JP3583771B2

JP3583771B2 - クロマトグラム解析方法

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Inventors: 正人伊藤; 喜三郎出口; 順吉三浦
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Filing date: 2002-10-10
Publication date: 2004-11-04
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Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ等のクロマトグラフィ技術に係り、特にクロマトグラム解析方法（以下、解析方法という）およびそれに使用されるクロマトグラフ装置、前記解析方法およびクロマトグラフ装置に用いられるデ−タ処理装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の技術の説明に先立ち、技術用語の定義をする。
本出願においては、コンボリューションとは、二つの関数ｘ（ｔ）、ｙ（ｔ）に対するたたみ込み積分として定義され、一般に計測機器からの出力波形は、入力波形と装置関数（電気回路ではインパルス応答、分光器ではスリット関数）とのコンボリューションとなる。
ディコンボリューションとは、コンボリューションの逆演算として定義される。具体的にはコンボリューションであらわされている積分方程式を解くことに相当する。
リコンボリューションとは、装置関数、すなわち拡がりを表わす関数ｈ（ｔ）を用いてディコンボリューションした波形に対し、ふたたびその関数ｈ（ｔ）を用いてコンボリューションすることをいう。
【０００３】
さて、従来から一般に計測機器からの出力波形デ−タは、その計測機器の動特性、すなわち装置関数の影響によって歪をうける。
クロマトグラフ装置においても同様であり、装置関数、すなわち拡がりを表わす関数ｈ（ｔ）によりクロマトグラム上に歪を生じたり、クロマトグラム上にピ−クの重なりが生じる。
このような場合、それぞれクロマトグラムのピ−ク面積を正確に求めることが困難であった。
【０００４】
従来、上記歪をうけた場合は、ディコンボリュ−ション処理により、上記ピ−クの重なりに対しては、通常曲線適合法を基本とした合成分離法を用い、デ−タ処理的に分解し、定量することが提案されている。
これに関する一般的な解決手法については、南茂夫編著「科学計測のための波形デ−タ処理」、ＣＱ出版株式会社刊、（１９８６）の記載技術がある。
また、多くの改善技術が、例えば特開昭６２−１７４６５号公報記載の技術、特開昭６３−１５１８５１号公報記載の技術等が提案されている。
【０００５】
前記特開昭６２−１７４６５号公報記載の技術は、立上り側の半値幅が、立上り地点から終了点までの距離の所定倍になるガウシアンにて近似するものであるが、クロマトグラムが重なりピ−ク波形の場合、必ずしもこのような近似で置換しうる場合は少ない。
この技術は、記憶容量を減らすことには有効であるけれども、ピーク波形が重なった場合、ピーク面積を正確に求めることについては、必ずしも有効ではないという欠点があった。
【０００６】
前記特開昭６３−１５１８５１号公報記載の技術においては、従来、重なりピークの分割をいわゆる垂直分割、スキミング分割処理をしていたものを二つのガウシアンに分割して近似し、最小二乗法と呼ばれる手法にてディコンボリュ−ション処理を行っているが、物理的に意味のある解が得られないという欠点があった。
【０００７】
また、米国特許４８０７１４８号、米国特許４９４１１０１号明細書等記載の技術においては、ディコンボリュ−ション処理において数値解析の手法が用いられ、Ｊａｎｓｓｏｎの方法、ヤコビ法、ガウス−ザイデル法等があり、演算時間、記憶語数の点で有利となっていたが、解の不連続点の拡大等に欠点があった。
【０００８】
【特許文献１】
特開昭６２−１７４６５号公報
【特許文献２】
特開昭６３−１５１８５１号公報
【特許文献３】
米国特許４８０７１４８号明細書
【特許文献４】
米国特許４９４１１０１号明細書
【非特許文献１】
南茂夫編著「科学計測のための波形デ−タ処理」、ＣＱ出版株式会社刊、（１９８６）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来の種々のディコンボリュ−ション処理は、クロマトグラムが歪をうけた場合のディコンボリュ−ション処理、クロマトグラムの重なりピ−ク波形を生じた場合に対する合成分離については、それぞれ個々に解決法を提供するが、歪をうけることによる重なりピ−ク波形を生じた場合には、歪をうけたことを考慮し、重なり波形を分離するところまでは詳しく検討され、対処されていなかった。
【００１０】
また、上記従来におけるクロマトグラムピ−ク波形の重なりに対する合成分離法は、次のような問題がある。
