JP3104445B2 - 乳酸の測定装置及び測定方法 - Google Patents
乳酸の測定装置及び測定方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、固定化酵素を利用した
迅速かつ簡便な乳酸の測定装置と測定方法に関する。
迅速かつ簡便な乳酸の測定装置と測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】乳酸発酵は、従来より食品工業の分野で
広く利用されている。例えば微生物による乳酸発酵は乳
酸や乳飲料の生産だけでなく、チーズ、バター、清酒、
しょうゆ、みそ、漬物等の生産に利用されている。これ
らの乳酸発酵に用いられる微生物としては、乳酸菌と糸
状菌がある。このうち乳酸菌では菌種によって、Ｄ−乳
酸のみを生産するもの、Ｌ−乳酸のみを生産するもの、
Ｄ−乳酸とＬ−乳酸の混合物を生産するもの等が知られ
ており、発酵過程でのＤ−乳酸及びＬ−乳酸の測定は発
酵制御、コンタミネーションの発見等に欠かせないもの
である。
広く利用されている。例えば微生物による乳酸発酵は乳
酸や乳飲料の生産だけでなく、チーズ、バター、清酒、
しょうゆ、みそ、漬物等の生産に利用されている。これ
らの乳酸発酵に用いられる微生物としては、乳酸菌と糸
状菌がある。このうち乳酸菌では菌種によって、Ｄ−乳
酸のみを生産するもの、Ｌ−乳酸のみを生産するもの、
Ｄ−乳酸とＬ−乳酸の混合物を生産するもの等が知られ
ており、発酵過程でのＤ−乳酸及びＬ−乳酸の測定は発
酵制御、コンタミネーションの発見等に欠かせないもの
である。
【０００３】従来、Ｄ−乳酸の測定は、Ｄ−乳酸脱水素
酵素（以下Ｄ−ＬＤＨと略す）と補酵素ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略す）を用い
て、生成した還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（以下ＮＡＤＨと略す）もしくはピルビン酸を吸光
光度法、蛍光強度法で測定していた。しかし、この測定
法では、Ｄ−ＬＤＨの性質により様々な問題があった。
酵素（以下Ｄ−ＬＤＨと略す）と補酵素ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略す）を用い
て、生成した還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（以下ＮＡＤＨと略す）もしくはピルビン酸を吸光
光度法、蛍光強度法で測定していた。しかし、この測定
法では、Ｄ−ＬＤＨの性質により様々な問題があった。
【０００４】第１に、反応効率が低いため、実用的なレ
ベルでは必要とする酵素量が多過ぎて、分析コストが高
くなる。用いる酵素量を減少させるためには、反応時間
を長くしたり、反応温度を調節するという手段が考えら
れるが、さらに繁雑な操作や測定時間の延長等のマイナ
ス要因となっていた。第２点として、Ｄ−ＬＤＨの関与
する反応の平衡はＮＡＤＨとピルビン酸からＤ−乳酸を
生成する方向に傾いているため、全てのＤ−乳酸が変化
しつくす前に反応が停止してしまう。そのため生成した
ピルビン酸を、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼにより消費する等の手段が必要であり、反応工程が
複雑化するとともに分析コストが上昇していた。
ベルでは必要とする酵素量が多過ぎて、分析コストが高
くなる。用いる酵素量を減少させるためには、反応時間
を長くしたり、反応温度を調節するという手段が考えら
れるが、さらに繁雑な操作や測定時間の延長等のマイナ
ス要因となっていた。第２点として、Ｄ−ＬＤＨの関与
する反応の平衡はＮＡＤＨとピルビン酸からＤ−乳酸を
生成する方向に傾いているため、全てのＤ−乳酸が変化
しつくす前に反応が停止してしまう。そのため生成した
ピルビン酸を、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼにより消費する等の手段が必要であり、反応工程が
複雑化するとともに分析コストが上昇していた。
【０００５】また、Ｄ−乳酸のみでなく、Ｌ−乳酸も測
定する場合には、先ずＤ−乳酸を分析し、次にＤ−乳酸
と同様の測定をＬ−乳酸脱水素酵素（以下Ｌ−ＬＤＨと
略す）を用いて行う必要がある。そのため操作は複雑と
なり、測定時間、コストが２倍になる。さらに乳酸脱水
素酵素のみを用いる測定方法では、その反応の一般的検
出手段が反応により変化するＮＡＤもしくはＮＡＤＨの
紫外域における吸光度変化であり、試料の濁りや着色物
質の影響を受けやすいという欠点があった。
定する場合には、先ずＤ−乳酸を分析し、次にＤ−乳酸
と同様の測定をＬ−乳酸脱水素酵素（以下Ｌ−ＬＤＨと
略す）を用いて行う必要がある。そのため操作は複雑と
なり、測定時間、コストが２倍になる。さらに乳酸脱水
素酵素のみを用いる測定方法では、その反応の一般的検
出手段が反応により変化するＮＡＤもしくはＮＡＤＨの
紫外域における吸光度変化であり、試料の濁りや着色物
質の影響を受けやすいという欠点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、従来開
示されたＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定方法では、充分実用
的な測定方法とは言い難い。本発明は、Ｄ−ＬＤＨとＬ
−ＬＤＨの固定化体を用い、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の
２成分を短時間で精度良く簡便に測定することができる
測定装置および測定方法を提供することを目的とする。
示されたＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定方法では、充分実用
的な測定方法とは言い難い。本発明は、Ｄ−ＬＤＨとＬ
−ＬＤＨの固定化体を用い、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の
２成分を短時間で精度良く簡便に測定することができる
測定装置および測定方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の要旨は下記に示
す実施態様に例示されるが、これらに限定されるもので
はない。
す実施態様に例示されるが、これらに限定されるもので
はない。
【０００８】（１） Ｄ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸
脱水素酵素を含む酵素固定化体、ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドと試料を前記酵素固定化体に接触さ
せる機構、及びＬ−乳酸測定機構を具備するＤ−乳酸
とＬ−乳酸の測定装置。
脱水素酵素を含む酵素固定化体、ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドと試料を前記酵素固定化体に接触さ
せる機構、及びＬ−乳酸測定機構を具備するＤ−乳酸
とＬ−乳酸の測定装置。
【０００９】（２） 上流より、送液されるキャリヤー
中へ試料を注入する機構、Ｄ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳
酸脱水素酵素を含む酵素固定化体を内包するリアクタ
ー、並びにＬ−乳酸酸化酵素固定化体及びＬ−乳酸酸化
酵素により試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増加また
は減少する電極活性物質を検知する電極、を具備するフ
ロー方式のＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定装置。
中へ試料を注入する機構、Ｄ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳
酸脱水素酵素を含む酵素固定化体を内包するリアクタ
ー、並びにＬ−乳酸酸化酵素固定化体及びＬ−乳酸酸化
酵素により試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増加また
は減少する電極活性物質を検知する電極、を具備するフ
ロー方式のＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定装置。
【００１０】（３） Ｄ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱
水素酵素を含む酵素固定化体と試料を含むキャリヤーが
接触した状態で、キャリヤーの送液を停止又は流速を低
下させる機構を有する（２）記載の測定装置。
水素酵素を含む酵素固定化体と試料を含むキャリヤーが
接触した状態で、キャリヤーの送液を停止又は流速を低
下させる機構を有する（２）記載の測定装置。
【００１１】（４） 前記リアクターの上流側に、更に
Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体及びＬ−乳酸酸化酵素により
試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増加または減少する
電極活性物質を検知する電極を設けた（２）記載の測定
装置。
Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体及びＬ−乳酸酸化酵素により
試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増加または減少する
電極活性物質を検知する電極を設けた（２）記載の測定
装置。
【００１２】（５） ａ．試料とニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドをＤ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱水
素酵素を含む酵素固定化体に接触させ、試料中のＤ−乳
酸とＬ−乳酸との変換反応を行った後にＬ−乳酸を測定
する工程、ｂ．試料中のＬ−乳酸を測定する工程、を含
むＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定方法。
ンジヌクレオチドをＤ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱水
素酵素を含む酵素固定化体に接触させ、試料中のＤ−乳
酸とＬ−乳酸との変換反応を行った後にＬ−乳酸を測定
する工程、ｂ．試料中のＬ−乳酸を測定する工程、を含
むＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定方法。
【００１３】（６） ａ．試料とニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドをＤ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱水
素酵素を含む酵素固定化体に接触させ、試料中のＤ−乳
酸とＬ−乳酸との変換反応を行う工程、及び ｂ．試料中のＬ−乳酸がＬ−乳酸酸化酵素により酸化さ
れる際に増加又は減少する電極活性物質を電気化学的に
検出する工程、を含むＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定方法で
あり、 ・工程ｂにおいて試料としてＬ−乳酸標準液を用い、Ｌ
−乳酸濃度と出力値の関係を示す検量線１を求め、 ・試料としてＬ−乳酸標準液を用い工程ａを行い、次に
その試料につき工程ｂを行いＬ−乳酸濃度と出力値の関
係を示す検量線２を求め、 ・試料としてＤ−乳酸標準液を用い工程ａを行い、次に
その試料につき工程ｂを行いＤ−乳酸濃度と出力値の関
係を示す検量線３を求め、 ・更に、工程ｂにおいて試料として測定試料を用い、出
力値１を測り、 ・試料として測定試料を用い工程ａを行い次に工程ｂを
行い出力値２を測り、 出力値１，出力値２，検量線１，検量線２，検量線３よ
り測定試料中のＤ−乳酸量とＬ−乳酸量を計算するＤ−
乳酸とＬ−乳酸の測定方法。
ンジヌクレオチドをＤ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱水
素酵素を含む酵素固定化体に接触させ、試料中のＤ−乳
酸とＬ−乳酸との変換反応を行う工程、及び ｂ．試料中のＬ−乳酸がＬ−乳酸酸化酵素により酸化さ
れる際に増加又は減少する電極活性物質を電気化学的に
検出する工程、を含むＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定方法で
あり、 ・工程ｂにおいて試料としてＬ−乳酸標準液を用い、Ｌ
−乳酸濃度と出力値の関係を示す検量線１を求め、 ・試料としてＬ−乳酸標準液を用い工程ａを行い、次に
その試料につき工程ｂを行いＬ−乳酸濃度と出力値の関
係を示す検量線２を求め、 ・試料としてＤ−乳酸標準液を用い工程ａを行い、次に
その試料につき工程ｂを行いＤ−乳酸濃度と出力値の関
係を示す検量線３を求め、 ・更に、工程ｂにおいて試料として測定試料を用い、出
力値１を測り、 ・試料として測定試料を用い工程ａを行い次に工程ｂを
行い出力値２を測り、 出力値１，出力値２，検量線１，検量線２，検量線３よ
り測定試料中のＤ−乳酸量とＬ−乳酸量を計算するＤ−
乳酸とＬ−乳酸の測定方法。
【００１４】（７） 緩衝液を送液する機構と、Ｌ−乳
酸酸化酵素固定化体と、Ｌ−乳酸が酸化される際に増加
または減少する電極活性物質を検知する電極を備えたフ
ロー型測定装置であり、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体の前
段にＤ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱水素酵素を固定化
した酵素固定化体を配置し、該Ｄ−乳酸脱水素酵素とＬ
−乳酸脱水素酵素を固定化した酵素固定化体にニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド及び試料を接触せしめる
機構を有する測定装置。
酸酸化酵素固定化体と、Ｌ−乳酸が酸化される際に増加
または減少する電極活性物質を検知する電極を備えたフ
ロー型測定装置であり、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体の前
段にＤ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱水素酵素を固定化
した酵素固定化体を配置し、該Ｄ−乳酸脱水素酵素とＬ
−乳酸脱水素酵素を固定化した酵素固定化体にニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド及び試料を接触せしめる
機構を有する測定装置。
【００１５】（８） Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体がＬ−
乳酸酸化酵素を固定化した担体を内包するカラムである
か、又は固定化酵素膜であり電極に取りつけられている
（７）記載の測定装置。
乳酸酸化酵素を固定化した担体を内包するカラムである
か、又は固定化酵素膜であり電極に取りつけられている
（７）記載の測定装置。
【００１６】（９） Ｄ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱
水素酵素を固定化した酵素固定化体が両酵素を担体に固
定化しカラムに充填したものである（７）記載の測定装
置。
水素酵素を固定化した酵素固定化体が両酵素を担体に固
定化しカラムに充填したものである（７）記載の測定装
置。
【００１７】（１０） Ｄ−乳酸脱水素酵素、Ｌ−乳酸
脱水素酵素固定化体にニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドと試料を接触せしめた状態で、一定時間送液を停
止させるか、あるいは一定時間送液の流速を低下させる
機構を設けた（７）記載の測定装置。
脱水素酵素固定化体にニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドと試料を接触せしめた状態で、一定時間送液を停
止させるか、あるいは一定時間送液の流速を低下させる
機構を設けた（７）記載の測定装置。
【００１８】（１１） Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体と電
極を有する流路系が並列に２流路あり、片側のＬ−乳酸
酸化酵素固定化体の前段にＤ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳
酸脱水素酵素を固定化した酵素固定化体を配置した
（７）記載の測定装置。
極を有する流路系が並列に２流路あり、片側のＬ−乳酸
酸化酵素固定化体の前段にＤ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳
酸脱水素酵素を固定化した酵素固定化体を配置した
（７）記載の測定装置。
【００１９】（１２） （７）記載の測定装置を用いて
Ｄ−乳酸脱水素酵素、Ｌ−乳酸脱水素酵素固定化体に試
料を接触せしめる際にニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドの存在する場合と存在しない場合と２度測定する
測定方法。尚、Ｄ−乳酸とＬ−乳酸の変換反応に充分な
時間をかけた場合、試料は略１：１の混合物となり、
（６）において検量線２と検量線３は略一致するため、
検量線は２本でも計算出来る。そして（６）は、この場
合等を含め一般化したものと解釈すべきである。
Ｄ−乳酸脱水素酵素、Ｌ−乳酸脱水素酵素固定化体に試
料を接触せしめる際にニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドの存在する場合と存在しない場合と２度測定する
測定方法。尚、Ｄ−乳酸とＬ−乳酸の変換反応に充分な
時間をかけた場合、試料は略１：１の混合物となり、
（６）において検量線２と検量線３は略一致するため、
検量線は２本でも計算出来る。そして（６）は、この場
合等を含め一般化したものと解釈すべきである。
【００２０】
【作用】Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨの反応を次式に示す。 Ｄ−ＬＤＨ反応： Ｄ−乳酸＋ＮＡＤ→ピルビン酸＋Ｎ
ＡＤＨ Ｌ−ＬＤＨ反応： Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ→ピルビン酸＋Ｎ
ＡＤＨ どちらの反応も可逆的であるが、どちらの酵素も平衡は
乳酸とＮＡＤが生成する方向に傾いている。そのため、
ＮＡＤの存在下で多量のＤ−ＬＤＨを試料に接触させて
も、ほとんどピルビン酸へ変化しない。Ｌ−ＬＤＨにつ
いても同様である。
ＡＤＨ Ｌ−ＬＤＨ反応： Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ→ピルビン酸＋Ｎ
ＡＤＨ どちらの反応も可逆的であるが、どちらの酵素も平衡は
乳酸とＮＡＤが生成する方向に傾いている。そのため、
ＮＡＤの存在下で多量のＤ−ＬＤＨを試料に接触させて
も、ほとんどピルビン酸へ変化しない。Ｌ−ＬＤＨにつ
いても同様である。
【００２１】しかし、本発明者らは試料とＮＡＤがＤ−
ＬＤＨ及びＬ−ＬＤＨ混合物と接触すると、試料中のＬ
−乳酸はＤ−乳酸に変換され、Ｄ−乳酸はＬ−乳酸に変
換される事を見出した。この現象は乳酸が一旦ピルビン
酸に酸化され、生じたピルビン酸とＮＡＤＨから近傍に
存在するＤ−ＬＤＨ及びＬ−ＬＤＨの触媒作用により乳
酸が再生されたものと考えられる。
ＬＤＨ及びＬ−ＬＤＨ混合物と接触すると、試料中のＬ
−乳酸はＤ−乳酸に変換され、Ｄ−乳酸はＬ−乳酸に変
換される事を見出した。この現象は乳酸が一旦ピルビン
酸に酸化され、生じたピルビン酸とＮＡＤＨから近傍に
存在するＤ−ＬＤＨ及びＬ−ＬＤＨの触媒作用により乳
酸が再生されたものと考えられる。
【００２２】さらに興味のある事実として、Ｄ−乳酸と
Ｌ−乳酸の混合試料においても、各乳酸光学異性体の変
換速度は独立していることを見出した。すなわち、Ｄ−
ＬＤＨとＬ−ＬＤＨの近接固定化体に試料及びＮＡＤを
接触せしめて、前記固定化体と接触後のＬ−乳酸量を検
出する。例えば、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体と過酸化水
素電極で検出することにより、本発明の目的を達成する
ことができる。各種濃度のＬ−乳酸のみを含む試料を接
触させた場合、Ｌ−乳酸と電極出力値の間に直線関係が
成立する濃度領域が認められる。そこでこの濃度領域の
一点を選び、そのＬ−乳酸溶液に各種濃度のＤ−乳酸を
添加すると別の検量線が得られる。この検量線をＬ１と
する。次に各種濃度のＤ−乳酸のみを含む試料と電流出
力値との関係から得られた検量線をＬ２とする。すると
Ｌ１とＬ２の勾配は一致し、またＬ１の切片は当該濃度
のＬ−乳酸を接触せしめた場合の電流出力値と一致す
る。この系において、Ｌ−乳酸とＤ−乳酸を入れかえて
も同じ結果が得られる。
