JP3777410B2

JP3777410B2 - エチレン合成を制御する新規遺伝子

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Publication number: JP3777410B2
Application number: JP2000620098A
Authority: JP
Inventors: 洋彦廣近; 清美阿部
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Priority date: 1999-05-25
Filing date: 1999-05-25
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2019-05-25
Also published as: AU3851699A; KR20020027324A; KR100443488B1; US7053203B1; CA2374379A1; WO2000071721A1; AU776516B2

Description

技術分野
本発明は、新規遺伝子に関する。より詳細には、植物においてエレチン合成を制御する機能を有するタンパク質をコードする新規遺伝子に関する。
背景技術
トランスポゾンは、動物、酵母、細菌および植物のゲノムに遍在することが知られる変異誘発遺伝子である。トランスポゾンは、その転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）機構により２つのクラスに分類されている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、複製することなくＤＮＡの形態で転移する。クラスＩＩに属するトランスポゾンとして、トウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）のＡｃ／Ｄｓ、Ｓｐｍ／ｄＳｐｍおよびＭｕ要素（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ、１９８９、Ｃｅｌｌ５６、１８１−１９１；Ｆｅｄｏｒｏｆｆら、１９８３、Ｃｅｌｌ３５、２３５−２４２；Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２、４７８３−４７８７）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍｍａｊｕｓ）のＴａｍ要素（Ｂｏｎａｓら、１９８４、ＥＭＢＯＪ、３、１０１５−１０１９）が知られている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、トランスポゾン・タッギングを利用する遺伝子単離に広く利用されている。この技術は、トランスポゾンがゲノム上で転移して、ある遺伝子中に挿入されると遺伝子の生理学的および形態学的変異が起こり、遺伝子が制御する表現型が変化することを利用する。この変化を検出することにより影響を受けた遺伝子を単離する（Ｂａｎｃｒｏｆｔら、１９９３、ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ、５、６３１−６３８；Ｃｏｌａｓａｎｔｉら、１９９８、Ｃｅｌｌ、９３、５９３−６０３；Ｇｒａｙら、１９９７、Ｃｅｌｌ、８９、２５−３１；Ｋｅｄｄｉｅら、１９９８、ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ、１０、８７７−８８７；Ｗｈｉｔｈａｍら、１９９４、Ｃｅｌｌ、７８、１１０１−１１１５）。
クラスＩに属するトランスポゾンは、レトロトランスポゾンとも呼ばれ、複製し、そしてＲＮＡ中間体を介して転移する。クラスＩトランスポゾンは、最初、ショウジョウバエおよび酵母で同定され、そして特徴付けられたが、最近の研究により植物ゲノム中に遍在し、そのかなりの部分を占めていることが明らかにされている（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、１９９６、ＴｒｅｎｄｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ．、４、３４７−３５３；Ｖｏｙｔａｓ、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７３７−７３８）。レトロトランスポゾンの大部分は、非移動性の組み込みユニットであるようである。最近の研究は、これらのいくつかが、創傷、病原体の攻撃および細胞培養などのストレス条件下で活性化されることを示している（Ｇｒａｎｄｂａｓｔｉｅｎ、１９９８、ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ、３、１８１−１８７；Ｗｅｓｓｌｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６、９５９−９６１；Ｗｅｓｓｌｅｒら、１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．５、８１４−８２１。例えば、タバコではＴｎｔ１ＡおよびＴｔｏ１（Ｐｏｕｔｅａｕら、１９９４、ＰｌａｎｔＪ．、５、５３５−５４２；Ｔａｋｅｄａら、１９８８、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６、３６５−３７６）、およびイネではＴｏｓ１７（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−７７８８）について、ストレス条件下における活性化が報告されている。
イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７は、最も良く研究されている植物中のクラスＩ要素である。Ｔｏｓ１７は、Ｔｙ１−ｃｏｐｉａ群レトロ要素の間の逆転写酵素ドメインの保存アミノ酸配列を基に作成された縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によりクローン化された（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２３３、２０９−２１６）。Ｔｏｓ１７は、４．３ｋｂの長さの、２つの同じ１３８ｂｐのＬＴＲ（長鎖末端反復）および開始メチオニンｔＲＮＡの３’末端に相補的なＰＢＳ（プライマー結合部位）を持つ（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上述）。Ｔｏｓ１７転写は、組織培養により強く活性化され、そして培養時間とともにそのコピー数を増加する。ゲノム研究のモデルジャポニカ品種である日本晴では、Ｔｏｓ１７の当初のコピー数は２であるが、組織培養後、再生した植物では、５〜３０コピーに増加している（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上述）。酵母およびショウジョウバエで特徴付けられたクラスＩＩトランスポゾンとは異なり、Ｔｏｓ１７は、染色体中をランダムな様式で転移し、そして安定な変異を引き起こし、そしてそれ故、イネにおける遺伝子の機能解析の逆遺伝学（ＲｅｖｅｒｓｅＧｅｎｅｔｉｃｓ）における強力なツールを提供する（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ、１９９７、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５，２３１−２４０；１９９９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲｉｃｅ（Ｋ．Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、４３−５８）。
発明の開示
本発明は、Ｔｏｓ１７を用いて提供される植物新規遺伝子を提供する。
本願発明者らは、イネにおいて、新たに転移したＴｏｓ１７コピーをもつ植物の表現型およびＴｏｓ１７標的部位の隣接配列の系統的な分析を鋭意重ねた結果、Ｔｏｓ１７挿入により、側根伸長阻害を起こすイネ変異体を得、Ｔｏｓ１７の標的部位として、植物においてエレチン合成を制御する新規遺伝子を解明し、本発明を完成するに至った。
本発明は、エレチン合成を制御し得る植物遺伝子をコードするオリゴヌクレオチドであって、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから４０５位のＧｌｎまでのアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドに関する。
好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、イネに由来する。
好ましくは、このオリゴヌクケオチドは、配列表の配列番号１で示される。
１つの局面で、本発明はまた、制御配列に作動可能に連結された上記オリゴヌクレオチドを含むベクターに関する。
好ましくは、上記ベクターは、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ−ＲＦである。
他の局面で、本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドを含む植物に関し、上記のベクターで形質転換された植物に関する。
さらに、本発明は、植物におけるエチレン合成の制御方法に関し、上記のオリゴヌクレオチドを植物に導入する工程を包含する。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、Ｔｏｓ１７を用いて提供される植物新規遺伝子、これを含むベクター、当該新規遺伝子で形質転換された植物、および当該新規遺伝子を植物に形質転換する工程を包含する、植物の改良方法を提供する。
本発明によれば、エチレン合成を制御し得る植物遺伝子をコードするオリゴヌクレオチドが提供される。本願明細書で用いる用語「エチレン合成を制御し得る」は、植物において、エチレン生合成に関与する遺伝子を、抑制または促進することをいう。用語「植物」は、単子葉植物、双子葉植物を包含する。
本発明のエチレン合成を制御し得る植物遺伝子をコードするオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから４０５位のＧｌｎまでのアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドである。
本発明のエチレン合成を制御し得る植物遺伝子をコードするオリゴヌクレオチドは、植物においてエチレン合成を制御し得る限り、配列表の配列番号２の３０３位のＡｓｐから３７６位のＧｌｙまでのアミノ酸配列と、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましは少なくとも９９％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを包含する。用語「配列の同一性」は、対比される２つのオリゴヌクレオチド配列が同一であることを意味し、対比される２つのオリゴヌクレオチド配列間の配列同一性の割合（％）は、対比される２つのオリゴヌクレオチド配列を最適に整列させた後、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で生じて適合した位置の数を得て適合位置数とし、適合した位置の数を比較オリゴヌクレオチド総数で除し、そして、この結果に１００を乗じて計算される。