１．ガウシアン等の非線形関数を仮定した場合、その関数を選択する妥当性が疑問である。
２．ＵＶスペクトル等のマルチチャンネル情報を導入する場合、フォトダイオ−ドアレイ検出器等の高価な検出器が必要となる。
３．ピ−ク分解においては最小自乗法を用いるため、解が得られるまでに長い計算時間を要し、また物理的に意味のある解が得られない場合もある。
【００１１】
本発明は、上記従来技術の問題点を解決するためになされたもので、クロマトグラムの波形の歪を補正し、重なりのピ−ク波形をシャ−プにすることにより分離を向上させ、ピ−ク面積をより正確に求め、定量分析の精度が改良されたクロマトグラム解析方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、クロマトグラム解析方法に係る本発明の構成は、分離カラムを通過した分析対象試料を検出器によって検出し、検出によって得られたクロマトグラムの解析を行うクロマトグラム解析方法において、
前記分析対象試料を前記分離カラムへ導入と別に、前記分離カラムによって保持されない標準試料を前記分離カラムへ導入するステップと、
前記クロマトグラム上から、前記標準試料のピークを同定するステップと、
前記クロマトグラムから前記分析対象試料の任意のピークのある時間の始点と終点を設定するステップと、
前記設定された時間区間内のデータを、前記同定された標準試料のピーク波形を用いてディコンボリューション処理を行うステップと、を有することを特徴とする。
前記に記載のクロマトグラム解析方法において、
前記ディコンボリューション処理を行った後のピークが複数のピークで、且つ重なりあった状態のままであった場合に、当該重なりピークに対して、垂直分割、あるいは非線形関数を用いた面積分割を行うことを特徴とする。
【００１３】
上記目的を達成するために、クロマトグラム解析方法に係る本発明の他の構成は、分離カラムを通過した分析対象試料を検出器によって検出し、検出によって得られたクロマトグラム内のピークを標準偏差σを係数として有するガウシアン関数を用いて表し解析を行うクロマトグラム解析方法において、
前記ガウシアン関数の標準偏差σに任意の値を設定するステップと、
前記クロマトグラムに対してディコンボリューション処理を行うステップと、
当該ディコンボリューション処理後のクロマトグラムについて、クロマトグラムが発散していないか、負の下限値を下回っていないか、不分離ピークがピーク間の谷を形成しているか、のいずれかの基準を満たしているかどうかの判定を行うステップと、
当該判定で不合格の場合、前記ガウシアン関数の標準偏差値を調整し、再度ディコンボリューション処理を行うステップと、を有することを特徴とする。
前記に記載のクロマトグラム解析方法において、
前記ディコンボリューション処理に使用した拡がり関数を用いて、前記ディコンボリューション処理によって分離されたピークに対してリコンボリューション処理後の波形を前記ディコンボリューション処理前のピーク波形と重ねて表示することを特徴とする。
【００１４】
より詳しく説明すると、クロマトグラムのピ−クは、種々の原因により拡がっている。例えば配管や検出器のフロ−セル等の流路を試料が流れることにより、試料ゾ−ンが拡がる。これはカラム外の拡がりと呼ばれている。
このカラム外の拡がりに代表される拡がりによる寄与は、オリジナルのピ−ク波形にコンボリュ−ション演算され、検出波形に現われる。
つまり、拡がり関数が既知であれば、検出波形をディコンボリュ−ション演算することによりオリジナルのピ−ク波形を計算することができる。
【００１５】
拡がり関数ｈ（ｔ）を決定する手法はいろいろなものが考えられる。
手法を大きく２つに分類すると、実験的に検出デ−タから求める方法と波形を特徴づけるいくつかのパラメ−タを持つ解析数学的なｈ（ｔ）を仮定する方法とがある。
前者はｈ（ｔ）が既知の方法、後者はｈ（ｔ）が未知の方法と考えることができる。
【００１６】
前記ｈ（ｔ）を測定から求める方法として、例えばカラム外の拡がりを得るために、カラムをジョイントと交換し、試料を注入し、検出器で測定された波形をｈ（ｔ）とみなす方法がある。
試料内の成分の種類に依存しないようなカラム内の拡がりも付加するなら、保持しない試料を注入し、そのピ−ク波形をｈ（ｔ）とみなすことができる。
【００１７】
保持しないピ−クを得る方法には、他に溶離液に溶出能力の極めて強い溶媒を使用すること、カラム充填剤に官能基を修飾しないものを作成し保持しないようにする等が考えられる。
また、標準試料の中に保持しない成分を添加し、非保持ピ−クを標準試料のクロマトグラムから得る方法も有効である。
【００１８】
ｈ（ｔ）が未知の場合、次のような点を前提条件し、ピ−ク幅の一部分に相当する拡がり関数ｈ（ｔ）をディコンボリュ−ション処理し、よりシャ−プなピ−クを持つ処理クロマトグラムからピ−ク面積をもとに正確に定量することができる。
【００１９】
