JP2998976B2 - ヒトインタ―ロイキン―６レセプターに対する抗体 - Google Patents
ヒトインタ―ロイキン―６レセプターに対する抗体Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒトIL−６レセプターと特異的に結合する抗
体、及びその製造方法に関するものである。
体、及びその製造方法に関するものである。
インターロイキン−６（以下IL−６と略す）は、種々
の重要な生理活性を有し、広く細胞の増殖分化に関与し
ているタンパク質である。さらにIL−６の異常産生が種
々の自己免疫疾患の病因因子である可能性が報告されて
いる（岸本、平野、Ann.Rev.Immunol.,6,p485,1988年参
照）。
の重要な生理活性を有し、広く細胞の増殖分化に関与し
ているタンパク質である。さらにIL−６の異常産生が種
々の自己免疫疾患の病因因子である可能性が報告されて
いる（岸本、平野、Ann.Rev.Immunol.,6,p485,1988年参
照）。
IL−６と特異的に結合する細胞膜上のIL−６レセプタ
ーは、田賀らにより解析され、各細胞上の数、IL−６と
の結合定数が報告されている（J.Exp.Med.,196,p967,19
87年参照）。さらにヒトIL−６レセプターのcDNAが山崎
らにより単離され、１次構造が報告されている（Scienc
e,241,p825,1988年参照）。これらの成果をもとに遺伝
子工学的に作製された、細胞表層より離脱したIL−６レ
セプターは、各種免疫疾患の治療薬、診断薬として期待
されている。
ーは、田賀らにより解析され、各細胞上の数、IL−６と
の結合定数が報告されている（J.Exp.Med.,196,p967,19
87年参照）。さらにヒトIL−６レセプターのcDNAが山崎
らにより単離され、１次構造が報告されている（Scienc
e,241,p825,1988年参照）。これらの成果をもとに遺伝
子工学的に作製された、細胞表層より離脱したIL−６レ
セプターは、各種免疫疾患の治療薬、診断薬として期待
されている。
この様なIL−６レセプターを大量に生産し、均一に精
製するためには、IL−６レセプターを迅速に同定する手
段として、あるいは精製する手段として、IL−６レセプ
ターの抗体の開発が望まれる。
製するためには、IL−６レセプターを迅速に同定する手
段として、あるいは精製する手段として、IL−６レセプ
ターの抗体の開発が望まれる。
しかしながら、これまでにIL−６レセプターを認識す
るモノクローナル抗体は公に知られていない。
るモノクローナル抗体は公に知られていない。
従って、本発明はIL−６レセプターに対する種々のタ
イプの抗体を提供しようとするものである。
イプの抗体を提供しようとするものである。
上記の目的を達成するため、本発明は、ヒトインター
ロイキン−６レセプターと特異的に結合し得る抗ヒトイ
ンターロイキン−６レセプター抗体；前記の性質を有す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ；ヒト
インターロイキン−６レセプター抗原により哺乳類を感
作し、該哺乳類から免疫細胞を採取し、該免疫細胞をミ
エローマ細胞株と融合せしめ、そして該融合株からヒト
インターロイキン−６レセプターを認識する株をクロー
ニングすることを特徴とするハイブリドーマの製造方
法；前記のハイブリドーマを培養し、該培養物からヒト
インターロイキン−６レセプターを認識するモノクロー
ナル抗体を採取することを特徴とする抗−ヒトインター
ロイキン−６レセプター抗体の製造方法；並びにヒトイ
ンターロイキン−６レセプター抗原により哺乳類動物を
免疫感作し、該動物からヒトインターロイキン−６レセ
プターを認識するポリクローナル抗体を採取することを
特徴とする抗−ヒトインターロイキン−６レセプターポ
リクローナル抗体の製造方法を提供する。
ロイキン−６レセプターと特異的に結合し得る抗ヒトイ
ンターロイキン−６レセプター抗体；前記の性質を有す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ；ヒト
インターロイキン−６レセプター抗原により哺乳類を感
作し、該哺乳類から免疫細胞を採取し、該免疫細胞をミ
エローマ細胞株と融合せしめ、そして該融合株からヒト
インターロイキン−６レセプターを認識する株をクロー
ニングすることを特徴とするハイブリドーマの製造方
法；前記のハイブリドーマを培養し、該培養物からヒト
インターロイキン−６レセプターを認識するモノクロー
ナル抗体を採取することを特徴とする抗−ヒトインター
ロイキン−６レセプター抗体の製造方法；並びにヒトイ
ンターロイキン−６レセプター抗原により哺乳類動物を
免疫感作し、該動物からヒトインターロイキン−６レセ
プターを認識するポリクローナル抗体を採取することを
特徴とする抗−ヒトインターロイキン−６レセプターポ
リクローナル抗体の製造方法を提供する。
本発明の抗体は、ヒトIL−６レセプターを特異的に認
識するものであり、これにはモノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体に
は、ヒトIL−６とヒトIL−６レセプターとの結合を競合
的に阻害するものと、これを競合的に阻害しないものと
が含まれる。前者の例としては、本発明のハイブリドー
マPM1により産生されるPM1モノクローナル抗体が挙げら
れ、後者の側としてはハイブリドーマMT18により産生さ
れるMT18モノクローナル抗体が挙げられる。
識するものであり、これにはモノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体に
は、ヒトIL−６とヒトIL−６レセプターとの結合を競合
的に阻害するものと、これを競合的に阻害しないものと
が含まれる。前者の例としては、本発明のハイブリドー
マPM1により産生されるPM1モノクローナル抗体が挙げら
れ、後者の側としてはハイブリドーマMT18により産生さ
れるMT18モノクローナル抗体が挙げられる。
本発明の抗体の製造のために用いられる免疫原として
は、ヒトIL−６レセプターを細胞表面に発現している動
物細胞を用いることができる。この様な細胞としてはヒ
トIL−６レセプターを産生するヒト由来細胞株、例えば
ヒトミエローマ細胞株U266、又はヒトIL−６レセプター
をコードするDNAにより形質転換された宿主細胞、例え
ばそのような動物細胞株が挙げられ、その例としてヒト
IL−６レセプターをコードするcDNAを含有するプラスミ