配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＵｎｉｘベースのＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ（ＰｒｏｇｒａｍＭａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８、１９９４年９月、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅＭａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ５３７１１；Ｒｉｃｃ、Ｐ．（１９９６）ＰｒｏｇｒａｍＭａｎｕａｌｆｏｒＥＧＣＧＰａｃｋａｇｅ、ＰｅｔｅｒＲｉｃｅ、ＴｈｅＳａｎｇｅｒＣｅｎｔｒｅ、ＨｉｎｘｔｏｎＨａｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０１ＲＱ、Ｅｎｇｌａｎｄ）およびｔｈｅＥｘＰＡＳｙＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ分子生物学用サーバー（ＧｅｎｃｖａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌａｎｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｅｎｅｖａ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。
本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、オリゴヌクレオチドが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
制御配列のタイプおよび種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーターなどが当業者に周知である。植物体への遺伝子の導入には、当業者に公知の方法が用いられ得る。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接細胞に導入する方法とが周知である。アグロバクテリウムを介する方法は、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムに形質転換し、ついで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎｅｔａｌ．、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。遺伝子を直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。
遺伝子が導入された細胞は、まずハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性で選択され、ついで、常法により、植物体に再生され得る。
本明細書中、以下で使用される名称、および以下で記載される実験室手順は、当該分野で周知で一般的に用いられる手順を使用する。標準的な技術は、組換え法、ポリヌクレオチド合成、ならびに微生物培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション）について使用される。この技術および手順は、一般的に、当該分野、およびこの書類を通じて提供される種々の一般的な参考文献（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照。これらは、本明細書中で参考として援用される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、代表的には、本明細書に記載の方法に従って得られるが、本発明に開示された配列を基に、化学合成によっても得られ得る。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓのオリゴヌクレオチド合成機を用いて製造業者によって提供される仕様書に従って合成され得る。
ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知である（ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡＥｒｌｉｃｈ編、ＦｒｅｅｍａｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ１：１７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、これらは、本明細書中で参考として援用する。
実施例
以下、本願発明を実施例を挙げて説明する。以下の実施例は、本発明の例示するものであって、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）培養によるＴｏｓ１７の活性化および得られた変異体の特徴付けヤポニカ種の変種Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅの完熟種子を出発材料に用い、先に記載のように（Ｈｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、前述）カルス開始培養および細胞懸濁培養を行った。Ｔｏｓ１７の活性化は、大槻（１９９０）の方法（イネ・プロトプラスト培養系、農林水産技術情報協会）に従って行った。要約すれば、イネの完熟種子を２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を添加したＭＳ培地（大槻（１９９０）、前述）で培養し（２５℃、１ケ月間）、カルス誘導を行った。得られたカルスを、２，４−Ｄを添加したＮ６液体培地（大槻（１９９０）、前述）で５ケ月間培養したのち、再分化培地（大槻（１９９０）、前述）に移し再分化イネ（第１世代（Ｒ１）植物）を得た。得られたＲ１イネの各々を１株とし、それぞれの株から約３０のＲ１種子を回収し、土壌を含むポットまたはＭＥＳ緩衝化寒天培地（５ｍＭＭＥＳ、ｐＨ５．７；０．５％アガロース）に植えて第２世代（Ｒ２）植物を得て形態分析を行った。Ｒ２集団の各植物の表現型を発芽１週間後に注意深く観察した結果、１つの株ＬＲＤ１株のＲ２集団の約１／３が側根伸長に欠陥があることが観察された。このことは、ＬＲＤ１株の側根伸長欠陥が、単一の遺伝子座の劣性変異により引き起こされることを示唆していた。
