JP2930966B2 - ポリペプチドを抗原とするモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、レトロウィルスの遺伝子に対応するアミノ
酸配列におけるポリペプチドを抗原として作成したモノ
クローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞並びにそのモノクローナル抗体を使用し
た未知の病原性レトロウィルスの検出方法および病気の
検査・診断・治療薬に関するものである。さらに、レト
ロウィルスの遺伝子に対応するアミノ酸配列におけるポ
リペプチドを使用した病気の検査・診断・予防薬に関す
るものである。

本明細書において、アミノ酸、ペプチドその他に関し
略号で表示する場合、当該分野における慣用略号に基づ
くものであり、その例を第１表に挙げる。また、アミノ
酸などに関し光学異性体があり得る場合は特に表示しな
ければＬ体を示すものとする。

従来の技術 レトロウィルスとは遺伝情報物質として、DNAではな
くRNAを有し、動物細胞に感染するとゲノムRNA（遺伝情
報を担っているRNA）が、ウィルス粒子中の逆転写酵素
の働きで、両端に長い反復配列（LTR）をもつ二本鎖DNA
となって、細胞染色体に組み込まれること（組込み）を
特徴とするウィルスである。

1911年にピー・ラウス（P.Rous）が鶏に肉腫を起こす
ウィルスであるラウス肉腫ウィルスを発見して以来、種
々の動物から肉腫や白血病を起こすレトロウィルスが次
々と見出されるようになった。

ヒトにおいては、1980年、ギャロ（Gallo）らによりHTL
V-Iが発見・分離され、さらに1981年、日沼、吉田らに
よりHTLV-Iの感染が成人Ｔ細胞白血病（ATL）の発生に
密接な病因的役割を有することが明らかにされた。その
後、ゴールド（Golde）らがヘアリー・セル白血病（hai
ry cell Leukemia）からヒトのレトロウィルスを見つけ
出し“HTLV-II"と名付けた。さらに、1983年、モンタギ
ィー（Montagier）らにより、後天性免疫不全症候群（A
IDS）の原因ウィルスとしてHIVが発見された。

さらに、種々の動物の肉腫や白血病において原因とな
るレトロウィルスが発見されていることから、未知のレ
トロウィルスがヒトの他の肉腫や白血病の原因となって
いる可能性も考えられる。しかし、現在のところヒトの
病原性レトロウィルスの検出と確認が困難なため、原因
不明の難病、すなわちヒトDNAの変化をもたらす癌等の
病因は化学物質に起因すると考えられている。

一方、SLE全身性エリテマトーデス（Systemic Iupus
erythematosus:SLE）のモデル動物として知られるNZBお
よびNZB/WF₁マウスにおいては、Ｃ型レトロウィルスがS
LE様病態の発生に本質的な役割を果たしている。

これらレトロウィルス感染症の診断には、通常ウィル
スそのもの、またはその構成蛋白を用い、患者血清中の
ウィルス抗体の有無を検査する方法、あるいは逆にウィ
ルス抗体をマイクロテストプレートまたはビーズに固相
したものと患者血清とを反応させ、血清中のウィルスの
有無をみる方法等が採用されている。しかし、これらの
方法では、病因ウイルスの抗原性の多様性から偽陽性、
偽陰性の結果を与えることもあって、感染経路の特性や
患者個人および社会に与える影響の上で重大な問題とな
っている。

近年、ヒトにおいてもさまざまな自己免疫疾患の病因
としてレトロウィルスの関与が提唱されている。しか
し、従来、こうした疾患のウィルス学的な検索として
は、電子顕微鏡によるウィルス様粒子の確認や多種ウィ
ルスに対する血清抗体価の上昇、あるいは患者よりウィ
ルスを発生すると思われる培養細胞株を樹立し、それに
対して血清学的な反応、あるいは核酸のハイブリダイゼ
ーション実験を行っている。しかしながら、これらはい
ずれも非常に難しい、信頼性の低い方法であり、これら
の疾患の病因はいまだ解明されていないのが現状であ
る。

発明が解決しようとする課題 上記のように、レトロウィルスがその病気の発症に関
係する白血病・癌および自己免疫疾患等の難病を代表す
る各種疾患においては、治療の第一歩である発症の原因
およびその診断・検査の面に未解決の問題が残され、そ
の解決が社会的に強く望まれている。

課題を解決するための手段 本発明者らは、この問題を解決すべく鋭意研究を進め
ていたところ、レトロウィルス感染に関係する白血病・
癌、自己免疫疾患などの血清学的診断法において、従来
から常用されている個々の病原ウィルスの抗原を用いる
という発想から離れ、ヒトや霊長類等のレトロウィルス
に共通に保存されているエピトープに着目し、これをレ
トロウィルス間に共通に存在する抗原として用い、新し
いモノクローナル抗体を作製することに成功した。さら
に、その抗体を利用して、ヒトや霊長類等の種々のレト
ロウィルスを検出することに成功した。又、これらのモ
ノクローナル抗体を作製した時に用いた合成ペプチドが
抗レトロウィルス抗体と反応することを強く示唆する結
果が得られた。すなわち、本発明は、レトロウィルス
の遺伝子に対応するアミノ酸配列においてレトロウィル
ス間で相同性の部分を含むポリペプチドを抗原として作
成したモノクローナル抗体、上記記載のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、上記記載
のモノクローナル抗体を用いて未知の病原性レトロウィ
ルスと抗原抗体反応させることによる病原性レトロウィ
ルスの検出方法、上記記載のモノクローナル抗体か
らなるレトロウィルスの感染に起因する病気の検査・診
断・治療薬、およびレトロウィルスの遺伝子に対応す
るアミノ酸配列において、レトロウィルス間で相同性の
ある部分を含むポリペプチドからなるレトロウィルスの
感染に起因する病気の検査・診断・予防薬に関するもの
である。

