合を、IL−6,
IL−６レセプターあるいは該蛋白質に対する抗体等で阻
害すれば、IL−６の生物活性を阻害することができよ
う。従って本発明の蛋白質は、医薬の活性成分としても
期待される。
本発明で提供されるヒトgp130をコードするDNA配列、
さらには該蛋白質を遺伝子工学的に生産するための手段
および方法により、自然状態では極めて微量にしか生産
されない該蛋白質を大量に生産することが可能である。
さらには該蛋白質を遺伝子工学的に生産するための手段
および方法により、自然状態では極めて微量にしか生産
されない該蛋白質を大量に生産することが可能である。
以下本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示
すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。なお、実施例においては本発明の蛋白質を便宜上
「gp130」と称する場合がある。
すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。なお、実施例においては本発明の蛋白質を便宜上
「gp130」と称する場合がある。
実施例1.ヒトIL−６の存在下でのヒトIL−６レセプター
とヒト細胞膜上の蛋白質（gp130）との結合 ヒトミエローマ細胞U266（IL−６レセプター及びgp13
0蛋白質の両者を産生する細胞）（２×107個）の1mCiの
35S−メチオニンで内部標識した後、２等分し、一方をI
L−６存在下（１μg/ml）、そして他方をIL−６非存在
下で0.5mlのRPMI1640中で37℃で30分間インキュベート
した。その後U266細胞を1mlの１％ジギトニン（和光純
薬）含有10mMトリエタノールアミン緩衝液（pH7.4）、
0.15M NaCl,1mM pAPMSF（和光純薬）で可溶化した。一
方、ブロムシアンで活性化したセファロース4Bに、抗IL
−６レセプター抗体MT18（参考例１）を常法どおり結合
させた。これと前述の可溶化した細胞の上清を混合し、
樹脂上のMT18抗体に可溶化したIL−６レセプターを結合
させた。
とヒト細胞膜上の蛋白質（gp130）との結合 ヒトミエローマ細胞U266（IL−６レセプター及びgp13
0蛋白質の両者を産生する細胞）（２×107個）の1mCiの
35S−メチオニンで内部標識した後、２等分し、一方をI
L−６存在下（１μg/ml）、そして他方をIL−６非存在
下で0.5mlのRPMI1640中で37℃で30分間インキュベート
した。その後U266細胞を1mlの１％ジギトニン（和光純
薬）含有10mMトリエタノールアミン緩衝液（pH7.4）、
0.15M NaCl,1mM pAPMSF（和光純薬）で可溶化した。一
方、ブロムシアンで活性化したセファロース4Bに、抗IL
−６レセプター抗体MT18（参考例１）を常法どおり結合
させた。これと前述の可溶化した細胞の上清を混合し、
樹脂上のMT18抗体に可溶化したIL−６レセプターを結合
させた。
非特異的結合物を前述の１％ジギトニン溶液で洗い流
した。その後、還元条件又は非還元条件にて、ドデシル
硫酸ナトリウム中ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SD
S/PAGE）、及びオートラジオグラフィーを行った。結果
を第１図に示す。第１図中、80kDaのバンドはU266細胞
由来の35S−メチオニン標識されたIL−６レセプターを
示し、そして130kDaのバンドは本発明のgp130蛋白質を
示す。この結果は、IL−６と結合したIL−６レセプター
が37℃では30分以内に単量体の分子量130kDaのヒト蛋白
質（gp130）と結合することを示している。
した。その後、還元条件又は非還元条件にて、ドデシル
硫酸ナトリウム中ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SD
S/PAGE）、及びオートラジオグラフィーを行った。結果
を第１図に示す。第１図中、80kDaのバンドはU266細胞
由来の35S−メチオニン標識されたIL−６レセプターを
示し、そして130kDaのバンドは本発明のgp130蛋白質を
示す。この結果は、IL−６と結合したIL−６レセプター
が37℃では30分以内に単量体の分子量130kDaのヒト蛋白
質（gp130）と結合することを示している。
実施例2.ヒトIL−６の存在下でのヒトIL−６レセプター
とマウス細胞膜上の蛋白質（gp130）との結合 IL−６レセプターを細胞表面に発現しないマウスＢ細
胞株M12に、プラスミドpZipNeoSV（Ｘ）Ｉ（Cepkoら、C
ell,37,p1053,1984年参照）のBamH I部位にヒトIL−６
レセプターcDNAを挿入して作製したプラスミドをエレク
トロポレーション法にて導入し、抗生物質G418（シグマ
社）に対する耐性により形質転換細胞をスクリーニング
した。この様にして確立されたヒトＬ−６レセプターを