（実施例２）Ｔｏｓ１７による破壊遺伝子の解析
実施例１で得られたＬＲＤ１株の示す側根伸長欠陥が、単一の遺伝子座の劣性変異により引き起こされることを示すために、まず、ＬＲＤ１株におけるＴｏｓ１７が転移挿入された標的部位（Ｔｓ）の隣接部位を増幅した。
１．新たに転移したＴｏｓ１７の隣接配列の増幅
実施例１で得られたＲ２イネ（ＬＲＤ１株）からＣＴＡＢ法（ＭｕｒｒａｙおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９８０、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．８、４３２１−４３２５）によりＤＮＡを調製した。Ｔｏｓ１７標的部位配列の増幅は、先に記載のように（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、前述；Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９９４、ＰｌａｎｔＪ．、５、８６３−８７１）、総ＤＮＡを用いる逆ＰＣＲにより実施した。
要約すれば、まず、新たなＴｏｓ１７標的部位を持つ再生植物からの総ＤＮＡの約１μｇを、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩで消化した。消化したＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、次いでエタノール沈澱により精製し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼを用いることにより、１２℃で総容量４００μｌで一晩連結した。ＵｌｔｒａＦｒｅｅＧ３−ＬＧＣ遠心分離ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いることにより連結混合物から塩類およびＡＴＰを除去した。連結されたＤＮＡの半分をＰＣＲの鋳型として用いた。以下に示す２セットのプライマーを用いる２段階のＰＣＲにより増幅反応を行った。第１段階：Ｔｏｓ１７ＬＴＲ１、ＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＴＡＴＣＴＴＧＴＡＴＡＴＡＣおよびＴｏｓ１７ＬＴＲ３、ＣＣＡＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＣＧＡＴＧＧＧ。第２段階：Ｔｏｓ１７ＬＴＲ−２、ＧＣＴＡＡＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＡＡおよびＴｏｓ１７ＬＴＲ−４、ＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＣＴＡＴＡＣＡＧＴ。Ｔｏｓ１７の挿入のない通常植物の標的部位は、組織培養を行わずにプライマーＴＧＡＧＴＴＣＣＣＣＴＴＧＡＧＴＣＡＧＣおよびＧＴＡＧＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＣを用いて増幅した。次いでそれぞれの逆ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中にクローニングしシークエンサー（ＡＢＩ社、Ｍｏｄｅｌ３７７）を用いて配列を決定した。
ＬＲＤ１株におけるＴｏｓ１７の隣接配列の配列決定の結果、９つの新たなＴｏｓ１７挿入の標的（Ｔｓ）部位（Ｔｓ１〜Ｔｓ９）が確認された。
２．変異体の表現型とＴｓ９遺伝子座の破壊との連鎖分析
側根伸長が阻害されたＬＲＤ１株のＲ２集団を対象に、Ｔｓ９隣接配列をプローブとして用いるサザンブロット法による同時分離分析を行った。さらに、Ｔｓ９隣接領域がヘテロ型（Ｔｏｓ１７の挿入された遺伝子と正常な遺伝子をもつ）のＲ２植物の自家受粉で得た個々のＲ３植物集団を対象に、ポリメラーゼ連鎖反応キット（ＬＡ−ＰＣＲ、ＴａＫａＲａＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて連鎖分析を行った。新たに転移されたＴｏｓ１７標的部位であるＴｓ９に隣接する以下の２つのプライマーを設計した。正方向プライマー：ＧＣＡＧＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＣＴＧＴＣおよび逆方向プライマー：ＣＡＡＧＴＴＡＧＧＡＧＣＧＴＣＡＴＧＧＡ。増幅反応のサイクルは以下のように行った。開始変性：９６℃１分、変性：９８℃２０秒３０サイクル、アニーリング：５７℃３分、伸長：７２℃５分。ＬＡ−ＰＣＲ法により、野生型植物で７７０ｂｐの、側根伸長変異体植物で５．１ｋｂｐの、そしてヘテロ型植物でその両方の増幅産物をそれぞれ得た。これらは、約１００のＲ２およびＲ３集団の植物において確認され、側根伸長阻害表現型と緊密に連鎖していた。このように、ＬＲＤ１株の示す側根伸長欠陥が、単一の遺伝子座Ｔｓ９の劣性変異により引き起こされることが確認された。
３．ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築およびＴｓ９の特徴付け
