JP3578751B2

JP3578751B2 - Carrier for plant growth and regeneration

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Publication number: JP3578751B2
Application number: JP2002205881A
Authority: JP
Inventors: 宏丹沢
Original assignee: 株式会社向山蘭園
Priority date: 2002-07-15
Filing date: 2002-07-15
Publication date: 2004-10-20
Anticipated expiration: 2019-10-20
Also published as: JP2003047337A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物体の育成あるいは再生に好適な高分子化合物担体に関し、より具体的には、育成あるいは再生した植物体に損傷を与えることなく、簡便に回収あるいは継代することを可能にする植物体育成あるいは再生用の担体、およびこれを利用する植物体の育成あるいは再生方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、目的とした形質を有する植物体の育成あるいは再生技術の開発が大きな注目を集めている。
【０００３】
近年、葉、茎、根、花弁、葯（花粉）あるいは幼植物などの植物体を直接、育成する技術をはじめとして、これらの植物体からプロトプラストを単離し、該プロトプラストを培養しカルスあるいは毛状根を再生し育成する技術など多彩な技術が開発されている。特にプロトプラストの段階で遺伝子導入あるいは細胞融合などの技術を応用し、より目的に合った植物体の育成あるいは再生が行われている。更には、葉、茎、根、花弁、葯等の植物体組織に、遺伝子銃などで直接外来遺伝子を導入する新しい育種法も開発されている。
【０００４】
これらの新しい育種法に共通する最も重要な点は、目的とする形質を獲得した植物体が効率良く、育成あるいは再生することが可能な培養法を確立することである。
【０００５】
植物体の培養は、液体培養と、寒天などのゲルを用いた固体培養に大きく分けられる。液体培養は植物体を懸濁状態で培養するために、大量培養に適した方法であると同時に、容易に継代培養が可能であり、また植物体の分泌物生産を目的としたバイオリアクターに向いているなどの利点を有しているが、植物の種類によっては、液体培養が困難なものがある。
【０００６】
一方、寒天（アガー）などを用いた固体培養法は、広範囲の植物種に適用が可能な方法であり特に変異体選抜に適した培養法であるが、以下に記すような大きな問題点を有している。
【０００７】
１）寒天培地で育成あるいは再生した植物体を、寒天フリーの状態で回収あるいは継代することが非常に困難である。
【０００８】
２）寒天培地で培養する場合に、栄養素の補給はゲルの外側から拡散によって行われるために、効率が非常に悪い。
【０００９】
３）寒天培地中に蓄積される老廃物の除去も拡散によって行われるため、非常に効率が悪い。特に植物体が自ら作るポリフェノールなどの生育阻害物質などの除去は、ほとんど不可能である。
【００１０】
４）植物体の産生する物質を生産することを目的としたバイオリアクター用の担体としては向いていない。
【００１１】
上記した問題点は、従来の固体培養に用いられる寒天（アガー）などのゲルの物性に起因している。即ちアガーあるいはアガロースは、ゾルーゲル転移温度を有していて該転移温度より高い温度では溶解状態即ちゾル状態を示し、該転移温度より低い温度でゲル状態に変化する性質を有している。この性質を利用して、ゾルーゲル転移温度より高いゾル状態で植物体をアガー等に埋没し、温度を下げることによってゲル状に変化させ、固体培養が実施されてきた。
【００１２】
しかしながら、寒天のゲルの融解温度は非常に高く、約９０℃近辺である（山内愛造ら、高分子ＯｎｅＰｏｉｎｔ“機能性ゲル”Ｐ２９、共立出版）ために、植物体を溶解状態の寒天に埋没する際に該植物体は熱的損傷を受ける。また、育成あるいは再生した植物体を寒天培地から回収あるいは継代する際に、温度をゾルーゲル転移温度より高い温度に上げ、寒天をゾル状態に変化させる必要があるが、その際にも植物体は高温にさらされ非常に大きな熱的損傷を受ける。
【００１３】
したがって従来の固体培養では、温度変化によって寒天フリーの状態で回収あるいは継代することは極めて困難であった。一方、植物体に付着している寒天を機械的に取り除くことは、多くの手間を必要とするのみならず、脆弱な植物体の組織（特にカルス、毛状根）に損傷を与えてしまう恐れがあった。
【００１４】
育成・再生後の寒天の除去には上記した問題点があるため、従来の固体培養法では、実際には、育成あるいは再生した植物体の土壌への移植が、植物体に寒天を付けたまま実施されてきた。しかしながらこの場合、寒天培地は栄養分を多く含むため、土壌中で細菌、カビなどが繁殖し易く植物体を腐らせてしまうという問題点が指摘されている。
【００１５】
一方、植物体の分泌物の産生を目的としたバイオリアクターに於ては、ゲル状の寒天培地中からの分泌物の回収は、液体培養法と比較して格段に困難である。即ち、該分泌物を含有する寒天ゲルを溶解する際の高温加熱が、分泌物に著しい損傷を与えるからである。
【００１６】
上記した寒天ゲルの問題点を軽減するために、アルギン酸ソーダーが植物体の育成あるいは再生用担体として用いられて来ている。即ち、アルギン酸ソーダーの水溶液中に植物体を埋没した後、該溶液を濃厚塩化カルシウム溶液に接触させることによって、アルギン酸ソーダーをゲル状態に変化せしめる方法である。
【００１７】
アルギン酸カルシウムは毒性が少ないという長所はあるものの、上記方法には以下のような問題点がある。
【００１８】
１）アルギン酸カルシウムゲル内で育成あるいは再生した植物体の回収あるいは継代の際に、アルギン酸カルシウムゲルを溶解する必要があり、その際に使用されるＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセティックアシッド）などのカルシウムキレート剤は細胞、組織などに損傷を与える。
【００１９】
２）アルギン酸カルシウムゲルは機械的強度が弱い。
【００２０】
３）リン酸濃度の高い培地などでは、アルギン酸カルシウムゲルのカルシウムとリン酸が反応して、リン酸カルシウムの沈澱が形成され、培養が困難になると同時にゲルが脆弱になる。
【００２１】
４）アルギン酸ソーダーのゲル化がカルシウムとのイオン交換反応により起るために、ゲルの表面から内部へとゲル化が進行し、ゲル内部に存在する植物体が均一なゲル化反応を阻害し不均一な構造を有するゲルが生成し易い。
【００２２】
以上述べたように、従来、植物体の育成あるいは再生用として用いられてきたゲルには大きな問題点が未解決のまま残されている。
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、育成あるいは再生した植物体を容易に回収あるいは継代することが可能な植物体の育成あるいは再生用担体、およびこれを用いる植物体の育成あるいは再生方法を提供することにある。
【００２４】
本発明の他の目的は、植物体が産生する物質を生産するためのバイオリアクター用担体として好適な材料を提供することにある。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は鋭意研究の結果、従来の寒天などのゲルが有するゾルーゲル転移温度よりも著しく低い温度で、可逆的に液体状態とゲル状態との変換を可能にした高分子化合物を、植物体の育成および／又は再生用の担体として用いることが上述した問題点の解消に極めて効果的なことを見出した。
【００２６】
本発明の植物体の育成又は再生用担体は上記知見に基づくものであり、より詳しくは、ＬＣＳＴ（下限臨界共溶温度）を有する温度感応性高分子化合物を架橋してなる高分子化合物を含むことを特徴とするものである。
【００２７】
本発明によれば、更に、ＬＣＳＴを有する温度感応性高分子化合物を架橋してなる担体を、該ＬＣＳＴより高い温度で所定の培地に分散させ、該分散液体中に植物体を混入し、前記ＬＣＳＴより低く温度を下げることにより上記分散液体の流動性を減少させ、ゲル状態として上記植物体の育成又は再生を行う植物体の育成又は再生方法が提供される。
【００２８】
本発明によれば、更に、ＬＣＳＴを有する温度感応性高分子化合物を架橋してなる担体を、該ＬＣＳＴより高い温度で所定の培地に分散させ、前記ＬＣＳＴより低く温度を下げることにより、上記該分散液体の流動性を減少させてゲル状態とした後、該ゲルに植物体を乗せるか又は差し込むことにより、該植物体の育成又は再生を行う植物体の育成又は再生方法が提供される。
【００２９】
