JP3123238B2 - ヌクレオシド誘導体の精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はジデオキシヌクレオシド
類、特に抗エイズ（ＡＩＤＳ）薬や抗ウイルス薬として
認可済み又は評価中の２′，３′−ジデオキシヌクレオ
シド誘導体の精製法に関する。２′，３′−ジデオキシ
イノシン（ｄｄＩ）、２′，３′−ジデオキシシチジン
（ｄｄＣ）及び３′−デオキシ−３′−アジドチミジン
（ＡＺＴ）は既に抗ＡＩＤＳ薬として米国食品医薬局
（ＦＤＡ）において認可されている。

【０００２】

【従来の技術】２′，３′−ジデオキシヌクレオシド誘
導体の製造方法は、これまで多く報告されている。これ
らの報告において、反応粗生成物から目的化合物を単離
精製する方法には、有機溶媒を用いる再結晶による精製
法(McCarthy et al.,J.Am.Chem.Soc.,(1966)88,1549 、
Mansuri et al.,J.Org.Chem.,(1989)43,4780、及びRobi
ns et al.,T etrahedron Lett.,(1984)25,367)、シリカ
ゲルクロマトグラフィーや合成吸着樹脂を用いる精製法
(USP 3,817,982、及びC.K.et al.,J.Med Chem.(1990)3
3,1553)が知られている。例えば、アデノシンを原料に
２′，３′−ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）を合成す
る際、原料アデノシンのグリコシド結合の切断により生
じたアデニン、未反応原料のアデノシン、デオキシアデ
ノシン等の核酸塩基、ヌクレオシド等（核酸誘導体類）
が副生する。ｄｄＡをこれら副生物から分離精製するの
に、再結晶による精製法、シリカゲルクロマトグラフィ
ーや樹脂を用いる精製法等それ自体公知の方法で行われ
るが、目的化合物と副生物、物理化学的性質の類似性か
ら、これまで知られている何れの分離方法を用いても、
目的化合物ｄｄＡを高純度で得るためには非常に低回収
率であり、またその操作が煩雑であり、工業的に実施可
能な精製法ではなかった。

【０００３】そこで、本発明は上記ｄｄＡとアドニン、
アデノシン、デオキシアデノシン等との混合物や２′，
３′−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）とヒポキサンチ
ン、イノシン、デオキシイノシン等との混合物からそれ
ぞれｄｄＡやｄｄＩを樹脂精製により単離する場合、通
常核酸誘導体類の精製に良く用いられる非極性多孔質樹
脂（例えば「ＳＰ−207 」三菱化成社製）を用い、これ
にｄｄＡ水溶液やｄｄＩ水溶液（ｐＨは７〜10）を接触
させてｄｄＡやｄｄＩを選択的に吸着させ、アルコール
により溶離する方法を試み、精製可能なことを見いだし
たが（特開平1-98496 、同1-175990、同1-165390、及び
同1-175991）、目的化合物の純度や回収率は必ずしも満
足できるものではなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】高純度の２′，３′−
ジデオキシヌクレオシド誘導体を不純物から高回収率で
分離精製することの出来る、工業的に有利な方法を開発
することが本発明の課題である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本課題を解決するべく、
本発明者は鋭意研究の結果、上記核酸誘導体類の不純物
を含有する２′，３′−ジデオキシヌクレオシド誘導体
をｐＨ12以上の塩基性水溶液とした後、有機溶媒による
抽出を行うことにより、又はそのような塩基性水溶液か
らの晶析を行うことにより、２′，３′−ジデオキシヌ
クレオシド誘導体を高純度かつ高回収率で精製できるこ
とを見いだし、このような知見に基づいて本発明を完成
した。

【０００６】即ち、本発明は、粗２′，３′−ジデオキ
シヌクレオシド誘導体を精製する方法において、該粗
２′，３′−ジデオキシヌクリオシド誘導体のｐＨが12
以上の塩基性水溶液から、該２′，３′−ジデオキシヌ
クレオシド誘導体を有機溶媒で抽出又は晶析することを
特徴とする精製方法に関するものである。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】図１にｄｄＡ及びｄｄＩの合成法の１列を
示す。ｄｄＡ及びｄｄＩは、それぞれ、アデノシン及び
イノシンを原料とし、これらからその２′及び３′位の
両水酸基を還元することにより合成することができる。
この反応は最終段階は核酸誘導体の５′−水酸基の保護
基を脱離する工程であるが、その１工程前の還元反応の
後、反応液を濃縮して有機溶媒を除去した後、水を加
え、ここに例えば水酸化ナトリウム水溶液を加えること
により塩基性とし、保護基の脱離反応が行われる。

