JP3214156B2 - 光学異性体の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素反応を利用したＤ
−乳酸とＬ−乳酸等の光学異性体の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】乳酸発酵は、従来より食品工業の分野で
広く利用されている。例えば微生物による乳酸発酵は乳
酸や乳飲料の生産だけでなく、チーズ、バター、清酒、
しょうゆ、みそ、漬物等の生産に利用されている。これ
らの乳酸発酵に用いられる微生物としては、乳酸菌と糸
状菌がある。このうち乳酸菌では菌種によって、Ｄ−乳
酸のみを生産するもの、Ｌ−乳酸のみを生産するもの、
Ｄ−乳酸とＬ−乳酸の混合物を生産するもの等が知られ
ており、発酵過程でのＤ−乳酸及びＬ−乳酸の測定は発
酵制御、コンタミネーションの発見等に欠かせないもの
である。

【０００３】従来、Ｄ−乳酸の測定は、Ｄ−乳酸脱水素
酵素（以下Ｄ−ＬＤＨと略す）と補酵素ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略す）をもちい
て、生成した還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（以下ＮＡＤＨと略す）もしくはピルビン酸を吸光
光度法や蛍光強度法で測定していた。しかし、この測定
法では、Ｄ−ＬＤＨの性質より様々な問題があった。第
１に、反応効率が低いため、実用的なレベルでは必要と
する酵素量が多過ぎて、測定におけるコストが高くな
る。用いる酵素量を減少させるためには、反応時間を長
くしたり、反応温度を調節するという手段が考えられる
が、さらに繁雑な操作や測定時間の延長等のマイナス要
因となっていた。第２点として、Ｄ−ＬＤＨの関与する
反応の平衡はＮＡＤＨとピルビン酸からＤ−乳酸を生成
する方向に傾いているため、全てのＤ−乳酸が変化しつ
くす前に反応が停止してしまう。そのため生成したピル
ビン酸を、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ
により消費する等の手段が必要であり、反応工程が複雑
化するとともに分析コストが上昇していた。

【０００４】また、Ｄ−乳酸のみでなく、Ｌ−乳酸を測
定するためには、Ｄ−乳酸と同様の測定をＬ−乳酸脱水
素酵素（以下Ｌ−ＬＤＨと略す）を用いて行い、その後
もう一回Ｄ−乳酸を分析する必要がある。そのため操作
は複雑となり、測定時間、コストが２倍になる。さらに
乳酸脱水素酵素のみを用いる測定方法では、その反応の
一般的検出手段が反応により変化するＮＡＤもしくはＮ
ＡＤＨの紫外域における吸光度変化であり、試料の濁り
や着色物質の影響を受けやすいという欠点があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
を解決し、Ｄ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨをもちいた、Ｄ−乳
酸およびＬ−乳酸の２成分を短時間で精度良く測定する
方法を提供することを目的とする。また、本発明はＤ−
グルタミン酸とＬ−グルタミン酸，Ｄ−ロイシンとＬ−
ロイシン，Ｄ−ガラクトースとＬ−ガラクトース等の他
の光学異性体を測定する方法を提供する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、光学異性体の
Ｌ−体及び／又はＤ−体を含む試料中のＬ−体及びＤ−
体の測定方法であって、試料中の光学異性体のＬ−体
を測定する工程；及び該光学異性体のＬ−脱水素酵素
及びＤ−脱水素酵素、並びに補酵素酸化体の存在下で試
料中のＬ−体とＤ−体の変換反応を行い、次いで前記変
換反応後のＬ−体を測定する工程を含む試料中の光学異
性体のＬ−体及びＤ−体の測定方法である。また、光学
異性体のＬ−体及び／又はＤ−体を含む試料中のＬ−体
及びＤ−体の測定方法であって、試料中の光学異性体
のＤ−体を測定する工程；及び該光学異性体のＬ−脱
水素酵素及びＤ−脱水素酵素、並びに補酵素酸化体の存
在下で試料中のＬ−体とＤ−体の変換反応を行い、次い
で前記変換反応後のＤ−体を測定する工程を含む試料中
の光学異性体のＬ−体及びＤ−体の測定方法である。