本発明の担体は、ＬＣＳＴを有する温度感応性高分子化合物が架橋してなる高分子化合物が水または培地中でＬＣＳＴより低い温度で吸水し膨潤し、ＬＣＳＴより高い温度で脱水し収縮して体積が著しく変化する性質を利用したものである。
【００３０】
したがって、例えば、本発明の担体の培地分散液中における担体と培地の量比、温度感応性高分子の架橋密度、および担体の大きさなどをコントロールすることにより、ＬＣＳＴより低い温度では流動性が著しく低いゲル状態を、ＬＣＳＴより高い温度では流動性の著しく高い液体状態を実現することができる。この液体状態とゲル状態との変換は、温度に対して可逆的である。また、上記の液体状態とゲル状態との変化温度は、上記ＬＣＳＴによって決定される。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明する。以下の記載において量比を表す「部」および「％」は、特に断らない限り質量基準とする。
【００３２】
（液体ーゲル転移温度）本発明において、「液体状態」「ゲル状態」および「液体ーゲル転移温度」は以下のように定義される。この定義については文献（ＰｏｌｙｍｅｒＪｏｕｒｎａｌ，１８（５），４１１−４１６（１９８６））を参照することができる。
【００３３】
担体の分散液体１ｍＬを内径１ｃｍの試験管に入れ、所定の温度（一定温度）とした水浴中で１２時間保持する。この後、試験管の上下を逆にした場合に、担体の分散液体／空気の界面（メニスカス）が担体の分散液体の自重で変形した場合（担体の分散液体が流出した場合を含む）には、上記所定温度において担体の分散液体は「液体状態」であると定義する。一方、上記試験管の上下を逆にしても、上記した担体の分散液体／空気の界面（メニスカス）が担体の分散液体の自重で変形しない場合には、該担体の分散液体は、上記所定温度において「ゲル状態」であると定義する。
【００３４】
一方、上記した「所定温度」を徐々に（例えば１℃きざみで）上昇させて、「ゲル状態」が「液体状態」に転移する温度を求めた場合、これによって求められる転移温度を「液体ーゲル転移温度」と定義する（この際、「所定温度」を１℃きざみで下降させ、「液体状態」が「ゲル状態」に転移する温度を求めてもよい）。
【００３５】
本発明の担体においては、上記液体ーゲル転移温度は０℃より高く、６０℃以下であることが好ましく、更には４℃以上５０℃以下（特に４℃以上４０℃以下）であることが、植物体の熱的損傷を防ぐ点から好ましい。このように好適な液体ーゲル転移温度を有する高分子化合物は、後述するような具体的な化合物の中から上記したスクリーニング方法（液体ーゲル転移温度測定法）に従って容易に選択することができる。
【００３６】
本発明の植物体の育成又は再生方法においては、上記した液体ーゲル転移温度（ａ℃）を、植物体の育成あるいは再生時の温度（ｂ℃）と、育成あるいは再生した植物体を回収あるいは継代する時の温度（ｃ℃）との間に設定することが好ましい。すなわち上記した３種の温度ａ℃、ｂ℃、およびｃ℃の間にはｂ＜ａ＜ｃの関係があることが好ましい。より具体的には、（ａ−ｂ）は１〜４０℃、更には２〜３０℃であることが好ましく、また（ｃ−ａ）は１〜４０℃、更には２〜３０℃であることが好ましい。
【００３７】
本発明に用いられるＬＣＳＴを有する温度感応性高分子化合物は、水中あるいは培地中でＬＣＳＴより高い温度では水又は培地に不溶性であるが、ＬＣＳＴより低い温度では可溶性に変化する性質を有している。
【００３８】
温度感応性高分子化合物の状態変化は、水和と脱水和によるものとされている。このような現象については、Ｈａｓｋｉｎｓ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．，Ａ２（８），１４４１，１９６８に、該高分子化合物のひとつであるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）を例に挙げて説明がなされている。ＰＮＩＰＡＡｍは水に対する溶解度温度係数が負の高分子化合物である。そして、低温においては、ＰＮＩＰＡＡｍ分子と水分子との水素結合に依存する水和物（オキソニウムヒドロキシド）が生成している。しかし、これはＬＣＳＴより高い温度に上げることによって分解し、脱水和するため、結果としてＰＮＩＰＡＡｍ分子同士が凝集して沈殿するとされている。
【００３９】
上記のＬＣＳＴを有する温度感応性高分子化合物に架橋構造を付与すると、水中あるいは培地中でＬＣＳＴより低い温度でも溶解することなく膨潤したゲル状態を保持するが、ＬＣＳＴより高い温度にすると該高分子は水不溶性に変化するために、ゲルから水が分離し該架橋体の体積が著しく減少する。上述したように、本発明の植物体の育生・再生用担体および植物体の育生・再生方法は、架橋された温度感応性高分子化合物のこのような性質を利用している。
【００４０】
（温度感応性高分子化合物）本発明に好ましく使用することができる温度感応性高分子化合物としては、ポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリｎ−置換メタアクリルアミド誘導体およびこれらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリプロピレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド、エーテル化メチルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物などが挙げられる。本発明において特に好ましく用いられるものは、ポリＮ−置換アクリルアミド誘導体またはポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体またはこれらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリプロピレンオキサイド、ポリビニルアルコール部分酢化物である。
【００４１】
本発明において好ましく用いられる高分子化合物を、以下にＬＣＳＴが低い順に列挙する。
【００４２】
ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン；ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド；ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン；ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド上記の高分子は単独重合体（ホモポリマー）であっても、上記重合体を構成する単量体と他の単量体との共重合体であってもよい。このような共重合体を構成する他の単量体としては、親水性単量体、疎水性単量体のいずれも用いることができる。
【００４３】
上記親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸など、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
一方、上記疎水性単量体としては、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート等のアクリレート誘導体およびメタクリレート誘導体、Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミドなどのＮ−置換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
一般的には、上記温度感応性高分子化合物に親水性単量体を共重合することによりＬＣＳＴは上昇し、疎水性単量体を共重合することによりＬＣＳＴは下降する。したがって、本発明の架橋構造を付与した温度感応性高分子化合物の分散液体の液体−ゲル転移温度は、親水性単量体を共重合した温度感応性高分子化合物を用いると上昇し、疎水性単量体を共重合した温度感応性高分子化合物を用いることにより下降する。したがって、共重合単量体成分を選択することによっても、本発明における液体−ゲル転移温度をコントロールすることができる。
【００４６】
温度感応性高分子化合物に架橋構造（不可逆的な架橋構造）を付与する方法としては、該温度感応性高分子化合物を与えるべき単量体を重合する際に架橋構造を導入する方法と、単量体の重合終了後に架橋構造を導入する方法とがあるが、本発明ではいずれの方法も採用することができる。
【００４７】
前者の方法は、一般的には、二官能性単量体（あるいは３以上の官能基を有する単量体）を共重合することによって行うことができる。例えば、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド、ヒドロキシエチルジメタクリレート、ジビニルベンゼンなどの二官能性単量体を用いて行うことができる。
【００４８】
後者の方法は、一般的には、光、電子線、γ線照射などにより分子間に架橋を形成することにより行うことができる。