レトロウィルスが動物細胞に感染すると細胞質内でウ
ィルス粒子が持ち込んだ逆転写酵素によってウィルスRN
AからDNAのコピーが合成される。細胞質内ではレトロウ
ィルスの直鎖状DNAが、核内では直鎖状および環状DNAが
検出される。この環状レトロウィルスDNAが、細胞DNAに
組み込まれる直接的前駆体（プロウィルス）だと考えら
れている。染色体に組み込まれたプロウィルスは、５′
‐LTR-gag-pol-env-LTR-3′という順序に並ぶ遺伝子領
域を持つ。ここでLTRは蛋白質をコードしないが、ウィ
ルス遺伝子の転写調節配列（エンハンサーやプロモータ
ー）があり、染色体への組み込み部位でもある。gagは
いくつかの蛋白質にプロセシングされ、ウィルス粒子内
の構造物となるが、ウィルス合成過程での役割に関して
は不明確な点が多い。polは３つのドメインに分けら
れ、プロテアーゼ・逆転写酵素・エンドヌクレアーゼを
コードする。envはウィルス粒子の外側の糖蛋白質と膜
を貫通している領域をコードしている。これに加えて、
動物に癌をおこすレトロウィルス（癌ウィルス）の多く
が、そのゲノム内に癌遺伝子（v-onc）を持っている。H
TLV-1、ウシ白血病ウィルス（BLV）やHIVなどは、v-onc
は持っていないが、ウィルス自身の遺伝子や細胞の遺伝
子の発現を調節する蛋白質をコードする遺伝子を持つこ
とはよく知られている。

これらの遺伝子の中で、pol、gagは比較的変異しにく
い。一方、env蛋白質のうちで、エンベロープ糖蛋白質
は変異をおこしやすいが、膜を貫通しているトランスメ
ンブランエンベロープ蛋白質（Transmembrane envelop
protein）をコードしている遺伝子は比較的変異しにく
く、レトロウィルス間でアミノ酸の相同性が非常によく
保たれている部分があることが知られている。以前よ
り、癌ウィルスを動物に感染させた場合、レトロウィル
スの感染にともない、しばしば動物に腫瘍が生じる前に
免疫不全状態が起こることも知られている。1985年、シ
アンシオロ（Cianciolo）らは、このトランスメンブラ
ンエンベロープ蛋白質のうち、レトロウィルス間でアミ
ノ酸の相同性が非常によく保たれている部分のペプチド
が、リンパ球の増殖を抑制することを示し、この部分が
動物の免疫不全症に関連していることを示唆した。これ
らの点に着目して、本発明者らは、レトロウィルス構成
蛋白質の中で、変異が起こりにくく、その機能がレトロ
ウィルスに特徴的である逆転写酵素（RT）およびトラン
スメンブランエンベロープ蛋白質（TM）のアミノ酸配列
のレトロウィルス間での比較を行った。

レトロウィルス間のアミノ酸配列の比較 本発明者らは、すでに解明したBaEV（ヒヒ内在性レト
ロウィルスM7株）の全塩基配列〔ジャパニーズ ジャー
ナル オブ ジェネティクス（Jpn.J.Genet.）62巻,127
〜137頁（1987年）〕から逆転写酵素およびトランスメ
ンブランエンベロープ蛋白質のアミノ酸配列を推定し、
他のレトロウィルスの配列との相同性、二次構造および
疎水性・親水性の程度をSDS-GENETYXプログラム（ソフ
トウェア開発（株）製・東京）により解析した。

その結果、逆転写酵素（RT）領域において２箇所（S0
1,S02）、トランスメンブランエンベロープ蛋白（TM）
領域において１箇所（S03）を選び出し相当する部分の
アミノ酸配列について、他のウィルスとの比較を行い、
その結果を第１−１図、第１−２図、第１−３図に示
す。なお、比較を行ったレトロウィルスとしては、現在
までに解明されている遺伝子配列を有する次のレトロウ
ィルスを用いた。すなわち、ヒヒ内在性レトロウィルス
M7株（BaEV）、モロニーげっ歯類白血病ウィルス（MML
V）、AKRげっ歯類白血病ウィルス（AKV）、ヒト内在性
レトロウィルス（CL41）、ヒトＴ細胞白血病ウィルスタ
イプ１（HTLV-I）、ラウス肉腫ウィルス（RSV）、牛白
血病ウィルス（BLV）、メイソン・ファイザー猿ウィル
ス（MPMV）、類人猿後天性免疫不全症候群レトロウィル
ス（SRV-1）、ヒト内在性レトロウィルス（HERV）、ヒ
ト免疫不全症ウィルス（HIV）、襄内Ａ型粒子（IAP）、
モロニーげっ歯類腫瘍ウィルス（MMTV）、網状内皮腫症
ウィルスＡ株（REV-A）、鳥類白血病ウィルス（FEL
V）、ヒト泡沫レトロウィルス（HSRV）などを用いた。
図中、＊印がBaEVに対して同一のアミノ酸を示す。

その結果、S01およびS02のアミノ酸配列は、第１−１
図および第１−２図に示すようにレトロウィルス間で非
常に相同性に富み、βシートとα−ヘリックスにはさま
れたターン構造をとり親水性に富んでいるように推定さ
れた。また、第１−３図に示すようにS03のアミノ酸配
列もレトロウィルス間で非常に相同性に富み、α−ヘリ
ックス構造を取り親水性に富んでいるように推定され
た。

