JP3605633B2

JP3605633B2 - 新規植物遺伝子、該遺伝子を利用した植物改変方法および該方法により得られる植物体

Info

Publication number: JP3605633B2
Application number: JP2000320111A
Authority: JP
Inventors: 正偉梁; 秧黒田; 育夫芦川; 治矢頭; 秀之青木; 慶▲ギョク▼ 王
Original assignee: 独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構
Priority date: 2000-10-19
Filing date: 2000-10-19
Publication date: 2004-12-22
Anticipated expiration: 2020-10-19
Also published as: JP2002125675A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は植物の新規遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、植物の形態を制御する遺伝子に関する。本発明はまた、この遺伝子を用いた植物改変方法、およびこの方法により得られた植物体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでにイネから多くの遺伝子が単離され、その塩基配列が決定されている。しかし、イネＤＮＡに含まれる多くの遺伝子は、未だにその機能が解明されておらず有効利用されていない。植物の有用遺伝子の単離および同定、ならびにその効率的な単離法の開発が求められている。
【０００３】
トランスポゾンは、動物、酵母、細菌および植物のゲノムに遍在することが知られる変異誘発遺伝子である。トランスポゾンは、その転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）機構により２つのクラスに分類されている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、複製することなくＤＮＡの形態で転移する。クラスＩＩに属するトランスポゾンとして、トウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）のＡｃ／Ｄｓ、Ｓｐｍ／ｄＳｐｍおよびＭｕ要素（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ、１９８９、Ｃｅｌｌ５６、１８１−１９１；Ｆｅｄｏｒｏｆｆら、１９８３、Ｃｅｌｌ３５、２３５−２４２；Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２、４７８３−４７８７）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍｍａｊｕｓ）のＴａｍ要素（Ｂｏｎａｓら、１９８４、ＥＭＢＯＪ、３、１０１５−１０１９）が知られている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、トランスポゾン・タッギングを利用する遺伝子単離に広く利用されている。この技術は、トランスポゾンがゲノム上で転移して、ある遺伝子中に挿入されると遺伝子の生理学的および形態学的変異が起こり、遺伝子が制御する表現型が変化することを利用する。この変化を検出することにより影響を受けた遺伝子を単離する（Ｂａｎｃｒｏｆｔら、１９９３、ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ、５、６３１−６３８；Ｃｏｌａｓａｎｔｉら、１９９８、Ｃｅｌｌ、９３、５９３−６０３；Ｇｒａｙら、１９９７、Ｃｅｌｌ、８９、２５−３１；Ｋｅｄｄｉｅら、１９９８、ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ、１０、８７７−８８７；Ｗｈｉｔｈａｍら、１９９４、Ｃｅｌｌ、７８、１１０１−１１１５）。
【０００４】
クラスＩに属するトランスポゾンは、レトロトランスポゾンとも呼ばれ、複製し、そしてＲＮＡ中間体を介して転移する。クラスＩトランスポゾンは、最初、ショウジョウバエおよび酵母で同定され、そして特徴付けられたが、最近の研究により植物ゲノム中に遍在し、そのかなりの部分を占めていることが明らかにされている（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、１９９６、ＴｒｅｎｄｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ．、４、３４７−３５３；Ｖｏｙｔａｓ、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７３７−７３８）。レトロトランスポゾンの大部分は、非移動性の組み込みユニットであるようである。最近の研究は、これらのいくつかが、創傷、病原体の攻撃および細胞培養などのストレス条件下で活性化されることを示している（Ｇｒａｎｄｂａｓｔｉｅｎ、１９９８、ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ、３、１８１−１８７；Ｗｅｓｓｌｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６、９５９−９６１；Ｗｅｓｓｌｅｒら、１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．５、８１４−８２１。例えば、タバコではＴｎｔ１ＡおよびＴｔｏ１（Ｐｏｕｔｅａｕら、１９９４、ＰｌａｎｔＪ．、５、５３５−５４２；Ｔａｋｅｄａら、１９８８、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６、３６５−３７６）、およびイネではＴｏｓ１７（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−７７８８）について、ストレス条件下における活性化が報告されている。
