JP2915486B2 - 間接固相抗体法 - Google Patents
間接固相抗体法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、間接固相抗体法に関する。さらに詳細に
は、本発明は、溶液中の抗原・抗体反応の定量方法に関
する。
は、本発明は、溶液中の抗原・抗体反応の定量方法に関
する。
従来、抗原・抗体反応の定量としては、固相酵素抗体
法、免疫沈降法、競合免疫法、及び阻害試験法等が知ら
れている。
法、免疫沈降法、競合免疫法、及び阻害試験法等が知ら
れている。
しかるに固相抗体法では、抗原を反応容器の内側に固
定する際に抗原の抗原性が変化してしまうことが少なく
なく、更には抗原が全く変性してしまうこもあり、溶液
条件下における抗原抗体反応を正確に測定することは不
可能であった。
定する際に抗原の抗原性が変化してしまうことが少なく
なく、更には抗原が全く変性してしまうこもあり、溶液
条件下における抗原抗体反応を正確に測定することは不
可能であった。
また、免疫沈降法では、反応系に添加される二次抗体
や沈澱剤、それらに含まれる不純物が抗原の反応性や抗
原性に影響を与える可能性が大きく、溶液条件下での抗
原抗体反応を正確に測定することはできなかった。ま
た、高感度で沈殿中の抗原や抗体の量を測定することは
容易でないという問題もあった。
や沈澱剤、それらに含まれる不純物が抗原の反応性や抗
原性に影響を与える可能性が大きく、溶液条件下での抗
原抗体反応を正確に測定することはできなかった。ま
た、高感度で沈殿中の抗原や抗体の量を測定することは
容易でないという問題もあった。
競合免疫法においても同様に、反応液中の因子が測定
系の抗原抗体反応に影響を与えるので、溶液条件下での
抗原抗体反応の測定は不可能であり、さらに阻害試験法
においては、反応系、測定系の相互間の影響を除外でき
ず、正確な抗原抗体反応の定量はできなかった。
系の抗原抗体反応に影響を与えるので、溶液条件下での
抗原抗体反応の測定は不可能であり、さらに阻害試験法
においては、反応系、測定系の相互間の影響を除外でき
ず、正確な抗原抗体反応の定量はできなかった。
従って、上記方法を用いても溶液条件下での抗原抗体
反応を正確に定量することは不可能であった。特に反応
溶液中に種々の因子を含む反応溶液条件下では、これら
の因子の影響を考慮しなければならず、抗体量の測定が
一層困難であった。例えば固相酵素抗体法（ELISA）で
は、抗原抗体反応に影響を与える因子と酵素による発色
反応に影響を与える因子のいずれによってもシグナル強
度が変化するので、反応系の因子の影響を受け易く正確
な測定が不可能になる場合があった。
反応を正確に定量することは不可能であった。特に反応
溶液中に種々の因子を含む反応溶液条件下では、これら
の因子の影響を考慮しなければならず、抗体量の測定が
一層困難であった。例えば固相酵素抗体法（ELISA）で
は、抗原抗体反応に影響を与える因子と酵素による発色
反応に影響を与える因子のいずれによってもシグナル強
度が変化するので、反応系の因子の影響を受け易く正確
な測定が不可能になる場合があった。
従って本発明は、溶液状態における抗原抗体反応を正
確に定量する方法を提供することを目的とし、特には種
々の因子を含む溶液中でも正確に抗原抗体反応を定量す
ることを可能にする方法を提供することを目的とする。
確に定量する方法を提供することを目的とし、特には種
々の因子を含む溶液中でも正確に抗原抗体反応を定量す
ることを可能にする方法を提供することを目的とする。
そこで、本発明者は鋭意研究した結果、抗原抗体反応
の反応溶液を希釈することによって抗原抗体反応を停止
させるとともに、反応系の因子が測定に与える影響を最
小限に抑えると抗原抗体反応を正確に定量できることを
見出し本発明を完成するに至った。本発明の方法によれ
ば、希釈の後、未反応の抗体量を測定することで、反応
系に含まれる因子が測定の際に与える影響を完全に除去
することができ、さらに、例えば固相酵素抗体法におい