【０００７】また、試料中の光学異性体のＬ−体を測定
する工程が、Ｌ−体の酸化酵素によりＬ−体を酸化し、
該酸化酵素の反応により増加し、または減少する電極活
性物質を検知することからなる上記の測定方法を開示す
る。また、試料中の光学異性体のＤ−体を測定する工程
が、Ｄ−体の酸化酵素によりＤ−体を酸化し、該酸化酵
素の反応により増加し、または減少する電極活性物質を
検知することからなる上記の測定方法を開示する。

【０００８】光学異性体のＬ−体とＤ−体が、各々Ｌ−
乳酸とＤ−乳酸，Ｌ−グルタミン酸とＤ−グルタミン
酸，Ｌ−ロイシンとＤ−ロイシン，又はＬ−ガラクトー
スとＤ−ガラクトースであり、Ｌ−脱水素酵素とＤ−脱
水素酵素が各々Ｌ−乳酸脱水素酵素とＤ−乳酸脱水素酵
素，Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素とＤ−グルタミン酸脱
水素酵素，Ｌ−ロイシン脱水素酵素とＤ−ロイシン脱水
素酵素，又はＬ−ガラクトース脱水素酵素とＤ−ガラク
トース脱水素酵素である上記の測定方法を開示する。

【０００９】本発明は、試料中のＬ−乳酸を測定する
工程、Ｌ−乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱水素酵素、及
びＮＡＤの存在下で試料中のＤ−乳酸とＬ−乳酸の平衡
反応を行い、前記平衡反応後のＬ−乳酸を測定する工
程、を含む試料中のＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定方法であ
る。

【００１０】また本発明は、Ｌ−乳酸を測定する工程
が、Ｌ−乳酸酸化酵素により試料中のＬ−乳酸を酸化し
増加又は減少する電極活性物質量を検知することによる
上記の測定方法を開示する。また本発明は、Ｌ−乳酸を
測定する工程が、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体に試料を接
触せしめ、酸素の減少もしくは過酸化水素の増加を電気
化学的に検出するＬ−乳酸の測定工程である上記の測定
方法を開示する。

【００１１】更に、本発明は、Ｌ−乳酸脱水素酵素、Ｄ
−乳酸脱水素酵素、及びＮＡＤの存在下でＤ−乳酸とＬ
−乳酸の平衡反応を行うための、Ｌ−乳酸脱水素酵素、
Ｄ−乳酸脱水素酵素、及びＮＡＤを含む測定キットを開
示する。

【００１２】尚、Ｌ−体（又はＤ−体）の表現は、同一
の文章の中でＬ−体かＤ−体のどちらか一方のみを読む
ものであり、２つの文章を省略して１つの文章で記載し
たものである。

【００１３】

【作用】Ｄ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨの反応を次式に示す。 Ｄ−ＬＤＨ反応： Ｄ−乳酸＋ＮＡＤ⁺＝ピルビン酸＋
ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ Ｌ−ＬＤＨ反応： Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ⁺＝ピルビン酸＋
ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ どちらの反応も可逆的であるが、どちらの酵素も平衡は
乳酸とＮＡＤが生成する方向に傾いている。そのため、
ＮＡＤの存在下でＤ−ＬＤＨを多量に試料に接触させて
も、ほとんどピルビン酸へ変化しない。Ｌ−ＬＤＨにつ
いても同様である。

【００１４】しかし本発明者らは、Ｄ−ＬＤＨを用いて
Ｄ−乳酸の測定を行うことができるより有利な反応を検
討した結果、Ｄ−乳酸にＤ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨを作用
させると、生成したピルビン酸とＮＡＤＨからＬ−乳酸
を生成することを見いだした。またＬ−乳酸にＤ−ＬＤ
ＨとＬ−ＬＤＨを作用させると、Ｌ−乳酸が減少する。