【０００５】
イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７は、最も良く研究されている植物中のクラスＩ要素である。Ｔｏｓ１７は、Ｔｙ１−ｃｏｐｉａ群レトロ要素の間の逆転写酵素ドメインの保存アミノ酸配列を基に作成された縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によりクローン化された（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２３３、２０９−２１６）。Ｔｏｓ１７は、４．３ｋｂの長さの、２つの同じ１３８ｂｐのＬＴＲ（長鎖末端反復）および開始メチオニンｔＲＮＡの３’末端に相補的なＰＢＳ（プライマー結合部位）を持つ（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上述）。Ｔｏｓ１７転写は、組織培養により強く活性化され、そして培養時間とともにそのコピー数を増加する。ゲノム研究のモデルジャポニカ品種である日本晴では、Ｔｏｓ１７の当初のコピー数は２であるが、組織培養後、再生した植物では、５〜３０コピーに増加している（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上述）。酵母およびショウジョウバエで特徴付けられたクラスＩＩトランスポゾンとは異なり、Ｔｏｓ１７は、染色体中をランダムな様式で転移し、そして安定な変異を引き起こし、そしてそれ故、イネにおける遺伝子の機能解析の逆遺伝学（ＲｅｖｅｒｓｅＧｅｎｅｔｉｃｓ）における強力なツールを提供する（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ、１９９７、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５，２３１−２４０；１９９９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲｉｃｅ（Ｋ．Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、４３−５８）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｔｏｓ１７を用いて提供される新規植物遺伝子を提供する。本願発明者らは、イネにおいて新たに転移したＴｏｓ１７コピーを持つ植物の表現型およびＴｏｓ１７標的部位の隣接配列の系統的な分析を重ねた結果、Ｔｏｓ１７挿入により、短根、細葉、小粒性などの特徴を示すイネ変異体を発見し、さらにこの変異の原因遺伝子を単離し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、植物の形態を制御する遺伝子をコードするポリヌクレオチドに関し、このポリヌクレオチドは、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから６８９位のＶａｌまでのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０００８】
本発明は、１つの局面で、上記のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質に関する。
【０００９】
本発明は、１つの局面で、制御配列、および該制御配列に作動可能に連結された上記のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００１０】
本発明は、１つの局面で、上記のポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子のアンチセンス配列を含むベクターに関する。
【００１１】
本発明は、１つの局面で、植物を改変する方法に関し、この方法は、上記のベクターを植物組織に導入し、形質転換体を得る工程；この形質転換体を再生し、植物体を得る工程；および上記植物体を所望の形質について選抜する工程を包含する。
【００１２】
上記所望の形質は、小粒性、短稈、および濃緑葉からなる群から選択され得る。
【００１３】
本発明は、１つの局面で、上記のベクターで形質転換された植物体に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、植物の形態を制御する植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドが提供される。本願明細書で用いる用語「植物の形態を制御する」とは、植物において草丈、根長、茎数、葉および種子の形態、ならびに種子収量などを変化させ、植物の品種改良に利用可能な有用農業形質を作出することをいう。用語「植物」は、単子葉植物、双子葉植物を包含する。
【００１５】
本発明の植物の形態を制御する植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、代表的には配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから６８９位のＶａｌまでのアミノ酸をコードするポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。
【００１６】
