JP3062841B2 - ポリペプチド - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、哺乳動物の肝癌組織か
ら樹立された培養細胞が分泌する新規ポリペプチドに関
するものであり、肝臓疾患などに対する医薬品、または
その臨床検査試薬などの分野に利用可能である。
ら樹立された培養細胞が分泌する新規ポリペプチドに関
するものであり、肝臓疾患などに対する医薬品、または
その臨床検査試薬などの分野に利用可能である。
【０００２】
【従来の技術】ヒトの肝癌組織より樹立されたＨｕＨ−
７肝癌細胞株は無血清培地で増殖し、種々の血清蛋白質
を分泌することが知られている（中林など、キャンサー
・リサーチ(Cancer research) 、１９８２年、４２巻、
３８５８頁〜３８６３頁）。
７肝癌細胞株は無血清培地で増殖し、種々の血清蛋白質
を分泌することが知られている（中林など、キャンサー
・リサーチ(Cancer research) 、１９８２年、４２巻、
３８５８頁〜３８６３頁）。
【０００３】従来、肝癌細胞からの分泌蛋白質として
は、塩基性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を単離・精製
したことが報告されている。この蛋白質はヘパリン−セ
ファロースに強く結合し、１モル／リットル以上の濃度
の塩化ナトリウム水溶液で初めて溶離されるとある（Kl
agsbrun ら、プロシーディング・ナショナル・アカデミ
ック・サイエンス（Proceeding national academic sci
ence) 、１９８７年、８４巻、１８３９頁〜１８４３
頁）。
は、塩基性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を単離・精製
したことが報告されている。この蛋白質はヘパリン−セ
ファロースに強く結合し、１モル／リットル以上の濃度
の塩化ナトリウム水溶液で初めて溶離されるとある（Kl
agsbrun ら、プロシーディング・ナショナル・アカデミ
ック・サイエンス（Proceeding national academic sci
ence) 、１９８７年、８４巻、１８３９頁〜１８４３
頁）。
【０００４】また、酸性ＦＧＦがＨｕＨ−７細胞の増殖
を促すことがMckeehanによって報告されている。
を促すことがMckeehanによって報告されている。
【０００５】さらに、ヒト肝癌培養細胞ＨｕＨ−７細胞
株の培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、ヘ
パリンをリガンドとするアフィニティクロマトグラフィ
ーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを経て、部分的に
精製された細胞増殖因子が得られることが報告されてい
る（H.Nakamuraら、クリニカ・シミカ・アクタ（Clinic
a Chimica Acta）１９８９年、１８３巻、２７３〜２８
４頁）。
株の培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、ヘ
パリンをリガンドとするアフィニティクロマトグラフィ
ーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを経て、部分的に
精製された細胞増殖因子が得られることが報告されてい
る（H.Nakamuraら、クリニカ・シミカ・アクタ（Clinic
a Chimica Acta）１９８９年、１８３巻、２７３〜２８
４頁）。
【０００６】
【発明の解決しようとする課題】しかし、上記肝癌由来
細胞因子の更なる精製品は、未だ得られておらず、した
がってその構造も判明していない。
細胞因子の更なる精製品は、未だ得られておらず、した
がってその構造も判明していない。
【０００７】本発明は、ヒトの肝癌由来の細胞増殖活性
因子の精製品を提供し、もって肝臓疾患その他に対する
医薬品、またはその臨床検査試薬などの分野への実用化
に資することを目的とする。
因子の精製品を提供し、もって肝臓疾患その他に対する
医薬品、またはその臨床検査試薬などの分野への実用化