【００１５】ＬＤＨの活性は一般にピルビン酸から乳酸
を生成する速度を測定することにより定義される。Ｄ−
ＬＤＨに対するＬ−ＬＤＨの比率は、活性で表した場合
略１／１０から略２０倍まで用いることができるが、１
／２〜１０倍の範囲が好ましく、より好ましくは１／２
〜５倍、更に好ましくは１〜５倍である。Ｄ−ＬＤＨに
対するＬ−ＬＤＨの比率を略１倍から略５倍に増加させ
ても、Ｄ−乳酸よりＬ−乳酸が生成する速度にはあまり
変化がない。この反応ではＤ−乳酸、Ｌ−乳酸のどちら
でも、また混合されていても、常にＤ−乳酸とＬ−乳酸
の比率が一定になるまで平衡反応が進行する。即ち、Ｄ
−乳酸：Ｌ−乳酸＝１：１程度となる。

【００１６】Ｄ−ＬＤＨとＬ−ＬＤＨの反応はそれぞれ
知られていたが、両者の反応を組み合わせることによ
り、例えばＤ−乳酸からＬ−乳酸に効率的に変換できる
ことは、全く予期できない事実である。この新事実に基
づいてＤ−乳酸よりＬ−乳酸の変換を行う事が出来る。
また、この工程と、Ｌ−乳酸の選択的測定法を組み合わ
せれば、Ｄ−乳酸とＬ−乳酸の定量が可能となる。尚、
以上に平衡反応が略一定状態になるまで進行した状態で
測定する場合を中心に説明したが、Ｄ−乳酸とＬ−乳酸
の変換反応途中であっても反応条件を正確に調整して検
量線を作成すれば反応途中でＬ−乳酸を測定しても本発
明のＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定を行うことが出来る。

【００１７】次に、このＬ−乳酸の選択的測定法と組み
合わせたＤ−乳酸とＬ−乳酸の定量方法について更に説
明する。生成したＬ−乳酸は、Ｄ−乳酸やＮＡＤ等のＬ
−乳酸以外の物質が存在していても影響のない方法で測
定しなければならない。そしてＬ−乳酸酸化酵素を用い
た測定法が利用できる。

【００１８】Ｌ−乳酸酸化酵素の反応を次式に示す。 Ｌ−乳酸＋Ｏ₂ →ピルビン酸＋Ｈ₂ Ｏ₂ この反応は、Ｄ−乳酸、ＮＡＤが共存していても影響さ
れない。そして生成した過酸化水素、または減少した酸
素を検出することによって、或いはジクロロインドフェ
ノール、フェリシアン化カリウム、ベンゾキノンなどの
電子伝達体、所謂メディエーターを介在させることによ
ってＬ−乳酸を検出することができる。

【００１９】この方法により、あらかじめ試料のＬ−乳
酸を測定し、次に前記のＤ−乳酸からＬ−乳酸への変換
を行った後にＬ−乳酸を測定すればその差から、Ｄ−乳
酸が測定できる。Ｄ−乳酸とＬ−乳酸が一定の比率にな
るまで反応が終了していなくても、単位時間当りのＤ−
乳酸からのＬ−乳酸の生成率、Ｌ−乳酸の減少率が一定
であるので酵素の反応時間を一定にしておけば、反応の
前後の比較でＤ−乳酸とＬ−乳酸の定量が可能である。

【００２０】Ｌ−乳酸酸化酵素を用いたＬ−乳酸の定量
には、減少した酸素または増加した過酸化水素等を検出
すればよい。これには、例えばパーオキシダーゼと２，
２’−アジノ−ジ（３−エチルベンツチアゾリン）−６
−スルホン酸または４−アミノアンチピリンを用いた方
法（トリンダー法）等により、可視部の吸光度を測定す
ることにより測定できる。可視部の吸光度測定は紫外部
の吸光度測定に比べ、濁りの影響を受けにくい。

【００２１】また、酸素、過酸化水素の増減等を電極に
よって電流値に変換して測定する電気化学的測定法は分
光光度計を用いる測定と比較して試料の濁りや、着色物
質を含んでいても影響されず、操作が簡単であり好まし
い。Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ、Ｌ−乳酸酸化酵素の使用
法は溶液で用いることもできるが固定化して用いること
もできる。溶液でもちいる場合は、反応に必要な酵素量
を試料に加えることができるが、酵素は使い捨てとなる
ため測定コストは上昇する。固定化して用いると酵素の
繰り返し利用が可能となることや、酵素の反応条件を調
整し易い等の利点がある。