細胞表面上に発現するマウスＢ細胞M12由来クローンをM
12IL6Rと名づけた。
とマウス細胞膜上の蛋白質（gp130）との結合 IL−６レセプターを細胞表面に発現しないマウスＢ細
胞株M12に、プラスミドpZipNeoSV（Ｘ）Ｉ（Cepkoら、C
ell,37,p1053,1984年参照）のBamH I部位にヒトIL−６
レセプターcDNAを挿入して作製したプラスミドをエレク
トロポレーション法にて導入し、抗生物質G418（シグマ
社）に対する耐性により形質転換細胞をスクリーニング
した。この様にして確立されたヒトＬ−６レセプターを
細胞表面上に発現するマウスＢ細胞M12由来クローンをM
12IL6Rと名づけた。
次に107個のM12IL6R細胞をPBSで洗浄し、0.1mlの50mM
Tris（pH7.4）,0.15M NaClに懸濁した。次に、0.1mlの
上記緩衝液中で1mCiのNa125Iと２個のIodobeads（Pierc
e社）とを室温で５分反応させ、これを前記細胞懸濁液
と混合し、30分間室温でインキュベートした。この様に
して標識された細胞にIL−６を１μg/ml加え又は加える
ことなく37℃で30分間反応させた後に実施例１に示す方
法で可溶化し、MT18による免疫沈降を行い、その後、SD
S/PAGE、オートラジオグラフィーを行った。この結果を
第２図に示す。この図中、80kDaのバンドはM12細胞に導
入されたIL−６レセプターcDNAに基くIL−６レセプター
を示し、130kDaのバンドはM12細胞により本来的に産生
されるgp130蛋白質を示す。この結果、ヒトIL−６と結
合したM12IL6R上のヒトIL−６レセプターが、37℃で30
分以内にM12IL6R由来のマウス蛋白質（gp130）に結合す
ることを示している。
Tris（pH7.4）,0.15M NaClに懸濁した。次に、0.1mlの
上記緩衝液中で1mCiのNa125Iと２個のIodobeads（Pierc
e社）とを室温で５分反応させ、これを前記細胞懸濁液
と混合し、30分間室温でインキュベートした。この様に
して標識された細胞にIL−６を１μg/ml加え又は加える
ことなく37℃で30分間反応させた後に実施例１に示す方
法で可溶化し、MT18による免疫沈降を行い、その後、SD
S/PAGE、オートラジオグラフィーを行った。この結果を
第２図に示す。この図中、80kDaのバンドはM12細胞に導
入されたIL−６レセプターcDNAに基くIL−６レセプター
を示し、130kDaのバンドはM12細胞により本来的に産生
されるgp130蛋白質を示す。この結果、ヒトIL−６と結
合したM12IL6R上のヒトIL−６レセプターが、37℃で30
分以内にM12IL6R由来のマウス蛋白質（gp130）に結合す
ることを示している。
実施例3.IL−６存在下での可溶性IL−６レセプターとgp
130の結合 ２×107個のM12細胞（IL−６レセプター非産生細胞）
を実施例２に示す方法で標識した。この様に標識された
５×106の細胞を、IL−６存在下（１μg/ml）又は非存
在下で、可溶性IL−６レセプターを含有するか又は含有
しないCOS7細胞の培養上清1mlに添加し、37℃で30分間
反応させた。その後、実施例１に示す方法で細胞をジギ
トニンで可溶化し、MT18抗体により免疫沈降し、SDS/PA
GE及びオートラジオグラフィーを行った。この結果を第
３図に示す。図中、130kDaのバンドはM12細胞により産
生されたgp130蛋白質を示す。なお、この例においては
可溶性IL−６レセプターは標識されていないためオート
ラジオグラフィーに表わされていない。この結果は、IL
−６と可溶性IL−６レセプターの結合物が細胞膜上の蛋
白質（gp130）と結合し、可溶性IL−６レセプター単独
ではgp130に結合しないことを示している。
130の結合 ２×107個のM12細胞（IL−６レセプター非産生細胞）
を実施例２に示す方法で標識した。この様に標識された
５×106の細胞を、IL−６存在下（１μg/ml）又は非存
在下で、可溶性IL−６レセプターを含有するか又は含有
しないCOS7細胞の培養上清1mlに添加し、37℃で30分間
反応させた。その後、実施例１に示す方法で細胞をジギ
トニンで可溶化し、MT18抗体により免疫沈降し、SDS/PA
GE及びオートラジオグラフィーを行った。この結果を第
３図に示す。図中、130kDaのバンドはM12細胞により産
生されたgp130蛋白質を示す。なお、この例においては
可溶性IL−６レセプターは標識されていないためオート
ラジオグラフィーに表わされていない。この結果は、IL
−６と可溶性IL−６レセプターの結合物が細胞膜上の蛋
白質（gp130）と結合し、可溶性IL−６レセプター単独
ではgp130に結合しないことを示している。
実施例4.IL−６存在下での可溶性IL−６レセプターによ
るIL−６の作用の増強 M1細胞を１×105個/ml、0.2ml/ウェルで、種々の濃度
