JP3602169B2

JP3602169B2 - Method for producing sorbitol-6-phosphate dehydrogenase

Info

Publication number: JP3602169B2
Application number: JP24354094A
Authority: JP
Inventors: 晋治古賀; 守高橋
Original assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Current assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1994-10-07
Publication date: 2004-12-15
Anticipated expiration: 2019-12-15
Also published as: JPH08103268A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属に属するソルビトール−６−リン酸脱水素酵素（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）生産菌を培養し、その培養物からソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を採取してなるソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来技術】
フルクトースは生化学上、または生理学的に重要な物質である。例えば、食品分野において、フルクトースは一般に多量のグルクコースと共存しており、果糖あるいは添加糖として大量に消費されている。また、健常人の血清には通常０．０６ｍＭのフルクトースが存在している。このフルクトースは人の健康状態を把握、例えば糖尿病のモニタリングの重要な因子の一つとされている。従って、フルクトースを正確に定量することが重要とされているが、通常グルコースがフルクトースの５０〜１００倍量存在しており、フルクトースを特異的に測定することは困難であった。
【０００３】
本発明者らはフルクトースを特異的に測定するためにフルクトキナーゼを発見し、ブランクの少ない、誤差を生じにくいフルクトース測定系を組み立てることが可能となった（特開平４−３２５０８９号公報）。しかし、本測定には共役の酵素としてホスホグルコースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４９）の２種が必要で、計３種もの酵素が必須であった。
【０００４】
一般に測定試薬の成分は多いほど、被検液中の共存物質の影響を受けやすいことは明白である。そこで、本ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素と組み合わせることにより２種の酵素でフルクトースを測定することを可能とする。
また、ソルビトールはポリオールのなかでも代表的なものであり、生体内ではグルコースからアルドース還元酵素により生成される。糖尿病において高血糖状態が続き細胞内におけるソルビトール産生が高進すると、ソルビトールは微量しか細胞外に拡散しないために細胞内に過剰蓄積し、蓄積されたソルビトールにより種々の障害をきたすことが明かとなってきた。従って、ソルビトールを正確に測定することは糖尿病患者の病体を把握するうえで重要である。
【０００５】
ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１４０，Ｄ−Ｓｏｒｂｉｔｏｌ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＮＡＤ^＋２−ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）の生産菌としてはエアロバクター・エアロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｏｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（Ｍ．Ｌｉｓｓ，Ｓ．Ｂ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｎ．Ｏ．Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２３７（４），１３４２−１３５０（１９６２））およびクロストリディウム・パスツリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）（Ｐ．Ｊ．Ｄｕｔｏｉｔ，Ｊ．Ｐ．Ｋｏｔｚｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０６，３３３−３４２（１９７０））などが知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
エアロバクター・エアロゲネス由来の酵素は精製中に抗酸化剤としてのメルカプトエタノールが使用されていることから不安定であることが示唆される。また、クロストリディウム・パスツリディウムに関しては嫌気的培養を行っており、実用に供されるものではない。通常の通気撹拌培養により増殖し、精製中に抗酸化剤を必要とすることなく十分な安定性を有するソルビトール−６−リン酸脱水素酵素生産菌株より、ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を効率よく生産できればより安定なフルクトース測定系を組み立てることが可能となる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは安定性に優れたソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を生産する微生物をスクリーニングしたところコマモナス・エスピーＳＹ−７７−１（Ｃｏｍａｍｏｎａｓｓｐ．ＳＹ−７７−１）が目的とする性質を有する当該酵素を生産していることを発見し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、コマモナス属に属するソルビトール−６−リン酸脱水素酵素生産菌を培養し、その培養物からソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を採取することを特徴とするソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の製造法に関する。
以下に本発明について詳細に説明する。
【０００９】
まず、本発明のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素生産菌について、コマモナス属に属するソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を生産する能力を有する微生物であれば何ら限定されるものではなく、ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素生産能を有する変種や変異株であってもよく、好ましくはコマモナス属に属するＳＹ−７７−１株（コマモナス・エスピーＳＹ−７７−１；通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４８１０として寄託されている；菌学的性状は米国特許第３９６０６６２号明細書参照のこと）が挙げられる。
【００１０】
本発明を実施するにあたり、その培養形態としては液体培養、個体培養いずれも可能であるが工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。また使用する培養源としては一般に微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩及びその他の微量栄養源の他、コマモナス属に属する微生物の利用できる栄養源であればすべて使用できる。
【００１１】
炭素源としてはグルコース、フルクトース、サッカロース、ソルビトール、キシロース、マルトース、グリセロール、デキストリン、でんぷん、アミノ酸等の他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独でまたは組み合わせて用いられる。窒素源としては無機窒素源、有機窒素源のいずれも使用可能であり、無機栄養源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、塩化アンモニウム等が挙げられる。また有機窒素源としては大豆、米、トウモロコシ、小麦等の粉、コーンスティープリカー、ブレインハートインフュージョン、ペプトン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス等が挙げられる。無機塩及び微量栄養素としてはリン酸、マグネシュウム、カリウム、鉄、カルシウム、亜鉛等の塩類の他ビタミン、非イオン性界面活性剤、消泡剤等の菌の生育やソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の生産を促進するものであれば必要に応じて使用できる。
【００１２】
培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育し、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が産生する範囲であればよく、通常１５℃〜３７℃、好ましくは２５℃〜３５℃である。培養時間は条件により異なるがソルビトール−６−リン酸脱水素酵素が最も産生される時間まで培養すればよく、通常２４〜１００時間程度である。
ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素は主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の抽出法を例示すればまず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの種種の菌体処理手段を適宜選択組み合わせて、粗製のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素含有液を得る。
【００１３】
粗製のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素含有液から公知のタンパク質や酵素などの単離、精製手段を用いて精製ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を得る。例えば、粗製のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素含有液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫安、食塩などによる塩析法などを適用してソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を沈澱させ、回収する。さらに、この沈澱物を必要に応じ透析、等電点沈澱を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法を適当に組み合わせることによりソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、界面活性剤などを加えあるいは加える事なく、限外濾過濃縮、凍結乾燥の方法により、液状または固形のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５〜１０％程度添加してもよい。
【００１４】
次に本発明で得られるソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の理化学的性質及び酵素活性測定法を述べる。
ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の活性測定法
０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．２５ｍｌ、０．１Ｍのソルビトール−６−リン酸０．２ｍｌ、１０ｍＭのＮＡＤ０．１ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌのジアホラーゼ０．０５ｍｌ、０．２５％のＮＴＢ（ニトロテトラゾニウムブルー）０．１ｍｌ、１０％のトリトンＸ−１００を０．０１ｍｌ、および蒸留水０．２９ｍｌよりなる反応液１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．１Ｎの塩酸を２ｍｌ添加して反応を停止させ、５分以内に層長１．０ｃｍセルを用いて波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤを生成させる酵素量とし、計算式は下記のとうりである。
【００１５】
【数１】