【００２２】酵素の固定化法は、吸着法、化学結合法、
包括法等のいずれでも良い。固定化に用いる担体にはケ
イソウ土、シリカゲル、ガラスビーズ、アルミナ、セラ
ミック、カーボン、活性炭、モレキュラーシーブ、シリ
コンゴム、セルロース、アガロース、アミノ酸系ポリマ
ー等が使用できる。固定化酵素は、例えばカラム等につ
めてリアクタを構成する。

【００２３】特に反応速度が比較的早いＬ−乳酸酸化酵
素を固定化することにより高感度でかつ簡便な測定装置
を構成できる。酸素、過酸化水素の増減はもちろん、比
色法により検出できるが電気化学的測定法が試料の濁り
や、着色物質を含んでいても影響せず、操作が簡単で優
れた方法である。通常、過酸化水素測定用の電極は、セ
ルに組み込まれる。セルの素材はアクリル、フッ素樹
脂、塩化ビニル樹脂、ガラス等の非導電性素材、またス
テンレス、金、白金等の導電性素材或いはこれらを組み
合わせたものを用いることができる。導電性素材を使用
する場合は、電極系との電気的絶縁処理を行っておく等
の注意を要する。電極としては、作用電極・対極より構
成される２電極系、または作用電極・参照電極・対極よ
り構成される３電極系を例示することができる。電極は
例えば測定セル底面中に導電性物質を埋め込んだり、内
壁表面に金属を蒸着する方法、溶液メッキ法、無電解メ
ッキ法、印刷等の方法で形成することができる。対極と
参照電極は、溶液間抵抗の影響を小さく抑えるために作
用電極の近傍に設けることが望ましい。

【００２４】作用電極には、金、白金、銀などの金属電
極あるいはグラッシーカーボン、カーボンペーストなど
の通常電気化学計測で用いられる素材が利用できる。対
極には作用極ですでに例示した材質やステンレス等の導
電性素材を用いることができ、ステンレスなどの導電性
素材を用いて構成したセルの接液部を対極とすることも
できる。参照電極には銀・塩化銀参照電極・飽和カロメ
ル参照電極など一般的なものを例示できる。下記表１に
基づきＤ−乳酸，Ｌ−乳酸，Ｄ−及びＬ−乳酸脱水素酵
素，ＮＡＤ，Ｌ−乳酸酸化酵素の代わりに表１の第２段
以下に記載したものに置き換えれば、表１の左欄に示し
た光学異性体の測定を乳酸と同様にして行うことができ
る。

【表１】

【００２５】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細
に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定されるも
のではない。

【００２６】実験Ａ 各種濃度のＬ−乳酸にＮＡＤ、Ｄ−ＬＤＨ、及びＬ−Ｌ
ＤＨを接触させ一定時間後にＬ−乳酸濃度を測定した。
Ｌ−乳酸測定は、固定化Ｌ−乳酸酸化酵素カラムによ
り、生成した過酸化水素を白金電極で測定する方法で行
った。

【００２７】（１）Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラムの製
造方法 ケイソウ土系ケイ酸担体である耐火レンガ（３０〜６０
メッシュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノ
プロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時
間浸漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こう
してアミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデ
ヒドに１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後に
ｐＨ７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置
き換え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホル
ミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液にペディオコッカスのＬ−乳酸酸化酵
素を５０ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μ
ｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この
酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラ
ムに充填しＬ−乳酸酸化酵素固定化カラムを得た。

【００２８】（２）過酸化水素電極の製造方法 直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ
硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その
後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、
１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水ト
ルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミ
ン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇを蒸
留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に
用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥
硬化することにより、アスコルビン酸等の測定妨害物質
の悪影響を除く選択透過膜を形成した。これを過酸化水
素電極の作用極とした。

