JP3547488B2

JP3547488B2 - Protoplast stabilization method and artificial cell wall coated protoplast

Info

Publication number: JP3547488B2
Application number: JP19883994A
Authority: JP
Inventors: 沢建郭; 順三砂本
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1994-08-23
Filing date: 1994-08-23
Publication date: 2004-07-28
Anticipated expiration: 2019-07-28
Also published as: JPH0856654A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、プロトプラストの安定化方法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、細胞工学やバイオテクノロジー等の分野において広く有用なプロトプラストを安定化するための新しい方法と、この方法により安定化した人工細胞壁被覆プロトプラストに関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
プロトプラスト（ Protoplast ）は、細菌、菌類、植物細胞などの細胞壁を酵素処理等によって取り除いた原形質体であり、適当な浸透圧条件下では細胞としての諸活性を維持するとともに、高分子物質や粒子の導入、あるいは細胞融合等の操作が可能であるという優れた特性を有している。
【０００３】
このため、プロトプラストは、例えば外来性ＤＮＡの導入による形質転換体の作成や特定の遺伝形質を有する細胞の選別等に広く用いられている。また植物細胞のプロトプラストの場合には、優良植物株の大量繁殖を目的とした固体細分化の材料としてもその有用性が認識されている。
しかしながら、プロトプラストは、そのままの状態では細胞安定性が低いという問題を有しており、実際の使用ではプロトプラストの調製やその培養に細心の注意を必要とするため、上記のような目的に利用することは必ずしも容易ではなかった。
【０００４】
この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、プロトプラストの特性に影響を及ぼすことなくその安定性を増加させるための方法と、この方法によって安定化させたプロトプラストを提供することを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、プロトプラストを疎水化多糖含有培地で培養し、その細胞膜を疎水化多糖で被覆し、人工的な細胞壁をに形成させることを特徴とするプロトプラストの安定化方法を提供する。
またこの発明は、細胞膜が疎水化多糖で被覆された人工細胞壁被覆プロトプラストを提供する。
【０００６】
さらに、この発明においては、疎水化多糖が部分疎水化されたプルランまたはキシログルカンリン酸であり、プロトプラストが植物細胞のプロトプラストであることを好ましい態様の一つとしており、その具体例として、細胞膜が部分疎水化されたプルランまたはキシログルカンリン酸で被覆されたニンジンプロトプラストをも提供する。
【０００７】
以下、この発明についてさらに詳しく説明する。
この発明が対象とするプロトプラストは、細菌や菌類（酵母、糸状菌等）、あるいは植物細胞のプロトプラストであり、その調製は公知の方法に従って行うことができる。例えば植物細胞のプロトプラストを調製する場合には、まず細胞壁接着物質（ヘミセルロース、ペクチン多糖など）を酵素分解して単細胞化し、次いでセルロースを主成分とする細胞壁をセルラーゼ等の酵素処理によって分解する。これら２段階の酵素処理は同時に行うこともできる。
【０００８】
このようにして単離、調製したプロトプラストは同じく公知の方法で培養するが、この発明においては、その培地中に疎水化多糖を添加する。この疎水化多糖は、例えばプルラン、アミロース、マンナン、アミロペクチン、デキストラン、およびキシログルカンリン酸等の天然多糖類に、コレステロールまたはパルミトイル等の疎水基を修飾したものであり、そのような疎水化処理は、上記の天然多糖類と疎水基とを水溶液中で自己集合させることによって行うことができる（Macromolecules, 25, 5665-5670, 1992; Physicochemical Characterization of Cholesterol-Bearing Polysaccharides in Solution: Organized Solutions edited by Friberg, S.E. and Lindman, B., Marcel Dekker. Inc., 290-304, 1992）。なお、このような疎水化多糖の例として、コレステロール基で修飾したプルランの化学式を以下に示す。
【０００９】
【化１】