ドにより形質転換されたマウスＴ細胞が挙げられる。し
かしながら、この様な細胞株は、細胞表面に発現してい
るIL−６レセプターの量が少ない等のため効率的な免疫
原とは言い難い。
は、ヒトIL−６レセプターを細胞表面に発現している動
物細胞を用いることができる。この様な細胞としてはヒ
トIL−６レセプターを産生するヒト由来細胞株、例えば
ヒトミエローマ細胞株U266、又はヒトIL−６レセプター
をコードするDNAにより形質転換された宿主細胞、例え
ばそのような動物細胞株が挙げられ、その例としてヒト
IL−６レセプターをコードするcDNAを含有するプラスミ
ドにより形質転換されたマウスＴ細胞が挙げられる。し
かしながら、この様な細胞株は、細胞表面に発現してい
るIL−６レセプターの量が少ない等のため効率的な免疫
原とは言い難い。
しかしながら、この様な免疫原を使用してであって
も、一旦ヒトIL−６レセプターに対する抗体を手にすれ
ば、これを用いてより効率的な免疫原を調製し、これを
用いてさらに多様な抗体を製造することができる。例え
ば、ヒトIL−６レセプターに対する抗体を適当な固体担
体に結合させ、他方、ヒトIL−６レセプターを産生する
細胞、例えば前記の細胞を培養して細胞溶解し、この細
胞溶解物を、前記の抗−ヒトIL−６レセプター抗体を結
合した固体担体と接触せしめることにより細胞溶解物中
のヒトIL−６レセプターを担体上に吸着・濃縮して、こ
れを免疫原として使用することができる。固体担体につ
いては抗体を結合できるもので、免疫する動物の生育に
重大な影響を及ぼさないものであれば特別の制限はな
い。例えば、本発明の実施例で説明される様なセファロ
ース等を基材とした固体担体は、簡便な操作で抗体を結
合でき、かつ、動物の生育に影響を与えない、等、本発
明における固体担体として好適である。さらには、遺伝
子工学的方法により、例えば特願平１−9774号明細書に
記載されている方法によりヒトIL−６レセプターを調製
し、これを免疫原として使用することもできる。また、
ヒトIL−６レセプターの一部分を構成するペプチドを調
製し、これを適当な高分子キャリヤー、例えばオバルブ
ミンに結合して免疫原として使用することもできる。さ
らには、感染後にヒトIL−６レセプターが発現するよう
にされたワクチニアウイルスを使用することもできる。
これらの免疫原はいずれも、ポリクローナル抗体を製造
するための免疫原として、及びハイブリドーマを調製す
るための免疫原として使用することができる。
も、一旦ヒトIL−６レセプターに対する抗体を手にすれ
ば、これを用いてより効率的な免疫原を調製し、これを
用いてさらに多様な抗体を製造することができる。例え
ば、ヒトIL−６レセプターに対する抗体を適当な固体担
体に結合させ、他方、ヒトIL−６レセプターを産生する
細胞、例えば前記の細胞を培養して細胞溶解し、この細
胞溶解物を、前記の抗−ヒトIL−６レセプター抗体を結
合した固体担体と接触せしめることにより細胞溶解物中
のヒトIL−６レセプターを担体上に吸着・濃縮して、こ
れを免疫原として使用することができる。固体担体につ
いては抗体を結合できるもので、免疫する動物の生育に
重大な影響を及ぼさないものであれば特別の制限はな
い。例えば、本発明の実施例で説明される様なセファロ
ース等を基材とした固体担体は、簡便な操作で抗体を結
合でき、かつ、動物の生育に影響を与えない、等、本発
明における固体担体として好適である。さらには、遺伝
子工学的方法により、例えば特願平１−9774号明細書に
記載されている方法によりヒトIL−６レセプターを調製
し、これを免疫原として使用することもできる。また、
ヒトIL−６レセプターの一部分を構成するペプチドを調
製し、これを適当な高分子キャリヤー、例えばオバルブ
ミンに結合して免疫原として使用することもできる。さ
らには、感染後にヒトIL−６レセプターが発現するよう
にされたワクチニアウイルスを使用することもできる。
これらの免疫原はいずれも、ポリクローナル抗体を製造
するための免疫原として、及びハイブリドーマを調製す
るための免疫原として使用することができる。
ポリクローナル抗体の製造は、常法に従って、例えば
上記のいずれかの免疫原によりマウス、ウサギ、ヒツ
ジ、ヤギ等を免疫感作することによって行うことができ
る。
上記のいずれかの免疫原によりマウス、ウサギ、ヒツ
ジ、ヤギ等を免疫感作することによって行うことができ
る。
ハイブリドーマの作製も常法に従って行うことができ
る。例えば前記の免疫原のいずれかによりマウス等の哺
乳類を免疫し、この動物から脾臓細胞を得、これを樹立
されたミエローマ細胞と融合せしめる。次に、目的とす
る反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマをクローニングする。
る。例えば前記の免疫原のいずれかによりマウス等の哺
乳類を免疫し、この動物から脾臓細胞を得、これを樹立
されたミエローマ細胞と融合せしめる。次に、目的とす
る反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマをクローニングする。
モノクローナル抗体を製造するには、前記のようにし
てクローニングされたハイブリドーマを培養し、培養上
清からモノクローナル抗体を採取する。あるいは、前記
ハイブリドーマを動物の腹腔内に接種し、腹水を得、こ
れからモノクローナル抗体を単離することもできる。ハ
イブリドーマ細胞上清中の抗体又は腹水中の抗体は、常
法に従って、例えば硫酸アンモニウム塩析により濃縮す
ることができ、さらにアフィニティークロマトグラフィ
ー、例えばIL−６レセプターを固定化した担体を用いる
アフィニティークロマトグラフィーにより精製すること
ができる。
てクローニングされたハイブリドーマを培養し、培養上
清からモノクローナル抗体を採取する。あるいは、前記
ハイブリドーマを動物の腹腔内に接種し、腹水を得、こ
れからモノクローナル抗体を単離することもできる。ハ
イブリドーマ細胞上清中の抗体又は腹水中の抗体は、常
法に従って、例えば硫酸アンモニウム塩析により濃縮す
ることができ、さらにアフィニティークロマトグラフィ
ー、例えばIL−６レセプターを固定化した担体を用いる
アフィニティークロマトグラフィーにより精製すること
ができる。
上記のポリクローナル抗体の製造方法、ハイブリドー
マの作製方法、モノクローナル抗体の調製方法、抗体の
回収・精製方法は、いずれもそれ自体当業界によりよく
知られている方法により行うことができる。
マの作製方法、モノクローナル抗体の調製方法、抗体の
