JP3014099B2

JP3014099B2 - 生物的材料、生物的材料の生産およびこの種の材料の治療への使用方法

Info

Publication number: JP3014099B2
Application number: JP63507716A
Authority: JP
Inventors: ダワイエ，ジャン‐ミッシェル; リューシエンセキンジエ，フィリップ; ジョゼマーゼイ，ゴンザーロ; リードショー，アラン
Original assignee: バイオジェンインコーポレイテッド
Priority date: 1987-08-26
Filing date: 1988-08-17
Publication date: 2000-02-28
Anticipated expiration: 2015-02-28
Also published as: ES2015348A6; JPH10327862A; ES2017274A6; SE8901342L; CA1341026C; IT8821743A0; KR0138919B1; AU2427288A; FR2621821A1; DE3855747D1; NZ225940A; ZA886251B; DK175837B1; IT1226855B; EP0341273B1; NL8820676A; BE1002375A3; GB8912533D0; GB2220662A; DK203189A

Description

【発明の詳細な説明】発明の技術分野本発明は、インターロイキン１活性を選択的に阻害す
るインターロイキン１阻害剤（IL−１ INH）に関す
る。また、本発明は、尿からこの種のIL−１ INHを精
製する方法、およびこの阻害剤をコードするDNA配列か
らなる組換えDNA分子で形質転換された宿主によってこ
の種のIL−１ INHを生産する方法に関し、この種のIL
−1INHを特徴とする処置方法および組成物に関する。こ
れらの方法および薬剤は、免疫抑制および抗炎症の用途
および治療に有用である。

背景技術インターロイキン１（IL−１）は、主としてマクロフ
ァージ／単球系統の細胞によって生産される蛋白質サイ
トカインである。IL−１ポリペプチドをコードし得る２
つの別個のIL−１遺伝子が存在する−−IL−１αおよび
IL−１βである［ピー・オーロンら、「ヒト単球インタ
ーロイキン−１前駆体cDNAのヌクレオチド配列」、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,81,p.7909（1984）、シー・マー
チら、「２つの別個のヒトインターロイキン１全DNAα
およびβのクローン化、配列並びに発現」、Nature,31
5,p.641（1985）］。組換えIL−１αおよびβを使用す
るこれらそれぞれの生物活性の研究により、果たして、
双方の形態のIL−１は多様な生物活性を分け合うことが
示された。

IL−１は幾種かの独特の生物活性を有する。これらの
１つの活性−−リンパ球活性化因子（LAF）−−は、結
果的にIL−１に対し、免疫応答メディエータたるを与
え、かくして、IL−１は、多くの細胞型の成熟化、分化
並びに成長を刺激する。例えば、未成熟ＴおよびＢリン
パ球［ピー・オーロンら、Prco.Natl.Acad.Sci.USA,81,
上記］である。他のIL−１の活性−−単核細胞因子（MC
F）活性−−は、結果的にIL−１に対し、逆行的炎症応
答の制御における中心的役割を演ずることを与え［シー
・ディナレロ、「ヒトインターロイキン１の今日」、J.
Clin.Immun.,5,p.287（1985）］ると共に、かくして、I
L−１は、例えば繊維芽細胞および軟骨細胞のような幾
種かの細胞を刺激し、それぞれプロスタグランジンE
₂（PGE₂）およびコラーゲナーゼを生産する。これらの
応答は、リューマチ性関節炎のような併発疾患または組
織の崩壊に随伴する疾患の病因に包含される［ジェイ・
ダイヤー、「リューマチ性関節炎におけるサイトカイン
および他のメディエータ」、Spring Semin.Immunopath,
7,p.387（1984）］。更に、IL−１は、IL−２の生産を
誘導することが知られており［ジェイ・ダブリュ・ロエ
ンサールら、「胸腺腫細胞によるIL−２分泌およびIL−
２レセプタ発現双方のIL−１依存性誘導」、J.Imm.,13
7,pp.1226−1231（1986）］、これはＴ−細胞の増殖に
関する。最後に、IL−１は、内皮細胞上の分子を刺激し
て白血球細胞を捕獲することも知られている［ジェイ・
オッペンハイムら、「１つ以上のインターロイキン１が
存在する」、Immun.Today,7,p.45（1986）］。

したがって、抗原特異的Ｔ−細胞およびＢ−細胞増殖
を抑制すると共に繊維芽細胞によるプロスタグランジン
およびコラーゲナーゼ合成を抑制するIL−１阻害剤を同
定し単離することは興味深い。この種の化合物は、免疫
および炎症応答に関する疾患の処置に有用たり得る。な
お、更に、IL−１媒介IL−２生産を抑制し得るIL−１阻
害剤を単離することが望ましい。他の蛋白質を同時に阻
害することなくIL−１の活性を選択的に阻害する化合物
の同定には更に興味がある。例えば、TNF−αのような
腫瘍壊死因子であり、これは、IL−１の幾種かの生物的
特性を分け合う。すなわち、ヒト皮膚繊維芽細胞による
PGE₂およびコラーゲナーゼ生産［ジェイ・ダイヤーら、
「カケクチン／腫瘍壊死因子は、ヒト滑液細胞および皮
膚繊維芽細胞によるコラーゲナーゼおよびプロスタグラ
ンジンE₂生産を刺激する」、J.Exp.Med.,162,p.2163（1
985）］または繊維芽細胞増殖の誘導［ピー・セッキン
ガら、「インターロイキン１活性の尿の阻害剤は、イン
ターロイキン１αおよびβの双方に影響を与えるが、腫
瘍壊死因子αには影響を与えない」、J.Immun,139,p.15
41（1987）］である。

現在では、プロスタグランジンのようなIL−１に対し
て阻害効果を示すとして報告されている化合物は、主と
して非選択的阻害剤として作用する。熱性患者の尿は、
IL−１の20〜30kDの選択的阻害剤を含有することも報告
されている［ゼット・リアオら、「熱性患者の尿中の特
異的インターロイキン１阻害剤の同定」、J.Exp.Med.,1
59、p.126（1984）］。リアオは、この化合物が極めて
粗製の形態以外にあるか、または、これがIL−１のMCF
活性を阻害するか、標的細胞のレセプタへのIL−１の結
合を阻害するか、IL−１の存在下で繊維芽細胞の増殖を
阻害するかについては示唆していない。IL−１阻害効果
を有すると報告された第二の化合物［ダブリュ・アレン
ドら、「ヒト単球によるインターロイキンまたはインタ
ーロイキン１阻害剤の生産に対する免疫複合体の効
果」、J.Immun.,134,p.3868（1985）］は、付着免疫複
合体上で培養されたヒト単球によって生産される。しか
しながら、アレンドの報告は、この化合物がIL−１のLA
FおよびMCF活性の双方を阻害するか否かの点で不明瞭で
ある（第3874頁を参照するとよい）。いずれにしろ、ア
レンドによる報文は、この化合物が実質的に純粋が否
か、これがIL−１の標的細胞レセプタへの結合を遮断す
るか、またはIL−１の存在下で繊維芽細胞の増殖を阻害
するか否かについては報告していない。IL−１阻害効果
を有すると報告された第三の化合物［ジェイ−エフ・バ
ラボインら、「繊維芽細胞および滑液細胞によるプロス
タグランジンE₂およびコラーゲナーゼ生産は、尿より誘
導されたヒトインターロイキン１および阻害剤によって
制御される」、J.Clin.Invest.78,p.1120（1986）］
は、極めて粗製の形態であることが示唆され、その作用
様式は記述されていない。