【００１６】
理化学的性質
（１）酵素作用
基質としてソルビトール−６−リン酸を用いた酵素作用を以下に示す。
【００１７】
【化１】

【００１８】
（２）基質特異性
ソルビトール−６−リン酸に基質特異性を示す。
各種基質に対する特異性は表１の通りである。
【００１９】
【表１】

【００２０】
（３）Ｋｍ値
ソルビトール−６−リン酸に対して２．０±０．５（ｍＭ）、ＮＡＤに対して０．１３±０．０５ｍＭ、チオＮＡＤに対して０．１４±０．０５ｍＭであった。
（４）等電点
ｐＨ３．５〜１０．０のキャリアアンフォライトを用いた電気泳動法により本酵素の等電点は４．８±０．２であった。
（５）分子量
トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（０．７５×６０ｃｍ）を用いたゲル濾過法により測定した本酵素の分子量は７００００±５０００であった。
（６）至適ｐＨ
前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求め、その結果を図１に示した。ｐＨ６．０〜６．５の範囲は１００ｍＭの酢酸緩衝液（図中、〇）、ｐＨ６．５〜８．０の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ７．５〜９．０の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（図中、△）、ｐＨ９．０〜１０．０の範囲は１００ｍＭのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（図中、●）を使用した場合の活性値を示すもので、至適ｐＨは８〜８．５であった。
（７）ｐＨ安定性
１Ｕ／ｍｌのソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を各種緩衝液中、３７℃、６０分間、処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図２に示した。ｐＨ５．０〜６．５の範囲は１００ｍＭの酢酸緩衝液（図中、〇）、ｐＨ６．５〜８．０の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ７．５〜９．０の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（図中、△）、ｐＨ９．０〜１１．０の範囲はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（図中、●）を使用した。ｐＨ８〜１１の範囲で最も良好な安定性を示した。
（８）至適温度
前記酵素活性測定法に従って、温度を３７℃〜６０℃の範囲で変化させて至適温度を求め、その結果を図３に示した。至適温度は５０℃付近であった。
（９）熱安定製
１Ｕ／ｍｌのソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で調製し、１０分間の加熱処理の後に残存活性を前記酵素活性測定法にしたがって測定した。その結果は図４に示される通りであって、酵素活性は少なくとも３７℃までは安定であった。
（１０）金属イオンの影響
１ｍＭの各種金属イオンのソルビトール−６−リン酸脱水素酵素活性への影響について調べた結果は表２に示す通りで、銅イオン、鉛イオンによる強い阻害がみられた。
【００２１】
【表２】