回収・精製方法は、いずれもそれ自体当業界によりよく
知られている方法により行うことができる。
以下本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示
すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
実施例1. ヒトIL−６レセプターに対するマウスモノク
ローナル抗体の製造 ヒトIL−６レセプターに対するマウスモノクローナル
抗体を作製する目的で、免疫原として、ヒトIL−６レセ
プターを膜面に発現しているマウスＴ細胞株を以下の方
法で作製した。すなわち、特願平１−9774号明細書に記
載されているpBSF2R.236及びpSV2neoをマウスＴ細胞株C
TLL−２（ATCC,TIB214）に常法で導入し、Ｇ−418を用
いる通常の方法でスクリーニングをし、最終的にIL−６
レセプターを細胞あたり約30,000個発現している株を樹
立し、これをCTBC3と名づけた。
ローナル抗体の製造 ヒトIL−６レセプターに対するマウスモノクローナル
抗体を作製する目的で、免疫原として、ヒトIL−６レセ
プターを膜面に発現しているマウスＴ細胞株を以下の方
法で作製した。すなわち、特願平１−9774号明細書に記
載されているpBSF2R.236及びpSV2neoをマウスＴ細胞株C
TLL−２（ATCC,TIB214）に常法で導入し、Ｇ−418を用
いる通常の方法でスクリーニングをし、最終的にIL−６
レセプターを細胞あたり約30,000個発現している株を樹
立し、これをCTBC3と名づけた。
免疫は以下の様に行った。RPMI1640を用いる通常の方
法で培養後、PBSバッファーで４回洗浄したCTBC3を、C5
7BL6マウス１匹あたり１×107細胞個、１週間に１回で
計６回、腹腔内に免疫した。
法で培養後、PBSバッファーで４回洗浄したCTBC3を、C5
7BL6マウス１匹あたり１×107細胞個、１週間に１回で
計６回、腹腔内に免疫した。
前記免疫されたマウスからの脾細胞を、親株としての
ミエローマ細胞系P3U1と、ポリエチレングリコールを用
いる通常の方法に従って融合せしめた。
ミエローマ細胞系P3U1と、ポリエチレングリコールを用
いる通常の方法に従って融合せしめた。
スクリーニングは以下の様に行った。IL−６レセプタ
ー陰性のヒトＴ細胞株JURKAT（ATCC,CRL8163）に、pBSF
2R.236とpSV2neoを常法で導入し、スクリーニングの結
果、IL−６レセプターを細胞あたり約100,000個発現し
ている株を樹立し、これをNJBC8と名づけた。NP40で可
溶化したNJBC8を認識し、NP40で可溶化したJURKATを認
識しない抗体を産生しているハイブリドーマが１クロー
ン単離され、これをMT18と名づけた。また、このハイブ
リドーマによって生産されるモノクローナル抗体をMT18
抗体と称する。前記のハイブリドーマMT18は、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第2999号（FERM B
P−2999）として寄託されている。第６図のデータはMT1
8抗体がIL−６レセプターを特異的に認識することを示
している。この図中Ａは、フルオレッセインイソシアネ
ートで標識されたMT18抗体によりJURKAT細胞を染色した
場合に螢光染色された細胞の分布を示し、Ｂは前記NJBC
8細胞を同様に処理した場合の結果を示す。
ー陰性のヒトＴ細胞株JURKAT（ATCC,CRL8163）に、pBSF
2R.236とpSV2neoを常法で導入し、スクリーニングの結
果、IL−６レセプターを細胞あたり約100,000個発現し
ている株を樹立し、これをNJBC8と名づけた。NP40で可
溶化したNJBC8を認識し、NP40で可溶化したJURKATを認
識しない抗体を産生しているハイブリドーマが１クロー
ン単離され、これをMT18と名づけた。また、このハイブ
リドーマによって生産されるモノクローナル抗体をMT18
抗体と称する。前記のハイブリドーマMT18は、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第2999号（FERM B
P−2999）として寄託されている。第６図のデータはMT1
8抗体がIL−６レセプターを特異的に認識することを示
している。この図中Ａは、フルオレッセインイソシアネ
ートで標識されたMT18抗体によりJURKAT細胞を染色した
場合に螢光染色された細胞の分布を示し、Ｂは前記NJBC
8細胞を同様に処理した場合の結果を示す。
実施例2. IL−６レセプターに対するモノクローナル抗
体の作製 IL−６レセプターに対するマウスモノクローナル抗体
を作製する目的で、免疫原として、ヒトIL−６レセプタ
ーを以下の方法で抽出した。
体の作製 IL−６レセプターに対するマウスモノクローナル抗体
を作製する目的で、免疫原として、ヒトIL−６レセプタ
ーを以下の方法で抽出した。
ヒトミエローマ細胞株U266（IL−６レセプター産生細
胞）３×109を1mlの１％ジギトニン（和光純薬）、10mM
トリエタノールアミンバッファー（pH7.4）,0.15M NaC
l,1mM pAPMSF（和光純薬）で可溶化した。一方、ブロム
シアンで活性化したセファロース4B（ファルマシア社）
に、抗IL−６レセプター抗体であるMT18抗体（実施例
１）を常法どおり結合させた。これと前述の可溶化した
細胞の上清を混合し、樹脂上のMT18抗体に可溶化したIL
−６レセプターを結合させた。非特異的結合物を前述の
１％ジギトニン溶液で洗い流した後、MT18抗体を介して
セファロース4Bに結合したIL−６レセプターを１回の免
疫原として用いた。
胞）３×109を1mlの１％ジギトニン（和光純薬）、10mM
トリエタノールアミンバッファー（pH7.4）,0.15M NaC
l,1mM pAPMSF（和光純薬）で可溶化した。一方、ブロム
シアンで活性化したセファロース4B（ファルマシア社）
に、抗IL−６レセプター抗体であるMT18抗体（実施例
１）を常法どおり結合させた。これと前述の可溶化した
細胞の上清を混合し、樹脂上のMT18抗体に可溶化したIL
−６レセプターを結合させた。非特異的結合物を前述の
１％ジギトニン溶液で洗い流した後、MT18抗体を介して
セファロース4Bに結合したIL−６レセプターを１回の免
疫原として用いた。
免疫およびハイブリドーマの作製は以下のように行っ
た。前述の免疫原を１週間に１回計４回、Balb/cマウス