その前提条件とは、検出されるピ−ク波形はオリジナルにはデルタ関数的あるいは非常にシャ−プな長方形的な濃度分布関数に対して、拡がり関数をコンボリュ−ション演算したものであると考えられる。
ここで拡がり関数は、ほぼガウシアンであり、それが若干テ−リング的あるいはリ−ディング的に修正された波形をしている。
つまり、拡がり関数自体もガウシアンに対してテ−リングかリ−ディングの修正関数がコンボリュ−ト演算されていると考えられる。
【００２０】
また、ガウシアンには２つのガウシアンをコンボリュ−ション演算すると、それもまたガウシアンであるという加成性がある。
以上により拡がり関数の一部分を構成しているガウシアンをディコンボリュ−ション演算することにより、よりシャ−プなオリジナルな波形に近づいたピ−クを計算することができることになる。
【００２１】
【作用】
上記各技術的手段の働きは次のとおりである。
本発明の構成によれば、検出クロマトグラムから既知のｈ（ｔ）またはガウシアンを合理的に選択し、ディコンボリュ−ション演算することにより、検出クロマトグラムの重なりピ−クよりシャ−プなピ−クを持つクロマトグラムに分離・独立させ、分離・独立した各ピ−クを積分した時、正確にピ−ク面積が求められ、正確な定量をすることができる。
上記ディコンボリュ−ション演算は、例えば非線形関数の最小自乗法と異なり、短い計算時間により物理的に意味のある解を必ず得ることができる。
【００２２】
また、上記ディコンボリュ−ション演算は、重なりピ−クが分離・独立されたときに、そのクロマトグラムを観察し、その演算の妥当性を判断しているが、熟練が必要となる。そこで、ディコンボリュ−ション演算に用いた拡がり関数ｈ（ｔ）を用い、独立した各ピークにリコンボリュ−ション演算を施し、最初の重なりピ−クを構成している各ピークを再現することができる。このリコンボリュ−ション演算後の各ピークと最初の重なりピ−クとを重ね描きすることにより上記ディコンボリュ−ション演算の妥当性を正確に判断することができる。
【００２３】
また、本発明の構成によれば、例えばフォトダイオ−ドアレイ検出器等の高価な検出器を省略し、簡単な構成によりクロマトグラム解析方法を実施することができる。
【００２４】
【実施例】
〔実施例１〕
以下、本発明に基づく一実施例を図１ないし図１１を参照して説明する。
図１は、本発明における一実施例に係るクロマトグラム解析方法（以下、解析方法という）に用いるマイクロボアＨＰＬＣシステムの構成を示すブロック図、図２は、図１の解析方法におけるクロマトグラムを示す線図、図３は、図１の解析方法におけるクロマトグラムの拡がりメカニズムの略示説明図、図４は、図１の解析方法におけるディコンボリュ−ション演算説明図、図５は、図１の解析方法に係る処理工程のフロ−チヤ−ト、図６は、図１の解析方法におけるクロマトグラムの重ね描きプロット図である。
【００２５】
また、図７は、図１の解析方法によるアミノ酸分析のクロマトグラムを示す線図、図８は、図１の解析方法によるグリコヘモグロビン分析のクロマトグラムを示す線図、図９は、図１の解析方法において拡がり関数が未知の場合の処理フロ−チャ−ト、図１０は、図１の解析方法におけるカテコ−ルアミン分析のクロマトグラムを示す線図、図１１は、図１の解析方法におけるリコンボリュ−ション演算による重ね描き説明図である。
【００２６】
本発明に係るクロマトグラム解析方法を実施するため、マイクロボアＨＰＬＣシステムを使用する。図１は、マイクロボアＨＰＬＣシステムの全体構成を示している。
図１において、４０はポンプ、４１はカラム、４２は検出器、４３はサンプラ、４４は制御部、４５はデ−タ解析部、４６はＣＲＴ表示部、４７はプリンタ、４９は溶離液、５１は未知試料、５２は標準試料、５４は入力部である。
【００２７】
本システムを構成する各部は、デ−タ解析部４５（〔実施例２〕において後述）を除き、通常のクロマトグラム解析方法を用いられるものである。したがって、詳細な説明は煩瑣となるので省略し、簡単に説明する。
【００２８】
前記マイクロボアＨＰＬＣシステムでは、カラム外の拡がりが分離に大きく影響し、無視できない。制御部４４の命令によりポンプ４０は溶離液４９を送液する。可動ニ−ドル弁を有するサンプラ４３は、未知試料５１あるいは標準試料５２をカラム４１への流路に注入する。
試料は、溶離液４９とともにカラム４１に送りこまれ、含有成分が分離展開され、検出器４２で検出される。
【００２９】
前記検出されたクロマトグラムは、デ−タ解析部４５に記憶される。
図２は、検出されたクロマトグラムである。前記標準試料５２には非保持成分を添加しているため、非保持ピ−ク６１としてそれが検出される。次に溶出されるピ−ク６２は標準試料の一成分であり、ピ−ク６１と異なりカラム内に保持され、ピ−ク幅も若干広くなっている。
【００３０】
図３を参照し、ピ−ク波形が形成されるメカニズムについて説明する。
図３は、図１の一実施例に係る解析方法におけるクロマトグラムの拡がりのメカニズムの説明図である。