のIL−６、および可溶性IL−６レセプターを含むCOS7細
胞の培養上清あるいは対照としてのCOS7細胞の培養上清
を25％加えた条件で培養した。培養開始後60時間〜70時
間の間に3H標識チミジンを加え、細胞内に取り込まれた
放射能活性を測定することによりM1細胞の増殖を調べ
た。第４図は、IL−６のもつM1細胞に対する増殖阻害効
果を、可溶性IL−６レセプターが増強させることを示
す。すなわちIL−６と結合した可溶性IL−６レセプター
がM1細胞のgp130と結合することにより、IL−６作用を
増強させる。
るIL−６の作用の増強 M1細胞を１×105個/ml、0.2ml/ウェルで、種々の濃度
のIL−６、および可溶性IL−６レセプターを含むCOS7細
胞の培養上清あるいは対照としてのCOS7細胞の培養上清
を25％加えた条件で培養した。培養開始後60時間〜70時
間の間に3H標識チミジンを加え、細胞内に取り込まれた
放射能活性を測定することによりM1細胞の増殖を調べ
た。第４図は、IL−６のもつM1細胞に対する増殖阻害効
果を、可溶性IL−６レセプターが増強させることを示
す。すなわちIL−６と結合した可溶性IL−６レセプター
がM1細胞のgp130と結合することにより、IL−６作用を
増強させる。
実施例5.ヒトgp130cDNAの単離 一連の遺伝子組み換え操作方法（ｍ−RNAの抽出、DNA
の制限酵素による切断等）は、マニアティスらの方法
（Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory1
982年参照）、ハーウィンらの方法（DNA Cloning,a Pra
ctical Approach vol.1.p49,IRL,Oxford,1985年参照）
を参照に行った。また、ラムダgt11 cDNAライブラリー
の抗体によるスクリーニングも定法に従った。
の制限酵素による切断等）は、マニアティスらの方法
（Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory1
982年参照）、ハーウィンらの方法（DNA Cloning,a Pra
ctical Approach vol.1.p49,IRL,Oxford,1985年参照）
を参照に行った。また、ラムダgt11 cDNAライブラリー
の抗体によるスクリーニングも定法に従った。
まず、ヒトミエローマ細胞U266（Cell,58巻p573,1989
年参照）からメッセンジャー（ｍ）RNAを抽出し、ラム
ダgt11（クローンテック社）を用いてcDNAライブラリー
を作製した。次に、gp130に対するマウス由来モノクロ
ーナル抗体AM64とAM277（特願平２−15090号明細書参
照）を用いて約50万個のクローンをスクリーニングした
結果、最終的に２個のクローン（λA,λＢ）を得た。λ
ＡとλＢのインサートcDNAを解析した結果、第５図に示
すようにいずれのインサートcDNAも、ヒトgp130コード
領域を完全に含まないことが判明した。
年参照）からメッセンジャー（ｍ）RNAを抽出し、ラム
ダgt11（クローンテック社）を用いてcDNAライブラリー
を作製した。次に、gp130に対するマウス由来モノクロ
ーナル抗体AM64とAM277（特願平２−15090号明細書参
照）を用いて約50万個のクローンをスクリーニングした
結果、最終的に２個のクローン（λA,λＢ）を得た。λ
ＡとλＢのインサートcDNAを解析した結果、第５図に示
すようにいずれのインサートcDNAも、ヒトgp130コード
領域を完全に含まないことが判明した。
そこで、λａのEcoR I断片と、λＢのEcoR I断片をcD
NA本来の方向に連結させた形でベクター、pBlueScript
SK（Stratagene社）のEcoR I部位に挿入し、ヒトgp130
コード領域を完全に含むインサートDNAを持つプラスミ
ド、pGP130を作製した。第６図にpGP130の構造を示す。
第７図に、pGP130のインサートDNAの配列、すなわちλ
ＡとλＢのインサートcDNA配列から決定されたヒトgp13
0cDNAの配列、および推定されるアミノ酸配列を示す。
NA本来の方向に連結させた形でベクター、pBlueScript
SK（Stratagene社）のEcoR I部位に挿入し、ヒトgp130
コード領域を完全に含むインサートDNAを持つプラスミ
ド、pGP130を作製した。第６図にpGP130の構造を示す。
第７図に、pGP130のインサートDNAの配列、すなわちλ
ＡとλＢのインサートcDNA配列から決定されたヒトgp13
0cDNAの配列、および推定されるアミノ酸配列を示す。
なお、このプラスミドpGP130を含有する大腸菌E.coli
HB101/pGP130は工業技術院微生物工業技術研究所に、
微工研条寄第2912号（FERM BP−2912）としてブタペス
ト条約に基き国際寄託されている。
HB101/pGP130は工業技術院微生物工業技術研究所に、