【００１０】
以上の通りの方法によって、プロトプラストの細胞膜を疎水化多糖で被覆することができ（図１参照）、これによって本来不安定なプロトプラストを極めて安定な状態で操作することが可能となる。例えば、通常のプロトプラストはカルシウム・イオノフォアＡ２３１８７存在下で死滅するが（Plant Science, 69, 135-138, 1990)、この発明の方法によって安定化させた人工細胞壁被覆プロトプラストは、下記実施例にも示したようにＡ２３１８７に対して高い耐性を示す。
【００１１】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００１２】
【実施例】
実施例１（ニンジンプロトプラストの調製と、その安定化）
まず、ニンジン細胞から以下の手順でプロトプラストを調製した。
材料とするニンジン懸濁培養細胞は、ニンジン品種Kuroda-gosunに由来し、Murasige-Skoog培地〔サッカロース３％、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-Ｄ）１ｍｇ／Ｌ、キネチン0.1 ｍｇ／Ｌ含有：ｐＨはオートクレーブ前に5.8に調整）で継代培養した。植え継ぎは２週間周期で行い、毎分１２０往復、振幅５〜６ｃｍ、２４℃で培養した。植え継いでから６日目の細胞をクリーンベンチ内で濾過して集め、Murasige-Skoog培地（0.25Ｍマンニトール、0.25Ｍソルビトール含有：ｐＨ5.6）で一度洗浄ののち、滅菌した三角フラスコに濾集した。酵素溶液（Cellulase Onozuka R 10：1.8 ％とDriselase：0.2 ％を含有）を先端に滅菌フィルターを取付けた注射器に充填し、濾過滅菌しながら酵素溶液を三角フラスコ内に添加した。フラスコを密封したのち、回転式の浸透機に置き、暗所下、２４℃で１８時間浸透した。４０μｍ孔径のナイロンフィルターで試料分散液を濾過し、濾液を５０ｇで５分間遠心分離し、次いで上澄液を除去し、洗液で再分散させたのち、６％Ficoll蔗糖液（0.5 Ｍ）上に静かに添加して２００×ｇで５分間遠心した。プロトプラストは二相界面に集塊した。さらに上澄液を除去し、プロトプラストを１０ｍｌ容量の遠心管に入れ、洗液を用いて分散させて５０×ｇで５分間遠心する操作を３回繰り返した。最後に、少量のプロトプラスト培養液（上記の細胞培養液に0.4Ｍマンニトール添加）で分散させ、ニンジン細胞のプロトプラストを調製した。
【００１３】
次に、このプロトプラスト分散液にコレステロール基で修飾したプルラン（ＣＨＰ）またはキシログルカン燐酸（ＣＨＸ−Ｐ）をそれぞれ0.3 ｍｇ／ｍｌの割合で添加し、２４℃で１〜３時間暗所培養した。また、対照として、ＣＨＰおよびＣＨＸ−Ｐを含有しない培養液中でも同様にしてプロトプラストを培養した。
【００１４】
以上の通りに培養した各プロトプラストについて、Fluorescein diacetate法により蛍光顕微鏡で個数を計測し、それぞれの生存率を求めた。結果は表１に示したとおりであり、ＣＨＰまたはＣＨＸ−Ｐ含有培地中で培養したプロトプラストは、対照に比べいづれも高い生存率を示した。
【００１５】
【表１】