発明の開示本発明は、実質的に純粋なIL−１阻害剤（「IL−１
INH」）を提供することにより前記した問題を解決す
る。これは、IL−１ LAFおよびIL−１ MCF活性を選択
的に阻害し、IL−２のIL−１媒介生産を阻害し、IL−１
媒介繊維芽細胞増殖を阻害し、標的細胞上でIL−１レセ
プタに結合し、免疫抑制または抗炎症組成物、方法並び
に治療に使用する。本発明によるIL−１ INHは、標的
細胞におけるPGE₂およびコラーゲナーゼのTNFα媒介生
産を阻害しない。よって、本発明のIL−１ INHは、免
疫抑制および抗炎症用途のための種々の組成物および方
法に有用である。本発明のIL−１ INHは、SDS/PAGE上
で約25kDの分子量とクロマトフォーカシングによって決
定された4.7の等電点とを有するポリペプチドであるこ
とを特徴とする。

これらのIL−１ INHを生産する本発明の方法の１つ
の態様は、天然起源からの精製である。この種の精製
は、熱性患者の粗製尿を濃縮し、尿から粗製IL−１ IN
Hを沈澱させ、１またはそれ以上のイオン交換クロマト
グラフ、疎水性クロマトグラフ、ゲル過並びに免疫吸
着によりこの沈澱物の他と蛋白質からIL−１ INHを分
画する工程からなる。

これらのIL−１ INHを生産する本発明の方法の第二
のおよび好適な態様は、この種の阻害剤の組換えによる
生産である。この種の方法では、本発明のIL−１ INH
をコードするDNA配列、これらの配列を特徴とする組換
えDNA分子並びにこれらのDNAにより形質転換された単細
胞宿主および分子を用いて、（付加的なＮ−末端メチオ
ニンを用いるか、用いることなく）本発明のIL−１ IN
Hまたはその一部を形質転換された宿主の醗酵により生
産する。IL−１ INH活性を示す本発明によるIL−１ I
NHポリペプチドは、IL−１ INHのアミノ酸配列に対す
る種々の他のアミノ酸置換、付加または欠失を包含し得
ることを理解すべきである。

本発明の他の目的は、本発明のIL−１ INHを用いて
活性IL−１ INH部位の分子構造および配置を決定し、
その情報を断片およびペプチドの設計に使用して、本発
明の免疫抑制または抗炎症組成物および方法へのIL−１
INHとしての使用を図ることである。

図面の簡単な説明第１図は、QAEセファロース工程により得られた尿のI
L−１ INHの活性プロフィールを示す。

第２図は、DEAEセファロース工程により得られた尿の
IL−１ INHの活性プロフィールを示す。

第３図は、AcA54過画分の尿のIL−１ INHの活性プ
ロフィールを示す。

第４図は、それぞれの精製工程後の尿のIL−１ INH
プールの投与−応答を示す。IL−1/LAFおよびIL−1/レ
セプタ結合アッセイにて測定したものである。

第５図は、IL−1/LAFアッセイにて測定したIL−１ I
NH活性を示す。

第６図は、IL−1/MCFアッセイにて測定したIL−１ I
NH活性を示す。

第７図は、IL−１ INHがhrTNFα−誘導PGE₂生産に影
響を与えないことを示す。

第８図は、IL−1/繊維芽細胞増殖アッセイにて測定し
たIL−１ INH活性を示す。

第９図は、それぞれの精製工程後のIL−１レセプタ結
合アッセイ、LAFアッセイ、EL−4/CTLLアッセイ並びにM
CFアッセイにて測定したIL−１ INH比活性を示す。

発明の詳細な説明ここに記載する発明が十分に理解されるべく、以下の
詳細な説明を記載する。

説明では、以下の用語を用いる： MCF−−「単核細胞因子」。IL−１の「MCF活性」が、
例えば繊維芽細胞、滑液細胞のような種々の標的細胞に
おけるプロスタグランジンＥおよびコラーゲナーゼ生産
を刺激するその能力を規定する。

LAF−−「リンパ球活性化因子」。IL−１の「LFA」活
性が、ＴおよびＢリンパ球の増殖および分化を刺激する
その能力を規定する。

CTLL−−「細胞毒性Ｔ−リンパ球細胞ライン」。CTLL
細胞をEL−４細胞と共にインキュベートし、EL−４細胞
によるIL−２の生産に対すIL−１の刺激効果をアッセイ
するのに使用した。その後IL−２は、CTLLXE細胞の増殖
を刺激するが、これは測定可能である。

本発明は、実質的に純粋なIL−１ INHに関する。本
発明により規定される「実質的に純粋な」IL−１ INH
は、主要な共存物質、特にアポリポ蛋白質A1およびレチ
ノール結合蛋白質を実質的に含有せず、SDS/PAGE上で単
一バンドとして移動する。

本発明のIL−１ INHは、IL−１ LAFおよびIL−１
MCF活性を選択的に阻害し、EL−４細胞によるIL−１媒
介IL−２生産を阻害し、IL−１媒介繊維芽細胞増殖を阻
害し、標的細胞上のIL−１レセプタに結合する。この種
の選択的阻害は、IL−１媒介活性をブロックする能力を
有するとして定義されるが、IL−１に類似する幾種かの
活性を有する他の化合物をブロックする能力を欠く。例
えば、ヒト組換えTNFα（hrTNFα）があるが、これはPE
G₂およびコラーゲナーゼ生産のメディエータである。こ
の特異性は、免疫系の他のメディエータの必要な活性を
妨害することなくIL−１を選択的にブロックするのに重
要な因子である。本IL−１ INHのこの特異性を、IL−
１の活性に対する本発明のIL−１ INHの効果をhrTNFα
と比較することにより示し、IL−1/MCFおよび繊維芽細
胞増殖アッセイを使用する。