【００２２】
【実施例】
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
【００２３】
【実施例１】
（コマモナス・エスピーＳＹ−７７−１株の培養）
ソルビトール２．０％、ブレインハートインフュージョン２．０％を含む液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを、５００ｍｌ溶三角フラスコ２０本に分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した後、これにコマモナス・エスピーＳＹ−７７−１の菌体１白金耳を接種し、２８℃で１２０ｒｐｍの振とう培養機で２０時間培養し、酵素活性２．７Ｕ／ｍｌの培養液１．９ｌを得た。
【００２４】
【実施例２】
（酵素の分離精製）
実施例１で得られた培養液１．９ｌを遠心分離して、得られた菌体を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２ｌで１回洗浄した。洗浄菌体を同様の緩衝液に懸濁して５０ｍｌに調製し、クボタ社製の超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ２０１Ｍ）を用いて１８０Ｗ、３０分間処理して破砕液を得た。
【００２５】
この破砕液を１２０００ｒｐｍ２０分間遠心分離し、４２ｍｌ（酵素活性１０５Ｕ／ｍｌ、４２００Ｕ）の上清を得た。この上清を透析チューブを用いて２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５ｌに対して５℃で１夜透析し、５１ｍｌの粗酵素液（酵素活性８５Ｕ／ｍｌ、４３４０Ｕ）を得た。得られた酵素液を２０ｍＭのトリス塩酸−緩衝液（ｐＨ８．０）で緩衝化したＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）１００ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０．２ＭのＫＣｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｌを流し、次いで、０．３ＭＫＣｌを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出し、酵素液２５０ｍｌ（酵素活性１３Ｕ／ｍｌ、３２５０Ｕ）を得た。
【００２６】
得られた酵素液に３ＭになるようにＮａＣｌを溶解し、３ＭのＮａＣｌを含んだ２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で緩衝化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）５０ｍｌ（１．５×２８ｃｍ）カラムに通した。溶出は３Ｍ〜０ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により行い、１Ｍ〜０ＭのＮａＣｌの溶出画分（酵素活性３５Ｕ／ｍｌ、２４５０Ｕ）を回収した。この酵素液に牛血清アルブミンを１００ｍｇ溶解し、凍結乾燥し、酵素粉末として６８ｍｇ（酵素活性３３Ｕ／ｍｇ）を得た。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、通常の通気撹拌培養により増殖し、精製中に抗酸化剤を必要とすることなく十分な安定性を有するソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を効率よく生産できるコマモナス属に属する微生物によるソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の新規な製造法を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の至適ｐＨ曲線を示す。
【図２】図２は本発明のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素のｐＨ安定曲線を示す。
【図３】図３は本発明のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の至適温度曲線を示す。
【図４】図４は本発明のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の熱安定曲線を示す。[0001]
[Industrial applications]
The present invention cultivates a sorbitol-6-phosphate dehydrogenase-producing bacterium belonging to the genus Comamonas and collects sorbitol-6-phosphate dehydrogenase from the culture to obtain a sorbitol-6-phosphate dehydrogenase. Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase.
[0002]
[Prior art]
Fructose is a biochemically or physiologically important substance. For example, in the food field, fructose generally coexists with a large amount of glucose and is consumed in large quantities as fructose or added sugar. In addition, normal human serum usually contains 0.06 mM fructose. This fructose is regarded as one of the important factors for understanding human health, for example, monitoring diabetes. Therefore, it is important to accurately determine fructose. However, glucose is usually present in an amount of 50 to 100 times that of fructose, and it has been difficult to specifically measure fructose.
[0003]
The present inventors have discovered fructokinase in order to specifically measure fructose, and have been able to assemble a fructose measurement system with few blanks and with little error (Japanese Patent Laid-Open No. 4-325089). However, this measurement requires two types of conjugated enzymes, phosphoglucose isomerase (EC 5.3.1.9) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49). A variety of enzymes were essential.
[0004]
In general, it is clear that the greater the number of components of the measurement reagent, the more likely it is to be affected by coexisting substances in the test solution. Thus, fructose can be measured with two kinds of enzymes by combining with the present sorbitol-6-phosphate dehydrogenase.
In addition, sorbitol is a typical polyol, and is produced from glucose in vivo by aldose reductase. When hyperglycemia persists and sorbitol production increases in cells in diabetes, it is clear that only a small amount of sorbitol diffuses out of the cell, so that sorbitol is excessively accumulated in the cell and causes various disorders due to the accumulated sorbitol. Have been. Therefore, accurate measurement of sorbitol is important for understanding the pathology of diabetic patients.