【００１６】
さらに、ＣＨＰ被覆の状態をFluorescein isothiocyanateで修飾したＣＨＰ（ＣＨＰ−ＦＩＴＣ）を用いて共焦点蛍光顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で観察した。すなわち、ＣＨＰ−ＦＩＴＣを0.6ｍｇ／ｍｌの割合で添加したプロトプラスト培養液中で、プロトプラストを２４℃で３時間暗所培養した。結果は図２の顕微鏡写真図に示した通りであり、細胞膜がＣＨＰ−ＦＩＴＣによって被覆されていることが明白に確認された。
実施例２（Ａ２３１８７に対する安定化試験）
実施例１で作成したＣＨＰ被覆プロトプラストおよびＣＨＸ−Ｐ被覆プロトプラストについて、カルシウム・イオノフォアＡ２３１８７に対する耐性を試験した。
【００１７】
結果は、図３および図４に示した通りである。なお、図３はＡ２３１８７を２０μＭの濃度で含有する培地中での被覆化プロトプラスト（ＣＨＰ、ＣＨＸ−Ｐ）と対照（未被覆プロトプラスト）の非溶解率を経時に示し、図４はＡ２３１８７の各濃度における２時間培養後の非溶解率を示した。
これらの結果から明らかなように、この発明方法によって細胞膜を疎水化多糖で被覆した人工細胞壁被覆プロトプラストは、未被覆の対照群に比べはるかに高い安定性を示した。
実施例３（細胞外カルシウムの細胞内流入に対する耐性試験）
実施例１で作成したＣＨＸ−Ｐ被覆プロトプラストについて、Ａ２３１８７存在下におけるカルシウム流入に対する耐性を試験した。
【００１８】
結果は図５および図６に示した通りである。なお、図５はＡ２３１８７（２０μＭ）とカルシウムイオン（０〜１０ｍＭ）を含有する培地での２時間培養後の各プロトプラストの非溶解率を示し、図６はＡ２３１８７（２０μＭ）と多糖（０．０〜１．２／ｍｇ／ｍｌ）を含有する培地での２時間培養後の各プロトプラストの非溶解率を示す。
【００１９】
これらの結果から明らかなように、この発明の人工細胞壁被覆プロトプラストは、未被覆の対照群に比べ細胞外からのカルシウムの流入に対して優れた耐性を示した。
実施例４（培養液中のセルラーゼに対する耐性試験）
実施例１で作成したＣＨＰ被覆プロトプラストについて、セルロース分解酵素であるセルラーゼに対する耐性を試験した。
【００２０】
実施例１と同様のプロトプラスト培養液（ＣＨＰ0.3 ｍｇ／ｍｌ含有）でニンジン・プロトプラストを、３時間、２４℃で暗所培養したのち、セルラーゼ（ONOZUKA R-10）を0.3 ｍｇ／ｍｌの割合で培養液中に添加した。この状態で一定時間培養を続けたのち、Fluorescein diacetate法によりプロトプラストの生存率を蛍光顕微鏡で計測した。対照として、ＣＨＰ非含有培養液で培養したプロトプラストについても、セルラーゼ含有培養液での生存率を計測した。
【００２１】
結果は表２に示した通りであり、この発明の人工細胞壁被覆プロトプラストはセルロース分解酵素セルラーゼの共存下でも高い安定性を有することが確認された。
【００２２】
【表２】