の腹部に免疫した。次にマウスからの脾細胞を、親株と
してのミエローマ細胞株P3U1と、ポリエチレングリコー
ルを用いる通常の方法に従って融合せしめた。
た。前述の免疫原を１週間に１回計４回、Balb/cマウス
の腹部に免疫した。次にマウスからの脾細胞を、親株と
してのミエローマ細胞株P3U1と、ポリエチレングリコー
ルを用いる通常の方法に従って融合せしめた。
スクリーニングは以下のように行った。まず、ハイブ
リドーマの培養上清と0.01mlのプロテインＧセファロー
ス（ファルマシア）を混合し、上清中のイムノグロブリ
ンを樹脂に吸着せしめた。一方、35Sメチオニンで内部
標識したU266細胞107個を可溶化後、前述のMT18抗体結
合セファロース4BでIL−６レセプターをアフィニティー
精製した。これを前述のプロテインＧセファロースで通
常の方法で免疫沈降させ、SDS/PAGEで解析した。この結
果、IL−６レセプターと特異的に結合する抗体を産生し
ているハイブリドーマが１クローン単離され、これをPM
1と命名した。又、このハイブリドーマによって生産さ
れるモノクローナル抗体をPM1抗体と称する。
リドーマの培養上清と0.01mlのプロテインＧセファロー
ス（ファルマシア）を混合し、上清中のイムノグロブリ
ンを樹脂に吸着せしめた。一方、35Sメチオニンで内部
標識したU266細胞107個を可溶化後、前述のMT18抗体結
合セファロース4BでIL−６レセプターをアフィニティー
精製した。これを前述のプロテインＧセファロースで通
常の方法で免疫沈降させ、SDS/PAGEで解析した。この結
果、IL−６レセプターと特異的に結合する抗体を産生し
ているハイブリドーマが１クローン単離され、これをPM
1と命名した。又、このハイブリドーマによって生産さ
れるモノクローナル抗体をPM1抗体と称する。
ハイブリドーマPM1は工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研条寄第2998号（FERM BP−2998）として寄託
されている。
所に微工研条寄第2998号（FERM BP−2998）として寄託
されている。
第１図に、モノクローナル抗体PM1とモノクローナル
抗体MT18のIL−６レセプターに対する反応性を示す。IL
−６レセプターを発現していないＴ細胞株Jurkat（第１
図中、ａ及びｃ）及びIL−６レセプターcDNAが導入され
ており持続的にIL−６レセプターを発現しているJurkat
（第１図中、ｂ及びｄ）のそれぞれと、MT18の培養上清
（第１図中、ａ及びｂの実線）及びPM1の培養上清（第
１図中、ｃ及びｄの実線）のそれぞれとを反応せしめ、
これらを螢光色素を結合したヤギ由来抗マウスイムノグ
ロブリン抗体と反応せしめた後螢光強度に対する螢光染
色された細胞の分布を調べた。比較のため対応する細胞
をMT18の培養上清及びPM1培養上清のいずれかによって
も処理しなかった場合の結果を第１図中a,b,c及びｄに
点線で示した。
抗体MT18のIL−６レセプターに対する反応性を示す。IL
−６レセプターを発現していないＴ細胞株Jurkat（第１
図中、ａ及びｃ）及びIL−６レセプターcDNAが導入され
ており持続的にIL−６レセプターを発現しているJurkat
（第１図中、ｂ及びｄ）のそれぞれと、MT18の培養上清
（第１図中、ａ及びｂの実線）及びPM1の培養上清（第
１図中、ｃ及びｄの実線）のそれぞれとを反応せしめ、
これらを螢光色素を結合したヤギ由来抗マウスイムノグ
ロブリン抗体と反応せしめた後螢光強度に対する螢光染
色された細胞の分布を調べた。比較のため対応する細胞
をMT18の培養上清及びPM1培養上清のいずれかによって
も処理しなかった場合の結果を第１図中a,b,c及びｄに
点線で示した。
この結果、PM1抗体及びMT18抗体のいずれもIL−６レ
セプターに結合することが確認された。
セプターに結合することが確認された。
実施例3. IL−６レセプターに対するポリクローナル抗
体の作製 IL−６レセプターに対するポリクローナル抗体を作製
する目的で、免疫原として、IL−６レセプターの細胞内
領域の一部に相当するペプチドにシステイン残基を付加
したもの（KTSMHPPYSLGQLVPC）を常法により合成した
（Ｋはリジン、Ｔはトレニオン、Ｓはセリン、Ｍはメチ
オニン、Ｈはヒスチジン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐは
プロリン、Ｙはチロシン、Ｌはロイシン、Ｇはグリシ
ン、Ｑはグルタミン、Ｖはバリン、Ｃはシステイン残基
を示す）。
体の作製 IL−６レセプターに対するポリクローナル抗体を作製
する目的で、免疫原として、IL−６レセプターの細胞内
領域の一部に相当するペプチドにシステイン残基を付加
したもの（KTSMHPPYSLGQLVPC）を常法により合成した
（Ｋはリジン、Ｔはトレニオン、Ｓはセリン、Ｍはメチ
オニン、Ｈはヒスチジン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐは
プロリン、Ｙはチロシン、Ｌはロイシン、Ｇはグリシ
ン、Ｑはグルタミン、Ｖはバリン、Ｃはシステイン残基
を示す）。
これをT.Hiranoらの示す方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,84,p228,1987年参照）により、オバルブミンと結合
させた。これをウサギに１週間に１回0.2mg計５回免疫
したのち全血清を採取した。さらに、免疫した合成ペプ
チドを結合させたセファロース4Bでアフィニティー精製
した。
SA,84,p228,1987年参照）により、オバルブミンと結合
させた。これをウサギに１週間に１回0.2mg計５回免疫
したのち全血清を採取した。さらに、免疫した合成ペプ
チドを結合させたセファロース4Bでアフィニティー精製
した。
第２図のデータは、このようにして作製されたポリク
ローナル抗体が、IL−６レセプターを特異的に認識する
ことを示す。すなわち、内部標識されたU266細胞（IL−
６レセプター産生細胞）をディタージェントで可溶化
し、この細胞溶解物を、MT18抗体（レーン１）、PM1抗
体（レーン２）、ウサギのイムノグロブリン（レーン
３）、又は実施例により調製した抗ペプチドポリクロー
ナル抗体（レーン４）により免疫沈降し、SPS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた後、オートラジオグ
ラフィーを行った。この結果、MT18モノクローナル抗