【００４９】
また、後者の方法は、例えば、温度感応性高分子化合物中の官能基（例えば、アミノ基）と結合し得る官能基（例えば、イソシアネート基）を分子内に複数個有する多官能性分子を架橋剤として用いて、温度感応性高分子化合物を架橋させることにより行うことができる。
【００５０】
本発明担体の水中における体積変化の割合（倍率）は、ＬＣＳＴより高い温度における収縮時の体積を１として、ＬＣＳＴより低い植物体育成あるいは再生時の温度における平衡膨澗体積が１．１〜１０００、さらには５〜１００となることが好ましい。ここで平衡膨澗体積とは、本発明担体を過剰量の水中に所定温度（一定温度）で少なくとも３日以上浸し、膨澗が平衡に達した後の体積をいう（これについては、例えば文献、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔａｌ．，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．５５，２４５５（１９８５）を参照することができる）。
【００５１】
上述したような本発明担体の温度に依存した体積変化の割合は、通常、その架橋構造、特に架橋密度に依存し、一般に架橋密度が低い方が体積変化が大きくなる傾向がある。その架橋密度は、前者の方法では、例えば、二官能性単量体の共重合比を変えることで、後者の方法では、例えば、光、電子線、γ線などの照射量を変えることで任意に制御することが可能である。
【００５２】
本発明において望ましい架橋密度の範囲は、全単量体に対する分岐点のモル比で、約０．２ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、更には約０．５ｍｏｌ％〜約４ｍｏｌ％であることが好ましい。前者の方法で架橋構造を導入する場合、二官能性単量体の全単量体（該二官能性単量体自体をも含む）に対する共重合重量比は、約０．３質量％（ｗｔ％）〜約３質量％（ｗｔ％）（更には約０．５質量％（ｗｔ％）〜約１．５質量％（ｗｔ％））の範囲であることが好ましい。
【００５３】
本発明において、架橋密度が上記した約０．２ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％の範囲を上回る場合には、本発明担体の温度に依存した体積変化の割合が小さくなるため、明瞭な液体−ゲル転移が生起しにくくなる。一方、架橋密度がこの範囲を下回る場合には、本発明担体の機械的強度が弱くなり、その分散液がゲル状態において植物体を保持するための十分な強度を維持しにくくなる。
【００５４】
上述したような架橋密度（全単量体に対する分岐点のモル比）は、例えば、^１３Ｃ−ＮＭＲ（核磁気共鳴吸収）測定またはＩＲ（赤外吸収スペクトル）測定または元素分析によって定量することが可能である。
【００５５】
本発明の担体の形状は、育成・再生する植物体の種類、大きさによって適宜、選択することができ、該担体は、例えば、粒子状、マイクロビーズ、繊維状、フレーク状、スポンジ状、膜状、板状など種々の形状をとることが可能である。吸水による膨潤を効率的に行う点からは、担体の形状は表面積の大きな形状であることが好ましく、より具体的には例えば、粒子状および／又はマイクロビーズ状であることが好ましい。
【００５６】
本発明の担体の大きさは、育成・再生する植物体の種類、大きさによって適宜、選択することが可能である。該担体が粒子状又はマイクロビーズ状の形状を有する場合、水系分散液中収縮時、すなわち該担体を構成する温度感応性高分子化合物のＬＣＳＴより高い温度において、０．１μｍ〜１ｃｍ（更には１μｍ〜１ｍｍ）の範囲の粒径を有することが好ましい。
【００５７】
本発明の担体の成型においては、通常の高分子化合物の成型法を用いることが可能である。
【００５８】
特に、担体の形状がマイクロビーズ状あるいは粒子状の場合には、乳化重合法、懸濁重合法、沈澱重合法などの手段が好ましく用いられる。温度感応性高分子化合物に架橋構造を付与する方法としては、上記したように、単量体を重合する際に二官能性単量体を用いて架橋する方法；あるいは重合が終了し、形状が付与された後に光、電子線、γ線照射などにより架橋する方法等を用いることが可能である。
【００５９】
特に、マイクロビーズ状の架橋された温度感応性高分子化合物を、水溶性単量体および水溶性二官能性単量体から合成する場合、逆相懸濁重合法が好適に用いられる。
【００６０】
このような逆相懸濁重合法においては、分散媒としては、単量体及び生成高分子を溶解しない有機溶媒を用いることが好ましく、例えば、ヘキサン等の飽和炭化水素が好ましく用いられる。また、懸濁助剤として界面活性剤（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤）を上記有機溶媒と共に用いても良い。得られるマイクロビーズの粒径は、添加する界面活性剤の種類、量、あるいは攪拌速度などにより制御することが可能である。重合開始剤としては、水溶性開始剤、非水溶性開始剤のいずれも使用し得る。重合生成物を効率的に回収する点からは、重合を上記温度感応性高分子化合物のＬＣＳＴより低い温度で行うことが望ましいので、レドックス開始剤系などの低温開始剤が好ましく用いられる。
【００６１】
本発明の担体を繊維状、フレーク状、スポンジ状、粒子状などに成型する場合は、例えば、ＬＣＳＴより低い温度に冷却された温度感応性高分子化合物の水溶液を、口金を用いてＬＣＳＴより高い温度の水中あるいは水を混合しない有機溶媒中に押し出すことによって実施できる。このような成型方法を用いる場合は、架橋構造の付与は、成型終了時に光、電子線、γ線照射などを用いることにより実施できる。
【００６２】
本発明の担体を板状、膜状に成型する場合には、例えば、上記温度感応性高分子化合物を有機溶媒あるいはＬＣＳＴより低い温度の水に溶解し、ソルベントキャスティング法により実施することができる。このような成型方法を用いる場合も、架橋構造の付与は光、電子線、γ線照射などを用いることによって実施できる。
【００６３】
更には、上述した種々の成型方法によって得られた各種の形状の担体を機械的な方法などで破砕し、所望の大きさの担体に成型することも可能である。
【００６４】
（培地）本発明においては、上述したような高分子化合物を含む担体と組み合わせて用いるべき培地ないし培養液として、寒天を実質的に含まない公知の（植物体の育成および／又は再生用）培地ないし培養液を特に制限なく使用することができる。
【００６５】
本発明において、上記架橋構造を有する温度感応性高分子化合物からなる担体の植物体培養用培地中の分散濃度は、該植物体の種類および形状によって適宜選択することが可能であるが、通常、０．１〜３０質量％（ｗｔ％）、更には１〜１０質量％（ｗｔ％）の濃度が好ましく用いられる。
【００６６】
（植物体の育成・再生方法）
上記した高分子化合物担体を用いて植物体を育成あるいは再生する方法の好ましい一例を以下に記載する。
【００６７】
先づ上述したような高分子化合物担体を所望の培地中に、該高分子化合物担体分散液の液体ーゲル転移温度より高い温度で均一に分散する。次に、該高分子化合物担体の培地分散液中に、葉、茎、根、花弁、葯（花粉）、幼植物などからなる植物体、あるいは上記植物体から再生したカルス、毛状根あるいはプロトプラストなどからなる植物体を混合分散させる。次に、該植物体分散溶液の温度を、上記液体ーゲル転移点温度より低い温度に設定することにより、所望の形状のゲル状体を作製し、該植物体の育成あるいは再生を行うことができる。
【００６８】
一方、該ゲル中で育成あるいは再生した植物体の回収あるいは継代は、温度を上記液体ーゲル転移温度より高い温度に上げ、該ゲルを再び液化することによって容易に実施することができる。
【００６９】
特に、本発明の高分子化合物担体の植物体の育生・再生方法への応用の効果的なものは、植物体の発根過程への応用である。
【００７０】
より具体的には、例えば、本発明の高分子化合物担体を所望の培地中に、該高分子化合物担体の液体−ゲル転移温度より高い温度で均一に分散させた後、温度を該液体−ゲル転移温度より低くすることによって、架橋高分子の吸水・膨潤に基づき均一にゲル化させる。該ゲル上には、葉、茎、根、花弁、葯（花粉）、幼植物などからなる植物体をのせ、あるいはさし込み、該ゲル状態を維持した状態で培養し、ゲル中に発根させる。発根した該植物体を該ゲルから回収あるいは継代する際に、温度を液体−ゲル転移温度より高く上げることによって架橋高分子の脱水・収縮に基づき上記ゲルを液化し、収縮した該担体の分散液から容易にかつ無傷で発根植物体を分離することができる。ここに、本発明の高分子化合物担体においては、上述したように液体−ゲル転移温度を適宜コントロール可能なことが、上記した従来の寒天ゲルに比較して重要な特徴となる。
【００７１】
更に、ＬＣＳＴより高い温度では、上記高分子化合物は脱水・収縮状態にあるため、該高分子からなる担体を含む培地分散液の粘度は、実質的には培地の粘度と同等である。この特性は、植物体の回収、継代を容易にするばかりでなく、該回収、継代時の培地の洗浄除去を簡便にし、しかも該回収、継代が植物体に与える損傷も全くない。