図３において、図中、図１の符号と同一符号は同等部分であるので詳細な説明は省略する。
上段（ａ）図は、試料流路を示すブロック図であり、下段（ｂ）図は、上段（ａ）図の試料流路における試料の濃度を示している。
【００３１】
単一成分を含む試料は、サンプラ４３により流路内に注入される。この時の流路内での試料濃度Ｃの空間分布図は、流れの方向をｘとすれば、長方形状の分布線図７１である。
この長方形状の分布線図７１がカラム４１を通過すると拡大する。前記カラム４１を通過した段階は、分布線図７２のようなガウシアンの形状である。
【００３２】
さらに、検出器４２において、前記ガウシアンの濃度分布を検出する時には流路配管や検出器のフローセル等により濃度分布が拡げられ、分布線図７３のように分布線図７２よりも広い分布形状になっている。
【００３３】
これを数式で記述すると、（２）式のようなモデルで表現できる。
【数２】

上式において、時刻ｔにおける検出波形をｙ（ｔ），サンプル注入時のオリジナルな長方形波形をｒ（ｔ），拡がり関数をｈ（ｔ）とする。上式においては、検出波形ｙ（ｔ）は、オリジナルな長方形波形ｒ（ｔ）と、拡がり関数ｈ（ｔ）とのコンボリュ−ションであることを示している。
【００３４】
ピ−クの形状の拡がりについては、上記説明でよいが、リテンションタイムについても考慮すると、もう一つＤｉｒａｃのデルタ関数がコンボリュ−ション演算されていると考えられる。これを（３）式に示す。
【数３】

【００３５】
上式において、ＥＭＧ（ｔ）は、ＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｌｙＭｏｄｉｆｉｅｄＧａｕｓｓｉｎであり、σ、τ、ｔ_Ｒは、ＥＭＧ（ｔ）のパラメータ、δ（ｔ）はデルタ関数、ｍ（ｔ）は修正関数である。
拡がりのメカニズムについては、“ＤＹＮＡＭＩＣＳＯＦＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＹ”，Ｊ．Ｃ．Ｇｉｄｄｉｎｇｓ著，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ刊，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９６５に詳しく説明されているのでそれに譲る。
【００３６】
拡がり関数ｈ（ｔ）は、カラム内での拡がりとカラム外での拡がりの両方からの影響により形成される。つまりカラム内での拡がり関数とカラム外での拡がり関数のコンボリュ−ションである。
【００３７】
図２における非保持ピ−ク６１に着目し、図３を参照し説明すると、注入時は長方形波形７１だったものが、カラム４１を通過し、ガウシアン波形７２に拡げられ、カラム外の拡がりの影響を受け、波形７３となり、ピ−ク６１として検出されていることになる。
【００３８】
一方、保持ピ−ク６２も同様なメカニズムで拡げられ、ピ−クが形成されているのであるが、前記カラム４１内に保持されているために、若干広めのピ−ク幅に拡げられている。
すなわち、ピ−ク６２に影響する拡がり関数は、ピ−ク６１と共通の拡がり関数とそれ以外の余剰の拡がり関数とのコンボリュ−ションになっている。
【００３９】
この場合、ピ−ク６２の拡がり関数からピ−ク６１の拡がり関数の影響を取り除き、余剰の拡がり関数だけを得ることができる。この処理をディコンボリュ−ション処理と呼ぶ。
【００４０】
前記ディコンボリュ−ション演算は、図２に示すピ−ク６４とピ−ク６５とのような重なりピ−クに対して効果がある。
図４を参照して説明する。図４は、図２に示す重なりピ−クに対しディコンボリュ−ション演算を説明している。
【００４１】
前記ピ−ク６４波形と前記ピ−ク６５波形とに対して前記ピ−ク６１波形の拡がり関数をディコンボリュ−ション演算すると、図４に示すような分離された余剰分のピ−クが得られ、より正確にそれぞれのピ−クの面積が計算できる。
実際は、ピ−ク波形６１を面積１に規格化した規格化関数をディコンボリュ−ション演算に利用する。規格化はピ−ク面積を保存するために行われる。
【００４２】
厳密に言えば、この規格化関数は、（式）２の注入時の長方形関数ｒ（ｔ）とピ−ク波形６１に影響する拡がり関数ｈ（ｔ）の規格化されたコンボリュ−ションである。
実際には、ピ−ク波形６１以外のピ−クにも長方形関数の影響があるため、ピ−ク６１波形の規格化関数でディコンボリュ−ション演算しても問題にはならないわけである。
【００４３】
以上の図４のディコンボリュ−ション手順を図１のマイクロボアＨＰＬＣシステムのブロック図と、図５に示す検出波形処理のフロ−チャ−トとを参照して説明する。
まず、非保持成分を添加した標準試料５２が注入され、工程３１にて波形処理が開始される。
【００４４】
