JP2996348B2 - グリコサミノグリカンから△▲上４▼―不飽和ウロン酸を分離するための方法 - Google Patents
グリコサミノグリカンから△▲上４▼―不飽和ウロン酸を分離するための方法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はグリコサミノグリカンからΔ４−不飽和ウロ
ン酸を分離するための新規方法に係る。
ン酸を分離するための新規方法に係る。
Δ４−不飽和ウロン酸を含有するグリコサミノグリカ
ン、グリコサミノグリカンで使用される所定の分解方法
で形成される。例えばヘパリンをヘパリンリアーゼで分
解する場合、分解はグリコサミン単位とウロン酸単位と
の間のグリコシド結合が破壊されるように行われ、新た
に形成された非還元未端中C4とC5との間に二重結合が形
成される。
ン、グリコサミノグリカンで使用される所定の分解方法
で形成される。例えばヘパリンをヘパリンリアーゼで分
解する場合、分解はグリコサミン単位とウロン酸単位と
の間のグリコシド結合が破壊されるように行われ、新た
に形成された非還元未端中C4とC5との間に二重結合が形
成される。
この型のフラグメントは天然には存在せず、患者に使
用すると免疫原性の可能性が増加する。従って、天然フ
ラグメントが得られるような方法で二重結合を除去する
ことが重要である。
用すると免疫原性の可能性が増加する。従って、天然フ
ラグメントが得られるような方法で二重結合を除去する
ことが重要である。
不飽和ウロン酸を除去するための方法は知られてい
る。従来方法の１例は、U.Ludwigsら［Biochem.J.（198
7），245,795］により記載されているようにΔ４−不飽
和ウロン酸を含有するグリコサミノグリカンを塩化第二
水銀で処理する方法である。この方法は、毒性の水銀化
合物を使用しなければならず、最終生成物中に微量の水
銀が残留するのを確実に避けることはできず、従って、
これらの生成物を人体に投与するのは不適当であるとい
う欠点がある。
る。従来方法の１例は、U.Ludwigsら［Biochem.J.（198
7），245,795］により記載されているようにΔ４−不飽
和ウロン酸を含有するグリコサミノグリカンを塩化第二
水銀で処理する方法である。この方法は、毒性の水銀化
合物を使用しなければならず、最終生成物中に微量の水
銀が残留するのを確実に避けることはできず、従って、
これらの生成物を人体に投与するのは不適当であるとい
う欠点がある。
Δ４−不飽和ウロン酸を、例えばFlavobacterium Hep
arinum複合体中に存在するグルクロニダーゼのような酸
素により分解して分離する方法も知られている。この方
法は、どのような型のグリコサミノグリカンもこの型の
酵素と反応するという訳ではないので、この方法の使用
は制限されるという欠点がある。更に、最終生成物から
酵素を除去するには多大な困難を伴い、また純粋な酵素
を得ることは困難且つ高価な方法である。
arinum複合体中に存在するグルクロニダーゼのような酸
素により分解して分離する方法も知られている。この方
法は、どのような型のグリコサミノグリカンもこの型の
酵素と反応するという訳ではないので、この方法の使用
は制限されるという欠点がある。更に、最終生成物から
酵素を除去するには多大な困難を伴い、また純粋な酵素
を得ることは困難且つ高価な方法である。
さて、グリコサミノグリカンをヨウ素溶液又は漂白剤
又はそれらの組み合わせで処理する方法は、既知の方法
の上記の欠点を伴うことなく、Δ４−不飽和ウロン酸を
グリコサミノグリカンから除去するための簡単で廉価で
有効且つ非毒性の方法であることが判明した。
又はそれらの組み合わせで処理する方法は、既知の方法
の上記の欠点を伴うことなく、Δ４−不飽和ウロン酸を
グリコサミノグリカンから除去するための簡単で廉価で
有効且つ非毒性の方法であることが判明した。
使用する方法は、Δ４−不飽和ウロン酸を含有するグ
リコサミノグリカンを適当な溶媒中でI2の溶液と反応さ
せることから成る。グリコサミノグリカンを漂白剤、例
えば過酸化水素のような過酸化物、又は過マンガン酸塩
又は過塩素酸塩などと反応させても同様の結果が得られ
る。この型の漂白反応はそれ自体知られており、例えば
米国特許第2830931号明細書に記載されている。場合に