微工研条寄第2912号（FERM BP−2912）としてブタペス
ト条約に基き国際寄託されている。
実施例6.ヒトgp130mRNAの各種細胞での発現 各種細胞でのヒトgp130を発現を調べるためにノーザ
ンブロット解析を行った。細胞の培養、細胞からのmRAN
の抽出、電気泳動、ブロッティング、プローブの標識、
バイブリダイゼーション、フィルターの洗浄、オートラ
ジオグラフィー等はすべて定法どおり行った。
ンブロット解析を行った。細胞の培養、細胞からのmRAN
の抽出、電気泳動、ブロッティング、プローブの標識、
バイブリダイゼーション、フィルターの洗浄、オートラ
ジオグラフィー等はすべて定法どおり行った。
ヒトミエローマ細胞株U266、ヒトＢ細胞株CESS、ヒト
バーキットリンフォーマJijoye、ヒトＴ細胞株Jurkat、
NK細胞株YTからmRNAを抽出した。次に各mRAN1μｇをホ
ルムアミド法で変性させ、0.8％アガロースゲル電気泳
動にかけ、ナイロンフィルター膜にノーザンブロッティ
ングした。続いて実施例１に記載の方法で得られたλＡ
のインサートcDNAを抽出し、これをプローブとして用
い、42℃、24時間のハイブリダイゼーションを行った。
洗浄後、オートラジオグラフィーを行った。
バーキットリンフォーマJijoye、ヒトＴ細胞株Jurkat、
NK細胞株YTからmRNAを抽出した。次に各mRAN1μｇをホ
ルムアミド法で変性させ、0.8％アガロースゲル電気泳
動にかけ、ナイロンフィルター膜にノーザンブロッティ
ングした。続いて実施例１に記載の方法で得られたλＡ
のインサートcDNAを抽出し、これをプローブとして用
い、42℃、24時間のハイブリダイゼーションを行った。
洗浄後、オートラジオグラフィーを行った。
その結果、第４図に示すように、gp130mRANの発現
は、U266,YTでは強く、CESSでは中程度、Jijoye,Jurkat
では弱いことがわかった。これは、各種細胞のIL−６の
反応性と相関する。
は、U266,YTでは強く、CESSでは中程度、Jijoye,Jurkat
では弱いことがわかった。これは、各種細胞のIL−６の
反応性と相関する。
参考例1.ヒトIL−６レセプターに対するマウスモノクロ
ーナル抗体の製造 ヒトIL−６レセプターに対するマウスモノクローナル
抗体を作製する目的で、免疫原として、ヒトIL−６レセ
プターを膜面に発現しているマウスＴ細胞株を以下の方
法で作製した。すなわち、特願平１−9774号明細書に記
載されているpBSF2R.236及びpSV2neoをマウスＴ細胞株C
TLL−２（ATCC,TIB214）に常法で導入し、Ｇ−418を用
いる通常の方法でスクリーニングをし、最終的にIL−６
レセプターを細胞あたり約30,000個発現している株を樹
立し、これをCTBC2と名づけた。
ーナル抗体の製造 ヒトIL−６レセプターに対するマウスモノクローナル
抗体を作製する目的で、免疫原として、ヒトIL−６レセ
プターを膜面に発現しているマウスＴ細胞株を以下の方
法で作製した。すなわち、特願平１−9774号明細書に記
載されているpBSF2R.236及びpSV2neoをマウスＴ細胞株C
TLL−２（ATCC,TIB214）に常法で導入し、Ｇ−418を用
いる通常の方法でスクリーニングをし、最終的にIL−６
レセプターを細胞あたり約30,000個発現している株を樹
立し、これをCTBC2と名づけた。
免疫は以下の様に行った。RPMI1640を用いる通常の方
法で培養後、PBSバッファーで４回洗浄したCTBC3を、C5
7BL6マウス１匹あたり１×107細胞個、１週間に１回で
計６階、腹腔内に免疫した。
法で培養後、PBSバッファーで４回洗浄したCTBC3を、C5
7BL6マウス１匹あたり１×107細胞個、１週間に１回で
計６階、腹腔内に免疫した。
前記免疫されたマウスからの膵細胞を、親株としての
ミエローマ細胞計P3U1と、ポリエチレングリコールを用
いる通常の方法に従って融合せしめた。
ミエローマ細胞計P3U1と、ポリエチレングリコールを用
いる通常の方法に従って融合せしめた。
スクリーニングは以下の様に行った。IL−６レセプタ
ー陰性のヒトＴ細胞株JURKAT（ATCC,CRL8163）に、pBRF
2R.236とPSV2neoを常法で導入し、スクリーニングの結
果、IL−６レセプターを細胞あたり約100,000個発現し
ている株を樹立し、これをNJBC8と名づけた。NP40で可
溶化したNJBC8を認識し、NP40で可溶化したJURKATを認
識しない。抗体を産生しているハイブリドーマが１クロ
ーン単離され、これをMT18と名づけた。また、このハイ
ブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体をMT
18抗体と称する。
ー陰性のヒトＴ細胞株JURKAT（ATCC,CRL8163）に、pBRF
2R.236とPSV2neoを常法で導入し、スクリーニングの結