て抗体量とシグナル強度が比例する条件を用いることに
より、未反応の抗体の量を正確に定量することができ
る。
の反応溶液を希釈することによって抗原抗体反応を停止
させるとともに、反応系の因子が測定に与える影響を最
小限に抑えると抗原抗体反応を正確に定量できることを
見出し本発明を完成するに至った。本発明の方法によれ
ば、希釈の後、未反応の抗体量を測定することで、反応
系に含まれる因子が測定の際に与える影響を完全に除去
することができ、さらに、例えば固相酵素抗体法におい
て抗体量とシグナル強度が比例する条件を用いることに
より、未反応の抗体の量を正確に定量することができ
る。
すなわち、本発明は、 抗原抗体反応を定量する方法において、 既知量の抗体と抗原とを溶液中で反応させる工程、 上記溶液を希釈して、抗原抗体反応を停止させるとと
もに、反応系の他の因子が測定に与える影響を最小限に
抑えるようにする工程、及び 抗原と未反応の抗体を固相抗体法で定量する工程を含
む定量方法を提供するものである。
もに、反応系の他の因子が測定に与える影響を最小限に
抑えるようにする工程、及び 抗原と未反応の抗体を固相抗体法で定量する工程を含
む定量方法を提供するものである。
本発明の方法において使用される抗原と抗体の組合せ
の例としては、recAタンパク抗原と、ARM321抗体、ARM4
14抗体、ARM191抗体、ARM193抗体からなる群より選ばれ
る抗体、recAタンパクの変異タンパクであるrecA430抗
原と、ARM321抗体、ARM414抗体、ARM191抗体、ARM193抗
体からなる群より選ばれる抗体等が挙げられる。
の例としては、recAタンパク抗原と、ARM321抗体、ARM4
14抗体、ARM191抗体、ARM193抗体からなる群より選ばれ
る抗体、recAタンパクの変異タンパクであるrecA430抗
原と、ARM321抗体、ARM414抗体、ARM191抗体、ARM193抗
体からなる群より選ばれる抗体等が挙げられる。
recAタンパク、ARM321抗体、ARM414抗体、ARM191抗
体、及びARM193抗体は、The Journal of Biological Ch
emistry,1985,260,pp15402−15405に、recA430は、The
Journal of Biological Chemistry,1989,264,pp21167−
21176に記載されている。このうち、recAタンパク抗原
と、抗RecAモノクローナル抗体ARM321、抗RecAモノクロ
ーナル抗体ARM414、及び抗RecAモノクローナル抗体ARM1
91からなる群より選ばれる抗体を使用することが好まし
い。
体、及びARM193抗体は、The Journal of Biological Ch
emistry,1985,260,pp15402−15405に、recA430は、The
Journal of Biological Chemistry,1989,264,pp21167−
21176に記載されている。このうち、recAタンパク抗原
と、抗RecAモノクローナル抗体ARM321、抗RecAモノクロ
ーナル抗体ARM414、及び抗RecAモノクローナル抗体ARM1
91からなる群より選ばれる抗体を使用することが好まし
い。
抗原と抗体を反応させる溶液は、いかなるものも可能
であり、抗原性を変える因子の存在する任意の溶液を選
ぶことができる。例えば、recAタンパクを抗原として用
いる場合は、recAタンパクの抗原性に影響を与える可能
性のあるATPやDNAを含む溶液中で抗原抗体反応を定量す
ることができる。その他、pH、イオン強度などを変化さ
せる因子を含有する任意の溶液を選ぶことができる。
であり、抗原性を変える因子の存在する任意の溶液を選
ぶことができる。例えば、recAタンパクを抗原として用
いる場合は、recAタンパクの抗原性に影響を与える可能
性のあるATPやDNAを含む溶液中で抗原抗体反応を定量す
ることができる。その他、pH、イオン強度などを変化さ
せる因子を含有する任意の溶液を選ぶことができる。