最も好適には、本発明のIL−１ INHはSDS−PAGE上で
約25kDの分子量を有し、クロマトフォーカシングによる
測定として4.7の等電点を有する。

本発明のIL−１ INHは、LAFアッセイ、MCFアッセ
イ、EL−4/細胞毒性Ｔ−リンパ球アッセイ（「EL−4/CT
LL」）並びに繊維芽細胞増殖アッセイにおいてIL−１媒
介応答を阻害し得る。IL−1/LAFアッセイにおいては、I
L−１αまたはβ誘導Ｔ−細胞増殖の阻害を、種々に希
釈した本発明のIL−１ INHの存在下で［H³］チミジン
の取り込みのレベルの減少を検出することにより測定す
る。IL−1/MCFアッセイにおいては、IL−１媒介PGE₂生
産の阻害を、種々に希釈した本発明のIL−１ INHの存
在下でPGE₂に対する抗血清を使用する二重抗体ラジオイ
ムノアッセイにより測定する。ラジオイムノアッセイに
より検出される培地へのPGE₂の減少は、IL−１ INH活
性を示す。EL−4/CTLLアッセイにおいては、IL−１媒介
IL−２生産の阻害を、種々に希釈した本発明のIL−１
INHの存在下で測定する。阻害は、CTLL細胞の増殖の測
定として使用する［H³］チミジン（［H³］−TdR）の取
り込みのレベルの減少として観察する。増殖は、投与−
応答様式でIL−２を誘導するIL−１の存在下でのみ生起
する。繊維芽細胞増殖アッセイにおいては、IL−１誘導
繊維芽細胞による［H³］−TdRの取り込みの阻害を、種
々に希釈した本発明のIL−１ INHの存在下で測定す
る。

前記したように、本発明のIL−１ INHは、標的細胞
上でIL−１レセプタに特異的に結合する。この結合は、
一連のIL−１結合アッセイを使用することにより示され
る。第一に、ラベルしたIL−１の結合に際し、標的細胞
上のレセプタに対するIL−１ INHの増加する濃度の効
果を測定した。高濃度のIL−１ INHは、結合したラベ
ルIL−１の量を減少させることを認めた。次に、過剰の
非ラベルのIL−１ INHを添加し、標的細胞に結合した
ラベルしたIL−１に対するその過剰の効果を観察した。
このアッセイは、過剰のIL−１ INHは、標的細胞の表
面に結合したラベルしたIL−１と成功裡に競合し置換す
ることを示した。更に、過剰のレチノール結合蛋白質を
添加し、これが、標的細胞に対するIL−１ INHの結合
を妨害しないことを観察した。このアッセイは、本IL−
１ INHがIL−１と特異的に競合して標的細胞上でIL−
１レセプタに結合することを示した。

本発明は、天然起源（例えば高度熱性患者または日和
見感染に罹患したAIDS患者）から本発明のIL−１ INH
の単離する精製方法にも関する。この方法は幾種かの工
程からなる。一般に、これらの工程の概要は、（１）尿
を濃縮し、（２）濃縮した尿から粗製IL−１ INHを沈
澱させると共に、少くともイオン交換クロマトグラフ、
疎水性クロマトグラフ、ゲル過並びに免疫吸着の１つ
によりこの沈澱物の他の蛋白質からIL−１ INHの分画
するものである。

この方法の好適な態様では、標準的手順、例えば限外
過を使用して熱性患者から粗製尿をまず濃縮する。次
に、硫酸アンモニウムを使用してこの濃縮した尿のプー
ルからIL−１ INHを含有する粗製画分を沈澱させた。
透析により硫酸アンモニウムを除去した後、イオン交換
クロマトグラフを使用して他の蛋白質からIL−１ INH
活性を含有する画分を分離する。特に、この最も好適な
態様では、２つの陰イオン交換樹脂−−ジエチル−（２
−ヒドロキシプロピル）アミノエチルセファロース
（（QAE）−セファロースカラム）およびジエチルアミ
ノエチル−セファロースカラム（（DEAE）−セファロー
スカラム）−−を単独または組合せて用いるが、好まし
くはDEAEセファロースカラムをQAEセファロースカラム
の後とする。種々の画分の活性を監視すべく、LAFおよ
びレセプタ結合アッセイを用いた。本発明のこの態様で
は、IL−１ INH活性画分を次に、ゲル過を使用する
分子量に基いて分画し（最も好ましくはAcA54ゲルによ
る）、前記したようにして再度活性画分を選択する。選
択された画分は、約25kDの分子量および少くとも90％の
蛋白質含量を示すことを特徴とする。主要な共存物は、
アポリポ蛋白質A1およびレチノール結合蛋白質である。
これらの共存物は種々の方法によって除去し得るにも拘
らず、好ましくは、免疫吸着の方法により、アポリポ蛋
白質およびレチノール結合蛋白質に対して与えられたモ
ノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる。

前記IL−１ INH活性画分を、フェニル−セファロー
スカラム（これは蛋白質をその疎水性によって分画す
る）上での疎水性クロマトグフによって更に精製する。
例えば、アポリポ蛋白質A1およびレチノール結合蛋白質
は、本発明の蛋白質より疎水性であり、したがってカラ
ム上に保持される。

前記説明した好適な方法を使用し、本発明のIL−１
INHの比活性、すなわち、最大の半分の阻害を与えるの
に必要なIL−１ INHの量は、それぞれの精製工程の後
に増加した。第９図を参照するとよい。IL−１レセプタ
結合アッセイ、LAFアッセイ、EL−4/CTLLアッセイ並び
にMCFアッセイを使用してこの比活性を測定した。しか
しながら、幾種かの他のアッセイも同様に使用し得る。

前記方法または好適な方法で精製したIL−１ INH
は、本発明の免疫抑制および抗炎症組成物並びに方法に
直接使用し得る。しかしながら、寧ろこの種の精製蛋白
質をアミノ酸配列データの供給源として使用してDNAプ
ローブの設計を可能とし、本発明のIL−１ INHをコー
ドするDNA配列の単離および選択への使用を図った。そ
の後、この種のDNA配列、これらを含む組換えDNA分子、
並びにこれらにより形質転換された単細胞宿主を用い
て、実質的に他のヒト蛋白質を含有しない本発明のIL−
１ INHを大量に生産し、本発明の組成物および治療へ
の使用を図った。

更に詳しくは、精製したIL−１ INHの種々の蛋白質
および断片のアミノ酸配列を決定した。その後、これら
の配列およびこれらをコードするとして推論されたDNA
配列を使用し、本発明のIL−１ INHをコードするDNA配
列の種々のDNAライブラリをスクリーニングするのに潜
在的に有用な一連のDNAプローブを設計する。この種の
ライブラリには、染色体遺伝子バンクおよびDNAまたは
本発明のIL−１ INHを生産することが示される組織ま
たは細胞ラインから調製されたcDNAライブラリが包含さ
れ、この種の細胞ラインには、当業界でよく知られた単
球細胞が包含される。