[0005]
As a bacterium producing sorbitol-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.140, D-Sorbitol-6-phosphate: NAD ⁺ 2-oxidoreductase), Aerobactererogenes (M.Liss, S. B. Horwitz, NO Kaplan, JBC, 237 (4), 1342-1350 (1962)) and Clostridium pasteurianum (PJ Dutoit, J.C. P. Kotze, Biochim. Biophys. Acta, 206, 333-342 (1970)) and the like.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The enzyme derived from Aerobacteria aerogenes is unstable because of the use of mercaptoethanol as an antioxidant during purification. In addition, Clostridium pasteuridium is anaerobically cultured and is not practically used. A sorbitol-6-phosphate dehydrogenase produced from a sorbitol-6-phosphate dehydrogenase-producing strain that grows by ordinary aeration and stirring culture and has sufficient stability without requiring an antioxidant during purification, If it can be produced efficiently, it will be possible to assemble a more stable fructose measurement system.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have screened a microorganism that produces sorbitol-6-phosphate dehydrogenase having excellent stability, and found that Comamonas sp. SY-77-1 (Camonas sp. SY-77-1) had the desired properties. The present inventors have found that the enzyme has the above-mentioned structure, and have completed the present invention.
[0008]
The present invention has been completed on the basis of the above findings, and cultivates a sorbitol-6-phosphate dehydrogenase producing bacterium belonging to the genus Comamonas, and collects sorbitol-6-phosphate dehydrogenase from the culture. And a method for producing sorbitol-6-phosphate dehydrogenase.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0009]
First, the sorbitol-6-phosphate dehydrogenase producing bacterium of the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of producing sorbitol-6-phosphate dehydrogenase belonging to the genus Comamonas. A variant or mutant having the ability to produce -6-phosphate dehydrogenase may be used, and preferably SY-77-1 strain belonging to the genus Comamonas (Comamonas sp. SY-77-1; Deposited with the National Institute of Biotechnology, Accession No. FERM BP-4810; mycological properties are described in US Pat. No. 3,960,662).
[0010]
In practicing the present invention, the culture form may be either liquid culture or solid culture, but industrially, it is advantageous to carry out aeration-agitation culture. As a culture source to be used, in addition to carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, and other trace nutrients generally used for culturing microorganisms, all nutrient sources that can be used by microorganisms belonging to the genus Comamonas can be used.
[0011]
As the carbon source, glucose, fructose, saccharose, sorbitol, xylose, maltose, glycerol, dextrin, starch, amino acids, etc., as well as fatty acids, fats, organic acids and the like are used alone or in combination. Either an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source can be used as the nitrogen source, and examples of the inorganic nutrient sources include ammonium sulfate, ammonium nitrate, urea, sodium nitrate, and ammonium chloride. Examples of organic nitrogen sources include soybean, rice, corn, wheat and other flours, corn steep liquor, brain heart infusion, peptone, meat extract, casein, amino acids, yeast extract and the like. Inorganic salts and micronutrients include phosphoric acid, magnesium, potassium, iron, calcium, zinc, and other salts, as well as growth of bacteria such as vitamins, nonionic surfactants, and antifoaming agents, and sorbitol-6-phosphate dehydrogenation. Any substance that promotes enzyme production can be used as needed.