反応の条件としては、反応温度は任意に選ぶことがで
き、反応時間は抗原と抗体の反応が飽和に達するまでの
任意の時間を選ぶことができる。
き、反応時間は抗原と抗体の反応が飽和に達するまでの
任意の時間を選ぶことができる。
抗原・抗体反応後、抗原・抗体の結合を解離させない
希釈剤を用いて反応溶液の希釈を行うことが好ましい。
この様な希釈剤としてはPBSを挙げることができる。PBS
とは、リン酸緩衝液を含有する生理食塩水である。該希
釈工程は抗原・抗体反応を効果的に停止させ、かつ抗体
以外の物質が後の固相抗体法の検出限界以下になる様に
行う。例えば、recAタンパクとARM321抗体、ARM414抗
体、及びARM191抗体からなる群より選ばれる抗体を用い
る場合には、PBS−ツイーンで約1,500倍に希釈すること
が好ましい。ここでPBS−ツイーンとは、0.05％ツイー
ンをPBSに溶かした溶液をいう。さらに、該希釈工程は
室温（約25℃）で、５分以内に行うことが好ましい。
希釈剤を用いて反応溶液の希釈を行うことが好ましい。
この様な希釈剤としてはPBSを挙げることができる。PBS
とは、リン酸緩衝液を含有する生理食塩水である。該希
釈工程は抗原・抗体反応を効果的に停止させ、かつ抗体
以外の物質が後の固相抗体法の検出限界以下になる様に
行う。例えば、recAタンパクとARM321抗体、ARM414抗
体、及びARM191抗体からなる群より選ばれる抗体を用い
る場合には、PBS−ツイーンで約1,500倍に希釈すること
が好ましい。ここでPBS−ツイーンとは、0.05％ツイー
ンをPBSに溶かした溶液をいう。さらに、該希釈工程は
室温（約25℃）で、５分以内に行うことが好ましい。
上記の様に希釈した反応液中の抗体量を測定するため
の固相抗体法としては、酵素抗体法、蛍光抗体法、ラジ
オイムノアッセイ等が挙げられる。このうち、酵素抗体
法が好ましい。具体的には、マイクロタイタープレート
のウェルに抗原を固定し、このウェルに抗原抗体反応を
行った反応液を希釈した液を加え未反応の抗体とウェル
に固定した抗原を反応させ、その後上記希釈した反応液
を洗い流し、さらにこのウェルに酵素で標識した二次抗
体を加えウェルに固定した抗原と反応した抗体と反応さ
せ、次いでこのウェルに上記酵素の基質となる物質を加
え、酵素反応によって生成した物質の比色により抗原抗
体複合体を定量することができる。上記固相抗体法で
は、抗原と未反応の抗体が定量されるので、この値を抗
原抗体反応前の抗体量から差し引くことにより、抗原抗
体反応を定量することができる。
の固相抗体法としては、酵素抗体法、蛍光抗体法、ラジ
オイムノアッセイ等が挙げられる。このうち、酵素抗体
法が好ましい。具体的には、マイクロタイタープレート
のウェルに抗原を固定し、このウェルに抗原抗体反応を
行った反応液を希釈した液を加え未反応の抗体とウェル
に固定した抗原を反応させ、その後上記希釈した反応液
を洗い流し、さらにこのウェルに酵素で標識した二次抗
体を加えウェルに固定した抗原と反応した抗体と反応さ
せ、次いでこのウェルに上記酵素の基質となる物質を加
え、酵素反応によって生成した物質の比色により抗原抗
体複合体を定量することができる。上記固相抗体法で
は、抗原と未反応の抗体が定量されるので、この値を抗
原抗体反応前の抗体量から差し引くことにより、抗原抗
体反応を定量することができる。
本発明の方法により、溶液状態下での抗原抗体反応
を、極めて容易にかつ正確に定量することが可能になっ
た。
を、極めて容易にかつ正確に定量することが可能になっ
た。
さらに、抗原を含むタンパク質内のアミノ酸変異や化
学修飾による抗原抗体反応の変化を知ることが可能にな
った。尚、このアミノ酸変異や化学修飾により抗原性が
変化しても、本発明の定量は可能である。
学修飾による抗原抗体反応の変化を知ることが可能にな
った。尚、このアミノ酸変異や化学修飾により抗原性が
変化しても、本発明の定量は可能である。
以下に本発明の実施態様として実施例をあげるが、こ
れは本発明の説明のためのものであって、本発明の範囲