そこで、本発明者等はこれらレトロウィルス間での相
同性を有する３箇所のポリペプチドを合成し、このもの
を抗原として得たモノクローナル抗体の各種レトロウィ
ルスに対する抗原抗体反応性を観察した。

ポリペプチドとしては、各種レトロウィルスの遺伝子
に対応するアミノ酸配列において相同性のある部分を有
するものが挙げられ、S01についてはSPWNTP（第１−１
図）,S02についてはLPQGFKNSPTLF（第１−２図）または
S03についてはQNRRGLDLL（第１−３図）を含むポリペプ
チドがその例として挙げられる。ポリペプチドが抗原と
して機能するには約20〜30個のアミノ酸配列を有するこ
とが好ましく、上記のアミノ酸配列の前及び／または後
にアミノ酸を付加したものが好ましく用いられる。

具体例としては例えばヒヒ内在性レトロウィルスのペ
プチドが挙げられ、S01に相当するものとして第１−１
図に示すヒヒ内在性レトロウィルス（BaEV）のpolのア
ミノ酸の位置200から221までのペプチドであるLELGVLRP
CRSPWNTPLLPVKKが、S02に相当するものとして第１−２
図に示すヒヒ内在性レトロウィルスのpolのアミノ酸の
位置300から319までのペプチドであるQLTWTRLPQGFKNSPT
LFDEが、またS03に相当するものとして第１−３図に示
すヒヒ内在性レトロウィルスのenvのアミノ酸の位置434
から456までのペプチドであるSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGI
が挙げられる。

なお、上記ポリペプチドを抗原として免疫を行うに際
し、該ポリペプチドの５′または３′末端にＣ（システ
イン）を付加してKLH（キーホール リンペット ヘモ
シアニン）と結合させて抗原能力を高めることがよく行
なわれるが、この時、５′または３′末端に付加したＣ
とKLH以外の反応が生ずることを避けるために上記ポリ
ペプチドにおいてＣが存在する場合は、このＣをＳに代
えて用いることが好ましい。

ペプチドの化学合成方法は固相法により行い、逆相高
速液体クロマトグラフィー（HPLC）により精製した。

上記により合成したポリペプチドはHPLCとアミノ酸ア
ナライザーにより目的物と確認した。

次に、これらの確認したアミノ酸配列をもつ合成ペプ
チドを抗原として動物の免疫を行い、モノクローナル抗
体を作製した。抗原としては、上記のようにKLHやBSA
（bovine serum albumin）等の高分子の蛋白を結合させ
たものを用いることが好ましい。

ここで免疫する動物を選ぶ場合に、その動物種および
抗原に対する免疫応答能力が重要になる。一般に、でき
るだけマウスかラットを免疫することが望ましい。なぜ
なら、安定な抗体産生ハイブリドーマを形成するミエロ
ーマ細胞株の多くがマウスまたはラット由来だからであ
る。特にバルブＣ（BALB/C）マウスを使用する例が多
い。

モノクローナル抗体は一般的な方法で作製でき、例え
ば抗原を適当なアジュバント、例えばフロイントアジュ
バントとともに動物に頻回投与することによって抗原に
対する抗体を産生する細胞を得ることができる。また、
一般にF₁マウスの方が親マウスに比較し抗体産生能が高
いので、それを使用するのが好ましい。抗原をフロイン
ト完全アジュバントに懸濁しマウスに腹腔内注射し、第
一回目の免疫を行い、次いで２週間経過後に再び当該抗
原をフロイント不完全アジュバントとともに前記動物に
腹腔内注射することによって、第２回目の免疫を行う。
追加免疫した後、２週間経過後に当該抗原の生理食塩水
溶液を腹腔内注射することにより目的が達成される。

次に、免疫動物からの抗体産生細胞の材料として脾臓
中のリンパ細胞が用いられることが多いが、リンパ節中
のリンパ細胞を用いることもできる。例えば、抗原投与
後、前記F₁雄マウスのうち最も抗体価の高いマウスの脾
臓を摘出し、ハンクス液中で、脾細胞懸濁液を調製し、
RPMI-1640培養液で脾細胞を洗浄後、細胞ペレットをRPM
I-1640培養液で再懸濁して調製すればよい。

また、細胞融合用に使用する骨髄腫細胞系はバルブＣ
マウスを起源とするH,L鎖非産生ミエローマ細胞であるS
P2/0.Ag14（SP-2）等を用いることができる。

細胞融合に使用する融合剤は一般に平均分子量が約1,
000〜6,000であるポリエチレングリコール（PEG）が従
来から使用されており、また、その濃度は30％から50％
（重量／重量）の範囲で使用されることが多い。このポ
リエチレングリコールは、細胞膜の脂質二重構造を部分
的に破壊して細胞膜の流動性を高め、遠心により互いに
接近させた細胞間の膜融合を起こさせると考えられてい
る。本発明者らは、アンプルの中に4mlの75mMヘペス（p
H調節剤）中に2gの分子量1,500PEGを含むベーリンガー
マンハイム社のPEG1,500を使用した。

融合条件としては、一般には多様な方法が用いられて
いるが、大別すれば２つの方法に分類することができ
る。すなわち、第１の方法はガルフレらの方法に準じた
もので、遠心によりペレットにした脾細胞とミエローマ
細胞にPEG溶液を加え、攪拌および振とうするだけで細
胞を融合させる方法である。通常50％PEG溶液が用いら
れ、それを１分間かけて約1ml添加した後、１分間溶液
と細胞を混和し、その後無血清培地を徐々に添加してPE
Gを希釈する。この方法を実際採用している者は比較的
多いため、本発明者の方法もこれに準じた。

第２の方法はゲフターらの方法に準じたもので、遠心
によりペレットにした脾細胞とミエローマをPEG溶液と
混和し、低速遠心して重力下で細胞を融合させる方法で
ある。

