JP2989862B2 - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—RNA viruses
- C07K16/112—Retroviridae (F), e.g. leukemia viruses
- C07K16/114—Lentivirus (G), e.g. human immunodeficiency virus [HIV], feline immunodeficiency virus [FIV] or simian immunodeficiency virus [SIV]
- C07K16/1145—Env proteins, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, principal neutralising domain [PND] or CD4-binding site
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はウイルス感染の予防、治療、あるいは診断に
有用な、並びに生化学及び組織学の研究に有用な新規物
質を提供する免疫学的技術に関する。より詳しくは、後
天性免疫不全症候群（エイズ）の原因ウイルスと認めら
れるヒト免疫不全ウイルス（HIV）を実質的に中和する
能力を有するモノクローナル抗体及び該抗体を分泌する
ハイブリドーマに関する。
有用な、並びに生化学及び組織学の研究に有用な新規物
質を提供する免疫学的技術に関する。より詳しくは、後
天性免疫不全症候群（エイズ）の原因ウイルスと認めら
れるヒト免疫不全ウイルス（HIV）を実質的に中和する
能力を有するモノクローナル抗体及び該抗体を分泌する
ハイブリドーマに関する。
技術背景 ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、後天性免疫不全症
候群（エイズ）およびエイズ関連症候群（ARC）等の一
連の疾患の原因であるヒトレトロウイルスである。よく
知られているように、HIVのプロトタイプはヒトＴ細胞
リンパ球趨向生ウイルス−III（Human T−Lymphotropic
Virus Type III;HTLV−III）とリンパ腫症関連ウイル
ス（Lymphadenopathy Associated Virus;LAV）とであ
る。今日、これらの疾患は世界的に問題となっている
が、これらに有効なワクチンや治療法はまだ提供されて
いない。
候群（エイズ）およびエイズ関連症候群（ARC）等の一
連の疾患の原因であるヒトレトロウイルスである。よく
知られているように、HIVのプロトタイプはヒトＴ細胞
リンパ球趨向生ウイルス−III（Human T−Lymphotropic
Virus Type III;HTLV−III）とリンパ腫症関連ウイル
ス（Lymphadenopathy Associated Virus;LAV）とであ
る。今日、これらの疾患は世界的に問題となっている
が、これらに有効なワクチンや治療法はまだ提供されて
いない。
エイズに関連する最も特徴的な血液学的異常は、細胞
表面にCD4抗原を持つヘルパー／インデューサーＴリン
パ球の機能的及び量的欠損である。HIVの起こす免疫不
全は、感染している宿主（ヒト）の生体防御機構に様々
な障害を起こし、例えば、カリニ肺炎のような日和見感
染やカポジ肉腫のような通常では観られにくい悪性腫瘍
を高発させる。HIVによる免疫不全は、進行性、非可逆
的で、死亡率はきわめて高く、数年間におそらく100％
に達すると言われている。
表面にCD4抗原を持つヘルパー／インデューサーＴリン
パ球の機能的及び量的欠損である。HIVの起こす免疫不
全は、感染している宿主（ヒト）の生体防御機構に様々
な障害を起こし、例えば、カリニ肺炎のような日和見感
染やカポジ肉腫のような通常では観られにくい悪性腫瘍
を高発させる。HIVによる免疫不全は、進行性、非可逆
的で、死亡率はきわめて高く、数年間におそらく100％
に達すると言われている。
HIVがＴ細胞に感染する第１段階において、ウイルス
粒子の感染の場合、レセプターであるCD4抗原に対する
ウイルス粒子の結合が起こる。その一方でHIVはまた、
細胞感染によっても感染を拡大していく。すなわち、既
に感染している細胞と非感染細胞とが細胞融合を起こ
し、特に脳やリンパ節等の臓器において、合胞体（多核
巨大細胞）形成を起こす。このような合胞体形成は、試
験管内の実験系でも観察されている。CD4陽性の細胞が
欠損する原因は、HIVの感染したＴ細胞がHIVの起こす細
胞障害効果を受け易いことによると言われている。
粒子の感染の場合、レセプターであるCD4抗原に対する
ウイルス粒子の結合が起こる。その一方でHIVはまた、
細胞感染によっても感染を拡大していく。すなわち、既
に感染している細胞と非感染細胞とが細胞融合を起こ
し、特に脳やリンパ節等の臓器において、合胞体（多核
巨大細胞）形成を起こす。このような合胞体形成は、試
験管内の実験系でも観察されている。CD4陽性の細胞が
欠損する原因は、HIVの感染したＴ細胞がHIVの起こす細
胞障害効果を受け易いことによると言われている。
HIVはこのヘルパー／インデューサーＴ細胞群のみに
感染するのではなく、単球／マクロファージ群にも感染
することが知られている。また、ほとんどの単球／マク
ロファージ群と一部のＴ細胞とは、HIVの起こす細胞障
害効果に対して抵抗性を示し、長時間ウイルスを保有
し、ウイルスを産生し続けることも知られている。
感染するのではなく、単球／マクロファージ群にも感染
することが知られている。また、ほとんどの単球／マク
ロファージ群と一部のＴ細胞とは、HIVの起こす細胞障
害効果に対して抵抗性を示し、長時間ウイルスを保有
し、ウイルスを産生し続けることも知られている。
また、HIVに感染したヒトの血清中にHIVに対する抗体
が存在するが、一般にその中和活性は低いことが知られ
ている（Weiss et al.,Nature,316,p.69−72（198
5））。
が存在するが、一般にその中和活性は低いことが知られ
ている（Weiss et al.,Nature,316,p.69−72（198
5））。
HIVの構造蛋白抗原として、コア（gag）抗原と外皮膜
（envelope）抗原の存在がよく知られている。HIVの外
皮膜は160キロダルトンの前駆体糖蛋白（gp160）とそれ
が切断されてできる120キロダルトン（gp120）と41キロ
ダルトン（gp41）のウイルス粒子に存在する膜糖蛋白と
を含んでいる。その中で、gp120は次の観点から重要性
が高い。
（envelope）抗原の存在がよく知られている。HIVの外
皮膜は160キロダルトンの前駆体糖蛋白（gp160）とそれ
が切断されてできる120キロダルトン（gp120）と41キロ
ダルトン（gp41）のウイルス粒子に存在する膜糖蛋白と
を含んでいる。その中で、gp120は次の観点から重要性
が高い。
（１）gp120またはgp120由来のある種の断片で実験動物
を免疫すると、ポリクローン性中和抗体が得られる。こ
のことは、gp120が少なくともウイルス中和能力を有す
る抗体の標的分子の一つであることを意味する（Lasky
et al.,Science,233,p.209−212（1986）。
を免疫すると、ポリクローン性中和抗体が得られる。こ
のことは、gp120が少なくともウイルス中和能力を有す
る抗体の標的分子の一つであることを意味する（Lasky
et al.,Science,233,p.209−212（1986）。
（２）HIVの感染の第１段階において、gp120はウイルス
レセプターであるCD4分子と結合する。このことは、gp1
20がHIVの感染にとって最も重要な分子であることを意
味する（McDougal et al.,Science 231,p.382−385（19
86））。
レセプターであるCD4分子と結合する。このことは、gp1
20がHIVの感染にとって最も重要な分子であることを意
味する（McDougal et al.,Science 231,p.382−385（19
86））。
（３）HIVによる合胞体形成、すなわちHIVの細胞間（ce
ll−to−cell）感染は、gp120と非感染細胞のCD4分子と
の直接的相互作用によって生じる（Lifson et al.,Natu
re,323,p.725−728（1985））。
ll−to−cell）感染は、gp120と非感染細胞のCD4分子と
の直接的相互作用によって生じる（Lifson et al.,Natu
re,323,p.725−728（1985））。
HTLV−IIIやLAVの構成蛋白に対する種々のモノクロー
ナル抗体、例えば、ウイルスの内部にあるコア抗原の一
つである。p24にに対するもの（Veronese F.D.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.,U.S.A.82,p.5199−5202（1985））、ウイ
ルスの逆転写酵素をコードしているpol遺伝子産物に対
するもの（Veronese F.D.,Science,231,p.1289−1291