【００７２】
従来、発根過程終了後の植物体を寒天ゲルから分離する際の操作が、その後の植物体の育成率の著しい低下の大きな原因であったが、本発明の高分子化合物担体はこのような問題点を完全に解消することができる。
【００７３】
また、上記ゲル培地中に不足した栄養素の補給、あるいは育成あるいは再生を妨害するような老廃物の除去も、上記した方法により古いゲルを液化し、除去した後、植物体を新しい培地に移植することにより実施可能である。本発明においては、このようにして容易にゲル培養を続行することができる。
【００７４】
また、本発明の高分子化合物担体は、植物体を上記の方法で育成・再生し、回収または継代した後に、ＬＣＳＴより高い温度で、担体の分散液体から該担体を（遠心分離などの方法によって）容易に回収し、洗浄し再使用することも可能である。
【００７５】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は特許請求の範囲の項の記載により定まるものであり、以下の実施例により制限を受けるものではない。
【００７６】
実施例１
（マイクロビーズ状担体の合成）
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）１５ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（Ｂｉｓ）０．１ｇ、および過硫酸アンモニウム０．１ｇを蒸留水１００ｍｌに溶解した。この水溶液を、ヘキサン１０００ｍｌにソルビタンモノオレエート（ＳＰＡＮ８０、関東化学（株）製）１０ｇを溶解した液中に加え、窒素気流下で激しく攪拌、懸濁させた後、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン３ｍｌを加えて、室温で４時間重合させた。
【００７７】
水相を分離後、ヘキサン５００ｍｌで３回洗浄した。次いで、蒸留水１０００ｍｌを加えて４℃に冷却した後、４０℃に加温してマイクロビーズ状担体を収縮させ、上清を捨てた。この水洗操作を３回繰り返した後、真空乾燥して本発明のマイクロビーズ状担体（Ａ）を得た。
【００７８】
Ｂｉｓ０．４ｇを用いる以外は上記と全く同様の操作で、本発明のマイクロビーズ状担体（Ｂ）を得た。
【００７９】
蒸留水中における担体（Ａ）および（Ｂ）の直径を光学顕微鏡下、種々の温度で測定し、得られた結果を図１のグラフに示した。また、これらの直径を、マイクロビーズ収縮時の体積を１とした体積の変化割合（倍率）に換算して、図２のグラフに示した。表１には、上記図１および図２に対応するデータを示した。
【００８０】
【表１】

【００８１】
（担体分散液の調整）
上記で得た乾燥担体（Ａ）５ｇを、ムラシゲースクーグ植物培地（ＭＳ培地；コスモ・バイオ（株）製）１００ｍｌに４０℃で分散させた。この分散液を徐々に冷却すると、約３１℃で流動性を失い、ゲル化した。このゲル状態のものを徐々に加温すると、約３２℃で再び流動性のある分散液に戻った。
【００８２】
実施例２
カーネーションの側芽組織を切り出し、洗剤と水道水で洗浄した後、７０％エタノール水溶液に３０秒間浸漬し、１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に７分間浸漬することによって滅菌した後、滅菌蒸留水によって数回、洗浄した。このようにして得られた側芽組織を外植体として、寒天０．８％含有のＭＳ培地上に植え、２週間培養しシユートを形成させた後、該シユートを節ごとに切断した。
【００８３】
次いで、実施例１で作製した本発明のマイクロビーズ状担体（Ａ）５ｇを、３７℃で、１−ナフタリン酢酸を０．１ｍｇ／ｌ、シュクロースを１０ｇ／ｌの濃度で含有する１００ｍｌのＭＳ培地に分散させた。該分散培地をオートクレーブ（１２１℃、２０分間）処理することによって滅菌した。
【００８４】
上記で得た担体（Ａ）分散培地は３７℃では液体状態であったが、温度を約２３℃に下げることによって完全なゲル状態となった。このようにして担体（Ａ）分散培地を完全なゲル状態とした後、該ゲル上に、上記節ごとに切断されたカーネーションのシュートを挿芽し、約２３℃で３週間培養したところ、培養３週間後には該ゲル内に発根が認められた。
【００８５】
次に、上記発根した植物体を順化のため培養器から回収するために、該発根植物体の培養器の温度を約３７℃に上げたところ、ただちに上記マイクロビーズ状担体の体積が減少して、分散培地はゲル状態から液体に変化し、該発根植物体を容易に培養器外に取り出すことができた。上記の回収工程に於て、根に付着した担体（Ａ）は容易に水洗いによって除去が可能であり、また根などの損傷は全く認められず、作業も非常に容易であった。
【００８６】
比較例１
通常の方法で、寒天を８ｇ／ｌ、１−ナフタリン酢酸を０．１ｍｇ／ｌ、およびシュクロースを１０ｇ／ｌの濃度で含有するＭＳ培地を作製し、オートクレーブ処理によって滅菌を行った。次いで、該培地を約２３℃に冷却しゲル化させた後、該ゲル上に、実施例２で用いた節ごとに切断されたカーネーションのシュートを挿芽し、約２３℃で実施例２と同様の方法で３週間培養した。培養３週間後にゲル内に発根が認められた。
【００８７】
上記発根植物体をゲルから分離するために、ゲルが付着した状態で該植物体を培養器から取り出し、常法に従って水中で機械的に振盪したが、毛状の根に付着したゲルは除去することが困難であり、手によって該ゲルを除去する操作で毛状の根がちぎれてしまった。また手による洗浄は、非常に繁雑であった。
【００８８】
実施例３
４〜５月生育したタバコ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｇｌｕｔｉｎｏｓａ）の茎を４〜５ｃｍに切り、洗剤と水道水で洗浄した後、７０％エタノール水溶液に３０秒間浸漬し、１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に７分間浸漬することによって滅菌した後、滅菌蒸留水によって数回洗浄した。
【００８９】
次に、滅菌したカミソリで上記の茎を５ｍｍ程度に切断し、該切片に約３ｍｍの径のコルクボーラーをさして髄組織を採取し、該髄組織を更に２〜３ｍｍ程度に切断した、以上の操作はすべて無菌操作によって行った。
【００９０】
次いで実施例１で作製した本発明のマイクロビーズ状の担体（Ａ）５ｇを、３７℃で、１００ｍｌの寒天を含まないタバコの細胞培養用培地（平井篤志ら、生物化学実験法１６，“植物細胞育種入門”ｐ１５（１９６９），学会出版センター）中に分散し、オートクレーブ処理することによって滅菌した。
【００９１】
上記マイクロビーズ状担体を含有する培地中に、３７℃で、上記の方法で得られた数個の髄組織切片を分散させた後に、温度を約２３℃に下げて該培地を完全にゲル化させることにより該髄組織をゲル中に包埋し、１０００〜３０００ルックスの人工照射条件下に１５日間培養したところ、それぞれの髄組織切片から良好なカルスの形成が認められた。
【００９２】
次に、ゲル中に形成されたカルスを回収するために、該ゲルを約３分間、３７℃に昇温することによってゲルを溶解した後、ゆるやかに遠心することによって上記カルスを単離した。更に０．５Ｍマンニトール液を加え再懸濁した後、遠心することによって、上記担体（Ａ）を完全に除去したタバコのカルスを回収することができた。
【００９３】
【発明の効果】
上述したように本発明によれば、ゲル中への植物体の包埋およびゲルからの植物体の回収等が、例えば植物体の生理的温度範囲内の温度変化によって、簡便に且つ植物体に全く損傷を与えることなく実施することができる。したがって本発明によれば、従来の寒天などを用いたゲル培養法の問題点を完全に解消することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のマイクロビーズ状担体の温度依存粒径変化の一例を示すグラフである。
【図２】本発明のマイクロビーズ状担体の温度依存体積変化の一例を示すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a polymer compound carrier suitable for growing or regenerating a plant, and more specifically, it enables easy recovery or subculture without damaging a grown or regenerated plant. The present invention relates to a carrier for growing or regenerating a plant, and a method for growing or regenerating a plant using the same.