よっては、Δ４−不飽和ウロン酸を含有するグリコサミ
ノグリカンをヨウ素溶液及び漂白剤の両方で処理すると
有利であり、特に二重結合を除去することが困難な場合
にこの方法を使用すると有利である。この場合、処理順
序は重要ではない。
リコサミノグリカンを適当な溶媒中でI2の溶液と反応さ
せることから成る。グリコサミノグリカンを漂白剤、例
えば過酸化水素のような過酸化物、又は過マンガン酸塩
又は過塩素酸塩などと反応させても同様の結果が得られ
る。この型の漂白反応はそれ自体知られており、例えば
米国特許第2830931号明細書に記載されている。場合に
よっては、Δ４−不飽和ウロン酸を含有するグリコサミ
ノグリカンをヨウ素溶液及び漂白剤の両方で処理すると
有利であり、特に二重結合を除去することが困難な場合
にこの方法を使用すると有利である。この場合、処理順
序は重要ではない。
Δ４−不飽和ウロン酸を含有するグリコサミノグリカ
ンはグリコサミノグリカンの分解により得られる。グリ
コサミノグリカンは複数又は単一のウロン酸−ヘキソサ
ミン単位を含む炭水化物、例えばヘパリン、ヘパラン硫
酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫
酸、K5抗原等であると理解される。
ンはグリコサミノグリカンの分解により得られる。グリ
コサミノグリカンは複数又は単一のウロン酸−ヘキソサ
ミン単位を含む炭水化物、例えばヘパリン、ヘパラン硫
酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫
酸、K5抗原等であると理解される。
分解は種々の方法で実施することができ、例えばヘパ
リンエステル類の塩基脱離により実施できるが、通常、
該グリコサミノグリカンは酵素により分解される。
リンエステル類の塩基脱離により実施できるが、通常、
該グリコサミノグリカンは酵素により分解される。
例えば、ヘパリンにはヘパリンリアーゼ、K5抗原には
K5リアーゼ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びデ
ルマタン硫酸の場合、コンドロイチナーゼAC又はABC、
ヘパラン硫酸にはヘパリチンリアーゼの酸素が使用され
る。
K5リアーゼ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びデ
ルマタン硫酸の場合、コンドロイチナーゼAC又はABC、
ヘパラン硫酸にはヘパリチンリアーゼの酸素が使用され
る。
適当な溶媒は、グリコサミノグリカン又はその塩及び
ヨウ素溶液及び／又は漂白剤が溶解する全ての溶媒であ
る。適当な溶媒は例えば、水、ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシド、アルコール及びその混合物であ
る。水溶液、特に水が好適である。必要に応じてヨウ素
を溶解するためにKIを加える。
ヨウ素溶液及び／又は漂白剤が溶解する全ての溶媒であ
る。適当な溶媒は例えば、水、ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシド、アルコール及びその混合物であ
る。水溶液、特に水が好適である。必要に応じてヨウ素
を溶解するためにKIを加える。
妥当な反応時間を得るためには、グリコサミノグリカ
ン:I2の重量比を1:10〜10:1とし、5:1〜2:1の比が好適
である。ヨウ素化反応は２〜９、好ましくは４〜５のpH
で実施される。
ン:I2の重量比を1:10〜10:1とし、5:1〜2:1の比が好適
である。ヨウ素化反応は２〜９、好ましくは４〜５のpH
で実施される。
５〜10、好ましくは7.5〜９のpH値でグリコサミノグ
リカン：漂白剤の重量比は約15:1〜1:5の間で選択され
る。
リカン：漂白剤の重量比は約15:1〜1:5の間で選択され
る。
Δ４−不飽和ウロン酸の分離は、NMRスペクトル中の
オレフィンシグナルの消失及びUV消衰の減少により首尾
よく追跡することができる。
オレフィンシグナルの消失及びUV消衰の減少により首尾
よく追跡することができる。
NMRスペクトル中では、δ約6.9±0.4ppmのシグナルが
二重結合の存在に決定的である。UVスペクトル中におい
て二重結合の量の減少は、220〜240nmの消衰の減少によ
り測定可能である。