（1986））、及び外皮膜のもう一つの構成蛋白であるgp
41に対するもの（Veronese F.D.,Science,229,p.1402−
1405（1985））が知られている。しかしながら、これら
の公知のモノクローナル抗体の中にはエイズの治療や予
防に重要なgp120抗原に反応するものはない。それどこ
ろか、精製されたLAVで免疫してもgp120抗原を効果的に
中和する能力を持つモノクローナル抗体は得られなかっ
たという報告もある（Chassange J.et al.,J.Immunol.1
36,p.1442−1445（1985））。
ナル抗体、例えば、ウイルスの内部にあるコア抗原の一
つである。p24にに対するもの（Veronese F.D.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.,U.S.A.82,p.5199−5202（1985））、ウイ
ルスの逆転写酵素をコードしているpol遺伝子産物に対
するもの（Veronese F.D.,Science,231,p.1289−1291
（1986））、及び外皮膜のもう一つの構成蛋白であるgp
41に対するもの（Veronese F.D.,Science,229,p.1402−
1405（1985））が知られている。しかしながら、これら
の公知のモノクローナル抗体の中にはエイズの治療や予
防に重要なgp120抗原に反応するものはない。それどこ
ろか、精製されたLAVで免疫してもgp120抗原を効果的に
中和する能力を持つモノクローナル抗体は得られなかっ
たという報告もある（Chassange J.et al.,J.Immunol.1
36,p.1442−1445（1985））。
エイズウイルスを効果的に中和する能力を有し、エイ
ズの予防や診断に役立つモノクローナル抗体を得るため
に種々の試みがなされた。
ズの予防や診断に役立つモノクローナル抗体を得るため
に種々の試みがなされた。
合成ペプチドを免疫源として、gp120抗原に反応する
モノクローナル抗体を得たこと、この抗体に認識される
エピトープは、HIVの外皮膜のアミノ酸配列の第503−53
2番目以内にあることが報告された（Chanh T.C.et al.,
Eur.J.Immunol.16,p.1455−1468（1986））。しかし、
報告されたこの抗体の結合活性は、ウエスターン・ブロ
ット法によっても、細胞表面の蛍光染色法によっても弱
かった。さらに、この報告にはモノクローナル抗体の中
和能力の存在の証明が記載されていない。
モノクローナル抗体を得たこと、この抗体に認識される
エピトープは、HIVの外皮膜のアミノ酸配列の第503−53
2番目以内にあることが報告された（Chanh T.C.et al.,
Eur.J.Immunol.16,p.1455−1468（1986））。しかし、
報告されたこの抗体の結合活性は、ウエスターン・ブロ
ット法によっても、細胞表面の蛍光染色法によっても弱
かった。さらに、この報告にはモノクローナル抗体の中
和能力の存在の証明が記載されていない。
上述のような状況の中で、本件発明者等はHTLV−IIIB
株のgp120と結合し、該ウイルスを強力に中和する能力
を有するモノクローナル抗体（0.5β）を作製し、既に
報告している（Matsushita et al.,J.Virology,62,p.21
07−2114（1988））。しかしながら、該0.5β抗体はHTL
V−IIIB株を中和することはできるが、疫学上多いとさ
れるHTLV−IIIMN株を中和することはできない。
株のgp120と結合し、該ウイルスを強力に中和する能力
を有するモノクローナル抗体（0.5β）を作製し、既に
報告している（Matsushita et al.,J.Virology,62,p.21
07−2114（1988））。しかしながら、該0.5β抗体はHTL
V−IIIB株を中和することはできるが、疫学上多いとさ
れるHTLV−IIIMN株を中和することはできない。
現在まで、疫学上多いとみなされるこのHTLV−IIIMN
株のgp120と結合し、これを実質的に中和するモノクロ
ーナル抗体は得られていない。本発明は発明者の調製し
たモノクローナル抗体がHTLV−IIIMNの外皮膜抗原gp120
と結合し、該ウイルスを実質的に中和することができる
という知見に基づいている。
株のgp120と結合し、これを実質的に中和するモノクロ
ーナル抗体は得られていない。本発明は発明者の調製し
たモノクローナル抗体がHTLV−IIIMNの外皮膜抗原gp120
と結合し、該ウイルスを実質的に中和することができる
という知見に基づいている。
発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、HIVを実質的に中和する能力を有す
るモノクローナル抗体及び該抗体を産生する能力を持つ
ハイブリドーマを提供することにある。
るモノクローナル抗体及び該抗体を産生する能力を持つ
ハイブリドーマを提供することにある。
ここに、中和という用語はHIV粒子の感染（cell free
infection）阻止及び／またはgp120とCD4との相互作用
によってHIV感染細胞と非感染細胞との間で起こる合胞
体形成の様な細胞間感染（cell−to−cell infection）
の阻止を意味する。
infection）阻止及び／またはgp120とCD4との相互作用
によってHIV感染細胞と非感染細胞との間で起こる合胞
体形成の様な細胞間感染（cell−to−cell infection）
の阻止を意味する。
課題を解決するための手段 本発明により、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の外皮
膜にある分子量約12万ダルトンの糖蛋白質抗原と結合し
て上記ウイルスを実質的に中和する能力を有するモノク
ローナル抗体またはその断片が提供される。
膜にある分子量約12万ダルトンの糖蛋白質抗原と結合し
て上記ウイルスを実質的に中和する能力を有するモノク
ローナル抗体またはその断片が提供される。
以下、本発明のモノクローナル抗体及びその調製法に
ついて概説する。本発明に基づくモノクローナル抗体は
HTLV−IIIMN株の外皮膜糖蛋白質gp120を認識し、該ウイ
ルスを中和する。このモノクローナル抗体は、例えばマ
ウス、モルモット、ウサギのような哺乳動物を適当なHT
LV−IIIMN産生細胞から得られるウイルス粒子もしくは
精製外皮膜糖蛋白質gp120、もしくは遺伝子組換え技術
を用いて調製される組換えペプチド、好ましくはgp120
のアミノ酸配列第247−370に対応する組換えペプチド、
もしくは該ウイルス蛋白のアミノ酸配列に基づいて調製
される好適な合成ペプチド、好ましくはgp120のアミノ
酸配列第303−325に対応する合成ペプチドで免疫し、得
られた脾臓細胞を例えば、マウスのミエローマ細胞と融
合させ、得られたハイブリドーマから、精製外皮膜糖蛋
白質gp120、もしくは前記組換えペプチド、もしくは前
記合成ペプチドに反応する細胞を選択し、該細胞を培養
することによって、調製することができる。
ついて概説する。本発明に基づくモノクローナル抗体は
HTLV−IIIMN株の外皮膜糖蛋白質gp120を認識し、該ウイ
ルスを中和する。このモノクローナル抗体は、例えばマ
ウス、モルモット、ウサギのような哺乳動物を適当なHT
LV−IIIMN産生細胞から得られるウイルス粒子もしくは
精製外皮膜糖蛋白質gp120、もしくは遺伝子組換え技術
を用いて調製される組換えペプチド、好ましくはgp120
のアミノ酸配列第247−370に対応する組換えペプチド、
もしくは該ウイルス蛋白のアミノ酸配列に基づいて調製
される好適な合成ペプチド、好ましくはgp120のアミノ
酸配列第303−325に対応する合成ペプチドで免疫し、得
られた脾臓細胞を例えば、マウスのミエローマ細胞と融
合させ、得られたハイブリドーマから、精製外皮膜糖蛋
白質gp120、もしくは前記組換えペプチド、もしくは前
記合成ペプチドに反応する細胞を選択し、該細胞を培養
することによって、調製することができる。
このハイブリドーマの調製に関しては、KohlerとMils
teinの方法（Nature 256,p.495（1975））を基に行な
う。抗原として用いるウイルス粒子もしくは外皮膜糖蛋
白質gp120は、ショ糖密度勾配遠心法によって調製したH
TLV−IIIMN産生細胞、例えばH9/HTLV−IIIMNに由来する
もの、遺伝子組換え技術を用いて調製される組換えペプ
チド、あるいは該ウイルス蛋白のアミノ酸配列に基づい
て調製される合成ペプチドが好適に用いられるが、他の
方法で得られる免疫用抗原も同様に使用することができ
る。免疫用マウスとしては、BALB/c系マウス、BALB/c系
マウスと他系マウスとのF1マウスなどが用いられる。免
疫はマウス１匹（４〜８週齢、20〜30g）に対して抗原2
0〜200μｇを用いて２〜３週間ごとに３〜６回行なう。
なお、マウスの飼育及び脾臓細胞の採取は常法に従う。
teinの方法（Nature 256,p.495（1975））を基に行な
う。抗原として用いるウイルス粒子もしくは外皮膜糖蛋