ここで、融合時の温度に関しては厳密に37℃に保つこ
とが必要であるとの報告があるが、あらかじめ、37℃に
温めておいたPEG溶液を室温で添加する程度の配慮でよ
いとの報告もあるので、本発明者はこれを使用した。ま
た、脾細胞とミエローマ細胞を融合させる細胞数の割合
については、通常１〜２×10⁸個の脾細胞を使用し、細
胞数の比率が1:1〜10:1になるように脾細胞をミエロー
マと混合することにより行われる。次に、PEGで融合し
た細胞懸濁液を遠心し、ペレットを選択培地で浮遊し、
フラットボトムマイクロテスト（III）プレート（ファ
ルコン製）に分注した。この場合、融合した細胞は37℃
５％CO₂湿気の下で約10日間インキュベーターで培養す
る。脾細胞としては約５×10⁵個／ウエルで用いた。

ここで選択培地としては、以下の培地を使用した。GI
T培地（日本製薬製）、２−メルカプトエタノール（2-M
E）:5×10^-5Ｍ、Ｌ−グルタミン:2mM、ペニシリン:100U
/ml、ストレプトマイシン:100μg/ml、インシュリン：1
0^-3U/mlおよびジハイドロキシエチルグリシン（DHEG）:
1.8mg/mlにHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよ
びチミジン）50倍濃縮液（フロー社）を1/50容量添加し
て調製した。

上記混合培養に使用される培地としては、通常の細胞
培養に用いられる各種の栄養培地を、いずれも使用する
ことができる。例えばRPMI-1640培地、イーグル最低必
須培地（MEM培地）等をウシ胎仔血清（FCS）仔ウシ血清
等の血清補液を用いて改質し、これにペニシリン、スト
レプトマイシン等を加えた培地等を例示することもでき
る。

次に、十分なハイブリドーマの増殖がみられたら、適
当な時期に種々の測定法により、目的とする抗体を産生
しているハイブリドーマをスクリーニングする。測定法
としては間接蛍光抗体法、放射免疫測定法、酵素免疫測
定法などの手段を採用することができる。この中で、本
発明では一般によく行われている酵素免疫測定法（EI
A）を用いた。EIAの中でもイムノソルベントを用いる場
合には、ELISA（エライザ）と呼ばれる。具体的には、
免疫に使用した各ポリペプチドをEIAプレートに吸着さ
せ、洗浄後、ウシ血清アルブミンでコートし、再び洗浄
後、ハイブリドーマ培養液と室温で２時間反応させる。
洗浄後、酵素標識二次抗体としてホースラディッシュパ
ーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスIgG（カペル社製）
を反応させる。洗浄後、基質として2,2′−アジノービ
ス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
（ABTS）を過酸化水素存在下に加えると、ホースラディ
ッシュパーオキシダーゼの働きにより、基質が分離され
発色する。この発色の程度により、ハイブリドーマ培養
液中の抗体価を測定する。

標識酵素として、現在ではもっぱらアルカリ性ホスフ
ァターゼ（AP）やホースラディッシュパーオキシダーゼ
（HRP）が使われており、標識抗体としては、標識動物
種特異イムノグロブリン抗体が市販されて容易に入手す
ることができる。HRPの基質としては、過酸化水素とこ
れにより酸化される物質を用い、ABTSの他に、ｏ−フェ
ニレンジアミン等が感度が高く、よく用いられる。

本発明者らは2,2′−アジノ−ビス（３−エチルベン
ゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩：
〔ABTS−(NH₄)₂〕と過酸化水素水を基質液に用いて発色
を行い450mμで比色定量を行った。

次に、抗体産生融合細胞を適当な方法で分別・培養
し、単一細胞に由来する単一クローン細胞株を作製す
る。この操作をクローニングと呼び、その方法としては
限界希釈法、ソフトアガー法、フィブリンゲル法、カッ
プ法などが挙げられるが、限界希釈法が好ましい。例え
ば、抗体陽性ウエルについては、マウスの胸腺細胞（約
１×10⁶個／ウエル）をフィーダー細胞として限界希釈
法によりクローニングを行った。次に、各ウエルの培養
上清を再度スクリーニングして陽性クローンを選別し
た。また、この細胞株を無血清培地に培養することによ
って得られた培養上清中のモノクローナル抗体を硫安法
で沈殿し、リン酸緩衝液で透析し、抗体量についてはバ
イオラッド社プロテインアッセイキットにより定量し
た。

このようにして、合成ペプチドに対する特異抗体スク
リーニング法により、S01、S02、S03の各々のアミノ酸
配列に対する抗体を産生するハイブリドーマを得ること
ができる。

次いで、これらのハイブリドーマから得られる抗体と
レトロウィルス（抗原）に対する反応性をみるイムノブ
ロッティングを行った。

ここで具体的な種々の抗原（レトロウィルス）として
は、A204細胞およびBaEV産生A204細胞株はじめ種々のレ
トロウィルス産生細胞株、例えばHTLV-1産生MT-2細胞
株、MPMV産生ヒト肺アデノカルチノーマ細胞株、SRV-1
産生ラジ細胞株、MMLV産生D3hlg細胞株、AKV産生AKR/J
マウスＴリンパ腫細胞株、RSV産生鳥繊維芽細胞などの
培養液を遠心した沈渣に緩衝液を加えたもの、又はこれ
らをサッカロースを用いた平衡密度勾配遠心により部分
精製したものに、SDSおよびメルカプトエタノールを加
え熱湯中にて加熱したものを用いた。