を制限するものではない。
れは本発明の説明のためのものであって、本発明の範囲
を制限するものではない。
以下の実施例は、特に断らない限り室温（25℃）下で
行った。
行った。
また、本実施例で用いたrecAタンパク及びDNAφ×174
は、J.Biol.Chem,1981,256,p7557−7564に、ARM321抗
体、ARM414抗体、ARM191抗体、及びARM193抗体は、J.Bi
ol.Chem,1985,260,PP15402−15404に、recA430は、J.Bi
ol.Chem,1989,264,pp21167−21176に記載の方法によっ
て得た。
は、J.Biol.Chem,1981,256,p7557−7564に、ARM321抗
体、ARM414抗体、ARM191抗体、及びARM193抗体は、J.Bi
ol.Chem,1985,260,PP15402−15404に、recA430は、J.Bi
ol.Chem,1989,264,pp21167−21176に記載の方法によっ
て得た。
〔参考例 １〕 固定相の作製 マイクロタイタープレート（96穴）のウェルに50μｌ
のrecAタンパク（２μg/ml）溶液を加えて４℃で15時間
放置して、更に200μｌのPBS（50mMリン酸緩衝液、pH7.
2、150mM NaCl）で３回洗い、ウェルの壁をrecAタンパ
クで覆い固定した。更にブロッキングの為に、100μｌ
の小牛血清アルブミン溶液（１％）をウェルに入れ、６
時間ほど放置してから130μｌのPBSでウェルを洗った。
のrecAタンパク（２μg/ml）溶液を加えて４℃で15時間
放置して、更に200μｌのPBS（50mMリン酸緩衝液、pH7.
2、150mM NaCl）で３回洗い、ウェルの壁をrecAタンパ
クで覆い固定した。更にブロッキングの為に、100μｌ
の小牛血清アルブミン溶液（１％）をウェルに入れ、６
時間ほど放置してから130μｌのPBSでウェルを洗った。
〔参考例 ２〕 検量線の作製 参考例２で作製した固定相のウェル中に、PBS−ツイ
ーン20（0.05％ツイーン20（バイオラッド社製）をPBS
に溶かした溶液）に溶かした濃度0.025nMの抗recAタン
パク抗体であるARM321抗体を50μｌ加え１時間放置し
た。そのウェルを130μｌのPBS−ツイーンで３回洗っ
た。次に、そのウェルに50μｌのペルオキシダーゼで標
識した500希釈ヤギに由来する抗マウスIgG抗体（KPL社
製）を加え１時間放置した後、130μｌのPBS−ツイーン
で３回、次いで200μｌのPBSで洗った。そこへ、100μ
ｌのｏ−フェニレンジアミン（1mg/ml）、0.05Mクエン
酸、0.05Mクエン酸ナトリウム、0.015％過酸化水素溶液
を加え30分放置し、呈色反応を行った。32μｌの4.5M硫
酸を加えその反応を停めた。呈色反応は、490nmの吸光
度を測ることによって測定した。以上の操作を、ARM321
抗体の濃度を0.038nM、0.05nM、0.063nM、0.094nM、0.1
25nM、0.156nM、0.188nM、0.219nM、0.250nM、0.281n
M、0.313nMに変えて繰り返すことにより、検量線を作製
した。
ーン20（0.05％ツイーン20（バイオラッド社製）をPBS
に溶かした溶液）に溶かした濃度0.025nMの抗recAタン
パク抗体であるARM321抗体を50μｌ加え１時間放置し
た。そのウェルを130μｌのPBS−ツイーンで３回洗っ
た。次に、そのウェルに50μｌのペルオキシダーゼで標
識した500希釈ヤギに由来する抗マウスIgG抗体（KPL社
製）を加え１時間放置した後、130μｌのPBS−ツイーン
で３回、次いで200μｌのPBSで洗った。そこへ、100μ
ｌのｏ−フェニレンジアミン（1mg/ml）、0.05Mクエン
酸、0.05Mクエン酸ナトリウム、0.015％過酸化水素溶液
を加え30分放置し、呈色反応を行った。32μｌの4.5M硫
酸を加えその反応を停めた。呈色反応は、490nmの吸光
度を測ることによって測定した。以上の操作を、ARM321