次に、工程３２で非保持ピ−ク６１を同定する。これはクロマトグラムの最初の時刻に現われるある大きさ以上のピ−クとして自動的に同定するか、またはオペレ−タが入力部５４から時刻指定を行うか、ＣＲＴ４６に表示しているクロマトグラムからマウスを使用し、ピ−ク６１をピックアップすることで指定することができる。
【００４５】
工程３３において、非保持ピ−ク６１の面積を１に規格化する。この時、ＣＲＴ４６に規格化関数を表示することもできる。
工程３４において、オペレ−タが正確に定量したい重なりピ−クのある時間の始点と終点を設定する。前記ＣＲＴ４６には、図４の左図のように、この部分だけを拡大したクロマトグラムを表示することもできる。ここでオペレ−タはクロマトグラムの全ての時間を設定することも可能である。
【００４６】
工程３５において規格化関数を用いて、設定された時間区間内でディコンボリュ−ション処理を行う。
工程３６において処理前後のクロマトグラムをＣＲＴ４６に図４の右側と左側とのように表示する。また、図６に示す如く、プリンタ４７に重ね描きしたクロマトグラムをプロットすることもできる。
【００４７】
工程３７において、シャ−プになった図４の右側のピ−クを対象に積分を実行し、定量計算を行う。
この処理後のクロマトグラムでもまだピ−クが重なっている場合には、従来通りの垂直分割等で面積計算する。
ここでガウシアン、ＥＭＧ等の非線形関数で最小自乗法により面積分割することもできる。ここでＣＲＴ４６かプリンタ４７に定量値を出力する。
工程３８において処理を終了する。
【００４８】
ディコンボリュ−ション処理をする拡がり関数を標準試料５２中の非保持成分のピ−ク波形の規格化関数で代用したが、この方法の他にも拡がり関数を得ることができる。
標準試料に添加する代わりに、予め拡がり関数を求めるために非保持成分だけ注入し、ピ−ク波形を得ることができる。
【００４９】
また、逆相クロマトグラフィ−ならメタノ−ル，アセトニトリル，ＴＨＦ，クロロホルム等有機溶媒１００％の溶離液を流し、保持の弱い成分を注入し、非保持ピ−クを得ることができる。
イオン交換クロマトグラフィ−では、例えばアミノ酸分析計の場合、ｐＨの高い再生液を流し、保持の弱いホスホセリン等を注入し、そのピ−ク波形を得ることができる。
【００５０】
また、カラム充填剤を操作し、非保持ピ−クを得ることもできる。イオン交換クロマトグラフィ−なら、イオン交換基の修飾しない坦体だけの充填剤を作成し、非保持ピ−クを得ることもできる。
【００５１】
ポストカラム反応ＬＣの実施例としてアミノ酸分析計をあげる。このシステムもカラム外の拡がりを無視できない。カラム外の拡がりは、カラムをジョイントに交換し、非保持ピ−クの波形を拡がり関数として見積ることができる。
【００５２】
図７に示す如く検出されたクロマトグラムにおいては、スレオニン（Ｔｈｒ）とセリン（Ｓｅｒ）の重なり部分が１４％であるのに対し、ディコンボリュ−ション処理されたクロマトグラムでは４％と１／３以下に向上した。
この処理クロマトグラムは、ポストカラム反応ＬＣにおいて、カラムの直後で検出できたとした場合のクロマトグラムに相当している。
【００５３】
拡がり関数の共通部分の除去例として、３．３分間処理のグリコヘモグロビン分析計をあげる。
拡がり関数を図８の左側に示すＨｂＦのピ−ク波形から見積ることができる。これはＨｂＡ１ｃのピ−ク幅が、リテンションタイムの順序を考慮し、ＨｂＦの幅よりも若干広いと考えられるためである。
【００５４】
図８の左側の検出クロマトグラムより孤立したピ−クであるＨｂＦの波形を規格化し、拡がり関数を得る。その規格化関数を用いて、不安定型と安定型とのＨｂＡ１ｃの重なりピ−クをディコンボリュ−ション処理すれば、図８の右側に示すような分離の向上したクロマトグラムが求められるわけである。
【００５５】
ディコンボリュ−ション処理は、この場合処理クロマトグラムを直接表示する必要はないが、定量精度を向上するためには、一般的なＨＰＬＣであるグリコヘモグロビン分析計においても非常に有効な手法である。
【００５６】
次にディコンボリュ−ション演算を正しく行うために演算前に利用すべき処理について説明する。図２に示されているノイズ６７やドリフト６８がディコンボリュ−ション演算を妨害する。
これらをそのままディコンボリュ−ション処理すると、擬似的なピ−クとして増幅されたり、ディコンボリュ−ション処理されるべきピ−クが正しく処理されないといった弊害が起こる。
【００５７】
まず、ノイズ除去処理としては一般的に検出クロマトグラムのデ−タ点をいくつか足し算して低減する方法が採られる。
この他に平滑化の方法や公知の高周波成分を除去する方法も利用できる。
【００５８】
ドリフト除去処理としては一般的にピ−ク間の谷から谷を直線で結だり、強制的に水平に直線を描き、検出クロマトグラムからベ−スラインを引き算する方法が採られる。
この他に公知の低周波成分を除去する方法，微積分を利用し低次の多項式成分を除去する方法、微分の特徴点からベ−スラインを探索する方法，ニュ−ラルネットワ−クを利用する方法等がある。
【００５９】