白質gp120は、ショ糖密度勾配遠心法によって調製したH
TLV−IIIMN産生細胞、例えばH9/HTLV−IIIMNに由来する
もの、遺伝子組換え技術を用いて調製される組換えペプ
チド、あるいは該ウイルス蛋白のアミノ酸配列に基づい
て調製される合成ペプチドが好適に用いられるが、他の
方法で得られる免疫用抗原も同様に使用することができ
る。免疫用マウスとしては、BALB/c系マウス、BALB/c系
マウスと他系マウスとのF1マウスなどが用いられる。免
疫はマウス１匹（４〜８週齢、20〜30g）に対して抗原2
0〜200μｇを用いて２〜３週間ごとに３〜６回行なう。
なお、マウスの飼育及び脾臓細胞の採取は常法に従う。
ミエローマ細胞としては、MOPC−21NS（Nature 256,p
495（1975））,SP2/0−Ag14（Nature,276,p.269（197
9））,p3X63Ag8−U1（Eur.J.Immunol.６,p.511（197
6））,p3X63−Ag8（Nature,256,p.495（1975））,p3X63
−Ag8.653（J.Immunol.123,p.1548（1979））等が好適
に用いられる。脾臓細胞とミエローマ細胞は１対１〜10
対１の割合で混合し、融合はNaC1（約0.85％）、ジメチ
ルスルホキシド（10〜20％（v/v））および分子量1,000
〜6,000のポリエチレングリコールを含有するリン酸緩
衝液（pH7.2〜7.4）中で行なう。融合は両細胞の混合物
を35〜37℃で１〜５分間インキュベートすることによっ
て行なう。融合細胞（ハイブリドーマ）の選択は、ヒポ
キサンチン（1.3〜1.4mg/dl），アミノプテリン（18〜2
0μg/dl），チミジン（375〜4,000μg/dl），ストレプ
トマイシン（50〜100μg/m），ペニシリン（50〜100
単位/m），グルタミン（3.5〜4.0g/），牛胎児血清
（10〜20％）を含有する基礎培地を用い、生育してくる
細胞として選択する。基礎培地としては、動物細胞の培
養に一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培
地などが用いられる。融合細胞のクローン化は限界希釈
法にて少なくとも３回繰り返して行なう。
495（1975））,SP2/0−Ag14（Nature,276,p.269（197
9））,p3X63Ag8−U1（Eur.J.Immunol.６,p.511（197
6））,p3X63−Ag8（Nature,256,p.495（1975））,p3X63
−Ag8.653（J.Immunol.123,p.1548（1979））等が好適
に用いられる。脾臓細胞とミエローマ細胞は１対１〜10
対１の割合で混合し、融合はNaC1（約0.85％）、ジメチ
ルスルホキシド（10〜20％（v/v））および分子量1,000
〜6,000のポリエチレングリコールを含有するリン酸緩
衝液（pH7.2〜7.4）中で行なう。融合は両細胞の混合物
を35〜37℃で１〜５分間インキュベートすることによっ
て行なう。融合細胞（ハイブリドーマ）の選択は、ヒポ
キサンチン（1.3〜1.4mg/dl），アミノプテリン（18〜2
0μg/dl），チミジン（375〜4,000μg/dl），ストレプ
トマイシン（50〜100μg/m），ペニシリン（50〜100
単位/m），グルタミン（3.5〜4.0g/），牛胎児血清
（10〜20％）を含有する基礎培地を用い、生育してくる
細胞として選択する。基礎培地としては、動物細胞の培
養に一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培
地などが用いられる。融合細胞のクローン化は限界希釈
法にて少なくとも３回繰り返して行なう。
ハイブリドーマを通常の動物細胞の培養と同様にして
培養すれば、その結果培地中に本発明の抗体を得ること
ができる。例えば、２〜５×106のハイブリドーマをス
トレプトマイシン（50〜100μg/m），ペニシリン（50
〜100単位/m），グルタミン（3.5〜4.0g/），牛胎
児血清（10〜20％）を含有するRPMI 1640培地10〜20m
を用い、フラスコ内で５％CO2存在下、35〜37℃,3〜７
日間培養することによって培養液中に抗体が分泌、蓄積
される。また、該ハイブリドーマをプリスタン処理のヌ
ードマウスまたはBALB/cマウスの腹腔内に移植して増殖
させることにより腹水中に本発明の抗体を蓄積させるこ
とができる。すなわち、これらのマウス腹腔内にプリス
タン0.5〜1mを接種し、その後２〜３週目に腹腔に５
×106〜１×107個のハイブリドーマを移植する。通常７
〜10日後に腹水が蓄積し、これを採取する。培養物およ
び腹水中のモノクローナル抗体はアフィゲルプロテイン
A MAPS−IIキット（BIO−RAD社）を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィーの手段等により精製される。
培養すれば、その結果培地中に本発明の抗体を得ること
ができる。例えば、２〜５×106のハイブリドーマをス
トレプトマイシン（50〜100μg/m），ペニシリン（50
〜100単位/m），グルタミン（3.5〜4.0g/），牛胎
児血清（10〜20％）を含有するRPMI 1640培地10〜20m
を用い、フラスコ内で５％CO2存在下、35〜37℃,3〜７
日間培養することによって培養液中に抗体が分泌、蓄積
される。また、該ハイブリドーマをプリスタン処理のヌ
ードマウスまたはBALB/cマウスの腹腔内に移植して増殖
させることにより腹水中に本発明の抗体を蓄積させるこ
とができる。すなわち、これらのマウス腹腔内にプリス
タン0.5〜1mを接種し、その後２〜３週目に腹腔に５
×106〜１×107個のハイブリドーマを移植する。通常７
〜10日後に腹水が蓄積し、これを採取する。培養物およ
び腹水中のモノクローナル抗体はアフィゲルプロテイン
A MAPS−IIキット（BIO−RAD社）を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィーの手段等により精製される。
得られたモノクローナル抗体は、HTLV−IIIMN株に由
来するgp120上のエピトープを認識し、さらに該ウイル
スを実質的に中和し得ることが明らかになった。詳細に
は以下の性状を有している。
来するgp120上のエピトープを認識し、さらに該ウイル
スを実質的に中和し得ることが明らかになった。詳細に
は以下の性状を有している。
（ａ）IgG,κに分類され、 （ｂ）HTLV−IIIMNの分子量12万ダルトンの糖蛋白質抗
原（gp120）と結合する能力を有し、 （ｃ）HTLV−IIIMNのgp120のアミノ酸配列の第303〜325
番目（YNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIG）に存在する少なくと
も一つのエピトープを認識する能力を有し、 （ｄ）HTLV−IIIMN粒子の表面に結合することにより、
ウイルス粒子がCD4陽性細胞に感染することを阻止する
能力を有し、 （ｅ）HTLV−IIIMNに感染した細胞の表面に結合するこ
とによって、感染細胞と非感染細胞とにより、誘発され
る合胞体形成を阻止する能力を有する。
原（gp120）と結合する能力を有し、 （ｃ）HTLV−IIIMNのgp120のアミノ酸配列の第303〜325
番目（YNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIG）に存在する少なくと
も一つのエピトープを認識する能力を有し、 （ｄ）HTLV−IIIMN粒子の表面に結合することにより、
ウイルス粒子がCD4陽性細胞に感染することを阻止する
能力を有し、 （ｅ）HTLV−IIIMNに感染した細胞の表面に結合するこ
とによって、感染細胞と非感染細胞とにより、誘発され
る合胞体形成を阻止する能力を有する。
すなわち、本発明によるモノクローナル抗体は合胞体
形成のような細胞間感染（cell−to−cell infection）
及び／またはHTLV−IIIMNの感染（cell free infectio
n）を強力に阻止できることが明らかになった。従っ
て、本発明によるモノクローナル抗体をエイズの予防及
び治療に用いることができる。また、ヒト宿主における
エイズウイルスの増殖の抑制にも有用である。本発明に
よるモノクローナル抗体はHTLV−IIIMNに対して強い中
和活性を有しているので、非感染Ｔ細胞への該ウイルス
の感染を予防することができる。
形成のような細胞間感染（cell−to−cell infection）
及び／またはHTLV−IIIMNの感染（cell free infectio
n）を強力に阻止できることが明らかになった。従っ
て、本発明によるモノクローナル抗体をエイズの予防及
び治療に用いることができる。また、ヒト宿主における
エイズウイルスの増殖の抑制にも有用である。本発明に
よるモノクローナル抗体はHTLV−IIIMNに対して強い中
和活性を有しているので、非感染Ｔ細胞への該ウイルス
の感染を予防することができる。