【０００９】この反応終了液には、目的とするｄｄＡの
他にアデニン、アデノシン、デオキシアデノシン等が含
まれる。この反応液を塩基性を保った状態で、例えば２
−プロパノールによって抽出を行うことにより２−プロ
パノール中にｄｄＡを選択的に抽出し、一方アデニン、
アデノシン、デオキシアデノシンは塩基性水溶液中に残
り、この結果高選択的に目的物と不純物とを分離するこ
とができる。同様な方法で合成されれりｄｄＩの反応終
了液には、目的とするｄｄＩの他にヒポキサンチン、イ
ノシン、デオキシイノシン等の副生物が含まれるが、同
様の条件でアルコール抽出を行うことによりアルコール
中にｄｄＩを選択的に抽出し、一方副生物は塩基性水溶
液中に残り、この結果高選択的に目的物と不純物とを分
離することができる。

【００１０】また、ｄｄＡ、アデニン、アデノシン、デ
オキシアデノシン等を含むｐＨ12以上の塩基性水溶液、
又はｄｄＩ、ヒポキサンチン、イノシン、デオキシイノ
シン等を含むｐＨ12以上の塩基性水溶液を、例えば濃縮
及び／又は冷却するなどの晶析処理に付することにより
結晶としてｄｄＡやｄｄＩを選択的に高純度かつ高回収
率で得ることもできる。これは、２′，３′−ジデオキ
シヌクレオシド誘導体の溶解度が低下し、一方類縁物質
の溶解度は大きくは低下しないという利点を利用したも
ので、高収率で目的物を得ることができる。加えて、晶
出した目的物の結晶粒径が大きくなり、結晶の分離性が
向上する。このように、本発明の塩基性条件下における
晶析法は工業的に優位な精製法を提供するものである。

【００１１】もちろん、一度上述の有機溶媒抽出法によ
り精製した目的の２′，３′−ジデオキシヌクレオシド
誘導体を塩基性水溶液とし、これから上述の晶析法によ
り再精製することにより更に高純度の目的物を得ること
も可能であり、また、順序を逆にして晶析についで有機
溶媒抽出法を適用することにより同様の目的を達成する
ことができる。後述のように、両方法のその他の組合せ
も可能である。

【００１２】本発明にいう２′，３′−ジデオキシヌク
レオシド誘導体は、例えば、グアノシン、アデノシン、
イノシン等のプリンヌクレオシド類及びウリジン、シチ
ジン等のピリミジンヌクレオシド類の２′位と３′位の
ジデオキシ体、その２′，３′−ジデヒドロ体、及びこ
れらの糖部や塩基部における誘導体で、具体的には、
２′，３′−ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）や２′，
３′−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）などの２′，３′
−ジデオキシヌクレオシド；２′，３′−ジデオキシ−
２′，３′−ジデヒドロヌクレシド；２′，３′−ジデ
オキシ−３′−アジドヌクレオシド；２′，３′−ジデ
オキシ−２′−フルオロアデノシン、２′，３′−ジデ
オキシ−２′−フルオロイノシンなどの２′，３′−ジ
デオキシ−２′−フルオロヌクレオシド；２′，３′−
ジデオキシ−３′−フルオロヌクレオシド等を挙げるこ
とができ、更にまた、２，６−ジアミノプリン、６−ク
ロロプリン、２−アミノプリン等のプリン塩基を有する
リボヌクレオシド類及び５−メチルウリジン等のピリミ
ジンヌクレオシド類の２′位と３′位のジデオキシ体及
びこれらの２′，３′−ジデヒドロ体を挙げることがで
きる。このように本発明の２′，３′−ジデオキシヌク
レオシド誘導体は、２′，３′−ジデオキシヌクレオシ
ド自体も含むものとして広義に定義されていることに留
意すべきである。

【００１３】本発明にいう塩基性条件とは、ｐＨ12以上
をいい、好ましくはｐＨ13以上である。ｐＨ11以下では
不純物との分離性が十分ではない。具体的には２′，
３′−ジデオキシヌクレオシドを濃度が、0.1 〜50重量
％、好ましくは１〜25重量％の無機又は有機塩基の水溶
液に溶解して得られた塩基性水溶液を用いることができ
る。