に資することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明によるポリペプチ
ドは、分子量が２万〜３万５千の範囲にあり、Ｎ末端か
ら２０残基が下記(1)(2)(3) のいずれかのアミノ酸配列
で構成されているものである。
ドは、分子量が２万〜３万５千の範囲にあり、Ｎ末端か
ら２０残基が下記(1)(2)(3) のいずれかのアミノ酸配列
で構成されているものである。
【０００９】配列(1) Ser Asn Asn Gln Lys Glu Tyr Lys Cys Gly Asp Leu Val Phe Ala Lys Met Lys Gly Tyr 配列(2) Ser Asn Asn Gln Lys Glu Tyr Lys Ser Gly Asp Leu Val Phe Ala Lys Met Lys Gly Tyr 配列(3) Ser Asn Asn Gln Lys Glu Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Val Phe Ala Lys Met Lys Gly Tyr
【００１０】上記アミノ酸配列を有する本発明ポリペプ
チドは、スイス３Ｔ３細胞に対し細胞増殖活性を有し、
該活性が下記(a)(b)(c)(d)のいずれかの処理で失活する
性質を有する。
チドは、スイス３Ｔ３細胞に対し細胞増殖活性を有し、
該活性が下記(a)(b)(c)(d)のいずれかの処理で失活する
性質を有する。
【００１１】(a) 熱処理、例えば１００℃、５分間の
熱処理(b) 還元試薬処理 、例えばジチオスライトールなどの
還元試薬処理(c) 酸溶液処理 、例えば１モル／リットルの酢酸溶液
処理(d) トリプシン水溶液処理 、例えば０．５ｍｇ／ミリ
リットルのトリプシン水溶液処理
熱処理(b) 還元試薬処理 、例えばジチオスライトールなどの
還元試薬処理(c) 酸溶液処理 、例えば１モル／リットルの酢酸溶液
処理(d) トリプシン水溶液処理 、例えば０．５ｍｇ／ミリ
リットルのトリプシン水溶液処理
【００１２】上記アミノ酸配列を有する本発明ポリペプ
チドは、ヒト肝癌培養細胞ＨｕＨ−７細胞株の培養上清
よりイオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンをリガン
ドとするアフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーの各精
製工程を順次経ることによって製造せられる。
チドは、ヒト肝癌培養細胞ＨｕＨ−７細胞株の培養上清
よりイオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンをリガン
ドとするアフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーの各精
製工程を順次経ることによって製造せられる。
【００１３】本発明によるポリペプチドはヒト肝癌由来
であり、次に述べるような細胞増殖活性を有するので、
以下ヒト肝癌由来増殖因子と呼び、ＨｕＨＧＦと略称す
る。本発明によるポリペプチドを製造するために、ま
ず、ヒトの肝癌組織より樹立されたＨｕＨ−７肝癌細胞
の培養上清からイオン交換クロマトグラフィー、ヘパリ
ンをリガンドとするアフィニティクロマトグラフィーお
よびゲル濾過クロマトグラフィーを用いてＨｕＨＧＦを
約１０００倍まで精製した。細胞増殖活性はスイス３Ｔ
３細胞で検定した。こうして精製した後のＨｕＨＧＦ
は、１〜２μｇ／ミリリットルの濃度でスイス３Ｔ３細
胞の増殖を促進した。ＨｕＨＧＦは熱および酸に不安定
でありかつトリプシン処理によって増殖活性を失った。
還元条件下でＨｕＨＧＦは完全に失活したので、ジスル
フィド結合が活性を維持するのに必要であることが示唆
された。
であり、次に述べるような細胞増殖活性を有するので、
以下ヒト肝癌由来増殖因子と呼び、ＨｕＨＧＦと略称す
る。本発明によるポリペプチドを製造するために、ま
ず、ヒトの肝癌組織より樹立されたＨｕＨ−７肝癌細胞
の培養上清からイオン交換クロマトグラフィー、ヘパリ
ンをリガンドとするアフィニティクロマトグラフィーお
よびゲル濾過クロマトグラフィーを用いてＨｕＨＧＦを
約１０００倍まで精製した。細胞増殖活性はスイス３Ｔ