体、PM1モノクローナル抗体及び実施例３により調製し
た抗ペプチドポリクローナル抗体はいずれもIL−６レセ
プターを特異的に認識することが確認された。
ローナル抗体が、IL−６レセプターを特異的に認識する
ことを示す。すなわち、内部標識されたU266細胞（IL−
６レセプター産生細胞）をディタージェントで可溶化
し、この細胞溶解物を、MT18抗体（レーン１）、PM1抗
体（レーン２）、ウサギのイムノグロブリン（レーン
３）、又は実施例により調製した抗ペプチドポリクロー
ナル抗体（レーン４）により免疫沈降し、SPS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた後、オートラジオグ
ラフィーを行った。この結果、MT18モノクローナル抗
体、PM1モノクローナル抗体及び実施例３により調製し
た抗ペプチドポリクローナル抗体はいずれもIL−６レセ
プターを特異的に認識することが確認された。
実施例4. IL−６レセプターへのIL−６の結合に対する
PM1抗体による競合阻害 IL−６の標識、及び細胞上のIL−６レセプターへのIL
−６の結合の同定はT.Tagaらの方法（J.Exp.Med.,166,p
967,1987年参照）に従った。125I−IL−６（14,000cp
m）と、４×105個のU266細胞（IL−６レセプター産生細
胞）とを室温で60分間反応させた。このとき、分子数で
100倍過剰の非標識IL−6,MT18の培養上清（70％容
量）、又はPM1の培養上清（70％容量）をそれぞれ存在
せしめた。FCS上に重層し、遠心後、細胞の放射能を測
定した。比較のため細胞を接種していない培地も同様に
処理した。
PM1抗体による競合阻害 IL−６の標識、及び細胞上のIL−６レセプターへのIL
−６の結合の同定はT.Tagaらの方法（J.Exp.Med.,166,p
967,1987年参照）に従った。125I−IL−６（14,000cp
m）と、４×105個のU266細胞（IL−６レセプター産生細
胞）とを室温で60分間反応させた。このとき、分子数で
100倍過剰の非標識IL−6,MT18の培養上清（70％容
量）、又はPM1の培養上清（70％容量）をそれぞれ存在
せしめた。FCS上に重層し、遠心後、細胞の放射能を測
定した。比較のため細胞を接種していない培地も同様に
処理した。
第３図のデータは、MT18抗体がIL−６とIL−６レセプ
ターの結合を競合阻害しないのに対し、PM1抗体が競合
阻害することを示している。
ターの結合を競合阻害しないのに対し、PM1抗体が競合
阻害することを示している。
さらに、第４図でも同様の結果が示された。第４図
中、ａはU266細胞をIL−６の存在下（破線）又は非存在
下（実線）でMT18の培養上清と反応せしめた後螢光標識
された抗マウスイムノグロブリンで染色した場合の螢光
染色強度に対する細胞数の分布を示しており、ｂはU266
細胞をIL−６の存在した（破線）又は非存在下（実線）
でPM1の培養液と反応せしめ、その後ａの場合と同様に
処理した場合の結果であり、ａ及びｂにおける点線はU2
66細胞にIL−６のみを結合せしめた後同様に処理した場
合の結果である。MT18抗体はIL−６の存在、非存在に拘
らずU266細胞と結合するのに対して、PM1抗体はIL−６
の非存在下ではU266細胞と結合するが過剰のIL−６の存
在下ではU266細胞と結合せず、従ってPM1抗体がIL−６
と競合することが確認された。
中、ａはU266細胞をIL−６の存在下（破線）又は非存在
下（実線）でMT18の培養上清と反応せしめた後螢光標識
された抗マウスイムノグロブリンで染色した場合の螢光
染色強度に対する細胞数の分布を示しており、ｂはU266
細胞をIL−６の存在した（破線）又は非存在下（実線）
でPM1の培養液と反応せしめ、その後ａの場合と同様に
処理した場合の結果であり、ａ及びｂにおける点線はU2
66細胞にIL−６のみを結合せしめた後同様に処理した場
合の結果である。MT18抗体はIL−６の存在、非存在に拘
らずU266細胞と結合するのに対して、PM1抗体はIL−６
の非存在下ではU266細胞と結合するが過剰のIL−６の存
在下ではU266細胞と結合せず、従ってPM1抗体がIL−６
と競合することが確認された。
実施例5. PM1抗体がIL−６の生物活性を阻害すること
の確認 IL−６依存性のヒトＴ細胞白血病株KT3をS.Simizuら
の方法（Blood,72,p1826,1988年参照）に従って培養し
た後、種々の濃度のIL−６を、25％容量のハイブリドー
マの培養上清の存在下又は非存在下で加え、市販の96穴
プレートに１ウエルあたり５×103細胞/100μで培養
した。60時間後、１ウエルあたり0.75μCiのトリチウム
標識されたチミヂンを加え、６時間後細胞を集め、そし
て取り込まれた放射能を測定した。
の確認 IL−６依存性のヒトＴ細胞白血病株KT3をS.Simizuら
の方法（Blood,72,p1826,1988年参照）に従って培養し
た後、種々の濃度のIL−６を、25％容量のハイブリドー
マの培養上清の存在下又は非存在下で加え、市販の96穴
プレートに１ウエルあたり５×103細胞/100μで培養
した。60時間後、１ウエルあたり0.75μCiのトリチウム
標識されたチミヂンを加え、６時間後細胞を集め、そし
て取り込まれた放射能を測定した。
第５図のデータは、MT18抗体がIL−６の生物活性を阻
害しないのに対し、PM1抗体がIL−６の生物作用を阻害
することを示している。
害しないのに対し、PM1抗体がIL−６の生物作用を阻害
することを示している。
実施例6. IL−６の細胞内領域を認識するモノクローナ
ル抗体の作製 実施例3.で使用したIL−６の細胞内領域の一部に相当
するペプチドにシステインを付加したもの（KTSMHPPYSL
GQLVPC）（オバルブミンとの結合体）を、１週間に１
回、計４回、Balb/cマウスの腹部に免疫した。次にマウ
スからの脾細胞をポリエチレングリコールを用いる通常
の方法に従い、ミエローマ細胞P3U1と融合せしめた。
ル抗体の作製 実施例3.で使用したIL−６の細胞内領域の一部に相当
するペプチドにシステインを付加したもの（KTSMHPPYSL
GQLVPC）（オバルブミンとの結合体）を、１週間に１
回、計４回、Balb/cマウスの腹部に免疫した。次にマウ
スからの脾細胞をポリエチレングリコールを用いる通常
の方法に従い、ミエローマ細胞P3U1と融合せしめた。
スクリーニングは以下のように行なった。まず、ハイ
ブリドーマの培養上清と0.01mlのプロテインＧセファロ