なお、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマは工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）
に受託番号第11472号（FERM P−11472）及び受託番号第
11594号（FERM P−11594）として寄託されている。
リドーマは工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）
に受託番号第11472号（FERM P−11472）及び受託番号第
11594号（FERM P−11594）として寄託されている。
以下、本発明の理解を深めるために実施例に沿って説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
実施例１ モノクローナル抗体の調製 抗原の調製 （１）合成ペプチド HTLV−IIIMN株外皮膜糖蛋白質gp120のアミノ酸配列第
303〜325番目に対応する合成ペプチド（YNKRKRIHIGPGRA
FYTTKNIIG）を免疫抗原及びアッセイ用抗原として使用
した。
303〜325番目に対応する合成ペプチド（YNKRKRIHIGPGRA
FYTTKNIIG）を免疫抗原及びアッセイ用抗原として使用
した。
該ペプチドの化学合成にはABI430Aペプチドシンセサ
イザー（アプライドバイオシステム社）を用いた。その
結果、粗生成物が得られ、TFMSA法によりレジンからペ
プチドを切り出した後、逆相HPLCによる精製を行なっ
た。逆相HPLCによる精製を３回繰り返し、得られたピー
ク画分を集め、アミノ酸分析を行なった結果、HTLV−II
IMN株のアミノ酸組成と一致したことより、所望の上記
配列を有するHTLV−IIIMN株gp120の合成ペプチドと断定
した。
イザー（アプライドバイオシステム社）を用いた。その
結果、粗生成物が得られ、TFMSA法によりレジンからペ
プチドを切り出した後、逆相HPLCによる精製を行なっ
た。逆相HPLCによる精製を３回繰り返し、得られたピー
ク画分を集め、アミノ酸分析を行なった結果、HTLV−II
IMN株のアミノ酸組成と一致したことより、所望の上記
配列を有するHTLV−IIIMN株gp120の合成ペプチドと断定
した。
次に得られた合成ペプチド（SP−１）を凍結乾燥し、
免疫用担体としてのKLH（キーホールリンペットヘモシ
アニン）と結合させ、ペプチド−KLHコンジュゲートを
作製した。まず、上記ペプチド10mgを10mMPBS（pH7.0）
2mに溶解し、MBS型架橋剤のジメチルホルムアミド溶
液（40mg/100μ）を添加して室温で30分間攪はんし
た。次に反応液をジクロメタン2mで３回洗浄し、得ら
れた水層を分取した（溶液Ａ）。一方、KLH20mgを0.2M
Tris−HCl（pH8.6 8MUrea）5mに溶解し、DTTを添加し
て室温で１時間攪はんした。反応液に10％トリクロロ酢
酸3mを加え、沈澱物を吸引過し、蒸留水2mで洗浄
した後、20mM NaPB（pH7.0 6MUrea）5mに溶解した
（溶液Ｂ）。
免疫用担体としてのKLH（キーホールリンペットヘモシ
アニン）と結合させ、ペプチド−KLHコンジュゲートを
作製した。まず、上記ペプチド10mgを10mMPBS（pH7.0）
2mに溶解し、MBS型架橋剤のジメチルホルムアミド溶
液（40mg/100μ）を添加して室温で30分間攪はんし
た。次に反応液をジクロメタン2mで３回洗浄し、得ら
れた水層を分取した（溶液Ａ）。一方、KLH20mgを0.2M
Tris−HCl（pH8.6 8MUrea）5mに溶解し、DTTを添加し
て室温で１時間攪はんした。反応液に10％トリクロロ酢
酸3mを加え、沈澱物を吸引過し、蒸留水2mで洗浄
した後、20mM NaPB（pH7.0 6MUrea）5mに溶解した
（溶液Ｂ）。
溶液Ａと溶液Ｂとを室温にて３時間混合攪はんし、反
応生成物を透析した後、凍結乾燥した。
応生成物を透析した後、凍結乾燥した。
以上のようにしてHTLV−IIIMN株gp120合成ペプチド及
びペプチド−KLHコンジュゲートを調製し、免疫用抗原
及びアッセイ用抗原として用いた。
びペプチド−KLHコンジュゲートを調製し、免疫用抗原
及びアッセイ用抗原として用いた。
（２）HTLV−IIIMN産生細胞の培養及びHTLV−IIIMN粒子
の調製 HTLV−IIIMN産生細胞はH9/HTLV−IIIMNを使用した。R
PMI 1640を基礎培地とし、これに20％FCS（牛胎児血
清）、2mM L−グルタミンを添加し50単位で調製し
た。36のスピナーフラスコ、培養コントローラ（和研
薬工業社製）によりH9/HTLV−IIIMNを培養し、細胞浮遊
液を3,000rpm、５分間遠心処理することにより培養上清
を調製した。ウイルス粒子の調製は、日立RPC35T連続ロ
ータを使用したショ糖密度勾配遠心（25％,50％不連続8
9,000×g 20hr）に培養上清を２/hで加えることによ
り行ない、この時ウイルス粒子は30−45％のショ糖層に
集まった。こうして、得られたウイルス粒子を免疫用抗
原及びアッセイ用抗原として使用した。
の調製 HTLV−IIIMN産生細胞はH9/HTLV−IIIMNを使用した。R
PMI 1640を基礎培地とし、これに20％FCS（牛胎児血
清）、2mM L−グルタミンを添加し50単位で調製し
た。36のスピナーフラスコ、培養コントローラ（和研
薬工業社製）によりH9/HTLV−IIIMNを培養し、細胞浮遊
液を3,000rpm、５分間遠心処理することにより培養上清
を調製した。ウイルス粒子の調製は、日立RPC35T連続ロ
ータを使用したショ糖密度勾配遠心（25％,50％不連続8
9,000×g 20hr）に培養上清を２/hで加えることによ
り行ない、この時ウイルス粒子は30−45％のショ糖層に
集まった。こうして、得られたウイルス粒子を免疫用抗
原及びアッセイ用抗原として使用した。
なお、精製gp120の調製は前述したH9/HTLV−IIIMN培
養液より細胞を遠心処理によって収集し、１％トリトン
Ｘ−100にて溶菌後、これを遠心処理してその上清をCon
A−セファロース4Bカラムでアフィニティー精製した。
この溶出液をHIV抗体（IgG）−セファロース4Bカラムに
てさらにアフィニティー精製を行なった。このようにし
て調製した精製gp120を免疫用抗原及びアッセイ用抗原
として使用した。
養液より細胞を遠心処理によって収集し、１％トリトン
Ｘ−100にて溶菌後、これを遠心処理してその上清をCon
A−セファロース4Bカラムでアフィニティー精製した。
この溶出液をHIV抗体（IgG）−セファロース4Bカラムに
てさらにアフィニティー精製を行なった。このようにし
て調製した精製gp120を免疫用抗原及びアッセイ用抗原
として使用した。
（３）HTLV−IIIMNgp120V3ドメイン（247−370）組換え
発現ペプチドの作製 H9/HTLV−IIIMN細胞（106−107個）を１×RSBバッフ
ァーに浮遊させ、SDS（最終濃度１％）、Proteinase K
（最終濃度1mg/m）を加え、37℃で２時間インキュベ
ートした。その後、フェノール抽出、エタノール沈澱を
繰り返し、高分子量DNA（genomic DNA）を得た。この高
分子量DNAを鋳型にして以下のA,Cプライマーを用い、HT
LV−IIIMNgp120V3ドメイン（アミノ酸247−370）を常法
に従ってPCR法で増幅した。
発現ペプチドの作製 H9/HTLV−IIIMN細胞（106−107個）を１×RSBバッフ
ァーに浮遊させ、SDS（最終濃度１％）、Proteinase K
（最終濃度1mg/m）を加え、37℃で２時間インキュベ
ートした。その後、フェノール抽出、エタノール沈澱を
繰り返し、高分子量DNA（genomic DNA）を得た。この高
分子量DNAを鋳型にして以下のA,Cプライマーを用い、HT
LV−IIIMNgp120V3ドメイン（アミノ酸247−370）を常法
に従ってPCR法で増幅した。
増幅はTaqポリメラーゼを用い、30〜35サイクル行な
った。
った。
このようにして得た増幅DNAフラグメントをpUC18プラ
スミドにてクローニングし、このクローン化DNAフラグ
メントをpUEX2発現ベクターに組み込み、大腸菌にトラ
ンスフェクトして42℃でheat inductionを行ない発現さ
せた。発現したHTLV−IIIMNgp120V3ドメイン（アミノ酸
247−370）はβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白となっ
ており、大腸菌封入体として以下の精製を行なった。
スミドにてクローニングし、このクローン化DNAフラグ
メントをpUEX2発現ベクターに組み込み、大腸菌にトラ
ンスフェクトして42℃でheat inductionを行ない発現さ
せた。発現したHTLV−IIIMNgp120V3ドメイン（アミノ酸
247−370）はβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白となっ
ており、大腸菌封入体として以下の精製を行なった。
発現した大腸菌をグラスビーズにて破砕した後、リゾ
チーム処理（最終濃度0.1mg/m）を４℃にて行ない、