【００２３】
【発明の効果】
以上詳しく説明した通り、この発明によって、本来はカルシウムの流入や細胞壁分解酵素に対して極めて不安定なプロトプラストを安定化することが可能になり、このような安定化によって例えば細胞工学やバイオテクノロジー分野におけるプロトプラストの応用範囲が大幅に拡大される。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のプロトプラスト安定化方法を例示した模式図である。
【図２】この発明の人工細胞壁被覆プロトプラストの細胞膜を被覆するＣＨＰの蛍光顕微鏡写真図である。
【図３】Ａ２３１８７を２０μＭの濃度で含有する培地中での人工細胞壁被覆プロトプラスト（ＣＨＰ、ＣＨＸ−Ｐ）と対照（未被覆プロトプラスト）の非溶解率（％）の経時的変化を示す。
【図４】Ａ２３１８７の各濃度における２時間培養後のプロトプラスト非溶解率を示す。
【図５】Ａ２３１８７（２０μＭ）とカルシウムイオン（０〜１０ｍＭ）を含有する培地での２時間培養後の各プロトプラストの非溶解率を示す。
【図６】Ａ２３１８７（２０μＭ）と多糖（０．０〜１．２／ｍｇ／ｍｌ）を含有する培地での２時間培養後の各プロトプラストの非溶解率を示す。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a method for stabilizing protoplasts. More specifically, the present invention relates to a novel method for stabilizing protoplasts which are widely useful in fields such as cell engineering and biotechnology, and to an artificial cell wall-coated protoplast stabilized by this method.
[0002]
[Prior art and its problems]
Protoplast is a protoplast obtained by removing the cell walls of bacteria, fungi, plant cells, etc. by enzymatic treatment, etc. Under appropriate osmotic pressure conditions, it maintains various cell activities, as well as polymer substances and particles It has an excellent property that it is possible to carry out operations such as introduction of cells or cell fusion.
[0003]
For this reason, protoplasts are widely used, for example, for preparing transformants by introducing exogenous DNA and for selecting cells having a specific genetic trait. In the case of protoplasts of plant cells, their usefulness is also recognized as a material for solid subdivision for mass propagation of excellent plant strains.
However, protoplasts have a problem that cell stability is low as they are, and in actual use, careful preparation and cultivation of protoplasts require careful attention. It was not always easy.
[0004]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method for increasing the stability of a protoplast without affecting its properties, and a protoplast stabilized by the method. It is an object.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present invention solves the above-mentioned problems, and stabilizes a protoplast characterized by culturing protoplasts in a hydrophobized polysaccharide-containing medium, coating the cell membrane with the hydrophobized polysaccharide, and forming an artificial cell wall on the protoplasts. Provide a method of conversion.
The present invention also provides an artificial cell wall-coated protoplast whose cell membrane is coated with a hydrophobized polysaccharide.
[0006]
Furthermore, in the present invention, the hydrophobized polysaccharide is preferably partially hydrophobized pullulan or xyloglucan phosphate, and one of the preferred embodiments is that the protoplast is a protoplast of a plant cell. Also provided are carrot protoplasts coated with partially hydrophobized pullulan or xyloglucan phosphate.
[0007]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The protoplasts targeted by the present invention are bacteria or fungi (yeast, filamentous fungi, etc.) or protoplasts of plant cells, and can be prepared according to a known method. For example, when preparing protoplasts of plant cells, first, cell wall adhesive substances (hemicellulose, pectin polysaccharide, etc.) are enzymatically decomposed into single cells, and then the cell wall mainly composed of cellulose is decomposed by enzymatic treatment such as cellulase. These two stages of enzyme treatment can be performed simultaneously.
[0008]
The protoplasts thus isolated and prepared are cultured by a known method. In the present invention, a hydrophobized polysaccharide is added to the culture medium. This hydrophobized polysaccharide is obtained by modifying a natural polysaccharide such as pullulan, amylose, mannan, amylopectin, dextran, and xyloglucan phosphate with a hydrophobic group such as cholesterol or palmitoyl. Can be performed by self-assembling the above-mentioned natural polysaccharide and a hydrophobic group in an aqueous solution (Macromolecules, 25, 5665-5670, 1992; Physicochemical Characterization of Cholesterol-Bearing Polysaccharides in Solution: Organized Solutions edited by Friberg, SE and Lindman, B., Marcel Dekker. Inc., 290-304, 1992). As an example of such a hydrophobized polysaccharide, the chemical formula of pullulan modified with a cholesterol group is shown below.
[0009]
Embedded image