ここまでは拡がり関数を測定デ−タより求めてきたが、拡がり関数が未知である場合でも、ガウシアンをディコンボリュ−ト演算することができる。
前述したように検出クロマトグラムのピ−ク波形は、（２）式で示されるように、拡がり関数ｈ（ｔ）と長方形波形のｒ（ｔ）とのコンボリュ−ションで表わせる。
【００６０】
この拡がり関数ｈ（ｔ）は、前述の“ＤＹＮＡＭＩＣＳＯＦＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＹ”Ｊ．Ｃ．Ｇｉｄｄｉｎｇｓ著により、カラム内の拡がりがどのような物理学的，化学的相互作用に起因していても、カラム外の拡がりが無視できないくらい大きくとも、ガウシアン様の形状をしている。
【００６１】
ｈ（ｔ）がリ−ディンク的かまたはテ−リング的にガウシアンから多少歪んでいたとしても、下記の（４）式のようにガウシアンＧ（ｔ）と修正関数ｍ（ｔ）とのコンボリュ−ションとして記述できる。
【数４】

【００６２】
上式において、ガウシアンをＧ（ｔ）、修正関数をｍ（ｔ）、σは標準偏差である。
例として、ｈ（ｔ）がＥＭＧ（ｔ）により表わせるテ−リングピ−クであるなら、前述の（３）式のように解析数学的に修正関数が求められる。
【００６３】
また、重なりピ−クは、（５）式のように表わせる。
【数５】

ここで、σ_１、σ_２はそれぞれ標準偏差である。
【００６４】
ガウシアンは、上記の如く、加成性があるため、２つのガウシアンのコンボリュ−ションに分解できるため、下記（６）式のような関係を持っている。
【数６】

【００６５】
つまり、（５）式で表わされている２つのピ−ク波形はガウシアンを用いて、ディコンボリュ−ション演算ができる。
この時そのガウシアンは、２つのピ−クの持つ標準偏差σ_１とσ_２よりも小さな標準偏差σ０を持つ幅の狭い波形でなければならない。
【００６６】
こうして、検出された重なりピークよりも幅の狭いピークを得ることができる。
最終的には、ｙ（ｔ）をガウシアンＧ（ｔ，σ_０）によりディコンボリューション演算すると、クロマトグラムは、幅のより狭いガウシアンともとのままの修正関数とのコンボリューションにより表わすことができるわけである。
【００６７】
【数７】

上式の〔〕内のように、σ_１，σ_２よりピーク幅の狭いピークが得られる。より詳しくいえば、注入時の長方形波形はこの修正関数によりコンボリュ−ション演算されている。
【００６８】
この拡がり関数ｈ（ｔ）が未知の場合の処理を図９を参照して説明する。
工程７１で処理を開始する。
工程７２で検出クロマトグラムからノイズ・ドリフトを除去し、ディコンボリュ−ション処理の準備をする。
工程７３でディコンボリュ−ション処理を手動で行なうか、自動で行なうのかを入力する。
【００６９】
自動の場合、工程８１で、検出クロマトグラムのピ−ク幅を全体的に見て、最小の幅よりもやや小さな標準偏差を持つガウシアンを拡がり関数として設定する。これは面積１に規格化されている。
ここで、リテンションタイムの短いピ−クと長いピ−クでピ−ク幅が２倍以上異なる場合は、時間を分割してディコンボリュ−ション演算することもできる。
【００７０】
ここで自動的にピ−ク幅を見つけ出すためにフ−リエ変換を利用することもできる。工程７６でディコンボリュ−ション処理を実行する。工程７７で処理クロマトグラムが発散していないか、負の下限値を下回っていないか判定する。また不分離ピ−クがピ−ク間の谷を形成しているか等を判定する。
【００７１】
ここで判定が合格となれば、工程７９へ進む。判定が不合格の場合、もう一度工程８１へ戻り、判定を参照し標準偏差を加減し、ディコンボリュ−ション処理を行なう。
判定合格の場合、工程７９で処理クロマトグラムの表示，定量結果の表示等を行なう。工程８０で終了する。
【００７２】
手動の場合、工程７４で入力操作を行う。一般的にはディコンボリュ−ション処理するガウシアンの標準偏差を入力する。他に処理区間の始・終点の入力もできる。また特定の重なりピ−クの分離を向上するために、ガウシアンの最適な標準偏差を探索することもできる。
【００７３】
この場合、標準偏差の初期値，推定されるピ−クの個数，大きさ，幅，保持時間等を参考値として入力することもできる。また制限値として、ピ−ク個数は３個までとか、重なりピ−クの幅が０．２分以上０．４分以下のように入力することもできる。
【００７４】
工程７５で工程７４にて入力された情報を演算し、ディコンボリュ−ション処理の設定値を求め、判定の基準値を算出する。工程７６でディコンボリュ−ション処理を実行する。工程７７で判定を行う。
不合格の場合、その理由を工程７８で表示し、工程７４で再入力を促す。合格の場合、工程７９で処理クロマトグラムと定量結果を表示する。
工程８０で終了する。
【００７５】
カテコ−ルアミン分析計により得られた生の１０分間のクロマトグラムを図１０の上段（ａ）に示す。