ース（ファルマシア）を混合し、上清中のイムノグロブ
リンを樹脂に吸着せしめた。一方、35Sメチオニンで内
部標識したU266細胞107個を可溶化後、前述のプロテイ
ンＧセファロースを用いる通常の方法で免疫沈降させ、
SDS/PAGEで解析してIL−６レセプターのバンドが検出さ
れ、更にこのバンドが免疫沈降の際にマウスに免疫した
ペプチド（KTSMHPPYSLGQLVPC）を添加することにより消
失することを確認した。その結果、IL−６レセプターの
細胞内領域の一部を特異的に認識する抗体を産生してい
るハイブリドーマが１クローン単離された。
ブリドーマの培養上清と0.01mlのプロテインＧセファロ
ース（ファルマシア）を混合し、上清中のイムノグロブ
リンを樹脂に吸着せしめた。一方、35Sメチオニンで内
部標識したU266細胞107個を可溶化後、前述のプロテイ
ンＧセファロースを用いる通常の方法で免疫沈降させ、
SDS/PAGEで解析してIL−６レセプターのバンドが検出さ
れ、更にこのバンドが免疫沈降の際にマウスに免疫した
ペプチド（KTSMHPPYSLGQLVPC）を添加することにより消
失することを確認した。その結果、IL−６レセプターの
細胞内領域の一部を特異的に認識する抗体を産生してい
るハイブリドーマが１クローン単離された。
本発明で提供されるIL−６レセプターを特異的に認識
するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、診
断薬及び治療薬として期待されるIL−６レセプター活性
を有する種々のタンパク質を大量に生産し、そして精製
するために有益である。
するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、診
断薬及び治療薬として期待されるIL−６レセプター活性
を有する種々のタンパク質を大量に生産し、そして精製
するために有益である。
また、本発明で提供される抗体を用いることにより、
自然状態では極めて微量にしか生産されないIL−６レセ
プターの諸性質を解析することが可能になる。このこと
は固体発生及び免疫機構の研究、さらにはそれらの成果
に基づく治療薬診断薬等の開発等に大きな意義をもつ。
自然状態では極めて微量にしか生産されないIL−６レセ
プターの諸性質を解析することが可能になる。このこと
は固体発生及び免疫機構の研究、さらにはそれらの成果
に基づく治療薬診断薬等の開発等に大きな意義をもつ。
さらに、本発明で提供されるIL−６の生物作用を阻害
する抗体は、IL−６の異常産生が病因因子であると考え
られている種々の自己免疫疾患の治療薬としての応用開
発も考えられる。
する抗体は、IL−６の異常産生が病因因子であると考え
られている種々の自己免疫疾患の治療薬としての応用開
発も考えられる。
第１図は、IL−６レセプターを発現していないＴ細胞株
Jurkat（a,c）又はIL−６レセプターcDNA含有ベクター
が導入されており持続的にIL−６レセプターを発現して
いるJurkat（b,d）と、MT18の培養上清（a,bの実線）又
はPM1の培養上清（ｃ及びｄの実線）との反応性を示
す。点線は培養上清で処理しなかった細胞についての結
果を示す。 第２図は、内部標識されたU266細胞を可溶化した後、MT
18モノクローナル抗体（レーン１）、PM1モノクローナ
ル抗体（レーン２）、ウサギのイムノグロブリン（レー
ン３）又は実施例３の抗ペプチドポリクローナル抗体
（レーン４）により免疫沈降せしめ、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーを行
った結果を示す。 第３図は、実施例３におけるIL−６レセプターへのIL−
６の結合に対するPM1抗体及びMT18抗体の阻害効果を示
すグラフである。 第４図は、IL−６の存在下（破線）又は非存在下（実
線）での、U266細胞へのMT18抗体（ａ）又はPM1抗体
（ｂ）の結合を比較した結果であり、破線はIL−６のみ
で処理したU266細胞についての結果を示す。 第５図は、MT18の培養上清存在下、PM1の培養上清存在
下あるいは非存在下で、種々の濃度のIL−６を添加して
培養した時の、KT3細胞によるトリチウム標識チミヂン
の取り込みを示す。 第６図は、MT18抗体がIL−６レセプター産生細胞のみに
結合することを示す細胞分布図である。
Jurkat（a,c）又はIL−６レセプターcDNA含有ベクター
が導入されており持続的にIL−６レセプターを発現して
いるJurkat（b,d）と、MT18の培養上清（a,bの実線）又
はPM1の培養上清（ｃ及びｄの実線）との反応性を示
す。点線は培養上清で処理しなかった細胞についての結
果を示す。 第２図は、内部標識されたU266細胞を可溶化した後、MT
18モノクローナル抗体（レーン１）、PM1モノクローナ
ル抗体（レーン２）、ウサギのイムノグロブリン（レー
ン３）又は実施例３の抗ペプチドポリクローナル抗体
（レーン４）により免疫沈降せしめ、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーを行
った結果を示す。 第３図は、実施例３におけるIL−６レセプターへのIL−
６の結合に対するPM1抗体及びMT18抗体の阻害効果を示
すグラフである。 第４図は、IL−６の存在下（破線）又は非存在下（実
線）での、U266細胞へのMT18抗体（ａ）又はPM1抗体
（ｂ）の結合を比較した結果であり、破線はIL−６のみ
で処理したU266細胞についての結果を示す。 第５図は、MT18の培養上清存在下、PM1の培養上清存在
下あるいは非存在下で、種々の濃度のIL−６を添加して
培養した時の、KT3細胞によるトリチウム標識チミヂン
の取り込みを示す。 第６図は、MT18抗体がIL−６レセプター産生細胞のみに
結合することを示す細胞分布図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (11)
- 【請求項１】ヒトインターロイキン−６レセプターと特
異的に結合することができ、且つヒトインターロイキン
−６レセプターとの結合についてヒトインターロイキン
−６と競合する、抗−ヒトインターロイキン−６レセプ
ター抗体。 - 【請求項２】モノクローナル抗体である請求項１に記載
の抗体。 - 【請求項３】ハイブリドーマPM1（FERM BP−2998）によ
り生産されるPM1抗体である請求項２に記載の抗体。 - 【請求項４】ポリクローナル抗体である、請求項１に記