[0010]
By the above-described method, the cell membrane of protoplasts can be coated with the hydrophobized polysaccharide (see FIG. 1), whereby the originally unstable protoplasts can be operated in an extremely stable state. For example, normal protoplasts die in the presence of the calcium ionophore A23187 (Plant Science, 69, 135-138, 1990), but artificial cell wall-coated protoplasts stabilized by the method of the present invention are also shown in the Examples below. As shown, it shows high resistance to A23187.
[0011]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[0012]
【Example】
Example 1 (Preparation of carrot protoplast and its stabilization)
First, protoplasts were prepared from carrot cells by the following procedure.
The carrot suspension culture cells used as the material were derived from a carrot variety Kuroda-gosun, and had a Murasige-Skoog medium [3% sucrose, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 1 mg / L, kinetin 0.1 mg / L L-containing: pH was adjusted to 5.8 before autoclaving). Subculture was carried out in a two-week cycle, and cultured at 120 reciprocations per minute, at an amplitude of 5 to 6 cm, and at 24 ° C. Six days after the passage, the cells are collected by filtration in a clean bench, washed once with Murasige-Skoog medium (containing 0.25 M mannitol and 0.25 M sorbitol, pH 5.6), and then collected in a sterilized Erlenmeyer flask. did. An enzyme solution (containing Cellulase Onozuka R 10: 1.8% and Driselase: 0.2%) was filled into a syringe equipped with a sterile filter at the tip, and the enzyme solution was added into an Erlenmeyer flask while sterilizing by filtration. After sealing the flask, it was placed in a rotary permeator and permeated at 24 ° C. for 18 hours in the dark. The sample dispersion was filtered through a nylon filter having a pore size of 40 μm, and the filtrate was centrifuged at 50 g for 5 minutes. Then, the supernatant was removed and redispersed with a washing solution. And gently centrifuged at 200 × g for 5 minutes. Protoplasts agglomerated at the two-phase interface. Further, the operation of removing the supernatant, placing the protoplasts in a 10 ml centrifuge tube, dispersing using a washing solution, and centrifuging at 50 × g for 5 minutes was repeated three times. Finally, the mixture was dispersed in a small amount of a protoplast culture solution (0.4 M mannitol was added to the above-described cell culture solution) to prepare a carrot cell protoplast.
[0013]
Next, 0.3 mg / ml of pullulan (CHP) or xyloglucan phosphoric acid (CHX-P) modified with a cholesterol group was added to the protoplast dispersion, followed by culturing at 24 ° C. for 1 to 3 hours in the dark. As a control, protoplasts were similarly cultured in a culture solution containing neither CHP nor CHX-P.
[0014]
The number of each protoplast cultured as described above was measured with a fluorescence microscope by the Fluorescein diacetate method, and the respective survival rates were obtained. The results are as shown in Table 1. The protoplasts cultured in the medium containing CHP or CHX-P showed higher survival rates than the control.
[0015]
[Table 1]