これは、血漿や尿のような生体試料の分析例である。生体試料を分析すると数多くのピ−クがしばしば現われる。これを適切なガウシアンでディコンボリュ−ション処理すると、中段（ｂ）のようなクロマトグラムが得られる。
各ピ−クがベ−スラインまで完全に分離している。
【００７６】
しかし、これをそのまま表示しても、処理クロマトグラムの意味するところは理解困難である。
むしろ、これを下段の（ｃ）に示した公知の表示法にしても差し支えない。
また、定量値のみを出力するだけで、ディコンボリュ−ション処理をオペレ−タ−に意識させないのがよいと考えられる。
【００７７】
以上、本発明の一実施例について説明したが、本発明は、上記実施例に限定されるものでなく、種々の変形例が考えられる。
本発明に係るクロマトグラム解析方法の他の一方法を説明する。
図１１は、本発明に係る解析方法におけるディコンボリュ−ション、リィコンボリュ−ションによる重ね描きの説明したものである。
【００７８】
図１１（１）は、検出されたオリジナルの波形である。このオリジナルの波形にディコンボリュ−ション処理し、各波形ピークを分離・独立させる。この状態を図１１（２）に示す。
分離・独立させた波形ピークをそれぞれディコンボリュ−ションしたときと同じ拡がり関数ｈ（ｔ）によりリコンボリュ−ションする。
リコンボリュ−ション演算された波形を検出されたオリジナルの波形に重ね描きをする。図１１（３）は、この状態を示したものである。
【００７９】
〔実施例２〕
本発明に係るクロマトグラフ解析装置の他の一実施例を説明する。図１２は本発明に係る他の一実施例であるクロマトグラフ解析装置の構成を示すブロック図である。
本発明に係るクロマトグラフ解析装置の全体構成については、〔実施例１〕において、図１のマイクロボアＨＰＬＣシステムについて説明したので、煩瑣となるので再度の説明を省略し、データ解析部４５のみを説明する。
【００８０】
前記データ解析部４５は、ノイズ・ドリフト除去機構と、拡がり関数解析機構と、ディコンボリューション演算機構と、定量計算機構と、判定機構とから構成されている。図中、図示されてないが、Ａ／Ｄ変換器、記憶装置、インタフェース部等も備えていることはいうまでもない。
前記構成の内、ノイズ・ドリフト除去機構、定量計算機構、判定機構は、公知の技術であるが順序としてあわせて説明をする。なお、前記各機構部は、バスによって接続されている。
【００８１】
前記ノイズ・ドリフト除去機構は、平滑化機構と、ベースライン算出機構と、高速フーリエ変換機構と、ニューラル・ネットワーク機構と、微分・積分機構と、ファジイ推論機構とを備えており、前記平滑化機構は、検出器４３からのクロマトグラムの測定データ群を移動平均法、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法、Ｋａｗａｔａ−Ｍｉｎａｍｉ法、周波数領域法のいずれかにより滑らかな曲線にフイットし、前記ベースライン算出機構は、適切なアルゴリズムによりベースラインを決定する。
【００８２】
前記高速フーリエ変換機構は、高周波成分であるノイズおよび低周波成分であるベースライン変動をそれぞれ周波数分布に基づき除去する。
また、前記ニューラル・ネットワーク機構は、ドリフト形状を予め学習しておき、測定データから所定の結合定数に従い、ドリフトを除去する。
【００８３】
前記微分・積分機構は、微分・積分により低次の多項式で表現されるベースライン成分を除去する。この整理された測定データ点群をファジイ推論機構が所定の結合定数に従い平滑化する。このようにして検出器４３からのクロマトグラムのノイズおよびドリフトは除去される。
【００８４】
前記拡がり関数解析機構は、Ｇａｕｓｓｉａｎ発生機構と、面積１規格化機構と、検出ピーク波形設定機構とを備え、解析数学的拡がり関数の場合は、前記Ｇａｕｓｓｉａｎ発生機構によりＧａｕｓｓｉａｎを発生する。実測的拡がり関数の場合は、前記面積１規格化機構により実測されたピーク波形を規格化し、前記検出ピーク波形設定機構により前記規格化された実測波形を拡がり関数としている。このようにして実測的ないし解析数学的拡がり関数を発生する。
【００８５】
前記ディコンボリューション演算機構は、時間区間設定機構と、拡がり関数設定機構と、ディコンボリューション処理機構とを備え、前記時間区間設定機構は、ディコンボリューション処理する区間を設定し、前記拡がり関数設定機構は、上記の発生させた実測的ないし解析数学的拡がり関数から拡がり関数を設定する。
前記ディコンボリューション処理機構は、設定されたディコンボリューション処理する区間の重なり波形を前記拡がり関数によりディコンボリューション処理し、重なり波形を分離・独立させる。
【００８６】
前記定量計算機構は、積分機構を備え、前記積分機構は、前記分離・独立させたピーク波形の面積をそれぞれ算出する。このようにしてピーク面積ないし高さに基づき定量を計算する。前記定量結果は、ＣＲＴ４６、プリンタ部４７に出力される。
【００８７】