抗体の濃度を0.038nM、0.05nM、0.063nM、0.094nM、0.1
25nM、0.156nM、0.188nM、0.219nM、0.250nM、0.281n
M、0.313nMに変えて繰り返すことにより、検量線を作製
した。
以上の操作を、ARM414抗体、ARM191抗体、ARM193抗体
を用いて繰り返した。
を用いて繰り返した。
結果を第１図に示した。この結果より、酵素抗体法の
シグナル（490nmでの吸光度）の強さが抗recAタンパク
抗体の量に比例しており、未反応の抗recAタンパク抗体
を0.2nMまでなら酵素抗体法によって正確に定量できる
ことがわかる。そこで、本実施例では、希釈操作の後、
未反応の抗体濃度が0.13nMになるようにした。
シグナル（490nmでの吸光度）の強さが抗recAタンパク
抗体の量に比例しており、未反応の抗recAタンパク抗体
を0.2nMまでなら酵素抗体法によって正確に定量できる
ことがわかる。そこで、本実施例では、希釈操作の後、
未反応の抗体濃度が0.13nMになるようにした。
〔参考例 ３〕 抗recタンパク抗体（IgG）の濃度と酵素抗体法のシグナ
ルの強さ 21μｌの反応液Ａ（31mMトリス緩衝液、pH7.5、13mM
塩化マグネシウム、2.8mMジチオスレイトール、88μg/m
l小牛血清アルブミン、２％グリセリン）の中で、0.2μ
Ｍの抗recAタンパク単クローンIgGのひとつであるARM32
1抗体と濃度0.2μＭ、0.5μＭ、１μＭ、２μＭの抗原
であるrecAタンパクとを37℃で10分反応させた。該反応
液から４μｌを取り出し1,500倍容（6ml）のPBS−ツイ
ーンを加えて抗原抗体反応を停止してから、室温中で希
釈後５分以内に50μｌの希釈溶液をすでにrecタンパク
をウェルの壁に固定してある参考例１のマイクロタイタ
ープレートのウェルに入れ、１時間放置した。そのウェ
ルを130μｌのPBS−ツイーンで３回洗った。次に、50μ
ｌのペルオキシダーゼで標識した1/500希釈ヤギに由来
する抗マウスIgG抗体（KPL社製）を加え１時間放置した
後、130μｌのPBS−ツイーンで３回、次いで200μｌのP
BSで洗った。そこへ、100μｌのｏ−フェニレンジアミ
ン（1mg/ml）、0.05Mクエン酸、0.05Mクエン酸ナトリウ
ム、0.015％過酸化水素溶液を加え30分放置して発色さ
せた後、32μｌの4.5M硫酸を加えその反応を停めた。49
0nmの吸光度を測定し、吸光度から参考例２の検量線を
用いて未反応の抗体量を求めた。
ルの強さ 21μｌの反応液Ａ（31mMトリス緩衝液、pH7.5、13mM
塩化マグネシウム、2.8mMジチオスレイトール、88μg/m
l小牛血清アルブミン、２％グリセリン）の中で、0.2μ
Ｍの抗recAタンパク単クローンIgGのひとつであるARM32
1抗体と濃度0.2μＭ、0.5μＭ、１μＭ、２μＭの抗原
であるrecAタンパクとを37℃で10分反応させた。該反応
液から４μｌを取り出し1,500倍容（6ml）のPBS−ツイ
ーンを加えて抗原抗体反応を停止してから、室温中で希
釈後５分以内に50μｌの希釈溶液をすでにrecタンパク
をウェルの壁に固定してある参考例１のマイクロタイタ
ープレートのウェルに入れ、１時間放置した。そのウェ
ルを130μｌのPBS−ツイーンで３回洗った。次に、50μ
ｌのペルオキシダーゼで標識した1/500希釈ヤギに由来
する抗マウスIgG抗体（KPL社製）を加え１時間放置した
後、130μｌのPBS−ツイーンで３回、次いで200μｌのP
BSで洗った。そこへ、100μｌのｏ−フェニレンジアミ
ン（1mg/ml）、0.05Mクエン酸、0.05Mクエン酸ナトリウ
ム、0.015％過酸化水素溶液を加え30分放置して発色さ
せた後、32μｌの4.5M硫酸を加えその反応を停めた。49
0nmの吸光度を測定し、吸光度から参考例２の検量線を
用いて未反応の抗体量を求めた。
以上の操作をARM414抗体、ARM191抗体について繰り返
した。
した。