３細胞で検定した。こうして精製した後のＨｕＨＧＦ
は、１〜２μｇ／ミリリットルの濃度でスイス３Ｔ３細
胞の増殖を促進した。ＨｕＨＧＦは熱および酸に不安定
でありかつトリプシン処理によって増殖活性を失った。
還元条件下でＨｕＨＧＦは完全に失活したので、ジスル
フィド結合が活性を維持するのに必要であることが示唆
された。
【００１４】上記ゲル濾過クロマトグラフィー後にドデ
シル硫酸ナトリウム存在下のポリアクリルアミド電気泳
動によって数本のタンパク質のバンドが見られたため、
更に逆相クロマトグラフィーを用いて精製を行なった。
その結果、上記電気泳動で単一バンドが得られ、分子量
は２万〜３万５千の間に見積られた。これらの結果は、
ＨｕＨＧＦが上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞
成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧ
Ｆ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）等とは異なる増殖因子で
あることを示唆している。ただし、ＨｕＨＧＦはヘパリ
ンに対しては親和性を有する。
シル硫酸ナトリウム存在下のポリアクリルアミド電気泳
動によって数本のタンパク質のバンドが見られたため、
更に逆相クロマトグラフィーを用いて精製を行なった。
その結果、上記電気泳動で単一バンドが得られ、分子量
は２万〜３万５千の間に見積られた。これらの結果は、
ＨｕＨＧＦが上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞
成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧ
Ｆ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）等とは異なる増殖因子で
あることを示唆している。ただし、ＨｕＨＧＦはヘパリ
ンに対しては親和性を有する。
【００１５】ＨｕＨＧＦのクロマトグラフィー等の溶出
挙動について説明する。Klagsbrunらは、上述の如く塩
基性ＦＧＦを肝癌細胞から単離・精製し、この蛋白質が
ヘパリン−セファロースに強く結合し、１モル／リット
ル以上の濃度の塩化ナトリウム水溶液で初めて溶離され
ることを報告している。これに対し、ＨｕＨＧＦは０．
６〜０．７モル／リットルの塩化ナトリウム水溶液でヘ
パリン−セファロースから脱離する。この結果より、Ｈ
ｕＨＧＦは塩基性ＦＧＦと異なることが判る。ＨｕＨＧ
Ｆの等電点は酸性側にあり、その点ではこれは酸性ＦＧ
Ｆに類似している。
挙動について説明する。Klagsbrunらは、上述の如く塩
基性ＦＧＦを肝癌細胞から単離・精製し、この蛋白質が
ヘパリン−セファロースに強く結合し、１モル／リット
ル以上の濃度の塩化ナトリウム水溶液で初めて溶離され
ることを報告している。これに対し、ＨｕＨＧＦは０．
６〜０．７モル／リットルの塩化ナトリウム水溶液でヘ
パリン−セファロースから脱離する。この結果より、Ｈ
ｕＨＧＦは塩基性ＦＧＦと異なることが判る。ＨｕＨＧ
Ｆの等電点は酸性側にあり、その点ではこれは酸性ＦＧ
Ｆに類似している。
【００１６】Mckeehanは上述のごとく酸性ＦＧＦがＨｕ
Ｈ−７細胞の増殖を促すことを報告しており、このこと
からもＨｕＨＧＦが酸性ＦＧＦに類似していることが示
唆される。しかし、酸性ＦＧＦの分子量は約１万７千で
あり、ヘパリン結合性もＨｕＨＧＦより若干強い。
Ｈ−７細胞の増殖を促すことを報告しており、このこと
からもＨｕＨＧＦが酸性ＦＧＦに類似していることが示
唆される。しかし、酸性ＦＧＦの分子量は約１万７千で
あり、ヘパリン結合性もＨｕＨＧＦより若干強い。
【００１７】逆相クロマトグラフィーによって精製した
単一バンドのアミノ酸配列を分析したところ、Ｎ末端か
ら２０残基のアミノ酸配列はこれまで報告されているポ
リペプチドの配列とは合致しなかった。すなわち、上記
ＨｕＨＧＦは新規なポリペプチドである。
単一バンドのアミノ酸配列を分析したところ、Ｎ末端か
ら２０残基のアミノ酸配列はこれまで報告されているポ
リペプチドの配列とは合致しなかった。すなわち、上記
ＨｕＨＧＦは新規なポリペプチドである。