本発明の植物の形状を制御する植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、植物の形状を制御する限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから６８９位のＶａｌまでのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを包含する。用語「配列の同一性」は、対比される２つのポリヌクレオチドが同一であることを意味し、対比される２つのポリヌクレオチド配列間の配列同一性の割合（％）は、対比される２つのポリヌクレオチド配列を最適に整列させた後、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＩ）が両方の配列で生じて適合した位置の数を得て適合位置数とし、適合した位置の数を比較ポリヌクレオチド総数で除し、そしてこの結果に１００を乗じて計算される。配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＵｎｉｘベースのＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ（ＰｒｏｇｒａｍＭａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８、１９９４年９月、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅＭａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ５３７１１；Ｒｉｃｅ、Ｐ．（１９９６）ＰｒｏｇｒａｍＭａｎｕａｌｆｏｒＥＧＣＧＰａｃｋａｇｅ、ＰｅｔｅｒＲｉｃｅ、ＴｈｅＳａｎｇｅｒＣｅｎｔｒｅ、ＨｉｎｘｔｏｎＨａｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０１ＲＱ、Ｅｎｇｌａｎｄ）およびｔｈｅＥｘＰＡＳｙＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ分子生物学用サーバー（ＧｅｎｅｖａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌａｎｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｅｎｅｖａ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００１７】
本願明細書で用いる用語「制御配列」とは、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。
【００１８】
本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」とは、遺伝子が発現し得るように、ポリヌクレオチドがその発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
【００１９】
制御配列のタイプおよび種類が宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーターなどが当業者に周知である。植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の方法が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウムを介する方法は、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、ついで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎｅｔａｌ．、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養により得られるカルスを含む。遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。
【００２０】
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性で選択され、次いで定法により植物体に再生される。
【００２１】
本明細書中、以下で使用される名称、および以下で記載される実験室手順は、当該分野で周知で一般的に用いられる手順を使用する。標準的な技術は、組換え法、ポリヌクレオチド合成、ならびに微生物培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション）について使用される。この技術および手順は、一般的に、当該分野、およびこの書類を通じて提供される種々の一般的な参考文献（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照。これらは、本明細書中で参考として援用される
【００２２】
【実施例】
以下、本願発明を実施例を挙げて説明する。以下の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明を限定するものではない。
【００２３】
（実施例１：培養によるＴｏｓ１７の活性化）
イネ品種「あきたこまち」の完熟種子を供試し、カルス培養および細胞懸濁培養を行った。Ｔｏｓ１７の活性化はＴｓｕｇａｗａおよびＳｕｚｕｋｉ（２０００、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１９、３７１−３７５）の方法に従って行った。要約すれば、イネの完熟種子を１ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を添加したＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１５、４７３−４７９）上で２５℃、１週間の培養を行った後に、ＫＳＰ培地（ＴｓｕｇａｗａおよびＳｕｚｕｋｉ、前述）で３週間の培養を行い、カルス誘導を行った。得られたカルスを１ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを添加したＫＳＰ液体培地（ＴｓｕｇａｗａおよびＳｕｚｕｋｉ、前述）で約３ヶ月間の懸濁培養を行った。さらにＰＲ培地（ＴｓｕｇａｗａおよびＳｕｚｕｋｉ、前述）に移し、約１週間前培養を行った後、再分化Ｒ培地（ＴｓｕｇａｗａおよびＳｕｚｕｋｉ、前述）に移し、再分化イネ（Ｒ_０世代植物）を得た。