得られた遠心沈査物をTriton X−100（最終濃度0.5％）
にて処理した。得られた遠心沈査物を8M Ureaに可溶化
して、免疫用抗原及びアッセイ用抗原として使用した。
チーム処理（最終濃度0.1mg/m）を４℃にて行ない、
得られた遠心沈査物をTriton X−100（最終濃度0.5％）
にて処理した。得られた遠心沈査物を8M Ureaに可溶化
して、免疫用抗原及びアッセイ用抗原として使用した。
マウスの免疫感作 一例として、前記で調製した合成ペプチドによる免疫
感作を以下に示す。
感作を以下に示す。
４〜８週齢のBALB/cマウス群を使用した。免疫感作は
腹腔内経路で３回接種した後、静脈内経路で１回接種す
るものとし、０日目にフロイントの完全アジュバント存
在下、14日目にフロイントの不完全アジュバント存在
下、28日目にフロイントの不完全アジュバント存在下、
42日目にアジュバント非存在下でそれぞれ100μｇの前
記で調製した合成ペプチドと合成ペプチド−KLHコンジ
ュゲート抗原混合物を接種した。
腹腔内経路で３回接種した後、静脈内経路で１回接種す
るものとし、０日目にフロイントの完全アジュバント存
在下、14日目にフロイントの不完全アジュバント存在
下、28日目にフロイントの不完全アジュバント存在下、
42日目にアジュバント非存在下でそれぞれ100μｇの前
記で調製した合成ペプチドと合成ペプチド−KLHコンジ
ュゲート抗原混合物を接種した。
細胞融合及びハイブリドーマの培養 最終免疫の３日後に、常法によりマウスから脾臓細胞
を採取した。
を採取した。
脾臓細胞をミエローマ細胞p3X63Ag8−U1と細胞数１対
５の割合で混合して、遠心処理（1,200r.p.m./5分）し
て上清を除き、沈澱した細胞塊を充分ほぐした後、攪は
んしながら、1mの混合液（ポリエチレングリコール−
4000（2g）,MEM（2m），ジメチルスルホキシド）に加
えた。５分間37℃にてインキュベートした後、液の全量
が50mになるようにゆっくりとMEMを加えた。遠心分離
後（900r.p.m./5分）後、上清を除き、ゆるやかに細胞
をほぐした。これに正常培地（RPMI−1640培地に牛胎児
血清10％を加えたもの）100mを加え、メスピペットを
用いてゆるやかに細胞を懸濁した。
５の割合で混合して、遠心処理（1,200r.p.m./5分）し
て上清を除き、沈澱した細胞塊を充分ほぐした後、攪は
んしながら、1mの混合液（ポリエチレングリコール−
4000（2g）,MEM（2m），ジメチルスルホキシド）に加
えた。５分間37℃にてインキュベートした後、液の全量
が50mになるようにゆっくりとMEMを加えた。遠心分離
後（900r.p.m./5分）後、上清を除き、ゆるやかに細胞
をほぐした。これに正常培地（RPMI−1640培地に牛胎児
血清10％を加えたもの）100mを加え、メスピペットを
用いてゆるやかに細胞を懸濁した。
懸濁液を24穴の培養プレートに分注し（1m／穴）５
％の炭酸ガスを含む培養器中で、温度37℃で24時間培養
した。次に、1m／穴のHAT培地（正常培地にヒポキサ
ンチン（１×10-4M），チミジン（1.5×10-3M）及びア
ミノプテリン（４×10-7M））を加え、さらに24時間培
養した。その後、２日間、24時間毎に、1mの培養上清
を同量のHT培地（HAT培地からアミノプテリンを除く）
と交換し、前記と同様にして10〜14日間培養した。
％の炭酸ガスを含む培養器中で、温度37℃で24時間培養
した。次に、1m／穴のHAT培地（正常培地にヒポキサ
ンチン（１×10-4M），チミジン（1.5×10-3M）及びア
ミノプテリン（４×10-7M））を加え、さらに24時間培
養した。その後、２日間、24時間毎に、1mの培養上清
を同量のHT培地（HAT培地からアミノプテリンを除く）
と交換し、前記と同様にして10〜14日間培養した。
コロニー状に生育した融合細胞（約300個）の認めら
れたそれぞれの穴について、1mの培養上清を同量のHT
培地と交換し、その後、２日間、24時間毎に、同様の交
換を行なった。
れたそれぞれの穴について、1mの培養上清を同量のHT
培地と交換し、その後、２日間、24時間毎に、同様の交
換を行なった。
HT培地で３〜４日培養した後、培養上清の一部を採
り、以下に述べるスクリーニング法にて目的のハイブリ
ドーマを選別した。
り、以下に述べるスクリーニング法にて目的のハイブリ
ドーマを選別した。
ハイブリドーマのスクリーニング 目的のハイブリドーマの選別には下記のEIA法、蛍光
抗体法、ウエスタン・ブロット法を組み合わせて行なっ
た。このようにして選別されたクローンについて中和活
性を測定した。
抗体法、ウエスタン・ブロット法を組み合わせて行なっ
た。このようにして選別されたクローンについて中和活
性を測定した。
（１）EIA法 96穴のマイクロテストプレートに前記のごとく作製し
た合成ペプチド抗原、もしくは精製gp120抗原、もしく
は組換えペプチド（蛋白質濃度２μg/m）を100μ／
穴で加え、４℃で一晩インキュベートすることにより固
相化した。さらに、２％BSA（ウシ血清アルブミン）溶
液100μを加え、同様にインキュベートしてマスキン
グを行なった。このようにして作製した抗原固相化プレ
ートに細胞融合法によって得られたハイブリドーマおよ
びクローニング後のハイブリドーマの培養上清を加え
て、37℃で２時間インキュベート後、0.1％Tween20/PBS
で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロ
ブリン抗体溶液（カッペル社製、5,000培希釈）を100μ
／穴加えた。37℃で１時間インキュベート後、0.1％T
ween20/PBSにて５回洗浄し、その後TMBZ基質溶液を加
え、常法により発色させ、その吸光度を波長450nmにて
測定した。こうしてHTLV−IIIMN由来の合成ペプチドと
のみ強く反応し、HTLV−IIIB由来の合成ペプチドと反応
しないハイブリドーマクローンを選択した。
た合成ペプチド抗原、もしくは精製gp120抗原、もしく
は組換えペプチド（蛋白質濃度２μg/m）を100μ／
穴で加え、４℃で一晩インキュベートすることにより固
相化した。さらに、２％BSA（ウシ血清アルブミン）溶
液100μを加え、同様にインキュベートしてマスキン
グを行なった。このようにして作製した抗原固相化プレ
ートに細胞融合法によって得られたハイブリドーマおよ
びクローニング後のハイブリドーマの培養上清を加え
て、37℃で２時間インキュベート後、0.1％Tween20/PBS
で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロ
ブリン抗体溶液（カッペル社製、5,000培希釈）を100μ
／穴加えた。37℃で１時間インキュベート後、0.1％T
ween20/PBSにて５回洗浄し、その後TMBZ基質溶液を加
え、常法により発色させ、その吸光度を波長450nmにて
測定した。こうしてHTLV−IIIMN由来の合成ペプチドと
のみ強く反応し、HTLV−IIIB由来の合成ペプチドと反応
しないハイブリドーマクローンを選択した。
（２）蛍光抗体法 H9/HTLV−IIIMN細胞または非感染H9細胞（５×10
5個）を被検培養上清100μに懸濁して、４℃で30分間
培養した。BSA（２％）とアザイド（0.1％）とを含むPB
S（PBS−BSA−Az）で２回細胞を洗浄した。次に、洗浄
後の細胞にFITC（fluorescein−isothiocyanate）で標
識された抗マウスIgG（シグマ社製、PBS−BSA−Azで1:4
0に希釈）100μを加え、該混合物を４℃で30分間反応
させた。PBS−BSA−Azで３回洗浄した後、反応混合物を
0.1％のパラホルムアルデヒドを含むPBSで固定した。
5個）を被検培養上清100μに懸濁して、４℃で30分間
培養した。BSA（２％）とアザイド（0.1％）とを含むPB
S（PBS−BSA−Az）で２回細胞を洗浄した。次に、洗浄
後の細胞にFITC（fluorescein−isothiocyanate）で標
識された抗マウスIgG（シグマ社製、PBS−BSA−Azで1:4
0に希釈）100μを加え、該混合物を４℃で30分間反応
させた。PBS−BSA−Azで３回洗浄した後、反応混合物を
0.1％のパラホルムアルデヒドを含むPBSで固定した。
レーザーフローサイトメトリー（スペクトラムIIIオ
ルソ・ダイアグノステック社製）を用いて、蛍光の強さ
によって抗体の反応性を測定し、H9/HTLV−IIIMN細胞の
表面に対して最大の結合能力を示すハイブリドーマを選
択して、限界希釈法にてクローニングした。クローニン
グ後のハイブリドーマクローンについても同様の手法で
選別した。
ルソ・ダイアグノステック社製）を用いて、蛍光の強さ
によって抗体の反応性を測定し、H9/HTLV−IIIMN細胞の
表面に対して最大の結合能力を示すハイブリドーマを選
択して、限界希釈法にてクローニングした。クローニン
グ後のハイブリドーマクローンについても同様の手法で
選別した。