cDNAを調製し、最終的にIL−１ INHポリペプチドを
クローン化し発現させる手段として、IL−１ INH生産
細胞供給源からポリA⁺mRNAを単離する。例えば、刺激さ
れたマクロファージである。従来の手順を使用するが、
例えば、次に記載されたものとする。ランドら、「真核
mRNAの５−末端配列は高い効率でクローン化し得る」、
Nucleic Acid Research,9,pp.2251−66（1981）、オカ
ヨマとベルグ、「全長さcDNAの高効率クローン化」、Mo
l.and Cell.Biol.,2,pp.161−70（1982）、並びにマニ
アティスら、「Molecular Cloning」中（コールド・ス
プリング・ハーバ・ラボラトリ編、コールド・スプリン
グ・ハーバ、ニューヨーク）、pp.229−46（1982）。次
に、前記単離されたポリA⁺mRNAからcDNAライブラリを構
成する。従来の手順を使用するが、例えば次に記載され
たものとする。ウィケンスら、「リゾチーム、オボムコ
イト並びにオーバルヒューマンmRNAに相補的な二本鎖DN
Aの合成」、J.Biol.Chem.,253,pp.2483−95（1978）、
マニアティスら、「Molecular Cloning」中（コールド
・スプリング・ハーバ・ラボラトリ編、コールド・スプ
リング・ハーバ、ニューヨーク）、pp.229−46（198
2）、並びにブイ・グブラら、「cDNAライブラリを作製
する単純かつ極めて効率的な方法」、Gene,25,pp.263−
69（1983）。

特定の組換えDNA分子を含有するもの、すなわち、IL
−１ INH挿入物を含有するもののクローンのライブラ
リをスクリーニングする幾種かのアプローチが存在す
る。例えば、本精製IL−１ INHの部分アミノ酸配列を
基礎とし、本発明のIL−１ INHの選択部分をコードす
る一連の合成DNA断片からなるDNAプローブを構成するこ
とができる。アミノ酸配列を決定する技術は、当業界で
よく知られている。IL−１ INHの種々の領域のアミノ
酸配列を決定したならば、縮退IL−１ INHプローブの
プールを化学的に合成し得るが、従来のホスホアミドDN
A合成技術を使用し、種々のDNAライブラリのスクリーニ
ングへの使用を図り、ハイブリダイゼーションにより関
連するDNA配列を選択する。その後、³²P−ATPおよびT4
ポリヌクレオチドキナーゼを使用して³²PによるDNAプロ
ーブの５′エンドラベルを行う。主として、エー・エム
・マキサムとダブリュ・ギルバート、「DNA配列決定の
新しい方法」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,pp.560−64
（1977）によって記載されている。その後、これらのDN
Aプローブを使用し、cDNAまたは染色体ライブラリのス
クリーニングを行う。例えば、単球白血球細胞ラインU9
37、THP−Ｉ並びにHL60であり、従来の方法を使用し、
本発明のIL−１ INHをコードするDNA配列について行
う。その後、これらの選択された配列を加工して、これ
らにより形質転換された原核および真核宿主におけるIL
−１ INHの発現を図るが、当業界でよく知られた技術
による。また、これらは、哺乳動物IL−１ INHをコー
ドする他の関連するDNA配列を選択するスクリーニング
のプローブとしても有用である。

本発明のDNA配列およびDNA分子は、広範な宿主／ベク
タの組合せを使用して発現し得る。例えば、有用なベク
タは染色体、非染色体並びに合成DNA配列の断片よりな
り、例えば、SV40の種々の公知誘導体および公知細菌プ
ラスミド、例えば、colE1、pCR1、pBR322、pMB9並びにR
P4;ファージDNA、例えば、ファージの種々の誘導体、例
えば、NM989、および他のDNAファージ、例えば、M13、
および他の線状一本鎖DNAファージ;2μプラスミドのよ
うな酵母に有用なベクタ；真核細胞に有用なベクタ、例
えば、動物細胞に有用なベクタ、例えば、SV−40アデノ
ウィルスを含有するものおよびレトロウィルス誘導DNA
配列並びにプラスミドおよびファージのDNAの組合せか
ら誘導されたベクタ、例えば、ファージDNAまたはその
誘導体を用いるように改変されたプラスミドである。

この種の発現ベクタも、少くとも１つの発現調節配列
を特徴とし、ベクタに挿入されたIL−１ INH DNA配列
を機能的に連結され、そのクローン化DNA配列の発現の
調節および制御を図る。有用な発現調節配列の例には、
lac系、trp系、tac系、trc系、ファージλの主要オペレ
ータおよびプロモータ領域、fdコート蛋白質の調節領
域、酵母の解糖系プロモータ、例えば、３−ホスホグリ
セレートキナーゼのプロモータ、酵母酸性ホスファター
ゼのプロモータ、例えば、Pho5、酵母α−交配因子のプ
ロモータ、並びにポリオーマ、アデノウィルス、レトロ
ウィルス、並びにシミアンウィルスから誘導されたプロ
モータ、例えば、初期および後期プロモータまたはSV4
0、並びに原核および真核細胞の遺伝子の発現を調節す
ることが知られている他の配列並びにそれらのウィルス
またはそれらの組合せがある。

この種の有用な発現ベクトルの内、真核宿主でのクロ
ーン化IL−１ INH DNA配列の発現を可能とするベクタ
が存する。例えば、動物およびヒト細胞［例えば、サザ
ーンとピー・ベルグ、J.Mol.Appl.Genet.,1,pp.327−41
（1982）、エス・サブラマニら、Mol.Cell.Biol.,1,pp.
854−64（1981）、アール・ジェイ・カウフマンとピー
・エー・シャープ、「モジュラ・ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ相補的DNA遺伝子により共感染された配列の増幅お
よび発現」、J.Mol.Biol.,159,pp.601−21（1982）、ア
ール・ジェイ・カウフマンとピー・エー・シャープ、Mo
l.Cell.Biol.,159,pp.601−64（1982）、エス・アイ・
スカヒルら、「チャイニーズ・ハムスター・オバリー細
胞におけるヒト免疫インターフェロンDNA遺伝子の産物
の発現と特徴」Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,80,pp.4654−
59（1983）、ジー・ウルラウブとエル・エー・チャシ
ン、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,77,pp.4216−20（198
0）］である。

更に、それぞれの特定の発現ベクタ内にて、本発明の
IL−１ INH DNA配列を挿入する種々の部位を選択し得
る。これらの部位は、これらを切断する制限エンドヌク
レアーゼにより通常は設計される。これらは、当業者に
よってよく認識されている。本発明に有用な発現ベクタ
は、選択されたDNA断片を挿入する制限エンドヌクレア
ーゼ部位を有する必要はないことを理解すべきである。
その代りに、このベクタは、他の手段によって断片に連
結し得る。この発現ベクタ、および特にその中で選択さ
れたDNA断片の挿入のために選択される部位並びにその
中の発現調節配列への機能的連結は、種々の因子により
決定される。例えば、特定の制限酵素に感受性の部位の
数、発現すべき蛋白質の大きさ、宿主細胞酵素による蛋
白質分解に対する所望の蛋白質の感受性、精製の途中で
除去するのが困難な宿主細胞蛋白質による共存または発
現すべき蛋白質への結合、発現特性、例えば、ベクタ配
列に関しての開始および停止コドンの位置、並びに当業
者によって認識される他の因子である。ベクトおよびDN
A配列の挿入部位の選択は、これらの因子のバランスに
よって決定され、必ずしも全ての選択が、与えられた場
合に対して等しく有効ではない。