【００２９】また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照
電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。作用極、
参照電極、対極を含む過酸化水素電極（６）は、セルに
おさめ、Ｌ−乳酸測定装置に組み込んだ。

【００３０】（３）Ｌ−乳酸測定装置 図１に示すフロー型Ｌ−乳酸測定装置によってＬ−乳酸
の測定を行う。緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ
（２）により送液し、オートサンプラ（３）より試料５
μｌを注入する。試料中のＬ−乳酸より、恒温槽（４）
中のＬ−乳酸酸化酵素固定化カラム（５）によって過酸
化水素が生成し、過酸化水素電極（６）により電流値の
変化が捕らえられ、検出器（７）により検出される。さ
らに信号をパーソナルコンピュータ（１０）に送ること
もできる。

【００３１】緩衝液の組成は１００ｍＭリン酸ナトリウ
ム、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリウムを
含みｐＨ７．０である。

【００３２】（４）測定方法 反応系での濃度をＮＡＤ５ｍＭ、Ｄ−ＬＤＨ５４．３ユ
ニット／ｍｌ、Ｌ−ＬＤＨ５４．３ユニット／ｍｌと
し、ｐＨ７．０、試料はＬ−乳酸１ｍＭ、Ｌ−乳酸
５ｍＭ、Ｌ−乳酸１０ｍＭで、全容量が２ｍｌであ
る。この試料を３０℃の恒温槽で、反応５分後、１０分
後、２０分後のＬ−乳酸濃度を求め、反応前のＬ−乳酸
に対して検出したＬ−乳酸の割合を求め検出率とした。

【００３３】検量線は蒸留水をブランクに、１、２、
５、１０ｍＭのＬ−乳酸を測定して作成した。また、基
質を含まない反応液を測定し、Ｌ−乳酸が検出されない
ことを確認した。さらに酵素を含まない試料について測
定した。

【００３４】（５）結果 １ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭそれぞれの５分後の検出率は
０．５６、０．５６、０．５４であり、１０分後の検出
率は、それぞれ０．５０、０．５１、０．４９であっ
た。また２０分後の検出率は、それぞれ０．５１、０．
５１、０．５０であった。濃度が異なっても、一定時間
後の反応率は同じであった。このように略１０分以上反
応させた場合検出率は０．５でほぼ一定となることがわ
かる。

【００３５】実験Ｂ 全乳酸濃度が同じであるＤ−乳酸、Ｌ−乳酸それにＤ、
Ｌ混合乳酸にＮＡＤ、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨを接触さ
せ一定時間後にＬ−乳酸濃度を測定した。Ｌ−乳酸測定
は、上記の実験Ａと同様にＬ−乳酸酸化酵素を固定化
し、生成した過酸化水素を白金電極で測定する方法で行
った。測定に用いたＬ−乳酸酸化酵素固定化カラム、白
金電極を作用極とした過酸化水素電極、Ｌ−乳酸測定装
置は実験Ａと同じである。

【００３６】（１）測定方法 反応系での濃度がＮＡＤ５ｍＭ、Ｄ−ＬＤＨ５４．３ユ
ニット／ｍｌ、Ｌ−ＬＤＨ５４．３ユニット／ｍｌとし
た。ｐＨはｐＨ７．０に調整した。乳酸濃度はすべて５
ｍＭで、Ｄ−乳酸のみ、Ｌ−乳酸のみ、Ｄ−乳酸
２．５ｍＭとＬ−乳酸２．５ｍＭの混合物で、全容量が
２ｍｌである。この試料を３０℃の恒温槽で、反応５分
後、１０分後のＬ−乳酸濃度を求めた。検量線は蒸留水
をブランクに、１、２、５、１０ｍＭのＬ−乳酸を測定
して作成した。また、基質を含まない反応液を測定し、
Ｌ−乳酸の検出値が得られないことを確認した。