土壌で４週間生育させた側根伸長が阻害されていない野生型イネの根から以下のようにＲＮＡを調製した。まず、ＩＳＯＧＥＮ溶液（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を用いて根から総ＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に含まれるオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いて、総ＲＮＡからポリ（Ａ）ｍＲＮＡを得た。得られたポリ（Ａ）ｍＲＮＡから常法に従いｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリーをλＺＩＰ−ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に構築した。この根のｃＤＮＡライブラリーは、５×１０^５プラークの感染能力を持つ。陽性のｃＤＮＡ挿入片を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドのインビボ切除は、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ２株で行った。
ゲノムライブラリーは、当研究室で先に調製されたものを用いた。調製法を要約すると、このゲノムライブラリーは、ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分分解して得たゲノム断片をＥＭＢＬ３（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆら、１９８３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７０、８２７−８４２）ベクター中に挿入して調製された。
これらライブラリーを、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の方法に従って、Ｔｓ９の逆ＰＣＲ産物をプローブとして用いてスクリーニングした。
ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーから得られた強いシグナルをもつクローンを、Ｔｓ９隣接配列に特異的な以下に示す１対のプライマーを用いるＰＣＲ法およびアガロース電気泳動によりさらにスクリーニングした：Ｔｓ９ＦＧＧＡＡＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＧＡＡＣ、およびＴｓ９ＲＴＴＧＣＴＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＴ。
ｃＤＮＡライブラリーから、強いハイブリダイゼーションシグナルを示す４つのｃＤＮＡクローンが得られた。
４つのクローンの中で最長の約２ｋｂサイズのｃＤＮＡを３７７シークエンサー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてその両方向について配列決定し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解析、およびＭａｃＶｅｃｔｏｒ６．０プログラム（帝人システムテクノロジー（株））を用いる疎水性分析に供した。
配列決定分析により、最長のｃＤＮＡクローンは２０９３ｂｐ（配列番号１）の長さを持ち、その３’末端に４つの異なるポリアデニル化部位（それぞれ、１９５４、１９７８、２０１１および２０９３位）を持つことがわかった。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ６．０パッケージを用いたｍＲＮＡの分析により、ショウジョウバエのＧ１などの他のタンパク質に見られるｒｉｎｇｆｉｎｇｅｒ部分を持つ４０５アミノ酸（配列番号２）からなるタンパク質をコードする最長の１２１５ｂｐオープンリーディングフレームが同定された。このタンパク質をＯｓＲｉｎｇ１と命名した。この２０９３ｂｐの配列を図１に示す。代表的なｒｉｎｇｆｉｎｇｅｒ部分は、図１に示す配列のヌクレオチド１３０４〜１４２６の間に見られ、７つのシステイン残基と１つのヒスチジン残基からなり、これらは、共同して２つのＺｎ^＋イオンの結合に関与すると考えられる。他のタンパク質で見られるｒｉｎｇｆｉｎｇｅｒ部分では、システイン残基とヒスチジン残基の間の間隔が高度に保存されていることが知られている（Ｆｒｅｅｍｏｎｔら、１９９１、Ｃｅｌｌ、６４、４８３−４８４）。ＯｓＲｉｎｇ１のシステインリッチ領域は、第４番目のシステインがヒスチジン残基で置換されている点を除いて、代表的なｒｉｎｇｆｉｎｇｅｒ部分のパターンと良く一致した。この特徴は、胚発達に関与するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＧ１遺伝子（ＢｏｕｃｈａｒｄおよびＣｏｔｅ、１９９３、Ｇｅｎｅ、１２５、２０５−２０９）、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａのＡＴＬ２遺伝子（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｇａｒｉａ、１９９６、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ、２５２、５８７−５９８）においても見出されている。
ＯｓＲｉｎｇ１タンパク質の他の特徴は、非極性残基が大部分を占め（全体の４１．２３％）、その中央にあるそれぞれ２４、１６、３０および３６残基にわたって広がる４つの疎水性ドメイン（それぞれ、アミノ酸８５〜１０８、アミノ酸１１９〜１３４、アミノ酸１９６〜２２５、およびアミノ酸２３７〜２７２）からなることである。第３番目と第４番目の疎水性ドメインの間には、１２の弱い親水性残基しか存在せず、第３番目と第４番目の疎水ドメインを含むドメインが最も大きな疎水性ドメインを構成すると考えられる。これらの性質から、本発明者らは、ＯｓＲｉｎｇ１遺伝子は、膜結合タンパク質をコードしていると考えている。