上記種々の抗原をレムリ（Laemmli）により報告され
た方法〔ネイチャー（Nature）,227巻,680〜685（197
0）〕に準じて、SDSポリアクリルアミドゲルにおける電
気泳動を行なった。次に、SDSポリアクリルアミドゲル
で分離した抗原をゲル面からニトロセルロースに転写
し、その膜上で抗原抗体反応を行い、抗原を同定する方
法がウェスタンブロッティング法である。標識二次抗体
として、抗マウスイムノグロブリンなどに酵素や放射性
同位元素を標識した物を用いて行うが、ここでは¹²⁵Iで
ラベルしたヒツジ抗マウスIgG等が用いられる。

まず、各抗ペプチド抗体のBaEVに対する反応性をイム
ノブロッティングによりアッセイし、その結果を第２図
および第３図に示した。

具体的にはBaEV産生A204細胞株（A204BE）および非産
生A204細胞株（Cont）の培養上清を用いた場合、逆転写
酵素の一部ペプチドであるS01およびS02のアミノ酸配列
に対する抗体（各々2A,2C,1D,1Fおよび11G,3E）はBaEV
産生細胞株に特異的に約70,000（ダルトン、以下同じ）
と約40,000に２本のバンドを検出した。約70,000のバン
ドは、BaEVの逆転写酵素の分子量と一致する。また、約
40,000のバンドはアミノ酸配列を決定しないと明確にさ
れないが、BaEV産生細胞株の培養上清のみに認められる
点から、BaEVの逆転写酵素の分解物等、該酵素に関連す
る蛋白質であることが予想される。

一方、第３図に示すように、トランスメンブランエン
ベロープ蛋白の一部ペプチドであるS03のアミノ酸配列
に対する抗体（9G,1C,7A,4G,7H,1G）はBaEV特異的に約2
0,000のバンドを検出した。これはBaEVのエンベロープ
蛋白質のうちのトランスメンブラン部分に関連した蛋白
質P20Eの分子量と一致する。

以上のことより、これらの抗体は基になったペプチド
を含む蛋白に実際に反応する抗体であることが判った。

さらに、続いて種々のレトロウィルスに対する反応性
をイムノブロッティングによりアッセイした結果を第４
〜第６図に示す。具体的には各領域のアミノ酸配列に反
応する抗体（第２〜第３図）から１つずつ選び（S01-1F
抗体、S02-11G抗体またはS03-A7抗体）種々のレトロウ
ィルス産生細胞株の培養上清を用いたイムノブロッティ
ングにより行った。

その結果、第４図に示すようにS01-1F抗体（S01のア
ミノ酸配列に反応する抗体）を用いた時、BaEVとアミノ
酸配列の相同性が高いMMLV産生細胞株の培養上清に対し
ては、約70,000と約40,000の逆転写酵素関連蛋白と思わ
れるバンドを検出し、同じく相同性の高いAKV産生細胞
株の培養上清に対しては、約70,000の逆転写酵素関連蛋
白と思われるバンドを検出した。

さらに、相関範囲が狭いSRV-1産生細胞株およびMPMV
産生細胞株の培養上清に対しても約90,000と約40,000の
弱いながら逆転写酵素関連蛋白質と思われるバンドを検
出した。

それ以外のウィルスに対しては特異的なバンドは得ら
れなかった。

したがって、この抗体はアミノ酸配列のうちSPWNTPに
認識部位があることが見出された。

また、ヒト内在性レトロウィルス（CL41）もS01領域
で、S01に対する抗体が反応するであろうと思われるア
ミノ酸配列SPWNTPを保存しているので、このレトロウィ
ルスが、かりに病原性があるとしても検出の可能性があ
る。

次に、第５図に示すようにS02-11G抗体はBaEVとアミ
ノ酸配列が全く同じであるMMLV産生細胞株の培養上清に
対して約70,000と約40,000の逆転写酵素関連蛋白質と思
われるバンドを検出し、同じくアミノ酸配列が全く同じ
であるAKV産生細胞株の培養上清に対しては約70,000の
逆転写酵素関連蛋白質と思われるバンドを検出した。さ
らに、S01の時の結果とは違い、S02においてはBaEVとア
ミノ酸配列がかなりの範囲で相同なHTLV-1産生MT-2細胞
株の培養上清に対して約60,000と約40,000の逆転写酵素
関連蛋白質と思われるバンドを検出した。したがって、
この抗体はアミノ酸配列のうちLPQGFKNSPTLFに認識部位
があることが見出だされた。

次に、第６図に示すようにS03-A7抗体はそのアミノ酸
配列が全く同じMPMV産生細胞株およびSRV-1産生細胞株
の培養上清より約20,000のトランスメンブラン蛋白（T
M）P20Eに相当する位置にバンドを検出した。さらに、
かなりの範囲で相同なMMLV産生細胞株およびAKV産生細
胞株の培養上清に対しては15,000と12,000付近にトラン
スメンブラン蛋白（TM）P15E,P12Eに相当する位置にバ
ンドを認めた。

さらに、このペプチド部分の内、エピトープとなる可
能性の高い９残基が共通しているHTLV-1産生細胞株培養
上清でも約20,000のトランスメンブラン蛋白P20Eに相当
する位置にバンドが認められた。

以上のことからレトロウィルスの遺伝子に対応するア
ミノ酸配列において、抗S01抗体はSPWNTP、抗S02抗体は
LPQGFKNSPTLF、抗S03抗体はQNRRGLDLLに認識部位がある
ことが見出された。また、これらの抗体を用いる事によ
り、現在発見されているレトロウィルスのうち広い範囲
のレトロウィルスを検出できることが判明した。従っ
て、これらのモノクローナル抗体を使用して抗原抗体反
応させることにより未知の病原性レトロウィルスの検出
方法を得ることができるものと考えられる。