【００３７】さらに酵素を含まない試料について測定し
た。

【００３８】（２）結果 反応開始５分後のＤ−乳酸のみの試料からの検出率は
０．４８、Ｌ−乳酸のみの試料からの検出率は０．５
６であり、Ｄ−乳酸とＬ−乳酸の混合試料については
Ｄ，Ｌ−乳酸の合計量に対するＬ−乳酸の生成量の比率
は０．５１であった。１０分後のＤ−乳酸のみの試料
からの検出率は０．５１、Ｌ−乳酸のみの試料からの
検出率は０．５１であり、Ｄ−乳酸とＬ−乳酸の混合
試料についてはＤ，Ｌ−乳酸の合計量に対するＬ−乳酸
の生成量の比率は０．５１であった。このように１０分
後の検出率は、組成にかかわらず、ほぼ０．５で一定と
なった。つまり、一定時間後の反応率はＤ、Ｌそれぞれ
で一定であることがわかった。

【００３９】実施例１ Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸の標準液とＤ−乳酸、Ｌ−乳酸混合
試料について、ＮＡＤ、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨを接触
させ一定時間後にＬ−乳酸濃度を測定した。また酵素を
加えない反応前の試料についてもＬ−乳酸濃度を測定し
た。実験Ａと同様にＬ−乳酸酸化酵素を固定化し、生成
した過酸化水素を白金電極で測定する方法で行った。測
定に用いたＬ−乳酸酸化酵素固定化カラム、白金電極を
作用極とした過酸化水素電極、Ｌ−乳酸測定装置は実験
Ａと同じである。

【００４０】（１）測定方法 反応系での濃度をＮＡＤ５ｍＭ、Ｄ−ＬＤＨ５４．３ユ
ニット／ｍｌ、Ｌ−ＬＤＨ５４．３ユニット／ｍｌと
し、ｐＨ７．０で、１つの試料について酵素を加えない
もの、酵素を加えて３０℃で１０分以上反応させたもの
（約２０分間）、の２点について測定した。測定は蒸留
水をブランクに用いて、１、２、５、１０ｍＭのＤ−乳
酸、Ｌ−乳酸の標準液の酵素なし、酵素反応後について
それぞれの電流値より検量線を作成した。試料は、
（イ）Ｄ−乳酸２．５ｍＭ、Ｌ−乳酸５ｍＭ、（ロ）Ｄ
−乳酸５ｍＭ、Ｌ−乳酸２．５ｍＭ、（ハ）Ｄ−乳酸５
ｍＭ、Ｌ−乳酸５ｍＭをそれぞれ含む３種類である。

【００４１】（２）結果

【００４２】

【表２】

【００４３】標準液の酵素なし、酵素反応後の電流値は
〔表２〕のようになり、次の検量線が得られた。ただ
し、Ｙは電流値（ｎＡ）、Ｘは反応前の試料中の乳酸濃
度（ｍＭ）とする。 検量線１、酵素なし Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝５５．６
６Ｘ−２．４４ 検量線２、酵素反応後 Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝２７．５
４Ｘ−０．５２ 検量線３、酵素反応後 Ｄ−乳酸検量線 Ｙ＝２７．３
６Ｘ−０．３９ この検量線より、試料（イ），（ロ），（ハ）のＤ−乳
酸、Ｌ−乳酸の濃度は、得られた電流値より〔表３〕の
ように精度よく求めることができた。計算法の一例を下
記に示す。

【００４４】酵素反応前（酵素なし）の電流値と、検量
線１（酵素なし、Ｌ−乳酸検量線）より、試料にはじめ
から存在したＬ−乳酸量ｘ₁ が求まる。次に酵素反応後
の電流値と検量線１（酵素なし、Ｌ−乳酸検量線）より
酵素反応後のＬ−乳酸量ｘ₂が計算できる。実験Ａ，実
験Ｂより酵素反応後にはＤ，Ｌ乳酸とも、反応前の量に
約０．５を掛けた値となるから、ｘ₂ ＝０．５ｘ₁ ＋
０．５・（Ｄ−乳酸量）となり、Ｄ−乳酸量を求めるこ
とができる。