[0012]
The cultivation is performed under aerobic conditions, and the culturing temperature may be within a range in which the bacteria grow and 3-hydroxybutyrate dehydrogenase is produced, and is usually 15 ° C to 37 ° C, preferably 25 ° C to 35 ° C. The cultivation time varies depending on the conditions, but the cultivation may be performed up to the time when sorbitol-6-phosphate dehydrogenase is most produced, and is usually about 24 to 100 hours.
Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase is mainly contained and accumulated in the cells, and may be extracted from the cells. As an example of the method for extracting sorbitol-6-phosphate dehydrogenase, first, a culture is solid-liquid separated, and the obtained wet cells are dispersed in a solution such as a phosphate buffer or a tris-hydrochloride buffer, and lysozyme is added. Various germ cell treatment means such as treatment, ultrasonic treatment, French press treatment, and dynomill treatment are appropriately selected and combined to obtain a crude sorbitol-6-phosphate dehydrogenase-containing solution.
[0013]
From the crude sorbitol-6-phosphate dehydrogenase-containing solution, purified sorbitol-6-phosphate dehydrogenase is obtained by using known protein and enzyme isolation and purification means. For example, sorbitol-6-phosphate dehydration is performed by applying a fractional precipitation method using an organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, or the like, a salting-out method using ammonium sulfate, salt, or the like to a crude sorbitol-6-phosphate dehydrogenase-containing solution. The enzyme is precipitated and recovered. Further, after dialysis and isoelectric focusing of the precipitate as necessary, column chromatography using an ion exchanger, a gel filtration agent, an adsorbent, etc. until a single band is shown by electrophoresis or the like. To purify. When the degree of purification of sorbitol-6-phosphate dehydrogenase is increased by appropriately combining these methods, they can be appropriately combined. The enzymes obtained by these methods can be used as stabilizers by adding or removing various salts, saccharides, proteins, lipids, surfactants, etc., by ultrafiltration, lyophilization, and liquid or solid sorbitol. -6-phosphate dehydrogenase can be obtained, and lyophilization may be appropriately performed. In this case, about 0.5 to 10% of saccharose, mannitol, salt, albumin or the like is added as a stabilizer. Is also good.
[0014]
Next, the physicochemical properties of the sorbitol-6-phosphate dehydrogenase obtained by the present invention and the method for measuring the enzyme activity will be described.
Method for measuring sorbitol-6-phosphate dehydrogenase activity 0.25 ml of 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), 0.2 ml of 0.1 M sorbitol-6-phosphate, 0.1 ml of 10 mM NAD 1 ml of a reaction solution consisting of 0.05 ml of 100 U / ml diaphorase, 0.1 ml of 0.25% NTB (nitrotetrazonium blue), 0.01 ml of 10% triton X-100, and 0.29 ml of distilled water. Is preliminarily heated at 37 ° C. for 1 minute, and 0.02 ml of the enzyme solution is added to react for 10 minutes. After the reaction, 2 ml of 0.1N hydrochloric acid is added to stop the reaction, and the absorbance at a wavelength of 550 nm is measured within 5 minutes using a 1.0 cm layer cell (As). As a blind test, the same operation is performed using 0.02 ml of distilled water instead of the enzyme solution, and the absorbance is measured (Ab). The absorbance difference between the absorbance of the enzyme (As) and the absorbance of the blind test (Ab) The enzyme activity is determined from (As-Ab). One unit of the enzyme activity is the amount of the enzyme that produces 1 μmol of reduced NAD per minute at 37 ° C., and the calculation formula is as follows.
[0015]
(Equation 1)