果、IL−６レセプターを細胞あたり約100,000個発現し
ている株を樹立し、これをNJBC8と名づけた。NP40で可
溶化したNJBC8を認識し、NP40で可溶化したJURKATを認
識しない。抗体を産生しているハイブリドーマが１クロ
ーン単離され、これをMT18と名づけた。また、このハイ
ブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体をMT
18抗体と称する。
第１図は、35S−メチオニンにより内部標識したU266細
胞をIL−６により処理した後（レーン２及び４）又はIL
−６により処理することなく（レーン１及び３）溶解
し、セファロースB4に固定化された抗IL−６レセプター
抗体MT18により免疫沈降せしめ、そして非還元条件下
（レーン１及び２）、又は還元条件下（レーン３及び
４）でSDS/PAGEを行った場合のオートラジオグラフィー
のパターンを示す。 第２図は、125Iにより表面標識したM12IL6R細胞をIL−
６により処理した後（レーン２）又はIL−６により処理
することなく（レーン１）溶解し、第１図の場合と同様
に処理して得られたオートラジオグラフィーのパターン
を示す。 第３図は、IL−６の存在下（レーン２及び４）又はIL−
６の非存在下（レーン１及び３）で、且つ可溶性IL−６
レセプターを含有する（レーン３及び４）か又は含有し
ない（レーン１及び２）COS7細胞培養上清の存在下で、
M12細胞をインキュベートした後溶解し、第１図の場合
と同様に処理して得たオートラジオグラフィーのパター
ンを示す。 第４図は、種々の濃度のIL−６存在下、可溶性IL−６レ
セプター存在下あるいは非存在下でのM1細胞の3H標識の
チミジンの取り込みを示す。 第５図は、λＡとλＢの制限酵素地図および対応するヒ
トgp130蛋白質の模式図を示す。ＥはEcoR Iサイトを示
す。また、SSはシグナル配列、ECは細胞外領域、TMは膜
貫通領域、Ｃは細胞内領域を示す。 第６図は、pGP130の構造を示す。 第７−１図〜７−５図は、pGP130のインサートDNA、す
なわちヒトgp130をコードするDNA配列について、その塩
基配列を解析した結果、及びこのDNA配列が発現された
場合に生産される蛋白質、すなわちヒトgp130の推定さ
れるアミノ酸配列を示す。下線部分はＮ末端側の疎水性
アミノ酸領域を示し、二重下線部分はＣ末端側の疎水性
アミノ酸領域を示す。 第８図は、ヒトgp130cDNAをプローブとしたときの各種
細胞のノーザンブロットの結果を示す。
胞をIL−６により処理した後（レーン２及び４）又はIL
−６により処理することなく（レーン１及び３）溶解
し、セファロースB4に固定化された抗IL−６レセプター
抗体MT18により免疫沈降せしめ、そして非還元条件下
（レーン１及び２）、又は還元条件下（レーン３及び
４）でSDS/PAGEを行った場合のオートラジオグラフィー
のパターンを示す。 第２図は、125Iにより表面標識したM12IL6R細胞をIL−
６により処理した後（レーン２）又はIL−６により処理
することなく（レーン１）溶解し、第１図の場合と同様
に処理して得られたオートラジオグラフィーのパターン
を示す。 第３図は、IL−６の存在下（レーン２及び４）又はIL−
６の非存在下（レーン１及び３）で、且つ可溶性IL−６
レセプターを含有する（レーン３及び４）か又は含有し
ない（レーン１及び２）COS7細胞培養上清の存在下で、
M12細胞をインキュベートした後溶解し、第１図の場合
と同様に処理して得たオートラジオグラフィーのパター
ンを示す。 第４図は、種々の濃度のIL−６存在下、可溶性IL−６レ
セプター存在下あるいは非存在下でのM1細胞の3H標識の
チミジンの取り込みを示す。 第５図は、λＡとλＢの制限酵素地図および対応するヒ
トgp130蛋白質の模式図を示す。ＥはEcoR Iサイトを示
す。また、SSはシグナル配列、ECは細胞外領域、TMは膜
貫通領域、Ｃは細胞内領域を示す。 第６図は、pGP130の構造を示す。 第７−１図〜７−５図は、pGP130のインサートDNA、す
なわちヒトgp130をコードするDNA配列について、その塩
基配列を解析した結果、及びこのDNA配列が発現された
場合に生産される蛋白質、すなわちヒトgp130の推定さ
れるアミノ酸配列を示す。下線部分はＮ末端側の疎水性
アミノ酸領域を示し、二重下線部分はＣ末端側の疎水性
アミノ酸領域を示す。 第８図は、ヒトgp130cDNAをプローブとしたときの各種
細胞のノーザンブロットの結果を示す。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/12 - 15/28 C12N 5/06 - 5/08 C12P 21/02 C07K 14/47 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) Ｇｅｎｅｓｅｑ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢ Ｌ／ＤＤＢＪ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｆ／ＰＩ Ｒ