有用な発現宿主には、周知の真核および原核宿主が包
含される。例えば、イー・コリの種、例えば、イー・コ
リSG−936、イー・コリHB101、イー・コリW3110、イー
・コリX1776、イー・コリX2282、イー・コリDHI、並び
にイー・コリMRC1、シュードモナス、枯草菌、例えば、
バシラス・サティリス（Bacillus subtilis）、ストレ
プトミセス、酵母並びに他の真菌類、動物、例えば、CO
S細胞およびCHO細胞、並びにヒト細胞並びに組織培養に
おける植物細胞である。

勿論、必ずしも全ての宿主／発現ベクタの組合せが、
本発明のDNA配列の発現に際し、または本発明のIL−１
INH様ポリペプチドの生産に際し、等しい効率で機能
するものではない。しかしながら、宿主／発現ベクタの
組合せの特定の選択は、本発明の範囲を逸脱することな
くここに記載した原理をすべからく熟考した後に当業者
によって為され得る。例えば、選択は、多数の因子のバ
ランスに基くべきである。これらには、例えば、宿主と
ベクタとの和合性、DNA配列によってコードされる蛋白
質の宿主に対する毒性、所望の蛋白質の回収の容易性、
DNA配列およびこれらに機能的に連結された発現調節配
列の発現特性、生物的安全性、コスト並びに折り畳み、
形態または他の全ゆる必要な所望の蛋白質の発現後改変
が包含される。

その後、本発明のDNA配列により形質転換された原核
または真核宿主の醗酵によって生産されるIL−１ INH
を、本発明の免疫抑制および抗炎症組成物並びに方法に
用いることができる。

また、本発明のIL−１ INHを分析してIL−１ INHの
活性を有する合成ペプチドが包含される断片またはペプ
チドを生産するこれらの活性部位を決定することもでき
る。この種の活性部位を決定する公知の方法の中には、
Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴、円偏光二色性、UV分光分析
並びに部位特異的突然変異がある。よって、これらの断
片およびペプチドも本発明の一部であり、その免疫抑制
または抗炎症標的並びに方法に用いることができる。

本発明のIL−１ INHポリペプチド、またはこれらか
ら誘導または合成されるか、またはこれらのアミノ酸配
列を使用するペプチド、またはこれらの塩または薬学的
に許容し得るこれらの誘導体の投与は、免疫抑制または
抗炎症活性を示す薬剤の投与について従来受け入れられ
た全ゆる方法を介して行うことができる。これらには、
経口、非経口、皮下、静脈内、病巣内または局所投与が
包含される。局所、病巣内または静脈内投与が好適であ
る。

これらの治療に使用される組成物も、種々の形態とし
得る。これらには、例えば、固体、準固体並びに液体投
与形態が包含され、例えば、タブレット、ピル、粉末、
液体溶液または懸濁液、座薬、注射および注入溶液があ
る。好適な形態は、意図する投与の様式並びに治療用途
に依存する。また、この組成物は、好ましくは、従来の
薬学的に許容し得るキャリヤを包含し、他の治療薬剤、
キャリヤ、アジュバント、賦形剤等、例えば、ヒト血清
アルブミンまたは血漿調製物を包含し得る。好ましく
は、本発明の組成物は、単位投与の形態とし、通常は１
日に１回以上投与する。

ここに記載した本発明がより十分に理解されるべく、
以下の実施例を記載する。これらの実施例は説明の目的
のためのみであり、如何なる様式においても、ここに記
載する特定の態様に本発明を限定すると解釈すべきでな
いことを理解すべきである。

実施例実施例1:IL−１ INHの精製ａ）ヒト尿由来の蛋白質の濃縮４℃にて、100リットルのプールした尿（尿感染症を
有さない高度熱性患者（＞38.5℃）由来）を用い、アミ
コン限外過ホロー・ファイバ装置により２リットルに
濃縮した。得られた溶液は、実施例２で記載するIL−１
レセプタアッセイによる測定で12U/mg蛋白質、実施例３
で記載するLAFアッセイによる測定で166U/mg蛋白質、実
施例４で記載するEL−4/CTLLアッセイによる測定で32U/
mg蛋白質、実施例５で記載するMCFアッセイによる測定
で125U/mg蛋白質の比活性を有していた。「Ｕ」または
単位、それぞれのバイオアッセイで最大の半分の阻害を
与えるIL−１ INH（μｇ）の量として定義する。第９
図を参照するとよい。

ｂ）ヒト尿由来の蛋白質の沈澱まず、固体硫酸アンモニウムを用いて、濃縮した尿の
プールを飽和させた。一定に攪拌しつつ４℃にて硫酸ア
ンモニウム飽和40％に達するまで硫酸アンモニウムを徐
々に添加することによった。次に、溶液から沈澱物を除
去したが、ソルバールRC−5B（イー・アイ・デュ・ポ
ン、ニュー・タウン、コーン）中での遠心分離により、
10,000rpmで１時間固定角GSAロータを使用した。次に、
ペレットを除去し、上澄を80％飽和硫酸アンモニウムに
調整し、10,000rpmで１時間遠心分離を行った。その
後、得られたペレットを、150mMのNaCl（650ml）を用い
20mMのリン酸ナトリウム（pH7.2）中に再懸濁した。そ
の後、この溶液を、10mMTris・HCl（pH8）、2mM EDTA並
びに5mMベンザミジンHClに対して24時間透析し、硫酸ア
ンモニウムを除去した。

ｃ）イオン交換クロマトグラフ次に、この合せた画分中のIL−１ INH活性を他の蛋
白質から分離したが、２つの異なる陰イオン交換樹脂に
対するIL−１ INHの強い結合親和力の使用を図ること
によった。それぞれの陰イオン交換樹脂を、単独または
組合せて用いたが、DEAEセファロースカラムは、好まし
くはQAEセファロースカラムの後とした。

１）ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチ
ル（QAE）セファロースカラム多数の陰イオン交換クロマトグラフ系が当業者によく
知られているが、最初にQAE−セファロースカラムの使
用を選択した。直径5cm×45cm（ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ、ピスカタウェイ、ニュー・ジャージ
ー）である。前記透析した溶液を装填した後、未結合蛋
白質が溶出されるまでカラムを洗浄した（280nmの光学
密度）。結合した蛋白質を溶出させた。カラムの４倍容
量の塩勾配を用い、平衡化緩衝液に溶解した０〜0.8MNa
Clとした。カラムの流速は、120ml/時間とした。種々の
画分の活性をモニタしたが、LAFおよびレセプタ結合ア
ッセイ（後記）を使用した。第１図を参照するとよい。
IL−１ INHの生物活性を示す画分は、150mMNaCl付近に
溶出された。合せた活性画分は、実施例２に記載するIL
−１レセプタ結合アッセイによる測定として33U/mg蛋白
質、実施例３に記載するLAFアッセイによる測定として6
3U/mg蛋白質、実施例４に記載するEL−4/CTLLアッセイ
による測定として27U/mg蛋白質、実施例５に記載するMC
Fアッセイによる測定として200U/mg蛋白質の比活性を有
していた。第９図を参照するとよい。