ゲノムライブラリーから得られたいくつかの陽性のゲノムクローンの構造は、制限酵素消化、およびＥＭＢＬ３ベクターの末端配列に特異的な１対の以下のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＬＡ−ＰＣＲ、ＴａＫａＲａＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて分析した。ＥＭＢＬ３正方向：ＡＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡＣＴＴＡＴＧＣＣＣ、およびＥＭＢＬ３逆方向：ＣＴＣＧＴＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＣＧＡＧＴ。配列決定は、上記の完全長ｃＤＮＡ末端配列に特異的な２つのプライマー（正方向：ＧＡＧＡＧＣＴＡＣＣＴＣＧＡＡＴＣＧＡＡ、および逆方向：ＧＣＴＣＡＡＣＴＣＡＧＧＴＧＡＴＣＡＴＣ）を用いて行った。その結果、１４ｋｂの挿入断片を含む１つのゲノムクローンが、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩ消化の後、５．３ｋｂの断片を生じ、上記の完全長ｃＤＮＡ配列に特異的なプライマーを用いるＬＡ−ＰＣＲによりこの断片が完全長のオープンリーディングフレームを含むことが確認された。ＯｓＲｉｎｇ１遺伝子は、５つのイントロンを持ち、Ｔｏｓ１７は、第３イントロンに挿入されていることがわかった。
（実施例３）ＯｓＲｉｎｇ１遺伝子の発現解析
根側根伸長阻害変異体におけるＴｏｓ１７挿入により引き起こされるＯｓＲｉｎｇ１遺伝子の発現阻害を解析するために、変異体（ホモ型）および野生型イネからＲＮＡを抽出し、ノーザン解析により発現特性を調べた。
水中で７日間発芽させ、土壌中で２、４および６週間生育させたそれぞれの植物の根および葉から、ならびにそれぞれの成熟植物の茎および花器官およびカルスから、ＩＳＯＧＥＮＲＮＡ抽出溶液（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を用いて総ＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡは、オリゴｄＴ−３０カラム（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を用いて精製し、そして５％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド溶液を含む１．５％アガロースゲルで分離した。さらに、それぞれの植物の葉のＤＮＡを、ＣＡＴＢ法（ＲｏｇｅｒｓおよびＢｅｎｄｉｃｈ、１９９４）を用いて抽出し、ＸｂａＩで消化した。電気泳動には、約２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡおよび約１μｇのＤＮＡを用いた。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、Ｔｓ９逆ＰＣＲ産物をプローブとして用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前述、に記載の方法に従って、０．５ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、２００μｇの子ウシ胸腺ＤＮＡを含む溶液中、６８℃で、それぞれ３および１２時間行った。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、５５℃で、０．５％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液中で２回、合計１時間洗浄した。
ノーザン解析の結果（結果は示さず）、ＯｓＲｉｎｇ１遺伝子は、２週齢から成熟野生型イネの側根を有する根において非常に強い発現が検出された。ＯｓＲｉｎｇ１遺伝子はまた、花器官において比較的高いレベルで発現していた。しかし、カルス培養では低レベルでしか発現せず、葉では、苗から成熟植物のすべてのステージで非常に低レベルでしか発現していなかった。
側根形成は、土壌で生育させた４週齢の植物からすべての根を切断することにより、またはポット生育させた側根のない植物で模倣することが可能である。根を切断した植物においては移植後、１週間後に、シュートの基部で側根のない一次根が出現し、２〜３週間後には、再生した一次根から多くの側根が形成される。ノーザン分析により、一次根では、ＯｓＲｉｎｇ１遺伝子の非常に弱い発現が観察されたに過ぎなかったが、多くの側根を持つ根では、非常に強い発現が観察された。これらの結果は、ＯｓＲｉｎｇ１遺伝子発現が、側根形成または生長・伸長のいずれかと緊密に連関していることを示した。
側根伸長阻害変異体において、Ｔｏｓ１７挿入によりＯｓＲｉｎｇ１が発現しなくなる機構を調べるために、Ｔｏｓ１７挿入部位の上流配列をＰＣＲ法により合成し、これをプローブを用いノーザンブロット解析を行った。その結果、側根伸長阻害変異体では、ＯｓＲｉｎｇ１配列から予想される２．１ｋｂＲＮＡは検出されず、０．９ｋｂのＲＮＡが検出された（結果は示さず。）。この０．９ｋｂのサイズは、ｃＤＮＡの５’末端〜ＯｓＲｉｎｇ１変異体中のＴｏｓ１７挿入部位までの配列に相当する。このことは、ＯｓＲｉｎｇ１発現がＴｏｓ１７挿入により中断され、そしてｒｉｎｇｆｉｎｇｅｒ配列のない部分的ＯｓＲｉｎｇ１ｍＲＮＡが変異体中で蓄積したことを示した。Ｔｏｓ１７の挿入により同様の遺伝子発現がなくなる例が、Ｔｏｓ１７挿入によるストライプ変異においても報告されている（ＹａｍａｓａｋｉＭ、私信）。
（実施例４）ＯｓＲｉｎｇ１遺伝子導入による相補性試験
１．相補性ベタクーの構築とＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによるＯｓＲｉｎｇ１変異体の形質転換