二重結合の存在に決定的である。UVスペクトル中におい
て二重結合の量の減少は、220〜240nmの消衰の減少によ
り測定可能である。
ヨウ素処理及び／又は漂白の条件は、生成物が、二重
結合を含むグリコサミノグリカンを５％（NMRによる）
未満含有するように選択される。好ましくは、NMRによ
り決定されるΔ４−不飽和化合物の量は１％未満であ
る。
結合を含むグリコサミノグリカンを５％（NMRによる）
未満含有するように選択される。好ましくは、NMRによ
り決定されるΔ４−不飽和化合物の量は１％未満であ
る。
上記方法は、Δ４−不飽和ウロン酸を含有するあらゆ
る型のグリコサミノグリカンに適当である。該方法は特
定的にはヘパリンフラグメントに適当であり、特にヘパ
リナーゼ分解により得られるヘパリンフラグメントに特
に適当である。
る型のグリコサミノグリカンに適当である。該方法は特
定的にはヘパリンフラグメントに適当であり、特にヘパ
リナーゼ分解により得られるヘパリンフラグメントに特
に適当である。
この手順に従って得られる生成物は、特に血栓症、血
管形成、癌、AIDS及び免疫系疾患の治療に使用される、
望ましくない免疫作用のない医薬製剤の有効成分であ
る。この型の製造は例えばタブレット、ピル、坐剤、注
射剤、浸剤等の形態で腸内及び腸管外投与するのに適当
である。
管形成、癌、AIDS及び免疫系疾患の治療に使用される、
望ましくない免疫作用のない医薬製剤の有効成分であ
る。この型の製造は例えばタブレット、ピル、坐剤、注
射剤、浸剤等の形態で腸内及び腸管外投与するのに適当
である。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
実施例１ a.ヘパリンリアーゼによるヘパリン分解 200gのヘパリンを10の緩衝液（0.25M酢酸アンモニ
ウム、0.0025M酢酸カルシウム、pH＝5.5）に溶解した。
2000単位のヘパリンリアーゼをこの溶液に加えた。所望
の平均分子量の到達後、溶液を100℃に加熱し、100℃で
10分間維持することにより反応を停止した。次にヘパリ
ンを５％（w/w）NaCl及び80％（v/v）メタノールで沈澱
させた。こうして得られたヘパリンフラグメントは（4,
5−不飽和ウロン酸の）二重結合を有する。
ウム、0.0025M酢酸カルシウム、pH＝5.5）に溶解した。
2000単位のヘパリンリアーゼをこの溶液に加えた。所望
の平均分子量の到達後、溶液を100℃に加熱し、100℃で
10分間維持することにより反応を停止した。次にヘパリ
ンを５％（w/w）NaCl及び80％（v/v）メタノールで沈澱
させた。こうして得られたヘパリンフラグメントは（4,
5−不飽和ウロン酸の）二重結合を有する。
b.ヘパリンフラグメントのヨウ素処理 ヘパリンリンアーゼで分解したヘパリンを蒸留水（10
mg/ml）に溶解した。この溶液を1:1の比でヨウ素溶液
（5mg/mlのKI、3mg/mlのI2）と混合した。pHは0.1N HCl
で4.5に調整した。付にpHを0.1N NaOHで約６時間4.5に
維持した。混合物を一晩完全に反応させた。その後、上
記と同一の沈澱が起こった。
mg/ml）に溶解した。この溶液を1:1の比でヨウ素溶液
（5mg/mlのKI、3mg/mlのI2）と混合した。pHは0.1N HCl
で4.5に調整した。付にpHを0.1N NaOHで約６時間4.5に
維持した。混合物を一晩完全に反応させた。その後、上
記と同一の沈澱が起こった。
c.漂白 階段ｂから得られたヘパリンフラグメント1.5gを20ml
の蒸留水に溶解し、ケイソウ土床を通して過し、蒸留
水ですすすいだ。水溶液を合わせ（30ml）、80℃まで迅
速に加熱し、pHを8.0〜8.5に調整した。この熱溶液に0.
5mlの過マンガン酸ナトリウム溶液（40％w/v）を加え、
その後、溶液を30分間80℃に維持した。次に溶液を40℃
まで冷却した。形成された二酸化マンガンを0.45μｍフ
ィルターで過することにより除去し、液をpH6.5に
した。生成物を上記のように沈澱させた。NMRスペクト
ルにおけるδ6.0の吸収は処理前の吸収（内部標準吸収
δ2.0、Ｎ−アセチル）の＜１％であった。
の蒸留水に溶解し、ケイソウ土床を通して過し、蒸留
水ですすすいだ。水溶液を合わせ（30ml）、80℃まで迅
速に加熱し、pHを8.0〜8.5に調整した。この熱溶液に0.