さらに、後出の第２表に示されるように、これらのモ
ノクローナル抗体を作製した時に用いた合成ペプチド
が、ヤギ血清よりも、ヤギ抗BaEV抗血清と強く反応した
ことから、これらの合成ペプチドが抗レトロウィルス抗
体に対して特異的な反応性を有する事が強く示唆され
た。以上の結果から、当ペプチドは、レトロウィルス感
染患者の血清中にある抗レトロウィルス抗体を検出でき
る可能性があり、レトロウィルスに起因して発症する白
血病、癌および自己免疫疾患等の難病を代表する各種疾
病に対する病気の検査・診断薬に利用することができる
ものと考えられる。また、これらの合成ペプチドを用い
てワクチンとして使用する予防薬に利用することも可能
である。

本発明で実施する新しい検査法はレトロウィルスの最
も特異的で基本的な共通抗原を検出するものでレトロウ
ィルス感染症に対して確定的な診断を得るための検査法
の１つとして使用することもでき、これら疾患にまつわ
る患者の個人的、社会的問題解決のために有用である。
これまで臨床的にはレトロウィルス感染症の診断される
にもかかわらず、これまでの血清学的検査によって陰性
であった患者のうち、本検査で陽性であれば抗原特異性
の異なる新しいレトロウィルス株による感染が検出され
ることになる。さらに、本検査法ではヒトレトロウィル
スに共通に反応する抗原および抗体を利用しているの
で、こうした病因の明確でない疾病についてレトロウィ
ルスが関連していることを検索するための検査法として
用いることができる。いわゆる「難病」のうち本検査法
によってレトロウィルスの感染が示唆されたものについ
てはウィルスの分離など病因の追及が可能となり、これ
らの疾患では医療上の診断・治療・予防に利用すること
ができるものである。また、これらの抗体を、レトロウ
ィルスの中和抗体として用いたりトキシンと結合させて
ミサイル療法に用いるなど治療にも用いる可能性があ
る。

したがって、本発明は社会への貢献性と産業上の利用
性に富むものである。次に、本発明を実施例にて、さら
に詳細に説明するが、これによって本発明が限定される
ものではない。

なお、この３種の抗体を産生する３種のハイブリドー
マ細胞は、各々SP-2 S01-1F,SP-2 S02-11GおよびSP-2 S
03-A7の標示のもと、通商産業省工業技術院微生物工業
研究所（FRI）に各々受託番号微工研菌寄第10538号、10
539号、10540号として、平成１年２月15日から寄託、保
管されている。

実施例１ ポリペプチド合成 次のアミノ酸配列を有するポリペプチドを固相法で合
成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により
精製した。

S01:LELGVLRPSRSPWNTPLLPVKK S02:QLTWTRLPQGFKNSPTLFDE S03:SLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGI 該合成ポリペプチドはHPLCとアミノ酸アナライザーに
より確認した。免疫原として使用する際にはポリペプチ
ドの５′末端にシステイン残基を付与し、キーホール
リンペット ヘモシアニン（KLH）と結合した。なおS01
については５′末端より９番目のＣをKLHとの反応を防
ぐためにＳとしている。

実施例２ ハイブリドーマの作製 フロイント完全アジュバント（Freund complete adju
vant＝FCA）と混合した各ポリペプチド（KLHと結合した
もの）20μｇを６〜７週令のC₃CF₁マウス（C3H×Balb/
C）F₁雄マウスの腹腔内に注射した。次に２週後にフロ
イント不完全アジュバント（Freund incomplete adjuva
nt＝FIA）と混合したポリペプチド（KLHと結合したも
の）で追加免疫を行なった。

その結果２回の免疫後S01のアミノ酸配列に最もよく
反応したマウスの血清はELISA法で相当する合成ペプチ
ドに6,400倍希釈まで反応し、S02のアミノ酸配列には、
最もよく反応したマウスの血清は1,600倍希釈まで、ま
たS03のアミノ酸配列に最もよく反応したマウスの血清
は102,400倍希釈まで反応した。

追加免疫後、２週目にポリペプチド（KLH結合）20μ
ｇの生理食塩水溶液を腹腔内に投与し（最終免疫）、３
回目に脾細胞を得た。次いで約２×10⁸個の脾細胞にSP-
2ミエローマ細胞約４×10⁷個を加え遠心後PEG1,500（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）1mlを徐々に滴下して細
胞融合を行った。

PEG1,500をRPM1640培地で希釈、遠心後、選択培地に
浮遊しフラットボトムマイクムテスト（III）プレーチ
（ファルコン製）に分注した（脾細胞：約５×10⁵／ウ
エル）。この後、融合した細胞は37℃、５％CO₂湿気の
下で約10日間培養を行った。

なお、選択培地はGIT培地（日本製薬（株）製）＋２
−メルカプトエタノール（2-ME）:5×10^-5Ｍ＋Ｌ−グル
タミン:2mM＋ペニシリン:100U/ml＋ストレプトマイシ
ン:100μg/ml＋インシュリン：10^-3U/ml＋ジハイドロキ
シエチルグリシン（DHEG）:1.8mg/mlにHAT（ヒポキサン
チン・アミノプテリン・チミジン）50倍濃縮液（フロー
社製）を1/50容量添加して調製した。その結果、すべて
のウエルにハイブリドーマの形成が認められた。また培
養上清を用いた合成ペプチドに対する反応性をELISA法
により検討したところ、多数の陽性ウエルが得られた。