結果を第２図に示した。上記抗体については、recAタ
ンパクの濃度が高くなるにつれて未反応の抗体の量が少
なくなることを示している。大体0.5μＭ前後のrecAタ
ンパクで未反応の抗体がなくなった。
ンパクの濃度が高くなるにつれて未反応の抗体の量が少
なくなることを示している。大体0.5μＭ前後のrecAタ
ンパクで未反応の抗体がなくなった。
〔参考例 ４〕 抗原抗体複合体の1,500倍希釈に対する安定性 0.2μＭの抗体（ARM414抗体、ARM321抗体、ARM191抗
体、ARM193抗体）と１μＭのrecAタンパクとを参考例３
と同じ条件で反応させてから、1,500倍容のPBS−ツイー
ンで希釈し、室温で放置する時間を変えて、酵素抗体法
で抗原と結合していない抗体の量を定量した。
体、ARM193抗体）と１μＭのrecAタンパクとを参考例３
と同じ条件で反応させてから、1,500倍容のPBS−ツイー
ンで希釈し、室温で放置する時間を変えて、酵素抗体法
で抗原と結合していない抗体の量を定量した。
結果を第３図に示す。第３図中、●は抗原、抗体の入
った完全系を示し；△は抗体を除いたコントロールを示
し；○は抗原（recAタンパク）を除いたコントロールを
示す。この結果から、ARM414抗体、ARM321抗体、ARM191
抗体については、希釈後60分にわたって複合体は安定に
存在していたが、ARM193抗体は希釈直後でも全てシグナ
ルを与えることがわかる。この事は、ARM193抗体とrecA
タンパクとの結合はこの希釈に耐えず、この抗体につい
ては本発明の方法は使用できないことを示している。
った完全系を示し；△は抗体を除いたコントロールを示
し；○は抗原（recAタンパク）を除いたコントロールを
示す。この結果から、ARM414抗体、ARM321抗体、ARM191
抗体については、希釈後60分にわたって複合体は安定に
存在していたが、ARM193抗体は希釈直後でも全てシグナ
ルを与えることがわかる。この事は、ARM193抗体とrecA
タンパクとの結合はこの希釈に耐えず、この抗体につい
ては本発明の方法は使用できないことを示している。
〔参考例 ５〕 抗原抗体反応の1,500倍希釈による停止処置の効果 6mlのPBS−ツイーンに１μＭのrecAタンパクを４μｌ
加え、直後に0.2μＭの抗体（ARM414抗体、ARM321抗
体、ARM191抗体）溶液を４μｌ加え室温で放置する時間
を変えて、酵素抗体法により抗原と結合してしない抗体
の量を定量した。
加え、直後に0.2μＭの抗体（ARM414抗体、ARM321抗
体、ARM191抗体）溶液を４μｌ加え室温で放置する時間
を変えて、酵素抗体法により抗原と結合してしない抗体
の量を定量した。
結果を第４図に示す。第４図中、●は抗原、抗体の入
った完全系を示し；△は抗体を除いたコントロールを示
し；○は抗原（recAタンパク）を除いたコントロールを
示す。この結果は、適度の希釈の後では、抗原と抗体は
たとえ共存してもその抗原抗体反応はおこらないかまた
は極めてゆっくりとしか起こらないことを示している。
よって、この希釈によって抗原抗体反応が効果的に停止
できることがわかる。
った完全系を示し；△は抗体を除いたコントロールを示
し；○は抗原（recAタンパク）を除いたコントロールを
示す。この結果は、適度の希釈の後では、抗原と抗体は
たとえ共存してもその抗原抗体反応はおこらないかまた
は極めてゆっくりとしか起こらないことを示している。
よって、この希釈によって抗原抗体反応が効果的に停止
できることがわかる。
〔実施例 １〕 参考例３の反応液Ａ中で１μＭのrecAタンパクと0.2
μＭのARM321抗体とを、ATP（ヤマサ醤油（株）製）濃
度０、0.1、0.3、1.3、2.6mMの存在下で37℃で反応時間
を変えて反応させた後、酵素抗体法で未反応の抗体量を
測定した。
μＭのARM321抗体とを、ATP（ヤマサ醤油（株）製）濃
度０、0.1、0.3、1.3、2.6mMの存在下で37℃で反応時間
を変えて反応させた後、酵素抗体法で未反応の抗体量を
測定した。