【００１８】増殖因子のいくつかは臨床的診断や治療に
利用されている。たとえば、ＥＧＦは火傷の治療薬や角
膜損傷治療薬として期待されている。ＦＧＦ活性は膀胱
癌や腎癌の患者の尿中で上昇するという報告がある（Ch
odakら、キャンサー・リサーチ(Cancer research) 、１
９８８年、４８巻、２０８３頁〜２０８８頁）。ＰＤＧ
Ｆは軟骨の損傷治療や創傷治癒として開発中である。Ｔ
ＧＦ−アルファは癌患者の体液中でしばしば観察され、
その活性の強さは患者の生存率と相関するという報告が
ある。（Arteaga ら、キャンサー・リサーチ(Cancer re
search) 、１９８８年、４８巻、５０２３頁〜５０２８
頁）。ヒトエリスロポエチンは造血ホルモンとして貧血
の診断薬や腎臓透析による貧血の治療薬として知られて
いる。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子はガンの
化学療法や放射線治療による副作用や甲状線機能こう進
症に伴う顆粒球減少症の治療薬として期待される。
利用されている。たとえば、ＥＧＦは火傷の治療薬や角
膜損傷治療薬として期待されている。ＦＧＦ活性は膀胱
癌や腎癌の患者の尿中で上昇するという報告がある（Ch
odakら、キャンサー・リサーチ(Cancer research) 、１
９８８年、４８巻、２０８３頁〜２０８８頁）。ＰＤＧ
Ｆは軟骨の損傷治療や創傷治癒として開発中である。Ｔ
ＧＦ−アルファは癌患者の体液中でしばしば観察され、
その活性の強さは患者の生存率と相関するという報告が
ある。（Arteaga ら、キャンサー・リサーチ(Cancer re
search) 、１９８８年、４８巻、５０２３頁〜５０２８
頁）。ヒトエリスロポエチンは造血ホルモンとして貧血
の診断薬や腎臓透析による貧血の治療薬として知られて
いる。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子はガンの
化学療法や放射線治療による副作用や甲状線機能こう進
症に伴う顆粒球減少症の治療薬として期待される。
【００１９】同様に、本発明によるポリペプチドＨｕＨ
ＧＦも肝臓疾患を初めとして種々の診断や治療に役立つ
可能性を有する。肝実質細胞増殖因子は肝細胞の増殖因
子として知られているが、これはまた非Ａ非Ｂ型肝炎な
どの診断薬や肝細胞再生のための治療薬として期待され
ており、本発明によるＨｕＨＧＦもこの方面への応用が
期待される。
ＧＦも肝臓疾患を初めとして種々の診断や治療に役立つ
可能性を有する。肝実質細胞増殖因子は肝細胞の増殖因
子として知られているが、これはまた非Ａ非Ｂ型肝炎な
どの診断薬や肝細胞再生のための治療薬として期待され
ており、本発明によるＨｕＨＧＦもこの方面への応用が
期待される。
【００２０】
１．ＨｕＨＧＦの精製 (1)培養上清の調整 ＨｕＨ−７細胞（ＪＣＲＢ０４０３、財団法人がん研究
振興財団細胞バンク）を７５ｃｍ2 の細胞培養用平底フ
ラスコを用いて炭酸ガスインキュベーターで温度３７
℃、ＣＯ2 含有量５％の雰囲気下で培養した。使用した
培養液は下記表１に示したとおりである。
振興財団細胞バンク）を７５ｃｍ2 の細胞培養用平底フ
ラスコを用いて炭酸ガスインキュベーターで温度３７
℃、ＣＯ2 含有量５％の雰囲気下で培養した。使用した
培養液は下記表１に示したとおりである。
【００２１】
【表１】
【００２２】培養液は２日おきに交換し、交換時に培養
上清を集め、その後の精製を行なうまでこれを温度−３
０℃で保存した。サブカルチャーはトリプシン−ＥＤＴ
Ａで細胞を処理することにより実施した。
上清を集め、その後の精製を行なうまでこれを温度−３
０℃で保存した。サブカルチャーはトリプシン−ＥＤＴ
Ａで細胞を処理することにより実施した。
【００２３】 (2) クロマトグラフィーによるＨｕＨＧＦの精製 保存した培養上清５リットルを限外濾過装置（ＹＭ−５
メンブレン内装、アミコン社製）を用いて３００ミリリ
ットルに濃縮した。濃縮液を５０ミリモル／リットルの
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩酸塩緩衝
液（ｐＨ８．０に設定、以下この緩衝液をトリス緩衝液