載の抗体。 - 【請求項５】次の配列： （Ｎ末端）KTSMHPPYSLGQLVPC（Ｃ末端） （ただし配列中のアルファベットはアミノ酸の一文字表
示法に従ったアミノ酸を示す。） で現されるヒトインターロイキン−６レセプター部分を
認識する抗体。 - 【請求項６】請求項２に記載のモノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマ。 - 【請求項７】ヒトインターロイキン−６レセプター抗原
により哺乳類を感作し、該哺乳類から免疫細胞を採取
し、該免疫細胞をミエローマ細胞株と融合せしめ、そし
て該融合株からヒトインターロイキン−６レセプターを
認識する株をクローニングすることを特徴とする、請求
項２に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマの製造方法。 - 【請求項８】前記ヒトインターロイキン−６レセプター
抗原が、固体キャリヤーに結合されたヒトインターロイ
キン−６レセプター、又は高分子キャリヤーに結合した
ペプチド（KTSMHPPYSLGQLVPC）である、請求項７に記載
の方法。 - 【請求項９】前記ハイブリドーマが、ハイブリドーマPM
1（FERM BP−2998）である、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】請求項６に記載のハイブリドーマ、又は
請求項7,8もしくは９に記載の方法により製造されたハ
イブリドーマを培養し、該培養物からヒトインターロイ
キン−６レセプターを認識するモノクローナル抗体を採
取することを特徴とする抗−ヒトインターロイキン−６
レセプター抗体の製造方法。 - 【請求項１１】ヒトインターロイキン−６レセプター抗
原により哺乳類動物を免疫感作し、該動物からヒトイン
ターロイキン−６レセプターを認識するポリクローナル
抗体を採取することを含んで成る抗−ヒトインターロイ
キン−６レセプターポリクローナル抗体の製造方法にお
いて、前記ヒトインターロイキン−６レセプター抗原が
次の配列： （Ｎ末端）KTSMHPPYSLGQLVPC（Ｃ末端） （ただし配列中のアルファベットはアミノ酸の一文字表
示法に従ったアミノ酸を示す。） を有するペプチドを高分子キャリヤーに結合した複合体
であることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-186016 | 1989-07-20 | ||
| JP18601689 | 1989-07-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03139293A JPH03139293A (ja) | 1991-06-13 |
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Family
ID=16180912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18942090A Expired - Lifetime JP2998976B2 (ja) | 1989-07-20 | 1990-07-19 | ヒトインタ―ロイキン―６レセプターに対する抗体 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0409607B1 (ja) |
| JP (1) | JP2998976B2 (ja) |
| KR (1) | KR100214759B1 (ja) |
| AT (1) | ATE144713T1 (ja) |
| CA (1) | CA2021594C (ja) |
| DE (2) | DE122009000023I2 (ja) |
| ES (1) | ES2093017T3 (ja) |
| HK (1) | HK49497A (ja) |
| NL (1) | NL300387I1 (ja) |
| SG (1) | SG42954A1 (ja) |
Families Citing this family (55)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05236966A (ja) * | 1991-04-25 | 1993-09-17 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | ヒトインターロイキン−６レセプターに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードするｄｎａ |
| US5795965A (en) | 1991-04-25 | 1998-08-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reshaped human to human interleukin-6 receptor |
| FR2694767B1 (fr) * | 1992-08-13 | 1994-10-21 | Innotherapie Lab Sa | Anticorps monoclonaux anti-IL6R, et leurs applications. |
| AU7967294A (en) * | 1993-10-06 | 1995-05-01 | Board Of Regents, The University Of Texas System | A monoclonal anti-human il-6 receptor antibody |
| US8017121B2 (en) | 1994-06-30 | 2011-09-13 | Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha | Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component |
| US5856098A (en) * | 1994-09-14 | 1999-01-05 | Progenitor, Inc. | Detection of a leptin receptor variant |
| US5912123A (en) * | 1994-09-14 | 1999-06-15 | Progenitor, Inc. | Detection of the leptin receptor in reproductive organs and methods for regulating reproductive biology |