[0016]
Physicochemical properties (1) Enzyme action The enzyme action using sorbitol-6-phosphate as a substrate is shown below.
[0017]
Embedded image

[0018]
(2) Substrate specificity Sorbitol-6-phosphate shows substrate specificity.
Table 1 shows the specificity for various substrates.
[0019]
[Table 1]

[0020]
(3) Km value: 2.0 ± 0.5 (mM) for sorbitol-6-phosphate, 0.13 ± 0.05 mM for NAD, 0.14 ± 0.05 mM for thio NAD. there were.
(4) Isoelectric point The isoelectric point of this enzyme was 4.8 ± 0.2 by electrophoresis using carrier ampholite having a pH of 3.5 to 10.0.
(5) Molecular weight The molecular weight of the enzyme measured by gel filtration using TSK-G3000SW (0.75 × 60 cm) manufactured by Tosoh Corporation was 70,000 ± 5000.
(6) Optimum pH
The optimum pH was determined according to the enzyme activity measurement method, and the results are shown in FIG. The range of pH 6.0 to 6.5 is 100 mM acetate buffer (〇 in the figure), the range of pH 6.5 to 8.0 is 100 mM phosphate buffer (□ in the figure), pH 7.5 to 9 The activity in the case of using 100 mM Tris-HCl buffer (液 in the figure) and the range of pH 9.0 to 10.0 in the case of using 100 mM glycine-sodium hydroxide buffer (● in the figure). The optimum pH was 8 to 8.5.
(7) pH stability 1 U / ml sorbitol-6-phosphate dehydrogenase was treated in various buffers at 37 ° C. for 60 minutes, and the residual activity was measured according to the above enzyme activity measurement method. The result is shown in FIG. The range of pH 5.0 to 6.5 is 100 mM acetate buffer (〇 in the figure), the range of pH 6.5 to 8.0 is 100 mM phosphate buffer (□ in the figure), pH 7.5 to 9 The range of 0.0 used a 100 mM Tris-HCl buffer (液 in the figure), and the range of pH 9.0 to 11.0 used a glycine-sodium hydroxide buffer (● in the figure). It exhibited the best stability in the pH range of 8-11.
(8) Optimum temperature According to the enzyme activity measurement method, the temperature was changed in the range of 37 ° C to 60 ° C to determine the optimum temperature, and the results are shown in FIG. The optimum temperature was around 50 ° C.
(9) Heat-stable 1 U / ml sorbitol-6-phosphate dehydrogenase was prepared in 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), and after 10 minutes of heat treatment, the remaining activity was determined by the enzyme activity measurement method. Was measured according to The results are as shown in FIG. 4, and the enzyme activity was stable at least up to 37 ° C.
(10) Influence of metal ions The results of examining the effects of 1 mM of various metal ions on sorbitol-6-phosphate dehydrogenase activity are shown in Table 2, and strong inhibition by copper ions and lead ions was observed. .
[0021]
[Table 2]