と略す）で透析した。半透膜としてはセロファンチュー
ブ（分画分子量１２，０００〜１４，０００、ユニオン
カーバイド社製）を用いた。
メンブレン内装、アミコン社製）を用いて３００ミリリ
ットルに濃縮した。濃縮液を５０ミリモル／リットルの
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩酸塩緩衝
液（ｐＨ８．０に設定、以下この緩衝液をトリス緩衝液
と略す）で透析した。半透膜としてはセロファンチュー
ブ（分画分子量１２，０００〜１４，０００、ユニオン
カーバイド社製）を用いた。
【００２４】i) イオン交換クロマトグラフィー 透析後、イオン交換体としてＤＥＡＥ−セファロースＣ
Ｌ−６Ｂを充填したカラム（１．６×５０ｃｍ、ファル
マシア社製）を用いて、上記透析物のイオン交換クロマ
トグラフィーを行なった。すなわち、上記カラムに濃縮
液をアプライした後、４５０ミリリットルのトリス緩衝
液でカラムを十分に洗浄し、ついで吸着物を塩化ナトリ
ウムを含有するトリス緩衝液で溶離した。溶離法として
は、塩化ナトリウム濃度０〜０．６モル／リットルの範
囲で直線グラディエント溶離を行なった。溶出液を２ミ
リリットルずつの分画で集め、スイス３Ｔ３細胞に対し
て増殖活性を示す分画部分１２０ミリリットルを一緒に
し、次のアフィニティクロマトグラフィー工程に使用し
た。
Ｌ−６Ｂを充填したカラム（１．６×５０ｃｍ、ファル
マシア社製）を用いて、上記透析物のイオン交換クロマ
トグラフィーを行なった。すなわち、上記カラムに濃縮
液をアプライした後、４５０ミリリットルのトリス緩衝
液でカラムを十分に洗浄し、ついで吸着物を塩化ナトリ
ウムを含有するトリス緩衝液で溶離した。溶離法として
は、塩化ナトリウム濃度０〜０．６モル／リットルの範
囲で直線グラディエント溶離を行なった。溶出液を２ミ
リリットルずつの分画で集め、スイス３Ｔ３細胞に対し
て増殖活性を示す分画部分１２０ミリリットルを一緒に
し、次のアフィニティクロマトグラフィー工程に使用し
た。
【００２５】 ii) ペパリンアフィニティクロマトグラフィー 一緒にした上記活性分画を２，０００ミリリットルのト
リス緩衝液で上記半透膜を用いて透析した。得られた透
析物を、ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂを充填した
カラム（１．３×３．８ｃｍ、ファルマシア社製）にア
プライし、トリス緩衝液３６０ミリリットルでカラムを
洗浄した後、吸着物を０〜１．５モル／リットル塩化ナ
トリウム含有トリス緩衝液の直線グラディエントで溶離
した。溶出液を２ミリリットルずつの分画で集め、スイ
ス３Ｔ３細胞に対して増殖活性を示す分画部分１００ミ
リリットルを一緒にし、次のゲル濾過のクロマトグラフ
ィー工程に使用した。
リス緩衝液で上記半透膜を用いて透析した。得られた透
析物を、ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂを充填した
カラム（１．３×３．８ｃｍ、ファルマシア社製）にア
プライし、トリス緩衝液３６０ミリリットルでカラムを
洗浄した後、吸着物を０〜１．５モル／リットル塩化ナ
トリウム含有トリス緩衝液の直線グラディエントで溶離
した。溶出液を２ミリリットルずつの分画で集め、スイ
ス３Ｔ３細胞に対して増殖活性を示す分画部分１００ミ
リリットルを一緒にし、次のゲル濾過のクロマトグラフ
ィー工程に使用した。
【００２６】iii) ゲル濾過クロマトグラフィー 一緒にした上記活性分画を２，０００ミリリットルのト
リス緩衝液で上記半透膜を用いて透析した。得られた透
析物をセファデックスＧ−１５０を充填したカラム
（２．６×１００ｃｍ、ファルマシア社製）にアプライ
し、ゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。溶出液を
２ミリリットルずつの分画で集め、分子量が５万以下で
スイス３Ｔ３細胞に対して増殖活性を示す６０ミリリッ
トルの分画を一緒にし、次の逆相クロマトグラフィー工
程に用いた。
リス緩衝液で上記半透膜を用いて透析した。得られた透
析物をセファデックスＧ−１５０を充填したカラム
（２．６×１００ｃｍ、ファルマシア社製）にアプライ