各種の判定を行う判定機構は、ディコンボリューション処理の成功を判定するために利用する判別式の値を計算する判別式計算機構、ディコンボリューション処理するために利用するＧａｕｓｓｉｎを探索するときに制限となる値を算出する制限値算出機構と、所定の結合係数に従いその最適なＧａｕｓｓｉｎを探索する拡がり関数探索機構を具備し、上記各処理段階において、各機構が所定の働きが可能となるようサポートしている。
【００８８】
図１２における制御部４４、データ解析部４５、ＣＲＴ部４６、プリンタ部４７等の機能を一体化して、Ａ／Ｄ変換部と、メモリ部と、制御部と、インタフェース部と、出力機器とからなり、クマトグラムの検出ピ−ク波形から拡がりを表わす関数ｈ（ｔ）を算出・出力し、検出ピ−ク波形および前記関数ｈ（ｔ）を用いて前記検出ピ−ク波形をディコンボリューション処理し、ディコンボリューション処理後のクロマトグラムを出力することを特徴とするクロマトグラム解析方法とクロマトグラフ装置とに用いられるデ−タ処理装置を構成しても差し支ええない。
【００８９】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明の構成によれば、クロマトグラムの波形の歪を補正し、重なりのピ−ク波形をシャ−プにすることにより分離を向上させ、ピ−ク面積をより正確に求められ、定量分析の精度が改良されたクロマトグラム解析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における一実施例に係る解析方法に用いるマイクロボアＨＰＬＣシステムの構成を示すブロック図である。
【図２】図１の解析方法におけるクロマトグラムを示す線図である。
【図３】図１の解析方法におけるクロマトグラムの拡がりメカニズムの略示説明図である。
【図４】図１の解析方法におけるクロマトグラムの重なりピークに対するディコンボリュ−ション演算説明図である。
【図５】図１の解析方法に係る処理工程のフロ−チヤ−トである。
【図６】図１の解析方法におけるクロマトグラムの重ね描きプロット図である。
【図７】図１の解析方法によるアミノ酸分析のクロマトグラムを示す線図である。
【図８】図１の解析方法によるグリコヘモグロビン分析のクロマトグラムを示す線図である。
【図９】図１の解析方法において拡がり関数が未知の場合の処理フロ−チャ−トである。
【図１０】図１の解析方法におけるカテコ−ルアミン分析のクロマトグラムを示す線図である。
【図１１】図１の解析方法におけるリィコンボリューション演算による重ね描き説明図である。
【図１２】本発明に係る他の一実施例に係るクロマトグラフ解析装置の構成を示すブロック図である。
【符号の説明】
４０…ポンプ
４１…カラム
４２…検出器
４３…サンプラ
４４…制御部
４５…デ−タ解析部
４６…ＣＲＴ表示部
４７…プリンタ
４９…溶離液
５１…未知試料
５２…標準試料
５４…入力部

Claims

分離カラムを通過した分析対象試料を検出器によって検出し、検出によって得られたクロマトグラム内のピークを、標準偏差σを係数として有するガウシアンを拡がり関数として用いて表し解析を行うクロマトグラム解析方法において、
前記ガウシアンの標準偏差σに任意の値を設定するステップと、
前記クロマトグラムに対してディコンボリューション処理を行うステップと、
当該ディコンボリューション処理後のクロマトグラムについて、
クロマトグラムが発散していないか、
負の下限値を下回っていないか、
不分離ピークがピーク間の谷を形成しているか、
のいずれかの基準を満たしているかどうかの判定を行うステップと、
当該判定で不合格の場合、前記ガウシアンの標準偏差値を調整し、再度ディコンボリューション処理を行うステップと、を有することを特徴とするクロマトグラム解析方法。
請求項１に記載のクロマトグラム解析方法において、
前記ディコンボリューション処理によって分離されたピークに対して、前記ディコンボリューション処理に用いた拡がり関数を用いてリコンボリューション処理を行い、リコンボリューション処理後の波形を前記ディコンボリューション処理前のピーク波形と重ねて表示することを特徴とするクロマトグラム解析方法。
請求項１に記載のクロマトグラム解析方法において、
ガウシアンの標準偏差σを設定する前に、前記クロマトグラムからノイズ及びドリフトを除去するステップを含むことを特徴とするクロマトグラム解析方法。
請求項１に記載のクロマトグラム解析方法において、
前記拡がり関数ｈ（ｔ）は、
ｈ（ｔ）＝Ｇ（ｔ）＊ｍ（ｔ）
（ここで、Ｇ（ｔ）は上記ガウシアン、ｍ（ｔ）は修正関数）
前記ガウシアンは、（１）式で表されることを特徴とするクロマトグラム解析方法。
請求項１に記載のクロマトグラム解析方法において、
前記標準偏差σは、検出されたクロマトグラムのピーク幅よりも小さな標準偏差を設定することを特徴とするクロマトグラム解析方法。
請求項１に記載のクロマトグラム解析方法において、
前記クロマトグラムが拡がり関数が未知のものであることを特徴とするクロマトグラム解析方法。