実施例３ ELISA法による特異抗体スクリーニング 合成ペプチドに対する特異抗体スクリーニングはELIS
A法により行った。

すなわち、Pro-Bind−アッセイ−プレート（ファルコ
ン製）に免疫に使用した各ポリペプチド1nMを含む0.1M
炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH9.6）を50μl/ウエル加
え、37℃で一晩コートした。各ウエルを0.1％（V/V）ツ
ウィーン20〔Tween20（界面活性剤の商品名）〕を含むT
BS緩衝液〔50mM Tris-HCl（pH8.2）,144mM NaCl〕（TBS
−ツウィーン）で４回、TBS緩衝液で１回洗浄後、１％
（W/V）牛血清アルブミンを含むTBS（TBS-BSA）を加
え、室温で60分静置した後、同様に洗浄した。ハイブリ
ドーマ培養上清50μｌを各ウエルに加え室温で120分間
静置後同様に洗浄した。

次に酵素標識２次抗体としてホースラディッシュパー
オキシダーゼ標識ウサギ抗マウスIgG（カペル社製）をT
BS-BSAで800倍希釈したものを50μg/ウエル加え、室温
で60分静置した。洗浄後基質として１μl/mlの30％H₂O₂
を含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH5）に1mMの濃度で溶解し
た〔2,2′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩:ABTS−(N
H₄)₂〕（和光純薬社製）100μl/ウエル加えた。室温で3
0分静置した後、405mMの励起光で酵素活性を測定した。
その結果、S01のアミノ酸配列に対しては10個、S02のア
ミノ酸配列に対しては３個、S03のアミノ酸配列に対し
ては19個の、特異的な抗体を安定して産生するハイブリ
ドーマを得た。

実施例４ クローニング 抗体陽性ウエルについては、マウスの胸腺細胞（約１
×10⁶個／ウエル）をフィーダー細胞として限界希釈法
によりクローニングを行った。次に各ウエルの培養上清
を再度スクリーニングして陽性クローンを選別した。

実施例５ モノクローナル抗体の精製 特異抗体産生ハイブリドーマ細胞クローンはアルブミ
ン不含完全無血清培地〔コスメディウム−001（商品
名）〕で増殖させた後、培養上清を0.22μｍのフィルタ
ー（ゲルマン社製）でろ過した。ろ過液を50％硫酸アン
モニウムで２度塩析後、リン酸緩衝液に溶解し透析を行
った。透析中に生じた不溶物を遠心で除いた後、透析液
を分注し−20℃に凍結保存した。透析液の抗体量はBIO-
RADプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラト
リー社製）により定量した。

実施例６ イムノブロッティング A204細胞及びBaEV産生A204細胞株をはじめ、種々のレ
トロウィルス産生細胞株としてHTLV-1産生MT-2細胞、SR
V-1産生ラジ細胞株、MPMV産生ヒト肺アデノカルチノー
マ細胞株、MMLV産生D3hlg細胞株、AKV産生AKR/Jマウス
Ｔリンパ腫細胞株、又はRSV産生鳥繊維芽細胞（fibrobl
ast）を培養し、定常期約10⁶cells/mlに達した時に培養
液を交換し、更に24時間培養後の培養上清を室温で1,00
0rpm5分間遠心し、その上清を0.22μｍフィルターによ
りろ過した。ろ液40mlを日立−SRP28SAローター〔日立
工機（株）製〕を用いて４℃で26,000rpm2時間遠心し得
られた沈渣にTNE緩衝液〔10mMTris-HCl（pH7.6）,100mM
NaCl,1mM EDTA〕を加えたもの、又はこれらをサッカロ
ースを用いた平衡密度勾配遠心により部分精製したもの
400μｌに３倍のSDSサンプルバッファー〔（30％グリセ
ロール、15％メルカプトエタノール、７％SDS、0.19M T
ris-HCl（pH6.8）,BPB（ブロモフェノール ブルー）0.
006％〕200μｌを加え、熱湯水中で５分間加熱した。上
記検体60μｌをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供した。ここでSDS−ポリアクリルアミドゲルに於け
る電気泳動は1970年レムリ（Laemmli）により報告され
た方法〔ネーチャー（Nature）、227巻、680〜685（197
0）〕に準じ5.7％濃縮用ゲルを持つ13.5％〜14.5％分離
用ゲル中で20mAの定電流の下で行った。また分子量を決
定するためバイオラッド社製の分子量マーカー（LOW）
を用いた。次に電流泳動後ゲルをブロッティング液〔25
mM Tris-HCl（pH8.3）,192mMグリシン、20％メタノー
ル、0.01％SDS〕に浸した後ブロッティング装置（日本
エイドー社製）を用いて、100mA,ON、４℃でゲル内のた
ん白をニトロセルロース膜に転写した。ブロッティング
したニトロセルロース膜はTBS〔50mM Tris-HCl（pH8.
2）,144mM NaCl〕で２回洗浄後、４％スキンミルクを含
むTBSで室温にて２時間ブロッティングした。ブロッテ
ィングした後、ニトロセルロース膜を0.1％ツウィーン
−20含有TBS（TBS−ツウィーン）で３回洗浄し、それぞ
れの合成ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗
体を５μg/mlの濃度で含む10％FBS含有TBS−ツウィーン
（TBS−ツウィーン−FBS）で２時間室温で反応させた。
反応後、ニトロセルロース膜をTBS−ツウィーンで４回
洗浄し標識２次抗体として¹²⁵I−ヒツジ抗マウスIgG（1
4.8μCi/μｇ）（ICN）0.4μCi/mlを含むTBS−ツウィー
ン−FBSで室温２時間反応させた。その後ニトロセルロ
ース膜はTBS−ツウィーンで４回、TBSで２回洗浄し、乾
燥後、−60℃で増感紙（コダック増感紙）を用い、RXO-
H X線フィルム（フジフィルム社製）に感光させた。