【００２４】
（実施例２：小粒突然変異体の選抜とその特性）
約３８０個体の再分化イネを自殖させ第１世代（Ｒ_１）植物を得て、さらにこれを自殖させて得られた約３８０系統の第２世代（Ｒ_２）を供試材料とし、胚乳形成に関する突然変異体系統を選抜した。突然変異体系統の１つｓｇ１（ｓｍａｌｌｇｒａｉｎ１）と命名した系統の玄米は、図１の（Ａ）に示すように野生型玄米（図１の（Ｂ））と比較して小粒であった。
【００２５】
このｓｇ１系統を、１％寒天培地（梁および一井、１９９６、日作記、６５、４７３−４７８）で栽培し、植物の生育特性および形態的特徴を調査した。図２の（Ａ）に示すように、幼苗期には、このｓｇ１系統は、野生型（図２の（Ｂ））と比較して、草丈はほぼ同じであったが、種子根長および冠根長はいずれも野生型に比べて短かった。また図３に示すように、側根長もまた、野生型に比べて短かった（図３の（Ａ）：ｓｇ１系統、および図３の（Ｂ）：野生型）。
【００２６】
次に、圃場に移植して栽培し、生育特性、形態的特徴および成熟後の玄米の形質を経時的に調査した。図４にｓｇ１系統の草丈、図５に分げつ数（茎数）、図６に根長を、図７に葉身を、図８に農業形質をそれぞれ野生型と比較して示す。各図において、ＡおよびＢは、それぞれｓｇ１系統および野生型の結果を示す。
【００２７】
図４に示すように、ｓｇ１変異系統（Ａ）と野生型（Ｂ）の草丈の差（それぞれ１０株の平均）は、移植後日数を経るにつれて若干増大し、草丈が最大に達した時点（移植後約８０日）では、ｓｇ１変異系統の草丈は、約１０％程度野生型に比べて短かった。
【００２８】
図５に示すように、分げつ数は、全調査期間を通じて、ｓｇ１変異系統（Ａ）は、野生型（Ｂ）に比べ１０〜２０％程度少なかった（それぞれ１０株の平均）。図６および図７は、圃場に移植後３０日のｓｇ１変異系統（Ａ）および野生型（Ｂ）の植物体を示す。図６に見られるように、ｓｇ１変異系統（Ａ）は、野生型（Ｂ）に比べ根長は短かった。また、図７に見られるように、ｓｇ１変異系統（Ａ）は、野生型（Ｂ）に比べ、展開した葉身はやや内側に巻いており、そして葉身幅はやや狭かった。
【００２９】
図８に示すように、成熟期の農業形質の調査では、ｓｇ１変異系統の穂長は、野生型とほぼ同じであったが、１穂当たりの着粒数は野生型に比べ少なく、稔実歩合はやや低く、玄米千粒重量は約１５％少なく、そして株あたりの収量は約５０％少なかった。なお、図８に示す農業形質の特性値は、常法にしたがって、それぞれ１０株について測定した値の平均値である。
【００３０】
（実施例３、ＳＧ１遺伝子の完全長ｃＤＮＡの単離およびｍＲＮＡの発現）
ｓｇ１変異の原因遺伝子を同定単離するために、ｓｇ１変異が分離するヘテロ集団から、ｓｇ１変異を示す個体と、正常個体を識別し、それぞれの葉身から、ＣＴＡＢ法（ＭｕｒｒａｙおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９８０、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．８、４３２１−４３２５）により核ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで切断し、Ｔｏｓ１７をプローブとしたゲノミックサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８、５０３）を行った。このゲノミックサザン分析によって目的遺伝子の存在を同定し、この遺伝子を含むＤＮＡ断片をテンプレートＤＮＡとして、ＴＡＩＬ−ＰＣＲによりＴｏｓ１７挿入部位に隣接するＤＮＡ塩基配列を決定した。
【００３１】
簡単に述べれば、ｓｇ１変異を示す個体と正常個体から得られたＤＮＡを、それぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断し、アガロース電気泳動後、ナイロンメンブレンに吸着させた。Ｔｏｓ１７部分配列（ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片約１０００ｂｐ）をプローブとして用い、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ｓｇ１変異を示す個体では、新規挿入Ｔｏｓ１７のバンド（約６８００ｂｐ）がホモとして観察されたが、正常個体ではホモとして観察されず、そして挿入Ｔｏｓ１７のバンドがｓｇ１変異表現型と完全に連鎖していたことがわかった。これらの結果より、標準のＴｏｓ１７プローブとハイブリダイズするバンドで示されるＤＮＡがｓｇ１変異を引き起こす原因遺伝子を含み、このバンドで表されるゲノム領域にＴｏｓ１７が挿入し、遺伝子型がホモになる際にｓｇ１変異体が生じると結論された。そこで、このＤＮＡを鋳型としてＴＡＩＬ−ＰＣＲ（ＬｉｕＹ−Ｇ．ら、１９９５、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２５、６７４−６８１、ＬｉｕＹ−Ｇ．ら、１９９５、ＰｌａｎｔＪ．、８、４５７−４６３）によりＴｏｓ１７に隣接する配列、つまりｓｇ１変異の原因遺伝子の一部の単離を行った。
【００３２】