結果を第５図に示す。ATP濃度は、●0mM、■0.1mM、
◆0.3mM、▲1.3mM、▼2.6mMである。○はrecAタンパク
を除いたコントロール（ATP非存在下）を示し、▽はrec
Aタンパクを除いたコントロール（ATP2.6mM存在）を示
す。この結果から、ATPの存在によってrecAタンパクがA
RM321抗体に対する抗原性を失うことがわかる。
◆0.3mM、▲1.3mM、▼2.6mMである。○はrecAタンパク
を除いたコントロール（ATP非存在下）を示し、▽はrec
Aタンパクを除いたコントロール（ATP2.6mM存在）を示
す。この結果から、ATPの存在によってrecAタンパクがA
RM321抗体に対する抗原性を失うことがわかる。
〔実施例２〕 参考例３の反応液Ａ中で１μＭのrecAタンパクと0.2
μＭのARM414抗体を、ATPγＳ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）（1.3mM）及び単鎖DNAφ×174（50μＭ）の存
在下、ATPγＳ（1.3mM）の存在下、単鎖DNAφ×174（15
0μＭ）の存在下、37℃で反応時間を変えて反応させた
後、酵素抗体法で未反応の抗体量を測定した。
μＭのARM414抗体を、ATPγＳ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）（1.3mM）及び単鎖DNAφ×174（50μＭ）の存
在下、ATPγＳ（1.3mM）の存在下、単鎖DNAφ×174（15
0μＭ）の存在下、37℃で反応時間を変えて反応させた
後、酵素抗体法で未反応の抗体量を測定した。
結果を第６図に示す。▼はATPγＳ及び単鎖DNAφ×17
4の存在下、▽はATPγＳの存在下、●は単鎖DNAφ×174
の存在下を示す。〇はrecAタンパクのみのコントロール
（ATP及びDNA非存在下）、☆はrecAタンパクを除いた抗
体のみのコントロール（ATP及びDNA非存在下）を示す。
4の存在下、▽はATPγＳの存在下、●は単鎖DNAφ×174
の存在下を示す。〇はrecAタンパクのみのコントロール
（ATP及びDNA非存在下）、☆はrecAタンパクを除いた抗
体のみのコントロール（ATP及びDNA非存在下）を示す。
この結果から、ATPγＳ及び単鎖DNAφ×174の存在に
よってrecAタンパクがARM414抗体に対する抗原性を失う
ことがわかる。
よってrecAタンパクがARM414抗体に対する抗原性を失う
ことがわかる。
〔実施例３〕 抗原にrecA430を、抗体にARM414を用いて実施例２の
方法を繰り返した。
方法を繰り返した。
第１図は、recAタンパク抗原に対する抗体の検量線であ
る。第１図Ａは、ARM321の検量線であり、第１図Ｂは、
ARM414の検量線であり、第１図Ｃは、ARM191の検量線で
あり、第１図Ｄは、ARM193の検量線である。 第２図は、一定量の抗体に対しrecAタンパク抗原の量を
変化させたときの490nmの吸光度である。第２図Ａは、
抗体にARM321を、第２図Ｂは、抗体にARM414を、第２図
Ｃは、抗体にARM191を用いたものである。 第３図は、recAタンパク抗原・抗体複合体の1,500倍希
釈に対する安定性を示すものである。第３図Ａは、抗体
にARM321を、第３図Ｂは、抗体にARM414を、第３図Ｃ
は、抗体にARM191を、第３図Ｄは、抗体にARM193を用い
たものである。 第４図は、recAタンパク抗原・抗体反応の1,500倍希釈
による停止処置の効果を示すものである。第４図Ａは、
抗体にARM321を、第４図Ｂは、抗体にARM414を、第４図
Ｃは、抗体にARM191を用いたものである。 第５図は、ATPによるrecAタンパクの抗原性の変化を定
量したものである。 第６図はATPγＳ、単鎖DNAφ×174によるrecAタンパク
の抗原性の変化を定量したものである。
る。第１図Ａは、ARM321の検量線であり、第１図Ｂは、
ARM414の検量線であり、第１図Ｃは、ARM191の検量線で