[0022]
【Example】
Next, examples of the present invention will be described in detail, but the present invention is not limited thereto.
[0023]
Embodiment 1
(Culture of Comamonas sp. SY-77-1 strain)
100 ml of a liquid medium (pH 7.0) containing 2.0% sorbitol and 2.0% brain heart infusion was dispensed into 20 500 ml Erlenmeyer flasks, and sterilized by heating at 120 ° C. for 20 minutes. -One platinum loop of cells of SP SY-77-1 was inoculated and cultured at 28 ° C for 20 hours in a shaking incubator at 120 rpm to obtain 1.9 l of a culture solution having an enzyme activity of 2.7 U / ml.
[0024]
Embodiment 2
(Separation and purification of enzymes)
1.9 L of the culture solution obtained in Example 1 was centrifuged, and the obtained cells were washed once with 2 L of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5). The washed cells were suspended in the same buffer to prepare 50 ml, and treated with an ultrasonic crusher (INSONATOR 201M) manufactured by Kubota Corporation at 180 W for 30 minutes to obtain a crushed liquid.
[0025]
This crushed liquid was centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes to obtain 42 ml (enzyme activity: 105 U / ml, 4200 U) of a supernatant. This supernatant was dialyzed against 5 l of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) at 5 ° C. overnight using a dialysis tube to obtain 51 ml of a crude enzyme solution (enzyme activity: 85 U / ml, 4340 U). . The resulting enzyme solution was passed through a 100 ml (2.6 × 19 cm) column of DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) buffered with 20 mM Tris-HCl-buffer (pH 8.0) and passed through a 0.2 M KCl solution. And a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 M was passed, and then eluted with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.3 M KCl. , 3250 U).
[0026]
NaCl was dissolved to 3 M in the obtained enzyme solution, and 50 ml of Phenyl-Sepharose (manufactured by Pharmacia) buffered with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 3 M NaCl (1. 5 × 28 cm) column. Elution was performed with a linear gradient of NaCl from 3M to 0M, and an eluted fraction of 1M to 0M NaCl (enzyme activity: 35U / ml, 2450U) was collected. 100 mg of bovine serum albumin was dissolved in this enzyme solution and freeze-dried to obtain 68 mg (33 U / mg of enzyme activity) as enzyme powder.
[0027]
【The invention's effect】
According to the present invention, a microorganism belonging to the genus Comamonas capable of efficiently producing sorbitol-6-phosphate dehydrogenase having sufficient stability without requiring an antioxidant during purification, which grows by ordinary aeration and stirring culture. A novel method for producing sorbitol-6-phosphate dehydrogenase by the method described above.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an optimal pH curve of the sorbitol-6-phosphate dehydrogenase of the present invention.
FIG. 2 shows a pH stability curve of the sorbitol-6-phosphate dehydrogenase of the present invention.
FIG. 3 shows an optimal temperature curve of the sorbitol-6-phosphate dehydrogenase of the present invention.
FIG. 4 shows a thermostability curve of the sorbitol-6-phosphate dehydrogenase of the present invention.

Claims

Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase comprising culturing a sorbitol-6-phosphate dehydrogenase-producing bacterium belonging to the genus Comamonas in a medium, and collecting sorbitol-6-phosphate dehydrogenase from the culture. Method for producing enzymes. However, the physicochemical properties of the sorbitol-6-phosphate dehydrogenase are as follows.
(1) Enzyme action It acts on sorbitol-6-phosphate in the presence of NAD to produce fructose-6-phosphate, NADH and H ⁺ .
(2) Substrate specificity Sorbitol-6-phosphate shows substrate specificity.
(3) Molecular weight 70000 ± 5000 (measured by gel filtration method)
(4) Optimum pH
8-8.5
(5) Optimum temperature around 50 ° C (6) pH stability Shows the best stability in the range of pH 8-11

The method for producing sorbitol-6-phosphate dehydrogenase according to claim 1, wherein the sorbitol-6-phosphate dehydrogenase producing bacterium belonging to the genus Comamonas is Comamonas sp. SY-77-1 (FERM BP-4810) strain. .