まず、新たなＴｏｓ１７標的部位を持つ再生植物からの総ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｂａＩで切断した後、電気泳動を行い、Ｔｏｓ１７標的部位の核ＤＮＡ断片を切り出して、これを鋳型として、以下に示す３セットのプライマーを用いる３回のＴＡＩＬ−ＰＣＲにより増幅反応を行った。第１回：Ｔｏｓ１７に特異的なプライマーＴ１、ＡＧＴＣＧＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＧおよび任意プライマーＡ１、ＮＧＴＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＧＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＡＡ。第２回目：Ｔｏｓ１７に特異的なプライマーＴ２、ＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣおよび任意プライマーＡ１。第３回：Ｔｏｓ１７に特異的なプライマーＴ３、ＡＴＣＣＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧおよびＡ１。次に３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をアガロースで電気泳動を行い、目的のＤＮＡ断片を精製した。市販のＤｙｅＣｙｃｌｅ法を用いたラベリングキット（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、このＤＮＡをテンプレートとしたシークエンシング反応液を調製し、ＰＣＲ（９６℃、３分、１サイクル；９６℃、３０秒、５０℃、１５秒、６０℃、４分、２５サイクル）を行い，３７３ＳＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でＴｏｓ１７に隣接する目的遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。
【００３３】
得られた塩基配列をもとに目的遺伝子に特異的なプライマーＳＰ１、ＴＴＧＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＧＡＴＴＧＣＣＴＡＴおよびＳＰ２、ＡＣＡＡＧＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡを設計し、常法にしたがって、ＰＣＲ法によって目的遺伝子の断片を増幅した。得られた断片（２８４ｂｐ）をプローブとして用い、イネ種子カルスで発現するｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリー（λＺＡＰＩＩのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩにクローニングしたライブラリー）を３回スクリーニングし、目的遺伝子のｃＤＮＡをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）のマルチクローニング部位中（ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ）にクローニングした（図９）。そしてクローニングしたｃＤＮＡの全塩基配列を常法に従い決定し、このｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列をコードする遺伝子をＳＧ１と命名した。このｃＤＮＡクローンインサートは、全長２５７６塩基で、２０７０塩基（６８９アミノ酸残基に相当）を有するアミノ酸翻訳領域をコードしていた（図１０）。
【００３４】
このイネｃＤＮＡをプローブとして用い、野生型の核ＤＮＡ抽出物についてサザン分析を行ったところ、ＳＧ１遺伝子はイネ核ゲノムに１コピーのみ存在し、また日本データバンク（ＤＤＢＪ）に登録されている全遺伝子を対象とした相同性検索を実施した結果、このｃＤＮＡ塩基配列と相同性を有する遺伝子は見出されなかった。従って、ＳＧ１遺伝子は、新規遺伝子であると結論付けられた。
【００３５】
ｓｇ１系統と野生型の植物体における、ＳＧ１遺伝子のｍＲＮＡの発現をノーザン分析で調べたところ、野生型では、特に根におけるの発現量が多く、そして種子カルス、根、葉および幼穂においてその発現が確認された（図１１：Ａはｓｇ１系統およびＢは野生型のノーザン分析の結果を示すレーンである）。その一方、ｓｇ１系統のカルスおよび葉ではその発現はわずかながら検出された。なお、成熟玄米については、いずれもＳＧ１遺伝子のｍＲＮＡは検出されなかった（データは示さず）。
（実施例４：ＳＧ１遺伝子を導入した形質転換植物の発現）
クローニングしたＳＧ１遺伝子の機能を確認するために、ＳＧ１遺伝子、およびＳＧ１遺伝子アンチセンス配列をバイナリーベクターｐＰＺＰ２０２に導入し、形質転換ベクターを構築した（図１２）。ＳＧ１遺伝子としては、配列番号１の１〜２５７６のヌクレオチド配列にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）のマルチクローニング部位の一部を含んだ２６４５ｂｐのヌクレオチド配列を、ＳＧ１遺伝子アンチセンス配列としては、配列番号１の１〜２５７６のヌクレオチド配列にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）のマルチクローニング部位の一部を含んだ２６０５ｂｐのヌクレオチド配列を、バイナリーベクターｐＰＺＰ２０２の中のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ部位、およびＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ部位にそれぞれ挿入した。各遺伝子は、プロモーターＣａＭＶ３５Ｓとフレームが合うように挿入した。なお、図１２の（Ａ）中、ＨＰＴｓｅｔは、ハイグロマイシン耐性遺伝子を、３５Ｓは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを、そしてＮＯＳは、ＮＯＳターミネーターをそれぞれ表す。