【００４５】

【表３】

【００４６】実施例２ 市販の各種乳酸飲料Ａ（関西ルナ製のヨーグルト），Ｂ
（ヤクルト社製の醗酵乳），Ｃ（協同乳業製の殺菌済乳
酸菌飲料），Ｄ（雪印乳業製のヨーグルト），Ｅ（雪印
乳業製の醗酵乳）のＤ−乳酸、Ｌ−乳酸、全乳酸濃度を
求めた。試料を２０〜４０倍に希釈し、ＮＡＤ、Ｄ−Ｌ
ＤＨ、Ｌ−ＬＤＨを接触させ一定時間後にＬ−乳酸濃度
を測定した。Ｌ−乳酸測定は、前記の実験Ａと同様にＬ
−乳酸酸化酵素を固定化し、生成した過酸化水素を過酸
化水素電極で測定する方法で行った。測定に用いたＬ−
乳酸酸化酵素固定化カラム、白金電極を作用極とする過
酸化水素電極、Ｌ−乳酸測定装置は実験Ａと同じであ
る。

【００４７】（１）測定方法 Ｌ−乳酸測定には試料希釈液をそのまま用い、Ｌ−乳
酸濃度を求めた。酵素反応後のＬ−乳酸測定：各試料
の希釈液０．５ｍｌに、ＮＡＤ１０ｍＭ、Ｄ−ＬＤＨ１
０ユニット／ｍｌ、Ｌ−ＬＤＨ５０ユニット／ｍｌ、を
含みリン酸濃度２００ｍＭでｐＨ７．５の反応液を０．
５ｍｌ加える。２時間以上室温で放置して反応させ、反
応を終了して、Ｌ−乳酸濃度を求めた。検量線は蒸留水
をブランクに用いて、１、２、５ｍＭのＬ−乳酸を測定
して作成した。得られた測定値より元濃度中の乳酸濃度
％に換算した。 （２）結果 乳酸飲料５種のＤ−乳酸、Ｌ−乳酸、全乳酸の濃度％は
表４のようになった。

【００４８】比較例１ 市販の各種乳酸飲料Ａ〜ＥのＤ−乳酸、Ｌ−乳酸、全乳
酸濃度をＦキット（ベーリンガー・山之内社）により求
めた。 （１）測定方法 本比較例では紫外領域（３４０ｎｍ）の吸光度を測定す
るため、試料の濁りが大きく影響するため、試料希釈液
の沈澱物を除く目的で遠心分離（１８０００ｒｐｍ ２
０分）した。したがって前処理が必要であった。得られ
た吸光度より乳酸濃度を求め元濃度中の乳酸濃度％に換
算した。即ち、Ｆキットにより試料にＮＡＤ、グルタミ
ン酸、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミラーゼを加
え混和し、分光光度計により３４０ｎｍの吸光度を測定
しブランクとした。さらにＤ−ＬＤＨを加え混和し、２
０分放置後吸光度を測定した。Ｄ−ＬＤＨによる吸光度
変化より試料中のＤ−乳酸濃度を算出した。Ｌ−乳酸測
定には、さらにこの反応液にＬ−ＬＤＨを加え、混和
し、２０分放置後吸光度を測定した。Ｌ−ＬＤＨによる
吸光度変化より、試料中のＬ−乳酸濃度を算出した。

【００４９】（２）結果 乳酸飲料５種のＤ−乳酸、Ｌ−乳酸、全乳酸の濃度％は
表５のようになった。この値をもとに実施例２による本
発明での測定値（Ｙ）と比較例１によるＦキットでの測
定値（Ｘ）の相関関係を調べた。 Ｄ−乳酸測定値 Ｙ＝１．０２Ｘ＋０．００ ｒ
＝１．０００ Ｌ−乳酸測定値 Ｙ＝０．９８Ｘ＋０．０２ ｒ
＝０．９９８ 全乳酸測定値 Ｙ＝１．０３Ｘ−０．０１ ｒ
＝０．９９９ Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸、全乳酸ともよく一致し、本発明に
よる方法で正確な測定が可能である。また本発明の測定
方法においては試料濁りの影響がなく、前処理を省略す
ることができた。