Ｌ−乳酸の混合試料においても、各乳酸光学異性体の変
換速度は独立していることを見出した。すなわち、Ｄ−
ＬＤＨとＬ−ＬＤＨの近接固定化体に試料及びＮＡＤを
接触せしめて、前記固定化体と接触後のＬ−乳酸量を検
出する。例えば、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体と過酸化水
素電極で検出することにより、本発明の目的を達成する
ことができる。各種濃度のＬ−乳酸のみを含む試料を接
触させた場合、Ｌ−乳酸と電極出力値の間に直線関係が
成立する濃度領域が認められる。そこでこの濃度領域の
一点を選び、そのＬ−乳酸溶液に各種濃度のＤ−乳酸を
添加すると別の検量線が得られる。この検量線をＬ１と
する。次に各種濃度のＤ−乳酸のみを含む試料と電流出
力値との関係から得られた検量線をＬ２とする。すると
Ｌ１とＬ２の勾配は一致し、またＬ１の切片は当該濃度
のＬ−乳酸を接触せしめた場合の電流出力値と一致す
る。この系において、Ｌ−乳酸とＤ−乳酸を入れかえて
も同じ結果が得られる。
【００２３】このことは、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の濃度
と電流出力値の関係はそれぞれ線型独立したものであ
り、実試料においてＤ−乳酸とＬ−乳酸が混合していて
も、最初に含まれるＬ−乳酸濃度を別途に決定すれば、
Ｄ−乳酸量を算出できることを示すものである。当然な
がら、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体と試料及びＮＡ
Ｄの接触時間が長くなればなるほどＤ−乳酸とＬ−乳酸
の変換率は上昇する。十分な時間反応させれば最終的に
Ｄ−乳酸とＬ−乳酸は平衡化しラセミ体が出来上がる。
しかし、平衡状態にすることによりＤ−乳酸量とＬ−乳
酸量を求める方法は、Ｄ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨを固定化
した場合、反応に長い時間を要し、連続的な測定を行う
には不適当である。一般の酵素反応において反応時間と
変換率の間に直線関係が成立するのは、基質の変換率が
２０％程度以下である場合である。従って固定化に用い
た酵素量において、２０％以下の変換率の場合は接触時
間が長くなるにつれて感度がほぼ直線的に上昇する。し
かし、それ以降は徐々に反応速度が低下するので、送液
の流速を遅くして接触時間を長くしても、それにより得
られる効果は低くなる。送液を停止、又は流速を低下し
ても実用的には変換率は８０％程度になる範囲の時間で
測定すると短時間で測定することが出来る。
と電流出力値の関係はそれぞれ線型独立したものであ
り、実試料においてＤ−乳酸とＬ−乳酸が混合していて
も、最初に含まれるＬ−乳酸濃度を別途に決定すれば、
Ｄ−乳酸量を算出できることを示すものである。当然な
がら、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体と試料及びＮＡ
Ｄの接触時間が長くなればなるほどＤ−乳酸とＬ−乳酸
の変換率は上昇する。十分な時間反応させれば最終的に
Ｄ−乳酸とＬ−乳酸は平衡化しラセミ体が出来上がる。
しかし、平衡状態にすることによりＤ−乳酸量とＬ−乳
酸量を求める方法は、Ｄ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨを固定化
した場合、反応に長い時間を要し、連続的な測定を行う
には不適当である。一般の酵素反応において反応時間と
変換率の間に直線関係が成立するのは、基質の変換率が
２０％程度以下である場合である。従って固定化に用い
た酵素量において、２０％以下の変換率の場合は接触時
間が長くなるにつれて感度がほぼ直線的に上昇する。し
かし、それ以降は徐々に反応速度が低下するので、送液
の流速を遅くして接触時間を長くしても、それにより得
られる効果は低くなる。送液を停止、又は流速を低下し
ても実用的には変換率は８０％程度になる範囲の時間で
測定すると短時間で測定することが出来る。
【００２４】尚、送液を停止、又は送液の流速を低下さ
せる態様については後に記載する。Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−Ｌ
ＤＨ固定化体と試料及びＮＡＤの接触時間を長くするに
はＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体に試料及びＮＡＤを
接触させた状態で、送液の流速を低下させればよい。又
試料がＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体に接する状態で
送液を停止し長時間反応させれば１００％の変換率も可
能である。この場合、乳酸はＤ−乳酸：Ｌ−乳酸＝１：
１のラセミ化が生成する。
せる態様については後に記載する。Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−Ｌ
ＤＨ固定化体と試料及びＮＡＤの接触時間を長くするに
はＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体に試料及びＮＡＤを
接触させた状態で、送液の流速を低下させればよい。又
試料がＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体に接する状態で
送液を停止し長時間反応させれば１００％の変換率も可
能である。この場合、乳酸はＤ−乳酸：Ｌ−乳酸＝１：
１のラセミ化が生成する。
【００２５】本発明ではＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化
体を用いて反応条件を一定にして測定するので、変換率
が１００％でなくても正確な測定をすることが出来る。
具体的には以下の測定装置が例示できる。第１の装置
は、試料を２つに分け、一方はＬ−乳酸酸化酵素にのみ
接触させＬ−乳酸測定に利用する。もう一方はＤ−ＬＤ
ＨとＬ−ＬＤＨとＮＡＤに一定時間接触させる。その後
Ｌ−乳酸酸化酵素に接触させ、変換反応後のＬ−乳酸の
測定に利用する。図１に示すように流路を２方向に分流
することにより簡単かつ迅速に測定することができる。
また試料のフローを分枝させずに２つの測定系で２度測
定してもよい。
体を用いて反応条件を一定にして測定するので、変換率
が１００％でなくても正確な測定をすることが出来る。
具体的には以下の測定装置が例示できる。第１の装置
は、試料を２つに分け、一方はＬ−乳酸酸化酵素にのみ
接触させＬ−乳酸測定に利用する。もう一方はＤ−ＬＤ
ＨとＬ−ＬＤＨとＮＡＤに一定時間接触させる。その後
Ｌ−乳酸酸化酵素に接触させ、変換反応後のＬ−乳酸の
測定に利用する。図１に示すように流路を２方向に分流
することにより簡単かつ迅速に測定することができる。
また試料のフローを分枝させずに２つの測定系で２度測
定してもよい。
【００２６】第２の装置は、上流よりＬ−乳酸酸化酵素
固定化カラム（４４）、過酸化水素電極（４５）、Ｄ−
ＬＤＨとＬ−ＬＤＨを固定化したカラム（４６）、Ｌ−
乳酸酸化酵素固定化カラム（４７）、過酸化水素電極
（４８）を直列に接続した装置である（図３）。先ず、
試料をＬ−乳酸酸化酵素固定化カラム（４４）に接触さ
せ、Ｌ−乳酸を検出し、続いてＤ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨ
とＮＡＤに一定時間接触させ、その後Ｌ−乳酸酸化酵素
固定化カラム（４７）に接触させ、Ｌ−乳酸の検出値を
求める。第３の装置は、Ｄ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨの固定
化カラム（２５）を有し、その下流側にＬ−乳酸検出機
構を具備したフロー方式の測定装置（図２）である。試
料とＤ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨの接触時にＮＡＤがある場
合とない場合について測定し、両者でのＬ−乳酸の検出
値を求める。このとき、試料にＮＡＤを添加した試料と
添加しない試料を測定してもよいし、ＮＡＤを含む緩衝
液で測定する場合と含まない緩衝液との２種類の緩衝液
を用いる方法でも良い。この態様については、実施例２
で説明する。
固定化カラム（４４）、過酸化水素電極（４５）、Ｄ−
ＬＤＨとＬ−ＬＤＨを固定化したカラム（４６）、Ｌ−
乳酸酸化酵素固定化カラム（４７）、過酸化水素電極
（４８）を直列に接続した装置である（図３）。先ず、
試料をＬ−乳酸酸化酵素固定化カラム（４４）に接触さ
せ、Ｌ−乳酸を検出し、続いてＤ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨ
とＮＡＤに一定時間接触させ、その後Ｌ−乳酸酸化酵素
固定化カラム（４７）に接触させ、Ｌ−乳酸の検出値を
求める。第３の装置は、Ｄ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨの固定
化カラム（２５）を有し、その下流側にＬ−乳酸検出機
構を具備したフロー方式の測定装置（図２）である。試
料とＤ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨの接触時にＮＡＤがある場
合とない場合について測定し、両者でのＬ−乳酸の検出
値を求める。このとき、試料にＮＡＤを添加した試料と
添加しない試料を測定してもよいし、ＮＡＤを含む緩衝
液で測定する場合と含まない緩衝液との２種類の緩衝液
を用いる方法でも良い。この態様については、実施例２
で説明する。
【００２７】実際の測定には、まずＤ−乳酸とＬ−乳酸
のそれぞれの標準液を測定し得られた電流値より検量線
を作成する。検量線１はＬ−乳酸の検量線でＤ−乳酸と
Ｌ−乳酸の変換反応を行わない場合に測定したものであ
る。つまり、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体を通過せ
ずに、あるいは通過する前でＬ−乳酸酸化酵素固定化体
にのみ接触する場合、または、ＮＡＤをＤ−ＬＤＨ、Ｌ
−ＬＤＨ固定化体に接触させないで試料を測定した場合
である。これらの条件ではＤ−乳酸を注入しても全く電
流値は得られない。
のそれぞれの標準液を測定し得られた電流値より検量線
を作成する。検量線１はＬ−乳酸の検量線でＤ−乳酸と
Ｌ−乳酸の変換反応を行わない場合に測定したものであ
る。つまり、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体を通過せ
ずに、あるいは通過する前でＬ−乳酸酸化酵素固定化体