| US6451523B1 (en) | 1994-09-14 | 2002-09-17 | Interneuron Pharmaceuticals, Inc. | Detection of a leptin receptor variant and methods for regulating obesity |
| US5763211A (en) * | 1994-09-14 | 1998-06-09 | Progenitor, Inc. | Isolated nucleic acid encoding Hu-B1.219, a novel human hematopoietin |
| US6355237B1 (en) | 1994-09-14 | 2002-03-12 | Progenitor, Inc. | Methods for using the obese gene and its gene product to stimulate hematopoietic development |
| US5643748A (en) | 1994-09-14 | 1997-07-01 | Progenitor, Inc. | HU-B1.219, a novel human hematopoietin receptor |
| ES2384222T3 (es) * | 1994-10-07 | 2012-07-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Inhibición del crecimiento anómalo de células sinoviales utilizando un antagonista de IL-6 como principio activo |
| CN1306963C (zh) * | 1994-10-21 | 2007-03-28 | 岸本忠三 | 用于治疗il－6产生所致疾病的药物组合物 |
| JP3458512B2 (ja) | 1995-02-23 | 2003-10-20 | 東ソー株式会社 | 骨密度の変動推定方法又は骨そしょう症の診断方法及びこれに用いる試薬キット |
| AU1833197A (en) * | 1996-01-18 | 1997-08-11 | Progenitor, Inc. | Detection of a leptin receptor variant and methods for regulating obesity |
| US6692742B1 (en) * | 1996-06-27 | 2004-02-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedies for myeloma to be used together with nitrogen mustard antitumor agents |
| JP5485489B2 (ja) | 2000-08-11 | 2014-05-07 | 中外製薬株式会社 | 抗体含有安定化製剤 |
| CN1259973C (zh) * | 2000-10-25 | 2006-06-21 | 中外制药株式会社 | 含有il－6拮抗剂作为有效成分的牛皮癣的预防或治疗剂 |
| UA80091C2 (en) | 2001-04-02 | 2007-08-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist |
| GB2401040A (en) | 2003-04-28 | 2004-11-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for treating interleukin-6 related diseases |
| MXPA06003768A (es) | 2003-10-17 | 2006-06-23 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agente terapeutico para el mesotelioma. |
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| TW200803894A (en) | 2005-11-25 | 2008-01-16 | Univ Keio | Prostate cancer therapeutic agents |
| AU2007208678B2 (en) | 2006-01-27 | 2013-01-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Therapeutic agents for diseases involving choroidal neovascularization |
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| US8080248B2 (en) | 2006-06-02 | 2011-12-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating rheumatoid arthritis with an IL-6R antibody |
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| WO2008020079A1 (en) | 2006-08-18 | 2008-02-21 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling |
| CN101528778A (zh) * | 2006-08-18 | 2009-09-09 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 用于治疗与il-6-介导的信号传导相关的疾病和病症的针对il-6r的氨基酸序列以及包括其的多肽 |
| WO2008071685A1 (en) * | 2006-12-13 | 2008-06-19 | Ablynx N.V. | Polypeptides specific for complexes involved in receptor-mediated signaling, such as the il-6/il-6 receptor complex |
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