完全長のＯｓＲｉｎｇ１遺伝子のオープンリーディングフレームを含む５．３ｋｂのＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に連結し、ｐＩＧ１２１−Ｈｍベクターに組み込んだ（Ａｋａｍａら、１９９２、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．１２、７−１１）（図２）。得られたベクターをｐＩＧ１２１−Ｈｍ−ＲＦと称した。この組換えベクターを用いて、エレクトロポーレーションにより、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよびハイグロマイシンの選択下でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０１株を形質転換した。得られたアグロバクテリウム株は、使用するまで凍結保存した。
ＯｓＲｉｎｇ１変異体の種子を、１％の次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、そして殺菌蒸留水で５回洗浄した。この種子を、３％スクロース、０．３ｇ／ｌカゼイン加水分解物、２．８ｇ／ｌのプロリン、２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを添加し、５．０ｇ／ｌのゲルガムで固化させたＮ６培地（Ｃｈｕら、１９７５、Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ、１８、６５９−６６８）上に置いた。なお、培地ｐＨはオートクレーブ前にｐＨ５．８に調整した。種子は、２８℃で２週間暗所で生育させ、約２ｍｍの大きさの微小カルスを得た。これを、カルス誘導培地に移し、４日間明所で培養し、アグロバクテリウム感染に用いた。
凍結乾燥した上記のアグロバクテリウムを、５０ｍｇ／ｌのカナマシイン、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含み、ｐＨ７．２に調整し、１５ｇ／ｌの寒天で固化したＡＢ培地（Ｃｈｉｌｔｏｎら、１９７４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７１、３６７２−３６７６）で２２℃３日間暗所で培養した。アグロバクテリウム菌体を集め、２０μｇのアセトシリリンゴン（Ｈｉｅｉら、１９９４、ＰｌａｎｔＪ．、６、２７１−２８２）を含む液体ＡＡＭ培地（Ｈｉｅｉら、１９９４）に懸濁した。得られた懸濁液を、上記の誘導カルスと、２２℃７日間暗所で同時インキュベーションしアグロバクテリウムを感染させた。得られたカルスを５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む液体カルス誘導培地で５回洗浄し、殺菌したＷｈａｔｍａｎＮｏ．１濾紙上で乾燥させた。このカルスを、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含むカルス誘導培地で３週間培養してハイグロマイシン耐性カルスを選択し、３０ｇ／ｌのスクロース、３０ｇ／ｌのソルビトール、２ｇ／ｌのカゼイン加水分解物、２ｇ／ｌのキネチン、５００ｍｇ／ｌのカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンおよび５／ｌのゲルガムを含むｐＨ５．８のＭＳ基礎培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１５、４７３−４９７）を含む再生培地に移した。
形質転換体は、オーキシンまたはＮＡＡを添加することなくハイグロマイシンを含む再生培地で容易に再生し、土壌に移した。図３に示すように、形質転換体は正常な側根伸長を示した。この結果から、ＯｓＲｉｎｇ１遺伝子の変異が側根伸長阻害の原因となっていると結論された。
（実施例５）ＯｓＲｉｎｇ１遺伝子の機能解析
側根伸長がエチレンによって阻害されることが報告されている（ＪａｃｋｓｏｎＭ．Ｂ．１９９１、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｎｒｏｏｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．−ＩｎＴｈｅＰｌａｎｔＨｏｒｍｏｎｅＥｔｈｙｌｅｎｅ、Ａ．Ｋ．ＭａｔｔｏおよびＪ．Ｃ．Ｓｕｔｔｌｅ編、１５９−１８１、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、ＦＬ．ＩＳＢＮ０−８４９３−４５６６−９）。変異体で見られる側根伸長阻害がエチレンと相関しているか否かを調べた。
変異体およびその野生型子孫の種子を、１．０％の次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、十分洗浄した後、２５℃で２４時間水中に浸した。それぞれの種子を、１０^−９〜１０^−５Ｍのオーキシン（Ｓｉｇｍａ社製）、または１０^−６〜１０^−３ＭのＡＣＣ（１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸；エチレン合成の前駆体、Ｓｉｇｍａ社製）、または１０^−１０〜１０^−７ＭのＡｇＮＯ_３；エチレン合成の阻害剤（ＳｍａｌｌｅＪ．ら、１９９７、ＥｔｈｙｌｅｎｅｃａｎｓｔｉｍｕｌａｔｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｈｙｐｏｃｏｔｙｌｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｌｉｇｈｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：２７５６−２７６１）の各々の存在下または非存在下で、５ｍＭのＭＥＳ（２−［Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｅｔｈａｎｅｓｕｆｌｏｎｉｃａｃｉｄ、Ｃ_６Ｈ_１３ＮＯ_４Ｓ、ＳＩＧＭＡ社製）緩衝化寒天培地（ｐＨ５．