（３）ウエスタン・ブロッティング法 トービン等の方法に準じて行なった（Towbin et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76,p.4350（1979））。
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76,p.4350（1979））。
HTLV−IIIMN精製ウイルスを文献記載の方法（Scienc
e,224 p.497（1984））で調製し、これを12％のSDS−PA
GEを用いて電気泳動し、ゲルをニトロセルロース膜に乗
せてウイルスを膜上に移行させ、膜を0.4〜0.5cm幅に切
断した。各細片をハイブリドーマ培養上清液に浸し、一
晩インキュベートした。その後、細片をPBSで３回洗浄
した後、ビオチン標識抗マウスIgG（TAGO社製）の1:750
希釈液中で２時間保温した。細片をPBSで３回洗浄後、
西洋わさびペルオキシダーゼを結合させたアビジン（シ
グマ社製）（1:1000希釈）に浸し、１時間保温した。PB
Sで３回洗浄後、４−クロロ−１−ナフトールを用いる
発色試薬（Bio−Rad社製）で発色させ、HTLV−IIIMNgp1
20の発色バンドを示すハイブリドーマを選びクローニン
グした。クローニング後のハイブリドーマクローンにつ
いても同様の手法で選別した。
e,224 p.497（1984））で調製し、これを12％のSDS−PA
GEを用いて電気泳動し、ゲルをニトロセルロース膜に乗
せてウイルスを膜上に移行させ、膜を0.4〜0.5cm幅に切
断した。各細片をハイブリドーマ培養上清液に浸し、一
晩インキュベートした。その後、細片をPBSで３回洗浄
した後、ビオチン標識抗マウスIgG（TAGO社製）の1:750
希釈液中で２時間保温した。細片をPBSで３回洗浄後、
西洋わさびペルオキシダーゼを結合させたアビジン（シ
グマ社製）（1:1000希釈）に浸し、１時間保温した。PB
Sで３回洗浄後、４−クロロ−１−ナフトールを用いる
発色試薬（Bio−Rad社製）で発色させ、HTLV−IIIMNgp1
20の発色バンドを示すハイブリドーマを選びクローニン
グした。クローニング後のハイブリドーマクローンにつ
いても同様の手法で選別した。
（４）中和活性測定法 H9/HTLV−IIIMNの培養上清をウイルス原液（104.5〜1
05TCID50）として使用した。
05TCID50）として使用した。
まず、10TCID50/50μに調製したウイルス液とハイ
ブリドーマクローン培養上清または腹水精製液の50μ
（種々の段階希釈したもの）とを96穴の平底プレートに
播種し、37℃で１時間インキュベートした。その後、MT
4細胞を104個/100μ／穴（10％FCS、Ｌ−グルタミン
3.5〜4.0g/、ペニシリン50U/m及びストレプトマイ
シン50μg/mを含むRPMI1640の培地に浮遊したもの）
で添加し、５日間培養した。
ブリドーマクローン培養上清または腹水精製液の50μ
（種々の段階希釈したもの）とを96穴の平底プレートに
播種し、37℃で１時間インキュベートした。その後、MT
4細胞を104個/100μ／穴（10％FCS、Ｌ−グルタミン
3.5〜4.0g/、ペニシリン50U/m及びストレプトマイ
シン50μg/mを含むRPMI1640の培地に浮遊したもの）
で添加し、５日間培養した。
感染時に生じる合胞体形成（シンシチウムフォーメー
ション）を抗体が抑制するか否かで中和活性を判定し
た。また、中和タイターは合胞体形成を100％抑制する
抗体の最低有効濃度として表した。
ション）を抗体が抑制するか否かで中和活性を判定し
た。また、中和タイターは合胞体形成を100％抑制する
抗体の最低有効濃度として表した。
上記の選別方法によって所望のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ（μ39.1及びμ5.5）が得られ
た。
産生するハイブリドーマ（μ39.1及びμ5.5）が得られ
た。
μ39.1及びμ5.5によるモノクローナル抗体の製造 プリスタン処理した８週齢のBalb/c雌マウスに前記実
施例で得られたハイブリドーマμ39.1及びμ5.5株の５
×106個／匹を各々のマウスの腹腔内に投与した。10〜2
1日目後に、腹水癌が誘発された。マウスから腹水を採
り、3000r.p.m./5分の遠心処理により固形成分が除去し
た後、アフィゲルプロテインＡ MAPS−IIキット（Bio
−Rad社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィ
ーにて精製した。
施例で得られたハイブリドーマμ39.1及びμ5.5株の５
×106個／匹を各々のマウスの腹腔内に投与した。10〜2
1日目後に、腹水癌が誘発された。マウスから腹水を採
り、3000r.p.m./5分の遠心処理により固形成分が除去し
た後、アフィゲルプロテインＡ MAPS−IIキット（Bio
−Rad社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィ
ーにて精製した。
実施例２ μ39.1抗体及びμ5.5抗体の性状解析 各種HIV変異株由来gp120合成ペプチドとの反応性 各種合成ペプチドとしてHTLV−IIIMN、HTLV−IIIB、H
TLV−IIIRF、及びHIV−２由来のそれぞれのgp120（アミ
ノ酸配列番号 303−325,または308−329）合成ペプチ
ドを使用した。方法は前述したハイブリドーマのスクリ
ーニングの（１）EIA法の項に示した。
TLV−IIIRF、及びHIV−２由来のそれぞれのgp120（アミ
ノ酸配列番号 303−325,または308−329）合成ペプチ
ドを使用した。方法は前述したハイブリドーマのスクリ
ーニングの（１）EIA法の項に示した。
第１図に示すように、コントロールである0.5β抗体
はIIIB由来のペプチドと強く反応し、IIIMN由来ペプチ
ドとは、高濃度域で交差反応するものの、低濃度域では
反応しないことが明かである。
はIIIB由来のペプチドと強く反応し、IIIMN由来ペプチ
ドとは、高濃度域で交差反応するものの、低濃度域では
反応しないことが明かである。
一方、μ39.1抗体は逆にIIIMN由来ペプチドと強く反
応し、IIIB由来ペプチドとは全く反応しないIIIMN株特
異的な抗体であることが示された。ここには示していな
いがμ39.1抗体は他のIIIRF株やHIV−２由来の合成ペプ
チドとも全く反応しなかった。
応し、IIIB由来ペプチドとは全く反応しないIIIMN株特
異的な抗体であることが示された。ここには示していな
いがμ39.1抗体は他のIIIRF株やHIV−２由来の合成ペプ
チドとも全く反応しなかった。
μ5.5抗体はμ39.1抗体と全く同様の反応性を示し、I
IIMN由来ペプチドとのみ強く反応するIIIMN株特異的な
抗体であることが示された。
IIMN由来ペプチドとのみ強く反応するIIIMN株特異的な
抗体であることが示された。
感染細胞由来のgp120との反応性（ウエスタン・ブロ
ッティング法） μ39.1及びμ5.5抗体の感染細胞由来の外皮膜蛋白質g
p120との反応性を調べる為に、ウエスタン・ブロッティ
ングを行なった。抗原としてH9/HTLV−IIIMN細胞lysate
を用いた。方法は前述したハイブリドマーのスクリーニ
ングの（３）ウエスタン・ブロッティング法の項に示し
た。Ａのストリップは陽性コントロールとしてヒトHIV
抗体陽性血清を用いたが、この部分にgp120のバンドが
観察される。0.5β抗体はIII−MN感染細胞のgp120とは
全く反応しないが、μ39.1抗体及びμ5.5抗体ははっき
りとIII−MN感染細胞のgp120を認識しており、その結合
はμ5.5抗体のほうがμ39.1抗体より明らかに強いこと
が判明した。（第２図） μ39.1抗体及びμ5.5抗体の有する中和特性 μ39.1抗体及びμ5.5抗体の有する中和特性について
検討した。方法はハイブリドーマのスクリーニングの
（４）中和活性測定法の項に示した。結果を第１表に示
す。
ッティング法） μ39.1及びμ5.5抗体の感染細胞由来の外皮膜蛋白質g
p120との反応性を調べる為に、ウエスタン・ブロッティ
ングを行なった。抗原としてH9/HTLV−IIIMN細胞lysate
を用いた。方法は前述したハイブリドマーのスクリーニ
ングの（３）ウエスタン・ブロッティング法の項に示し
た。Ａのストリップは陽性コントロールとしてヒトHIV
抗体陽性血清を用いたが、この部分にgp120のバンドが
観察される。0.5β抗体はIII−MN感染細胞のgp120とは
全く反応しないが、μ39.1抗体及びμ5.5抗体ははっき
りとIII−MN感染細胞のgp120を認識しており、その結合
はμ5.5抗体のほうがμ39.1抗体より明らかに強いこと
が判明した。（第２図） μ39.1抗体及びμ5.5抗体の有する中和特性 μ39.1抗体及びμ5.5抗体の有する中和特性について
検討した。方法はハイブリドーマのスクリーニングの
（４）中和活性測定法の項に示した。結果を第１表に示
す。
右側のカラムはそれぞれの変異株によるウイルス感染
を100％阻害する抗体の最低有効濃度を示している。コ
ントロールである0.5β抗体はIIIB/LAV株に対して特異