[0016]
Further, the state of CHP coating was observed with a confocal fluorescence microscope (Bio-Rad) using CHP (CHP-FITC) modified with Fluorescein isothiocyanate. That is, protoplasts were cultured in a dark place at 24 ° C. for 3 hours in a protoplast culture solution to which CHP-FITC was added at a rate of 0.6 mg / ml. The results were as shown in the micrograph of FIG. 2, and it was clearly confirmed that the cell membrane was covered with CHP-FITC.
Example 2 (stabilization test for A23187)
The CHP-coated and CHX-P-coated protoplasts prepared in Example 1 were tested for resistance to the calcium ionophore A23187.
[0017]
The results are as shown in FIG. 3 and FIG. FIG. 3 shows the non-dissolution rate of coated protoplasts (CHP, CHX-P) and control (uncoated protoplasts) in a medium containing A23187 at a concentration of 20 μM over time, and FIG. 4 shows the concentration of each of A23187. Shows the non-dissolution rate after 2 hours of culture.
As is apparent from these results, the artificial cell wall-coated protoplast in which the cell membrane was coated with the hydrophobized polysaccharide by the method of the present invention exhibited much higher stability than the uncoated control group.
Example 3 (Test for resistance to intracellular influx of extracellular calcium)
The CHX-P-coated protoplasts prepared in Example 1 were tested for resistance to calcium influx in the presence of A23187.
[0018]
The results are as shown in FIGS. FIG. 5 shows the non-dissolution rate of each protoplast after culturing for 2 hours in a medium containing A23187 (20 μM) and calcium ions (0 to 10 mM), and FIG. 6 shows A23187 (20 μM) and polysaccharide (0.0 -1.2 / mg / ml) shows the non-dissolution rate of each protoplast after culturing for 2 hours in a medium containing the same.
[0019]
As is evident from these results, the artificial cell wall-coated protoplast of the present invention exhibited superior resistance to the influx of calcium from outside the cell as compared with the uncoated control group.
Example 4 (resistance test for cellulase in culture solution)
The CHP-coated protoplasts prepared in Example 1 were tested for resistance to cellulase, a cellulolytic enzyme.
[0020]
Carrot protoplasts were cultured in the same protoplast culture medium (containing 0.3 mg / ml CHP) as in Example 1 for 3 hours at 24 ° C. in the dark, and then cellulase (ONOZUKA R-10) was added at a rate of 0.3 mg / ml. Was added to the culture solution. After culturing for a certain period of time in this state, the survival rate of protoplasts was measured by a fluorescence microscope by the Fluorescein diacetate method. As a control, the survival rate of the protoplasts cultured in the CHP-free culture medium was also measured in the cellulase-containing culture medium.
[0021]
The results are as shown in Table 2, and it was confirmed that the protoplasts coated with the artificial cell wall of the present invention had high stability even in the presence of the cellulase enzyme cellulase.
[0022]
[Table 2]

[0023]
【The invention's effect】
As described in detail above, the present invention makes it possible to stabilize protoplasts which are originally extremely unstable against calcium influx and cell wall degrading enzymes. Such stabilization enables, for example, cell engineering and biotechnology fields. The range of application of protoplasts in the field is greatly expanded.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic view illustrating a protoplast stabilization method of the present invention.
FIG. 2 is a fluorescence micrograph of CHP covering the cell membrane of the artificial cell wall-coated protoplast of the present invention.
FIG. 3 shows the time course of the non-dissolution rate (%) of artificial cell wall-coated protoplasts (CHP, CHX-P) and a control (uncoated protoplast) in a medium containing A23187 at a concentration of 20 μM.
FIG. 4 shows the protoplast non-dissolution rate after culturing for 2 hours at each concentration of A23187.
FIG. 5 shows the non-dissolution rate of each protoplast after culturing for 2 hours in a medium containing A23187 (20 μM) and calcium ions (0 to 10 mM).
FIG. 6 shows the non-dissolution rate of each protoplast after culturing for 2 hours in a medium containing A23187 (20 μM) and polysaccharide (0.0 to 1.2 / mg / ml).

Claims

A method for stabilizing protoplasts, comprising culturing protoplasts in a hydrophobized polysaccharide-containing medium and coating the cell membrane with the hydrophobized polysaccharide.

The method for stabilizing protoplast according to claim 1, wherein the hydrophobized polysaccharide is partially hydrophobized pullulan, amylose, mannan, amylopectin, dextran or xyloglucan phosphate.

3. The method for stabilizing protoplast according to claim 1, wherein the protoplast is a protoplast of a plant cell.

The method for stabilizing protoplast according to claim 3, wherein the plant protoplast is carrot protoplast.

An artificial cell wall-coated protoplast whose cell membrane is coated with a hydrophobized polysaccharide.

The artificial cell wall protoplast according to claim 5, wherein the hydrophobized polysaccharide is partially hydrophobized pullulan amylose, mannan, amylopectin, dextran or xyloglucan phosphate.

The protoplast according to claim 5 or 6, wherein the protoplast is a protoplast of a plant cell.

Carrot protoplasts whose cell membrane is coated with partially hydrophobized pullulan or xyloglucan phosphate.