２）ジエチルアミノエチル（DEAE）セフアロースカラム活性なプールを10mMTris・HCl（pH7）に対して透析
し、DEAE−セルロース高流速カラム、2.5cm×30cm（フ
ァルマシア・ファインケミカルス、ピスカタウェイ、ニ
ュー・ジャージー）上に装填した。活性なプールを装填
したカラムを平衡化緩衝液（10mMTris・HCl、pH7）によ
り洗浄し、光学密度（280nMにおける）をほぼ０とし
た。その後、平衡化緩衝液に溶解した０〜0.2MNaCl勾配
により結合した蛋白質を溶出した。勾配は、カラムの容
量の10倍とした。カラムの流速は78ml/時間とした。ま
た、前記したように、種々の画分の活性をモニタした。
この溶出は、90mMNaCl洗浄工程の終りにIL−１ INH活
性を含有する画分の溶出を与えた。第２図は、DEAEセフ
ァロース上での尿のIL−１阻害剤の活性プロフィールを
示す。図中、阻害活性は、（Ａ）IL−1/LAFアッセイお
よび（Ｂ）IL−１レセプタ結合アッセイ（下記）に従っ
た。

次に、YM−10膜を使用するアミコン限外過装置によ
り活性プールを6mlに濃縮した。得られた溶液は、IL−
１レセプタ結合アッセイ（下記）による測定として50U/
mg蛋白質、LAFアッセイ（下記）による測定として125U/
mg蛋白質、EL−4/CTLLアッセイ（下記）による測定とし
て40U/mg蛋白質、MCFアッセイ（下記）による測定とし
て500U/mg蛋白質の比活性を有していた。第９図を参照
するとよい。

勿論、本発明の範囲を逸脱することなく、他の陰イオ
ン交換カラムも選択し得ることを理解すべきである。

ｄ）ウルトロゲルAcA54 次に、前記したように調製した濃縮物を２回分画した
が、ゲル過を使用する分子量によるものとした。多数
の適切なゲル過系が当業者によく知られているが、分
画範囲6000−70,000ダルトンを有するAcA54ゲル（LKB、
スウェーデン）の使用を選択した。また、前記したよう
に、画分の活性をモニタした。第３図を参照するとよ
い。得られた活性画分のプールは、IL−１レセプタ結合
アッセイ（下記）による測定として1666U/mg蛋白質、LA
Fアッセイ（下記）による測定として526U/mg蛋白質、EL
−4/CTLLアッセイ（下記）による測定として333U/mg蛋
白質、MCFアッセイ（下記）による測定として1110U/mg
蛋白質の比活性を有し（第９図を参照するとよい）、約
25kDの分子量を有していた。また、他の過系も使用し
得ることを理解すべきである。

第４図は、（Ａ）IL−1/LAFアッセイおよび（Ｂ）後
期するIL−1/レセプタ結合アッセイによる種々の尿IL−
１ INHプールの投与−応答（dose−responce）を示
す。それぞれの精製工程の後、すなわち、尿の濃縮、QA
E−セファロース、DEAE−セフアロース、並びにAcA54
（２回）の後、阻害を達成するのに必要なIL−１ INH
の濃度（μg/ml）は減少し、より純粋な蛋白質となるこ
とを示した。

ｅ）ネガティブ免疫吸着アミノ酸配列決定によりゲル過からの活性プールを
分析した。自動エドマン分解の従来の方法を使用し、少
くとも90％の蛋白質含量を示す２つの主要な共存物が、
アポリポ蛋白質AIおよびレチノール結合蛋白質であるこ
とを認めた。これらの蛋白質を除去するには種々の方法
が利用可能であるが、免疫吸着および疎水性クロマトグ
ラフを選択した。

よって、次に、主要な共存物をIL−１ INHのAcA54活
性プールから免疫吸着によって分離した。レチノール結
合蛋白質およびアポリポ蛋白質AIに対するモノクローナ
ルおよびポリクローナル抗体は、免疫化の標準的な方法
を使用して作製した。その後、イムノグロブリンGs（Ig
Gs）を40％流酸アンモニウム飽和を用いる沈澱により部
分精製した。IgGペレットを0.2Mのリン酸ナトリウムに
再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。次に、このIg
Gプールをビニルスルホン活性化アガロースと共役させ
た。製造者（KEN−EN−TEC、バイオテクノロジー・コー
プ、デンマーク）により記載されたように行った。免疫
吸着体を平衡化した後、リン酸塩緩衝塩類溶液を用い、
IL−１ INHプールからの共存物を吸着させた。このプ
ールに何回か免疫吸着体を通過させ、全ゆるレチノール
結合蛋白質およびアポリポ蛋白質AIが完全に吸着される
まで行うことにより、測定として、ナトリウム・ドデシ
ル硫酸−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAG
E）によった。得られた溶液は、IL−１レセプタ結合ア
ッセイ（下記）による測定として3334U/mg蛋白質、LAF
アッセイ（下記）による測定として2500U/mg蛋白質、EL
−4/CTLLアッセイ（下記）による測定として1250U/mg蛋
白質、MCFアッセイ（下記）による測定として2160U/mg
蛋白質の比活性を有し（第９図を参照するとよい）、SD
S/PAGE上で単一のピークを示した。

ｆ）フェニル−セファロース免疫吸着したIL−１阻害剤プールを1MNaClに調整し
（10mMTris・HCl pH7に溶解した１容の2MNaClを添加す
ることによった）、フェニルセファロース（0.5×5cm、
この樹脂はフォルマシア・ファイン・ケミカルス・スウ
ェーデンから得た）に装填した。樹脂は予め0.21MNaCl
を含有する10mMTris・HCl、pH7（平衡化緩衝液）を用い
て平衡化させた。装填後、３カラム容量の平衡を用いて
カラムを洗浄し、全ての未結合蛋白質を溶出させ、10mM
Tris・HCl、pH7に溶解した0.2MNaCl〜0Mの勾配により結
合して蛋白質を溶出させた。全勾配は、カラム容量の50
倍とした。カラムの流速は30ml/時間とした。IL−１阻
害剤活性は、0.160MNaCl付近で溶出され、25Kda M.W.の
蛋白質を与え、4.7のPIを有していた。得られた溶液
は、実施例２に記載するIL−１レセプタ結合アッセイに
よる測定として38461U/mg蛋白質、実施例３に記載するL
AFアッセイによる測定として2,500U/mg蛋白質、実施例
４に記載するEL−4/CTLLアッセイによる測定として35,0
20U/mg蛋白質、実施例５に記載するMCFアッセイによる
測定として30,303U/mg蛋白質の比活性を有し（第９図を
参照するとよい）、SDS/PAGE上で単一のピームを示し
た。