【００１４】本発明において、塩基性水溶液を調製する
際用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム等のアルカリ金属の水酸化物及び水酸化カルシ
ウム等のアルカリ土類金属の水酸化物が用いられるが、
好ましくは水酸化ナトリウムが用いられる。

【００１５】なお、例えば、２′，３′−ジデオキシヌ
クレオシド誘導体の合成反応終了液のｐＨが12以上であ
る場合は、そのような合成反応終了液をそのまま本発明
の精製処理に付してよいことはもちろんである。

【００１６】本発明の粗２′，３′−ジデオキシヌクレ
オシド誘導体の塩基性水溶液は、２′，３′−ジデオキ
シヌクレオシド誘導体を 0.1〜30重量％好ましくは１〜
20重量％含有することが生産性の理由から好ましい。

【００１７】本発明に用いられる抽出溶媒は、２−プロ
パノール、１−ブタノール、２−ブタノール、２−メチ
ル−１−プロパノール、２−メチル−２−プロパノー
ル、１−ペンタノール等のアルコール類；アセトニトリ
ル；酢酸エチル、酢酸メチル等のカルボン酸エステル
類；ベンゼン、ヘキサン、トルエン等の炭化水素類；ジ
エチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の
エーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロ
エタン等のハロゲン化炭化水素類；メチルエチルケトン
等のケトン類；等の有機溶媒であるが、抽出率の理由か
らアルコール類が好ましい。通常、粗２′，３′−ジデ
オキシヌクレオシド誘導体の塩基性水溶液に対して体積
比で 0.1〜10倍量が用いられる。

【００１８】抽出温度には特別の制限はなく、０〜100
℃で行うことができる。

【００１９】このような条件で抽出するに際して、振と
うや攪拌を行なうと抽出時間を短縮できる。通常１分〜
24時間程度で抽出が完了する。

【００２０】抽出終了後、目的物を含有する有機溶媒層
を分層し、これよりそれ自体公知の方法、即ち、溶媒を
留去するなどの方法により除去することにより濃縮する
ことにより、目的物である２′，３′−ジデオキシヌク
レオシド誘導体を析出させ、容易に単離することができ
る。抽出溶媒を除去する際に、途中で水加えて濃縮し、
水溶液とするとより能率良く目的物を回収することがで
きる。この際、本発明に従い、塩基性水溶液とし晶析す
ることにより高純度の目的物を単離することが可能であ
る。

【００２１】本発明でいう晶析は、通常、それ自体公知
の方法、即ち、例えば、２′，３′−ジデオキシヌクレ
オシド誘導体の塩基性水溶液を、好ましくは減圧下、更
に好ましくは１〜200mmHg の減圧下に、必要により30〜
100 ℃に加熱して濃縮し、その後冷却することにより行
われる。晶析濃度は、目的化合物により異なるが、通常
５〜100 ｇ／ｄｌ程度の濃度まで濃縮して行う。

【００２２】得られた濃縮液を室温に放置する強制冷却
し、所望により０℃程度まで冷却することにより目的物
である２′，３′−ジデオキシヌクレオシド誘導体の結
晶を析出させることができ、濾別等の操作で容易に分離
することができる。

【００２３】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に説明する。

【００２４】実施例１（合成例） 合成例(a) ： アデノシンから２′，３′−ジデオキシ
アデノシン（ｄｄＡ）の合成（その１） アデノシン20ｇ（74.9mmol）の酢酸100ml 溶液に、オル
ト酢酸トリメチル11.7ml(1.3倍当量）を加え、50℃で３
時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮した後、アセトニト
リル100ml を加え、反応液を10℃まで冷却し、ここに臭
化アセチル22ml（４倍当量）を１時間かけて滴下した。
反応液を更に２時間15℃で攪拌した後、炭酸ナトリウム
水溶液で中和し、アセトニトリルで抽出した。抽出液に
10％のパラジウムを担持した炭素触媒（10％Ｐｄ−Ｃ触
媒）を３ｇ（５mol ％）加え、水酸化ナトリウム（Ｎａ
ＯＨ）水溶液で系内のｐＨを 9.5にコントロールしなが
ら系内を水素雰囲気とし、室温で水素添加反応を５時間
行った。反応終了後反応液をろ過し、溶媒を減圧下留去
した後ＮａＯＨ水溶液を加え、液をｐＨ12に保って５時
間攪拌した。