にのみ接触する場合、または、ＮＡＤをＤ−ＬＤＨ、Ｌ
−ＬＤＨ固定化体に接触させないで試料を測定した場合
である。これらの条件ではＤ−乳酸を注入しても全く電
流値は得られない。
【００２８】検量線２はＬ−乳酸がＮＡＤの存在下でＤ
−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体を通過した後の電流値よ
り得られる検量線である。検量線２は検量線１に比べＬ
−乳酸から生成する過酸化水素の比率は低くなってい
る。検量線３は検量線２と同一条件でＤ−乳酸の標準液
より得られた電流値から作成する。実試料の測定の場合
は、検量線１と同工程で得られる電流値１と検量線２及
び検量線３と同工程より得られる電流値２が得られる。
−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体を通過した後の電流値よ
り得られる検量線である。検量線２は検量線１に比べＬ
−乳酸から生成する過酸化水素の比率は低くなってい
る。検量線３は検量線２と同一条件でＤ−乳酸の標準液
より得られた電流値から作成する。実試料の測定の場合
は、検量線１と同工程で得られる電流値１と検量線２及
び検量線３と同工程より得られる電流値２が得られる。
【００２９】Ｄ−乳酸量とＬ−乳酸量は以下に例示する
方法でそれぞれ計算される。電流値１より検量線１に代
入しＬ−乳酸量を算出する。算出したＬ−乳酸濃度を検
量線２に代入し、電流値２に寄与するＬ−乳酸の電流値
を算出する。電流値２より前記電流値２に寄与するＬ−
乳酸電流値を差し引くとＤ−乳酸の電流値が求められ
る。このＤ−乳酸寄与分の電流値を検量線３に代入する
とＤ−乳酸量が算出できる。
方法でそれぞれ計算される。電流値１より検量線１に代
入しＬ−乳酸量を算出する。算出したＬ−乳酸濃度を検
量線２に代入し、電流値２に寄与するＬ−乳酸の電流値
を算出する。電流値２より前記電流値２に寄与するＬ−
乳酸電流値を差し引くとＤ−乳酸の電流値が求められ
る。このＤ−乳酸寄与分の電流値を検量線３に代入する
とＤ−乳酸量が算出できる。
【００３０】本発明では、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨを固
定化して用いる点に大きな特徴を有する。固定化して用
いると酵素の繰り返し利用が可能となることや、酵素の
反応条件を調整し易い等の利点がある。酵素の固定化法
は、特に限定されず、吸着法、化学結合法、包括法等を
用いることが出来る。中でも強固な固定化体を作成でき
る化学結合法が望ましい。固定化にもちいる担体にはケ
イソウ土、シリカゲル、ガラスビーズ、アルミナ、セラ
ミック、カーボン、活性炭、モレキュラーシーブ、シリ
コンゴム、セルロース、アガロース、アミノ酸系ポリマ
ー等が使用できる。化学結合法としては、担体表面にア
ミノシラン化試薬でアミノ基を導入し、さらにグルタル
アルデヒド等の多官能性アルデヒドを用いてホルミル化
を行った後、酵素を接触させて固定化する方法が例示で
きる。固定化酵素の形態は、電極表面の膜上に固定化す
る方法、担体に固定化しカラム等のリアクターに充填す
る方法、膜や中空糸を利用したリアクター等が考えられ
る。なかでもカラムに固定化した担体を充填する方法
は、試料と固定化酵素との接触時間を長くすることがで
き変換率を上昇できることから有利である。カラムは容
積が大きい方が多くの担体を充填でき反応時間も長くな
り有利である。しかし、反応時間が長いと測定時間も長
くなり測定に不利になるので、望ましい容積は１０〜５
００μｌ程度である。またカラムの素材は、アクリル、
フッ素樹脂、塩化ビニル樹脂、ガラスやステンレス等の
金属等あるいはこれらを組み合せたものを用いることが
できる。
定化して用いる点に大きな特徴を有する。固定化して用
いると酵素の繰り返し利用が可能となることや、酵素の
反応条件を調整し易い等の利点がある。酵素の固定化法
は、特に限定されず、吸着法、化学結合法、包括法等を
用いることが出来る。中でも強固な固定化体を作成でき
る化学結合法が望ましい。固定化にもちいる担体にはケ
イソウ土、シリカゲル、ガラスビーズ、アルミナ、セラ
ミック、カーボン、活性炭、モレキュラーシーブ、シリ
コンゴム、セルロース、アガロース、アミノ酸系ポリマ
ー等が使用できる。化学結合法としては、担体表面にア
ミノシラン化試薬でアミノ基を導入し、さらにグルタル
アルデヒド等の多官能性アルデヒドを用いてホルミル化
を行った後、酵素を接触させて固定化する方法が例示で
きる。固定化酵素の形態は、電極表面の膜上に固定化す
る方法、担体に固定化しカラム等のリアクターに充填す
る方法、膜や中空糸を利用したリアクター等が考えられ
る。なかでもカラムに固定化した担体を充填する方法
は、試料と固定化酵素との接触時間を長くすることがで
き変換率を上昇できることから有利である。カラムは容
積が大きい方が多くの担体を充填でき反応時間も長くな
り有利である。しかし、反応時間が長いと測定時間も長
くなり測定に不利になるので、望ましい容積は１０〜５
００μｌ程度である。またカラムの素材は、アクリル、
フッ素樹脂、塩化ビニル樹脂、ガラスやステンレス等の
金属等あるいはこれらを組み合せたものを用いることが
できる。
【００３１】Ｄ−乳酸とＬ−乳酸の変換反応を起こすた
めに作用させるＤ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨの混合割合は特
に限定されないが、Ｄ−ＬＤＨに対するＬ−ＬＤＨの比
率は、活性で表した場合略１／１０から略２０倍まで用
いることができる。この濃度範囲において１／２〜１０
倍の範囲が好ましく、より好ましくは１／２〜５であ
る。尚、ＬＤＨ活性は一般にピルビン酸から乳酸を生成
する速度を測定することにより定義される。
めに作用させるＤ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨの混合割合は特
に限定されないが、Ｄ−ＬＤＨに対するＬ−ＬＤＨの比
率は、活性で表した場合略１／１０から略２０倍まで用
いることができる。この濃度範囲において１／２〜１０
倍の範囲が好ましく、より好ましくは１／２〜５であ
る。尚、ＬＤＨ活性は一般にピルビン酸から乳酸を生成
する速度を測定することにより定義される。
【００３２】サンプル中の乳酸の変換反応は、前記のＤ
−ＬＤＨ反応とＬ−ＬＤＨ反応の作用によるため、Ｄ−
ＬＤＨとＬ−ＬＤＨはほぼ同時に試料及びＮＡＤが接触
するように近接固定するのが好ましい。具体的には、Ｄ
−ＬＤＨ固定化膜とＬ−ＬＤＨ固定化膜を重ねる方法、
Ｄ−ＬＤＨを固定化した担体とＬ−ＬＤＨを固定化した
担体を混合する方法、Ｄ−ＬＤＨ溶液とＬ−ＬＤＨ溶液
を混合後、担体又は膜に固定化する方法等がある。ただ
しＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨは一般に酵素活性が低く酵素
反応も遅いので、電極表面上に固定化する方法では必ず
しも充分に乳酸の変換反応を行うことは出来ないので、
担体に固定化しカラム等のリアクターに充填して用いる
のが望ましい。
−ＬＤＨ反応とＬ−ＬＤＨ反応の作用によるため、Ｄ−
ＬＤＨとＬ−ＬＤＨはほぼ同時に試料及びＮＡＤが接触
するように近接固定するのが好ましい。具体的には、Ｄ
−ＬＤＨ固定化膜とＬ−ＬＤＨ固定化膜を重ねる方法、
Ｄ−ＬＤＨを固定化した担体とＬ−ＬＤＨを固定化した
担体を混合する方法、Ｄ−ＬＤＨ溶液とＬ−ＬＤＨ溶液
を混合後、担体又は膜に固定化する方法等がある。ただ
しＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨは一般に酵素活性が低く酵素
反応も遅いので、電極表面上に固定化する方法では必ず
しも充分に乳酸の変換反応を行うことは出来ないので、
担体に固定化しカラム等のリアクターに充填して用いる
のが望ましい。
【００３３】ＮＡＤの添加方法としては試料に添加して
もよいし、キャリヤーに添加してもよい。ＮＡＤを試料
に添加する場合は２ｍＭから２０ｍＭ程度が好ましく、
この方法は試料数が少ない場合に適している。また、フ
ロー方式でキャリヤーに添加する場合は常にＤ−ＬＤ
Ｈ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体とＮＡＤは接触している状態に
あり、試料に添加する場合より使用効果が高いので１ｍ
Ｍから１０ｍＭ程度が好ましい。この方法は試料数が多
い場合に適している。
もよいし、キャリヤーに添加してもよい。ＮＡＤを試料
に添加する場合は２ｍＭから２０ｍＭ程度が好ましく、
この方法は試料数が少ない場合に適している。また、フ
ロー方式でキャリヤーに添加する場合は常にＤ−ＬＤ
Ｈ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体とＮＡＤは接触している状態に
あり、試料に添加する場合より使用効果が高いので１ｍ
Ｍから１０ｍＭ程度が好ましい。この方法は試料数が多
い場合に適している。
【００３４】もちろん、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化
体と試料及びＮＡＤの接触時間を長くするとＮＡＤは少
量でよい。尚、前記のようにＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固
定化体の反応速度は比較的遅いため、充分な感度を得る
ため、又は変換率を高め平衡状態に近くするためには、
Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体とＮＡＤ及び試料を接
触せしめた状態で、一定時間送液を停止、あるいは一定
時間送液の流速を低下させる機構を設けてもよい。
体と試料及びＮＡＤの接触時間を長くするとＮＡＤは少
量でよい。尚、前記のようにＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固
定化体の反応速度は比較的遅いため、充分な感度を得る
ため、又は変換率を高め平衡状態に近くするためには、
Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体とＮＡＤ及び試料を接
触せしめた状態で、一定時間送液を停止、あるいは一定
時間送液の流速を低下させる機構を設けてもよい。
【００３５】送液を一定時間停止する場合には、送液の
停止開始は試料全体が、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化
体に入った時点とするのが良く、その停止時間は本発明
において特徴とする、測定の迅速性を損なわない範囲で