実施例2:IL−１ INHのレセプタ結合能力 EL−４−6.1標的細胞上のIL−１レセプタに対する本I
L−１ INHの結合特性を決定すべく、まず、標的細胞に
対する［¹²⁵I］−IL−１の結合によりIL−１ INHが妨
害されるか否かを見るべく試験を行った。¹²⁵Iを用いて
IL−１をラベルした。クロラミンＴ方法［ロウェンサル
ら、「Ｔ細胞によるインターロイキン−１の結合および
内面化」、J.Exp.Med.,164、p.1060］によった。これ
を、過剰の非ラベルIL−１ INHと共にインキュベート
し、その後、油勾配上で洗浄した。ガンマ・カウンタを
使用し、次に、細胞により保持された物質を測定し、IL
−１ INHの濃度の増加により、標的細胞の表面に結合
される［¹²⁵I］−IL−１の量が減少することを認めた。

更に試験を行い、IL−１ INHが、標的細胞への［¹²⁵
I］−IL−１ INHの結合を妨害するか否か、［¹²⁵I］−
IL−１ INHの結合が、非ラベルIL−１によって競合さ
れ得るか否か、標的細胞に対する［¹²⁵I］−IL−１ IN
Hの結合が、レチノール結合蛋白質またはアポリポ蛋白
質AIによって競合され得るか否かを見た。［¹²⁵I］を用
い、ボルトンとフンタの方法によってIL−１ INHをラ
ベルした［ボルトンとフンタ、「¹²⁵I含有アシル化剤と
の共役による蛋白質の高特異的放射能活性ラベル化」、
Biochem.J.,133,p.529（1973）］。この材料とEL−４−
6.1標的細胞とのインキュベートを行った後、油勾配上
で洗浄し、SDS PAGE上での分析を行い、約25kDの分子
種がEL−４細胞に結合することを認めた。過剰の非ラベ
ルIL−１ INHと共に［¹²⁵I］−IL−１ INHをインキュ
ベートすると、ラベルした25kD分子種の結合が妨害され
ることを認めた。また、［¹²⁵I］−IL−１−INHを50ナ
ノグラムの非ラベルIL−１βと共にインキュベートし、
これにより、ラベルした25kD分子種の結合が妨害される
ことを認めた。また、［¹²⁵I］−IL−１ INHを１μｇ
の免疫精製レチノール結合蛋白質および１μｇの組換え
アポリポ蛋白質AIと共にインキュベートし、これによ
り、ラベルした25kD分子種の結合が妨害されないことを
認めた。よって、ラベルしたIL−１ INH調製物中に存
在する25kD分子種は、インタクトのELP−１−6.1細胞の
表面に結合し、この結合は、非ラベルの阻害剤により、
また、IL−１により競合されるが、レチノール結合蛋白
質またはアポリポ蛋白質AIによっては競合されない。

実施例3:IL−1/LAFアッセイ C₃H/HeJマウスにおけるチモサイト（Ｔ−細胞）増殖
による測定として、IL−1/LAFアッセイにおけるIL−１
INHの阻害活性を示した［ジェイ・エム・ダイヤら、
「ヒト組換えIL−１は、ヒト滑液細胞によるコラーゲナ
ーゼおよびプロスタグランジンE₂の生産を刺激する」、
J.Clin Invest.,77.p.645（1986）］。PHA（１μg/ml）
を用いて72時間に渡りチモサイト（thymocyte）細胞を
共に刺激した。hrIL−１α［ピー・ウィングフィールド
ら、「イー・コリ中で発現したヒトインターロイキン−
１の精製および特徴」、「Eur.J.Biochem,165,p.537（1
987）］またはIL−１β［ピー・ウィングフィールド
ら、「イー・コリ中で発現したヒトインターロイキン−
１βの精製および特徴」、Eur.J.Biochem,160,p.491（1
986）］の存在下で、異なる終濃度（20pg/ml〜20,000pg
/mlの範囲）のhrIL−１とした。これを第５図に示す。
細胞に対し実施例１（ｅ）に由来するIL−１ INH画分
を添加した場合、共に刺激したhIL−１αまたはhIL−１
βチモサイトの増殖の完全な阻害を得た。阻害活性は、
IL−１ INHの３つの希釈、1/20、1/40並びに1/80でモ
ニタした。

hrIL−１非存在下でのPHA刺激細胞へのIL−１ INHの
添加は［H³］−TdRの取り込みに影響を与えないため、
阻害は、細胞毒性または非特異的効果によるものではな
く、IL−１の生物活性の阻害によるものであると決定し
た。

実施例4:EL−4/CTLLアッセイ IL−１ INHの阻害活性を決定した。EL−４細胞中でI
L−２の生産を誘導するIL−１αまたはIL−１βの能力
が阻害されるか否かを観察することによった［例えば、
エー・ジェイ・エッチ・ギヤリングら、「10³U/mlのIL
−２に応答しないIL−１についての単純な高感度バイオ
アッセイ」、J.Immun.Met.,99,p.7（1987）を参照する
とよい］。これは、周囲の培地からチミジンを取り込む
ことのできないEL−４細胞のサブクローンをCTLL−２細
胞と共に培養し、CTLL−２細胞が増殖するか否かを観察
することにより測定した。

EL−4.6.1c10細胞およびCTLL−２細胞を共に培養し、
マイクロタイタの穴（96穴プレート）当り10⁴のそれぞ
れの種類の細胞濃度とし、約１ピコグラム/mlのIL−１
αまたはIL−１βの存在下とし、実施例１（ｅ）に由来
するIL−１ INHを共存させた。共存培養の18時間後に
１ミクロキューリの［H³］−TdRを添加し、湿潤雰囲気
下にて37℃で６時間更にインキュベートした。MASH細胞
回収装置によりガラス・ファイバ・ストリップ上に細胞
を回収し、乾燥し、シンチレーション・カクテルを用い
て調製し、ベータ・カウンタ中でのカウントを図った。
1/20、1/40並びに1/80のIL−１ INHの希釈で、［H³］
−TdR取り込みの完全な阻害を得た。