Claims (12)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列： を有するヒトgp130蛋白質をコードするか、又は該アミ
ノ酸配列中１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び
／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているア
ミノ酸配列を有し且つヒトgp130蛋白質の生物学的活性
を維持している蛋白質をコードするDNA。 - 【請求項２】下記塩基配列： を有するか、又は該塩基配列中１又は複数個のヌクレオ
チドが欠失、付加及び／又は他のヌクレオチドによる置
換により修飾されている塩基配列を有し、請求項１に記
載のアミノ酸配列又は修飾されたアミノ酸配列をコード
するDNA。 - 【請求項３】シグナル配列をコードするDNAがさらに付
加されている請求項１又は２に記載のDNA。 - 【請求項４】上記アミノ酸配列： を有するヒトgp130蛋白質又は該アミノ酸配列中１個又
は複数個のアミノ酸配列の欠失、付加及び／又は他のア
ミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を
有し且つヒトgp130蛋白質の生物学的活性を維持してい
る蛋白質を含んで成る融合蛋白質をコードするDNA。 - 【請求項５】下記塩基配列： 又は該塩基配列中１個又は複数個のヌクレオチドの欠
失、付加及び／又は他のヌクレオチドによる置換により
修飾された塩基配列を含んで成り、請求項４に記載の融
合蛋白質をコードするDNA。 - 【請求項６】シグナル配列をコードするDNAがさらに付
加されている請求項４又は５に記載のDNA。 - 【請求項７】請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA
を含んで成る発現ベクター。 - 【請求項８】請求項４〜６のいずれか１項に記載のDNA
を含んで成る発現ベクター。 - 【請求項９】請求項７に記載の発現ベクターにより形質
転換された宿主。 - 【請求項１０】請求項８に記載の発現ベクターにより形
質転換された宿主。 - 【請求項１１】請求項９に記載の宿主を培養し、該培養
物からヒトgp130蛋白質又はヒトgp130蛋白質の生物学的
活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする、ヒト
gp130蛋白質又はヒトgp130蛋白質の生物学的活性を有す
る蛋白質の製造方法。 - 【請求項１２】請求項10に記載の宿主を培養することを
特徴とするヒトgp130蛋白質又はヒトgp130蛋白質の生物
学的活性を有する蛋白質を含んで成る融合蛋白質の製造
方法。
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| AU60039/90A AU635296B2 (en) | 1989-08-03 | 1990-07-31 | Human gp130 protein |
| KR1019900011808A KR0178384B1 (ko) | 1989-08-03 | 1990-08-01 | 인간 gp130 단백질 |
| AT90308530T ATE147099T1 (de) | 1989-08-03 | 1990-08-02 | Menschliches gp130-protein codierende dns |
| ES90308530T ES2096580T3 (es) | 1989-08-03 | 1990-08-02 | Adn que codifica la proteina gp130 humana. |
| DE69029545T DE69029545T2 (de) | 1989-08-03 | 1990-08-02 | Menschliches GP130-Protein codierende DNS |
| US07/561,564 US5132403A (en) | 1989-08-03 | 1990-08-02 | Human gp130 protein |
| CA002022610A CA2022610C (en) | 1989-08-03 | 1990-08-02 | Human gp130 protein |
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| IE293090A IE902930A1 (en) | 1990-05-31 | 1990-08-13 | Human gp130 protein |