【００５０】

【表４】

【表５】

【００５１】

【発明の効果】本発明の乳酸測定法により、Ｄ−乳酸、
Ｌ−乳酸を、簡便に、精度よく定量することが可能とな
った。本発明では、Ｆキット法に比べ、ピぺット操作の
回数が少ないため簡便に行える。用いる試薬と酵素の種
類が少ないため操作が簡便に行え、コスト的にも安い。
測定濃度範囲が広く、Ｌ−乳酸測定装置の注入量を変化
させることにより変えることができる。測定に試料注入
装置を用いれば省力化ができる。等の特徴をもってい
る。また、本発明によりアミノ酸等の光学異性体の測定
を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例で用いたフロー型Ｌ−乳酸測定装
置の図である。

【符号の説明】

１ 緩衝液槽 ２ ポンプ ３ サンプラ ４ 恒温槽 ５ Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラム ６ 過酸化水素電極 ７ 検出器 ８ シングルボードコンピュータ ９ ＲＳ２３２Ｃコード １０ パーソナルコンピュータ １１ サンプラ制御信号 １２ 送液ポンプ制御信号 １３ 排液

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光学異性体のＬ−体及び／又はＤ−体を
   含む試料中のＬ−体及びＤ−体の測定方法であって、 試料中の光学異性体のＬ−体を測定する工程；及び
   該光学異性体のＬ−脱水素酵素及びＤ−脱水素酵素、並
   びに補酵素酸化体の存在下で試料中のＬ−体とＤ−体の
   変換反応を行い、次いで前記変換反応後のＬ−体を測定
   する工程を含む試料中の光学異性体のＬ−体及びＤ−体
   の測定方法。
2. 【請求項２】 光学異性体のＬ−体及び／又はＤ−体を
   含む試料中のＬ−体及びＤ−体の測定方法であって、 試料中の光学異性体のＤ−体を測定する工程；及び
   該光学異性体のＬ−脱水素酵素及びＤ−脱水素酵素、並
   びに補酵素酸化体の存在下で試料中のＬ−体とＤ−体の
   変換反応を行い、次いで前記変換反応後のＤ−体を測定
   する工程を含む試料中の光学異性体のＬ−体及びＤ−体
   の測定方法。
3. 【請求項３】 試料中の光学異性体のＬ−体を測定する
   工程が、Ｌ−体の酸化酵素によりＬ−体を酸化し、該酸
   化酵素の反応により増加し、または減少する電極活性物
   質を検知することからなる請求項１記載の測定方法。
4. 【請求項４】 試料中の光学異性体のＤ−体を測定する
   工程が、Ｄ−体の酸化酵素によりＤ−体を酸化し、該酸
   化酵素の反応により増加し、または減少する電極活性物
   質を検知することからなる請求項２記載の測定方法。
5. 【請求項５】 光学異性体のＬ−体とＤ−体が、各々Ｌ
   −乳酸とＤ−乳酸，Ｌ−グルタミン酸とＤ−グルタミン
   酸，Ｌ−ロイシンとＤ−ロイシン，又はＬ−ガラクトー
   スとＤ−ガラクトースであり、Ｌ−脱水素酵素とＤ−脱
   水素酵素が各々Ｌ−乳酸脱水素酵素とＤ−乳酸脱水素酵
   素，Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素とＤ−グルタミン酸脱
   水素酵素，Ｌ−ロイシン脱水素酵素とＤ−ロイシン脱水
   素酵素，又はＬ−ガラクトース脱水素酵素とＤ−ガラク
   トース脱水素酵素である請求項１または２記載の測定方
   法。
6. 【請求項６】試料中のＬ−乳酸を測定する工程、Ｌ
   −乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱水素酵素、及びＮＡＤの
   存在下で試料中のＤ−乳酸とＬ−乳酸の平衡反応を行
   い、前記平衡反応後のＬ−乳酸を測定する工程、を含む
   試料中のＤ−乳酸とＬ−乳酸の測定方法。
7. 【請求項７】 Ｌ−乳酸を測定する工程が、Ｌ−乳酸酸
   化酵素により試料中のＬ−乳酸を酸化し増加又は減少す
   る電極活性物質量を検知することによる請求項６記載の
   測定方法。