あり、第１図Ｄは、ARM193の検量線である。 第２図は、一定量の抗体に対しrecAタンパク抗原の量を
変化させたときの490nmの吸光度である。第２図Ａは、
抗体にARM321を、第２図Ｂは、抗体にARM414を、第２図
Ｃは、抗体にARM191を用いたものである。 第３図は、recAタンパク抗原・抗体複合体の1,500倍希
釈に対する安定性を示すものである。第３図Ａは、抗体
にARM321を、第３図Ｂは、抗体にARM414を、第３図Ｃ
は、抗体にARM191を、第３図Ｄは、抗体にARM193を用い
たものである。 第４図は、recAタンパク抗原・抗体反応の1,500倍希釈
による停止処置の効果を示すものである。第４図Ａは、
抗体にARM321を、第４図Ｂは、抗体にARM414を、第４図
Ｃは、抗体にARM191を用いたものである。 第５図は、ATPによるrecAタンパクの抗原性の変化を定
量したものである。 第６図はATPγＳ、単鎖DNAφ×174によるrecAタンパク
の抗原性の変化を定量したものである。
Claims (6)
- 【請求項１】抗原抗体反応を定量する方法において、 既知量の抗体と抗原とを溶液中で反応させる工程、 上記溶液を希釈して、抗原抗体反応を停止させると
ともに、反応系の他の因子が測定に与える影響を最小限
に抑えるようにする工程、及び 抗原と未反応の抗体を固相抗体法で定量する工程を
含む定量方法。 - 【請求項２】抗原性を変える因子が存在する溶液中の抗
原抗体反応を定量する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】抗体がモノクローナル抗体である請求項１
記載の方法。 - 【請求項４】抗体がIgGである請求項２記載の方法。
- 【請求項５】抗原が高分子である請求項１記載の方法。
- 【請求項６】抗原がrecAタンパク若しくは変異タンパク
で、抗体が抗RecAモノクローナル抗体ARM321、抗RecAモ
ノクローナル抗体ARM414、及び抗RecAモノクローナル抗
体ARM191からなる群より選ばれ、希釈剤がPBS−ツイー
ンである請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11599190A JP2915486B2 (ja) | 1990-05-02 | 1990-05-02 | 間接固相抗体法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11599190A JP2915486B2 (ja) | 1990-05-02 | 1990-05-02 | 間接固相抗体法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0412274A JPH0412274A (ja) | 1992-01-16 |
| JP2915486B2 true JP2915486B2 (ja) | 1999-07-05 |
Family
ID=14676157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11599190A Expired - Fee Related JP2915486B2 (ja) | 1990-05-02 | 1990-05-02 | 間接固相抗体法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2915486B2 (ja) |
-
1990
- 1990-05-02 JP JP11599190A patent/JP2915486B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0412274A (ja) | 1992-01-16 |
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|---|---|---|---|
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