【００２５】こうして得られたｄｄＡアルカリ水溶液
（ｐＨ12）1000ml中には、第１表の組成で各核酸誘導体
を含んでいた。

【００２６】

【表１】

【００２７】合成例(b) ： アデノシンから２′，３′
−ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）の合成（その２） アデノシン20ｇ（74.9mmol) の酢酸100ml 溶液にオルト
酢酸トリメチル11.7ml(1.3倍当量）を加え、50℃で３時
間攪拌した。反応液を減圧下濃縮した後、アセトニトリ
ル100ml を加え、反応液を10℃まで冷却し、ここに臭化
アセチル22ml（４倍当量）を１時間かけて滴下した。反
応液を更に２時間15℃で攪拌した後、炭酸ナトリウム水
溶液で中和し、アセトニトリルで抽出した。抽出液にＺ
ｎ粉末 7.8ｇ（２倍当量）を加え、室温で２時間攪拌し
た。反応液をエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩２
水和物（ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ₂ Ｏ）90ｇ（４倍当
量）をＮａＯＨ水溶液でｐＨ７に調整した液に投入し、
アセトニトリル200ml で抽出した。抽出液に10％Ｐｄ−
Ｃ触媒を３ｇ（５mol ％）加え、系内を水素雰囲気と
し、室温で水素添加反応を５時間行った。反応終了後反
応液をろ過し、溶媒を減圧下留去した後ＮａＯＨ水溶液
を加え、液をｐＨ12に保って５時間攪拌した。

【００２８】こうして得られたｄｄＡアルカリ水溶液
（ｐＨ12）1000ml中には、第２表に示す組成で各核酸誘
導体を含んでいた。

【００２９】

【表２】

【００３０】合成例(c) ： アデシノンから２′，３′
−ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）の合成（その３） アデノシン20ｇ（74.9mmol）のアセトニトリル200ml ス
ラリー溶液に、水0.67ml(37.5mmol)とアセトキシイソブ
チリルブロミド47.0ｇ(224.7mmol，３倍当量）を加え、
室温で２時間反応した。10％重曹水で中和し、水層を分
層除去した。有機層に亜鉛−銅錯体（Ｚｎ−Ｃｕ錯体）
19.3ｇ（２倍当量）を加え、室温で２時間攪拌した。反
応液をＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ₂ Ｏ 90ｇ（４倍当量）
をＮａＯＨ水溶液でｐＨ７に調整した液に投入し、アセ
トニトリル200ml で抽出した。抽出液に10％Ｐｄ−Ｃ触
媒を３ｇ（５mol ％）加え、系内を水素雰囲気とし、室
温で水素添加反応を５時間行った。反応終了後反応液を
濾過し、溶媒を減圧下留去した後ＮａＯＨ水溶液を加
え、液をｐＨ12に保って５時間攪拌した。

【００３１】こうして得られたｄｄＡアルカリ水溶液
（ｐＨ12）1000ml中には、第３表に示す組成で各該酸誘
導体を含んでいた。

【００３２】

【表３】

【００３３】実施例２ 合成例(a) で得られた組成Ａのケン化液を塩酸を用いて
ｐＨ７に調整した。このｐＨ調整液より10mlずつ４回分
取し、４つの分取分の１つ目はそのまま、２つ目、３つ
目及び最後のものにはＮａＯＨをそれぞれ１、10及び20
重量％濃度となる量加えて４種の試験液を準備した。こ
れら４種の試験液のｐＨは、それぞれ、７、＞13、＞1
3、及び＞13であった。

【００３４】各試験液に10mlの２−メチル−１−プロパ
ノールを加え、よく混合した後静置して分層させた。

【００３５】有機層及び水層の各核酸誘導体の濃度を高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、
分配係数（有機層／水層）と有機層中のｄｄＡ純度を算
出した。結果を第４表に示す。

【００３６】

【表４】

【００３７】上表より明かなように、ＮａＯＨ濃度が高
くなると共にｄｄＡの分配係数が高くなり、不純物３′
−デオキシアデノシン（３ｄＡ）、アデノシン（Ａ
Ｒ）、及びアデニン（Ａｄ）の分配係数は低くなり、そ
の結果、有機層中に高純度かつ高回収率でｄｄＡが抽出
された。