的な中和活性を示すが、μ39.1抗体は逆にIIIMN株の感
染を63μg/mの濃度で100％阻害し、他のIIIB、IIIRF
は阻害しないIIIMN株特異的な中和抗体であることが明
かである。μ5.5抗体はμ39.1抗体と同様にIIIMN株特異
的中和活性を示すが、その中和活性はμ39.1抗体より50
倍以上高く、IIIMN株の感染を１μg/mの濃度で100％
阻害する強力な中和抗体であることがわかる。
を100％阻害する抗体の最低有効濃度を示している。コ
ントロールである0.5β抗体はIIIB/LAV株に対して特異
的な中和活性を示すが、μ39.1抗体は逆にIIIMN株の感
染を63μg/mの濃度で100％阻害し、他のIIIB、IIIRF
は阻害しないIIIMN株特異的な中和抗体であることが明
かである。μ5.5抗体はμ39.1抗体と同様にIIIMN株特異
的中和活性を示すが、その中和活性はμ39.1抗体より50
倍以上高く、IIIMN株の感染を１μg/mの濃度で100％
阻害する強力な中和抗体であることがわかる。
また、左側のカラムはそれぞれの感染細胞による細胞
間感染を80％阻害する抗体の最低有効濃度を示している
が、コントロールの0.5β抗体はIIIB/LAV感染細胞特異
的な中和活性を示すのに対して、ここでもμ39.1抗体は
IIIMN感染細胞による細胞間感染を63μg/mの濃度で阻
害し、他のIIIB、IIIRF株感染細胞による細胞間感染は
阻害しなかった。すなわち、感染細胞による細胞間感染
阻害においてもIIIMN株特異的な中和抗体であることが
判明した。
間感染を80％阻害する抗体の最低有効濃度を示している
が、コントロールの0.5β抗体はIIIB/LAV感染細胞特異
的な中和活性を示すのに対して、ここでもμ39.1抗体は
IIIMN感染細胞による細胞間感染を63μg/mの濃度で阻
害し、他のIIIB、IIIRF株感染細胞による細胞間感染は
阻害しなかった。すなわち、感染細胞による細胞間感染
阻害においてもIIIMN株特異的な中和抗体であることが
判明した。
ここでもμ5.5抗体はμ39.1抗体と同様にIIIMN株特異
的な中和活性を示すが、その中和活性はμ39.1抗体より
約４倍高い値を有し、IIIMN感染細胞による細胞間感染
を16μg/mの濃度で阻害する強力な中和抗体であるこ
とがわかる。
的な中和活性を示すが、その中和活性はμ39.1抗体より
約４倍高い値を有し、IIIMN感染細胞による細胞間感染
を16μg/mの濃度で阻害する強力な中和抗体であるこ
とがわかる。
発明の効果 本発明によるモノクローナル抗体をエイズの予防及び
治療に利用することが期待できる。
治療に利用することが期待できる。
第１図は本発明によるモノクローナル抗体（μ39.1及び
μ5.5）の種々のHIV変異株由来のgp120（アミノ酸303−
325,または308−329）合成ペプチドとの反応性を示す。
各抗体の初期濃度は500μg/mである。 第２図は本発明によるモノクローナル抗体（μ39.1及び
μ5.5）のHTLV−IIIMN感染細胞由来の外皮膜等蛋白質gp
120との反応性を示す。
μ5.5）の種々のHIV変異株由来のgp120（アミノ酸303−
325,または308−329）合成ペプチドとの反応性を示す。
各抗体の初期濃度は500μg/mである。 第２図は本発明によるモノクローナル抗体（μ39.1及び
μ5.5）のHTLV−IIIMN感染細胞由来の外皮膜等蛋白質gp
120との反応性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 審査官 高堀 栄二 (56)参考文献 特開 平２−160800（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−506561（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／9181（ＷＯ，Ａ１) 国際公開90／3984（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．144, Ｎｏ．４（1990．Ｆｅｂ．）ｐ．1257− 1262 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．144, Ｎｏ．12（1990．Ｊｕｎ．）ｐ．4641− 4647 ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒ ｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ. ３（1990．Ｍａｒ．）ｐ．307−316 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 16/10 C12P 21/08 C12N 5/20 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (2)
- 【請求項１】ハイブリドーマFERM P−11472またはハイ
ブリドーマFERM P−11594より産生されるモノクローナ
ル抗体であって、HTLV−IIIMNの外皮膜に存在し分子量
約12万ダルトンを有する糖蛋白質抗原gp120に結合する
ことができ、実質的にHTLV−IIIMNを中和することがで
き、そして以下の特性を有するモノクローナル抗体。： （ａ）IgG,κに分類され、 （ｂ）HTLV−IIIMNのgp120上のアミノ酸配列の第303〜3
25番目（YNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIG）に存在する少なく
とも一つのエピトープを認識する能力を有し、 （ｃ）HTLV−IIIMN以外の他のウイルス株または当該ウ
イルスの抗原決定基との結合性を示さず、 （ｄ）HTLV−IIIMN粒子の表面に結合することにより、
ウイルス粒子がCD4陽性細胞に感染することを阻止する
能力を有し、そして （ｅ）HTLV−IIIMNに感染した細胞の表面に結合するこ
とによって、感染細胞と非感染細胞とにより誘発される
合胞体形成を阻止する能力を有する。 - 【請求項２】特許請求の範囲第（１）項記載のモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマFERM P−11472ま
たはハイブリドーマFERM P−11594。
Priority Applications (6)
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|---|---|---|---|
| JP2188300A JP2989862B2 (ja) | 1990-07-02 | 1990-07-16 | モノクローナル抗体 |
| EP91110884A EP0465979B1 (en) | 1990-07-02 | 1991-07-01 | Anti HTLV-III (strain MN) monoclonal antibody |
| DE69128108T DE69128108T2 (de) | 1990-07-02 | 1991-07-01 | Monoklonaler Antikörper gegen HTLV-III (Stamm MN) |
| AT91110884T ATE159983T1 (de) | 1990-07-02 | 1991-07-01 | Monoklonaler antikörper gegen htlv-iii (stamm mn) |
| AU80107/91A AU641026B2 (en) | 1990-07-02 | 1991-07-01 | HIV monoclonal antibody |
| US08/253,030 US5712373A (en) | 1990-07-02 | 1994-06-02 | HIV monoclonal antibody specific for the HTLV-IIImn gp120 envelope glycoprotein |
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|---|---|---|---|
| JP2-175075 | 1990-07-02 | ||
| JP17507590 | 1990-07-02 | ||
| JP2188300A JP2989862B2 (ja) | 1990-07-02 | 1990-07-16 | モノクローナル抗体 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021085528A1 (ja) | 2019-10-29 | 2021-05-06 | 国立大学法人熊本大学 | 抗ｈｉｖ活性を有するｃｄ４ミミック化合物 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993004090A1 (en) * | 1991-08-22 | 1993-03-04 | Nissin Shokuhin Kabushiki Kaisha | Hiv immunotherapeutics |