し、ゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。溶出液を
２ミリリットルずつの分画で集め、分子量が５万以下で
スイス３Ｔ３細胞に対して増殖活性を示す６０ミリリッ
トルの分画を一緒にし、次の逆相クロマトグラフィー工
程に用いた。
【００２７】IV) 逆相クロマトグラフィー 一緒にした上記分画を前記の限外濾過装置によって１０
倍に濃縮し、濃縮物を逆相クロマトグラフィーに付し
た。逆相クロマトグラフィー条件は以下のとおりであ
る。使用したカラムはシリカ系の逆相カラム（コスモシ
ル５Ｃ−１８、４．６×１５０ｍｍ、半井テスク社製）
であり、溶離は濃度０〜５０重量％のアセトニトリルの
直線グラディエントで行なった。ただし、最初の１０分
間で０〜３０重量％、次の６０分間で３０〜５０重量％
の二段階でアセトニトリルの比率を増加させた。基本液
には０．１重量％トリフルオロ酢酸含有水を用いた。こ
のクロマトグラフィーは流速１ミリリットル／分で行な
い、分画は１ミリリットルずつ行なった。
倍に濃縮し、濃縮物を逆相クロマトグラフィーに付し
た。逆相クロマトグラフィー条件は以下のとおりであ
る。使用したカラムはシリカ系の逆相カラム（コスモシ
ル５Ｃ−１８、４．６×１５０ｍｍ、半井テスク社製）
であり、溶離は濃度０〜５０重量％のアセトニトリルの
直線グラディエントで行なった。ただし、最初の１０分
間で０〜３０重量％、次の６０分間で３０〜５０重量％
の二段階でアセトニトリルの比率を増加させた。基本液
には０．１重量％トリフルオロ酢酸含有水を用いた。こ
のクロマトグラフィーは流速１ミリリットル／分で行な
い、分画は１ミリリットルずつ行なった。
【００２８】こうして得られた各分画のＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動を実施した。その結果、分子量
３万付近に単一のタンパク質のバンドが見られた。スイ
ス３Ｔ３細胞に対する増殖活性の高い２２番目の分画を
以下のアミノ酸配列分析に用いた。
リルアミドゲル電気泳動を実施した。その結果、分子量
３万付近に単一のタンパク質のバンドが見られた。スイ
ス３Ｔ３細胞に対する増殖活性の高い２２番目の分画を
以下のアミノ酸配列分析に用いた。
【００２９】 ２．スイス３Ｔ３細胞に対する細胞増殖活性の測定 測定に用いた培養細胞は、大阪大学医学部の喜多野博士
より供与されたスイス３Ｔ３繊維芽細胞である。
より供与されたスイス３Ｔ３繊維芽細胞である。
【００３０】上記活性はスイス３Ｔ３細胞増殖能を測定
することにより求めた。すなわち、スイス３Ｔ３細胞を
９６ウェルのマイクロプレートに、１ウェル当り３×１
０3個の細胞を２００μリットルのＤＭＥ培養液（フロ
ーラボラトリー社製、１０容量％牛胎児血清（ＦＣＳ）
含有）に懸濁させたものをシードした。４８時間炭酸ガ
スインキュベーターで培養し（ＣＯ2 ：５％、温度３７
℃）、次に各ウェルとも濃度０．２容量％でＦＣＳを含
むＤＭＥ培養液２００μリットルで置換し、更に３６時
間培養を続けた。この状態でＨｕＨ−７培養上清のスイ
ス３Ｔ３細胞に対する細胞増殖活性をみるために、培養
上清または陽性コントロールとしてＦＣＳ、陰性コント
ロールとしてリン酸緩衝液で細胞を刺激した。１８時間
後に０．５μキューリーの 3Ｈチミジン（アメルシャム
社製）を各ウェルに加え、ＤＮＡに上記チミジンを３７
℃で６時間取り込ませ、その後ＤＮＡに取り込まれた 3
Ｈチミジンの放射活性を測定した。
することにより求めた。すなわち、スイス３Ｔ３細胞を
９６ウェルのマイクロプレートに、１ウェル当り３×１
０3個の細胞を２００μリットルのＤＭＥ培養液（フロ
ーラボラトリー社製、１０容量％牛胎児血清（ＦＣＳ）
含有）に懸濁させたものをシードした。４８時間炭酸ガ
スインキュベーターで培養し（ＣＯ2 ：５％、温度３７
℃）、次に各ウェルとも濃度０．２容量％でＦＣＳを含
むＤＭＥ培養液２００μリットルで置換し、更に３６時
間培養を続けた。この状態でＨｕＨ−７培養上清のスイ
ス３Ｔ３細胞に対する細胞増殖活性をみるために、培養
上清または陽性コントロールとしてＦＣＳ、陰性コント
ロールとしてリン酸緩衝液で細胞を刺激した。１８時間
後に０．５μキューリーの 3Ｈチミジン（アメルシャム