【００３８】合成例(b) 及び(c) で得られた組成Ｂ及び
Ｃのケン化液についても、合成例(a) で得られた組成Ａ
のケン化液と全く同じ処理をして、それぞれ、次の第５
表及び第６表に示す結果を得た。

【００３９】

【表５】

【００４０】

【表６】

【００４１】両表から、合成例(b) 及び(c) で得られた
ケン化液についても、合成例(a) で得られたケン化液に
ついてと同様に、ＮａＯＨ濃度が高くなると共にｄｄＡ
の分配係数が高くなり、不純物３ｄＡ、ＡＲ、及びＡｄ
の分配係数は低くなり、その結果、有機層中に高純度か
つ高回収率でｄｄＡが抽出された。

【００４２】実施例３ ｄｄＡ 1.0ｇ、３ｄＡ 100mg、ＡＲ 100mg及びＡｄ 100
mgからなる結晶混合物を水（溶媒１）100ml に加えて60
℃に加熱溶解した。溶液を室温で結晶の生ずるまで減圧
（10mmHg）濃縮し、その後５℃まで冷却した。

【００４３】析出結晶は濾過し、乾燥し、乾燥結晶をＨ
ＰＬＣにより分析し、この結晶の純度及び各核酸誘導体
の回収率を求めた。

【００４４】下記第７表に示すその他の溶媒 (2)〜(6)
についても同様の実験を行なった。ただし、溶媒(5) 及
び(6) の場合の加熱溶解温度は50℃とし、減圧濃縮にお
ける圧力は10mmHgとし、その後５℃まで冷却した。

【００４５】

【表７】

【００４６】上表から、溶媒がＮａＯＨ濃度の高い水溶
液の場合、再結晶して得られたｄｄＡ結晶は回収率が高
く、また、３ｄＡ、ＡＲ及びＡｄを含まないか、含んで
も極く少量の高純度のものであることがわかる。

【００４７】実施例４ 合成例(a) と同様の反応操作で得られたケン化液１Ｌ
（ｄｄＡを115.05ｇ、３ｄＡを13.10 ｇ、２ｄＡを2.04
ｇ、ＡＲを4.07ｇ、及びＡｄを3.67ｇ含有）に、25％Ｎ
ａＯＨ水溶液を10Ｌ加え、２−プロパノール10Ｌで３回
抽出を行った。得られた２−プロパノール抽出層を濃縮
し、途中水250ml を加えて再濃縮した。途中25％ＮａＯ
Ｈ水溶液を200ml 加えて撹拌し、20℃に冷却して晶析し
た。析出した結晶を濾取して精製ｄｄＡ結晶を得た。

【００４８】以上の塩基性条件下の抽出操作と晶析操作
の組み合せにより、高純度のｄｄＡ結晶が得られた。ケ
ン化液、２−プロパノール抽出液及び再結晶後の結晶
の、各段階の核酸誘導体の含量組成をＨＰＬＣを用いて
測定した。結果を第８表に示す。

【００４９】

【表８】

【００５０】

【発明の効果】本発明により、２′，３′−ジデオキシ
ヌクレオシド誘導体を精製するに際し、工業的かつ簡便
に不純物を除去精製し、目的化合物を高純度でかつ高回
収率で得ることが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】２′，３′−ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）
及び２′，３′−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）の合成
法を例示する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高橋 里次 三重県四日市市大字日永1730番地 味の 素株式会社 東海工場内 (56)参考文献 特開 平１−98496（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−175991（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 473/00 - 473/40 C07B 63/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 粗２′，３′−ジデオキシアデノシンの
   ｐＨ12以上の塩基性水溶液から該２′，３′−ジデオキ
   シアデノシンを有機溶媒で抽出することを特徴とする
   ２′，３′−ジデオキシアデノシンの精製法。
2. 【請求項２】 粗２′，３′−ジデオキシアデノシンの
   ｐＨ12以上の塩基性水溶液から該２′，３′−ジデオキ
   シアデノシンを晶析することを特徴とする２′，３′−
   ジデオキシアデノシンの精製法。
3. 【請求項３】 該有機溶媒がアルコールである請求項１
   に記載の精製法。
4. 【請求項４】 該塩基性水溶液のｐＨが13以上である請
   求項１又は２のいずれかに記載の精製法。