[0002]
[Prior art]
In recent years, the development of techniques for growing or regenerating plants having desired traits has attracted great attention.
[0003]
In recent years, protoplasts have been isolated from these plants, including techniques for directly growing plants such as leaves, stems, roots, petals, anthers (pollens) or young plants, and the protoplasts have been cultured to form callus or hairy plants. Various techniques have been developed, including techniques to regenerate and grow roots. In particular, at the protoplast stage, techniques such as gene introduction or cell fusion are applied to grow or regenerate plants more suitable for the purpose. Furthermore, a new breeding method has been developed in which a foreign gene is directly introduced into a plant tissue such as leaves, stems, roots, petals, and anthers using a gene gun or the like.
[0004]
The most important point common to these new breeding methods is to establish a culture method in which a plant that has acquired a desired trait can efficiently grow or regenerate.
[0005]
Plant cultivation is broadly divided into liquid culturing and solid culturing using a gel such as agar. Liquid culture is a method suitable for mass culture in order to culture plants in suspension.At the same time, liquid culture can be easily subcultured and used in bioreactors for the purpose of producing secretions of plants. Although it has advantages such as being suitable, liquid culture is difficult depending on the type of plant.
[0006]
On the other hand, the solid culture method using agar (agar) is a method applicable to a wide range of plant species and is a culture method particularly suitable for mutant selection, but has the following major problems. are doing.
[0007]
1) It is very difficult to collect or subculture plants grown or regenerated on an agar medium in an agar-free state.
[0008]
2) When culturing on an agar medium, nutrients are replenished by diffusion from the outside of the gel, so the efficiency is very poor.
[0009]
3) Since the removal of waste products accumulated in the agar medium is also performed by diffusion, the efficiency is extremely low. In particular, it is almost impossible to remove growth inhibitors such as polyphenols produced by plants.
[0010]
4) It is not suitable as a carrier for a bioreactor for producing a substance produced by a plant.
[0011]
The problems described above are caused by the physical properties of gels such as agar (agar) used in conventional solid culture. That is, agar or agarose has a sol-gel transition temperature, and has a property of exhibiting a dissolved state, that is, a sol state at a temperature higher than the transition temperature, and changing to a gel state at a temperature lower than the transition temperature. By utilizing this property, plants have been buried in agar or the like in a sol state higher than the sol-gel transition temperature, changed into a gel by lowering the temperature, and solid culture has been carried out.
[0012]
However, the melting temperature of the agar gel is very high, around 90 ° C (Aizo Yamauchi et al., Polymer One Point “functional gel” P29, Kyoritsu Shuppan), so that the plant body is buried in the dissolved agar. In doing so, the plant is thermally damaged. In addition, when recovering or subculturing the grown or regenerated plant from the agar medium, it is necessary to raise the temperature to a temperature higher than the sol-gel transition temperature and change the agar to the sol state. Very high thermal damage due to high temperature.
[0013]
Therefore, in the conventional solid culture, it was extremely difficult to recover or subculture in an agar-free state due to a temperature change. On the other hand, mechanically removing agar from the plant not only requires much effort, but also may damage fragile plant tissues (especially callus and hairy roots). was there.
[0014]
Since the removal of agar after growing and regenerating has the above-mentioned problems, in the conventional solid culture method, transplantation of the grown or regenerated plant into the soil is carried out with the agar attached to the plant. Has been implemented. However, in this case, it has been pointed out that since the agar medium contains a large amount of nutrients, bacteria, molds and the like easily proliferate in the soil and cause the plants to rot.
[0015]
On the other hand, in a bioreactor aimed at producing secretions of a plant, recovery of secretions from a gel agar medium is much more difficult than in a liquid culture method. That is, high-temperature heating when dissolving the agar gel containing the secretion causes a significant damage to the secretion.
[0016]
Sodium alginate has been used as a carrier for growing or regenerating plants in order to reduce the above-mentioned problems of agar gel. That is, a method in which a plant is buried in an aqueous solution of sodium alginate, and then the solution is brought into a gel state by bringing the solution into contact with a concentrated calcium chloride solution.
[0017]
Although calcium alginate has the advantage of being less toxic, the above method has the following problems.
[0018]
1) It is necessary to dissolve the calcium alginate gel at the time of recovery or subculture of plants grown or regenerated in the calcium alginate gel, and a calcium chelate such as EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) used at that time. The agent damages cells, tissues and the like.
[0019]
2) Calcium alginate gel has low mechanical strength.
[0020]
3) In a medium containing a high concentration of phosphoric acid, calcium in the calcium alginate gel reacts with phosphoric acid to form a precipitate of calcium phosphate, which makes culturing difficult and weakens the gel.
[0021]
4) Since gelation of sodium alginate is caused by an ion exchange reaction with calcium, gelation proceeds from the surface of the gel to the inside thereof, and the plants existing inside the gel hinder the uniform gelation reaction and become improper. A gel having a uniform structure is easily generated.
[0022]
As described above, gels that have been conventionally used for growing or regenerating plant bodies still have large problems left unsolved.
[0023]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a plant growing or regenerating carrier capable of easily collecting or subculturing a grown or regenerated plant, and a method for growing or regenerating a plant using the same. .
[0024]
Another object of the present invention is to provide a material suitable as a bioreactor carrier for producing a substance produced by a plant.
[0025]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventor has developed a polymer compound capable of reversibly converting between a liquid state and a gel state at a temperature significantly lower than the sol-gel transition temperature of a conventional gel such as agar, and producing a plant compound. It has been found that the use as a carrier for growing and / or regenerating is extremely effective in solving the above-mentioned problems.
[0026]
The plant growing or regenerating carrier of the present invention is based on the above findings, and more specifically includes a polymer compound obtained by crosslinking a temperature-sensitive polymer compound having an LCST (lower critical solution temperature). It is characterized by the following.
[0027]
According to the present invention, further, a carrier obtained by crosslinking a temperature-sensitive polymer compound having an LCST is dispersed in a predetermined medium at a temperature higher than the LCST, and a plant is mixed into the dispersion liquid, By lowering the temperature below the LCST, a method of growing or regenerating a plant is provided, in which the fluidity of the dispersion liquid is reduced and the plant is grown or regenerated in a gel state.
[0028]
According to the present invention, further, a carrier obtained by crosslinking a temperature-sensitive polymer compound having an LCST is dispersed in a predetermined medium at a temperature higher than the LCST, and the temperature is lowered below the LCST to thereby reduce the temperature. A method for growing or regenerating a plant, which grows or regenerates the plant, by placing or inserting the plant into the gel after reducing the fluidity of the dispersion liquid to a gel state, is provided.
[0029]
In the carrier of the present invention, a polymer compound obtained by crosslinking a temperature-sensitive polymer compound having an LCST absorbs and swells in water or a medium at a temperature lower than the LCST, and dehydrates and shrinks at a temperature higher than the LCST to obtain a volume. Is a characteristic that remarkably changes.
[0030]
Therefore, for example, by controlling the amount ratio of the carrier and the medium in the medium dispersion of the carrier of the present invention, the cross-link density of the temperature-sensitive polymer, and the size of the carrier, the fluidity at a temperature lower than the LCST is improved. A significantly lower gel state and a liquid state with significantly higher fluidity at temperatures higher than the LCST can be realized. This conversion between the liquid and gel states is reversible with temperature. The change temperature between the liquid state and the gel state is determined by the LCST.
[0031]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to the drawings as necessary. In the following description, “parts” and “%” representing quantitative ratios are based on mass unless otherwise specified.
[0032]
(Liquid-Gel Transition Temperature) In the present invention, the “liquid state”, “gel state” and “liquid-gel transition temperature” are defined as follows. This definition is described in the literature (Polymer Journal,18(5), 411-416 (1986)).