あれば良く、実用的には５分以内とするのが短時間で測
定するためには望ましい。また、一定時間送液の流速を
低下させる場合は、少なくとも試料部の先頭がＤ−ＬＤ
Ｈ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体をでる以前に流速を低下させる
必要があり、好ましくは試料部の先頭がＤ−ＬＤＨ、Ｌ
−ＬＤＨ固定化体を入る時点で流速を低下させる。低速
を保つ時間は試料全体がＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化
体を通過し終わるまでであって、同様に５分以内とする
のが短時間で測定するためには望ましい。
停止開始は試料全体が、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化
体に入った時点とするのが良く、その停止時間は本発明
において特徴とする、測定の迅速性を損なわない範囲で
あれば良く、実用的には５分以内とするのが短時間で測
定するためには望ましい。また、一定時間送液の流速を
低下させる場合は、少なくとも試料部の先頭がＤ−ＬＤ
Ｈ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体をでる以前に流速を低下させる
必要があり、好ましくは試料部の先頭がＤ−ＬＤＨ、Ｌ
−ＬＤＨ固定化体を入る時点で流速を低下させる。低速
を保つ時間は試料全体がＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化
体を通過し終わるまでであって、同様に５分以内とする
のが短時間で測定するためには望ましい。
【００３６】試料溶液のＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化
体での一定時間送液を停止、又は一定時間送液する流速
を低下させる手段としては、例えば、試料注入部からＤ
−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体までの配管の長さと配管
径とその時のポンプの送液速度から計算によって求める
か、あるいは予め実測するなどして注入時間からＤ−Ｌ
ＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体に到達するまでの時間を求
め、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体に達した時にポン
プ流速の制御値を変更すると良い。
体での一定時間送液を停止、又は一定時間送液する流速
を低下させる手段としては、例えば、試料注入部からＤ
−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体までの配管の長さと配管
径とその時のポンプの送液速度から計算によって求める
か、あるいは予め実測するなどして注入時間からＤ−Ｌ
ＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体に到達するまでの時間を求
め、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体に達した時にポン
プ流速の制御値を変更すると良い。
【００３７】これらの、具体的な方法としては、例え
ば、特定の電子回路あるいはコンピューターを用いて、
Ｄ／Ａ変換器を介してポンプの流速を制御し、かつ試料
注入からＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体への到達時間
を正確に監視する方法が用いられる。また、実施例２で
説明するように、切換バルブに接続したループ部にＤ−
ＬＤＨとＬ−ＬＤＨ固定化体リアクターを接続し、リア
クター内で試料を留めることにより変換率を高めること
もできる。
ば、特定の電子回路あるいはコンピューターを用いて、
Ｄ／Ａ変換器を介してポンプの流速を制御し、かつ試料
注入からＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化体への到達時間
を正確に監視する方法が用いられる。また、実施例２で
説明するように、切換バルブに接続したループ部にＤ−
ＬＤＨとＬ−ＬＤＨ固定化体リアクターを接続し、リア
クター内で試料を留めることにより変換率を高めること
もできる。
【００３８】次に、Ｌ−乳酸の選択的測定法について説
明する。Ｌ−乳酸は、Ｄ−乳酸やＮＡＤ等のＬ−乳酸以
外の物質が存在していても影響のない方法で測定しなけ
ればならない。そしてＬ−乳酸酸化酵素を用いた測定法
が利用できる。Ｌ−乳酸酸化酵素の反応を次式に示す。 Ｌ−乳酸＋Ｏ2 →ピルビン酸＋Ｈ2 Ｏ2 この反応は、Ｄ−乳酸やＮＡＤが共存していても影響さ
れないので正確にＬ−乳酸のみを定量するのに適してい
る。
明する。Ｌ−乳酸は、Ｄ−乳酸やＮＡＤ等のＬ−乳酸以
外の物質が存在していても影響のない方法で測定しなけ
ればならない。そしてＬ−乳酸酸化酵素を用いた測定法
が利用できる。Ｌ−乳酸酸化酵素の反応を次式に示す。 Ｌ−乳酸＋Ｏ2 →ピルビン酸＋Ｈ2 Ｏ2 この反応は、Ｄ−乳酸やＮＡＤが共存していても影響さ
れないので正確にＬ−乳酸のみを定量するのに適してい
る。
【００３９】Ｌ−乳酸酸化酵素を用いたＬ−乳酸の定量
には、減少した酸素または増加した過酸化水素等を検出
すればよい。また、ジクロロインドフェノール、フェリ
シアン化カリウム、ベンゾキノンなどの電子伝達体、所
謂メディエーター等を介在させ測定することも出来る。
酸素、過酸化水素等の電極活性物質の増減を電極によっ
て電流値に変換して測定する電気化学的測定法は分光光
度計を用いる測定と比較して試料の濁りや、着色物質に
影響されず、操作が簡単であり好ましい。
には、減少した酸素または増加した過酸化水素等を検出
すればよい。また、ジクロロインドフェノール、フェリ
シアン化カリウム、ベンゾキノンなどの電子伝達体、所
謂メディエーター等を介在させ測定することも出来る。
酸素、過酸化水素等の電極活性物質の増減を電極によっ
て電流値に変換して測定する電気化学的測定法は分光光
度計を用いる測定と比較して試料の濁りや、着色物質に
影響されず、操作が簡単であり好ましい。
【００４０】Ｌ−乳酸酸化酵素は溶液でも使用できる
が、固定化して用いると酵素の繰り返し利用が可能とな
ることや、酵素の反応条件を調整し易い等の利点があ
る。固定化方法としてはＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨに関し
て前記したものと同様の吸着法、化学結合法、包括法等
が利用でき、カラム等のリアクターに内包して用いるこ
とが出来る。また、Ｌ−乳酸酸化酵素をグルタルアルデ
ヒド、ホルムアルデヒド、サクシニルアルデヒド等の架
橋剤で固定した膜を電極に取りつけて使用することもで
きる。膜状に固定する際にはアルブミン、グロブリン、
ゼラチン等の他のタンパク質を添加してＬ−乳酸酸化酵
素を架橋することもできる。
が、固定化して用いると酵素の繰り返し利用が可能とな
ることや、酵素の反応条件を調整し易い等の利点があ
る。固定化方法としてはＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨに関し
て前記したものと同様の吸着法、化学結合法、包括法等
が利用でき、カラム等のリアクターに内包して用いるこ
とが出来る。また、Ｌ−乳酸酸化酵素をグルタルアルデ
ヒド、ホルムアルデヒド、サクシニルアルデヒド等の架
橋剤で固定した膜を電極に取りつけて使用することもで
きる。膜状に固定する際にはアルブミン、グロブリン、
ゼラチン等の他のタンパク質を添加してＬ−乳酸酸化酵
素を架橋することもできる。
【００４１】消費された酸素を測定する酸素電極は、カ
ルバニ型、クラーク型等各種公知のものを利用できる。
生成する過酸化水素を測定する過酸化水素電極として
は、アノード基体に炭素、白金、ニッケル、パラジウム
等を用い、カソード側に銀等を用いた公知のものを利用
できる。一般にアノードとしては、過酸化水素に対する
過電圧が低く高感度が得られるという理由から白金を用
いることが多い。そして電極表面にポリシロキサン膜、
アクリル樹脂膜、蛋白膜、アセチルセルロース膜等の選
択透過膜を有している形式の電極が妨害物除去の観点か
ら望ましい。
ルバニ型、クラーク型等各種公知のものを利用できる。
生成する過酸化水素を測定する過酸化水素電極として
は、アノード基体に炭素、白金、ニッケル、パラジウム
等を用い、カソード側に銀等を用いた公知のものを利用
できる。一般にアノードとしては、過酸化水素に対する
過電圧が低く高感度が得られるという理由から白金を用
いることが多い。そして電極表面にポリシロキサン膜、
アクリル樹脂膜、蛋白膜、アセチルセルロース膜等の選
択透過膜を有している形式の電極が妨害物除去の観点か
ら望ましい。
【００４２】電極系は作用電極、対極より構成される２
電極の過酸化水素電極や酸素電極が利用できる。また安
定性、精度の点からは作用電極、参照電極、対極より構
成される３電極のものが好ましい。送液されるキャリヤ
ーとしてはＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ、Ｌ−乳酸酸化酵素
に適したｐＨであるｐＨ７付近で緩衝能があり、電極に
電気化学的な影響を及ばさない緩衝液等が用いられる。
電極の過酸化水素電極や酸素電極が利用できる。また安
定性、精度の点からは作用電極、参照電極、対極より構
成される３電極のものが好ましい。送液されるキャリヤ
ーとしてはＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ、Ｌ−乳酸酸化酵素
に適したｐＨであるｐＨ７付近で緩衝能があり、電極に
電気化学的な影響を及ばさない緩衝液等が用いられる。
【００４３】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさら
に詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。
に詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。
【００４４】実施例１ （１）Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラムの製造 焼成したケイソウ土である耐火レンガ（３０〜６０メッ
シュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸
漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうして
アミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒド
に１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ
７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換
え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル
化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液にＬ−乳酸酸化酵素（シグマ社製）５０ユ
ニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接触さ
せ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化
担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのアクリル製のカ
ラムに充填しＬ−乳酸酸化酵素固定化カラムとした。
シュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸
漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうして
アミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒド
に１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ
７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換
え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル
化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液にＬ−乳酸酸化酵素（シグマ社製）５０ユ
ニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接触さ
せ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化
担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのアクリル製のカ
ラムに充填しＬ−乳酸酸化酵素固定化カラムとした。
【００４５】（２）過酸化水素電極の製造 直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ
硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その
後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、
１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水ト
ルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミ
ン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇを蒸
留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に
用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥
硬化して過酸化水素選択透過膜とし、これを過酸化水素
電極とした。また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照
電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ
硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その
後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、
１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水ト
ルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミ
ン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇを蒸
留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に
用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥
硬化して過酸化水素選択透過膜とし、これを過酸化水素
電極とした。また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照
電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
【００４６】（３）Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化カラ
ムの製造 Ｌ−乳酸酸化酵素の固定化法と同様にホルミル化した焼
成ケイソウ土（耐火レンガ）に、ｐＨ７．０、１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液にＤ−ＬＤＨ（ベーリンガー
山之内社製）３００ユニット／ｍｌ、Ｌ−ＬＤＨ（シグ
マ社製）９００ユニット／ｍｌを混合した溶液５００μ
ｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この
酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのアク
リル製のカラムに充填しＤ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨを固定
化したカラムとした。
ムの製造 Ｌ−乳酸酸化酵素の固定化法と同様にホルミル化した焼
成ケイソウ土（耐火レンガ）に、ｐＨ７．０、１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液にＤ−ＬＤＨ（ベーリンガー
山之内社製）３００ユニット／ｍｌ、Ｌ−ＬＤＨ（シグ
マ社製）９００ユニット／ｍｌを混合した溶液５００μ
ｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この
酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのアク
リル製のカラムに充填しＤ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨを固定
化したカラムとした。
【００４７】（４）測定装置 図１に示すフロー型測定装置によってＬ−乳酸、Ｄ−乳
酸の測定を行う。緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ
（２）により送液し、サンプラ（３）により試料１μｌ
を注入する。注入された試料は三方ジョイント（５）で
二方に分流される。一方はＬ−乳酸酸化酵素カラム
（６）を通過し、Ｌ−乳酸より過酸化水素が生成し、過
酸化水素電極（７）により電流値の変化を検出する。こ
の電極を第１電極とする。一方はＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤ
Ｈカラム（８）を通過しＤ−乳酸とＬ−乳酸の変換反応
が起こる。Ｌ−乳酸酸化酵素カラム（９）を通過し、過
酸化水素電極（１０）で電流値の変化が検出される。こ
ちらを第２電極とする。これらのカラムと電極を３０℃
の恒温槽（４）中に設置する。それぞれの電極で電流値
の変化は検出器（１１）により検出される。さらに信号
をパーソナルコンピュータ（１４）に送ることもでき
る。 緩衝液の組成は１００ｍＭリン酸ナトリウム、５
０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリウム、５ｍＭ
ＮＡＤを含みｐＨ７．０である。ポンプの流速は１．３
ｍｌ／分であり、第１電極での流速は０．７ｍｌ／分、
第２電極での流速は０．６ｍｌ／分であった。
酸の測定を行う。緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ
（２）により送液し、サンプラ（３）により試料１μｌ
を注入する。注入された試料は三方ジョイント（５）で
二方に分流される。一方はＬ−乳酸酸化酵素カラム
（６）を通過し、Ｌ−乳酸より過酸化水素が生成し、過
酸化水素電極（７）により電流値の変化を検出する。こ
の電極を第１電極とする。一方はＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤ
Ｈカラム（８）を通過しＤ−乳酸とＬ−乳酸の変換反応
が起こる。Ｌ−乳酸酸化酵素カラム（９）を通過し、過
酸化水素電極（１０）で電流値の変化が検出される。こ
ちらを第２電極とする。これらのカラムと電極を３０℃
の恒温槽（４）中に設置する。それぞれの電極で電流値
の変化は検出器（１１）により検出される。さらに信号
をパーソナルコンピュータ（１４）に送ることもでき
る。 緩衝液の組成は１００ｍＭリン酸ナトリウム、５
０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリウム、５ｍＭ
ＮＡＤを含みｐＨ７．０である。ポンプの流速は１．３
ｍｌ／分であり、第１電極での流速は０．７ｍｌ／分、
第２電極での流速は０．６ｍｌ／分であった。
【００４８】（５）標準液の測定 （４）の測定装置に蒸留水、１、２、５、１０ｍＭのＬ
−乳酸、２、５、１０、２０、５０ｍＭのＤ−乳酸を注
入し、第１、第２電極で得られた電流値は表１のように
なり、次の検量線が得られた。ただし、Ｙは電流値（ｎ
Ａ）、Ｘは試料中の乳酸濃度（ｍＭ）とする。第１電極
（７）は、Ｌ−乳酸にのみ反応するので検量線１はＬ−
乳酸のみの検量線である。第２電極（１０）では、Ｌ−
乳酸とＤ−乳酸の変換反応が行われ、Ｌ−乳酸標準液を
測定する際Ｌ−乳酸は一定の比率で減少し、Ｄ−乳酸標
準液を測定する際にはＤ−乳酸は一定の比率でＬ−乳酸
に変換され検出される。Ｄ−乳酸とＬ−乳酸のどちらで
も検出されるので、Ｌ−乳酸の検量線である検量線２と