| US07/889,131 US5223611A (en) | 1989-08-03 | 1992-05-27 | DNA encoding for human GP130 protein |
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| JP1-200230 | 1989-08-03 | ||
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|---|---|
| JPH0429997A JPH0429997A (ja) | 1992-01-31 |
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| Country | Link |
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| JP (1) | JP2898064B2 (ja) |
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| AT (1) | ATE147099T1 (ja) |
| AU (1) | AU635296B2 (ja) |
| CA (1) | CA2022610C (ja) |
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| ES (1) | ES2096580T3 (ja) |
| IL (1) | IL95235A (ja) |
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| DK0988871T3 (da) * | 1991-12-18 | 2004-05-24 | Icu Medical Inc | Fremgangsmåde til overføring af fluid |
| JPH05304986A (ja) * | 1992-04-28 | 1993-11-19 | Tosoh Corp | ｇｐ１３０蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 |
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| US5891998A (en) * | 1993-06-23 | 1999-04-06 | Istituto Di Ricerche Di Biologica Molecolare P. Angeletti S.P.A. | Interleukin-6 receptor agonists |
| US5783672A (en) | 1994-05-26 | 1998-07-21 | Immunex Corporation | Receptor for oncostatin M |
| WO1996000462A1 (de) * | 1994-06-23 | 1996-01-04 | Elin Motoren Gesellschaft M.B.H | Kühlung für einen motor |
| GB9419021D0 (en) | 1994-09-21 | 1994-11-09 | Applied Research Systems | Therapeutic protein |
| ES2384222T3 (es) | 1994-10-07 | 2012-07-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Inhibición del crecimiento anómalo de células sinoviales utilizando un antagonista de IL-6 como principio activo |
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| US5747470A (en) * | 1995-06-07 | 1998-05-05 | Gen-Probe Incorporated | Method for inhibiting cellular proliferation using antisense oligonucleotides to gp130 mRNA |
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| AU7445900A (en) | 1999-09-27 | 2001-04-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Novel hemopoietin receptor protein, nr12 |
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-
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