[0033]
1 mL of the carrier dispersion liquid is placed in a test tube having an inner diameter of 1 cm, and kept in a water bath at a predetermined temperature (constant temperature) for 12 hours. Thereafter, when the test tube is turned upside down, when the carrier liquid / air interface (meniscus) is deformed by the weight of the carrier dispersion liquid (including the case where the carrier dispersion liquid flows out), At this predetermined temperature, the dispersion liquid of the carrier is defined as being in a "liquid state". On the other hand, even if the test tube is turned upside down, in the case where the interface between the dispersion liquid of the carrier and the air (meniscus) is not deformed by the weight of the dispersion liquid of the carrier, the dispersion liquid of the carrier is maintained at the predetermined temperature. Is defined as a “gel state”.
[0034]
On the other hand, when the above-mentioned “predetermined temperature” is gradually increased (for example, in steps of 1 ° C.) to determine the temperature at which the “gel state” transitions to the “liquid state”, the transition temperature thus obtained is referred to as “liquid-gel”. (At this time, the “predetermined temperature” may be lowered in steps of 1 ° C. to determine the temperature at which the “liquid state” changes to the “gel state”.)
[0035]
In the carrier of the present invention, the liquid-gel transition temperature is higher than 0 ° C and preferably 60 ° C or lower, and more preferably 4 ° C or higher and 50 ° C or lower (particularly 4 ° C or higher and 40 ° C or lower). It is preferable from the viewpoint of preventing thermal damage to the body. Such a polymer compound having a suitable liquid-gel transition temperature can be easily selected from the specific compounds described below according to the above-described screening method (liquid-gel transition temperature measurement method).
[0036]
In the method for growing or regenerating a plant of the present invention, the above-mentioned liquid-gel transition temperature (a ° C.) and the temperature for growing or regenerating the plant (b ° C.) It is preferable to set the temperature between the temperature and the temperature (c ° C.) at the time of replacement. That is, it is preferable that there is a relation of b <a <c between the above three temperatures a ° C., b ° C., and c ° C. More specifically, (ab) is preferably 1 to 40C, more preferably 2 to 30C, and (ca) is 1 to 40C, more preferably 2 to 30C. Is preferred.
[0037]
The temperature-sensitive polymer compound having an LCST used in the present invention has a property of being insoluble in water or a medium at a temperature higher than the LCST in water or a medium, but changing to be soluble at a temperature lower than the LCST. .
[0038]
The state change of the temperature-sensitive polymer compound is attributed to hydration and dehydration. For such a phenomenon, see Haskins, M .; , Et al. , J. et al. Macromol. Sci. Chem. ,A2(8), 1441, 1968, there is described an example of poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAAm) which is one of the polymer compounds. PNIPAAm is a polymer compound having a negative temperature coefficient of solubility in water. At a low temperature, a hydrate (oxonium hydroxide) that depends on the hydrogen bond between the PNIPAAm molecule and the water molecule is generated. However, this is decomposed and dehydrated by raising the temperature to a temperature higher than the LCST, and as a result, the PNIPAAm molecules aggregate and precipitate.
[0039]
When a cross-linked structure is imparted to the above-mentioned temperature-sensitive polymer compound having an LCST, the polymer is maintained in a swollen gel state without dissolving in water or in a medium even at a temperature lower than the LCST. Since water is insoluble in water, water is separated from the gel and the volume of the crosslinked product is significantly reduced. As described above, the plant growth / regeneration carrier and the plant growth / regeneration method of the present invention utilize such properties of a crosslinked temperature-sensitive polymer compound.
[0040]
(Temperature-Sensitive Polymer Compound) Examples of the temperature-sensitive polymer compound that can be preferably used in the present invention include poly N-substituted acrylamide derivatives, poly n-substituted methacrylamide derivatives, copolymers thereof, and polyvinyl methyl ether. , Polypropylene oxide, polyethylene oxide, etherified methylcellulose, partially acetylated polyvinyl alcohol, and the like. Particularly preferably used in the present invention are poly N-substituted acrylamide derivatives or poly N-substituted methacrylamide derivatives or copolymers thereof, polyvinyl methyl ether, polypropylene oxide, and partially acetylated polyvinyl alcohol.
[0041]
The polymer compounds preferably used in the present invention are listed below in ascending order of LCST.
[0042]
Poly-N-acryloylpiperidine; poly-Nn-propylmethacrylamide; poly-N-isopropylacrylamide; poly-N, N-diethylacrylamide; poly-N-isopropylmethacrylamide; poly-N-cyclopropylacrylamide; poly -N-acryloylpyrrolidine; poly-N, N-ethylmethylacrylamide; poly-N-cyclopropylmethacrylamide; poly-N-ethylacrylamide The above polymer may be a homopolymer or a homopolymer. It may be a copolymer of a monomer constituting the union and another monomer. As the other monomer constituting such a copolymer, any of a hydrophilic monomer and a hydrophobic monomer can be used.
[0043]
Examples of the hydrophilic monomer include N-vinylpyrrolidone, vinylpyridine, acrylamide, methacrylamide, N-methylacrylamide, hydroxyethyl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, hydroxymethyl methacrylate, hydroxymethyl acrylate, and acrylic having an acidic group. Acid, methacrylic acid and salts thereof, vinyl sulfonic acid, styrene sulfonic acid, etc., and N, N-dimethylaminoethyl methacrylate having a basic group, N, N-diethylaminoethyl methacrylate, N, N-dimethylaminopropyl Examples include, but are not limited to, acrylamide and salts thereof.
[0044]
On the other hand, as the hydrophobic monomer, ethyl acrylate, methyl methacrylate, butyl methacrylate, acrylate derivatives such as glycidyl methacrylate and methacrylate derivatives, N-substituted alkyl methacrylamide derivatives such as Nn-butyl methacrylamide, vinyl chloride, Examples include, but are not limited to, acrylonitrile, styrene, vinyl acetate, and the like.
[0045]
Generally, the LCST increases by copolymerizing a hydrophilic monomer with the above-mentioned temperature-sensitive polymer compound, and decreases by copolymerizing a hydrophobic monomer. Therefore, the liquid-gel transition temperature of the dispersion liquid of the temperature-sensitive polymer compound having the crosslinked structure of the present invention increases when the temperature-sensitive polymer compound obtained by copolymerizing the hydrophilic monomer is used, and the hydrophobicity is increased. The temperature is lowered by using a temperature-sensitive polymer compound obtained by copolymerizing a monomer. Therefore, the liquid-gel transition temperature in the present invention can be controlled also by selecting the comonomer component.
[0046]
As a method for providing a cross-linked structure (irreversible cross-linked structure) to the temperature-sensitive polymer compound, a method of introducing a cross-linked structure when polymerizing a monomer to be provided with the temperature-sensitive polymer compound, a method of simply introducing the cross-linked structure, There is a method of introducing a crosslinked structure after the polymerization of the monomer, and any of these methods can be employed in the present invention.
[0047]
The former method can be generally performed by copolymerizing a bifunctional monomer (or a monomer having three or more functional groups). For example, the reaction can be performed using a bifunctional monomer such as N, N-methylenebisacrylamide, hydroxyethyl dimethacrylate, divinylbenzene, and the like.
[0048]
The latter method can be generally performed by forming a crosslink between molecules by irradiation with light, an electron beam, γ-ray, or the like.
[0049]
In the latter method, for example, a polyfunctional molecule having a plurality of functional groups (for example, isocyanate groups) capable of binding to functional groups (for example, amino groups) in a temperature-sensitive polymer compound is crosslinked. It can be carried out by using a temperature-sensitive polymer compound as a crosslinking agent.
[0050]
The volume change ratio (magnification) of the carrier of the present invention in water is such that the volume at the time of shrinkage at a temperature higher than the LCST is 1, and the equilibrium swelling volume at the temperature of plant growth or regeneration lower than the LCST is 1.1 to 1000. And more preferably 5 to 100. Here, the equilibrium swelling volume refers to the volume after the carrier of the present invention is immersed in an excess amount of water at a predetermined temperature (constant temperature) for at least 3 days and the swelling reaches equilibrium. Rev. Lett., T. Tanaka, et al., Phys.55, 2455 (1985)).