【００３６】
得られた形質転換ベクターを用いて、エレクトロポーレーションにより、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよびハイグロマイシンの選択下でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０１株を形質転換した。得られたアグロバクテリウム株は、使用するまで凍結保存した。
【００３７】
野生型の種子から穎を除き玄米とし、これを７０％エタノールで３分間殺菌し、殺菌蒸留水で３回洗浄した後、さらに５０％の次亜塩酸ナトリウム溶液で３０分間殺菌し、そして殺菌蒸留水で５回洗浄した。この玄米を、３０ｇ／ｌシュクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２．８ｇ／ｌのプロリン、２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを添加し、４．０ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＮ６培地（Ｃｈｕら、１９７５、Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ、１８、６５９−６６８）を含むカルス誘導培地上に置いた。なお、培地ｐＨはオートクレーブ前にｐＨ５．８に調整した。玄米は、２８℃で４週間明所で生育させ、約５ｍｍの大きさのカルスを得た。このカルスをアグロバクテリウム感染に用いた。
【００３８】
グリセロール中で凍結保存した上記のアグロバクテリウムを、２０ｍｇ／ｌのカナマシイン、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシン、１００ｍｇ／ｌのスペクノマイシンを含みｐＨ７．２に調整し、１５ｇ／ｌの寒天で固化したＡＢ培地（Ｃｈｉｌｔｏｎら、１９７４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７１、３６７２−３６７６）上で暗所で２８℃３日間の培養を行った。アグロバクテリウム菌体を集め、１０ｍｇ／ｌのアセトンシリンゴン（Ｈｉｅｉら、１９９４、ＰｌａｎｔＪ．、６、２７１−２８２）を含む液体ＡＡＭ培地（Ｈｉｅｉら、１９９４）に懸濁した。得られた懸濁液の中に上記のカルスを２分間浸漬した後、殺菌したペーパータオルで余分の水分を除き、これを１０ｍｇ／ｌアセトンシリンゴンを含む上記のカルス誘導培地に置き、暗所で２８℃、３日間の共存培養を行い、アグロバクテリウムを感染させた。得られた感染カルスを殺菌蒸留水で１０回洗浄し、最後に５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む殺菌蒸留水で１回洗浄した後、殺菌したペーパータオルで余分の水分を除いた。このカルスを１０ｍｇ／ｌアセトンシリンゴン、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、３００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含む上記のカルス誘導培地で２８℃、２週間の培養を行い、さらに５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むカルス誘導培地で４週間の培養を行った。ハイグロマイシン耐性カルスを選択し、３０ｇ／ｌのシュクロース、３０ｇ／ｌのソルビトール、２ｇ／ｌのカザミノ酸、２．２ｍｇ／ｌのカイネチン、１．０ｍｇ／ｌのＮＡＡ、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンおよび４ｇ／ｌのゲルライトを含むｐＨ５．８のＭＳ基礎培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１５、４７３−４９７）を含む再生培地に移した。
【００３９】
形質転換体は、ハイグロマイシンを含む再生培地で容易に再生し、土壌に移して栽培した。
【００４０】
野生型のイネにＳＧ１遺伝子アンチセンス配列を導入した結果、得られた再分化当代（Ｔ_０）の形質転換イネの生育は、非形質転換イネと同等であったが、Ｔ_０を自殖させて得られた種子（玄米）（Ｔ_１）には、野生型に比べ小粒性を呈するものが認められた（図１３の（Ａ）：図１３（Ｂ）は対照の野生型の種子である）。
【００４１】
この玄米（Ｔ_１）を発芽させ、ハイグロマイシン添加培地で生育させたところ、耐性を有する個体および耐性を有さない個体に分離した。ハイグロマイシン耐性を有する個体（形質転換体）を養成し、形質転換植物の形態的特性を調べた。その結果、様々な草丈を有する個体が観察された、この中にはｓｇ１突然変異体と同じ特徴的形質を示す個体があった。
【００４２】
野生型と異なる表現型を示す形質転換イネ（Ｔ_１）の葉身から、上記と同様に、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＳＧ１遺伝子断片をプローブとして用いサザン分析を行ったところ、導入されたＳＧ１遺伝子アンチセンス配列のコピー数は、個体により異なり、調査した３個体（Ｓ−１、Ｓ−２、Ｓ−３）では１〜３個であることが判明した（図１４：ＳＧ１遺伝子のｃＤＮＡ内部に制限酵素部位の無い、４種類の制限酵素で処理したサザン分析の結果である。野生型（Ｂ）の１〜４レーンはいずれもバンドは１本であり、ＳＧ１遺伝子のコピー数は１である。形質転換イネＳ−１株ではバンドの数は４、Ｓ−２株は２、Ｓ−３株は３であったので、新たに導入したＳＧ１遺伝子アンチセンス配列の数はそれぞれ３、１および２である。）。また、形質転換イネ（Ｒ_１）の葉身から全ＲＮＡを抽出し、ＳＧ１遺伝子断片をプローブとして用いノーザン分析を行ったところ、導入したＳＧ１遺伝子アンチセンス配列のｍＲＮＡが多量に発現していた（図１５のＡは形質転換イネ、そして図１５のＢは対照である非形質転換イネのノーザン分析である）。