８）上に水平に置き、２５℃で７日間暗所で生育させ形態分析に供した。それらの種子根を、ホルマリン−酢酸−アルコール（ＦＡＡ）固定液で固定し、抱水クロラール溶液で透明化し（Ｙａｄｅｇａｒｉ，Ｒ．ら、１９９４、ＣｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｒｅｕｎｃｏｕｐｌｅｄｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｒａｓｐｂｅｒｒｙｅｍｂｒｙｏｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ６：１７１３−１７２９）、そして微分干渉顕微鏡で観察した。
その結果、ＡＣＣを含む発芽培地（０．５％寒天（ＩＮＡＡＧＡＲ、フナコシ薬品株式会社））に置いた野生型イネは、その側根伸長が著しく阻害された（図４）。一方、７〜１０ＭのＡｇＮＯ_３を含む発芽培地で生育させた変異体は、側根伸長が増加し野生型の側根伸長のレベルに回復した。これらの現象は、変異体では根におけるエレチン生産量が増加していることを示唆した。
（実施例６）エチレン産生量の測定
野生型および変異体おける器官別のエチレン生成量をガスクロマトグラフィーを用いて測定した。
２５℃、暗所で７日間生育させた芽生えを鞘葉（地上部）と根に分け、５０ｍＬのチューブに入れて密閉し、２５℃、暗所で培養した。２０時間後に試料の入ったチューブから１ｍＬの気体をシリンジで採取し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−８ＡＩＦ、島津製作所製）を用いて、以下の測定条件で、発生したエチレン量を測定した。
（ガスクロマトグラフィー測定条件）
カラム：活性アルミナ、カラム温度：６０℃、試料燃焼室の温度：９０℃、検出器：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）（水素流量：６０ＫＰａ、空気流量：５０ＫＰａ）、キャリアガス：窒素、キャリアガス流量：６０ＫＰａ。このときのエチレンのリテンションタイムは、０．５分であった。
結果を図５に示した。図示されるように、変異体ではエチレンの生成量が野生型に比べ有意に増加していた。この結果は、ＯｓＲｉｎｇ１遺伝子が根におけるエチレン合成を阻害していることを示している。
上記の実施例は、本発明の種々の局面、および本発明の特定のオリゴヌクレオドがどのように作成され、および利用されるのかを例示して記載している。本発明の範囲を制限するものではない。
産業上の利用可能性
植物育種に利用可能なエチレン合成を制御し得る新規オリゴヌクレオチドが提供される。当該オリゴヌクレオチドを植物に導入し、エチレン合成を制御することにより、側根伸長の促進や冠水耐性の付与、果実や花きの品質保持能力の向上した植物が提供される。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す図である。図中の三角印は、イントロンの位置を示し、括弧内の数字は、イントロンのヌクレエチド数を示す。図中央の、第３イントロンの上にある下向きの矢印は、Ｔｏｓ１７の挿入位置を示す。図の下に示した４つの下向きの矢印は、ポリアデニル化部位を示す。下線部分は、疎水性残基が豊富な領域を示す。丸で囲ったアミノ酸残基は、ｒｉｎｇｆｉｎｇｅｒ領域中の保存されたＺｎ^２＋結合残基を示す。
図２は、相補試験に用いた相補ベクターの構築を示す図である。
図３は、Ｔｏｓ１７挿入変異体、および本発明のオリゴヌクレオチドを導入した形質転換体の側根伸長を示す写真である。左から順に、対照（野生型イネの根）、Ｔｏｓ１７挿入変異体の側根伸長、および本発明のオリゴヌクレオチドを導入した形質転換体の側根伸長を示す。野生型（左）に比べて、Ｔｏｓ１７挿入変異体（中央）では、側根伸長が顕著に阻害されている。本発明のオリゴヌクレオチドを導入した形質転換体（右）では、側根伸長が野生型のレベルまで回復した。
図４は、側根伸長に対するエチレン前駆体ＡＣＣと、エチレン阻害剤ＡｇＮＯ_３の効果を示す図である。左から順に、野生型イネ（無処理）、野生型イネ（ＡＣＣ、１０^−４Ｍ処理）、Ｔｏｓ１７挿入変異体（無処理）、およびＴｏｓ１７挿入変異体（ＡｇＮＯ_３、１０^−７Ｍ処理）の側根伸長を示す。野生型をＡＣＣ処理すると、側根の伸長阻害が起こり、Ｔｏｓ１７挿入変異体をＡｇＮＯ_３処理すると側根伸長が正常レベルに回復した。
図５は、野生型と変異体におけるエチレン産生量の比較を示す図である。

Claims

エレチン合成を制御し得る植物遺伝子をコードするオリゴヌクレオチドであって、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから４０５位のＧｌｎまでのアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
イネ由来の、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
配列表の配列番号１で示される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
制御配列に作動可能に連結された請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む、ベクター。
ｐＩＧ１２１−Ｈｍ−ＲＦである請求項４に記載のベクター。
請求項４に記載のベクターで形質転換された、植物。
植物におけるエチレン合成の制御方法であって、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを植物に導入する工程を包含する、方法。