社製）を各ウェルに加え、ＤＮＡに上記チミジンを３７
℃で６時間取り込ませ、その後ＤＮＡに取り込まれた 3
Ｈチミジンの放射活性を測定した。
【００３１】刺激したサンプルに対してスイス３Ｔ３細
胞に取り込まれた放射活性を下記表２に示す。
胞に取り込まれた放射活性を下記表２に示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】＊培養上清ミリリットルあたりの蛋白質量
を示す。この蛋白質量は紫外線吸光法（ＵＶ２８０ｎ
ｍ）によって測定した。
を示す。この蛋白質量は紫外線吸光法（ＵＶ２８０ｎ
ｍ）によって測定した。
【００３４】上記各精製工程における細胞増殖活性も上
記と同様の方法で測定した。
記と同様の方法で測定した。
【００３５】 ３．ＨｕＨＧＦの種々の処理による活性の変化 ＨｕＨＧＦの性質を明らかにするために、これを以下の
ような試薬で処理した時にスイス３Ｔ３細胞に対する細
胞増殖活性がどのように変化するかを調べた。使用した
ＨｕＨＧＦは上記逆相クロマトグラフィーで精製したサ
ンプルである。このサンプルの活性を１００％とした
時、種々の試薬処理後の残存活性を下記表３に示す。
ような試薬で処理した時にスイス３Ｔ３細胞に対する細
胞増殖活性がどのように変化するかを調べた。使用した
ＨｕＨＧＦは上記逆相クロマトグラフィーで精製したサ
ンプルである。このサンプルの活性を１００％とした
時、種々の試薬処理後の残存活性を下記表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】４．アミノ酸配列分析 本発明による精製ＨｕＨＧＦを気相式シーケンサーにか
け、アミノ酸配列分析を２０サイクル行なった。シーケ
ンサーとしてはApplied Biosystems ４７７Ａ型を使用
し、ＰＴＨ−アミノ酸同定用としてApplied Biosystems
１２０Ａ型を使用した。その結果、Ｎ末端から２０残
基が下記配列表に示す配列番号(1)(2)(3) のいずれかの
アミノ酸配列で構成されていることが判った。
け、アミノ酸配列分析を２０サイクル行なった。シーケ
ンサーとしてはApplied Biosystems ４７７Ａ型を使用
し、ＰＴＨ−アミノ酸同定用としてApplied Biosystems
１２０Ａ型を使用した。その結果、Ｎ末端から２０残
基が下記配列表に示す配列番号(1)(2)(3) のいずれかの
アミノ酸配列で構成されていることが判った。
【００３８】このアミノ酸配列は、全く新規なものであ
る。
る。
【００３９】
【発明の効果】本発明によれば、ヒトの肝癌由来の細胞
増殖活性因子の精製品を提供することができ、もって肝
臓癌疾患その他に対する医薬品、またはその臨床検査試
薬などの分野への実用化に資することができる。
増殖活性因子の精製品を提供することができ、もって肝
臓癌疾患その他に対する医薬品、またはその臨床検査試
薬などの分野への実用化に資することができる。
【００４０】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント：Ｎ末端フラグメント 起源：ヒトの肝癌培養細胞 直接の起源：ＪＣＲＢＯ４０３、財団法人がん研究振興
財団細胞バンク 配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント：Ｎ末端フラグメント 起源：ヒトの肝癌培養細胞 直接の起源：ＪＣＲＢＯ４０３、財団法人がん研究振興
財団細胞バンク 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント：Ｎ末端フラグメント 起源：ヒトの肝癌培養細胞 直接の起源：ＪＣＲＢＯ４０３、財団法人がん研究振興
財団細胞バンク
財団細胞バンク 配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント：Ｎ末端フラグメント 起源：ヒトの肝癌培養細胞 直接の起源：ＪＣＲＢＯ４０３、財団法人がん研究振興
財団細胞バンク 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント：Ｎ末端フラグメント 起源：ヒトの肝癌培養細胞 直接の起源：ＪＣＲＢＯ４０３、財団法人がん研究振興