【００４３】
以上のように、ＳＧ１遺伝子アンチセンス配列の導入により、植物形質転換体は、草丈を含む、種々の形質を変化させることが判明した。従って、ＳＧ１遺伝子は植物の形態形成を含む種々の形質に大きな影響を与えることが確認された。本発明により提供される形質転換植物は、新しい品種開発の材料として利用可能である。
【００４４】
【発明の効果】
植物の根および幼穂で高発現する新規遺伝子が提供される。この遺伝子を利用することにより、種々の形態をもつ植物が提供される。
【００４５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】あきたこまちの野生型およびその胚乳形成突然変異体ｓｇ１の玄米の写真である。（Ａ）はｓｇ１の玄米、そして（Ｂ）は野生型の玄米である。
【図２】あきたこまちの野生型およびその胚乳形成突然変異体ｓｇ１の幼植物の写真である。（Ａ）はｓｇ１の幼植物、そして（Ｂ）は野生型の幼植物である。
【図３】あきたこまちの野生型およびその胚乳形成突然変異体ｓｇ１の幼植物の側根を示す写真である。（Ａ）はｓｇ１の幼植物、そして（Ｂ）は野生型の幼植物である。
【図４】あきたこまちの野生型およびその胚乳形成突然変異体ｓｇ１の草丈の経日変化を示す図である。（Ａ）はｓｇ１系統、そして（Ｂ）は野生型の草丈を示す。
【図５】あきたこまちの野生型およびその胚乳形成突然変異体ｓｇ１の茎数の経日変化を示す図である。（Ａ）はｓｇ１系統、そして（Ｂ）は野生型の茎数を示す。
【図６】あきたこまちの野生型およびその胚乳形成突然変異体ｓｇ１の圃場移植後３０日目の植物体の写真である。（Ａ）はｓｇ１系統、そして（Ｂ）は野生型である。
【図７】あきたこまちの野生型およびその胚乳形成突然変異体ｓｇ１の圃場移植直後の植物体の写真である。（Ａ）はｓｇ１系統、そして（Ｂ）は野生型である。
【図８】あきたこまちの野生型およびその胚乳形成突然変異体ｓｇ１の成熟期の農業形質の比較を示す図である。（Ａ）はｓｇ１系統、そして（Ｂ）は野生型である。
【図９】ＳＧ１遺伝子のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）中にクローニングされたｃＤＮＡ断片の概略を示す図である。
【図１０】ＳＧ１遺伝子の塩基配列および推定されるアミノ酸配列を示す図である。
【図１１】ｓｇ１系統と野生型植物体の各器官におけるｍＲＮＡの発現を示す図である。（Ａ）はｓｇ１系統、そして（Ｂ）は野生型である。
【図１２】ＳＧ１遺伝子（センス）およびアンチセンスＳＧ１遺伝子を含む形質転換ベクターの一部を示す図である。（Ａ）は、センスＳＧ１遺伝子を、（Ｂ）は、アンチセンスＳＧ１遺伝子をそれぞれ含む形質転換ベクターの一部を示す図である。
【図１３】アンチセンスＳＧ１遺伝子を導入した形質転換イネの玄米（Ａ）と非形質転換イネの玄米（Ｂ）の写真である。
【図１４】アンチセンスＳＧ１遺伝子を導入した形質転換イネ（Ｓ−１、Ｓ−２、Ｓ−３）と非形質転換イネ（Ｂ）におけるＳＧ１遺伝子のコピー数の比較を示す図である。
【図１５】アンチセンスＳＧ１遺伝子を導入した形質転換イネと非形質転換イネ（Ｂ）にの葉身におけるｍＲＮＡの発現の比較を示す図である。

Claims

ポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから６８９位のＶａｌまでのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子を植物において欠失させることにより、草丈が短くなる表現型、根長が短くなる表現型、葉身が狭くなる表現型、茎数が減少する表現型、および種子数が減少する表現型からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を生じる、ポリヌクレオチド。
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、アミノ酸配列を含む、タンパク質。
制御配列、および該制御配列に作動可能に連結された請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子のアンチセンス配列を含む、ベクター。
植物を改変する方法であって、
請求項４に記載のベクターを植物組織に導入し、形質転換体を得る工程；
該形質転換体を再生し、植物体を得る工程；および
該植物体を所望の形質について選抜する工程、
を包含する、方法。
前記所望の形質が、小粒性、短稈、および濃緑葉からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
請求項４に記載のベクターで形質転換された、植物体。
ポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから６８９位のＶａｌまでのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補体、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補体を含み、該ポリヌクレオチドを植物に導入することにより、草丈が短くなる表現型、根長が短くなる表現型、葉身が狭くなる表現型、茎数が減少する表現型、および種子数が減少する表現型からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を生じる、ポリヌクレオチド。