5mlの過マンガン酸ナトリウム溶液（40％w/v）を加え、
その後、溶液を30分間80℃に維持した。次に溶液を40℃
まで冷却した。形成された二酸化マンガンを0.45μｍフ
ィルターで過することにより除去し、液をpH6.5に
した。生成物を上記のように沈澱させた。NMRスペクト
ルにおけるδ6.0の吸収は処理前の吸収（内部標準吸収
δ2.0、Ｎ−アセチル）の＜１％であった。
実施例２ 実施例1aに従って得られた酵素分解されたヘパリン
（100mg）を10mlの蒸留水に溶解し、溶液を10mlのKI/I2
溶液（0.012MのI2を含有する0.033MのKI溶液10ml）と混
合した。pHを4.5にし、0.1N NaOHでこの値に維持した。
20時間後、混合物を水で４倍に希釈し、QAE−Zetaprep
カートリッジ（ベット容積100ml）で精製した。吸着剤
を水洗し、3M NaClで溶離した。最後に、調製物を75％
メタノールで沈澱させた。NMRスペクトルにおいて、δ
6.0のピークは完全に消失した。
（100mg）を10mlの蒸留水に溶解し、溶液を10mlのKI/I2
溶液（0.012MのI2を含有する0.033MのKI溶液10ml）と混
合した。pHを4.5にし、0.1N NaOHでこの値に維持した。
20時間後、混合物を水で４倍に希釈し、QAE−Zetaprep
カートリッジ（ベット容積100ml）で精製した。吸着剤
を水洗し、3M NaClで溶離した。最後に、調製物を75％
メタノールで沈澱させた。NMRスペクトルにおいて、δ
6.0のピークは完全に消失した。
実施例３ 実施例1aに従って得られた酵素分解されたヘパリン
（500mg）を7mlの蒸留水に溶解し、0.45μｍフィルター
で過し、3mlの蒸留水ですすいだ。溶液を80℃まで迅
速に加熱し、pHを1N NaOHでpH8.5にし、その後、0.2ml
の40％（w/w）過マンガン酸ナトリウム溶液を加えた。
溶液を80℃、pHを約8.5に30分間維持した後、溶液を40
℃に冷却、形成されたMn2を0.45μｍフィルターで別
した。pHを6.5にし、４％（w/w）NaCl及び80％メタノー
ルを加えることにより、漂白したヘパリンフラグメント
を沈澱させた。NMRスペクトルにおいて、δ6.0のピーク
は消失した。
（500mg）を7mlの蒸留水に溶解し、0.45μｍフィルター
で過し、3mlの蒸留水ですすいだ。溶液を80℃まで迅
速に加熱し、pHを1N NaOHでpH8.5にし、その後、0.2ml
の40％（w/w）過マンガン酸ナトリウム溶液を加えた。
溶液を80℃、pHを約8.5に30分間維持した後、溶液を40
℃に冷却、形成されたMn2を0.45μｍフィルターで別
した。pHを6.5にし、４％（w/w）NaCl及び80％メタノー
ルを加えることにより、漂白したヘパリンフラグメント
を沈澱させた。NMRスペクトルにおいて、δ6.0のピーク
は消失した。
実施例４ 実施例1bに記載した方法と同様の方法で、ヘパリンか
ら得られた四糖（50mg）を総容量20ml中で60μmolのI2
及び120μmolのKIと共にインキュベーションした。pH4.
5で65時間後、混合物をSephadexG-10カラムで脱塩し、
その後、凍結乾燥した。NMRスペクトルにおいて、δ6.0
のピークは消失した。
ら得られた四糖（50mg）を総容量20ml中で60μmolのI2
及び120μmolのKIと共にインキュベーションした。pH4.