財団細胞バンク
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 中村 秀次 大阪府吹田市千里丘中４−２ (72)発明者 神戸 泰 兵庫県芦屋市翠ケ丘20−16 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/47 C12P 21/00 - 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 ヒト肝癌培養細胞ＨｕＨ−７細胞株の培
養上清よりイオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンを
リガンドとするアフィニティクロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー
の各精製工程を順次経て得られたポリペプチドであっ
て、 分子量が２万〜３万５千の範囲にあり、Ｎ末端から２０
残基が下記(1)(2)(3)のいずれかのアミノ酸配列で構成
され、 配列(1) Ser Asn Asn Gln Lys Glu Tyr Lys Cys Gly Asp Leu Val Phe Ala Lys Met Lys Gly Tyr 配列(2) Ser Asn Asn Gln Lys Glu Tyr Lys Ser Gly Asp Leu Val Phe Ala Lys Met Lys Gly Tyr 配列(3) Ser Asn Asn Gln Lys Glu Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Val Phe Ala Lys Met Lys Gly Tyrスイス３Ｔ３細胞に対し細胞増殖活性を有し、該活性が (a) 熱処理 (b) 還元試薬処理 (c) 酸溶液処理 (d) トリプシン水溶液処理 のいずれかの処理で失活する、ポリペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22315891A JP3062841B2 (ja) | 1991-09-03 | 1991-09-03 | ポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22315891A JP3062841B2 (ja) | 1991-09-03 | 1991-09-03 | ポリペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06220094A JPH06220094A (ja) | 1994-08-09 |
| JP3062841B2 true JP3062841B2 (ja) | 2000-07-12 |
Family
ID=16793703
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22315891A Expired - Fee Related JP3062841B2 (ja) | 1991-09-03 | 1991-09-03 | ポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3062841B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3455785B2 (ja) | 1993-06-04 | 2003-10-14 | 積水化学工業株式会社 | ヒト肝癌細胞由来増殖因子の遺伝子 |
-
1991
- 1991-09-03 JP JP22315891A patent/JP3062841B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3455785B2 (ja) | 1993-06-04 | 2003-10-14 | 積水化学工業株式会社 | ヒト肝癌細胞由来増殖因子の遺伝子 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06220094A (ja) | 1994-08-09 |
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