Ｄ−乳酸の検量線である検量線３が得られる。 検量線１ 第１電極 Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝１５．５Ｘ
＋０．９ 検量線２ 第２電極 Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝１１．８Ｘ
−０．６ 検量線３ 第２電極 Ｄ−乳酸検量線 Ｙ＝ １．５Ｘ
−０．６
−乳酸、２、５、１０、２０、５０ｍＭのＤ−乳酸を注
入し、第１、第２電極で得られた電流値は表１のように
なり、次の検量線が得られた。ただし、Ｙは電流値（ｎ
Ａ）、Ｘは試料中の乳酸濃度（ｍＭ）とする。第１電極
（７）は、Ｌ−乳酸にのみ反応するので検量線１はＬ−
乳酸のみの検量線である。第２電極（１０）では、Ｌ−
乳酸とＤ−乳酸の変換反応が行われ、Ｌ−乳酸標準液を
測定する際Ｌ−乳酸は一定の比率で減少し、Ｄ−乳酸標
準液を測定する際にはＤ−乳酸は一定の比率でＬ−乳酸
に変換され検出される。Ｄ−乳酸とＬ−乳酸のどちらで
も検出されるので、Ｌ−乳酸の検量線である検量線２と
Ｄ−乳酸の検量線である検量線３が得られる。 検量線１ 第１電極 Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝１５．５Ｘ
＋０．９ 検量線２ 第２電極 Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝１１．８Ｘ
−０．６ 検量線３ 第２電極 Ｄ−乳酸検量線 Ｙ＝ １．５Ｘ
−０．６
【００４９】
【表１】
【００５０】（６）混合試料の測定 （４）の測定装置にＤ−乳酸、Ｌ−乳酸の混合液を注入
した。第１、第２電極で得られた電流値、標準液測定に
より算出した検量線より算出したＤ−乳酸、Ｌ−乳酸の
濃度は表２のようになった。未知試料中の乳酸の濃度算
出方法は、まず第１電極で得られた電流値より検量線１
によって試料中のＬ−乳酸濃度が求められる。この濃度
より検量線２によって第２電極に関与するＬ−乳酸の電
流値が求められる。第２電極で得られた電流値よりＬ−
乳酸による電流値を差し引いた残りがＤ−乳酸による電
流値なので、この値と検量線３によってＤ−乳酸の濃度
を求めることができる。
した。第１、第２電極で得られた電流値、標準液測定に
より算出した検量線より算出したＤ−乳酸、Ｌ−乳酸の
濃度は表２のようになった。未知試料中の乳酸の濃度算
出方法は、まず第１電極で得られた電流値より検量線１
によって試料中のＬ−乳酸濃度が求められる。この濃度
より検量線２によって第２電極に関与するＬ−乳酸の電
流値が求められる。第２電極で得られた電流値よりＬ−
乳酸による電流値を差し引いた残りがＤ−乳酸による電
流値なので、この値と検量線３によってＤ−乳酸の濃度
を求めることができる。
【００５１】
【表２】
【００５２】実施例２ （１）Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラムの製造 実施例１と同様にＬ−乳酸酸化酵素固定化カラムを作成
した。 （２）Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化カラムの製造 実施例１と同様にＤ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨ固定化カラム
を作成した。 （３）過酸化水素電極の製造 実施例１と同様に過酸化水素電極を作成した。
した。 （２）Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化カラムの製造 実施例１と同様にＤ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨ固定化カラム
を作成した。 （３）過酸化水素電極の製造 実施例１と同様に過酸化水素電極を作成した。
【００５３】（４）測定装置 図２に示すフロー型測定装置によってＬ−乳酸、Ｄ−乳
酸の測定を行う。緩衝液槽（２１）より緩衝液をポンプ
１（２２）により送液し、切り替バルブ（２３）に送
る。この切り替バルブは六方バルブであり、ロード側で
はＡとＢ、ＣとＤ、ＥとＦが接続している。インジェク
ト側では、ＢとＣ、ＤとＥ、ＦとＡが接続する。Ａには
ポンプ１（２２）、ＢにはＬ−乳酸酸化酵素カラム（２
８）が配置されており、ＣとＦはＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤ
Ｈカラム（２５）で接続されている。またＥには試料注
入口（２４）、Ｄには試料を吸引するポンプ２（２６）
を接続する。
酸の測定を行う。緩衝液槽（２１）より緩衝液をポンプ
１（２２）により送液し、切り替バルブ（２３）に送
る。この切り替バルブは六方バルブであり、ロード側で
はＡとＢ、ＣとＤ、ＥとＦが接続している。インジェク
ト側では、ＢとＣ、ＤとＥ、ＦとＡが接続する。Ａには
ポンプ１（２２）、ＢにはＬ−乳酸酸化酵素カラム（２
８）が配置されており、ＣとＦはＤ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤ
Ｈカラム（２５）で接続されている。またＥには試料注
入口（２４）、Ｄには試料を吸引するポンプ２（２６）
を接続する。
【００５４】ロード側の場合はポンプ１（２２）より送
液された緩衝液はＡに送られ、Ｂから出て３０℃の恒温
槽（２７）中のＬ−乳酸酸化酵素カラム（２８）へ送液
される。試料はＥより注入され、ＦよりＤ−ＬＤＨ、Ｌ
−ＬＤＨカラム（２５）へ送液され、Ｃから出てＤへと
接続される。この状態でポンプ２（２６）を停止させる
と一定量の試料（約１００μｌ）はＤ−ＬＤＨ、Ｌ−Ｌ
ＤＨカラム（２５）内で変換反応を行う。ただし、Ｄ−
ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨでの反応条件を一定にするため、試
料は５ｍＭＮＡＤ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、５０
ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリウムを含みｐＨ
７．０に調製する。もちろんＮＡＤがなければ試料はＤ
−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨカラム内で反応しない。そのため
ＮＡＤを含む試料、含まない試料を注入することでＤ−
ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨカラムで反応したもの、しないもの
をそれぞれ測定することができる。またポンプ２（２
６）の停止時間は３分間であった。
液された緩衝液はＡに送られ、Ｂから出て３０℃の恒温
槽（２７）中のＬ−乳酸酸化酵素カラム（２８）へ送液
される。試料はＥより注入され、ＦよりＤ−ＬＤＨ、Ｌ
−ＬＤＨカラム（２５）へ送液され、Ｃから出てＤへと
接続される。この状態でポンプ２（２６）を停止させる
と一定量の試料（約１００μｌ）はＤ−ＬＤＨ、Ｌ−Ｌ
ＤＨカラム（２５）内で変換反応を行う。ただし、Ｄ−
ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨでの反応条件を一定にするため、試
料は５ｍＭＮＡＤ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、５０
ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリウムを含みｐＨ
７．０に調製する。もちろんＮＡＤがなければ試料はＤ
−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨカラム内で反応しない。そのため
ＮＡＤを含む試料、含まない試料を注入することでＤ−
ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨカラムで反応したもの、しないもの
をそれぞれ測定することができる。またポンプ２（２
６）の停止時間は３分間であった。
【００５５】そしてバルブをインジェクト側へ切り替え
ると緩衝液はＡからＦに送られ、一定量のＤ−ＬＤＨ、
Ｌ−ＬＤＨカラム内で反応した試料がＣからＢへ送られ
る。Ｌ−乳酸酸化酵素カラム（２８）を通過する際に、
Ｌ−乳酸より過酸化水素が生成し、過酸化水素電極（２
９）により電流値の変化を検出する。電極で電流値の変
化は検出器（３０）により検出される。さらに信号をパ
ーソナルコンピュータ（３２）に送ることもできる。
ポンプで送液される緩衝液の組成は１００ｍＭリン酸ナ
トリウム、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリ
ウムを含みｐＨ７．０である。ポンプ１の流速は１．０
ｍｌ／分であった。
ると緩衝液はＡからＦに送られ、一定量のＤ−ＬＤＨ、
Ｌ−ＬＤＨカラム内で反応した試料がＣからＢへ送られ
る。Ｌ−乳酸酸化酵素カラム（２８）を通過する際に、
Ｌ−乳酸より過酸化水素が生成し、過酸化水素電極（２
９）により電流値の変化を検出する。電極で電流値の変
化は検出器（３０）により検出される。さらに信号をパ
ーソナルコンピュータ（３２）に送ることもできる。
ポンプで送液される緩衝液の組成は１００ｍＭリン酸ナ
トリウム、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリ
ウムを含みｐＨ７．０である。ポンプ１の流速は１．０
ｍｌ／分であった。
【００５６】（５）標準液の測定 （４）の測定装置に蒸留水、０．０５、０．１０ｍＭの
Ｌ−乳酸、０．０５、０．１０ｍＭのＤ−乳酸を注入
し、３分間停止させ測定した。各々の試料はＮＡＤ５ｍ
Ｍ含むもの含まないものについて測定した。検出した電
流値は表３のようになり、次の検量線が得られた。ただ
し、Ｙは電流値（ｎＡ）、Ｘは試料中の乳酸濃度（ｍ
Ｍ）とする。 検量線１ ＮＡＤなし Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝６７９Ｘ
＋０．０８ 検量線２ ＮＡＤあり Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝３３７Ｘ
−０．０８ 検量線３ ＮＡＤあり Ｄ−乳酸検量線 Ｙ＝３３０Ｘ
−０．０３
Ｌ−乳酸、０．０５、０．１０ｍＭのＤ−乳酸を注入
し、３分間停止させ測定した。各々の試料はＮＡＤ５ｍ
Ｍ含むもの含まないものについて測定した。検出した電
流値は表３のようになり、次の検量線が得られた。ただ
し、Ｙは電流値（ｎＡ）、Ｘは試料中の乳酸濃度（ｍ