[0051]
The ratio of the volume change depending on the temperature of the carrier of the present invention as described above usually depends on the crosslinked structure, particularly the crosslink density, and generally, the lower the crosslink density, the larger the volume change. In the former method, for example, the cross-linking density is arbitrary by changing the copolymerization ratio of the bifunctional monomer, and in the latter method, for example, by changing the irradiation amount of light, electron beam, γ-ray, or the like. It is possible to control.
[0052]
In the present invention, the preferable range of the crosslink density is about 0.2 mol% to about 10 mol%, more preferably about 0.5 mol% to about 4 mol%, in terms of the molar ratio of branch points to all monomers. When the crosslinked structure is introduced by the former method, the copolymerization weight ratio of the bifunctional monomer to all the monomers (including the bifunctional monomer itself) is about 0.3% by mass (wt. %) To about 3% by weight (wt%) (more preferably, about 0.5% by weight (wt%) to about 1.5% by weight (wt%)).
[0053]
In the present invention, when the crosslink density exceeds the above-mentioned range of about 0.2 mol% to about 10 mol%, the rate of volume change depending on the temperature of the carrier of the present invention becomes small, so that a clear liquid-gel transition occurs. Less likely to occur. On the other hand, when the crosslink density is below this range, the mechanical strength of the carrier of the present invention becomes weak, and it becomes difficult for the dispersion to maintain a sufficient strength for holding the plant in a gel state.
[0054]
The crosslink density (molar ratio of branch points to all monomers) as described above is, for example,^ThirteenIt can be quantified by C-NMR (nuclear magnetic resonance absorption) measurement, IR (infrared absorption spectrum) measurement, or elemental analysis.
[0055]
The shape of the carrier of the present invention can be appropriately selected depending on the type and size of the plant to be grown and regenerated. The carrier may be, for example, a particle, a microbead, a fiber, a flake, a sponge, or a membrane. Various shapes such as a shape and a plate shape can be adopted. From the viewpoint of efficient swelling by water absorption, the shape of the carrier is preferably a shape having a large surface area, and more specifically, for example, is preferably a particle shape and / or a microbead shape.
[0056]
The size of the carrier of the present invention can be appropriately selected depending on the type and size of the plant to be grown and regenerated. When the carrier has a shape of particles or microbeads, when shrinking in an aqueous dispersion, that is, at a temperature higher than the LCST of the temperature-sensitive polymer compound constituting the carrier, 0.1 μm to 1 cm (further 1 μm １1 mm).
[0057]
In molding the carrier of the present invention, it is possible to use an ordinary method for molding a polymer compound.
[0058]
In particular, when the carrier is in the form of microbeads or particles, means such as emulsion polymerization, suspension polymerization, and precipitation polymerization are preferably used. As a method for imparting a cross-linked structure to a temperature-sensitive polymer compound, as described above, a method of cross-linking using a bifunctional monomer when polymerizing a monomer; After the application, a method of cross-linking by irradiation with light, an electron beam, γ-ray, or the like can be used.
[0059]
In particular, when a crosslinked temperature-sensitive polymer compound in the form of microbeads is synthesized from a water-soluble monomer and a water-soluble bifunctional monomer, a reversed-phase suspension polymerization method is suitably used.
[0060]
In such a reversed-phase suspension polymerization method, it is preferable to use an organic solvent that does not dissolve the monomer and the produced polymer as the dispersion medium. For example, a saturated hydrocarbon such as hexane is preferably used. Further, a surfactant (for example, a nonionic surfactant such as sorbitan fatty acid ester) may be used together with the organic solvent as a suspending aid. The particle size of the obtained microbeads can be controlled by the type and amount of the surfactant to be added or the stirring speed. As the polymerization initiator, any of a water-soluble initiator and a water-insoluble initiator can be used. From the viewpoint of efficiently recovering the polymerization product, it is desirable to carry out the polymerization at a temperature lower than the LCST of the temperature-sensitive polymer compound. Therefore, a low-temperature initiator such as a redox initiator system is preferably used.
[0061]
When the carrier of the present invention is formed into a fibrous form, a flake form, a sponge form, a particulate form, or the like, for example, an aqueous solution of a temperature-sensitive polymer compound cooled to a temperature lower than the LCST is higher than the LCST using a die. It can be carried out by extruding into water at a temperature or into an organic solvent in which water is not mixed. When such a molding method is used, the cross-linking structure can be provided by using light, electron beam, γ-ray irradiation, or the like at the end of molding.
[0062]
When the carrier of the present invention is formed into a plate shape or a film shape, for example, the temperature-sensitive polymer compound can be dissolved in an organic solvent or water at a temperature lower than the LCST, and can be carried out by a solvent casting method. Even when such a molding method is used, the cross-linking structure can be imparted by using light, electron beam, γ-ray irradiation, or the like.
[0063]
Further, it is also possible to crush the carrier of various shapes obtained by the above-mentioned various molding methods by a mechanical method or the like and to mold the carrier into a desired size.
[0064]
(Medium) In the present invention, as a medium or a culture medium to be used in combination with the above-described carrier containing a polymer compound, a known (substrate-growing and / or regenerating) medium substantially free of agar Alternatively, the culture solution can be used without any particular limitation.
[0065]
In the present invention, the dispersion concentration of the carrier composed of the temperature-sensitive polymer compound having the cross-linked structure in the plant culture medium can be appropriately selected depending on the type and shape of the plant. A concentration of 0.1 to 30% by mass (wt%), more preferably 1 to 10% by mass (wt%) is preferably used.
[0066]
(How to grow and regenerate plants)
A preferred example of a method for growing or regenerating a plant using the above-described polymer compound carrier is described below.
[0067]
First, the polymer compound carrier as described above is uniformly dispersed in a desired medium at a temperature higher than the liquid-gel transition temperature of the polymer compound carrier dispersion. Next, a plant consisting of leaves, stems, roots, petals, anthers (pollens), young plants, or the like, or callus, hairy roots or protoplasts regenerated from the above plant, is added to the medium dispersion of the polymer compound carrier. And the like. Next, by setting the temperature of the plant dispersion solution to a temperature lower than the liquid-gel transition temperature, a gel having a desired shape can be prepared, and the plant can be grown or regenerated. .
[0068]
On the other hand, the recovery or subculture of plants grown or regenerated in the gel can be easily performed by raising the temperature to a temperature higher than the liquid-gel transition temperature and liquefying the gel again.
[0069]
In particular, an effective application of the polymer compound carrier of the present invention to a method of growing and regenerating a plant is an application to a rooting process of the plant.
[0070]
More specifically, for example, after uniformly dispersing the polymer compound carrier of the present invention in a desired medium at a temperature higher than the liquid-gel transition temperature of the polymer compound carrier, the temperature is changed to the liquid-gel By making the temperature lower than the transition temperature, the crosslinked polymer is uniformly gelled based on water absorption and swelling. A plant consisting of leaves, stems, roots, petals, anthers (pollens), seedlings, etc. is placed on or inserted into the gel, cultured in a state where the gel state is maintained, and rooted in the gel. Let it. When the rooted plant is recovered or subcultured from the gel, the gel is liquefied based on dehydration and shrinkage of the crosslinked polymer by raising the temperature above the liquid-gel transition temperature, and the shrunk carrier is removed. Rooting plants can be easily and intactly separated from the dispersion. Here, in the polymer compound carrier of the present invention, the ability to appropriately control the liquid-gel transition temperature as described above is an important feature as compared with the above-mentioned conventional agar gel.
[0071]
Further, at a temperature higher than the LCST, since the polymer compound is in a dehydrated / shrinked state, the viscosity of the medium dispersion containing the carrier made of the polymer is substantially equal to the viscosity of the medium. This property not only facilitates the recovery and passage of the plant, but also facilitates the washing and removal of the culture medium during the recovery and passage, and does not cause any damage to the plant by the recovery or passage.
[0072]
Conventionally, the operation of separating the plant body from the agar gel after the rooting process has been a major cause of the remarkable decrease in the subsequent growth rate of the plant body. Problems can be completely eliminated.