5で65時間後、混合物をSephadexG-10カラムで脱塩し、
その後、凍結乾燥した。NMRスペクトルにおいて、δ6.0
のピークは消失した。
実施例５ 実施例４に記載した方法と同様の方法で、大腸菌K5か
ら得られた49.9mgの四糖を60μmolのI2及び120μmolのK
Iで処理した。NMRスペクトルにおいて、δ5.7のピーク
は完全に消失した。
ら得られた49.9mgの四糖を60μmolのI2及び120μmolのK
Iで処理した。NMRスペクトルにおいて、δ5.7のピーク
は完全に消失した。
実施例６ コンドロイチナーゼABCで分解したデルマタン硫酸（7
mg）を1mlの蒸留水に溶解し、実施例１と同様に、1mlの
ヨウ素溶液（5mg/mlのKI及び3mg/mlのI2）で処理し、漂
白した。NMRセペクトルにおいて、δ6.0のピークは完全
に消失した。
mg）を1mlの蒸留水に溶解し、実施例１と同様に、1mlの
ヨウ素溶液（5mg/mlのKI及び3mg/mlのI2）で処理し、漂
白した。NMRセペクトルにおいて、δ6.0のピークは完全
に消失した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C08B 37/10 C07H 7/033
Claims (5)
- 【請求項１】Δ４−不飽和ウロン酸を含有するグリコサ
ミノグリカンをヨウ素溶液又は漂白剤又はそれらの組み
合わせで処理することを特徴とする、Δ４−不飽和ウロ
ン酸を含有するグリコサミノグリカンからΔ４−不飽和
ウロン酸を分離するための方法。 - 【請求項２】Δ４−不飽和ウロン酸を含有するグリコサ
ミノグリカンをヨウ素溶液で処理することを特徴とす
る、Δ４−不飽和ウロン酸を含有するグリコサミノグリ
カンからΔ４−不飽和ウロン酸を分離するための方法。 - 【請求項３】Δ４−不飽和ウロン酸を含有するグリコサ
ミノグリカンを漂白剤で処理することを特徴とする、Δ
４−不飽和ウロン酸を含有するグリコサミノグリカンか
らΔ４−不飽和ウロン酸を分離するための方法。 - 【請求項４】ヨウ素処理後にグリコサミノグリカンを漂
白するか、又は漂白後にヨウ素溶液で処理するこを特徴
とする請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項５】ヘパリンリアーゼ分解により得たヘパリン
フラグメントをヨウ素溶液及び／又は漂白剤で処理する
ことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載
の方法。
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|---|---|---|---|
| NL8900119 | 1989-01-19 | ||
| NL8900119A NL8900119A (nl) | 1989-01-19 | 1989-01-19 | Werkwijze voor het afsplitsen van (delta)4-onverzadigd uronzuur in glycosaminoglycaan fragmenten. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP2006219767A (ja) * | 2005-02-08 | 2006-08-24 | Univ Of Tsukuba | 製紙用化学パルプ中の不飽和ウロン酸の除去方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US3135660A (en) * | 1956-11-09 | 1964-06-02 | Riker Laboratories Inc | Method for purifying sulfated carbohydrates with oxidizing agents |
| US4239664A (en) * | 1978-10-31 | 1980-12-16 | Research Corporation | Anti-thrombogenic PVP-heparin polymer |
| US4826827A (en) * | 1979-10-05 | 1989-05-02 | Choay S.A. | Short chained oligosaccharides having biological properties, a process for making the same and the use thereof as drugs |
| US4322275A (en) * | 1980-01-10 | 1982-03-30 | Ionics Incorporated | Fractionation of protein mixtures |
| US4446314A (en) * | 1980-09-30 | 1984-05-01 | Cutter Laboratories, Inc. | Fractionation of heparin |
| DK196986D0 (da) * | 1986-04-30 | 1986-04-30 | Novo Industri As | Fremstilling af polysaccharider |
| SE8702254D0 (sv) * | 1987-05-29 | 1987-05-29 | Kabivitrum Ab | Novel heparin derivatives |
| NL8701342A (nl) * | 1987-06-09 | 1989-01-02 | Tno | Bifunctionele oligosacchariden alsmede daarvan afgeleide aktieve verbindingen. |
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1989
- 1989-01-19 NL NL8900119A patent/NL8900119A/nl not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-01-10 DE DE69017235T patent/DE69017235T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-10 DK DK90200059.5T patent/DK0379239T3/da active
- 1990-01-10 EP EP90200059A patent/EP0379239B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-10 ES ES90200059T patent/ES2071742T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-10 AT AT90200059T patent/ATE119168T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-01-17 US US07/466,161 patent/US5451668A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-18 JP JP2009462A patent/JP2996348B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
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| EP0379239A1 (en) | 1990-07-25 |
| DE69017235D1 (de) | 1995-04-06 |
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|---|---|---|---|
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