| US5665569A (en) * | 1991-08-22 | 1997-09-09 | Nissin Shokuhin Kabushiki Kaisha | HIV immunotherapeutics |
| KR100266554B1 (ko) * | 1993-01-14 | 2000-09-15 | 사꼬 미쓰오 | 재조합항-hiv항체및그의제조방법 |
| CA2153165C (en) * | 1993-01-14 | 2003-05-06 | Hiroaki Maeda | Recombinant anti-hiv antibody and process for preparing the same |
| US6987096B1 (en) | 1995-04-27 | 2006-01-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antiviral proteins and peptides, DNA coding sequences therefor, and uses thereof |
| US7048935B2 (en) | 1995-04-27 | 2006-05-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Cyanovirin conjugates and matrix-anchored cyanovirin and related compositions and methods of use |
| US6193982B1 (en) | 1995-04-27 | 2001-02-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Anti-cyanovirin antibody with an internal image of gp120, a method of use thereof, and a method of using a cyanovirin to induce an immune response to gp120 |
| US5843882A (en) | 1995-04-27 | 1998-12-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antiviral proteins and peptides |
| US6428790B1 (en) | 1995-04-27 | 2002-08-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services | Cyanovirin conjugates and matrix-anchored cyanovirin and related compositions and methods of use |
| US6780847B2 (en) | 1995-04-27 | 2004-08-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Glycosylation-resistant cyanovirins and related conjugates, compositions, nucleic acids, vectors, host cells, methods of production and methods of using nonglycosylated cyanovirins |
| DE60221705T2 (de) | 2001-03-22 | 2008-06-05 | The United States of America, represented by the Secretary, Dept. of Health and Human Services, the Natl. Institutes of Health, Office of Technology Transfer | Glykosylierungsresistente cyanovirine und damit verbundene konjugate, zusammensetzungen, nukleinsäuren, vektoren, wirtszellen, herstellungsverfahren sowie verfahren zur verwendung nichtglykosylierter cyanovirine |
| US8722861B2 (en) | 2007-11-19 | 2014-05-13 | Kumamoto University | Monoclonal antibodies that bind to the V3 loop of HIV-1 gp120 |
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|---|---|---|---|---|
| DE3853779T2 (de) * | 1987-05-29 | 1995-09-07 | Baylor College Medicine | Hiv-1 neutralisierende monoklonale antikörper. |
| EP0339504A3 (en) * | 1988-04-26 | 1990-09-12 | The Du Pont Merck Pharmaceutical Company | Human immunodeficiency virus (hiv) env-coded peptide capable of eliciting hiv-inhibiting antibodies in mammals |
| AU640619B2 (en) * | 1988-10-03 | 1993-09-02 | Repligen Corporation | Hiv proteins and peptides useful in the diagnosis, prophylaxis or therapy of aids |
| WO1990015078A1 (en) * | 1989-06-05 | 1990-12-13 | Scott Charles F Jr | HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO HIV-1MN gp 120 |
-
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1991
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- 1991-07-01 DE DE69128108T patent/DE69128108T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-01 AT AT91110884T patent/ATE159983T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 AU AU80107/91A patent/AU641026B2/en not_active Ceased
Non-Patent Citations (3)
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| ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．３（１９９０．Ｍａｒ．）ｐ．３０７−３１６ |
| Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１４４，Ｎｏ．１２（１９９０．Ｊｕｎ．）ｐ．４６４１−４６４７ |
| Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１４４，Ｎｏ．４（１９９０．Ｆｅｂ．）ｐ．１２５７−１２６２ |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021085528A1 (ja) | 2019-10-29 | 2021-05-06 | 国立大学法人熊本大学 | 抗ｈｉｖ活性を有するｃｄ４ミミック化合物 |
Also Published As
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| AU641026B2 (en) | 1993-09-09 |
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| JPH04152893A (ja) | 1992-05-26 |
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| DE69128108D1 (de) | 1997-12-11 |
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| EP0465979A1 (en) | 1992-01-15 |
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