実施例７ モノクローナル抗体のサブ−イソタイプの決
定 モノクローナル抗体のサブ−イソタイプの決定はクロ
ーニング後のハイブリドーマの培養上清のアメリカンク
オレックス社のマウス モノクローナル サブ−イソタ
イプキットを用いたELISA法により行った。その結果を
次の表に示す。

実施例８ BaEVに対するイムノブロッティングアッセイ 抗ペプチド抗体のBaEVに対する反応性をSDS−ポリア
クリルアミドゲルで分離したBaEV産生又は非産生A204細
胞株の培養上清のイムノブロッティングにより検討し
た。

BaEV産生又は非産生A204細胞株の培養上清を超遠心に
より濃縮し、14.5％SDS−ポリアクリルアミドゲルで分
離しニトロセルロースフィルターにエレクトロブロット
した。ブロットは縦方向に切断し、異なった抗体でアッ
セイした。

第２図に見られるように、S01およびS02のアミノ酸配
列に対する抗体はそれぞれ10個中４個、３個中２個がBa
EV産生細胞株の培養上清を用いた場合のみBaEVの逆転写
酵素関連たん白と思われる約70,000と40,000の特異的な
バンドを検出した。一方、S03のアミノ酸配列に対する
抗体は19個中６個がBaEV産生細胞株の培養上清を用いた
場合のみ約20,000の特異的なバンドを検出した。これは
BaEVのエンベロープたん白のうちトランスメンブラン部
分（P20E）に関連したたん白と思われた（第３図）。

実施例９ 種々のレトロウィルスに対するイムノブロッ
ティングアッセイ 各領域のアミノ酸配列に反応する抗体から強い反応性
を示しているものを１つずつ選び（S01-1F抗体、S02-11
G抗体、またはS03-7A抗体）、これらの抗体の種々のレ
トロウィルスに対する反応性をSDS−ポリアクリルアミ
ドゲルで分離した種々のウィルス産生細胞株の培養上清
をサッカロースを用いた平衡密度勾配遠心により部分精
製したもののイムノブロッティングにより検討した。

その結果、S01-1F抗体はMMLV産生細胞株の培養上清に
約70,000と約40,000のバンドを検出し、またAKV産生細
胞株の培養上清に対して約70,000のバンドを検出した。
SRV-1産生細胞株およびMPMV産生細胞株の培養上清に対
しては約90,000と40,000のバンドを検出した（第４
図）。

次にS02-11G抗体においてはMMLV産生細胞株の培養上
清に対しては約70,000と約40,000のバンドを検出し、ま
たAKV産生細胞株の培養上清に対して約70,000のバンド
を検出した。HTLV-1産生細胞株の培養上清では約60,000
と約40,000のバンドを検出した（第５図）。

さらにS03-7A抗体においては、SRV-1産生細胞株およ
びMPMV産生細胞株の培養上清においては約20,000のバン
ドを、MMLV産生細胞株およびAKV産生細胞株の培養上清
に対しては15,000と12,000付近に２つのバンドを、HTLV
-1産生細胞株培養上清に対しては20,000のバンドを認め
た（第６図）。

実施例10 合成ペプチドとヤギ抗BaEV抗血清との反応性 特異抗体スクリーニングの項で述べた実施例３の方法
に準じ、Pro-Bind−アッセイ−プレートにS01,S02また
はS03の合成ペプチドを吸着させ、TBS−ツウィーン−FB
Sで400倍希釈したヤギ抗BaEV抗血清との反応性をELISA
法により検討した。その結果、対照とした同倍率希釈の
ヤギ血清と比較して405nMの励起光で明らかに高い吸光
度を示し、これらのペプチドのすべてがヤギ抗BaEV抗血
清と反応する事が認められた。次にその結果を示す。

【図面の簡単な説明】

第１−１図および第１−２図は各種レトロウィルスの逆
転写酵素領域におけるアミノ酸配列（S01およびS02）を
示す。 第１−３図は各種レトロウィルスのトランスメンブラン
・エンベロープたん白ペプチドにおけるアミノ酸配列
（S03）を示す。 第２図および第３図は、本発明の抗ペプチド抗体のBaEV
に対する反応性をイムノブロッティングによりアッセイ
した図であり、第２図がS01およびS02に対する抗体に関
するものであり、第３図がS03に対する抗体に関するも
のである。 第４図、第５図および第６図は各々S01抗体、S02抗体ま
たはS03抗体と各種レトロウィルスに対する反応性をみ
たイムノブロッティング図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ０７Ｋ 14/15 // Ｃ０７Ｋ 14/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 前置審査 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，1985，Ｖｏｌ. 126，Ｎｏ．２，Ｐ．672−677 Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，1984, Ｖｏｌ．49，Ｐ．471−478 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1983，Ｖｏｌ．80，Ｐ. 3618−3622 Ｓｃｉｅｎｃｅ，1986，Ｖｏｌ．231, Ｐ．1567−1572 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 1/00 - 41/00 C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 7/08 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトまたは霊長類のレトロウイルスを認識
   するモノクローナル抗体を産生する、SP-2 S01-1F（FER
   M P-10538）、SP-2 S02-11G（FERM P-10539）もしくはS
   P-2 S03-A7（FERM P-10540）で標示されるハイブリドー
   マ細胞。
2. 【請求項２】請求項１記載のハイブリドーマ細胞から産
   生されたヒトまたは霊長類のレトロウイルスを認識する
   モノクローナル抗体。
3. 【請求項３】請求項２記載のモノクローナル抗体を用い
   て、未知の病原性レトロウィルスと抗原抗体反応させる
   ことによる病原性レトロウィルスの検出方法。
4. 【請求項４】請求項２記載のモノクローナル抗体からな
   るレトロウィルスの感染に起因する病気の検査・診断
   薬。