Ｍ）とする。 検量線１ ＮＡＤなし Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝６７９Ｘ
＋０．０８ 検量線２ ＮＡＤあり Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝３３７Ｘ
−０．０８ 検量線３ ＮＡＤあり Ｄ−乳酸検量線 Ｙ＝３３０Ｘ
−０．０３
【００５７】
【表３】
【００５８】（６）混合試料の測定 （４）の測定装置にＤ−乳酸とＬ−乳酸の混合液につい
てＮＡＤを含むもの含まないものについて測定した。得
られた電流値、標準液測定により算出した検量線より計
算したＤ−乳酸、Ｌ−乳酸濃度は表４のようになった。
未知試料中の乳酸の濃度算出方法は実施例１と同様に行
った。
てＮＡＤを含むもの含まないものについて測定した。得
られた電流値、標準液測定により算出した検量線より計
算したＤ−乳酸、Ｌ−乳酸濃度は表４のようになった。
未知試料中の乳酸の濃度算出方法は実施例１と同様に行
った。
【００５９】
【表４】
【００６０】
【発明の効果】本発明の測定装置を用いることにより、
Ｄ−乳酸とＬ−乳酸の測定が短時間で正確に簡単にでき
るようになった。また、溶液のＬ−ＬＤＨ，Ｄ−ＬＤＨ
を使用したＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定に比べ、本発明で
は酵素の繰り返し利用が可能となり、酵素の反応条件を
調整し易くなった。
Ｄ−乳酸とＬ−乳酸の測定が短時間で正確に簡単にでき
るようになった。また、溶液のＬ−ＬＤＨ，Ｄ−ＬＤＨ
を使用したＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定に比べ、本発明で
は酵素の繰り返し利用が可能となり、酵素の反応条件を
調整し易くなった。
【図１】図１は実施例１で用いたフロー型Ｄ−乳酸Ｌ−
乳酸測定装置の図である。
乳酸測定装置の図である。
【図２】図２は実施例２で用いたフロー型Ｄ−乳酸Ｌ−
乳酸測定装置の図である。
乳酸測定装置の図である。
【図３】図３は本発明の他の態様を示す。
１ 緩衝液槽 ２ ポンプ ３ サンプラ ４ 恒温槽 ５ 三方ジョイント ６ Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラム ７ 過酸化水素電極（第１電極） ８ Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化カラム ９ Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラム １０ 過酸化水素電極（第２電極） １１ 検出器 １２ シングルボードコンピュータ １３ ＲＳ２３２Ｃコード １４ パーソナルコンピュータ １５ サンプラ制御信号 １６ 送液ポンプ制御信号 １７ 廃液 ２１ 緩衝液槽 ２２ ポンプ１ ２３ 切り替バルブ ２４ 試料注入口 ２５ Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化カラム ２６ ポンプ２ ２７ 恒温槽 ２８ Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラム ２９ 過酸化水素電極 ３０ 検出器 ３１ シングルボードコンピュータ ３２ パーソナルコンピュータ ３３ ＲＳ２３２Ｃコード ３４ 送液ポンプ制御信号 ３５ 廃液 ４１ 緩衝液槽 ４２ ポンプ ４３ サンプラ ４４ Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラム ４５ 過酸化水素電極（第１電極） ４６ Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化カラム ４７ Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラム ４８ 過酸化水素電極（第２電極） ４９ 恒温槽 ５０ 検出器 ５１ シングルボードコンピュータ ５２ パーソナルコンピュータ ５３ ＲＳ２３２Ｃコード ５４ サンプラ制御信号 ５５ 送液ポンプ制御信号 ５６ 廃液
Claims (6)
- 【請求項１】Ｄ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱水素酵
素を含む酵素固定化体、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドと試料を前記酵素固定化体に接触させる機
構、及びＬ−乳酸測定機構を具備するＤ−乳酸とＬ−
乳酸の測定装置。 - 【請求項２】上流より、送液されるキャリヤー中へ試料
を注入する機構、Ｄ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱水素
酵素を含む酵素固定化体を内包するリアクター、並びに
Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体及びＬ−乳酸酸化酵素により
試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増加または減少する
電極活性物質を検知する電極、を具備するフロー方式の
Ｄ−乳酸とＬ−乳酸の測定装置。 - 【請求項３】Ｄ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱水素酵素
を含む酵素固定化体と試料を含むキャリヤーが接触した
状態で、キャリヤーの送液を停止又は流速を低下させる
機構を有する請求項２記載の測定装置。 - 【請求項４】前記リアクターの上流側に、更にＬ−乳酸
酸化酵素固定化体及びＬ−乳酸酸化酵素により試料中の
Ｌ−乳酸が酸化される際に増加または減少する電極活性
物質を検知する電極を設けた請求項２記載の測定装置。 - 【請求項５】ａ．試料とニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドをＤ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱水素酵素を
含む酵素固定化体に接触させ、試料中のＤ−乳酸とＬ−
乳酸との変換反応を行った後にＬ−乳酸を測定する工
程、ｂ．試料中のＬ−乳酸を測定する工程、を含むＤ−
乳酸とＬ−乳酸の測定方法。 - 【請求項６】ａ．試料とニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドをＤ−乳酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱水素酵素を
含む酵素固定化体に接触させ、試料中のＤ−乳酸とＬ−
乳酸との変換反応を行う工程、及び ｂ．試料中のＬ−乳酸がＬ−乳酸酸化酵素により酸化さ
れる際に増加又は減少する電極活性物質を電気化学的に
検出する工程、を含むＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定方法で
あり、 ・工程ｂにおいて試料としてＬ−乳酸標準液を用い、Ｌ
−乳酸濃度と出力値の関係を示す検量線１を求め、 ・試料としてＬ−乳酸標準液を用い工程ａを行い、次に
その試料につき工程ｂを行いＬ−乳酸濃度と出力値の関
係を示す検量線２を求め、 ・試料としてＤ−乳酸標準液を用い工程ａを行い、次に
その試料につき工程ｂを行いＤ−乳酸濃度と出力値の関
係を示す検量線３を求め、 ・更に、工程ｂにおいて試料として測定試料を用い、出
力値１を測り、 ・試料として測定試料を用い工程ａを行い次に工程ｂを
行い出力値２を測り、 出力値１，出力値２，検量線１，検量線２，検量線３よ
り測定試料中のＤ−乳酸量とＬ−乳酸量を計算するＤ−
乳酸とＬ−乳酸の測定方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04327057A JP3104445B2 (ja) | 1992-12-07 | 1992-12-07 | 乳酸の測定装置及び測定方法 |
| US08/067,960 US5510244A (en) | 1992-01-30 | 1993-05-27 | Apparatus and method for assaying optical isomers |
| GB9311118A GB2267343B (en) | 1992-05-29 | 1993-05-28 | An apparatus and method for assaying optical isomers |
| DE4317958A DE4317958C2 (de) | 1992-05-29 | 1993-05-28 | Vorrichtung und Verfahren zur Analyse von optischen Isomeren |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04327057A JP3104445B2 (ja) | 1992-12-07 | 1992-12-07 | 乳酸の測定装置及び測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06169798A JPH06169798A (ja) | 1994-06-21 |
| JP3104445B2 true JP3104445B2 (ja) | 2000-10-30 |
Family
ID=18194822
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04327057A Expired - Fee Related JP3104445B2 (ja) | 1992-01-30 | 1992-12-07 | 乳酸の測定装置及び測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3104445B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4934817B2 (ja) * | 2006-03-31 | 2012-05-23 | 国立大学法人 香川大学 | マイクロフロー型バイオセンサおよび希少糖の検出または定量への使用 |
-
1992
- 1992-12-07 JP JP04327057A patent/JP3104445B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06169798A (ja) | 1994-06-21 |
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