実施例5:IL−1/MCFアッセイ更に、IL−1/MCFアッセイにおけるIL−１ INHの阻害
活性を示した。ヒト幼児包皮から得られた繊維芽細胞に
より測定した［ジェイ・ダイヤら、「リュウマチ性滑液
細胞によるコラーゲナーゼおよびプロスタグランジン放
出を刺激する因子の生産におけるマクロファージおよび
リンパ球の関与」、J.Clin.Invest.,64,p.1386（197
6）、ジェイ・ダイヤら、「リウマチ性滑液細胞におけ
るコラーゲナーゼおよびプロスタグランジンE₂刺激活性
により測定したヒトインターロイキン−1mRNAの誘
導」、Eur.J.Immunol.,14,p.898（1984）］。IL−1/LAF
アッセイと同様の濃度でhrIL−１αまたはhrIL−１βを
用いて繊維芽細胞を刺激し、IL−1/LAFアッセイと同様
の最終希釈で阻害活性をモニタした。72時間細胞を培養
した後、二重抗体ラジオイムノアッセイより繊維芽細胞
上澄におけるプロスタグランジンE₂生産を測定し［ジェ
イ・ダイヤ（1979）、上記］、プロスタグランジンE₂に
対する抗血清を使用した。第６図に示すように、hrIL−
１αまたはhrIL−１βのいずれによっても、100pg/mlの
濃度までプロスタグランジンE₂生産の投与応答を認め
た。実施例１（ｅ）に由来するIL−１ INH画分を添加
することによりこの生物活性を阻害することができた。
IL−１ INHは、hrIL−１αおよびhrIL−１βに対して
同様に有効であると決定した。

その後、hrIL−１をhrTNFα［エー・マーメノウト
ら、「THFの分子クローン化および発現並びにマウスのT
NFとの比較」、Eur,J.Biochem,152,pp.515−22（198
5）］と置換して前記アッセイを行った。TNFαも、プロ
スタグランジンE₂およびコラーゲナーゼ生産のメディエ
ータだからである。第７図に示すように、hrTNF誘導プ
ロスタグランジンE₂生産は、本IL−１ INHの添加によ
って顕著な影響を受けず、本IL−１ INHの特異性を示
した。

実施例6:繊維芽細胞増殖アッセイ更に、［H³］TdRの取り込みにより測定する繊維芽細
胞増殖アッセイを使用し、実施例１（ｅ）に由来するIL
−1 INHの存在下でIL−１の生物活性をアッセイした。1
0mM HEPES、ペニシリン100U/ml、ストレプトマイシン10
0μg/ml、１％グルタミン、１％非必須アミノ酸並びに
２％FCSを補填したイーグルのMEM中にて、ヒト包皮繊維
芽細胞を培養後、細胞を96穴プレート（2000細胞／穴）
に接種し、５％CO₂インキュベータ中にて37℃で24時間
培養した。培地を除去した後、hrIL−１αまたはhrIL−
１βを添加することにより繊維芽細胞を刺激し、前記ア
ッセイと同様の希釈でIL−１ INHを添加した。48時間
待機し、更に16時間［H³］TdRにより細胞をパルスし
た。細胞から培地を除去し、その後これをPBSを用いて
洗浄し、更に15分37℃にてトリプシン処理を行った。細
胞回収装置（スカトロン、リエル、ノルーウェイ）を用
い、ガラス・フィルタ（スカトロン、インコ、ステーリ
ング、バージニア、U.S.A.）上に細胞を集め、水で洗浄
し、風乾し、シンチレーション・カウンタを使用してcp
m取り込みを決定した。第８図に示すように、繊維芽細
胞の増殖は、hrIL−１αおよびhrIL−１βについて投与
依存性であった。250pg/mlのhrIL−１αまたはβを用い
て最大の［H³］TdRの取り込みを得た。AcA54阻害画分の
添加により、hrIL−１誘導増殖の完全な減少が得られ
た。また、IL−１濃度を増加させることにより、または
IL−１ INHを希釈することにより阻害の完全な遂行を
達成した。

また、hrTNFαを用いて繊維芽細胞を刺激することに
よりこの阻害の特異性を決定したが、これは、250pg/ml
の濃度まで投与依存性の様式で繊維芽細胞増殖を誘導し
た。AcA54阻害画分の添加によっては、hrTNFαの生物活
性の阻害は得られなかった。これにより、IL−１ INH
の特異性が確認された。

実施例7:等電点の決定実施例１（ｅ）から溶出された蛋白質のプールを使用
し、予め25mMのイミダゾール（pH7.5）で平衡化したPBE
クロマトフォーカシング（ファルマシア・ファイン・ケ
ミカル、スウェーデン）カラム（2.5×10cm）に装填し
た。ポリバッファ74HCl、pH4を添加した。これは結合蛋
白質の溶出を与えるが、その等電点に依存する。IL−１
INHのpIは4.7であると決定した。

本発明の多数の態様を前記したが、この基本的な構成
を改変して本発明の方法および組成物を利用する他の態
様を提供し得ることは明らかである。

したがって、本発明の範囲は、ここに記載する請求の
範囲によって規定され、例として示した特定の態様によ
らないことを銘記すべきである。

フロントページの続き (72)発明者セキンジエ，フィリップリューシエンスイス国、1227 カルージュ、リュージャックグロセラン４ (72)発明者マーゼイ，ゴンザーロジョゼスイス国、1201 ジュネーブ、リューネカール 11 (72)発明者ショー，アランリードスイス国、1227 ジュネーブ、ケデュシュバルブラン 19

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】IL−１ INHが、ヒト由来であり、SDS/PAG
Eにおいて単一バンドとして泳動され、アポリポ蛋白質
Ａおよびレチノール結合蛋白質を実質的に含まず、そし
てSDS PAGE上で約25,000ダルトンの分子量を有し、（ａ）IL−１のLAF活性の阻害活性を有し；（ｂ）IL−１のMCF活性の阻害活性を有し；（ｃ）IL−１媒介繊維芽細胞増殖に対する阻害活性を有
し；（ｄ）IL−１のIL−１受容体への結合阻害活性を有し；（ｅ）TNF媒介PGE₂およびコラゲナーゼ産生に対する阻
害活性を有さず；および（ｆ）IL−１媒介IL−２産生アッセイにて少なくとも1.
2×10³U/mgの比活性を有することを特徴とする実質的に純粋なIL−１ INH。
【請求項２】IL−１ INHが、クロマトフォーカシング
による等電点4.7を有することを特徴とする請求項１記
載のIL−１ INH。
【請求項３】IL−１ INHが、IL−１レセプタ結合アッ
セイで少なくとも3.8×10⁴U/mgの比活性を有することを
特徴とする請求項１記載のIL−１ INH。
【請求項４】IL−１ INHが、IL−1/LAFアッセイで少な
くとも6.2×10⁴U/mgの比活性を有することを特徴とする
請求項１記載のIL−１ INH。
【請求項５】IL−１ INHが、EL−4/CTLLアッセイで少
なくとも3.5×10⁴U/mgの比活性を有することを特徴とす
る請求項１記載のIL−１ INH。
【請求項６】IL−１ INHが、IL−1/MCFアッセイで少な
くとも3.0×10⁴U/mgの比活性を有することを特徴とする
請求項１記載のIL−１ INH。
【請求項７】薬学的に許容し得るベヒクル中に治療的に
有効な量の請求項１〜６のいずれか１項に記載のIL−１
INHを含む免疫抑制または抗炎症用薬学的組成物。