[0073]
In addition, replenishment of nutrients lacking in the gel medium, or removal of waste products that hinder growth or regeneration, liquefies old gels by the above-described method, removes them, and then transplants the plants to a new medium. This can be implemented by: In the present invention, gel culture can be easily continued in this manner.
[0074]
In addition, the polymer compound carrier of the present invention is obtained by growing and regenerating a plant body by the above-described method, collecting or subculturing the plant, and then separating the carrier from the dispersion liquid of the carrier at a temperature higher than the LCST by a method such as centrifugation. ) Can be easily recovered, washed and reused.
[0075]
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples. However, the scope of the present invention is determined by the description of the claims, and is not limited by the following Examples.
[0076]
Example 1
(Synthesis of microbead-shaped carrier)
15 g of N-isopropylacrylamide (NIPAAm), 0.1 g of N, N'-methylenebisacrylamide (Bis), and 0.1 g of ammonium persulfate were dissolved in 100 ml of distilled water. This aqueous solution was added to a solution in which 10 g of sorbitan monooleate (SPAN80, manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) was dissolved in 1000 ml of hexane, and the mixture was vigorously stirred and suspended under a nitrogen stream, and then N, N, N ′, 3 ml of N'-tetramethylethylenediamine was added, and polymerization was carried out at room temperature for 4 hours.
[0077]
After separating the aqueous phase, it was washed three times with 500 ml of hexane. Subsequently, 1000 ml of distilled water was added and the mixture was cooled to 4 ° C., and then heated to 40 ° C. to shrink the microbead-shaped carrier, and the supernatant was discarded. After repeating this water washing operation three times, vacuum drying was performed to obtain the microbead-shaped carrier (A) of the present invention.
[0078]
Except that 0.4 g of Bis was used, the microbead-like carrier (B) of the present invention was obtained in exactly the same manner as above.
[0079]
The diameters of the carriers (A) and (B) in distilled water were measured at various temperatures under an optical microscope, and the obtained results are shown in the graph of FIG. In addition, these diameters were converted into a volume change ratio (magnification) with the volume at the time of microbead shrinkage being 1, and shown in the graph of FIG. Table 1 shows data corresponding to FIG. 1 and FIG.
[0080]
[Table 1]

[0081]
(Preparation of carrier dispersion)
5 g of the dried carrier (A) obtained above was dispersed at 40 ° C. in 100 ml of Murashige Skoog plant medium (MS medium; manufactured by Cosmo Bio Inc.). When the dispersion was gradually cooled, it lost its fluidity at about 31 ° C. and gelled. When the gel was gradually heated, it returned to a fluid dispersion at about 32 ° C.
[0082]
Example 2
The carnation side bud tissue is cut out, washed with detergent and tap water, immersed in a 70% aqueous ethanol solution for 30 seconds, immersed in a 1% aqueous sodium hypochlorite solution for 7 minutes, and then sterilized with sterile distilled water. Washed once. The lateral bud tissue thus obtained was used as an explant, inoculated on an MS medium containing 0.8% agar, cultured for 2 weeks to form a shot, and then cut into nodes.
[0083]
Next, 5 g of the microbead-like carrier (A) of the present invention prepared in Example 1 was added at 37 ° C. to 100 ml of MS containing 0.1 mg / l of 1-naphthaleneacetic acid and 10 g / l of sucrose. Dispersed in the medium. The dispersion medium was sterilized by autoclaving (121 ° C., 20 minutes).
[0084]
The carrier (A) dispersion medium obtained above was in a liquid state at 37 ° C., but was completely gelated by lowering the temperature to about 23 ° C. After the carrier (A) dispersion medium was made into a complete gel state in this manner, carnation shoots cut at the above nodes were cut out on the gel and cultivated at about 23 ° C. for 3 weeks. Three weeks later, rooting was observed in the gel.
[0085]
Next, in order to recover the rooted plant from the incubator for acclimation, the temperature of the incubator of the rooted plant was raised to about 37 ° C., and immediately the volume of the microbead-shaped carrier was reduced. As a result, the dispersion medium changed from a gel state to a liquid state, and the rooted plant could be easily taken out of the incubator. In the above-mentioned recovery step, the carrier (A) adhering to the roots could be easily removed by washing with water, and no damage to the roots or the like was observed at all, and the operation was very easy.
[0086]
Comparative Example 1
An MS medium containing agar at a concentration of 8 g / l, 1-naphthalene acetic acid at 0.1 mg / l, and sucrose at a concentration of 10 g / l was prepared by a usual method, and sterilized by autoclaving. Next, the medium was cooled to about 23 ° C. to form a gel, and then the carnation shoots cut at each node used in Example 2 were inoculated on the gel, and the shoots were mixed with Example 2 at about 23 ° C. The cells were cultured for 3 weeks in the same manner. Rooting was observed in the gel after 3 weeks of culture.
[0087]
To separate the rooting plant from the gel, the plant is taken out of the incubator with the gel attached, and mechanically shaken in water according to a conventional method, but the gel attached to the hairy root is removed. It was difficult to remove the gel by hand, and the hairy root was torn off. Hand washing was also very complicated.
[0088]
Example 3
The stem of the tobacco (Nicotina glutinosa) grown from April to May is cut into 4 to 5 cm, washed with detergent and tap water, immersed in a 70% aqueous ethanol solution for 30 seconds, and then in a 1% aqueous sodium hypochlorite solution for 7 minutes. After sterilization by immersion, it was washed several times with sterile distilled water.
[0089]
Next, the above stem was cut to about 5 mm with a sterilized razor, and a cork borer having a diameter of about 3 mm was put on the section to collect the pulp tissue, and the pulp tissue was further cut to about 2 to 3 mm. All operations were performed by aseptic operation.
[0090]
Then, 5 g of the microbead-like carrier (A) of the present invention prepared in Example 1 was added to 100 ml of agar-free tobacco cell culture medium (Atsushi Hirai et al., Biochemical Experimental Method 16, Plants) at 37 ° C. Cell breeding primer "p15 (1969), Gakkai Shuppan Center) and sterilized by autoclaving.
[0091]
After dispersing several medullary tissue sections obtained by the above method in a medium containing the microbead-shaped carrier at 37 ° C., the temperature was lowered to about 23 ° C. to completely gel the medium. Then, the medullary tissue was embedded in a gel and cultured for 15 days under artificial irradiation conditions of 1000 to 3000 lux. As a result, formation of a good callus from each medullary tissue section was confirmed.
[0092]
Next, in order to collect the callus formed in the gel, the gel was dissolved by raising the temperature of the gel to 37 ° C. for about 3 minutes, and then the callus was isolated by gentle centrifugation. Furthermore, 0.5 M mannitol solution was added and resuspended, and then centrifuged to collect the tobacco callus from which the carrier (A) had been completely removed.
[0093]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, embedding of a plant in a gel and recovery of the plant from the gel can be easily and easily performed on the plant by a temperature change within a physiological temperature range of the plant. It can be performed without any damage. Therefore, according to the present invention, the problem of the conventional gel culture method using agar or the like can be completely solved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing an example of a temperature-dependent particle size change of a microbead-like carrier of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing an example of a temperature-dependent volume change of the microbead-like carrier of the present invention.

Claims

A carrier for growing or regenerating a plant containing a polymer compound obtained by irreversibly cross-linking a temperature-sensitive polymer compound having an LCST (lower critical solution temperature) , and
A carrier for growing or regenerating a plant , wherein the fluidity as a liquid dispersed in water is reduced by lowering the temperature to a lower temperature than the LCST .

The carrier for growing or reproducing a plant according to claim 1, wherein the LCST is higher than 0 ° C and 60 ° C or lower.

The carrier for growing or regenerating a plant according to claim 1, wherein the carrier has a shape of a particle, a microbead, a fiber, a flake, a sponge, a film, or a plate.

The carrier for growing or regenerating a plant according to claim 1, which has a size in a range of 0.1 µm to 1 cm.